Análise Morfométrica e Imunoistoquímica da Mucosa do Jejuno

SOCIEDADE EVANGÉLICA BENEFICENTE DE CURITIBA
HOSPITAL UNIVERSITÁRIO EVANGÉLICO DE CURITIBA
FACULDADE EVANGÉLICA DO PARANÁ
INSTITUTO DE PESQUISAS MÉDICAS
EDUARDO WENDLER
ANÁLISE MORFOMÉTRICA E IMUNOISTOQUÍMICA DA MUCOSA DO JEJUNO
EXCLUSO, ÍLEO TERMINAL E CÓLON ASCENDENTE APÓS DERIVAÇÃO
JEJUNOJEJUNAL. ESTUDO EM RATOS
Dissertação apresentada ao Programa de PósGraduação em Princípios em Cirurgia do Instituto
de Pesquisas Médicas da Faculdade Evangélica
do Paraná como requisito parcial à obtenção do
grau acadêmico de Mestre.
Orientador: Prof. Dr. Paulo Afonso Nunes Nassif
Coordenador: Prof.Dr.Osvaldo Malafaia
CURITIBA
2012
Aos meus páis, Luiz Ernesto Wendler e Rosane
Boutin Wendler, e à meu irmão, Guilherme Wendler, pelo
amor e dedicação que sempre me transmitiram, pelos
olhares atenciosos que continuam me acompanhando e
me encorajando até os dias de hoje.
AGRADECIMENTOS
A DEUS pois até aqui me ajudou o senhor me dando vida, saúde, proteção,
oportunidades e orientações. A Ele devo todos os momentos que já vivi.
Ao Prof. Dr. Paulo Afonso Nunes Nassif, a quem posso chamar de tio e
orientador, pela amizade, pelo incentivo, paciência e compreensão na confecção
desta dissertação. Muito obrigado. A sua imensa dedicação profissional foi o que
motivou esse estudo. E tenho certeza que iremos compartilhar novos desafios,
sonhos e alegrias.
Ao Prof. Dr. Osvaldo Malafaia, coordenador do Programa Pós-Graduação
em Princípios da Cirurgia e grande incentivador no crescimento acadêmico e
profissional. Muito obrigado pela confiança.
À Prof. Dra. Denise Serpa Bopp Nassif, pela grande amizade, pela
paciência, pelos aconselhamentos, pelas correções e pela maravilhosa hospitalidade
durante vários dias até o término deste trabalho. Meu muito obrigado.
Aos Profs. Drs. Nicolau Gregori Czeczko e Jurandir Marcondes Ribas Filho,
integrantes do colegiado deste programa de Pós-graduação.
Ao Dr. Antonio de Pádua Gomes da Silva, pelas análises histológicas, além
da forma atenciosa, companheira e sincera com que participou desta dissertação.
À Dra. Carmen Austrália Paredes Marcondes Ribas, pela sua cooperação e
apoio ao longo do caminho.
À Márcia Olandoski Erbano, pela ajuda imprescindível durante as análises
estatísticas.
À Franciele Viezzer Chicora, pelo apoio, compreensão, carinho e constante
ajuda quando solicitada.
Ao novo amigo Bruno Luiz Ariede, sempre disposto, dedicado e incansável.
Suas inúmeras ajudas foram indispensáveis desde o início até a conclusão desta
dissertação.
Ao amigo João Brito de Freitas, disponível em todos os momentos em que
precisei fazendo o possível para facilitar esta caminhada.
À todos os professores que lecionaram neste período. Muito Obrigado.
Ao Instituto de Pesquisas Médicas (IPEM), pela oportunidade de realização
da etapa experimental desta dissertação.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)
e ao
Conselho Nacional de Desenvolvimento Tecnológico (CNPq), pelo apoio
desta.
E a todos que direta ou indiretamente participaram desta tese.
"Nunca se afaste de seus sonhos, pois se
eles se forem, você continuara vivendo, mas terá
deixado de existir".
Charles Chaplin
RESUMO
As derivações intestinais revolucionaram o tratamento da obesidade
mórbida, pela sua viabilidade e resposta sustentada. Porém, estudos experimentais,
sugerem após estas derivações um aumento do risco de câncer de cólon devido ao
aumento do tamanho e da proliferação das criptas intestinais. OBJETIVOS: O
presente estudo tem como objetivo analisar após derivação jejunojejunal: a
morfometria do jejuno e íleo, avaliando a espessura da mucosa, altura dos vilos e
profundidade das criptas. A morfometria do cólon ascendente avaliando a espessura
da mucosa. A expressão dos marcadores Ki-67 e p53 mediante técnica de
imunoistoquímica no jejuno, íleo e cólon ascendente. MÉTODOS: Foram utilizados
24 ratos Wistar machos divididos em dois grupos, controle e experimento, de 12
animais, separados em grupos de quatro animais e acomodados em três gaiolas.
Realizou-se derivação jejunojejunal através da anastomose latero-lateral entre o
segmento a 10 cm do ângulo de Treitz com o segmento do jejuno localizado a 60 cm
da válvula ileocecal. Os ratos do Grupo Controle não foram submetidos a
procedimento operatório. A morte dos animais foi realizada 9 semanas após o
procedimento, onde procedeu-se a ressecção segmentar do jejuno excluso, íleo
terminal e cólon ascendente avaliando a morfometria desses segmentos pela
espessura da mucosa, altura dos vilos, profundidade das criptas e a expressão do
Ki-67 e p53 pela imunoistoquímica. Para a comparação entre os grupos experimento
e controle, foi considerado o teste não-paramétrico de Mann-Whitney
RESULTADOS: Foram encontradas diferenças significativas entre os grupos
experimento e controle em relação a espessura da mucosa no jejuno (p=0,011), no
íleo (p<0,001) e no cólon (p=0,027). A média no grupo experimento é maior do que a
média no grupo controle. Existe diferença significativa entre os grupos também em
relação à altura dos vilos no íleo (p<0,001) e profundidade das criptas no jejuno
(p<0,001). Em ambas as variáveis, a média no grupo experimento é maior do que a
média no grupo controle. Os resultados indicaram que existe diferença significativa
entre os grupos em relação à expressão do Ki-67 no cólon (p < 0,001). Houve uma
expressão média maior do grupo controle do que no grupo experimento (médias
49,67 e 40,92, respectivamente). Não foram encontradas diferenças significativas
entre os grupos em relação à expressão do Ki-67 no jejuno e no íleo. Na avaliação
do P53, foi encontrada coloração nuclear negativa em todos os casos.
CONCLUSÕES: No jejuno a espessura da mucosa e a profundidade das criptas, foi
maior no grupo experimento do que no grupo controle, apresentando significância
estatística. No íleo, a espessura da mucosa e a altura dos vilos, foi maior no grupo
experimento do que no grupo controle, apresentando significância estatística. No
cólon ascendente, a espessura da mucosa foi maior no grupo experimento do que
no grupo controle, apresentando diferença estatística. A expressão do Ki-67 não
apresentou diferenças significativas entre os grupos controle e experimento no
jejuno e no íleo. No cólon ascendente a expressão do Ki-67 foi maior no grupo
controle do que no grupo experimento, com significância estatística. A expressão do
p53 foi negativa em todos os casos
Descritores: Derivação Jejuno-Ileal. Proteína Supressora de Tumor p53. Antígeno
Ki-67. Obesidade. Derivação Gástrica
ABSTRACT
Key-Words: Jejunoileal Bypass. Tumor Suppressor Protein p53. Ki-67 Antigen.
Obesity. Gastric Bypass.
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1 -! A) TRICOTOMIA DO ANIMAL; B) CAMPO DELIMITANDO O
ABDOMEN DO ANIMAL!.......................................................................32
FIGURA 2 -! INCISÃO ABDOMINAL MEDIANA (3 CM DE EXTENSÃO)!..................33
FIGURA 3 -! EXPOSIÇÃO DAS ALÇAS INTESTINAIS!............................................33
FIGURA 4 -! DERIVAÇÃO JEJUNOJEJUNAL ATRAVÉS DA ANASTOMOSE
LATERO-LATERAL !..............................................................................34
FIGURA 5 - ! SÍNTESE DA PAREDE ABDOMINAL !...................................................34
FIGURA 6 -! RE-LAPAROTOMIA COM EXPOSIÇÃO DAS ALÇAS INTESTINAIS!..36
FIGURA 7 -! RESSECÇÃO SEGMENTAR DO INTESTINO!.....................................37
FIGURA 8 -! ANÁLISE MORFOMÉTRICA PELA COLORAÇÃO HEMATOXILINA E
EOSINA!................................................................................................38
FIGURA 9 -! ANÁLISE IMUNOISTOQUIMICA PARA P53 DO ÍLEO TERMINAL!......39
FIGURA 10 -!A N Á L I S E I M U N O I S TO Q U I M I C A PA R A K I - 6 7 D O C Ó L O N
ASCENDENTE!.....................................................................................39
FIGURA 11 -!COLORAÇÃO DE HEMATOXILINA E EOSINA !...................................42
FIGURA 12 -!COLORAÇÃO DE HEMATOXILINA E EOSINA !...................................44
FIGURA 13 -!COLORAÇÃO DE HEMATOXILINA E EOSINA !...................................45
FIGURA 14 -!IMUNOISTOQUÍMICA DE KI-67!...........................................................47
LISTA DE GRÁFICOS
GRÁFICO 1 - AVALIAÇÃO DA ESPESSURA DA MUCOSA DO JEJUNO, NO ÍLEO E
NO CÓLON NO GRUPO EXPERIMENTO E CONTROLE .................42
GRÁFICO 2 - AVALIAÇÃO DA ALTURA DOS VILOS DO JEJUNO E DO ÍLEO NO
GRUPO EXPERIMENTO E CONTROLE ...........................................43
GRÁFICO 3 - AVALIAÇÃO DA PROFUNDIDADE DAS CRÍPTAS DO JEJUNO E DO
ÍLEO NO GRUPO EXPERIMENTO E CONTROLE ............................45
GRÁFICO 4 - EXPRESSÃO DO KI-67 DO JEJUNO, DO ÍLEO E DO CÓLON NO
GRUPO EXPERIMENTO E CONTROLE ...........................................46
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 - AVALIAÇÃO DA ESPESSURA DA MUCOSA DO JEJUNO, NO ÍLEO E
NO CÓLON NO GRUPO EXPERIMENTO E CONTROLE ...................41
TABELA 2 - AVALIAÇÃO DA ALTURA DOS VILOS DO JEJUNO E DO ÍLEO NO
GRUPO EXPERIMENTO E CONTROLE .............................................43
TABELA 3 - AVALIAÇÃO DA PROFUNDIDADE DAS CRIPTAS DO JEJUNO E DO
ÍLEO NO GRUPO EXPERIMENTO E CONTROLE ..............................44
TABELA 4 - EXPRESSÃO DO KI-67 DO JEJUNO, DO ÍLEO E DO CÓLON NO
GRUPO EXPERIMENTO E CONTROLE .............................................46
LISTA DE SÍMBOLOS / ABREVIATURAS
SUS
Sistema Único de Saúde
DNA
Ácido Desoxirribonucleico
RNA
Ácido Ribonucleico
HE
Hematoxilina e eosina
HLA
Antígeno Leucocitário humano
PCNA
Antígeno Nuclear de Proliferação Celular
Ki-67
Marcador de Proliferação Celular
p53
Proteína 53
GLP-1
Glucagon-like peptide-1
GLP-2
Glucagon-like peptide-2
PYY
Polipeptídeo Y
GIST
Gastrointestinal stromal tumor
MIB-1
Primeiro Anticorpo Monoclonal
IMC
Índice de Massa Corpóreal
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO !........................................................................................................14
1.1 OBJETIVO !...........................................................................................................16
2 REVISÃO DA LITERATURA !..................................................................................18
3 MATERIAL E MÉTODO !..........................................................................................31
3.1 DELINEAMENTO DO ESTUDO!..........................................................................31
3.2 AMOSTRA E ANIMAIS DE EXPERIMENTAÇÃO!................................................31
3.3 PREPARO DOS ANIMAIS!...................................................................................31
3.4 PROCEDIMENTO ANESTÉSICO!........................................................................31
3.5 PROCEDIMENTO OPERATÓRIO!.......................................................................32
3.6 PÓS-OPERATÓRIO!.............................................................................................35
3.7 MORTE DOS ANIMAIS!........................................................................................35
3.8 ANÁLISE PÓS-OPERATÓRIA !.............................................................................35
3.8.1 Grupo Experimento!...........................................................................................35
3.8.2 Grupo Controle!..................................................................................................37
3.9 AVALIAÇÃO HISTOLÓGICA !...............................................................................37
3.10 METODOLOGIA ESTATÍSTICA!.........................................................................40
4 RESULTADOS !........................................................................................................41
4.1 VARIÁVEIS: ESPESSURA DA MUCOSA, ALTURA DOS VILOS E
PROFUNDIDADE DE CRIPTAS!................................................................................41
4.1.1 Espessura da mucosa!.......................................................................................41
4.1.2 Altura dos vilos!..................................................................................................43
4.1.3 Profundidade das criptas!..................................................................................44
4.2 KI-67 - COMPARAÇÃO ENTRE EXPERIMENTO E CONTROLE!.......................45
5 DISCUSSÃO !..........................................................................................................48
5.1 PERSPECTIVAS FUTURAS!................................................................................52
6 CONCLUSÕES !......................................................................................................53
REFERÊNCIAS !.........................................................................................................54
ANEXO!......................................................................................................................59
APÊNDICES !..............................................................................................................60
14
1 INTRODUÇÃO
Durante séculos, a obesidade foi vista como sinônimo de beleza, bem estar
físico, riqueza e poder. Hoje ela é considerada um problema de saúde pública,
devido ao seu impacto na expectativa média de vida (DÂMASO, 2003). Definida,
segundo a Organização Mundial de Saúde (1998), como “Doença na qual o excesso
de gordura corporal se acumulou a tal ponto que a saúde pode ser afetada”, a
obesidade já é considerada a principal causa de morte evitável, ao lado do tabaco.
No mundo há mais de um bilhão de adultos com sobrepeso, sendo que entre
estes, pelo menos 300 milhões são obesos. A obesidade já é responsável por até
7% dos custos de assistência a saúde em alguns países desenvolvidos, mas estimase que estes valores sejam ainda maiores, já que geralmente nem todas as
condições relacionadas a obesidade são abrangidas nestes cálculos (LANCHA,
2006).
A cirurgia de obesidade proporciona perda do peso através de métodos
restritivos (nos quais é realizada uma redução na capacidade gástrica), disabsortivos
(nos quais se realiza uma redução na área absortiva do intestino delgado), ou
através de uma associação de ambos. Levantamento do Ministério da Saúde mostra
que aumentou em 542% a oferta de cirurgia bariátrica nos hospitais vinculados ao
Sistema Único de Saúde (SUS). O cálculo tomou por base o ano de 2001, data em
que o procedimento começou a ser realizado na rede pública, e quando somente
497 cirurgias foram feitas em todo o país e em 2008 foram 3.195 procedimentos.
No ano 2002-2003, 146.301 cirurgias para obesidade foram realizadas em
31 nações pertencentes à Federação Internacional para a Cirurgia da Obesidade, ou
grupos nacionais, mais a Suécia. Destas cirurgias, 69,96% ofereceram algum
componente disabsortivo aos pacientes (BUCHWALD e WILLIAMS, 2004).
As derivações intestinais revolucionaram o tratamento da obesidade
mórbida, pela sua viabilidade e resposta sustentada. Porém, estudos experimentais,
sugerem após estas derivações um aumento do risco de câncer de cólon devido ao
aumento do tamanho e da proliferação das criptas intestinais. A redução cirúrgica na
área absortiva intestinal produz hiperplasia compensatória do intestino
remanescente, a qual é proporcional à extensão do segmento removido. Os eventos
subjacentes a esta resposta têm sido em sua maioria estudados no intestino de
15
ratos (nos quais a enterectomia parcial aumenta a carcinogênese colorretal), mas o
fenômeno da adaptação intestinal por certo ocorre no homem (BRISTOL, WELLS e
WILLIAMSON, 1984). Procedimentos disabsortivos permitem que uma quantidade
maior de secreção biliopancreática, que normalmente seria reabsorvida pelo
intestino delgado, atinja o intestino grosso (SYLVAN, SJOLUND, JANUNGER,
RUTEGARD, STENLING e ROOS, 1992).
O Ki-67 é um antígeno marcador do ciclo e crescimento celular, o qual pode
ser detectado por meio imunoistoquímico, estando presente somente no núcleo e
em regiões perinucleares (BACCHI; GOWN, 1993). Os primeiros a realizarem
estudos foram GERDES et al. (1993), produzindo o primeiro anticorpo monoclonal
(MIB-1), inicialmente testado em tecidos congelados ou centrifugados de células de
HodgKin e Reed-Sternberg.
NUSSRAT et al. (2011) avaliaram a importância da expressão p53 e Ki-67
como marcadores imunoistoquímicos na detecção precoce de alterações prémalignas em diferentes tipos de adenomas colorretais.
SOUSA et al. (2012) avaliaram a expressão das proteínas p53 e Ki-67 em
adenomas colorretais, suas relações com características clinicopatológicas e a
relação entre as duas proteínas. A expressão de p53 foi maior nos adenomas com
alto grau de displasia. A expressão de Ki-67 foi maior nos adenomas retais e com
alto grau de displasia.
Os efeitos dos ácidos biliares sobre a carcinogênese no intestino grosso
incluem: perda do epitélio de superfície colônico, dano do DNA, aumento da
atividade da ornitina decarboxilase, supressão da expressão dos genes HLA,
ativação da proteíno-quinase C, aumento da permeabilidade da membrana celular,
controle do gene de transcrição (gadd 153), indução da apoptose e inibição da
polimerase ß do DNA. Outro efeito importante dos ácidos biliares é a indução da
proliferação celular, a qual desempenha um papel crítico na carcinogênese dos
cólons (KOZONI, TSIOULIAS, SHIFF e RIGAS, 2000).
Dietas enriquecidas com sais biliares e gordura influenciam positivamente na
taxa de expressão do antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA), refletindo
efeito estimulatório direto destes elementos sobre os colonócitos (BARONE,
BERLOCO, LADISA, IERARDI, CARUSO, VALENTINI, NOTARNICOLA e
FRANCAVILLA, 2002). A taxa de proliferação de células crípticas colônicas
16
encontra-se aumentada em pacientes submetidos a derivação jejunoileal para o
tratamento de obesidade (APPLETON, WHEELER, AL-MUFTI, CHALLACOMBE e
WILLIAMSON , 1988). A despeito da clara demonstração de que um aumento na
concentração fecal de sais biliares pode aumentar a proliferação dos colonócitos, é
ainda controversa qual a magnitude da alteração metabólica destas células após
cirurgias disabsortivas.
Ratos Sprague-Dawley submetidos à derivação jejunoileal de 85% e a
análise da profundidade das criptas demonstraram que no terço médio dos cólons a
profundidade delas era de 33% maior após a derivação. No terço distal as criptas
foram 25% mais profundas e após a derivação observaram que as células criptais no
terço médio do intestino grosso dobraram e no terço distal triplicaram. Os dados
demonstram aumento sustentável e substancial na taxa de proliferação celular e
adaptação do intestino grosso após a derivação jejunoileal (BRISTOL et al. 1984).
Estes achados podem influenciar diretamente a prática cirúrgica
contemporânea. Tendo como dados a hiperplasia colônica decorrente deste conjunto
de procedimentos, um grande número de pacientes jovens e de meia-idade pode
estar em risco de desenvolvimento de câncer do intestino grosso.
O adenocarcinoma colorretal é a segunda causa de morte por câncer nos
países ocidentais (MCARDLE e HOLE, 2004) e uma das neoplasias malignas mais
diagnosticadas nos Estados Unidos (CENTER OF DISEASES CONTROL, 2006).
Epidemiologicamente o estudo em modelos animais sugerem após as derivações
jejunoileais um aumento do risco de câncer de cólon, devido ao aumento da inibição
da apoptose, hiperproliferação das células criptais resultando na hiperplasia das
criptas (De VOGEL et al. 2008)
1.1 OBJETIVO
O presente estudo tem como objetivo analisar após derivação jejunojejunal:
1 - A morfometria do jejuno avaliando a espessura da mucosa, altura dos
vilos e profundidade das criptas.
2 - A morfometria do íleo avaliando a espessura da mucosa, altura dos vilos
e profundidade das criptas.
17
3 - A morfometria do cólon ascendente avaliando a espessura da mucosa.
4 - A expressão dos marcadores Ki-67 mediante técnica de
imunoistoquímica no jejuno, íleo e cólon ascendente
5 - A expressão do p53 mediante técnica de imunoistoquímica no jejuno, íleo
e cólon ascendente.
18
2 REVISÃO DA LITERATURA
KREMEN, LINNER e NELSON (1954) foram os primeiros autores a publicar
os efeitos da utilização da derivação jejunoileal em cães como meio capaz de reduzir
o peso corporal. Realizaram uma série de experimentos e avaliaram a perda de
peso, quando se excluíram 50% do intestino delgado proximal ou distal do trato
gastrointestinal, e o trânsito foi refeito mediante anastomoses jejunoileal ou
jejunocolônica. Derivou-se para a pele o segmento excluído, evitando-se assim,
ressecções. Os resultados demonstraram que os cães apresentaram significativa
perda de peso, e que a manutenção da válvula ileocecal era associada a menor
perda de peso corporal.
Posteriormente, esse cirurgia ficou conhecido como bypass jejunoileal e,
após modificações, começou a ser utilizado em seres humanos (PAYNE, DEWIND e
COMMS, 1963).
WILLIAMSON, et al. (1978) avaliaram o aumento de neoplasia intestinal pela
hiperplasia mucosa compensatória causada por ressecção da metade proximal do
intestino delgado de ratos, 10 dias após a última de 16 injeções semanais de uma
substância indutora de câncer chamada azoximetano. A aplicação isolada deste
carcinógeno foi capaz de aumentar os conteúdos intestinais tanto de RNA quanto de
DNA em 26%, em 17 a 18 semanas, antes que houvesse evidência macroscópica de
neoplasia. Três meses após a ressecção de intestino delgado proximal, a hiperplasia
ileal foi caracterizada por aumentos na quantidade de RNA (42% para 76%) e de
DNA (68% para 95%), vilosidades mais altas, criptas mais profundas, e dilatação
luminal; contudo o cólon demonstrou somente hiperplasia irregular. Concluíram que
a combinação dos efeitos do azoximetano com a ressecção da metade proximal do
intestino delgado produzia um número aumentado de tumores colônicos por animal
(2,9 versus 1,6 para controles). A despeito desta hiperplasia intensa produzida pela
ressecção, a neoplasia ileal não ocorreu.
No mesmo ano, para determinar as contribuições relativas da bile e do suco
pancreático sobre hiperplasia intestinal adaptativa, WILLIAMSON, BAUER, ROSS e
MALT, estudaram a proliferação celular da mucosa ileal de ratos após exposição
direta de bile isolada ou de efluente biliopancreático combinado ao intestino delgado.
A bile foi desviada através de canulação do colédoco acima do pâncreas. As
19
secreções biliopancreáticas foram derivadas através de um segmento duodenal
transposto contendo a papila. A derivação de bile ao intestino delgado com e sem o
suco pancreático causou aumentos similares nos conteúdos de RNA (16% para
50%) e DNA (22% para 41%) tanto 48horas quanto 1 semana após a cirurgia. A
atividade específica do DNA após a injeção de timidina tritiada (um marcador de
proliferação celular) foi maior após a derivação do efluente combinado. Após 1 mês
os conteúdos de ácidos nucléicos no íleo proximal após derivação biliopancreática
eram de 37% a 59% mais altos que após transecção ou derivação biliar (p<0,005).
Da mesma forma, após derivação biliar a altura das vilosidades e a profundidade
das criptas eram aumentadas somente na primeira semana, mas após a derivação
de ambas as secreções os aumentos foram encontrados em 1 semana e 1 mês.
Eles concluíram que altas concentrações luminais de bile causam proliferação
celular transitória na mucosa ileal, mas que a presença adicional de suco
pancreático prolonga a resposta adaptativa.
WILLIAMSON, et al. (1979) estudaram os efeitos da derivação
biliopancreática para o intestino delgado sobre o número e a distribuição de tumores
em ratos induzidos por azoximetano. Sete meses após a derivação biliopancreática,
hiperplasia ileal persistente foi manifestada tanto por altos níveis de RNA quanto de
DNA mucoso comparado com controles (34% contra 102% : p<0,001). A derivação
biliopancreática duplicou a incidência de tumores colônicos. Eles concluíram que a
potencialização de neoplasias colônicas pela derivação biliopancreática
provavelmente depende da estimulação da proliferação da mucosa colônica.
SCOPINARO, et al. (1979) em um estudo em humanos, realizaram a
ressecção de 50% do estômago, divisão do intestino delgado em sua metade,
anastomose do segmento distal com o estômago através de
gastrojejunoanastomose e anastomose do segmento proximal ao íleo terminal, a 50
cm da válvula ileocecal. Constituíram assim um segmento alimentar de 200 cm e um
segmento comum de 50 cm, para trânsito do bolo alimentar e das secreções
biliopancreáticas. Com esse procedimento induziu-se elevado grau de disabsorção,
permitindo, entretanto, maior absorção de sais biliares, menor quantidade de
distúrbios hidroeletrolíticos e sintomas associados à síndrome da alça cega
relacionados à derivação jejunoileal.
20
TILSON e LIVSTONE (1980) avaliaram a cinética celular dos intestinos
delgado e grosso no período pós-operatório imediato no rato, após ressecção de
50% da porção média do intestino delgado. Uma resposta proliferativa foi evidente
no cólon com apenas 24 horas, indicando que a hiperplasia adaptativa se inicia em
fases precoces no intestino remanescente após ressecção parcial.
SCUDAMORE e FREEMAN (1983) estudaram os efeitos de várias cirurgias
realizadas no intestino delgado (secção, ressecção, ou bypass) sobre a neoplasia
intestinal de ratos induzidos com o carcinógeno 1,2-dimetilhidrazina (um precursor
do azoximetano). Todos os ratos receberam injeções subcutâneas semanais de
dihidroclorito de dimetilhidrazina durante 14 semanas. O grupo 1 não sofreu cirurgia
alguma e serviu como controle. Realizaram transsecção do intestino delgado a 5 cm
da junção duodenojejunal, seguida de anastomose simples (grupo 2), ressecção de
intestino delgado com remoção do intestino proximal a um ponto localizado a 35%
da junção ileocecal seguido de anastomose término-terminal primária (grupo 3), e
bypass realizado com o jejuno proximal anastomosado ao íleo em um ponto 35 cm
proximal à junção ileocecal, seguido da criação de uma alça cega de jejunoíleo
(grupo 4). Seis semanas após a cirurgia, os animais foram sacrificados, e a
distribuição, tamanho e incidência de tumores nos intestinos delgado e grosso foram
registradas. Os cólons dos ratos dos grupos 3 (ressecção) e 4 (bypass)
apresentaram mais tumores (82% de cada grupo), que os cólons dos ratos dos
grupos 1 (controle) e 2 (transsecção) (60% e 53% respectivamente).
BRISTOL, WELLS e WILLIAMSON (1984) submeteram ratos SpragueDawley a bypass jejunoileal de 85% após indução de carcinogênese através do uso
de azoximetano. A produção de tumores nos cólons destes ratos foi comparada com
a de um grupo controle no qual foi realizada uma ileotomia com rafia e uma secção
no jejuno com anastomose primária. Todos os ratos que receberam azoximetano
desenvolveram no mínimo um tumor colorretal. Após bypass jejuonoileal, a média da
produção de tumores aumentou de 3 para 8 (p<0,01). Neste mesmo estudo, um
grupo de ratos não recebeu azoximetano, sendo submetido a análise da taxa de
produção de células crípticas (através da captura de metáfases com vincristina), e à
análise da profundidade das criptas. No terço médio do colorreto a profundidade das
criptas era de 33% maior após a derivação jejunoileal. No terço distal as criptas
eram 25% mais profundas. A taxa de produção de células crípticas mais que
21
duplicou no terço médio do intestino grosso e triplicou no terço distal. Os autores
concluíram que os dados demonstram um aumento sustentado e substancial na taxa
de proliferação celular após a derivação jejunoileal.
MAC FARLAND, et al. (1987) realizaram biópsias por colonoscopia em 38
pacientes, 10 a 13 anos após a realização de bypass jejunoileal. Nenhuma displasia
significante ou alterações pré-malignas foram observadas em 371 biópsias. Em um
paciente dois adenomas tubulovilosos foram encontrados em um cólon normal sob
outros aspectos, o qual é provável ser um achado casual. Os autores, apesar de
reconhecer que mais 10 a 20 anos seriam necessários para estabelecer
definitivamente a relação entre o bypass jejunoileal e o risco aumentado de câncer
do intestino grosso em humanos, desaconselharam a vigilância colonoscópica
regular.
HALL e LEVISON, (1990) identificaram que a atividade proliferativa celular
no tipo eucarionte pode ser realizada por contagem microscópica das mitoses, pela
medida do conteúdo de DNA nuclear e identificação imunoistoquímica de proteínas.
As mais comumente utilizadas são o Ki-67 e PCNA (antígenos nuclear de
proliferação celular). Este último representa proteínas ciclinas do ciclo celular,
componentes da DNA-polimerase.
HALL e LEVISON, (1990) verificaram que a proliferação celular é processo
biológico normal e fundamental. Muitos tecidos normais são ativamente
proliferativos, como por exemplo centros germinativos, epitélio colônico e epitélio
das criptas do intestino delgado. A interpretação dos índices de proliferação celular
deve ser avaliado no contexto do conhecimento da natureza do tecido normal.
Vários métodos são utilizados para avaliar e quantificar a proliferação celular no
material histopatológico.
SEIGNEURIN e GUILLAUD, (1991) verificaram que no ciclo celular, ocorre
variação de expressão segundo a fase. Tanto a quantidade quanto a distribuição do
antígeno é característica para estabelecer o exato ponto do ciclo em cada grupo
celular. Da fase G1 para a M, a quantidade de expressão aumenta
progressivamente, sendo de localização nucleolar, durante a fase G1 e nucleolar e
carioplasmática na fase G2. Ela é largamente utilizada para estimar fração de
crescimento de população celular. Em muitos tecidos malignos a porcentagem de
positividade celular do antígeno é correlacionada com parâmetros que refletem
22
agressividade ou progressão. Com todas estas características biológicas que possui,
o antígeno Ki-67 é forte aliado, e com grande potencial futuro, para estudos da
cinética proliferativa tumoral, apesar de sua estrutura bioquímica não ter função
completamente elucidada até o momento.
SYLVAN, et al. (1992) analisaram biopsias colonoscópicas múltiplas de 30
mulheres submetidas, de 11 a 17 anos antes, à derivação jejunoileal para obesidade
mórbida. Utilizando-se de avaliação da histologia e da citometria de fluxo do DNA,
em somente um paciente foi detectado displasia de baixo grau em uma lesão
adenomatosa inicial, que não era visível macroscopicamente. Nenhuma aneuploidia
de DNA foi observada. Dentro destes 17 anos de pós-operatório, não foi possivel
verificar por estes métodos qualquer transformação maligna colorretal em pacientes
submetidos à derivação jejunoileal. Os autores concluem que, sabendo-se que a
carcinogênese é um processo de longa evolução, vigilância adicional seria
necessária antes que o risco aumentado para o carcinoma colorretal pudesse ser
excluído.
BACCHI e GOWN (1993) verificaram a presença do antígeno Ki-67 em
células tumorais de algumas neoplasias malignas selecionadas. Só posteriormente
com a introdução do anticorpo MIB-1, passou a ser empregado em tecidos
formolizados e incluídos em blocos de parafina.
VIGUERAS et al. (1999) estudaram as características histológicas da
mucosa intestinal de ratos durante o primeiro ano de vida. Foi realizado estudo em
69 ratos Wistar com idade variando de 1 dia a 1 ano de vida. As características do
estudo incluem: altura e números dos vilos no duodeno, jejuno e íleo e a
profundidade e números das criptas, no duodeno, jejuno, íleo, cólon e reto.
Observações morfométricas foram expressadas em curva logarítmica matemática
que mostrou padrão normal para crescimento intestinal para cada nível do intestino.
O número de vilos no intestino delgado diminuiu do 1° ao 35° dia de idade onde
todos os outros parâmetros intestinais aumentaram durante o mesmo período.
Depois de 35 dias os ratos tiveram diminuição ou aumento menores. A quantificação
das mudanças intestinais promoveram um novo padrão complementar como
referência para pesquisas de indicações de normalidade de funcionamento de ratos.
BARONE, et al. (2002), estudaram a proliferação de colonócitos de ratos
alimentados com dietas enriquecidas com sais biliares ou gordura através da
23
imunorreatividade ao PCNA. Quando comparados à dieta padrão, as dietas
enriquecidas com ácido quenodesoxicólico, ácido desoxicólico (ambos componentes
da bile) e com gordura produziram um aumento significante tanto na concentração
total de sais biliares na água fecal quanto na percentagem de núcleos PCNApositivos, ambos com significância estatística. Os animais que ingeriram os ácidos
quenodesoxicólico e desoxicólico demonstraram histologia colônica e atividade
citolítica das fezes similar aos controles, com um índice apoptótico significativamente
reduzido. Concluíram que os resultados obtidos demonstram que os sais biliares
agem como mitógenos diretos nas células epiteliais dos cólons.
MILOVIC, et al. (2002), investigaram os efeitos dos sais biliares na
proliferação e apoptose nas células de neoplasias colônicas, as quais foram
expostas a concentrações crescentes do ácido desoxicólico. A proliferação foi
avaliada pela contagem celular e a apoptose pela estimativa da percentagem de
sobrevivência celular e investigação da morfologia nuclear. Como resultados,
quando a concentração atingia até 20 micrômetros, o ácido desoxicólico estimulou o
crescimento das células tumorais humanas. Em concentrações acima de 100
micrômetros, o ácido desoxicólico induziu apoptose nestas células. Como conclusão,
afirmam os autores que baixas doses de ácido desoxicólico estimulam a proliferação
das células cancerosas humanas, enquanto concentrações superiores a 100
micromol por litro deste ácido biliar secundário induz apoptose nestas células.
Ressaltam ainda que o desoxicolato pode favorecer a possibilidade de
transformação maligna através do aumento da renovação celular epitelial no colon.
RIBEIRO et al. (2004) estudaram o efeito da administração de dieta com
glutamina, em ratos submetidos à ressecção subtotal do intestino delgado, avaliando
a perda de peso pós-operatória e a morfometria da mucosa intestinal. Foram
constituídos três grupos de ratos Wistar machos recebendo as seguintes dietas: com
glutamina (grupo EG), sem glutamina (grupo EsG), e a dieta padrão do laboratório
(grupo ER). A ressecção intestinal foi realizada em todos os animais incluindo-se a
válvula íleocecal, com remanescente jejunal de apenas 25cm a partir do piloro,
anastomosado látero-lateralmente ao cólon ascendente. A perda de peso entre os
três grupos não diferiu estatisticamente. A análise da morfometria da mucosa
intestinal mostrou diferença significativa: 1) animais do grupo Enterectomia com
Glutamina (EG) apresentaram vilosidade duodenal significativamente maior que o
24
grupo EsG (p< 0,05), mas não diferiram do grupo que recebeu dieta padrão do
laboratório (ER); 2) nas medidas da vilosidade jejunal, cripta jejunal e mucosa
jejunal, o grupo Enterectomia com Glutamina (EG) apresentou maior altura,
profundidade e extensão, respectivamente, em relação ao grupo Enterectomia sem
glutamina (EsG) (p<0,05), porém não diferiu estatisticamente do grupo dieta padrão
do laboratório (ER).
TRZEBICKY (1804), citado por RAMOS (2004), realizou o primeiro estudo
experimental demonstrando a importância do intestino delgado para a absorção de
nutrientes. Esse pesquisador demonstrou que procedimentos envolvendo
ressecções jejunais são associados a maior perda de peso corporal e a alterações
nutricionais que ressecções ileais.
AZEVEDO et al. (2007) analisaram seis animais (Rattus norvegicus com 90
dias de idade) divididos em dois grupos: GC (grupo controle) e GE (grupo
experimental). Os animais do GC receberam ração com teor protéico de 26% e os
do GE ração com 4% de proteínas. Após 90 dias de experimento, os animais foram
submetidos à eutanásia, à retirada do íleo e a processos histológicos corados por
hematoxilina e eosina (HE), quando se avaliaram os efeitos da desnutrição protéica
severa (4%) sobre ratos Wistar adultos (Rattus norvegicus) nos seguintes
parâmetros: peso corporal; parede total do íleo; túnica mucosa; túnica muscular;
altura do enterócito; diâmetro maior nuclear. A análise histomorfométrica da parede
total do íleo dos ratos adultos desnutridos evidenciou que houve uma redução
estatisticamente significante no grupo experimental em relação ao grupo controle.
Ou seja: a parede intestinal alterou-se como um todo, especialmente na espessura
da túnica mucosa, muscular, altura do enterócito e diâmetro maior de seu núcleo,
permitindo-se concluir que a desnutrição protéica afeta tecidos de alta e baixa
renovação celular presente no íleo.
MARTINEZ et al. (2008) Estudaram 100 doentes (54 mulheres), com média
de idade de 59,8 anos com adenocarcinoma colorretal. A expressão da proteína p53
foi analisada por imunoistoquímica, com anticorpo monoclonal anti-p53 pela técnica
da estreptavidi na-biotina-peroxidase. A expressão tecidual da proteína p53 foi
relacionada as variáveis: gênero, idade, grau histológico, tipo histológico, tamanho
do tumor, estadiamento TNM, profundidade de invasão da parede intestinal,
comprometimento linfonodal, invasão angiolinfática, localização do tumor no
25
intestino grosso em relação entre expressão da proteína p53 e as variáveis
consideradas empregou-se o teste qui-quadrado, estabelecendo-se nível de
significância de 5% (p<0,05). A proteína p53 foi positiva em 77% dos casos. Com
relação as diferentes variáveis consideradas verificou-se maior tendência de
expressão da proteína mutante quando se considerava a idade (p=0,001), grau
histológico (p=0,001), estádio tardio da classificação TNM (p=0,001), maior
profundidade de invasão na parede cólica (p=0,001), comprometimento (p=0,001),
invasão angliolinfática (p=0,2), localização após flexura esplênica (p=0,001), não se
encontrando relação com gênero (p=0,49), e tamanho do tumor (p=0,08). Os
resultados do presente estudo permitem concluir que a expressão da proteína p53
mutante ocorre com maior frequência nos tumores localizados a partir da flexura
esplênica.
VERNILO et al. (2008) realizaram estudo imunoistoquímico para investigar a
da expressão do p53 e Ki-67 em adenomas coloretais, afim de esclarecer o valor
significativo de malignidade e desenvolvimento de novos pólipos intestinais. 78
pólipos foram removidos de 51 pacientes e examinados. 29 pacientes (56,9%)
tinham adenomas com displasia de baixo grau (13 destes desenvolveram novos
pólipos em 3 anos de segmento) e 22 (43,1%) tinham adenoma de alto grau de
displasia (6 destes desenvolveram novos pólipos em 3 anos de segmento). Foi
testada a associação entre o p53 e a expressão do Ki-67 em várias variáveis
clinicopatológico e a regressão analisada foi fundamental para identificar os fatores
de risco de malignidade e desenvolvimento de novos adenomas. Uma relação
significativa entre o grau de displasia e a imunoreação do p53 foi observada. A
expressão do Ki-67 não foi relatada para displasia. A expressão dos marcadores
biológicos pode ser, no futuro próximo, utilizado como uma corrente examinadora de
pólipos, contudo mais estudos são necessários para melhor deferir seus valores
preditivos.
SAINSBURY et al. (2008) compararam mucosas biomarcadas em indivíduos
de peso normal (IMC de 18,5 a 24,9 kg/m2) com indivíduos obesos mórbidos (IMC >
40) por 6 meses após serem submetidos ao bypass gástrico em Y de Roux. Células
mitóticas epiteliais do reto, área das criptas e ramificação das criptas foram
mensuradas e acompanhadas. A apoptose foi mensurada pela imunoistoquímica
através da Neocitoqueratina 18 a qual foi fixada nas secções teciduais. 26 pacientes
26
obesos mórbidos tiveram aumento significativo de mitoses, área das criptas e
ramificação das criptas, todos com p<0,01 comparadas com 21 pacientes com peso
normal. Surpreendentemente isto foi associado com grande aumento das mitoses e
diminuição das apoptoses das células epiteliais. Aceita-se as mucosas biomarcadas
como indicadores futuro de câncer coloretal. Estão aumentadas em pacientes com
obesidade mórbida comparado com pacientes de peso normal. A hiperproliferação
que existe depois da bypass gástrico em Y de Roux pode ser um importante
indicador a longo prazo para risco de câncer coloretal em pacientes submetidos a
cirurgia bariátrica.
NEVES et al. (2009) avaliaram a imunoexpressão de Ki-67 e p53 em GIST.
Foram estudados a expressão de Ki-67 e p53 por imunoistoquímica em tumores de
40 pacientes com GIST. Os tumores foram divididos segundo o risco de recorrência
em 2 grupos: I com risco alto ou intermediário e II com risco baixo ou muito baixo.
Entre os 40 pacientes, 21 eram do sexo masculino, a idade média foi de 56 anos, 16
ocorreram no intestino delgado, 13 no estômago, 5 no retroperitônio, 4 no cólon e
reto, e 2 no mesentério. Trinta e dois tumores foram classificados no grupo I e 8 no
grupo II. Metade dos pacientes desenvolveu recorrência, sendo 90% de cólon (P =
0,114). O índice de proliferação tumoral Ki-67 variou entre 0,02 e 0,35 (média =
0,12). Este índice foi marginalmente superior nos tumores do grupo I com
recorrência (P = 0,09), quando comparado aos do mesmo grupo sem recorrência. A
expressão do p53 foi observada em 65% dos GISTs. Nos tumores do grupo I foi
observada com maior frequência, expressão de p53 e Ki-67 (P = 0,022; OR = 8.00 IC 95%: 1,32-48,65). Concluíram que a localização mais comum foi no intestino
delgado, 80% tinham potencial maligno, justificando a alta recorrência encontrada.
Não se observou correlação significante entre p53 e evolução dos pacientes. Nos
pacientes do grupo I, a avaliação do Ki-67 pode ser um marcador de prognóstico. A
positividade dos dois marcadores é maior entre os pacientes de pior prognóstico.
NONOSE et al. (2009) quantificaram os níveis teciduais de mucinas neutras
e ácidas (sulfomucinas e sialomucinas) na mucosa colônica comparando segmentos
com e sem trânsito intestinal e relacionando-os ao tempo de exclusão do trânsito
intestinal. Quarenta e cinco ratos Wistar machos foram divididos em três grupos
experimentais compostos por 15 animais sendo a morte realizada em 6, 12 e 18
semanas após o procedimento cirúrgico. De cada grupo experimental 10 animais
27
foram submetidos à derivação do cólon esquerdo por meio de colostomia proximal e
fístula mucosa distal (subgrupo experimento) e cinco a laparotomia isolada
(subgrupo controle). A avaliação da expressão de mucinas neutras foi realizada pela
técnica histoquímica do Periódico Ácido de Schiff e as mucinas ácidas pela técnica
do Alcian Blue. Houve redução na quantidade de mucinas neutras e ácidas no cólon
desprovido de trânsito quando comparado ao provido de trânsito, independente do
tempo de exclusão.
A derivação do trânsito fecal diminui os níveis teciduais de
mucinas neutras e ácidas na mucosa cólica quando comparado aos segmentos com
trânsito preservado. Com o progredir do tempo de exclusão intestinal nos segmentos
sem trânsito fecal ocorreu aumento dos níveis teciduais de mucinas neutras e
mucinas ácidas sulfatadas e redução significante dos níveis de sialomucinas.
RESCK et al. (2010) analisaram as alterações histopatológicas
caracterizadas pelo índice de mitoses produzidas no intestino grosso de ratos Wistar
submetidos à derivação jejunoileal após administração continua de vitamina C e
nitrito de sódio, em diferentes grupos. Oitenta ratos machos Wistar pesando entre
450-550g foram divididos em doze grupos, com vinte animais controles não
operados (5 animais ingeriram somente água, 5 animais ingeriram somente vitamina
C, 5 animais ingeriram somente nitrito de sódio e 5 animais ingeriram vitamina C
+nitrito de sódio). Em vinte animais apenas manipulação intestinal foi realizada,
estes servindo como grupo experimento. Nos restantes (grupo denominado
operado), o intestino foi seccionado a 3cm da junção duodenojejunal, e a derivação
jejunoileal foi realizada através da anastomose látero-lateral no íleo terminal a 2cm
da válvula íleocecal. Após 180 dias de observação, os animais eram pesados
semanalmente, e para análise foram divididos em segmentos (S1, S2, S3, S4 e S5)
correspondentes ao ceco, cólon ascendente, transverso, descendente e reto.
Concluem que, comparando todos os segmentos colônicos avaliados dos vários
grupos estudados, foi observado que os animais que receberam nitrito de sódio
associado à vitamina C apresentaram menor índice de mitoses. Além disso, foi
verificado que a vitamina C não apresentou um efeito inibidor, estatisticamente
significativo, na preservação da mucosa e no índice de mitoses.
MARTINEZ et al. (2010) verificaram a relação entre dano oxidativo do DNA e
mutações na proteína p53 em modelo experimental de colite de exclusão. Quarenta
e cinco ratos Wistar foram divididos em três grupos com 15 animais sendo a morte
28
realizada 6, 12 e 18 semanas após o procedimento cirúrgico. Para cada grupo, 10
animais foram submetidos à derivação do trânsito intestinal por meio de colostomia
proximal no cólon esquerdo e fístula mucosa distal (grupo experimento) e cinco
exclusivamente a laparotomia sem derivação do trânsito intestinal (grupo controle).
Avaliou-se histologicamente a presença de colite com escala de graduação
inflamatória. A pesquisa de mutações na proteína p53 foi avaliada por
imunoistoquímica com anticorpo primário específico para ratos. Nos segmentos
desprovidos de trânsito fecal existe maior grau de inflamação quando comparado
aos tecidos com trânsito fecal preservado (p=0,001). Os níveis de estresse oxidativo
foram significativamente maiores nos segmentos desprovidos de trânsito (p<0,0001)
quando comparados aos segmentos providos de trânsito e aumentavam com o
progredir do tempo de exclusão (p=0,007). Os níveis de estresse oxidativo
encontram-se diretamente relacionados ao maior grau de inflamação tecidual. Não
houve mutações na proteína p53 nos segmentos exclusos de trânsito fecal,
independente do tempo de exclusão considerado.
LE ROUX et al. (2010) Determinaram as mudanças na proliferação das
células das criptas e do peptídeo GLP-2 em roedores e humanos depois do bypass
gástrico em Y de Roux (RYGB). Ratos Wistar com Y de Roux, sem Y de Roux,
GLP-2, GLP-1 e PYY foram mensurados 23 dias após. Biópsias no íleo terminal
foram realizadas usando o anticorpo Ki-67, o qual é um detector cíclico e portanto
demonstra as células na fase S do ciclo celular. O número total de células, o número
de mitoses e o número de células rotuladas por criptas foram contadas. Níveis de de
GLP-2 nos ratos depois do Y de Roux foram elevados para 91% acima dos animais
que não foram submetidos a Y de Roux (p=0,02). Nas necropsias, as taxas de
mitoses (p<0,001) e células positivas para o anticorpo Ki-67 (p<0,001) foram
aumentadas, iniciando proliferação das criptas celulares. A taxa de GLP-2 em
humanos depois do Y de Roux alcançou um pico no sexto mês de 168% (p<0,001),
total PYY (P<0,01), e PYY3-36 (p<0,05) responsáveis pelo aumento progressivo
acima de 24 meses. Concluíram que o Y de Roux leva a um aumento do GLP-2 e a
proliferação celular das criptas da mucosa. Outros hormônios das células intestinais
permanecem elevados por pelo menos dois anos em humanos. Esses achados
podem contribuir para a restauração da superfície da área absortiva do intestino
29
onde há alterações de má absorção e contribuem para o controle da perda de peso
depois do Y de Roux.
NUSSRAT et al. (2011) avaliaram a importância da expressão p53 e Ki-67
como marcadores imunoistoquímicos na detecção precoce de alterações prémalignas em diferentes tipos de adenomas colorretais. Além disso, correlacionaram
a expressão imunoistoquímica dos dois marcadores com diferentes parâmetros
clinicopatológicos, incluindo: idade e sexo do paciente, tipo, local, tamanho e grau de
displasia de adenomas colorretal. Quarenta e sete espécimes de polipectomia de
adenomas colorretais foram recuperados a partir dos materiais de arquivo das
Doenças Gastrointestinais e Hepáticos do Hospital em Bagdá de 2009-2010.
Fragmentos de 4µm foram corados pela técnica imunoistoquímica com os
marcadores tumorais com Ki-67 e p53. Os valores de p<0,05 foram considerados
estatisticamente significativos. Expressões imunoistoquímica de Ki-67 e p53
apresentaram significativa correlação com o tamanho e grau de displasia em
adenomas colorretais. No entanto, não houve correlação significativa entre a
expressão imunoistoquímica de Ki-67 e p53 com a idade e sexo do paciente, e do
tipo e local de adenomas colorretais. Não houve relação entre as duas proteínas na
amostra. Adenomas vilosos do cólon apresentaram correlação significativa com o
grau de displasia, enquanto não houve correlação significativa entre o tamanho e
local de adenoma colorretal com o grau de displasia. Displasia de alto grau com
marcadores imunoistoquimicos de Ki-67 e p53 positivos, podem ser parâmetros
importantes para a seleção da população total de adenoma colorretal, sendo
merecedores de estreita vigilância para acompanhamento de programas de
prevenção ao câncer. Ela está intimamente ligada com o aumento da idade,
particularmente em doentes com adenoma de grande porte do componente viloso
em sua histologia.
SOUSA et al. (2012) avaliaram a expressão das proteínas p53 e Ki-67 em
adenomas colorretais, suas relações com características clinicopatológicas e a
relação entre as duas proteínas. As amostras consistituiram-se de 50 pólipos
adenomatosos encontrados em pacientes submetidos a exames colonoscópicos.
Após a realização de polipectomia, os pólipos eram conservados em solução
tamponada de formalina a 10% e submetidos a rotina de preparo de cortes e
lâminas e coloração pela hematoxilina e eosina para confirmação da natureza
30
adenomatosa. Realizou-se imunoistoquímica específica para as proteínas p53 e
Ki-67 pelo método imunoenzimático da streptoavidina-biotina-peroxidase para cada
adenoma. A proteína p53 foi positiva em 18% dos adenomas e a proteína Ki-67,
expresso como índice (Ki-67), obteve média de 0,49. Houve diferença
estatisticamente significante na expressão de p53 (p=0,0003) e Ki-67 (p=0,02) entre
os adenomas com alto e baixo grau de displasia, sendo maior no primeiro grupo.
Encontrou-se, ainda maior expressão da proteína Ki-67 nos adenomas retais em
relação aos de localização cólica . Não houve relação entre a expressão das duas
proteínas, na amostra. A proteína p53 é expressa em parte dos adenomas enquanto
Ki-67 é expressa na sua totalidade. A expressão de p53 foi maior nos adenomas
com alto grau de displasia. A expressão de Ki-67 foi maior nos adenomas retais e
com alto grau de displasia.
31
3 MATERIAL E MÉTODO
3.1 DELINEAMENTO DO ESTUDO
O presente estudo, foi realizado no Programa de Pós-Graduação em
Princípios da Cirurgia do Instituto de Pesquisas Médicas do Hospital Universitário
Evangélico de Curitiba.
O trabalho recebeu aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa da
Faculdade Evangélica do Paraná (Anexo 1). Foram utilizadas as Normas para
apresentação de Documentos Científicos da Universidade Federal do Paraná
(2007). Utilizou-se a Nômina Anatômica Veterinária (1997) e os princípios éticos em
experimentação animal preconizados na Lei Federal 11794 de 08/10/2008.
3.2 AMOSTRA E ANIMAIS DE EXPERIMENTAÇÃO
Foram utilizados 24 ratos Wistar (Rattus Novergicus albinus, rodentia
mamalia) machos, com peso médio de 347 gramas (Apêndice 1).
3.3 PREPARO DOS ANIMAIS
Os ratos do Grupo Experimento, composto por 12 animais, foram separados
em grupos de quatro animais e acomodados em três gaiolas de polipropileno com
cobertura vazada e etiquetas de identificação. Os animais do Grupo Controle,
composto por 12 animais, foram distribuídos e alojados de maneira semelhante ao
experimento. O ciclo claro-escuro foi mantido artificialmente com períodos de 12
horas claro e 12 horas escuro. Foram mantidos a temperatura ambiente controlada
entre 18 e 23ºC. A umidade relativa do ar será a própria do ambiente. Os animais
receberam água e ração (Nuvilab CR1® Nuvital, Colombo, PR) ad libitum.
3.4 PROCEDIMENTO ANESTÉSICO
A anestesia foi realizada em todos os animais com o uso de cloridrato de
quetamina (50 a 75mg/Kg) e xilazina (5 a 10mg/Kg) pela via subcutânea.
32
3.5 PROCEDIMENTO OPERATÓRIO
Procedeu-se a tricotomia do animal delimitando-se o abdome (Figura 1).
FIGURA 1 - A) TRICOTOMIA DO ANIMAL; B) CAMPO DELIMITANDO O ABDOMEN DO ANIMAL
Foi realizada incisão abdominal mediana, com aproximadamente 3 cm de
extensão, com bisturi de lâmina número 15. Os planos envolvidos foram: pele, tecido
celular subcutâneo, aponeurose da parede ventral do abdome na linha alba e
peritônio (Figura 2).
33
FIGURA 2 - INCISÃO ABDOMINAL MEDIANA (3 CM DE EXTENSÃO)
Foi realizado inventário da cavidade peritoneal, com exposição das alças
intestinais. O intestino delgado foi exposto, medido na sua totalidade (Figura 3).
FIGURA 3 - EXPOSIÇÃO DAS ALÇAS INTESTINAIS
Realizou-se derivação jejunojejunal através da anastomose latero-lateral
entre o segmento a 10 cm do ângulo de Treitz com o segmento do jejuno localizado
a 60 cm da válvula ileocecal (Figura 4).
34
FIGURA 4 - DERIVAÇÃO JEJUNOJEJUNAL ATRAVÉS DA ANASTOMOSE LATERO-LATERAL
NOTA: 10 cm = Distância do ângulo de Treitz até a anastomose latero-lateral;
60 cm = distância da anastomose latero-lateral até a válvula íleocecal
As suturas intestinais foram realizadas com fios cirúrgicos de Polipropileno
número 5 – 0 (Prolene 5-0 ® Ethicon) em plano único.
Após as alças intestinais foram introduzidas a cavidade peritoneal e a síntese
da parede abdominal foi realizada por planos com utilização de fio de polipropileno
3-0 (Prolene 3-0 ®Ethicon) para o plano mioaponeurótico e fio de mononylon 3-0 (®
Ethicon) na pele (Figura 5).
FIGURA 5 - SÍNTESE DA PAREDE ABDOMINAL
LEGENDA: A) plano mioaponeurótico e B) pele
Os ratos do Grupo Controle não foram submetidos a procedimento operatório.
35
3.6 PÓS-OPERATÓRIO
A analgesia pós-operatória foi realizada com uma aplicação de buprenorfina
na dose 0,01 a 0,05mg/kg, por via intramuscular.
3.7 MORTE DOS ANIMAIS
A morte dos animais foi realizada 9 semanas do pós-operatório com inalação
de dióxido de carbono. Os animais foram colocados sob campânula, onde inalaram
70% de CO2 no ar para a rápida perda de consciência, sem hipóxia. Isto resultou em
rápida anestesia, seguida por morte (PAIVA; MAFFILI e SANTOS, 2005).
3.8 ANÁLISE PÓS-OPERATÓRIA
3.8.1 Grupo Experimento
Após a morte, o animal foi colocado em decúbito dorsal com fixação das
patas por meio de elástico, procedendo-se a re-laparotomia mediana com exposição
das alças intestinais (Figura 6).
36
FIGURA 6 – RE-LAPAROTOMIA COM EXPOSIÇÃO DAS ALÇAS INTESTINAIS
O jejuno excluso, o íleo terminal e o cólon ascendente foram preparados
através de irrigação de sua luz com solução fisiológica (Cloreto de Sódio a 0,9%)
para remoção dos resíduos fecais, seguido de instilação de solução fixadora de
formalina a 10%, utilizando um cateter flexível de Abbocath 16 ® Abbott.
Após este preparo procedeu-se a ressecção segmentar do jejuno excluso,
íleo terminal e cólon ascendente (Figura 7).
37
FIGURA 7 – RESSECÇÃO SEGMENTAR DE JEJUNO EXCLUSO, ÍLEO TERMINAL E CÓLON
ASCENDENTE
3.8.2 Grupo Controle
Realizou-se laparotomia com identificação dos segmentos intestinais, com
preparação por irrigação de sua luz com solução fisiológica (Cloreto de Sódio a
0,9%) para remoção dos resíduos fecais, seguido de instilação de solução fixadora
de formalina a 10%, utilizando um cateter flexível de Abbocath 16 ® Abbott.
Procedeu-se ressecção segmentar do jejuno proximal, íleo terminal e cólon
ascendente.
3.9 AVALIAÇÃO HISTOLÓGICA
O material obtido das cirurgias foi fixado em formalina neutra tamponada a
10%. Após a fixação, o material foi clivado e submetido a procedimento histológico
padrão, emblocado em parafina e cortes de 5 micrômetros foram obtidos.
Os cortes para análise morfométrica foram corados pela coloração de
hematoxilina e eosina, analisando a espessura da mucosa, altura dos vilos e
profundidade das críptas (Figura 8) em microscópio óptico Nikon Eclipse E-200
trinocular acoplado a câmera digital Dino-Eye 4023 e a medição foi realizada através
38
do software Dino-Capture 2.0 previamente calibrado. De cada caso, três áreas
representativas foram medidas.
FIGURA 8 - ANÁLISE MORFOMÉTRICA PELA COLORAÇÃO HEMATOXILINA E EOSINA
LEGENDA: A) Espessura da mucosa; B) Altura dos vilos; C) Profundidade das criptas
Cortes para imunoistoquímica foram submetidos a desparafinização,
bloqueio de peroxidase e recuperação antigênica por banho-maria em tampão citrato
pH 6.0 por 40 minutos. Os seguintes anticorpos foram incubados :
- p53 - Clone SP-5 (Cell Marque, Rocklin, EUA), pré-diluído, incubado por 1 hora
(Figura 9).
39
FIGURA 9 – ANÁLISE IMUNOISTOQUIMICA PARA P53 DO ÍLEO TERMINAL.
Nota: A) Células Caliciais; B) Núcleo celulares não corados pelo p53
- Ki-67 - clone SP-6 (BioSB, Santa Barbara, EUA), diluição 1:500, incubado por 1
hora (Figura 10).
FIGURA 10 – ANÁLISE IMUNOISTOQUIMICA PARA KI-67 DO CÓLON ASCENDENTE.
Nota: A) Núcleo celulares corados pelo Ki-67. B) Núcleo celulares não corados pelo Ki-67
40
Detecção realizada com sistema MACH4 (Biocare, Concord, EUA) com
cromógeno DAB e contracoloração com hematoxilina.
Controles externos positivos e negativos foram realizados em conjunto.
Para análise das reações imunoistoquímicas para proteína p53, foi
considerada positiva coloração nuclear. As lâminas foram escaneadas em objetiva
panorâmina (40x) e em caso de negatividade, 10 campos de 400x foram
escaneados.
Para as reações do Ki-67, foram contadas 200 células epiteliais da mucosa
por toda a sua espessura, e o percentual de células positivas foi registrado.
3.10 METODOLOGIA ESTATÍSTICA
Os resultados obtidos no estudo foram descritos por médias, medianas,
valores mínimos, valores máximos e desvios padrões. Para a comparação entre os
grupos experimento e controle, foi considerado o teste não-paramétrico de MannWhitney. Valores de p<0,05 indicaram significância estatística. Os dados foram
analisados com o programa Statistica v.8.0.
41
4 RESULTADOS
Para a análise estatística dos dados obtidos no estudo, foram consideradas
as médias das três medidas efetuadas em cada unidade de observação.
Na avaliação do p53 (Apêndice 2), foi encontrada coloração nuclear negativa
em todos os casos. Sendo assim, não foi efetuada análise estatística para esta
variável.
4.1 VARIÁVEIS: ESPESSURA DA MUCOSA, ALTURA DOS VILOS E
PROFUNDIDADE DAS CRIPTAS
Para cada uma das variáveis da morfometria, testou-se a hipótese nula de
que a média no grupo experimento é igual à média no grupo controle, versus a
hipótese alternativa de médias diferentes.
4.1.1 Espessura da mucosa
Com relação a variável espessura da mucosa (Apêndice 3), verificou-se
diferenças significativas com relação a espessura da mucosa do jejuno p=0,011, no
íleo p=0,001 e no cólon p=0,027. Observa-se que na tabela abaixo nos três locais, a
média do grupo experimento é maior que a média do grupo controle (Tabela 1,
Gráfico 1 e Figura 11).
Variável
Grupo
n Média Mediana Mínimo Máximo Desvio Valor
padrão de p
Jejuno - espessura da Controle
mucosa
Experimento
12 477,9 470,3
424,0
588,7
43,0
12 590,4 606,3
436,0
777,0
126,2
Íleo - espessura da
mucosa
Controle
12 417,5 398,8
378,0
515,7
42,3
Experimento
12 528,1 522,7
420,0
639,0
52,0
Controle
12 212,5 205,7
182,7
274,7
26,7
Cólon - espessura da
mucosa
0,011
<0,001
Experimento 12 240,9 241,0
168,7 279,7
31,8
0,027
TABELA 1 - AVALIAÇÃO DA ESPESSURA DA MUCOSA DO JEJUNO, NO ÍLEO E NO CÓLON NO
GRUPO EXPERIMENTO E CONTROLE
42
GRÁFICO 1 - AVALIAÇÃO DA ESPESSURA DA MUCOSA DO JEJUNO, NO ÍLEO E NO CÓLON NO
GRUPO EXPERIMENTO E CONTROLE
FIGURA 11 – COLORAÇÃO DE HEMATOXILINA E EOSINA
NOTA: Espessura da mucosa no grupo experimento.
LEGENDA: A) Jejuno excluso. B) Íleo Termina. C) Cólon Ascendente
43
4.1.2 Altura dos vilos
Com relação a variável altura dos vilos (Apêndice 4), verificou-se diferença
significativa quando comparados o íleo ao grupo controle (p<0,001) sendo a média
do grupo experimento maior que a do grupo controle (Tabela 2, Gráfico 2 e Figura
12).
Variável
Jejuno - altura dos vilos
Íleo - altura dos vilos
Média Mediana Mínimo Máximo Desvio Valor
padrão de p
Grupo
n
Controle
12 316,8 303,7
275,7
372,3
35,2
Experimento 12 351,3 356,8
256,0
444,7
69,9
Controle
185,0
278,0
32,8
12 221,1 219,0
0,145
Experimento 12 314,8 309,7
240,3 372,3
37,8
<0,001
TABELA 2 - AVALIAÇÃO DA ALTURA DOS VILOS DO JEJUNO E DO ÍLEO NO GRUPO
EXPERIMENTO E CONTROLE
GRÁFICO 2 - AVALIAÇÃO DA ALTURA DOS VILOS DO JEJUNO E DO ÍLEO NO GRUPO
EXPERIMENTO E CONTROLE
44
FIGURA 12 – COLORAÇÃO DE HEMATOXILINA E EOSINA
NOTA: Comparação da altura dos vilos no grupo experimento (A e B) versus grupo controle (C e D).
LEGENDA: A e C) Íleo Terminal. B e D) Jejuno excluso.
4.1.3 Profundidade das críptas
Com relação a variável profundidade das críptas (Apêndice 5), verificou-se
diferença significativa quando comparados o jejuno ao grupo controle (p<0,001)
sendo a média do grupo experimento maior que a do grupo controle (Tabela 3,
Gráfico 3 e Figura 13).
Média Mediana Mínimo Máximo Desvio Valor
padrão de p
Variável
Grupo
n
Jejuno - profundidade
de criptas
Controle
12 134,4 126,0
96,3
216,3
30,8
Experimento 12 239,1 232,7
162,3
347,3
59,8
Íleo - profundidade de Controle
12 196,6 198,0
criptas
Experimento 12 213,2 219,8
117,7
261,7
39,1
150,0
266,7
34,0
<0,001
0,280
TABELA 3 - AVALIAÇÃO DA PROFUNDIDADE DAS CRÍPTAS DO JEJUNO E DO ÍLEO NO GRUPO
EXPERIMENTO E CONTROLE
45
GRÁFICO 3 - AVALIAÇÃO DA PROFUNDIDADE DAS CRÍPTAS DO JEJUNO E DO ÍLEO NO
GRUPO EXPERIMENTO E CONTROLE
FIGURA 13 – COLORAÇÃO DE HEMATOXILINA E EOSINA
NOTA: Comparação da profundidade de criptas no grupo experimento (A e B) versus grupo controle (C e D).
LEGENDA: A e C) Íleo Terminal. B e D) Jejuno excluso.
4.2 KI-67 - COMPARAÇÃO ENTRE EXPERIMENTO E CONTROLE
Considerando-se a expressão do Ki-67 (Apêndice 6) em cada local de
avaliação e as diferenças entre os locais, testou-se a hipótese nula de que as
médias são iguais para os dois grupos, versus a hipótese alternativa de médias
diferentes (Tabela 4, Gráfico 4 e Figura 14).
46
Avaliação
CÓLON
ÍLEO
JEJUNO
Média
Mediana Mínimo
Máximo Desvio
padrão
Experimento 12
40,92
39,50
35,00
52,00
4,93
Controle
12
49,67
49,50
47,00
52,00
1,72
Experimento 12
83,50
84,50
75,00
89,00
4,64
Controle
12
85,00
85,00
82,00
87,00
1,54
Experimento 12
87,00
86,00
78,00
94,00
4,31
Grupo
n
Valor de
p
<0,001
0,307
Controle
12
84,92
85,00
83,00
89,00
1,73
0,142
TABELA 4 - EXPRESSÃO DO KI-67 DO JEJUNO, DO ÍLEO E DO CÓLON NO GRUPO
EXPERIMENTO E CONTROLE
GRÁFICO 4 - EXPRESSÃO DO KI-67 DO JEJUNO, DO ÍLEO E DO CÓLON NO GRUPO
EXPERIMENTO E CONTROLE
47
FIGURA 14 – IMUNOISTOQUIMICA DE KI-67
NOTA: Comparação entre grupo experimento (A, B e C) com grupo controle (D, E e F).
LEGENDA: A e D) Jejuno excluso. B e E) Íleo Terminal. C e F) Cólon Ascendente.
Os resultados indicaram que existe diferença significativa entre os grupos
em relação à expressão do Ki-67 no cólon (p < 0,001). Houve uma expressão média
maior do grupo controle do que no grupo experimento (médias 49,67 e 40,92,
respectivamente). Não foram encontradas diferenças significativas entre os grupos
em relação à expressão de Ki-67 no jejuno e no íleo.
48
5 DISCUSSÃO
O rato é considerado como espécie convencional de laboratório dentre os
conceitos de bioterismo. Assim, apresenta algumas características favoráveis como
a capacidade de viver em ambiente totalmente artificial e consumir dieta
padronizada. Entre as vantagens de utilizá-lo em experimentos, encontram-se a sua
fácil manutenção e observação. Além disso, existe a possibilidade de trabalhar com
um número maior de animais que possuem ciclos vitais curtos e a possibilidade de
contar com padronização genética. Outra vantagem é o fato de existir sobre ele uma
grande quantidade de informações sobre sua anatomia e fisiologia na literatura
(YAGUSHITA, 2006).
À semelhança deste estudo, o rato foi o modelo animal selecionado para
avaliação da adaptação intestinal após derivação jejunoileal por TILSON e
LIVSTONE (1980); SCUDAMORE e FREEMANN (1983); HERMANEK e
NARISAWA (1984); BRISTOL, WELLS e WILLIAMSON (1984) e por WILLIAMSON e
RAINEY (1984).
A exemplo de outras pesquisas também utilizamos o rato como animal de
experimentação pelas condições adequadas e específicas de ambiente, alojamento
e fácil manuseio tanto para o procedimento anestésico como para o cirúrgico.
A derivação jejunoileal é a uma modalidade de cirurgia disabsortiva que
apresenta baixa complexidade em sua realização em ratos. O modelo apresenta
muitas variações. SCUDAMORE e FREEMANN (1983) realizaram a anastomose da
derivação jejunoileal em 35 ratos Wistar a 35 cm da válvula ileocecal, entretanto, o
local da secção do jejuno foi a 5 cm do ângulo de Treitz para resultar em uma
disabsorção de 50%. Na presente pesquisa a anastomose jejunojejunal foi realizada
no jejuno a 10 cm do ângulo de Treitz com segmento jejunal a 60cm da valvula
ileocecal. A diferença provável no local da secção jejunal entre os trabalhos
provavelmente foi devida à diferença de faixa de peso dos animais selecionados
para estudo: os ratos utilizados por SCUDAMORE e FREEMANN pesavam entre
140 e 160 g, contra media de 347 g dos animais utilizados no presente estudo.
BRISTOL, WELLS e WILLIAMSON (1984) se utilizaram de ratos SpragueDawley (pesando em média 380g), nos quais foi realizada uma disabsorção de 85%
da área do intestino delgado. Como a maioria das cirurgias com algum componente
49
disabsortivo atualmente realizadas para o tratamento de pacientes com obesidade
mórbida possui índices de derivação menores que 85% (BUCHWALD e WILLIAMS,
2004), o modelo com exclusão da metade do intestino delgado foi o escolhido
diferente do presente estudo que tem como finalidade avaliar as alterações
histológicas após realização de anastomose jejunojejunal que também é utilizada na
derivação gastrojejunal em Y de Roux em seres humanos.
XU, et al. (2002) descreveram um modelo experimental de derivação
gástrica em ratos. Ambos os princípios fisiológicos que fundamentam as operações
bariátricas foram utilizados: restrição e disabsorção. Este modelo é uma reprodução
mais fiel do mais freqüente procedimento usado para o tratamento da obesidade em
humanos, entretanto, devido à sua complexidade e à indisponibilidade em nosso
meio de materiais de grampeamento mecânico para anastomoses, este
procedimento operatório restritivo não foi utilizado no presente experimento.
Dentre os marcadores utilizados no estudo das alterações morfológicas da
mucosa colônica relacionados ao aumento da sua exposição aos sais biliares
encontram-se: análise histológica simples (MCFARLAND, et al., 1987), contagem da
produção de tumores em animais submetidos a indução com carcinógeno
(SCUDAMORE e FREEMAN, 1983; HERMANEK e NARISAWA, 1984; BRISTOL
WELLS E WILLIAMSON, 1984), e a morfometria das criptas (BRISTOL, WELLS e
WILLIAMSON, 1984; WILLIAMSON e RAINEY, 1984).
Para avaliação da proliferação celular os pesquisadores revisados se
utilizaram da taxa de produção de células crípticas através de estudo de captura de
metáfases (a segunda fase da divisão celular) de cultura celular com vincristina
(APPLETON, et al., 1988); do Ki-67 (AKEDO, et al., 2001; FRACCHIA, et al., 2005;
NEVES et al. 2009); timidina tritiada (OTTAVIANI, et al., 1999) em nosso estudo
utilizamos o Ki-67 para a avaliação da proliferação celular e observamos que não
houve diferenças significativas entre os grupos em relação à expressão deste
marcador no jejuno e no íleo. No cólon houve diferença significativa entre os grupos
em relação à expressão do Ki-67.
SYLVAN, et al. (1992) avaliaram o risco de câncer colorretal após derivação
jejunoileal em 30 mulheres operadas de 11 a 17 anos antes. As biópsias foram
retiradas do ceco, cólon ascendente, transverso, descendente, sigmóide e reto.
Estas amostras foram submetidas à avaliação histológica e a análise de
50
anormalidades no DNA por citometria de fluxo. Contrariamente ao estudo de Teixeira
(2006), por este método, seus resultados não demonstram aumento da atividade
proliferativa da mucosa colônica do grupo submetido à cirurgia. No presente estudo
o p53 foi negativo em todos os casos e no cólon ascendente observamos
proliferação celular pela impregnação do Ki-67 após anastomose jejunojejunal.
Deve-se ressaltar a relação evidente entre o metabolismo dos sais biliares e
a alteração da dinâmica do epitélio colônico. Conforme os estudos de TILSON e
LIVSTONE (1980); SCUDAMORE e FREEMANN (1983); BRISTOL, WELLS e
WILLIAMSON (1984); WILLIAMSON e RAINEY (1984); APPLETON, et al. (1988);
KOZONI, et al. (2000) fica estabelecido que as cirurgias disabsortivas exercem
efeitos proliferativos sobre a mucosa colônica, ainda que exista quem discorde
(HERMANEK e NARISAWA, 1984; SYLVAN, et al., 1992). Ao contrario dos autores
acima não observamos aumento significativo da proliferação celular no cólon
ascendente do grupo experimento após derivação jejunojejunal.
A importância da relação entre a proliferação celular e a carcinogênese
enfatizada pelos trabalhos de WILLIAMSON et al. (1983, 1984) é corroborada por
publicação de AKEDO et al. (2001), onde foi avaliada a taxa de proliferação celular
da mucosa colônica normal de pacientes com história médica prévia de um ou mais
tumores colônicos (cânceres precoces, os quais são definidos como tumores com
profundidade de invasão que está limitada à camada muscular ou submucosa,
adenomas ou ambos). Cento e seis espécimes do cólon sigmóide e 130 do cólon
ascendente de 246 pacientes foram submetidos a análise do índice de marcação
pelo Ki-67 (a exemplo do PCNA, um método imunoistoquímico para avaliação de
proliferação). Os autores relataram que os pacientes com os índices de marcação
mais altos no terço superior em mucosa aparentemente normal do sigmóide, mas
não no cólon ascendente, tiveram significativamente mais tumores na colonoscopia
de controle realizada dois anos após. Eles concluíram que os altos índices de
marcação do Ki-67 no terço médio de mucosa de aparência normal do sigmóide
indicam um alto risco para o câncer colorretal. Assim, no estudo de TEIXEIRA
(2006) ,os ratos submetidos à derivação jejunoileal, teoricamente, teriam uma maior
chance de desenvolverem neoplasias colorretais.
Segundo o modelo proposto por FEARON e VOLGESTEIN (1990), a
carcinogênese colorretal se inicia a partir de alterações proliferativas, e
51
subsequentemente surgem alterações estruturais da mucosa. O papel
desempenhado pela proliferação celular na transformação maligna e no
subseqüente crescimento dos tumores colorretais é complexa (GILLIAND, et al.,
1996).No presente estudo não podemos afirmar indícios de carcinogenese pois a
p53 utilizado como marcador tumoral foi negativo em todos os casos, e a
proliferação celular no cólon ascendente foi menor no grupo experimento do que no
controle.
Nos trabalhos realizados com o objetivo de analisar as alterações mucosas
do intestino grosso relacionadas à derivação jejunoileal, os períodos entre o
procedimento cirúrgico e o sacrifício dos animais variaram amplamente.
HERMANEK e NARISAWA (1984) realizaram indução de câncer com instilações
intra-retais de nitrosamina. Eles sacrificaram os animais 32 semanas após a cirurgia,
e não foram capazes de constatar diferenças na produção de tumores do intestino
grosso entre os grupos controle e experimento. Um período similar de seguimento,
(30 semanas) foi adotado por BRISTOL, WELLS e WILLIAMSON (1984) ao
analisarem a da taxa de produção de células crípticas e a profundidade das criptas
(morfometria) dos terços médio e distal do colorreto após derivação jejunoileal de
85% em ratos. Os autores observaram que as criptas dos animais submetidos à
cirurgia eram de 25% (terço distal) a 33% (terço médio) mais profundas que as do
grupo controle. A taxa de produção de células crípticas aumentou mais que o dobro
no terço médio e triplicou no terço distal: corroborando os resultados do estudo de
TEIXEIRA (2006).
Entretanto, SCUDAMORE e FREEMANN (1984), com apenas 6 semanas
conseguiram constatar diferenças entre a produção de tumores em cólons dos ratos
(induzidos com 1,2-dimetilhidrazina: um precursor do azoximetano) dos grupos
submetidos ou não à cirurgia.
KOZONI, et al. (2000) consideram 4 semanas como o período
correspondente aos estágios iniciais da carcinogênese. Diferentemente do estudo de
TEIXEIRA (2006), os autores avaliaram a proliferação e apoptose das células
epiteliais colônicas após instilação retal (duas vezes ao dia) de ácido litocólico
(ALC). O ALC causou aumento do comprimento das criptas comparadas com as do
grupo controle.
52
Neste estudo o período de 9 semanas entre o procedimento cirúrgico e a
morte dos animais foi escolhido por ter sido demonstrado através dos estudos
citados acima ser ele suficiente para avaliar a presença de alterações histológicas
relacionadas ao procedimento.
O lado direito dos cólons (ceco e cólon ascendente) é o mais suscetível aos
efeitos proliferativos da bile, pois, de todos os segmentos, é ele o mais exposto aos
sais biliares (THOMAS et al., 2001). WILLIAMSON e RAINEY (1984) com base na
resistência do ceco à indução de câncer, quando comparado aos outros segmentos
colônicos, levantaram a suposição da analogia dele com o apêndice humano. Por
estes motivos, no estudo de Teixeira, o segmento escolhido para a análise da
atividade proliferativa foi o cólon ascendente, corroborando com o presente estudo
que devido a anastomose jejunojejunal, o cólon ascendente fica mais exposto a
presença dos sais biliares.
5.1 PERSPECTIVAS FUTURAS
Em nossa opinião após os resultados do presente estudo a anastomose
jejunojejunal que é realizada na derivação gastrojejunal em Y de Roux mantendo
alça comum mais longa, sofre menor agressão dos efeitos proliferativos da bile e
menor exposição aos sais biliares do que as derivações que apresentam alça
comum mais curtas, como as jejunoileais.
É necessário a realização de novos estudos com outros marcadores do ciclo
e crescimento celular e da carcinogênese em diferentes tempos pós-operatórios.
53
6 CONCLUSÕES
1) No jejuno, a espessura da mucosa, altura dos vilos e profundidade das
criptas foi maior no grupo experimento do que no grupo controle, porém somente a
espessura da mucosa e a profundidade das críptas apresentaram significância
estatística
2) No íleo, a espessura da mucosa, altura dos vilos e profundidade das
criptas foi maior no grupo experimento do que no grupo controle, porém somente a
espessura da mucosa e a altura dos vilos apresentaram significância estatística.
3) No cólon ascendente houve diferença estatística na espessura da
mucosa.
4) A expressão do Ki-67 não apresentou diferenças significativas entre os
grupos controle e experimento no jejuno e no íleo. No cólon ascendente a expressão
do Ki-67 foi maior no grupo controle do que no grupo experimento, com significância
estatística.
5) A expressão do p53 foi negativa em todos os casos
54
REFERÊNCIAS
AKEDO, I.; et al. Evaluation of epithelial cell proliferation rate in normalappearing
colonic mucosa as a high-risk marker for colorectal câncer. Cancer Epidemiol.
Biomark. Prev. v.10, p.925-930, 2001
APPLETON, G.V.N.; et al. Rectal hyperplasia after jejunoileal bypass for morbid
obesity. Gut, v.29, p.1544-1548, 1988.
AZEVEDO, J. F.; et al. Análise morfométrica da parede intestinal do íleo de ratos
submetidos a intensa carência de proteínas. Arq. Ciênc. Vet. Zool. v. 10, n. 2, p.
85-89, 2007.
BACCHI, C. E.; GOWN, A. M. Detection of cell proliferation in tissue sections. Braz
J Med Biol Res. v. 26, p. 677-87, 1993.
BARONE, M.; et al. Demonstration of a direct stimulatory effect of bile salts on rat
colonic epitelial cell proliferation. Scand. J. Gastroenterol. v.37, n.1, p.88-94, 2002.
BRISTOL, J.B.; WELLS, M,; WILLIAMSON, R.C.N. Adaptation to jejunoileal bypass
promotes experimental colorectal carcinogenesis. Br. J. Surg. v.71, n.2, p.123-126,
1984.
BUCHWALD, H.; WILLIAMS, S. E. Bariatric surgery wolrldwide 2003. Obes. Surg. v.
14, p.1157-1164, 2004.
BUCHWALD, H.; WILLIAMS, S.E. Bariatric surgery wolrldwide 2003. Obes. Surg. v.
14, p.1157-1164, 2004.
CENTER OF DISEASES CONTROL AND PREVENTION. Disponível em:http://
www.cdc.gov/cancer/colorectal/pdf/CRC-FS2003.pdf Acesso em 19 set. 2011.
DÂMASO, A. Obesidade. Exercício e metabolismo Energético. Rio de Janeiro.
Guanabara Koogan, 2003.
DE VOGEL, J.; et al. Dietary heme injures surface epithelium resulting in
hyperproliferation, inhibition of apoptosis and crypt hyperplasia in rat colon.
Carcinogenesis. v. 29, n. 2, p. 398-403, 2008.
55
FEARON E. R.; VOLGESTEIN, B. A genetic model of colorectal câncer
tumorigenesis. Cell, n. 61, p. 759-767, 1990.
FRACCIA, M.; et al. Serum bile acids, programmed cell death and cell proliferation in
the mucosa of patients with colorectal adenomas. Dig. Liver Dis. n. 37, v. 7, p.
509-514, 2005.
GERDES, J. Ki-67 and other proliferation markers useful for immunohistological
diagnostic and prognostic evaluations in human malignancies. Semin Cancer Biol.
v. 1, n. 3, p. 199–206, 1990.
GILLIAND, R.; et al. Colorectal cell kinetics. Br. J. Surg. v.83, n.6, p.739-749, 1996.
HALL, P. A.; LEVISON, D. A. Assessment of cell proliferation in histological material.
J Clin Pathol. v.43, n.3, p.184-92, 1990.
HERMANEK, P. J.; NARISAWA, T. Nitrosamine-induced colonic carcinogenesis in
rats after jejuno-ileal bypass. Hepatogastroenterology. v. 31, n. 3, p. 133-134,
1984.
KOZONI, V.;et al. The effect of litocholic acid on proliferation and apoptosis during
the early stages of colon carcinogenesis: diferential effect on apoptosis in the
presence of a colon carcinogen. Carcinogenesis, v.21, n5. p.999-1005, 2000.
KREMEN, A.J.;LINNER, J.H.; NELSON, C.H.; An experimental evaluation of the
nutritional importance of proximal and distal small intestine. Ann. Surg. v.140, n.3, p.
439-448, 1954.
LANCHA, J. R. Obesidade – Uma Abordagem Multidisciplinar. Rio de Janeiro:
Ganabara Koogan, 2006.
LE ROUX, C. W.; et al. Gut Hypertrophy After Gastric Bypass Is Associated With
Increased Glucagon-Like Peptide 2 and Intestinal Crypt Cell Proliferation. Ann Surg.
v. 252, n. 1, p. 50-56, 2010.
MARTINEZ, C. A. R.; et al. Influência da localização do tumor na expressão tecidual
da proteína p53 em doentes com câncer colorretal: estudo de 100 casos. Rev. Col.
Bras. Cir. v. 35, n. 4, p. 235-243, 2008.
56
MARTINEZ, C. A. R.; et al. The effects of oxidative DNA damage and mutations in
the p53 protein on cells of the colonic mucosa with and without the fecal stream: an
experimental study in rats. Scand J Gastroenterol, v. 45, n. 6, p. 714-724, 2010
MCARDLE, C.S.; HOLE, D.J. Influence of volume and specialization on survival
following surgery for colorectal cancer. Br. J. Surg. v.91, p.610-617, 1994
MCFARLAND, R.J.; et al. Dysplasia of the colon after jejunoileal bypass. Br. J. Surg.
v.74, n.1, p.21-22, 1987
MILOVIC, V.; et al. Effects os deoxycholate on human colon cancer cells: apoptosis
or proliferation. Eur. J. Clin. Invest. v.32, n.1, p.29-34, 2002.
NEVES, L. R. O.; et al. Ki-67 and p53 in gastrointestinal stromal tumors--GIST. Arq
Gastroenterol. v. 46, n. 2:116-20, 2009.
NONOSE, R. Avaliação do padrão de expressão e do conteudo de mucinas na
mucosa cólica em modelo experimental de colite de exclusao: estudo em
ratos. [Dissertação] Universidade São Francisco, Bragança Paulista, SP. 2009.
NUSSRAT F. L.; et al. Immunohistochemical Expression of Ki-67 and p53 in
Colorectal Adenomas: A Clinicopathological Study. Oman Med J. v. 26, n. 4, p.
229-34, 2011.
OTTAVIANI, G.; et al. The prognostic value of cell proliferation in colorectal
adenomas assessed with tritiated thymidine and anti-proliferating cell nuclear
antigen. Cancer Detect. Prev. v.23, p.57-63, 1999.
PAIVA, F. P.; MAFFILI, V. V.; SANTOS, A. C. S. Curso de manipulação de animais
de laboratorio. FIOCRUZ, Ministerio da Saude. 2005.
PAYNE, J.H.; DEWIND, L.T.; COMMS, R.R. Metabolic observations in patients with
jejunocolic shunts. Am. J. Surg. v.106, p.273-289, 1963
RAMOS, E.J.B. Alterações bioquímicas, neuro-hormonais e gênicas após
bypass gástrico em ratos obesos. Dissertação (Doutorado) – setor de Ciências da
Saúde da Universidade Federal do Paraná. Curitiba, 2004.
57
RESCK, M. C. C.; et al. Estudo experimental das alterações morfologicas do
intestino grosso em ratos submetidos à operação de derivação jejunoileal.
[Tese]. UNICAMP, São Paulo, SP. 2010.
RIBEIRO, S. R.; et al. Perda de peso e estudo morfométrico da mucosa intestinal de
ratos submetidos à ressecção subtotal de intestino delgado: influência do uso de
dieta com glutamina. Rev. Hosp. Clin. v. 59, n. 6, p. 349-356, 2004.
SAINSBURY, A.; et al. Increased colorectal epithelial cell proliferation and crypt
fission associated with obesity and roux-en-Y gastric bypass. Cancer Epidemiol
Biomarkers Prev. v. 17, n. 6, p. 1401-1410, 2008.
SCOPINARO, N.; et al. Biliopancreatic bypass for obesity: II. Initial experience in
man. Br. J. Surg. v.66, n.9, p.618-620, 1979.
SCUDAMORE, C.H.; FREEMAN, H.J. Effects of small bowel transection, resection,
or bypass in 1,2-dimetilhidrazine-induced rat intestinal neoplasia. Gastroenterology,
v.84, n.4, p.725-731, 1983.
SEIGNEURIN, D.; GUILLAUD, P. Ki-67 antigen, a cell cycle and tumor growth
marker. Pathol Biol. v. 39, n. 10, p. 1020-1028, 1991.
SOUSA, W. A. Immunohistochemical evaluation of p53 and Ki-67 proteins in
colorectal adenomas. Arq Gastroenterol. v. 49, n. 1, p. 35-40, 2012.
SYLVAN, A.; et al. Colorectal cancer risk after jejunoileal bypass: dysplasia and DNA
content in longtime follow-up of patients operated on for morbid obesity. Dis. Colon
Rectum. v.35, n.3, p.245-248, 1992.
TEIXEIRA, H. M. Alterações da mucosa do intestino grosso após derivação
jejunoileal. [Dissertação] Instituto de Pesquisas Méicas da Universidade Evangélica
do Paraná, Curitiba. 2006.
THOMAS, L.A.; et al. Bile acid metabolism by frsch human colonic contents: a
comparison of caecal versus faecal sample. Gut., v. 49, p. 835-42, 2001.
TILSON, M. D.; LIVSTONE, E. M. Early prolliferative activity: its occurrence in the
crypts of small bowel and colon after partial small-bowell resection. Arch. Surg. v.
115, n.12, p.1481-1485, 1980.
58
VERNILLO, R.; et al. Immunohistochemical expression of p53 and Ki67 in colorectal
adenomas and prediction of malignancy and development of new polyps. Int J Biol
Markers. v. 23, n. 2, p. 89-95, 2008.
VIGUERAS, R. M.; et al. The histological effect of the human chorionic gonadotropin
and luteinizing hormone-releasing hormone on experimental cryptorchidism in rats.
Proc West Pharmacol Soc. v. 42, p. 71-73, 1999.
WILLIAMSON, R. C.; RAINEY, J. B. The relationship between intestinal hyperplasia
and carcinogenesis. Scand J Gastroenterol. v. 104 (Suppl.), p. 57-76, 1984.
WILLIAMSON, R.C.; et al. Contributions of bile and pancreatic juice to cell
proliferation in ileal mucosa. Surgery, v.83, n.5, p.570-576, 1978b
WILLIAMSON, R.C.; et al. Enhanced colonic carcinogenesis with azoxymethane in
rats after pancreaticobiliary diversion to mid small bowel. Gastroenterology, v.76, n.
6, p.1386-1392, 1979.
WILLIAMSON, R.C.; et al. Promotion of azoxymethane-induced colonic neoplasia by
resection of the proximal small bowel. Cancer Res. v.38, n.10, p.3212-3217, 1978a
WORLD HEALTH ORGANIZATION. Report of a WHO Consultation on Obesity.
Preventing and managing the global epidemic. WHO, Geneve, 1998.
XU, Y.; et al. Gastric bypass model in obese rats to study metabolic mechanisms of
weight loss. J. Surg. Res. v.107, n.1, p.56-63, 2002.
YAGUSHITA, N. Cicatrização induzida pela membrane de cellulose porosa
(Membracel®) em dorso de ratos. Dissertação (Mestrado em Princípios de
Cirurgia) – Instituto de Pesquisas Médicas da Universidade Evangélica do Paraná.
Curitiba, 2006.
59
ANEXO 1 - CARTA DE ACEITE DO COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA
60
APÊNDICES
APÊNDICE 1 - MEDIDAS DO PESO (EM GRAMAS) DOS RATOS DOS GRUPOS
EXPERIMENTO E CONTROLE
Dias
0
7
14
21
28
35
42
49
56
63
Experimento 1
350
277
280
288
308
318
321
323
331
330
Experimento 2
351
338
342
353
360
361
367
374
381
384
Experimento 3
361
341
345
349
356
361
366
373
380
382
Experimento 4
311
295
301
305
308
305
309
313
317
322
Experimento 5
352
324
333
341
347
354
363
365
371
373
Experimento 6
313
327
331
334
329
331
335
341
351
350
Experimento 7
360
355
352
360
363
371
374
385
387
389
Experimento 8
415
400
403
415
418
421
424
432
441
449
Experimento 9
321
312
311
315
323
331
337
343
351
356
Experimento 10 322
315
315
319
320
325
327
335
339
349
Experimento 11
438
423
426
411
409
415
417
425
431
443
Experimento 12 412
401
395
394
399
407
409
412
418
423
331
317
319
323
328
333
338
344
350
355
Média
Controle
1
389
391
398
405
406
410
412
409
415
420
Controle
2
362
368
371
376
379
383
387
390
392
395
Controle
3
332
341
344
349
351
354
358
342
343
345
Controle
4
324
326
329
335
339
341
343
347
351
353
Controle
5
345
348
352
355
359
363
366
370
371
374
Controle
6
321
326
329
332
336
340
344
345
348
350
Controle
7
401
408
410
412
416
419
423
427
430
432
Controle
8
374
379
383
386
389
392
394
399
401
403
Controle
9
389
392
397
399
402
407
410
412
415
418
Controle
10 367
370
374
379
381
385
389
392
395
398
Controle
11
345
348
352
355
359
361
364
367
370
372
Controle
12 402
406
409
411
414
420
425
427
430
430
363
367
371
375
378
381
385
386
388
391
Média
61
APÊNDICE 2 - EXPRESSÃO DO P53
P53
COLON
ILEO
JEJUNO
Experimento
1
N
N
N
Experimento
2
N
N
N
Experimento
3
N
N
N
Experimento
4
N
N
N
Experimento
5
N
N
N
Experimento
6
N
N
N
Experimento
7
N
N
N
Experimento
8
N
N
N
Experimento
9
N
N
N
Experimento
10
N
N
N
Experimento
11
N
N
N
Experimento
12
N
N
N
Controle
1
N
N
N
Controle
2
N
N
N
Controle
3
N
N
N
Controle
4
N
N
N
Controle
5
N
N
N
Controle
6
N
N
N
Controle
7
N
N
N
Controle
8
N
N
N
Controle
9
N
N
N
Controle
10
N
N
N
Controle
11
N
N
N
Controle
12
N
N
N
N = Coloração nuclear NEGATIVA.
Foi observada apenas coloração citoplasmática, inespecífica, para p53. Não foi
observada coloração nuclear.
62
APÊNDICE 3 - ESPESSURA DA MUCOSA
JEJUNO
ILEO
CÓLON
Experimento 1
457
395
456
500
544
521
244
253
233
Experimento 2
490
322
518
414
420
426
163
191
152
Experimento 3
588
567
512
350
720
467
204
220
210
Experimento 4
683
631
636
617
611
689
271
257
214
Experimento 5
817
819
681
544
486
541
278
303
258
Experimento 6
683
675
591
567
591
531
282
293
249
Experimento 7
886
804
641
441
501
501
227
232
208
Experimento 8
633
702
737
545
482
536
252
272
260
Experimento 9
747
612
575
592
564
477
215
241
256
Experimento 10
395
515
419
473
501
599
257
180
245
Experimento 11
461
604
639
572
572
559
234
324
277
Experimento 12
403
478
484
533
528
495
302
199
215
Controle
1
540
671
555
531
473
454
249
278
297
Controle
2
470
537
516
401
433
419
232
162
234
Controle
3
477
511
488
500
522
525
218
248
283
Controle
4
468
514
473
405
410
383
201
225
216
Controle
5
471
499
329
380
387
401
198
202
186
Controle
6
470
516
376
397
385
406
178
187
183
Controle
7
465
493
529
401
420
378
209
199
201
Controle
8
510
380
454
428
399
368
213
209
203
Controle
9
521
427
449
470
445
404
231
217
236
Controle
10
482
433
501
428
375
388
195
204
210
Controle
11
493
376
403
377
365
392
184
209
195
Controle
12 498
487
421
391
381
407
189 178 191
Foram realizadas medidas em 3 diferentes áreas das amostras. Em cada uma
delas foi medida a espessura total da mucosa (em micrômetros).
63
APÊNDICE 4 - ALTURA DOS VILOS
JEJUNO
ILEO
Experimento
1
285
251
232
310
321
341
Experimento
2
303
185
355
236
219
266
Experimento
3
351
360
307
405
416
266
Experimento
4
436
383
392
367
331
419
Experimento
5
407
494
374
316
262
282
Experimento
6
334
440
346
331
365
331
Experimento
7
497
432
405
281
323
301
Experimento
8
353
419
473
307
277
277
Experimento
9
491
377
353
393
336
326
Experimento
10
224
306
241
244
307
365
Experimento
11
297
350
374
307
336
299
Experimento
12
229
295
297
265
282
324
Controle
1
318
424
375
293
244
289
Controle
2
357
362
338
191
266
258
Controle
3
353
351
353
261
265
308
Controle
4
322
305
301
134
227
194
Controle
5
298
286
243
175
213
182
Controle
6
355
298
224
204
254
213
Controle
7
327
277
248
216
279
241
Controle
8
302
308
284
198
233
222
Controle
9
299
274
265
176
200
184
Controle
10
346
338
361
180
197
193
Controle
11
341
291
415
210
202
196
Controle
12
318
287
260
235
199
227
Foram realizadas medidas em 3 diferentes áreas das amostras. Em cada uma
delas foi medida a altura dos vilos (em micrômetros).
64
APÊNDICE 5 - PROFUNDIDADE DAS CRÍPTAS
JEJUNO
ILEO
Experimento
1
172
144
224
190
223
180
Experimento
2
187
137
163
178
201
160
Experimento
3
237
207
205
-55
304
201
Experimento
4
247
248
244
250
280
270
Experimento
5
410
325
307
228
224
259
Experimento
6
349
235
245
236
226
200
Experimento
7
389
372
236
160
178
200
Experimento
8
280
283
264
238
205
259
Experimento
9
256
235
222
199
228
151
Experimento
10
171
209
178
229
194
234
Experimento
11
164
254
265
265
236
260
Experimento
12
174
183
187
268
246
171
Controle
1
222
247
180
238
229
165
Controle
2
113
175
178
210
167
161
Controle
3
124
160
135
239
257
217
Controle
4
101
121
152
255
214
219
Controle
5
117
103
125
275
263
247
Controle
6
113
141
128
177
201
187
Controle
7
137
109
104
203
187
198
Controle
8
96
105
88
209
215
176
Controle
9
191
99
175
188
154
142
Controle
10
161
89
114
190
135
156
Controle
11
134
132
123
239
211
202
Controle
12
127
119
102
105
132
116
Foram realizadas medidas em 3 diferentes áreas das amostras. Em cada uma
delas foi medida a profundidade das críptas (em micrômetros).
65
APÊNDICE 6 - EXPRESSÃO DO KI-67
KI-67
COLON
ILEO
JEJUNO
Experimento
1
42%
89%
88%
Experimento
2
48%
89%
84%
Experimento
3
43%
75%
91%
Experimento
4
52%
82%
94%
Experimento
5
35%
84%
86%
Experimento
6
37%
85%
84%
Experimento
7
38%
81%
85%
Experimento
8
38%
77%
86%
Experimento
9
37%
85%
86%
Experimento
10
42%
80%
91%
Experimento
11
39%
89%
78%
Experimento
12
40%
86%
91%
Controle
1
47%
82%
86%
Controle
2
48%
87%
83%
Controle
3
52%
85%
89%
Controle
4
5.1%
8.6%
8.3%
Controle
5
4.9%
8.5%
8.5%
Controle
6
4.8%
8.3%
8.6%
Controle
7
4.8%
8.7%
8.5%
Controle
8
5.1%
8.4%
8.3%
Controle
9
5.2%
8.6%
8.4%
Controle
10
5.0%
8.5%
8.6%
Controle
11
4.9%
8.6%
8.4%
Controle
12
5.1%
8.4%
8.5%
Resultado expresso em % de núcleos corados para Ki-67.
Foram contadas 200 células em toda a espessura da mucosa, por experimento