000814364.

UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA - UNESP
CÂMPUS DE JABOTICABAL
REMODELAMENTO DO MIOCÁRDIO NA CARDIOMIOPATIA
DILATADA INDUZIDA COM DOXORRUBICINA EM
COELHOS
Fábio Nelson Gava
Médico Veterinário
2014
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA - UNESP
CÂMPUS DE JABOTICABAL
REMODELAMENTO DO MIOCÁRDIO NA CARDIOMIOPATIA
DILATADA INDUZIDA COM DOXORRUBICINA EM
COELHOS
Fábio Nelson Gava
Orientador: Prof. Dr. Aparecido Antonio Camacho
Tese apresentada à Faculdade de Ciências
Agrárias e Veterinárias – Unesp, Câmpus de
Jaboticabal, como parte das exigências para a
obtenção do título de Doutor em Medicina
Veterinária (Clínica Médica Veterinária).
2014
G279r
Gava, Fábio Nelson
Remodelamento do miocárdio na cardiomiopatia dilatada induzida
com doxorrubicina em coelhos / Fábio Nelson Gava. – – Jaboticabal,
2014
xvi, 56p. : il. ; 28cm
Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista, Faculdade de
Ciências Agrárias e Veterinárias, 2014
Orientador: Aparecido Antonio Camacho
Banca examinadora: Rosemeri de Oliveira Vasconcelos, Mirela
Tinucci Costa, Katia Mitsube Tarraga, Wagner Luís Ferreira
Bibliografia
1. Modelo experimental. 2. Ecodopplercardiografia. 3. Imunohistoquímica. 4. Microscopia eletrônica. 5. Apoptose. I. Título. II.
Jaboticabal-Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias.
CDU 619:616.12:636.92
Ficha catalográfica elaborada pela Seção Técnica de Aquisição e Tratamento da Informação –
Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação - UNESP, Câmpus de Jaboticabal.
i
DADOS CURRICULARES DO AUTOR
FÁBIO NELSON GAVA - filho de Aparecido Nelson Gava e Marlene Aparecida
Pellegronotti Gava, nascido em 06 de Março de 1984 na cidade de Piracicaba –SP.
Em 2002, ingressou no curso de Medicina Veterinária na Faculdade de Ciências
Agrárias e Veterinárias – UNESP, Jaboticabal. De 01/08/2004 à 31/07/2005 foi
bolsista PIBIC/CNPq de iniciação científica, orientado pela Prof a. Dra. Rosângela Z.
Machado. Em 2006 foi bolsista FAPESP de iniciação científica, sob orientação do
Prof. Dr. Aparecido Antonio Camacho. Graduou-se em Janeiro de 2007 e em
seguida participou do programa de residência em Medicina Veterinária e Saúde
Pública, na área de Clínica Médica de Pequenos Animais, no período de 01/02/2007
à 31/01/2009 na Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – UNESP,
Jaboticabal. Em 2009 ingressou no Programa de Pós-Graduação em Medicina
Veterinária (Clínica Médica) na mesma universidade, obtendo o título de Mestre em
Fevereiro de 2011 (bolsista FAPESP). Ingressou no doutorado em Março de 2011,
com bolsa FAPESP até Fevereiro de 2013, quando iniciou como professor na
Universidade Camilo Castelo Branco – Unicastelo, Câmpus Descalvado, das
disciplinas de Clínica Médica de Pequenos Animais, Semiologia Veterinária e
Semiotécnica da Prática Veterinária.
ii
“Tenho em mim todos os sonhos do mundo”
Fernando Pessoa
iii
Dedico,
Aos meus avós,
Olívio, Jandyra, Antônio e Maria,
Que me ensinaram
que a humildade pode nos levar a distâncias jamais percorridas.
iv
AGRADECIMENTOS
Em 2002 meus pais Nelson e Marlene, e meu irmão Fabrício, me
proporcionaram e apoiaram a vinda para Jaboticabal. Chegando aqui, fui acolhido
pela “família” República Nazarena: Gustavo (Cyo), Thiago (Quaiada), e Franco
(Gozado), pela amiga-funcionária Sandrinha e por todos meus amigos de turma da
VET 2002. Em meio a tantas disciplinas, encontros, festas, em 2005 iniciei meu
estágio e iniciação científica na Cardiologia. Isso só foi possível devido ao fato do
Prof. Camacho ter acreditado em mim e me dado essa oportunidade. Meus pais
sempre me disseram que precisamos de “padrinhos” na vida. Pessoas que nos
aconselham, orientam e educam. E uma sábia escolha que fiz, foi escolher o Prof.
Camacho como meu “padrinho”. Além de se tornar um grande amigo, me orientou
esses anos todos e proporcionou a realização do meu maior sonho: ser professor.
Os anos foram passando, a república foi mudando (Sumo, Janota, Pará,
Crema, Gabriel) e eu ficando.... Nesse tempo, conheci grandes amigos que levarei
para sempre comigo (Sabrina, Geórgia, Gi, Onçona, Gabi, Espinha, Tequila, Atoa,
Tchaina, Xorona, Letícia, Andressa, Mariana, Sofia, Ellen, Marina,...).
Veio a
residência, que me proporcionou crescimento técnico e científico muito valioso e
novos amigos (residentes, pós-graduandos e funcionários do HV). Durante tudo isso,
tive professores. Verdadeiros mestres, que se preocuparam não somente em
ensinar, mas em educar e orientar. Aqui, junto com Prof. Camacho, gostaria de
agradecer à Prof. Mirela, que além de me ensinar muito, me acompanha desde a
minha chegada, sempre com um sorriso no rosto ao me ver, muito presente e
sempre muito feliz a cada conquista minha. À Prof. Marileda, que por muitas vezes
gastamos horas e horas conversando sobre algum caso clínico ou sobre a vida,
onde sempre me ensinou algo novo. Ao Prof. Canola, que me dá a oportunidade de
ministrar aulas em sua disciplina há anos e também muito presente a cada vitória. À
Prof. Rosângela, que me introduziu a vida científica.
A pós-graduação me trouxe os “cardiolegas”: Glaucia, Tatiana, Marlos, Daniel,
João Paulo, Rodrigo, Evandro, Fernando, Edna, Rafael, Fabricio, Roberto, Jorge,
Sheila, Felipe e Ana. Amigos, excelentes profissionais que proporcionaram histórias
de experimentos e de vida que levarei para sempre.
v
Com o trabalho do mestrado, fomos apresentados à Prof. Rose. Um exemplo
de humildade, sabedoria e competência, que acreditou e abraçou essa idéia e vem
me ensinando desde então. Nossos resultados jamais teriam sido os mesmos sem a
sua participação. Inclusive, trouxe o Márcio Bandarra para o nosso grupo, o qual
trabalhou fielmente comigo, me ensinando imuno-histoquímica e resolvendo os
problemas com as caspases!
Aos membros da banca da qualificação desse doutorado, Prof Camacho,
Prof. Laus, Prof. Mirela, Prof. Canola e Prof. Alessi, meus sinceros agradecimentos
às considerações feitas ao trabalho e a minha pessoa.
Também agradeço à “Tuca” do Laboratório de Microscopia Eletrônica da
USP, Ribeirão Preto; à Claudia e à Claudia Ribeirinho, do Laboratório de
Microscopia Eletrônica da Unesp, Jaboticabal e a “Chica” do laboratório de
histopatologia da Unesp, Jaboticabal.
Aos meus alunos e colegas professores da Unicastelo, que me receberam de
braços abertos e me fortalecem a cada dia.
Ao grupo de animais que participou desse estudo, o meu respeito e o desejo
de que nossos resultados ajudem a ciência da cardiologia e da oncologia, a ponto de
que seu sacrifício tenha valido a pena.
A UNESP, Câmpus de Jaboticabal, que me proporcionou tudo isso.
Doze anos de formação se passaram, mas a cada dia tenho um novo
sonho e a vontade de crescer cada vez mais...
Agradeço a Deus e a todos os nomes citados acima.
vi
Agradeço,
A Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), pela bolsa
de doutorado (processo no 2010/18502-4) e pelo auxílio (processo no 2011/12124-0)
concedidos para esse estudo.
vii
SUMÁRIO
Página
Certificado da Comissão de Ética...............................................................
ix
RESUMO.........................................................................................................
x
ABSTRACT.....................................................................................................
xi
Lista de abreviaturas....................................................................................
xii
Lista de tabelas.............................................................................................
xiii
Lista de figuras..............................................................................................
xiv
1. INTRODUÇÃO............................................................................................
1
2. REVISÃO DA LITERATURA......................................................................
3
3. OBJETIVOS................................................................................................
10
3.1 Objetivos específicos.......................................................................
10
4. MATERIAL E MÉTODOS...........................................................................
11
4.1 Locais de realização da pesquisa...................................................
11
4.2 Animais.............................................................................................
11
4.3 Indução da cardiomiopatia dilatada com doxorrubicina..............
11
4.4 Ecodopplercardiografia...................................................................
12
4.5 Eutanásia e coleta de material.........................................................
13
4.6 Microscopia eletrônica de transmissão.........................................
14
4.7 Microscopia eletrônica de varredura.............................................
14
4.8 Imuno-histoquímica..........................................................................
15
4.9 Estatística..........................................................................................
17
5. RESULTADOS...........................................................................................
18
viii
5.1 Mortalidade.......................................................................................
18
5.2 Ecodopplercardiografia...................................................................
18
5.3 Microscopia eletrônica de transmissão..........................................
21
5.4 Microscopia eletrônica de varredura..............................................
25
5.5 Imuno-histoquímica..........................................................................
27
5.6 Correlações.......................................................................................
29
6. DISCUSSÃO…..…………………………………………………………………
32
7. CONCLUSÕES……………………………………………………………….....
39
8. REFERÊNCIAS...........................................................................................
40
ix
x
REMODELAMENTO DO MIOCÁRDIO NA CARDIOMIOPATIA DILATADA
INDUZIDA COM DOXORRUBICINA EM COELHOS
RESUMO - A cardiotoxicidade induzida pela doxorrubicina gera remodelamento
miocárdico e disfunção sistólica. O presente estudo avaliou a participação da
apoptose e componentes da matriz extracelular (miofibroblastos e fibronectina) na
cardiomiopatia dilatada induzida com doxorrubicina em coelhos. Foram utilizados 25
coelhos da raça Nova Zelândia, alocados em dois grupos (controle e tratados). O
fármaco foi administrado por seis semanas e a ecodopplercardiografia foi realizada
no momento zero e após a última administração. O remodelamento do miocárdio foi
avaliado por microscopia eletrônica (varredura e transmissão) e por imunodetecção
de fibras apoptóticas, miofibroblastos e fibronectina. Nos animais tratados houve
redução significativa da função sistólica observada na ecodopplercardiografia e
aumento das fibras apoptóticas e miofibroblastos, no ventrículo esquerdo, septo
interventricular e ventrículo direito. Houve correlação negativa significativa entre o
número de mitocôndrias lesadas e das células apoptóticas no septo interventricular e
no ventrículo esquerdo com os índices de função sistólica. Os dados obtidos
permitem inferir que a apoptose por via mitocondrial participa da disfunção sistólica
observada no tratamento com doxorrubicina e que o aumento da matriz extracelular
não é o principal causador de disfunção sistólica na cardiomiopatia dilatada induzida
com doxorrubicina
Palavras-chave: modelo experimental, ecodopplercardiografia, imuno-histoquímica,
microscopia eletrônica, apoptose.
xi
MYOCARDIAL REMODELING IN DOXORUBICIN-INDUCED DILATED
CARDIOMYOPATHY IN RABBITS
ABSTRACT - The cardiotoxicity induced by doxorubicin generates myocardial
remodeling and systolic dysfunction. The present study evaluated the role of
apoptosis and extracellular matrix components (fibronectin and myofibroblasts) in
doxorubicin-induced dilated cardiomyopathy in rabbits. Twenty five New Zealand
rabbits were used, allocated into two groups (control and treated). The drug was
administered for six weeks and Doppler echocardiography was performed before the
first and after the last administration. Myocardial remodeling was evaluated by
electron microscopy (scanning and transmission) and immunodetection of apoptotic
cells, myofibroblasts and fibronectin. Significant reduction in systolic function,
increased apoptotic fibers and myofibroblasts were noticed in treated animals, on the
left ventricle, interventricular septum and right ventricle. There was a significant
negative correlation between the number of damaged mitochondria and apoptotic
cells at the left ventricle and interventricular septum with systolic function, showing
that the apoptosis by mitochondrial pathway plays a role on the systolic dysfunction
during treatment with doxorubicin and the increase in extracellular matrix is not the
primary cause of systolic dysfunction induced by doxorubicin.
Keywords: experimental model, Doppler echocardiography, immunohistochemistry,
electron microscopy, apoptosis.
xii
LISTA DE ABREVIATURAS
AD
Átrio direito
AE
Átrio esquerdo
AO
Aorta
CMD
Cardiomiopatia dilatada
Cód.
Código
DAB
Diaminobenzidina
DBS
Diagnostic Biosystems
DIVEd
Diâmetro interno do ventrículo esquerdo em diástole
DIVEs
Diâmetro interno do ventrículo esquerdo em sístole
EP
Erro padrão
EPLVEd
Espessura da parede livre do ventrículo esquerdo em diástole
EPLVEs
Espessura da parede livre do ventrículo esquerdo em sístole
ESIVd
Espessura do septo interventricular em diástole
ESIVs
Espessura do septo interventricular em sístole
FCAV
Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias
FEC
Fração de encurtamento
FEJ
Fração de ejeção
G1
Grupo 1
G2
Grupo 2
ITEI
Índice de performance miocárdica de Tei
OBJ
Objetiva
SIV
Septo interventricular
SMA
Smooth Muscle Actin
T0
Tempo zero
T45
Tempo 45
TEVE
Tempo de ejeção ventricular esquerda
TRIV
Tempo de relaxamento isovolumétrico
Unesp
Universidade Estadual Paulista
USP
Universidade de São Paulo
VD
Ventrículo direito
VE
Ventrículo esquerdo
xiii
LISTA DE TABELAS
Página
Tabela 1
Protocolo de imuno-histoquímica utilizado para os
anticorpos: α- SMA, caspase e fibronectina em miocárdio
de coelhos após o tratamento com doxorrubicina. Unesp,
Jaboticabal, SP (2014).
16
Tabela 2
Valores dos parâmetros ecodopplercardiográficos (média ±
EP) obtidos de coelhos submetidos ao tratamento com
doxorrubicina. Unesp, Jaboticabal, SP (2014).
19
Tabela 3
Valores das contagens de mitocôndrias alteradas (média ±
EP) em coelhos após o tratamento com doxorrubicina.
Unesp, Jaboticabal, SP (2014).
25
Tabela 4
Valores das contagens de células imunomarcadas para αSMA (miofibroblastos) e Caspase 3 (apoptose) e
porcentagem de marcação de fibronectina (média ± EP) em
coelhos após o tratamento com doxorrubicina. Unesp,
Jaboticabal, SP (2014).
29
xiv
LISTA DE FIGURAS
Página
Figura 1
Imagem ecocardiográfica em modo “M” do ventrículo
esquerdo (eixo curto) de coelho submetido ao
tratamento com doxorrubicina (G2) no T0 (A) e no T45
(B) (mesmo indivíduo). EF= Fração de ejeção; FS=
Fração de encurtamento. Unesp, Jaboticabal, SP
(2014).
20
Figura 2
Micrografia eletrônica de transmissão de miocárdio de
coelhos do grupo controle. A) Ventrículo direito:
presença de fibras cardíacas contendo mitocôndrias
(setas) em distribuição colunar no sarcoplasma e
presença de um vaso sanguíneo (V) (4.646x); B) Septo
interventricular: evidenciação das linhas Z (Z) no
sarcômero. (4.646x); C) Ventrículo esquerdo: verifica-se
o aspecto digitiforme das cristas mitocondriais (seta)
(16.700x); D) Ventrículo esquerdo: evidenciando a
estrutura sarcômero, composto pela banda I (a qual
inclui a linha Z), banda A (que inclui a banda H e a linha
M) (46.460x). Unesp, Jaboticabal, SP (2014).
22
Figura 3
Micrografia eletrônica de transmissão de miocárdio de
coelhos tratados com doxorrubicina. A) Ventrículo
esquerdo: presença de miocitólise e espessamento das
linhas Z (hipercontração, setas), com dissociação e
fragmentação de fibras miocárdicas e presença de
edema (E) (2.784x); B) Septo interventricular: presença
de um fibroblasto (F) no interstício, entre fibras
cardíacas degeneradas (*) e saudáveis (seta) (6000x);
C) Ventrículo direito: fibra apoptótica (FA), com núcleo
eletrodenso, degeneração das mitocôndrias e
preservação da membrana citoplasmática (7.750x); D)
Septo interventricular: endotélio degenerado (setas),
com formação de grandes vacúolos citoplasmáticos (V)
(6000x). Unesp, Jaboticabal, SP (2014).
23
Figura 4
Micrografia eletrônica de transmissão de miocárdio de
coelhos tratados com doxorrubicina. A: Ventrículo
direito: aumento do número de mitocôndrias, com lise
das cristas e formação de grandes vacúolos (V)
(6.000x); B: Ventrículo direito: perda do aspecto
digitiforme das cristas (seta) (6.000x); C: Ventrículo
direito: aumento da matriz extracelular (ME) (12.930x);
D: Ventrículo esquerdo: lise das cristas e fusão das
mitocôndrias (*) (15.000x). Unesp, Jaboticabal, SP
(2014).
24
Figura 5
Micrografia eletrônica de varredura de miocárdio de
coelhos. A: Ventrículo esquerdo de animal do grupo
26
xv
controle. Notar a distribuição uniforme e alinhada das
fibras musculares cardíacas. (500x); B: Ventrículo
esquerdo de coelho submetido ao tratamento com
doxorrubicina. Notar a fragmentação e desorganização
dos cardiomiócitos (seta vermelha) e fragmentação das
fibras colágenas adjacentes (seta branca), formando
espaços-vazios entre as fibras musculares (*) (500x); C:
Septo interventricular de coelho submetido ao
tratamento com doxorrubicina. Observar o aumento da
matriz extracelular (seta amarela) (1000x); D: Ventrículo
direito de coelho submetido ao tratamento com
doxorrubicina (1000x). Presença de dissociação das
fibras cardíacas por aumento da matriz extracelular (*).
Unesp, Jaboticabal, SP (2014).
Figura 6
Imuno-histoquímica de miocárdio de coelhos. A e B: αSMA; C e D: caspase; E e F: fibronectina. A: Ventrículo
direito de animal do grupo controle: notar marcação da
α-SMA somente ao redor dos vasos (setas) (controle
positivo, Obj. 10x); B: Septo interventricular de coelho
submetido ao tratamento com doxorrubicina: presença
de miofibroblastos na matriz extracelular (seta / Obj.
40x); C: Ventrículo esquerdo com ausência de
imunomarcação para apoptose (grupo controle, Obj.
40x); D: Septo interventricular de coelho submetido ao
tratamento com doxorrubicina: marcação de fibras
apoptóticas (setas pontilhadas). Notar picnose nuclear e
citoplasma positivo para caspase-3 clivada (Obj. 40x);
E: Ventrículo direito negativo para fibronectina (grupo
controle, Obj 40x); F: Ventrículo direito de coelho
submetido ao tratamento com doxorrubicina: aumento
da imunodetecção de fibronectina na matriz extracelular
(* / Obj. 40x). Complexo de polímeros ligados a
peroxidase. Unesp, Jaboticabal, SP (2014).
28
Figura 7
Correlações dos índices ecodopplercardiográficos
(Fração de ejeção e Fração de encurtamento) com o
número de mitocôndrias alteradas no septo
interventricular (SIV) e no ventrículo esquerdo (VE).
Correlação de Pearson (P<0,05). Unesp, Jaboticabal,
SP (2014).
30
Figura 8
Correlações dos índices ecodopplercardiográficos
(Fração de ejeção e Fração de encurtamento) com o
número de células apoptóticas no septo interventricular
(SIV) e no ventrículo esquerdo (VE). Correlação de
Pearson (P<0,05). Unesp, Jaboticabal, SP (2014).
31
Figura 9
Correlações dos índices ecodopplercardiográficos
(Fração de ejeção e Fração de encurtamento) com o
número de miofibroblastos no septo interventricular
(SIV) e no ventrículo esquerdo (VE). Correlação de
Pearson (P<0,05). Unesp, Jaboticabal, SP (2014).
31
xvi
Figura 10
Apoptose por via mitocondrial. Após um stress oxidativo,
ocorre aumento da permeabilidade da membrana das
mitocôndrias, com liberação de citocromo C e proteínas
pró-apoptóticas (fator indutor de apoptose), ativação da
cascata das caspases e a morte celular por apoptose.
Fonte: Arquivo pessoal.
35
Figura 11
Esquema representativo da fisiopatogenia da indução
da cardiomiopatia dilatada com doxorrubicina. A
administração crônica do fármaco gera um stress
oxidativo, alterando a permeabilidade da membrana
mitocondrial. Ocorre liberação de fatores próapoptóticos das mitocôndrias alteradas, que levarão à
morte celular por apoptose. Essa é responsável pela
dilatação cardíaca e diminuição da função sistólica. VD=
ventrículo direito; VE= ventrículo esquerdo; AO= aorta;
AE= átrio esquerdo. Fonte: Arquivo pessoal.
36
1
1. INTRODUÇÃO
Considerando que a cardiomiopatia dilatada (CMD) é uma enfermidade
frequente, de grande interesse científico e de tratamento desafiador, tanto em
animais domésticos como em seres humanos, o estudo de modelos experimentais
para essa doença faz-se necessário.
O grupo de pesquisa em cardiologia veterinária da Unesp, câmpus de
Jaboticabal, chefiado pelo Prof. Dr. Aparecido Antonio Camacho vem estudando
esses modelos desde 1993 (DAL FARRA et al., 1993; DAL FARRA et al., 1995;
DIAS et al., 1997; NAKAGE et al., 1999; ANDRADE et al., 2003; CAMACHO et al.,
2004; CAMACHO & ANDRADE, 2005; SILVA & CAMACHO, 2005; PEREIRA-NETO
et al., 2006; SOUZA & CAMACHO, 2006; FERREIRA et al., 2008)
Porém, frente
aos recentes paradigmas éticos aos quais se encontram as pesquisas, a busca por
novos modelos de experimentação é uma real necessidade.
Sabendo-se que a doxorrubicina pode ser utilizada para a indução da CMD,
este grupo de pesquisa tem estudado a criação de um modelo experimental em
coelhos, desde 2009. Os primeiros trabalhos consistiram em estudar a melhor
dosagem de administração, bem como, avaliação radiográfica, eletrocardiográfica,
ecodopplercardiográfica e anatomo-histopatológica (GAVA et al., 2013).
Os resultados têm sido satisfatórios, porém, algumas dúvidas permaneceram
principalmente em relação à causa da diminuição da função sistólica (observada na
ecodopplercardiografia) relacionada ao remodelamento miocárdico (observado na
histopatologia).
Observou-se a presença de necrose (em baixa intensidade) e aumento da
matriz extracelular nos indivíduos tratados, mas a intensidade desses achados não
mostrou correlação com a diminuição da função sistólica.
Sabendo-se que a doxorrubicina causa apoptose das células neoplásicas,
este trabalho avaliou a hipótese do fármaco causar morte dos cardiomiócitos por
esse mesmo mecanismo, levando a disfunção sistólica. Para isso, a eutanásia foi
realizada imediatamente após a diminuição da função sistólica observada na
ecodopplercardiografia (momento pré-estabelecido em estudos anteriores) e o
2
miocárdio dos animais foi avaliado à luz da imuno-histoquímica e microscopia
eletrônica.
O estudo foi realizado em três regiões do miocárdio, estabelecendo-se a
comparação entre a intensidade das lesões no ventrículo esquerdo, no septo
interventricular e no ventrículo direito, uma vez que as lesões no ventrículo direito
são pouco descritas.
3
2. REVISÃO DA LITERATURA
As
enfermidades
que
afetam
o
miocárdio
são
denominadas
de
cardiomiopatias. Essas doenças estão relacionadas com disfunção miocárdica e são
causas importantes de insuficiência cardíaca congestiva (ICC). Na Medicina
Veterinária, elas são classificadas em cardiomiopatia dilatada, hipertrófica, restritiva,
oculta e arritmogênica ventricular direita (WARE, 2006).
A cardiomiopatia dilatada (CMD) é a afecção do miocárdio de maior incidência
em cães, caracterizada pelo aumento das câmaras cardíacas, disfunção sistólica, ou
seja, deficiência na contratilidade e consequente desequilíbrio no débito cardíaco
(SISSON et al.,1999). Afeta principalmente cães de raças grandes, com exceção do
Cocker Spaniel (MEURS, 1998; SISSON et al., 1999).
A etiologia continua incerta e especula-se que fatores genéticos, nutricionais,
infecciosos, isquêmicos, tóxicos, metabólicos ou a combinação desses estejam
envolvidos (CAMACHO, 2007). Estudos demonstram que fatores genéticos
assumem grande importância no desenvolvimento da doença em cães e em seres
humanos (MEURS, 1998; MEURS et al., 2001).
A fisiopatologia da enfermidade consiste, inicialmente, em lesão miocárdica,
com progressiva dilatação das câmaras cardíacas e diminuição da função sistólica.
Com a perda progressiva da capacidade contrátil, ocorre déficit hemodinâmico,
diminuição do débito cardíaco (DC) e da pressão arterial (PA), ativando vários
mecanismos compensatórios como aumento do tônus simpático e da liberação da
vasopressina (SISSON et al.,1999). Além disso, como resposta à queda da PA, a
enzima renina é liberada na circulação e induz à gênese da angiotensina I (AI), por
ação direta sobre o angiotensinogênio (SKIDGEL et al., 1984).
Na passagem pelo leito vascular pulmonar, a AI é hidrolisada e transformada
em angiotensina II (AII), a partir da ação da enzima conversora de angiotensina
(ECA) (SKEGGS et al., 1956; ESTHER et al., 1997). A AII é um potente
vasoconstritor e promove a síntese de aldosterona, que é um fator determinante
para a manutenção da PA. Esta atua nos túbulos distais e nos ductos coletores dos
néfrons, promovendo retenção de sódio, de água e a excreção de íons K+ e H+
(SKIDGEL et al., 1984).
4
Ocorre dilatação das câmaras ventriculares, em razão do aumento da précarga, observando-se, inicialmente, hipertrofia excêntrica, com consequente quadro
de insuficiência valvular atrioventricular bilateral. Com o progresso da doença, ocorre
fibrose, edema intersticial e alargamento das fibras miocárdicas, com piora do
quadro de deformidade geométrica das câmaras ventriculares e insuficiência valvar
(SISSON et al.,1999; O´GRADY & O´SULLIVAN, 2004). Observa-se também,
comprometimento gradual dos processos metabólicos celulares envolvidos no
transporte do íon cálcio, gerando o seu acúmulo nas mitocôndrias. A respiração
celular fica prejudicada, predispondo à arritmia cardíaca (MEHVAR & BROCKS,
2001; WARE, 2006; CAMACHO, 2007).
Como ICC esquerda e direita geralmente estão presentes, os sinais clínicos
variam. Os animais podem apresentar fraqueza, letargia, anorexia, taquipnéia ou
dispnéia, intolerância ao exercício, tosse, cianose e edema pulmonar nos casos de
ICC esquerda. Efusões pleurais e pericárdicas, ascite, hepatoesplenomegalia,
distensão de pulso jugular e edema de membros posteriores são característicos de
ICC direita (SISSON et al.,1999; O´GRADY & O´SULLIVAN, 2004; WARE, 2006).
O diagnóstico da doença baseia-se no histórico clínico, exame físico, achados
radiográficos, eletrocardiográficos e, principalmente, ecodopplercardiográficos. Ao
exame físico, além dos achados de ICC esquerda e direita, alterações do ritmo
cardíaco e sopro podem ser auscultados. Os achados radiográficos consistem em:
cardiomegalia, distensão de veias pulmonares, edema pulmonar, efusão pleural e
pericárdica, ascite e hepatoesplenomegalia (SISSON et al.,1999; CAMACHO, 2007).
A ecodopplercardiografia permite avaliar as dimensões das câmaras
cardíacas e a função miocárdica. As principais alterações ecocardiográficas
encontradas na CMD são: dilatação das câmaras cardíacas, hipocinesia do septo e
da parede ventricular, diminuição das frações de encurtamento e ejeção, aumento
da relação átrio esquerdo/aorta e aumento da distância do ponto E da valva mitral ao
septo interventricular. Regurgitação atrioventricular pode ser detectada com o uso do
Doppler (KOCH et al.,1996; BOON, 1998; SISSON et al.,1999; GARNCARZ , 2007).
Dentre os principais achados anatomopatológicos, encontram-se aumento de
câmaras cardíacas, palidez e adelgaçamento do miocárdio, músculos papilares
atróficos e hipertrofia ventricular excêntrica. A análise histopatológica pode revelar
5
degeneração miocárdica com miocitólise, vacuolização e atrofia dos miócitos e
necrose miocárdica, principalmente na base dos músculos papilares, septo
ventricular e subendocárdio da parede livre do ventrículo esquerdo (TIDHOLM &
JÖNSSON, 2005; CAMACHO, 2007).
O tratamento da cardiomiopatia dilatada consiste em controlar os sinais de
insuficiência cardíaca congestiva, melhorar o débito cardíaco, controlar as arritmias,
melhorando a qualidade de vida do paciente. Assim, torna-se necessário o uso de
diuréticos, vasodilatadores (inibidores da enzima conversora de angiotensina),
antiarrítmicos e agentes inotrópicos positivos (WARE, 2006; CAMACHO, 2007).
Porém, devido ao fato dessa enfermidade ainda possuir um prognóstico
reservado para seres humanos e animais, a criação de modelos experimentais tem
despertado
grande
interesse
científico
(KASAMA
et
al.,
2007).
Cobaias,
camundongos e coelhos têm sido utilizados para estudos em cardiopatias. Dentre
eles, devido ao pequeno porte, melhores condições de manejo e facilidade de
acesso às técnicas diagnósticas, como o ecodopplercardiograma, os coelhos são
mais utilizados (ROBERT, 2007a).
Pesquisadores têm utilizado coelhos para testes de novas medidas
terapêuticas nos diversos tipos de cardiomiopatias, como novos fármacos e terapia
com células-tronco (SIMUNEK et al., 2004; CHEN et al., 2006; LU et al., 2006;
AUPPERLE et al., 2007; KAISEROVÁ et al., 2007; KASAMA et al., 2007; ROBERT,
2007b).
Sabendo-se dos efeitos cardiotóxicos da doxorrubicina, esse agente
antineoplásico pode ser utilizado em modelos experimentais para indução da
cardiomiopatia dilatada (JAENKE et al., 1980; ARNOLDA et al., 1985). Este
quimioterápico é um antibiótico do grupo das antraciclinas, que foi isolado a partir de
culturas fúngicas de Streptomyces peucetius var. caesius (OLSON & CAPEN, 1978;
SUSANECK, 1983; JACOBS, 1996).
A doxorrubicina possui atividade antineoplásica em diversas neoplasias,
apresentando largo espetro de ação, especialmente em sarcomas de tecidos moles,
osteossarcoma, leucemias, linfomas, carcinomas e tumor venéreo transmissível
(DIAS et al., 1997; DAGLI & LUCAS, 2006).
6
O mecanismo preciso de ação antitumoral desse fármaco ainda é motivo de
investigação científica, porém sabe-se que provoca o desencadeamento de vários
efeitos bioquímicos que desempenham papel importante quanto à terapêutica e a
toxicidade. É capaz de afetar a síntese de ácidos nucléicos, por inibição da DNApolimerase e da RNA-polimerase, intercalando-se entre os pares de nucleotídeos
adjacentes do DNA, com modificação da estrutura do cromossomo. Além disso,
sabe-se que a doxorrubicina causa apoptose das células neoplásicas (DAGLI &
LUCAS, 2006; YANG et al., 2013).
Em estudo com cães, SOUZA & CAMACHO (2006) referem à semelhança da
cardiomiopatia dilatada induzida pela doxorrubicina com a cardiomiopatia dilatada
idiopática, principalmente em relação aos achados ecocardiográficos, como
dilatação de câmaras cardíacas e perda da função sistólica.
Empregando-se a eletrocardiografia com Holter, PEREIRA-NETO et al. (2006)
descreveram que cães tratados com doxorrubicina desenvolveram arritmias
supraventriculares e ventriculares, comprovando que os efeitos cardiotóxicos da
doxorrubicina também influenciam no ritmo cardíaco.
Na busca por novas terapias para a CMD, SOUSA (2007) refere melhora na
função sistólica em cães submetidos à indução da CMD com doxorrubicina após o
transplante autógeno de células-tronco hematopoéticas, ressaltando a importância
desse tipo de estudo na busca por melhoria na qualidade de vida dos pacientes.
Microscopicamente, as lesões miocárdicas encontradas em cães e humanos
tratados com doxorrubicina são muito semelhantes às da CMD. Elas são
caracterizadas por degeneração vacuolar, atrofia dos cardiomiócitos, necrose,
infiltrado mononuclear, fibrose e infiltração adiposa (KEHOE et al., 1978; VAN
VLEET & FERRANS, 1986; MAUDLIN et al., 1992). Essas alterações são bem
descritas no ventrículo esquerdo e no septo interventricular, sendo que, Herpel et al.
(2005) relatam a importância de se estudar também as lesões que ocorrem no
ventrículo direito nas cardiomiopatias.
Entretanto, os efeitos tóxicos provocados pela doxorrubicina no miocárdio
ainda permanecem obscuros. Acredita-se que a cardiotoxicidade decorra da
formação de radicais livres, com reações de peroxidação. A liberação de
superóxidos propicia a conversão dos ácidos graxos insaturados da membrana
7
celular miocárdica em peróxidos lipídicos, resultando em alterações estruturais no
miócito, com formação de vacúolos e atrofia progressiva das miofibrilas. Sabe-se
que a doxorrubicina pode desencadear liberação de histamina, metabólitos do ácido
araquidônico e fator de ativação plaquetário, contribuindo para progressão de lesões
no miocárdio. Tais alterações resultam em dilatação cardíaca, remodelamento do
músculo cardíaco e perda da capacidade contrátil. Contudo, a maioria dos estudos
correlaciona a disfunção sistólica com a presença de fibrose e não com o
mecanismo indutor da morte celular (SUSANECK, 1983; TOMLINSON et al., 1985;
GANZ et al., 1996; TOYODA et al., 1998; TJEERDSMA et al., 1999; SOUSA, 2007).
Gava et al. (2013), em estudo com coelhos tratados com doxorrubicina,
relataram o desenvolvimento de disfunção sistólica e a presença de fibrose à
histopatologia, porém, não muito intensa, fazendo supor que a diminuição da
contratilidade cardíaca fosse anterior ao desenvolvimento da fibrose.
Dentre os mecanismos de morte celular, a apoptose é um processo biológico
complexo e fundamental que permite ao organismo eliminar e remover células
impróprias (PORTER & JANICKE, 1999). A partir de um sinal apoptótico, ocorrem
alterações que geram a morte celular, sem a liberação dos seus conteúdos
intracelulares (PEDERSEN, 1999). Isso elimina as células danificadas, mutadas,
envelhecidas ou potencialmente perigosas (RAVAGNAN et al., 2002).
Durante um estímulo apoptótico, como um stress oxidativo, por exemplo, a
mitocôndria é “desviada” de sua função original, que é a manutenção da vida celular,
para um papel contrário, facilitando a morte celular. Ocorre a liberação de
substâncias, como o citocromo c e o fator indutor de apoptose (FIA), iniciando a
ativação das caspases (SUSIN et al., 1999). As alterações mitocondriais podem ser
visibilizadas à microscopia eletrônica de transmissão (ANTUNES et al., 2013).
As caspases são enzimas de uma família de proteases presentes no genoma
dos mamíferos. Participam de uma cascata, iniciada em resposta a sinais próapoptóticos, que leva à eliminação da célula (THORNBERRY & LAZEBNIK, 1998).
São essenciais para a ativação e execução da apoptose (PORTER & JANICKE,
1999).
As caspases 3, 6 e 7 são consideradas caspases de execução ou efetoras e
exercem importante papel no controle da morte celular programada. A caspase 3 é a
8
mais prevalente nas células e gera a quebra de muitas proteínas nucleares
(ZIMMERMANN E GREEN, 2001; TERZIAN et al., 2007).
Com o auxílio da técnica de imuno-histoquímica, iniciou-se uma série de
estudos sobre apoptose nas diferentes doenças miocárdicas, confirmando seu
envolvimento em lesões agudas e crônicas. Com isso, a expressão da caspase-3 no
miocárdio por meio de imuno-histoquímica pode ser utilizada para a elucidação de
mecanismos fisiopatológicos, bem como fator preditivo para o estudo de novas
terapias nas cardiomiopatias, inclusive na cardiomiopatia dilatada (KUMAR et al.,
2001; SHITE et al., 2001; CHICCO et al., 2006; BAE et al., 2008; KIM & KANG,
2010; CHAO et al., 2011).
Após a morte dos cardiomiócitos inicia-se o remodelamento miocárdico onde
a matriz extracelular (MEC) é o compartimento mais envolvido.
Estudos têm
demonstrado a participação de colágenos fibrilares, fibronectina e fibroblastos
fenotipicamente transformados (miofibroblastos) na reparação do miocárdio.
Mudanças na quantidade e distribuição dessas estruturas afetam a complacência
miocárdica, com consequente alteração da função sistólica e diastólica (CAULFIELD
& WOLKOWICZ, 1990; CAULFIELD et al., 1992; JANICKI et al., 1995; HELING et
al., 2000; HERPEL et al., 2006; FRANZ et al., 2010).
Os miofibroblastos são células também presentes no remodelamento
miocárdico após lesão, responsáveis pela produção de fibronectina e colágeno.
Estudos demonstram que o aumento na quantidade de miofibroblastos no miocárdio
lesado mantém a complacência miocárdica, evitando a ruptura da área cardíaca
afetada e, consequentemente, mantendo as funções sistólica e diastólica
(PESSANHA et al., 1999; BERNI et al., 2009).
Sabendo-se que os miofibroblastos apresentam características tanto de
fibroblastos quanto de células musculares lisas, a sua presença no miocárdio pode
ser identificada à microscopia eletrônica e pela expressão das células positivas para
a alfa-actina de músculo liso (α-SMA), à imuno-histoquímica. Em um miocárdio
normal, as únicas células positivas para α-SMA devem ser as da musculatura lisa
vascular (PESSANHA et al., 1999).
Estudos em cães, humanos e animais de laboratório demostram a
importância da distribuição dos miofibroblastos na musculatura cardíaca lesada,
9
para a evolução da insuficiência cardíaca, bem como um indicador de melhora frente
às novas modalidades terapêuticas a serem testadas (ZHANG et al., 1998;
SWANEY et al., 2005; HAN et al., 2008; ASAZUMA-NAKAMURA et al., 2009).
A fibronectina é uma proteína da MEC fortemente associada à reparação
miocárdica. Estudos experimentais têm demonstrado que ocorre acúmulo inicial de
fibronectina, associada ao aumento tardio na produção de colágeno (KNOWLTON
et al., 1992). Por meio de técnicas de imuno-histoquímica, o estudo da expressão
dessa
proteína
no
miocárdio
tem
contribuído
para
a
compreensão
do
remodelamento nos diferentes tipos de injúria (FUNK et al., 1997; CHENG et al.,
1999; ORTMANN et al., 2000; HERPEL et al., 2006; LI et al., 2006).
10
3. OBJETIVOS
O presente estudo foi desenvolvido para avaliar a apoptose, presença de
miofibroblastos e de fibronectina nos ventrículos e no septo interventricular, como
possíveis responsáveis pela evolução da insuficiência cardíaca na cardiomiopatia
dilatada induzida com doxorrubicina em coelhos. Também foi realizada uma
comparação desses achados entre o ventrículo esquerdo, septo interventricular e o
ventrículo direito.
3.1 Objetivos específicos
x
Obter os seguintes índices ecodopplercardiográficos após a indução da
cardiomiopatia dilatada com doxorrubicina em coelhos: fração de Ejeção e
fração de encurtamento (como parâmetros de função sistólica), tempo de
relaxamento isovolumétrico, relação E´/A´septal e lateral do ânulo mitral (como
parâmetros de função diastólica) e índice de desempenho miocárdico de TEI
(como parâmetro de função global miocárdica).
x
Descrever o remodelamento miocárdico de coelhos submetidos à indução da
cardiomiopatia dilatada com doxorrubicina mediante microscopia eletrônica de
varredura e de transmissão em miocárdio
x
Comparar a imunodetecção de α-SMA, caspase-3 e fibronectina em fragmentos
de ventrículo direito, septo interventricular e ventrículo esquerdo após a indução
da cardiomiopatia dilatada com doxorrubicina, verificando em qual dessas
regiões anatômicas há maior expressão.
x
Correlacionar as imunodetecções e achados da microscopia eletrônica de
transmissão do ventrículo esquerdo e septo interventricular com os índices
fração de ejeção, fração de encurtamento, tempo de relaxamento isovolumétrico
e índice de TEI.
11
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Locais de realização da pesquisa
O experimento foi conduzido no Laboratório de Cardiologia do Hospital
Veterinário “Governador Laudo Natel”, no Departamento de Patologia Veterinária, no
Laboratório de Microscopia Eletrônica da Faculdade de Ciências Agrárias e
Veterinárias - UNESP, câmpus de Jaboticabal-SP e no Laboratório de Microscopia
Eletrônica da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto- USP.
O estudo foi aprovado pela Comissão de Ética e Bem Estar Animal da
Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – UNESP Jaboticabal (protocolo no
506609).
4.2 Animais
Foram utilizados 25 coelhos da raça Nova Zelândia Branco, adultos, machos
e com peso entre 2,0 e 4,0 kg. Os coelhos foram mantidos em gaiolas individuais de
dimensões de 80cm x 50cm x 35cm, com ração comercial própria para a espécie e
água “ad libitum”. Os animais foram distribuídos aleatoriamente em dois grupos
experimentais, sendo um grupo controle (G1) composto de 10 coelhos e um grupo
tratado (G2) composto de 15 coelhos.
4.3 Indução da cardiomiopatia dilatada com doxorrubicina
O protocolo de indução foi o mesmo utilizado em outros estudos do nosso
grupo de pesquisa (GAVA et al., 2013). A diluição do fármaco1 foi realizada em
capela2 de fluxo laminar própria para manejo de agentes antineoplásicos, até a
concentração de 2 mg/mL. Foram utilizados acessórios de segurança (luvas,
avental, gorro e máscara) durante todas as manipulações e administrações do
fármaco.
1
2
Doxorrubicina 50 mg – Eurofarma ®
Capela de fluxo laminar Filtracom ®
12
Nenhum animal foi anestesiado durante a administração e para correta
imobilização foi utilizado um suporte de contenção. Inicialmente, foi realizada
tricotomia da região auricular para posterior assepsia e o acesso venoso foi obtido
com implantação de scalp3 no 21 na veia auricular e a dose total do fármaco diluído
foi administrada em “bolus”, de forma lenta.
Os animais do grupo G2 receberam doxorrubicina na dose de 1 mg/kg, duas
vezes por semana, por seis semanas (total de 12 administrações) e os animais do
grupo G1 receberam apenas solução fisiológica, seguindo o mesmo protocolo.
4.4 Ecodopplercardiografia
O exame ecodopplercardiográfico foi realizado no dia zero (T0), antes do
início da indução e 45 dias após a primeira administração de doxorrubicina (T45),
três dias após a 12ª administração.
Primeiramente, foi realizada tricotomia da região torácica e a seguir os
animais foram posicionados em decúbito lateral, sem anestesia. Para a realização
da ecodopplercardiografia, empregou-se ecodopplercardiógrafo4 com transdutor
bifrequencial 7,5 – 10 MHz.
Com o animal posicionado em decúbito lateral direito, localizou-se a janela
paraesternal direita, obtendo-se, inicialmente, o eixo longo. Com a visibilização
bidimensional do ventrículo esquerdo em eixo curto, obteve-se a imagem em modoM, posicionando o cursor equidistante dos músculos papilares, em plano cordal. A
partir dessa imagem, foram obtidos os seguintes parâmetros: espessamento do
septo interventricular em diástole (ESIVd); diâmetro interno do ventrículo esquerdo
em diástole (DIVEd), espessamento da parede livre do ventrículo esquerdo em
diástole (EPLVEd),
espessamento do septo interventricular em sístole ESIVs,
diâmetro interno do ventrículo esquerdo em sístole (DIVEs) e espessamento da
parede livre do ventrículo esquerdo em sístole (EPLVEs), fração de ejeção (FEJ) e
fração de encurtamento (FEC).
Posteriormente, os animais foram posicionados em decúbito lateral esquerdo,
para obtenção da imagem apical. Para a mensuração do tempo de relaxamento
3
4
BD (Becton, Dickinson and Company)
My Lab 30 Gold Vet.®
13
isovolumétrico (TRIV), o cursor do Doppler pulsado foi posicionado equidistante
entre a via de saída do ventrículo esquerdo e o fluxo transmitral. Determinou-se o
tempo desde o término do fluxo transaórtico até o início do enchimento ventricular
rápido (onda E).
Para o cálculo do índice de desempenho miocárdico de Tei (ITEI), mensurouse o intervalo entre o término do espectro da onda A mitral e o início da onda E
mitral subsequente. Desse valor, subtraiu-se o tempo de ejeção do ventrículo
esquerdo (TEVE), sendo o resultado dividido pelo próprio TEVE (TEI et al., 1995).
O Doppler tecidual do VE foi realizado na imagem apical quatro câmaras com
a amostra de volume posicionado às margens septal e lateral do anel mitral e
tricúspide, para a mensuração das medidas e velocidade tecidual na fase de
enchimento rápido (E´) e a velocidade de enchimento na fase de contração atrial
(A´). A partir disso foi calculada a relação E´/A´.
4.5 Eutanásia e coleta de material
A eutanásia dos animais foi realizada de acordo com a Resolução no 1000 do
CFMV, de 11 de Maio de 2012, indicada pela Comissão de Ética no Uso de Animais
da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – UNESP Jaboticabal.
Inicialmente, foi realizada injeção de propofol5, seguida de cloreto de potássio6.
Imediatamente,
foram
colhidos
fragmentos
do
ventrículo
direito,
septo
interventricular e ventrículo esquerdo, fixados em solução de formol7 a 10%
tamponado com fosfatos, pH 7,6 para confecção de lâminas para imunohistoquímica. Também foram colhidos fragmentos do ventrículo direito, septo
interventricular e ventrículo esquerdo fixados em glutaraldeído8 3% por 3 horas a 4o
C e, posteriormente, transferidos para solução de tampão fosfato 0,1M a 4o C, para
processamento no Laboratório de Microscopia Eletrônica da Faculdade de Ciências
Agrárias e Veterinárias - UNESP, câmpus de Jaboticabal-SP e no Laboratório de
Microscopia Eletrônica da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto- USP.
5
Propovan 10mg/ml, Cristália®
Cloreto de Potássio 19,1% Equiplex®
7
Formoldeído P.A., Sinth®
8
Glutaraldeido 25%, Merck®
6
14
4.6 Microscopia eletrônica de transmissão
Após a lavagem com tampão fostato 0,1M a 4oC, o material destinado a
microscopia eletrônica de transmissão foi pós-fixado em tetróxido de ósmio a 0,1%
com tampão fostato 0,1M, pH 7,3 por 2 horas a 4o C.
As amostras foram desidratadas em uma sequência crescente de acetona:
30%, 50%, 70%, 90% e 95%, por 15 minutos (uma única vez) e a 100%, por 20
minutos (três vezes). O material foi infiltrado com resina araldite (1 parte de resina: 1
parte de acetona) à temperatura ambiente por 48 horas. Após esse procedimento,
foi adicionado resina pura com os frascos abertos a 40º por 2 horas. A inclusão e
polimerização foram realizadas a 60º C, por 72 horas. Após esse período, o material
foi aparado, realizando-se cortes de 0,5 µm de espessura, corados com azul de
toluidina a 1% para observação em microscopia de luz. Por último, foram realizados
os cortes ultrafinos (70nm) e contrastados com acetato de uranila saturado e citrato
de chumbo.
As grades contrastadas foram observadas em microscópio eletrônico de
transmissão9 e fotografadas com sistema digital10. Foram registradas três imagens
de cada fragmento (VD, SIV e VE) de cada animal em aumento de 15000x para
contagem do número de mitocôndrias com lesão. A contagem foi realizada
empregando-se o programa Micrometrics SE Premium. O resultado final do número
de mitocôndrias alteradas em cada fragmento foi obtido a partir do cálculo da média
das contagens nas três imagens.
4.7 Microscopia eletrônica de varredura
Após a lavagem com tampão fostato 0,1M, o material destinado a microscopia
eletrônica de varredura foi pós-fixado em tetróxido de ósmio a 0,1%, pH 7,4 por 2
horas a 4oC, com posterior lavagem em tampão fostato. A desidratação foi realizada
em uma sequência crescente de álcoois: 30%, 50%, 70%, 90% por 20 minutos (uma
única vez) e a 100% por 20 minutos (três vezes).
9
JEOL - JEM 1010
AMT Advantage câmera, System V2.25.5, KODAK 141
10
15
A secagem das amostras ao ponto crítico foi realizada em aparelho EMS®
850 e posteriormente metalizadas com átomos de ouro em aparelho DESK II 11 e
examinadas em microscópio eletrônico de varredura12 operando com feixe de
elétrons a 15 kV. Realizou-se análise descritiva das imagens obtidas.
4.8 Imuno-histoquímica
As imunodetecções de células apoptóticas, miofibroblastos e fibronectina
foram feitas em cortes dos miocárdios incluídos em parafina, por meio da técnica de
imuno-histoquímica (Tabela 1). As lâminas foram desparafinizadas em estufa 60ºC
por uma hora, seguida de dois banhos em xilol (10 minutos cada) e passagens em
soluções de álcoois. Após a desparafinização e banhos em álcool, todos os passos
foram precedidos por lavagem em água deionizada e solução tampão Tris HCL (pH
7,4).
Para a imunomarcação de caspase (apoptose), a recuperação antigênica foi
realizada pelo calor, utilizando-se câmara de pressão Pascal13 em solução tampão
de citrato de sódio 10 mM (pH 6,0). Para a imunodetecção da α-SMA e da
fibronectina, optou-se por não realizar a recuperação antigênica.
Os passos seguintes foram similares para os três anticorpos. O bloqueio da
peroxidase endógena foi feito com peróxido de hidrogênio 30 volumes, adicionado
ao álcool metílico, com concentração final da solução de 8%, com incubação de 30
minutos. Em seguida, fez-se o bloqueio de proteínas inespecíficas com produto
comercial (Protein Block, DAKO, cód. X0909), por 30 minutos, à temperatura
ambiente e com leite em pó14 a 3,0% por 60 minutos. A incubação dos anticorpos
primários foi feita em câmara úmida, por 18 horas, à temperatura de 4ºC com
exceção da caspase, com incubação em temperatura ambiente (37ºC) por 2 horas.
Para a imunodetecção de α-SMA, usou-se anticorpo monoclonal anti-α-SMA
produzido em camundongo (DBS, cód. MOB 001) na diluição de 1:600. Para a
caspase, empregou-se o anticorpo caspase-3 clivada policlonal produzido em coelho
11
DESK® II Deton vaccun NJ, EUA
JEOL® - JSM 5410 Tokyo-Japão
13
Câmara de Pressão Pascal, DakoCytomation
14
Leite em pó MOLICO®
12
16
(Biocare Medical, cód. CP229), na diluição de 1:1200. Para a fibronectina utilizou-se
anticorpo monoclonal fibronectina produzido em camundongo (DBS, cód. Mob 300),
na diluição de 1:900. Como complexo secundário utilizaram-se polímeros ligados a
peroxidase (Kit Advance HRP, Dako, cód. K4068), segundo protocolo do fabricante.
Para a revelação da reação utilizou-se o cromógeno diaminobenzidina (DAB, Dako,
cód. K3468), por três minutos por lâmina.
A contra coloração foi feita com Hematoxilina de Harris, por 30 segundos,
com posterior lavagem em água corrente, seguida de desidratação em soluções
crescentes de álcoois e xilol e montagem com Entellan (Merk, cód. HX888585).
Como controle negativo optou-se por excluir o anticorpo primário da reação.
Tabela 1. Protocolo de imuno-histoquímica utilizado para os anticorpos: α- SMA,
caspase e fibronectina em miocárdio de coelhos após o tratamento com
doxorrubicina. Unesp, Jaboticabal, SP (2014).
α-SMA
Especificação
Espécie de
origem
Diluição
Recuperação
antigênica
Incubação dos
anticorpos
Caspase
Fibronectina
Caspase 3
Fibronectina
DBS, cód. MOB 001)
(policlonal, Biocare
Medical, cód. CP229)
(monoclonal, DBS, cód.
Mob 300)
Camundongo
Coelho
Camundongo
1:600
1:1200
Calor (Câmara de
Pressão Pascal)
Câmara úmida (2
horas à 37oC)
1:900
α-SMA (monoclonal,
Câmara úmida (18
horas à 4oC)
Câmara úmida (18
horas à 4oC)
DBS: Diagnostic Biosystems; cód. : Código; DAB: diaminobenzidina;
Todas as lâminas foram fotografadas em cinco campos aleatórios (objetiva de
40x para α-SMA e Caspase 3; objetiva de 10x para fibronectina). As imagens obtidas
com a imunodetecção de células apoptóticas e de miofibroblastos foram submetidas
ao programa Micrometrics SE Premium15 para contagem do número de células
marcadas. O resultado final de cada lâmina foi obtido a partir do cálculo da média do
número de células marcadas nas cinco imagens. Para o anticorpo fibronectina as
imagens foram submetidas ao programa Image-Pro plus16 para cálculo da
porcentagem da área marcada, uma vez a essa marcação ocorreu na matriz
15
16
TM
Micrometrics SE Premium, versão 2.8
Image-Pro plus ®, versão 6.0
17
extracelular. O resultado de cada lâmina foi obtido a partir do cálculo da média das
porcentagens de áreas marcadas nas cinco imagens.
4.9 Estatística
Os valores referentes aos parâmetros ecodopplercardiográficos foram
submetidos à análise de variância e as médias foram comparadas empregando-se
teste de Tukey com 5% de probabilidade, para comparação entre os grupos no T0 e
no T45.
A contagem de células positivas para a caspase (células apoptóticas) e
α-SMA (miofibroblastos), porcentagem de área marcada para fibronectina e número
de mitocôndrias alteradas em cada região analisada (VD, SIV e VE) foram
submetidos à análise de variância e as médias foram comparadas empregando-se o
teste de Tukey com 5% de probabilidade para comparação entre as regiões e entre
os grupos.
Empregou-se a correlação de Pearson a 5 % de probabilidade, entre os
resultados
da
imuno-histoquímica
(células
apoptóticas,
miofibroblastos
e
fibronectina) e os parâmetros ecodopplercardiográficos (fração de ejeção, fração de
encurtamento, índice de TEI e tempo de relaxamento isovolumétrico).
Foram utilizados os programas “AgroEstat”, versão 1.1.0.696 e “SAS”, versão
9.0.
18
5. RESULTADOS
5.1 Mortalidade
Não houve óbito nos animais do grupo G1 durante toda a indução, todavia, no
grupo G2 foram registrados 33% (n=5) de mortalidade, sendo que esses óbitos
ocorreram a partir de 30 dias do início da administração da doxorrubicina.
5.2 Ecodopplercardiografia
Os valores dos parâmetros ecodopplercardiográficos (média ± EP) no T0 e no
T45 encontram-se representados na Tabela 2.
Pode ser notada dilatação das câmaras cardíacas na maioria dos animais
tratados com doxorrubicina com a análise subjetiva das imagens ecocardiográficas
pelo modo bidimensional no T45 (Figura 1).
Houve diminuição significativa da espessura do septo interventricular na
sístole, na comparação entre os grupos no T45. Ocorreu aumento significativo no
diâmetro interno do ventrículo esquerdo em sístole, na comparação entre os grupos
no T45 e na comparação dos animais tratados nos dois momentos avaliados.
O espessamento da parede livre na sístole foi significativamente menor nos
animais tratados no T45. Isso ocorreu tanto na comparação entre os grupos nesse
tempo, quanto na comparação entre os tempos do grupo tratado.
A fração de encurtamento, fração de ejeção e tempo de relaxamento
isovolumétrico foram significativamente menores no T45 na comparação entre os
grupos e também na comparação entre os tempos nos animais tratados.
Não houve diferença entre os grupos e entre os tempos para o índice de
desempenho miocárdico de Tei (ITEI).
Com relação ao Doppler tecidual, os animais tratados apresentaram relação
E´/A´ <1 nos ânulos lateral e septal da válvula mitral no T45.
19
Tabela 2. Valores dos parâmetros ecodopplercardiográficos (média ± EP) obtidos
de coelhos submetidos ao tratamento com doxorrubicina. Unesp, Jaboticabal, SP
(2014).
Momento de avaliação
Parâmetro
ESIVs
ESIVd
DIVEs
DIVEd
EPLVEs
EPLVEd
FEC
FEJ
ITEI
TRIV
E´/A´ septal
E´/A´ lateral
T0
T45
G1
4,33 ± 0,17aA
4,95 ± 0,36aA
G2
4,51 ± 0,15aA
4,19 ± 0,17aB
G1
3,13 ± 0,0,12aA
3,25 ± 0,10aA
G2
3,42 ± 0,07aA
3,41 ± 0,13aA
G1
9,08 ± 0,28aA
9,16 ± 0,47aA
G2
8,86 ± 0,26aA
10,25 ± 0,44bB
G1
14,39 ± 0,36aA
14,76 ± 0,51aA
G2
14,05 ± 0,34aA
13,05 ± 0,53aA
G1
4,26 ± 0,07aA
4,37 ± 0,09aA
G2
4,54 ± 0,12aA
3,45 ± 0,14bB
G1
3,03 ± 0,18aA
3,07 ± 0,13aA
G2
3,45 ± 0,20aA
3,35 ± 0,08aA
G1
37,06 ± 0,83aA
38,26 ± 1,45aA
G2
36,82 ± 0,92aA
21,36 ± 0,76bB
G1
70,56 ± 1,08aA
71,86 ± 1,73aA
G2
70,63 ± 1,23aA
47,14 ± 1,34bB
G1
0,48 ± 0,03aA
0,48 ± 0,04aA
G2
0,41 ± 0,05aA
0,52 ± 0,14aA
G1
53,95 ± 2,39aA
50,44 ±3,2aA
G2
47,18 ± 3,82aA
34,08 ± 2,75bB
G1
1,29±0,16
1,34±0,08
G2
1,82±0,15
0,95±0,14#
G1
1,62±0,13
1,69±0,18
G2
1,82±0,16
0,98±0,08#
G1: Grupo controle; G2: Grupo tratado com doxorrubicina. ESIVs: espessura do septo interventricular em sístole (mm);
ESIVd: espessura do septo interventricular em diástole (mm); DIVEs: diâmetro interno do ventrículo esquerdo em sístole
(mm); DIVEd: diâmetro interno do ventrículo esquerdo em diástole (mm); EPLVEs: espessura da parede livre do ventrículo
esquerdo em sístole (mm); EPLVEd: espessura da parede livre do ventrículo esquerdo em diástole (mm); FEC: fração de
encurtamento (%); FEJ: Fração de ejeção (%); ITEI: índice de performance miocárdica de Tei; TRIV: tempo de relaxamento
isovolumétrico (mseg); E´: velocidade tecidual na fase de enchimento rápido; A´: velocidade de enchimento na fase de
contração atrial.
Letras minúsculas diferentes na mesma linha indicam diferença significativa (p<0,05) entre os tempos.
Letras maiúsculas diferentes na mesma coluna indicam diferença significativa (p<0,05) entre os grupos.
#Presença de disfunção diastólica: E´/A´ < 1,0.
20
Figura 1. Imagem ecocardiográfica em modo “M” do
ventrículo esquerdo (eixo curto) de coelho submetido ao
tratamento com doxorrubicina (G2) no T0 (A) e no T45 (B)
(mesmo indivíduo). EF= Fração de ejeção; FS= Fração de
encurtamento. Unesp, Jaboticabal, SP (2014).
21
5.3 Microscopia eletrônica de transmissão
No grupo controle, verificou-se que as fibras cardíacas foram preservadas. O
padrão de distribuição característico das mitocôndrias no sarcoplasma do miocárdio
normal foi colunar (Figuras 2A e 2B). O sarcoplasma foi preenchido por miofibrilas
bem alinhadas e o aspecto das cristas mitocondriais foi digitiforme (Figura 2C).
O sarcômero continha normalmente as bandas I e A. A banda I é um
segmento do sarcômero que inclui a linha Z. A banda A corresponde à maior porção
do sarcômero e é composta por uma banda menor, denominada H e pela linha M
(Figura 2D).
Nos animais tratados com doxorrubicina, houve sobreposição das linhas Z e
encurtamento do sarcômero, miocitólise e formação de edema. Outro aspecto foi a
tumefação do sarcoplasma, com organelas dissociadas em seu interior (Figura 3A).
No espaço extracelular, verificaram-se presença de fibroblastos e fibras colágenas
(Figura 3B).
Ocasionalmente, foram observadas fibras apoptóticas caracterizadas por
núcleo eletrodenso, degeneração das mitocôndrias e manutenção da integridade da
membrana citoplasmática (Figura 3C). Verificou-se também, a presença de capilares
que ocasionalmente mostravam tumefação e vacuolização do citoplasma das células
endoteliais (Figura 3D).
No miocárdio dos animais tratados com doxorrubicina, o aspecto mais
evidente foi o aumento do número das mitocôndrias alteradas, aglomeradas no
sarcoplasma. Na maioria dos animais, estas se fundiam formando grandes vacúolos.
Verificaram-se tumefação e lise das cristas mitocondriais e redução das miofibrilas,
com perda de definição das linhas Z, banda A e I (Figura 4).
Houve diferença significativa na contagem de mitocôndrias alteradas na
comparação entre os grupos nas três regiões estudadas. O número de mitocôndrias
alteradas foi significativamente maior no ventrículo direito e no septo interventricular,
comparativamente ao ventrículo esquerdo, nos animais tratados. As médias ± errospadrão do número de mitocôndrias alteradas estão representadas na Tabela 3.
22
Figura 2. Micrografia eletrônica de transmissão de miocárdio de coelhos do grupo controle. A)
Ventrículo direito: presença de fibras cardíacas contendo mitocôndrias (setas) em distribuição colunar
no sarcoplasma e presença de um vaso sanguíneo (V) (4.646x); B) Septo interventricular:
evidenciação das linhas Z (Z) no sarcômero. (4.646x); C) Ventrículo esquerdo: verifica-se o aspecto
digitiforme das cristas mitocondriais (seta) (16.700x); D) Ventrículo esquerdo: evidenciando a
estrutura sarcômero, composto pela banda I (a qual inclui a linha Z), banda A (que inclui a banda H e
a linha M) (46.460x). Unesp, Jaboticabal, SP (2014).
23
Figura 3. Micrografia eletrônica de transmissão de miocárdio de coelhos tratados com doxorrubicina.
A) Ventrículo esquerdo: presença de miocitólise e espessamento das linhas Z (hipercontração, setas),
com dissociação e fragmentação de fibras miocárdicas e presença de edema (E) (2.784x); B) Septo
interventricular: presença de um fibroblasto (F) no interstício, entre fibras cardíacas degeneradas (*)
e saudáveis (seta) (6000x); C) Ventrículo direito: fibra apoptótica (FA), com núcleo eletrodenso,
degeneração das mitocôndrias e preservação da membrana citoplasmática (7.750x); D) Septo
interventricular: endotélio degenerado (setas), com formação de grandes vacúolos citoplasmáticos (V)
(6000x). Unesp, Jaboticabal, SP (2014).
24
ME
Figura 4. Micrografia eletrônica de transmissão de miocárdio de coelhos tratados com doxorrubicina.
A: Ventrículo direito: aumento do número de mitocôndrias, com lise das cristas e formação de
grandes vacúolos (V) (6.000x); B: Ventrículo direito: perda do aspecto digitiforme das cristas (seta)
(6.000x); C: Ventrículo direito: aumento da matriz extracelular (ME) (12.930x); D: Ventrículo esquerdo:
lise das cristas e fusão das mitocôndrias (*) (15.000x). Unesp, Jaboticabal, SP (2014).
25
Tabela 3. Valores das contagens de mitocôndrias alteradas (média ± EP) em
coelhos após o tratamento com doxorrubicina. Unesp, Jaboticabal, SP (2014).
Região
VD
SIV
VE
Mitocôndrias
G1
8,06±1,93aA
0,88±0,26aA
1,76±0,82aA
alteradas
G2
22,83±3,45aB
19,93±1,37aB
12,13±2,49bB
G1: Grupo controle; G2: Grupo tratado com doxorrubicina; VD:Ventrículo direito; SIV: Septo interventricular; VE:Ventrículo
esquerdo.
Letras minúsculas diferentes na mesma linha indicam diferença significativa (p<0,05) entre as regiões
Letras maiúsculas diferentes na mesma coluna indicam diferença significativa (p<0,05) entre os grupos.
5.4 Microscopia eletrônica de varredura
A microscopia eletrônica de varredura mostrou fibras cardíacas intactas,
alinhadas e sem alterações nas amostras do grupo controle (Figura 5A).
No miocárdio dos animais tratados pode-se observar alteração na
conformação das fibras musculares, com dissociação a ruptura de cardiomiócitos
(Figuras 5B e 5D). A matriz extracelular adjacente às fibras cardíacas apresentou-se
aumentada (Figuras 5C e 5D) e, por vezes, com severa dissociação e ruptura de
fibras colágenas, formando cavitações ou espaços vazios no miocárdio (Figura 5B).
As mesmas características foram visibilizadas qualitativamente no ventrículo
direito, septo interventricular e ventrículo esquerdo.
26
*
*
Figura 5. Micrografia eletrônica de varredura de miocárdio de coelhos. A: Ventrículo esquerdo de
animal do grupo controle. Notar a distribuição uniforme e alinhada das fibras musculares cardíacas.
(500x); B: Ventrículo esquerdo de coelho submetido ao tratamento com doxorrubicina. Notar a
fragmentação e desorganização dos cardiomiócitos (seta vermelha) e fragmentação das fibras
colágenas adjacentes (seta branca), formando espaços-vazios entre as fibras musculares (*) (500x);
C: Septo interventricular de coelho submetido ao tratamento com doxorrubicina. Observar o aumento
da matriz extracelular (seta amarela) (1000x); D: Ventrículo direito de coelho submetido ao tratamento
com doxorrubicina (1000x). Presença de dissociação das fibras cardíacas por aumento da matriz
extracelular (*). Unesp, Jaboticabal, SP (2014).
27
5.5 Imuno-histoquímica
Sabendo-se que células do músculo liso expressam α-SMA, os animais do
grupo controle apresentaram forte marcação para esse anticorpo na parede vascular
que foi considerada como controle positivo interno do anticorpo (Figura 6A).
Diferentemente dos animais tratados, que apresentaram células com citoplasma
intensamente marcado e formato alongado, entre os cardiomiócitos, caracterizando
os miofibroblastos (Figura 6B). Houve diferença significativa na contagem dos
miofibroblastos nos animais tratados com doxorrubicina na comparação com os
animais do grupo controle. A comparação entre as regiões estudadas não revelou
diferença significativa.
A imunodetecção para caspase-3 revelou fibras com núcleo picnótico,
membrana citoplasmática íntegra, caracterizando a apoptose. A marcação foi
predominantemente citoplasmática. (Figuras 6C e 6D). Houve diferença significativa
na contagem de células apoptóticas nos animais tratados com doxorrubicina, em
comparação com os animais do grupo controle. A comparação entre as regiões
estudadas não revelou diferença significativa.
Sendo a fibronectina uma proteína da matriz extracelular (Figuras 6E e 6F), a
sua imunodetecção foi avaliada por área de marcação no corte histológico. As áreas
positivas para fibronectina no interstício miocárdico foram discretas, porém houve
maior imunodetecção nos animais tratados com doxorrubicina, em comparação com
os do grupo controle, no septo interventricular e no ventrículo esquerdo. Não houve
diferença na imunodetecção de fibronectina entre os grupos, no ventrículo direito. A
comparação entre as regiões estudadas não revelou diferença significativa.
As médias das contagens de miofibroblastos, células apoptóticas e a
porcentagem de área marcada para fibronectina estão representadas na Tabela 4.
28
Figura 6. Imuno-histoquímica de miocárdio de coelhos. A e B: α-SMA; C e D: caspase; E e F:
fibronectina. A: Ventrículo direito de animal do grupo controle: notar marcação da α-SMA somente ao
redor dos vasos (setas) (controle positivo, Obj. 10x); B: Septo interventricular de coelho submetido ao
tratamento com doxorrubicina: presença de miofibroblastos na matriz extracelular (seta / Obj. 40x); C:
Ventrículo esquerdo com ausência de imunomarcação para apoptose (grupo controle, Obj. 40x); D:
Septo interventricular de coelho submetido ao tratamento com doxorrubicina: marcação de fibras
apoptóticas (setas pontilhadas). Notar picnose nuclear e citoplasma positivo para caspase-3 clivada
(Obj. 40x); E: Ventrículo direito negativo para fibronectina (grupo controle, Obj 40x); F: Ventrículo
direito de coelho submetido ao tratamento com doxorrubicina: aumento da imunodetecção de
fibronectina na matriz extracelular (* / Obj. 40x). Complexo de polímeros ligados a peroxidase. Unesp,
Jaboticabal, SP (2014).
29
Tabela 4. Valores das contagens de células imunomarcadas para α-SMA
(miofibroblastos) e Caspase 3 (apoptose) e porcentagem de marcação de fibronectina
(média ± EP) em coelhos após o tratamento com doxorrubicina. Unesp, Jaboticabal, SP
(2014).
Região
Anticorpo
VD
SIV
VE
G1
0,26±0,09aA
0,82±0,29aA
0,91±0,39aA
G2
6,54±1,51aB
5,72±1,39aB
5,11±0,79aB
G1
2,48±0,69aA
2,2±0,76aA
2,0±0,54aA
G2
25,15±2,96aB
25,31±3,63aB
24,94±3,53aB
Fibronectina
G1
0,51±0,24aA
1,09±0,31aA
1,33±0,51aA
(%)
G2
3,35±1,62aA
5,04±1,62aB
5,74±1,90aB
α-SMA
Caspase
G1: Grupo controle; G2: Grupo tratado com doxorrubicina; VD: Ventrículo direito; SIV: Septo interventricular; VE: Ventrículo
esquerdo. Letras minúsculas diferentes na mesma linha indicam diferença significativa (p<0,05) entre as regiões; Letras
maiúsculas diferentes na mesma coluna indicam diferença significativa (p<0,05) entre os grupos pelo teste de Tukey.
5.6 Correlações
O número de mitocôndrias alteradas no septo interventricular e no ventrículo
esquerdo apresentou correlação negativa significativa com os parâmetros de função
sistólica (fração de ejeção e fração de encurtamento) (Figura 7). O número de
mitocôndrias alteradas no septo interventricular apresentou correlação com o TRIV,
mas não com o Índice de Tei.
A contagem de células apoptóticas no septo interventricular e no ventrículo
esquerdo apresentou correlação negativa significativa com os índices de função
sistólica (fração de ejeção e fração de encurtamento) (Figura 8). Quanto mais fibras
apoptóticas, menor é a função sistólica em coelhos tratados com doxorrubicina. Não
houve correlação significativa na imunodetecção da caspase, com os parâmetros
TRIV e Índice de Tei.
A imunodetecção dos miofibroblastos no septo interventricular e no ventrículo
esquerdo apresentou correlação negativa significativa com a fração de ejeção e de
encurtamento, revelando que quanto mais miofibroblastos presentes, menor foi a
30
função sistólica de coelhos tratados com doxorrubicina (Figura 9). Não houve
correlação dessa expressão com os parâmetros TRIV e Índice de Tei.
A
imunodetecção
da
fibronectina
na
matriz
extracelular
do
septo
interventricular e do ventrículo esquerdo não apresentou correlação significativa com
nenhum parâmetro ecodopplercardiográfico.
Figura 7. Correlações dos índices ecodopplercardiográficos (Fração de ejeção e Fração de
encurtamento) com o número de mitocôndrias alteradas no septo interventricular (SIV) e no
ventrículo esquerdo (VE). Correlação de Pearson (P<0,05). Unesp, Jaboticabal, SP (2014).
31
Figura 8. Correlações dos índices ecodopplercardiográficos (Fração de ejeção e Fração de
encurtamento) com o número de células apoptóticas no septo interventricular (SIV) e no ventrículo
esquerdo (VE). Correlação de Pearson (P<0,05). Unesp, Jaboticabal, SP (2014).
Figura 9. Correlações dos índices ecodopplercardiográficos (Fração de ejeção e Fração de
encurtamento) com o número de miofibroblastos no septo interventricular (SIV) e no ventrículo
esquerdo (VE). Correlação de Pearson (P<0,05). Unesp, Jaboticabal, SP (2014).
32
6. DISCUSSÃO
Os índices de mortalidade encontrados nesse estudo confirmam o potencial
tóxico da doxorrubicina em coelhos, contudo a administração de 1 mg/kg duas vezes
na semana mostrou-se passível de realização, sem alto índice de mortalidade,
permitindo avaliações fidedignas no final do experimento. Tal fato corrobora outros
trabalhos utilizando doxorrubicina em coelhos (JAENKE et al., 1980; ARNOLDA et
al., 1985; CHEN et al., 2010; GAVA et al., 2013).
A mortalidade dos animais pode ser explicada pelo grande potencial tóxico do
fármaco em diversos sistemas. Mielossupressão, nefrotoxicidade e hepatotoxicidade
são outros efeitos colaterais determinantes para o uso da doxorrubicina. As
antraciclinas produzem radicais livres altamente reativos, capazes de lesar
membranas celulares e o DNA. Assim, pode exercer toxicidade em diversos órgãos,
tempo e dose-dependente (DIAS et al., 2003; DAGLI & LUCAS, 2006).
O aumento das câmaras cardíacas, as diminuições da fração de
encurtamento e de ejeção visibilizadas na ecodopplercardiografia, confirmaram a
eficiência desse exame para detecção das alterações da cardiomiopatia dilatada
induzida pela doxorrubicina em coelhos. Essas mesmas alterações também foram
observadas por LU et al. (2006) e CHEN et al. (2010) em coelhos submetidos ao
tratamento com esse mesmo fármaco.
Esses achados refletem a diminuição da função sistólica ocorrida após
exposição cumulativa à doxorrubicina. Com
essas
alterações
funcionais
encontradas nos animais do grupo tratado com doxorrubicina, notou-se claramente
que a cardiotoxicidade foi dose-dependente. Quando a dose cumulativa do fármaco
atingiu 12 mg de doxorrubicina/kg no T45 (6 semanas), os coelhos já apresentaram
alterações na função sistólica, com valores abaixo dos estabelecidos para a espécie
(STYPMANN et al., 2007; GAVA et al., 2013).
A diminuição da contratilidade cardíaca observada demonstra a grande
sensibilidade que o miocárdio dos coelhos apresenta à exposição ao fármaco e a
rapidez de indução da CMD nesses animais. O mesmo fato ocorreu em estudo
realizado em cães (SOUZA & CAMACHO, 2006), porém, a indução exigiu um tempo
33
maior (12 semanas), uma vez que a droga pode ser administrada somente a cada 21
dias na espécie canina.
Pelo fato da espécie utilizada apresentar frequência cardíaca alta, a análise
diastólica por meio do fluxo transmitral é prejudicada devido à presença de fusão das
ondas E e A nos fluxos transvalvares átrio-ventriculares (FONTES-SOUZA et al.,
2009). A sedação para o exame não é indicada, pois vários autores referem à
fragilidade dessa espécie frente a certos fármacos anestésicos e a susceptibilidade
de alteração dos parâmetros ecodopplercardiográficos (FONTES-SOUZA et al.,
2009; STYPMANN et al., 2007). Por isso, a análise diastólica foi realizada com o
TRIV e o Doppler tecidual do VE, sem sedação.
O presente estudo infere que o tratamento com doxorrubicina gera disfunção
diastólica, com base nos parâmetros avaliados. A inversão do TRIV e da relação
E´/A´ lateral e septal do anel mitral também já foram observados em ratos, cães e
humanos tratados com doxorrubicina (MYRENG & SMISETH, 1990; NEILAN, et al.,
2006; TASSAN-MANGINA et al., 2006; SOUSA, 2007). Além disso, sabe-se que a
diástole é extremamente dependente de ATP, produzido pelas mitocôndrias, as
quais se apresentaram com alterações importantes detectadas na microscopia
eletrônica de transmissão (KAPILA & MAHAJAN, 2009).
Com o avanço da tecnologia, compreende-se que a análise da função
diastólica é complexa e que deve ser utilizado um conjunto de fatores para sua
conclusão, como técnicas mais modernas de Doppler tecidual (Strain e Strain Rate),
as quais não estavam disponíveis no momento desse estudo (FONTES-SOUZA et
al., 2009; SIGNOLET et al, 2009). Salgado et al. (2014) citam que as alterações da
função diastólica, encontradas com o Doppler tecidual, precedem à diminuição da
função sistólica, salientando a importância dessa avaliação em pessoas submetidas
ao tratamento com doxorrubicina.
Sabendo-se que o índice de performance miocárdica (ITEI) não é influenciado
pela frequência cardíaca e pode ser utilizado seguramente para análise conjunta da
função sistólica e diastólica (TEI et al., 1995). Nesse estudo, esse parâmetro não
apresentou diferença significativa, discordando dos achados em cães obtidos por
SOUSA (2007). Em seres humanos tratados com doxorrubicina, há alteração do ITEI
em crianças (ISHII et al., 2000; EIDEM et al., 2001), mas não em adultos (ROHDE et
34
al., 2007). Assim, esses fatos demonstraram que se deve ter cautela no momento da
avaliação desse índice ecodopplercardiográfico de forma isolada, devido às
variações nas respostas inter e intraespecíficas frente à terapia com doxorrubicina.
A microscopia eletrônica de varredura foi uma ferramenta útil para a avaliação
dos danos gerados pela doxorrubicina no miocárdio de coelhos. Porém, essa técnica
permitiu apenas uma avalição qualitativa e os achados de alteração na conformação
das fibras musculares e dissociação dos cardiomiócitos também já foram
visibilizados em estudos com outras cardiopatias (GOLDSMITH et al., 2000; ELMORSY et al., 2007).
Os animais do grupo controle apresentaram ultraestrutura do miocárdio
normal, compatível com outros trabalhos em coelhos e em outras espécies
(WHEREAT et al., 1969; SCHAPER et al., 1985). Apesar de ser uma técnica
onerosa e de difícil acesso, a microscopia eletrônica de transmissão mostrou-se útil
para a descrição das lesões do miocárdio causadas pela doxorrubicina.
A alteração na morfologia das mitocôndrias foi o achado mais importante e
permitiu inferir que a lesão mitocondrial participa do processo de insuficiência
cardíaca gerada pela doxorrubicina, uma vez que a contagem de mitocôndrias
lesadas apresentou correlação significativa com a diminuição da função sistólica.
Essas lesões também foram descritas qualitativamente por Zhou et al. (2001) em
modelo experimental com ratos.
GREEN & LEEUWENBURGH (2002) em estudo in vitro descreveram que a
lesão nessa organela pode ser explicada devido ao acúmulo da droga nas
mitocôndrias,
com
formação
de
radicais
livres,
reações
de
peroxidação,
degeneração das mitocôndrias, alterações estruturais e funcionais no miócito,
formação de vacúolos, perda dos miofilamentos e atrofia progressiva das miofibrilas.
Essas alterações estruturais também foram observadas no estudo em tela.
Com isso, pode-se inferir que a doxorrubicina causou um stress oxidativo nas
mitocôndrias com a liberação de substâncias pró-apoptóticas, iniciando a ativação
da cascata das caspases (Figura 10). Através da imuno-histoquímica, constatou-se
nesse trabalho, um grande número de células apoptóticas, imunodetectadas pela
expressão da caspase-3. Essa detecção também foi utilizada recentemente por Lee
35
et al. (2014) em ratos Fisher submetidos ao tratamento com doxorrubicina e
posterior terapia gênica.
Figura 10. Apoptose por via mitocondrial. Após um stress oxidativo,
ocorre aumento da permeabilidade da membrana das mitocôndrias,
com liberação de citocromo C e proteínas pró-apoptóticas (fator
indutor de apoptose), ativação da cascata das caspases e a morte
celular por apoptose. Fonte: Arquivo pessoal.
As correlações significativas da imunodetecção da caspase 3 no septo
interventricular e na parede livre do ventrículo esquerdo com as frações de ejeção e
encurtamento, denotam a importância desse mecanismo de morte celular como
causador de diminuição da função sistólica (Figura 11). Esses achados corroboram
os descritos por Garg et al. (2005), que descreveram a importância de estudos
clínicos associando a apoptose como geradora de insuficiência cardíaca, nas
diversas cardiopatias.
Sabendo-se disso, iniciou-se uma busca científica intensa por novas terapias,
como novos fármacos, células tronco e terapias gênicas, que possam amenizar a
apoptose miocárdica nas diversas cardiomiopatias em animais e em seres humanos
(YAOITA et al., 1998; KOGLIN et al., 1999; LEE et al., 1999; LI et al., 1997; YAN et
al., 2007; LEE et al., 2014). Tendo em vista a importância da apoptose na
cardiomiopatia dilatada induzida com doxorrubicina, o estudo em tela serve como
36
base para novas pesquisas, com terapias que possam minimizar a apoptose gerada
por esse fármaco no miocárdio.
Figura 11. Esquema representativo da fisiopatogenia da indução da cardiomiopatia dilatada com
doxorrubicina. A administração crônica do fármaco gera um stress oxidativo, alterando a
permeabilidade da membrana mitocondrial. Ocorre liberação de fatores pró-apoptóticos das
mitocôndrias alteradas, que levarão à morte celular por apoptose. Essa é responsável pela
dilatação cardíaca e diminuição da função sistólica. VD= ventrículo direito; VE= ventrículo
esquerdo; AO= aorta; AE= átrio esquerdo. Fonte: Arquivo pessoal.
37
Também foi visto neste trabalho, um aumento no número de miofibroblastos,
através da imunodetecção da α-SMA. Sabe-se que os componentes da matriz
extracelular podem modular o fenótipo dos fibroblastos, que aumentam a expressão
de α-SMA e tornam-se miofibroblastos (CAULFIELD & WOLKOWICZ, 1990;
CAULFIELD et al., 1992).
Essas células estão associadas com o aumento da
produção de fibronectina e colágeno tipo III. Com isso, os achados desse trabalho
corroboram os estudos realizados por Pessanha et al. (1999), no qual foi detectada
presença de miofibroblastos em miocárdio de ratos Wistar, após o tratamento com
inibidores da síntese de óxido nítrico.
A imunodetecção da α-SMA no septo interventricular e no ventrículo esquerdo
apresentou correlação significativa com a fração de ejeção e de encurtamento,
revelando que quanto mais miofibroblastos presentes, menor é a função sistólica de
coelhos tratados com doxorrubicina.
Isso demonstra a incapacidade dos
miofibrobasltos em manter a função sistólica frente à ação tóxica da doxorrubicina.
Willems et al. (1994) sugerem que o aumento do número de miofibroblastos nas
lesões miocárdicas ocorre na tentativa de manter a complacência miocárdica,
evitando a ruptura da área afetada durante a contratilidade cardíaca. Porém, isso
não foi visto nesse estudo, provavelmente devido à intensidade da lesão causada
pela doxorrubicina ser maior que a capacidade de reparação tecidual para
manutenção da função sistólica.
O estudo da matriz extracelular por meio da imunodetecção da fibronectina foi
o menos expressivo. Houve diferença significativa entre os grupos no septo
interventricular e no ventrículo esquerdo, mostrando que a fibronectina é produzida
na reparação tecidual, após o tratamento com doxorrubicina, mas em pouca
quantidade, no momento avaliado. Esse fato não corrobora os achados de Herpel et
al. (2006), que salientaram a importância da fibronectina no desenvolvimento das
cardiomiopatias. Contudo, o estudo em tela preconizou a elucidação do mecanismo
que levou a morte celular, não dando tempo de gerar um aumento da produção de
fibronectina pelos miofibroblastos. Isso explica a baixa expressão dessa proteína,
uma vez que ela é sintetizada nos estágios avançados do remodelamento do
miocárdio (KNOWLTON et al., 1992; HERPEL et al., 2006).
38
Muitas pesquisas apontam a fibrose como causadora da disfunção sistólica
gerada pelo tratamento com doxorrubicina (SCHUNKE et al., 2013; YU et al., 2013).
Os dados obtidos nesse trabalho não corroboram esses descritos. A falta de
correlação da porcentagem de área marcada com fibronectina com as frações de
ejeção e de encurtamento é mais um indicador de que a disfunção sistólica foi
causada pela apoptose celular e não pela fibrose miocárdica. Essa correlação
poderia ser significativa, caso a eutanásia desses animais fosse realizada
posteriormente, porém, o objetivo desse estudo foi estudar o remodelamento nas
fases iniciais da injúria causada pela doxorrubicina no miocárdio.
Uma vez que a maioria das investigações científicas descrevem as alterações
microscópicas somente no ventrículo esquerdo (TIDHOLM & JÖNSSON, 2005), os
dados obtidos nessa pesquisa permitiram inferir que a doxorrubicina age nas três
regiões anatômicas estudadas.
A imunodetecção para caspase e miofibroblastos não apresentou diferença
na comparação entre o ventrículo direito, o septo interventricular e o ventrículo
esquerdo. Tal fato difere dos achados histopatológicos descritos por Toyoda et al.
(1998) em cães tratados com doxorrubicina, onde o ventrículo direito apresentou
discretas alterações, em comparação com o ventrículo esquerdo e o septo
interventricular.
Herpel et al. (2005) observaram que essas diferenças também ocorrem na
CMD idiopática, onde em estudo imuno-histoquímico com miocárdio de seres
humanos com CMD, o remodelamento miocárdico ocorreu de forma diferente entre
os ventrículos nos estágios tardios da doença.
A severidade das alterações encontradas no ventrículo direito denota a
importância da avaliação funcional dessa região anatômica por meio da
ecodopplercardiografia, após a indução da CMD com doxorrubicina. Porém, essa
avaliação depende de validações que ainda estão sendo realizadas, até mesmo em
seres humanos (FELIX et al., 2010; VITARELLI & TERZANO, 2010).
39
7. CONCLUSÕES
Fundamentando-se nos resultados obtidos nesse estudo, pode-se concluir
que:
x
A lesão mitocondrial participa do início do desenvolvimento da cardiomiopatia
dilatada induzida por doxorrubicina em coelhos;
x
A apoptose por via mitocondrial é um mecanismo de morte celular envolvido
na cardiotoxicidade da doxorrubicina e causa diminuição da função sistólica;
x
Os miofibroblastos participam do remodelamento do miocárdio gerado pela
administração da doxorrubicina em coelhos, mas não contribuem com a
manutenção da função sistólica;
x
O aumento da matriz extracelular não é o principal causador de disfunção
sistólica em coelhos submetidos à indução da cardiomiopatia dilatada com
doxorrubicina;
x
A apoptose e o aumento do número de miofibroblastos ocorrem no ventrículo
direito, septo interventricular e no ventrículo esquerdo, na mesma magnitude,
na indução da cardiomiopatia dilatada com doxorrubicina em coelhos.
40
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