universidade federal do rio grande do norte centro de
Propaganda
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS CURSO DE MESTRADO ÉRIKA GALVÃO DE LIMA CORRELAÇÃO ENTRE A INFECÇÃO GENITAL PELO VÍRUS DO PAPILOMA HUMANO, A RESPOSTA IMUNE E OS ACHADOS COLPOCITOLÓGICOS EM MULHERES GRÁVIDAS E NÃO GRÁVIDAS Orientador: Prof. Dr. José Veríssimo Fernandes NATAL / RN 2012 ÉRIKA GALVÃO DE LIMA CORRELAÇÃO ENTRE A INFECÇÃO GENITAL PELO VÍRUS DO PAPILOMA HUMANO, A RESPOSTA IMUNE E OS ACHADOS COLPOCITOLÓGICOS EM MULHERES GRÁVIDAS E NÃO GRÁVIDAS Dissertação de M estrado Programa de Pós-Graduação Biológicas do Centro de apresentada em ao Ciências Biociências, da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como parte dos requisitos para obtenção do título de M estre em Ciências Biológicas. Orientador: Prof. Dr. José Veríssimo Fernandes NATAL / RN 2012 AGRADECIMENTOS A Deus, que iluminou o meu caminho durante esta longa caminhada. Aos meus pais, Erinalva Galvão e Eugênio Pereira, pelo amor e carinho que sempre me dedicam e, principalmente, a minha mãe pela paciência com meus ataques, pelo apoio emocional e suporte financeiro durante essa jornada. A minha irmã, Ellen Galvão, por ter ideias loucas que não concordo e, por isso, brigarmos. Obrigada por me amar, mesmo que às vezes a materialização do meu amor não apareça, ele existe. Ao meu namorado, Herbert Azevedo, pelo colo e pelos abraços nos momentos de desespero, pela edição das figuras e por sempre ouvir histórias repetidas. Você me faz muito feliz! Aos meus familiares, tias (os), primas (os) pelo carinho e apoio. Em especial, quero agradecer a minha madrinha Edna Galvão e a minha tia/prima Jurelza Galvão por sempre estarem ao meu lado me ajudando a crescer e melhorar cada dia mais. Ao professor orientador, José Veríssimo Fernandes, pela paciência na orientação e por acreditar que eu seria capaz de realizar as tarefas necessárias para o sucesso do trabalho. Obrigada pela oportunidade! A equipe do LADIC (Laboratório de Doenças Infecciosas e Câncer), alunos e professores, que me ensinaram muito e que compartilharam comigo bons momentos de distração. Aqui ressaltando os alunos de iniciação científica, Raíza Nara, Juliana M edeiros, os que agora também são mestrandos M ário Branco, Daíse Sousa, e minha companheira de curso, já mestre, Cleine Aglacy Nunes M iranda, juntas passamos por diversas situações que fariam alguns desistirem pelo caminho. M as fomos forte e nos apoiamos mutuamente. Aos professores, Josélio M aria Galvão de Araújo e Paulo M arcos da M atta Guedes, pelo auxílio na montagem dos protocolos e pelas demais contribuições a esse trabalho. A todos os professores do curso de mestrado em Ciências Biológicas, que também foram importantes para o desenvolvimento deste trabalho. A secretaria, Louise da M atta, e a bolsista, Liege, por sempre resolver os problemas burocráticos e pela atenção dispensada. Aos meus amigos e colegas, pelo incentivo, força e apoio, por me fazerem rir e por me verem chorar. A vocês, Alessandra M arinho, Andrew Douglas, Byanca Vanderlei, Bruna Katherinny, Bruno M attos, Carla Gameiro, Dayse Santos, Diego Carvalho, Ermeton Duarte, Fernanda M arques, Gracielle Dantas, Hilarina Diniz, Jéssica Jales, Luana Lima, Luciana Rodrigues, Luíza Xavier, Olivia Souza, M aria Carolina Soares Lopes, M aria Cecília Santos, M urielle M orais, Paulo Sérgio Barros, Raquel Brito e Sthephanie Nassif. Quatro Leis da Espiritualidade 1 - A pessoa que vem é a pessoa certa Ninguém entra em nossas vidas por acaso. Todas as pessoas ao nosso redor, interagindo com a gente, têm algo para nos fazer aprender e avançar em cada situação. 2 - Aconteceu a única coisa que poderia ter acontecido Nada, absolutamente nada do que acontece em nossas vidas poderia ter sido de outra forma. Mesmo o menor detalhe. Não há nenhum “se eu tivesse feito tal coisa…”. O que aconteceu foi tudo o que poderia ter acontecido, e foi para aprendermos a lição e seguirmos em frente. Todas e cada uma das situações que acontecem em nossas vidas são perfeitas. 3 - Toda vez que você iniciar é o momento certo Tudo começa na hora certa, nem antes nem depois. Quando estamos prontos para iniciar algo novo em nossas vidas, é que as coisas acontecem. 4 - Quando algo termina, termina Estamos nessa vida para viver inúmeras experiências, e se continuarmos sempre voltando às mesmas páginas deixaremos de ler outros livros maravilhosos que só estão aguardando por uma chance para entrar em nossas vidas. Por isso vire a última página sem dor no coração e pegue o próximo livro. Surpresas maravilhosas estarão te esperando, basta você abrir o livro e começar a ler esse novo capítulo da sua vida. LISTA DE FIGURAS Página Figura 1. Representação esquemática do genoma do HPV mostrando o 25 arranjo dos genes precoces E ou genes não estruturais, dos genes do capsídeo (L1 e L2) e da região não codificante URR. Figura 2. Estrutura do HPV. Salientando a localização das proteínas do 29 capsídeo L1 e L2 e a maneira como o DNA genômico e as histonas se agrupam. Figura 3. A infecção por HPV reduz a expressão de IFN-γ e TNF-α na 50 cérvice uterina. Figura 4. Pacientes infectadas por HPV apresentam aumento da expressão de TGF-β e redução na expressão de IL-10 na cérvice uterina. 51 LISTA DE TABELAS Página Tabela 1. As proteínas do HPV e suas funções. 24 Tabela 2. Categorização dos grupos para análise de citocinas. 43 Tabela 3. Sequência de primers usados no estudo. 43 Tabela 4. Perfil sociodemográfico das participantes do estudo. 45 Tabela 5. Prevalência da infecção genital por HPV em mulheres grávidas e 46 não grávidas Tabela 6. Correlação entre o resultado dos exames citomorfológicos e a 47 presença de HPV em mulheres grávidas e não grávidas Tabela 7. Comparação da eficiência de dois exames citomorfológicos para 48 a detecção de lesão por HPV em 56 com PCR positiva para HPV. Tabela 8. Associação entre a infecção genital por HPV com características socioeconômicas e fatores de risco clássicos para doenças sexualmente transmissíveis. 49 ABREVIATURAS E SIGLAS A APC Célula Apresentadora de Antígeno B β-actina Proteína do citoesqueleto β-globina Proteína do citoesqueleto C CD1d M embro da família do CD (cluster de diferenciação)-1d CD40 M olécula coestimulatória membro da família do CD (cluster de diferenciação) CD80 M olécula coestimulatória membro da família do CD (cluster de diferenciação) CD86 M olécula coestimulatória membro da família do CD (cluster de diferenciação) CT Limiar do ciclo ou Thersohld Cycle CTL Linfócito T citotóxico D DC Célula Dendrítica DNA Ácido desoxirribonucleico DNA-c DNA complementar E E1 Proteína precoce E1 E2 Proteína precoce E2 E4 Proteína precoce E4 E5 Proteína precoce E5 E6 Proteína precoce E6 E7 Proteína precoce E7 et al. Expressão latina “Et alii” que significa "e outros" G GATA-3 Fator de transcrição de células T H HIF-1 Fator de transcrição induzido por de hipóxia-1 HPV Vírus do Papiloma Humano HSV-2 Vírus Herpes Simples tipo 2 Hu Human I IC Intervalo de confiança IFN Interferon IFN-α Interferon alfa IFN-β Interferon beta IFN-γ Interferon gama IFN-κ Interferon kappa IgA Imunoglobulina A IgG Imunoglobulina G IL-1 Interleucina-1 IL-4 Interleucina-4 IL-5 Interleucina-5 IL-6 Interleucina-6 IL-10 Interleucina-10 IL-12 Interleucina-12 IL-13 Interleucina-13 IL-15 Interleucina-15 IL-17 Interleucina-17 IL-17A Interleucina-17ª IL-17F Interleucina-17F IL-18 Interleucina-18 IL-21 Interleucina-21 IL-22 Interleucina-22 IL-23 Interleucina-23 IL-26 Interleucina-26 IRF-1 Fator de regulação do Interferon-1 IRF-3 Fator de regulação do Interferon-3 J JEC Junção escamocolunar L LC Célula de Langerhans L1 Proteína tardia L1 L2 Proteína tardia L2 M M ALT Tecido linfoide associado à mucosa M CH Complexo Principal de Histocompatibilidade M HC-I Complexo Principal de Histocompatibilidade de classe I min M inutos N N Número amostral NK Células “natural killers” P p Nível de significância pb Pares de bases PCR Reação em Cadeia da Polimerase PKR Proteína Quinase R pRb Proteína supressora de tumor pRb PRR Receptores de Reconhecimento de Padrão p53 Proteína supressora de tumor p53 R RC Razão de Chance RN Rio Grande do Norte RNA Ácido ribonucleico RNA-m RNA mensageiro RNA-t RNA transportador S STAT-1 Fator de transcrição membro da família STAT (Signal Transducers and Activators of Transcription) -1 STAT-3 Fator de transcrição membro da família STAT (Signal Transducers and Activators of Transcription) -3 SUS Sistema Único de Saúde T TBE Tris-borato de EDTA T-Bet Fator de transcrição T-Bet T CD4+ Linfócitos T CD4 T CD8+ Linfócitos T CD8 TCLE Termo de consentimento livre e esclarecido Th1 Resposta imunológica do tipo Th1 Th2 Resposta imunológica do tipo Th2 Th3 Tipo de linfócito T regulador Th17 Resposta imunológica do tipo Th17 TGF-β Fator de transformação do crescimento TLR Receptores semelhantes à TOLL TLR9 Receptores semelhantes à TOLL-9 TNF Fator de necrose tumoral TNF-α Fator de necrose tumoral alfa Treg Resposta imunológica do tipo T regulatória Tr1 Tipo de linfócito T regulador Tyk2 Proteína Tirosina Quinase sem receptor-2 U URR Região reguladora não codificante SÍMBOLOS ~ Aproximadamente c/ Com Δ Delta ºC Graus Celsius > M aior que > M aior ou igual que < M enor que < M enor ou igual que ® M arca registrada µg M icrograma µL M icrolitro mL M ililitro nm Nanômetro % Percentual s/ Sem ™ Trade M ark U/mL Unidades por mililitro SUMÁRIO Página 1. 2. 2.1. 2.2. 2.3. 2.3.1. 2.3.2. 2.4. 2.4.1. 2.4.2. 3. 3.1. 3.2. 4. 5. 5.1. 5.2. 5.2.1. 5.2.2. 5.3. 5.4. 5.5. 5.5.1. 5.5.2. 5.6. 6. 7. 8. 9. 10. 10.1. 10.2. 10.3. 10.4. 10.4.1. 10.4.2. 10.4.3. INTRODUÇÃO REVISÃO DE LITERATURA O Papilomavírus Humano Classificação do Papiloma Vírus Humano Patogênese Persistência versus Eliminação Mecanismos de Evasão Imune Imunologia do Trato Genital Imunidade da Mucosa Anogenital Imunidade Adaptativa OBJETIVOS Objetivo Geral Objetivos Específicos DELINEAMENTO EXPERIMENTAL PACIENTES E MÉTODOS Local do Estudo e Obtenção das Amostras Exames Citomorfológicos Citologia Colposcopia Extração do DNA das Células Cervicais Reação em Cadeia da Polimerase para a Análise e Detecção do DNA de HPV Quantificação de Citocinas e Fatores Transcricionais das Respostas Th1, Th2, Th17 e de Linfócitos T Reguladores Extração de RNA e síntese de cDNA Análise da Expressão de Citocinas através de PCR em Tempo Real Análise Estatística RESULTADOS DISCUSSÃO CONCLUSÕES REFERÊNCIAS ANEXOS Nomenclatura Atual para Descrição e Classificação dos Achados Colposcópicos Fluxograma de colposcopia Categorização das Citocinas Analisadas no Estudo Considerações Éticas Questionário Termo de Consentimento Livre e Esclarecido Parecer do Comitê de Ética 18 22 22 23 26 26 27 33 33 33 37 37 37 38 39 39 39 39 40 40 41 41 41 42 43 44 52 59 60 67 67 68 69 70 70 72 74 RESUMO A infecção genital pelo vírus do papiloma humano (HPV) é muito frequente entre homens e mulheres em todo o mundo, afetando em especial mulheres jovens, constituindo-se em grave problema de saúde pública nas regiões menos desenvolvidas, sendo favorecida pelas condições precárias de vida da população. A citologia oncótica e a colposcopia têm notória importância no diagnóstico das lesões precursoras do câncer do colo uterino e, portanto, na sua prevenção. No entanto, mesmo com a disponibilidade dessas ferramentas diagnósticas o número de mulheres que desenvolvem câncer do colo do útero ainda é elevado. Esse estudo tem por objetivo avaliar a prevalência de infecção do trato genital por HPV, em mulheres grávidas e não grávidas, avaliando o perfil da resposta imune apresentado pelas mulheres desses dois grupos, visando estabelecer correlações entre o perfil de resposta imune, a presença do vírus e ocorrência de lesões da cérvice uterina. Foram incluídas neste estudo 221 pacientes, sendo 91 grávidas e 130 não grávidas, com idade variando de 14 a 72 anos. As mulheres foram submetidas a uma avaliação colpocitológica para a detecção de possíveis alterações na cérvice uterina e em seguida coletados espécimes para análise por meio da reação em cadeia da polimerase (PCR) convencional para detecção do HPV e PCR em tempo real p ara detecção de RNA mensageiro (RNA-m) de citocinas pró-inflamatórias e antiinflamatórias. A prevalência global da infecção genital pelo HPV, encontrada neste estudo, foi de 28,1%, sendo 31,9% em pacientes grávidas e 25,4% nas não grávidas. As mulheres jovens com até 30 anos e aquelas com baixa escolaridade apresentaram maior risco de ter infecção pelo HPV. A colposcopia apresentou melhor correlação com a detecção do DNA do HPV por PCR, quando comparada à citologia. De um modo geral, as pacientes infectadas pelo HPV, grávidas ou não, apresentaram uma redução da expressão de RNA-m tanto para as citocinas pró-inflamatórias (IFN-γ, TNF-α), quanto para a citocina anti-inflamatória (IL-10) em relação às pacientes não infectadas com HPV. Nas pacientes não grávidas e infectadas, a expressão do RNA-m para IL-17 mostrou-se aumentada nas pacientes sem lesões, enquanto que, aquelas com lesão apresentaram maior expressão do RNA-m para TGF-β. As mulheres grávidas e infectadas pelo HPV e sem lesão, apresentaram aumento na expressão do RNA-m para TGF-β. Não houve diferença de prevalência do HPV entre mulheres grávidas e não grávidas. Observou-se uma redução da produção de citocinas pró-inflamatórias, exceto IL-17, em todas as mulheres infectadas pelo HPV, e um aumento de TGF-β, nas mulheres infectadas pelo HPV grávidas ou não. Os resultados sugerem que, nas mulheres deste estudo, a infecção pelo HPV promoveu uma alteração no perfil de citocinas necessárias para a ativação de uma resposta imune efetiva, possivelmente favorecendo a persistência viral. Palavras chave: vírus do papiloma humano, infecção genital, HPV na gravidez, citologia, colposcopia, citocinas. ABSTRACT The genital HPV infection is very common between men and women worldwide, affecting particularly young women, constituting a serious public health problem in less developed regions, favored by the poor living conditions of population. The cytology and colposcopy have notorious importance in the diagnosis of precursor lesions of cervical cancer and therefore its prevention. However, even with such diagnostic tools, the number of women who develop cervical cancer is still high. This study aims to assess the prevalence of genital tract infection by HPV in pregnant and nonpregnant women, evaluating the profile of the immune response presented by the women of these two groups in order to establish correlations among profile of immune response, presence of virus and occurrence of lesions of the uterine cervix. We analyzed specimens obtained from the cervix of 221 patients, 91 pregnant and 130 non-pregnant, aged 14-72 years. The women were subjected to colposcopic and cytologic evaluation detect possible changes in the cervix and then samples were collected in order to perform HPV detection by PCR and real-time PCR for detection of mRNA of proinflammatory and anti-inflammatory cytokines. In the present study, the overall prevalence of HPV genital infection was 28.1%; of which 31.9% were pregnant patients and 25.4% in non-pregnant women. Young women under 30 years and those with low educational level education showed a higher risk of HPV infection. Colposcopy showed better correlation with detection of HPV DNA by PCR, when compared to cytology. Generally, HPV infected patients, pregnant or not, exhibited reduced mRNA expression of both pro-inflammatory (IFN-γ, TNF-α) and anti-inflammatory (IL -10) cytokines, when compared to patients not infected by HPV. Nonpregnant patients infected presented increase mRNA expression of IL-17 in patients without injury, whereas those with lesion showed higher mRNA expression of TGF-β. Pregnant women without injury infected exhibited increased mRNA expression of TGF-β. There was no difference in HPV prevalence between pregnant and nonpregnant women. There was a reduction of pro-inflammatory cytokines, except IL-17, in all women infected by HPV. M oreover, we observed an increase of TGF-β in HPV-infected women who are pregnant or not. The results suggest that, in women in this study, HPV infection promoted changes in the profile of cytokines necessary for activation of effective immune response, possibly favoring viral persistence. Keywords: human papillomavirus, genital infection, HPV in pregnancy, cytology, colposcopy, cytokines. 18 1. INTRODUÇÃO O papilomavírus humano (HPV) é uma das causas mais comuns de doença sexualmente transmissível em homens e em mulheres em todo o mundo, especialmente nos países em desenvolvimento, onde a prevalência da infecção assintomática varia de 2 a 44%, dependendo da região geográfica e da população estudada (De SANJOSÉ et al., 2007). Nesses países menos desenvolvidos, a infecção por esse vírus constitui-se em um grave problema de saúde pública, favorecido pelas precárias condições de vida das populações, tendo em vista os baixos níveis socioeconômicos e educacionais (SHIELDS et al., 2004). As taxas de prevalência de infecção pelo HPV também variam amplamente, de acordo com a idade específica, o que parece em grande parte refletir diferenças no comportamento sexual entre as populações de diferentes partes do mundo (SM ITH et al., 2008). Estudos mostram que a maioria dos indivíduos sexualmente ativos estão mais expostos e adquirem a infecção por este vírus em alguma fase de suas vidas (BASEM AN; KOUTSKY, 2005; TROTTIER; FRANCO, 2006; BOSCH; De SANJOSÉ; CASTELLSAGUÉ, 2008). A infecção pelo HPV é mais prevalente em mulheres jovens, que são mais vulneráveis aos vírus e muitas vezes se tornam infectadas ao mesmo tempo por vários genótipos do HPV. A infecção é adquirida, em geral, logo após o início da sua atividade sexual, apresentando maiores taxas nas mulheres com até 30 anos, observando-se uma redução na taxa de prevalência com o aumento da idade, provavelmente devido à redução da atividade sexual ou como resultado do desenvolvimento de uma resposta imune contra o vírus (CASTLE et al., 2005; FERNANDES et al., 2008; SM ITH et al., 2008; CHAN et al., 2010). Estima-se que cerca de 19 milhões de novos casos de infecção por HPV ocorrem anualmente em mulheres sexualmente ativas em todo o mundo, e destes, quase metade em adolescentes (M ALHORTA, 2008). A maioria das infecção por HPV é transitória e cura espontaneamente, sem qualquer tratamento. Entretanto, em um número pequeno, porém significativo de indivíduos, a infecção torna-se persistente, permanecendo latente por tempo variável, sendo posteriormente reativada e podendo resultar em lesões precursoras de diferentes graus, as quais podem progredir para o câncer de colo do útero (BURD, 2003; VILLA, 2003; OPPELT et al., 2009). 19 Em um estudo de meta-análise CLIFFORD et al., 2005a, relatam taxas de prevalência da infecção pelo HPV em mulheres com citologia normal que varia de 1,4% na Espanha a 25,6% na Nigéria. Em quatro países do continente asiático, a prevalência média relatada foi de 8,7% com a maior taxa encontrada na Índia (14,2%). Em três países da Europa, a taxa média de prevalência foi de 5,2% sendo a maior delas encontrada na Itália (9,2%). Nos três países da América do Sul incluídos no estudo, a taxa média de prevalência foi de 14,3%, sendo a maior encontrada na Argentina (16,3%). Em outra meta-análise realizada por CLIFFORD et al., 2005b, abrangendo estudos realizados em mulheres com lesões de baixo grau, foram encontradas taxas médias de prevalência de 59,1% na África, 67,1% na Ásia, 67,8% na Europa, 68,3% nas Américas do Sul e Central e de 80,1% na América do Norte. No Brasil, são relatadas diferentes taxas de prevalência da infecção genital pelo HPV em mulheres com citologia normal. ELUF-NETO et al., 1994, encontraram uma taxa média de prevalência 17,0% em mulheres de São Paulo. Em estudo multicêntrico que incluiu amostras de mulheres do Brasil por BOSCH et al., 1995, encontraram uma taxa de prevalência de 13,0%. Em um estudo realizado em mulheres do Rio Grande do Sul por NONNENM ACHER et al., 2002, relataram uma taxa de prevalência de 27,0%. FRANCO et al., 1995, observaram para mulheres do Nordeste brasileiro taxa de prevalência de 18,3%. LORENZATO et al., 2000, encontraram taxa de prevalência 19,5%. No Rio Grande do Norte, FERNANDES et al., 2008, encontraram taxa de prevalência de 24,5%. O curso natural da infecção pelo HPV sofre influência de fatores intrínsecos do vírus e do hospedeiro, incluindo herança genética, estado imune, modificações hormonais e comportamento sexual, além de fatores físicos, químicos e ambientais (VILLA, 1997; M UÑOZ, 2000; COELHO et al., 2004; M UÑOZ et al., 2006). SOUZA & VILLA, em 2003, mostraram que a ocorrência de polimorfismo nos genes do complexo principal de histocompatibilidade (M HC) e no gene da proteína supressora de tumor p53, códon 72, parecem estar associados com maior ou menor susceptibilidade a carcinogênese da cérvice uterina mediada pela infecção por HPV. Além disso, os fatores de risco clássicos para o câncer de colo do útero são, essencialmente, os mesmos para a infecção genital por HPV, destacando-se entre estes: o relacionamento sexual com múltiplos parceiros, a idade precoce do primeiro intercurso sexual e da primeira gravidez, além do número de gestações, prática do tabagismo, uso prolongado de contraceptivos orais, além de infecções concomitantes 20 por outros agentes sexualmente transmissíveis (SELLORS et al., 2003; M UÑOZ et al., 2006). Atualmente, não se tem mais dúvida da participação direta de certos tipos de HPV(s) na etiologia de lesões pré-malignas e malignas da cérvice uterina, de forma que, a infecção por genótipos de alto risco desse vírus é considerada causa necessária, embora não suficiente do câncer de colo uterino (FRANCO et al., 1999; M UÑOZ et al., 2006). Sequências do genoma de HPV(s) de alto risco foram detectadas nas células de até 98% dos casos desse tipo de tumor quando analisadas por meio de técnicas suficientemente sensíveis (VILLA, 2003; M ONSONEGO et al., 2004; CUSCHIERI et al., 2005). A principal atividade transformadora dos HPV(s) de alto risco é fornecida pelas oncoproteínas E6 e E7. Estes dois fatores atuam cooperativamente no desenvolvimento de câncer induzido pelo HPV, com a ação de um fator complementando a do outro (M OODY; LAIM INS, 2010). A interação do HPV com o hospedeiro parece ser mediada por algumas condições intrínsecas do indivíduo, entre elas: idade, estado nutricional, fatores hormonais, estado imune, herança genética, estado gestacional, e alta paridade (M UÑOZ et al., 2006; SILVEIRA et al., 2008). Estudos sugerem haver, uma tendência de maior gravidade das lesões decorrentes da infecção pelo HPV e progressão mais rápida para a malignidade, nas pacientes com algum grau de supressão da resposta imune, inclusive aquela que ocorre naturalmente durante o período de gravidez (COELHO et al., 2004; SILVEIRA et al., 2008). Alguns autores demonstraram maior incidência de infecção por HPV em gestantes, com uma maior proporção de detecção de tipos de HPV de alto potencial oncogênico, sugerindo que o estado de gravidez é fator de risco para lesões cervicais, possivelmente facilitando a ativação seletiva dos HPV(s) de alto risco, devido a fatores imunológicos e hormonais associados à gravidez (KIVIAT et al., 1989; FIFE et al., 1996; COELHO et al., 2004, RAM A et al.,2008a). A infecção natural pelo HPV induz geralmente, uma imunidade deficiente, devido a ação das proteínas codificadas por esses vírus, as quais provocam na célula hospedeira a ativação de múltiplos mecanismos para impedir a ativação de uma resposta imune robusta. Entre estes mecanismos destacam-se a redução do número de células de Langerhans (LCs) mediadas pela proteína viral E6, a regulação negativa da expressão de moléculas do M HC de classe I pela proteína E5 – facilitando a evasão do vírus ao ataque de linfócitos T citotóxicos (CTLs), e o bloqueio da via de sinalização de 21 interferons (IFNs) do tipo I por E7 (IWASAKI, 2010). Além disso, as proteínas virais E6 e E7 em conjunto, regulam negativamente a expressão de IFNs, resultando na falta de sinais co-estimuladores da produção de citocinas inflamatórias, incluindo os próprios interferons. Isso ocorre durante o reconhecimento do antígeno e pode induzir a tolerância imunológica ao invés de respostas imunológicas apropriadas (SASAGAWA; TAKAGI, M AKINODA, 2012). Estes mecanismos de evasão imune podem, eventualmente, favorecer o estabelecimento da infecção persistente pelo HPV, criando uma condição que favorece a progressão das lesões, aumentando assim o risco de desenvolvimento de câncer de colo do útero. Assim, conhecimento do perfil epidemiológico da infecção, da constituição genética do vírus e da resposta imune do hospedeiro, torna-se de grande importância para subsidiar estudos de análise da repercussão em termos de saúde pública, como medidas de controle e desenvolvimento de terapias alternativas baseadas na resposta imune do paciente. Tais informações poderão ser de fundamental importância para que se possa avaliar de forma mais abalizada a relação custo benefício de uma provável campanha de vacinação da população feminina, contra o HPV, com base no conhecimento da realidade local. Neste estudo pretende-se analisar a prevalência do HPV e a participação da resposta imune do tipo Th17 na evolução da infecção por esse patógeno em mulheres grávida e não grávidas, estabelecendo correlações com a presença ou ausência de lesões da cérvice uterina de diferentes graus. Visa ainda a busca de fatores preditivos de resposta imunológica frente à doença em pacientes, a fim de abrir possibilidade de se estudar novas formas de terapia, como aquelas baseadas na resposta protetora ao vírus, bem como na imunologia locotumoral. 22 2. REVISÃO DE LITERATURA 2.1. O Papiloma Vírus Humano Os papilomavírus constituem um grande grupo de pequenos vírus, classificados na família Papilomaviridae e no gênero Papillomavirus. Eles são ubíquos, altamente específicos para os seus respectivos hospedeiros e sítios anatômicos que infectam. São todos epiteliotrópicos e, por isso, podem ser encontrados em superfícies queratinizadas de pele e nas mucosas de muitas espécies animais, tais como pássaros, répteis e mamíferos – incluindo os seres humanos, nos quais podem infectar diferentes sítios anatômicos (Van REGENM ORTEL et al., 2000; BURD, 2003). O HPV possui genoma de DNA de filamento duplo circular, associado a proteínas semelhantes às histonas, com aproximadamente oito mil pares de base (FAVRE et al., 1977; PFISTER; Zur HAUSEN, 1978; Zur HAUSEN, 1996; VILLA, 2003; M UÑOZ et al., 2006). O genoma encontra-se envolvido por um capsídeo de simetria icosaédrica, constituído por setenta e dois capsômeros, sem a presença de um envelope, apresentando-se como partículas de aproximadamente 55nm (KLUG; FINCH, 1965; BURD, 2003; LONGWORTH; LAIM INS, 2004). A estrutura do genoma desses vírus foi esclarecida por CRAWFORD & CRAWFORD, em 1963, quando ficou demonstrada a presença de nove a dez unidades abertas de leitura distribuídas em três partes: uma região precoce E – do inglês: early -, uma região tardia L – do inglês: late -, e uma região reguladora não codificante, URR (Upstream Region Regulation) (Zur HAUSEN, 1996; VILLA, 1999; M UÑOZ et al., 2006). (Figura 1) A região precoce compreende seis genes envolvidos na replicação do DNA, na persistência viral, na ativação do ciclo lítico e na oncogênese (Zur HAUSEN, 1996; M UÑOZ et al., 2006). A região tardia compreende dois genes que codificam as proteínas estruturais do capsídeo viral (Zur HAUSEN, 1996; LONGWORTH; LAIM INS, 2004). (Figura 2) A região não codificante corresponde a cerca de 10% do genoma dos vírus, apresenta entre 800 e 900 pares de bases, com variação substancial na sequência de nucleotídeos entre tipos individuais do vírus. Nessa região encontram-se a origem de replicação viral e os elementos transcricionais responsivos – que regulam a expressão dos genes virais -, e as sequências semelhantes ao elemento responsivo para 23 glicocorticoides – incluindo os hormônios progesterona e progestinas (CHAN; KLOCK; BERNARD, 1989; CAM PO, 1995; Zur HAUSEN, 1996; VILLA, 2003), que regulam positivamente a expressão do gene E6 no HPV16 (M OODLEY et al.,2003). A tabela abaixo resume as principais funções das proteínas virais. 2.2. Classificação do Papiloma Vírus Humano A classificação dos HPV(s) leva em consideração a sequência de nucleotídeos de sua unidade de tradução L1 (Zur HAUSEN, 1996). Cerca de 150 tipos já foram catalogados e caracterizados com base no sequenciamento do seu gene L1, mostrando uma marcante variedade genômica entre eles. Os HPV(s) foram numerados de acordo com a ordem de identificação, de forma que o HPV do tipo 1 foi o primeiro a ser descrito e o HPV 16 o décimo sexto, e assim por diante. Segundo BURD, em 2003, oitenta e cinco tipos distintos de vírus já estavam identificados e inteiramente sequenciados, desses cerca de quarenta são encontrados regularmente no trato genital. No Brasil algumas variantes com maior potencial oncogênico, principalmente do HPV 16, já foram identificadas (ALENCAR et al., 2007; CERQUEIRA et al., 2008). Os HPV(s) podem ser divididos em dois grupos: os que possuem tropismo pela superfície queratinizada da pele, causando as verrugas comuns, e aqueles que infectam a mucosa da boca, a garganta, o trato respiratório, e, em particular, o trato anogenital causando infecções que vão desde manifestações assintomáticas, passando por lesões intraepiteliais de diferentes graus até o câncer (BURD, 2003; M ISTRY; WIBOM ; EVANDER, 2008). Clinicamente, as infecções pelos HPV(s) causam um amplo espectro de lesões proliferativas cutâneas, mucocutâneas e do epitélio das mucosas, sendo os vírus classificados em três grupos de acordo com a localização da infecção: (1) cutaneotrópicos, que infectam as superfícies queratinizadas da pele causando lesões benignas caracterizadas como verrugas comuns; (2) cutaneotrópicos associados a lesões malignas da pele, em pacientes com epidermodisplasia verruciforme (EV); e (3) mucogenitotrópicos, que infectam a genitália externa, a mucosa da cavidade oral e da laringe e, especialmente, a mucosa genital (PEREYRA; GERRA; VILLA, 1997). 24 Tabela 1. As proteínas do HPV e suas funções. Proteínas E1 E2 E4 E5 E6 E7 L1 L2 Funções Replicação do DNA viral. Controle da replicação, transcrição e segregação do genoma viral. Favorece e apoia a amplificação do genoma do HPV, além de regular a expressão dos genes tardios, controlando a maturação do vírus e facilitando a liberação dos vírions. Acentua a atividade transformadora da E6 e E7; Promove a fusão entre as células, gerando instabilidades cromossômicas e aneuploidias ; Contribui para a evasão a resposta imunológica. Liga-se e degrada a proteína supressora de tumor p53, inibindo a apoptose; Interage com proteínas da resposta imune inata, contribuindo para a evasão imune e persistência do vírus; Ativa a expressão da telomerase. Liga-se e degrada a proteína supressora de tumor pRb; Aumenta a atividade de ciclinas dependentes de quinases (CDK); Afeta a expressão de genes da fase S por interagir diretamente com fator de transcrição E2F e com histonas desacetilases; Induz uma tolerância periférica em linfócitos T citotóxicos; Regula negativamente a expressão do receptor semelhante à TOLL-9 (TLR9,) contribuindo para a evasão da resposta imune. Proteína maior do capsídeo; Contém o principal determinante necessário para a adesão aos receptores de superfície celular; É altamente imunogênica e tem epítopos conformacionais que induzem a produção de anticorpos neutralizantes específicos contra o vírus. Proteína menor do capsídeo Contribui para a ligação do vírion ao receptor da célula, favorecendo a sua captura, o seu transporte para o núcleo, e a entrega de DNA viral nos centros de replicação; Além disso, auxilia E2 no empacotamento do DNA viral dentro dos capsídeos. Os HPV(s) genitais são classificados, de acordo com seu potencial oncogênico, em dois grupos: os de baixo risco, que normalmente não estão associados ao câncer, e os de alto risco, que são reconhecidos atualmente como causa necessária, embora não suficiente, para o desenvolvimento do câncer do colo uterino (M UÑOZ et al., 2006; TROTTIER; FRANCO, 2006). No grupo de baixo risco para o câncer, encontram-se os HPV(s) relacionados a lesões benignas da região anogenital e da orofaringe, tais como, HPV 6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 70, 72 e 81 (LOWY; KIRNBAUER; SCHILLER, 1994; M UÑOZ et al., 2003; VILLA, 2003). No grupo de alto risco, estão os HPV(s) que possuem propriedades imortalizadora e transformante de células, sendo que alguns deles são encontrados em mais de 90% dos espécimes obtidos de cânceres de colo uterino (Van Der BRULE et al., 1990; YOSHIKAWA et al., 1991; M UÑOZ et al., 2003), da vulva, 25 do ânus, do pênis e de outros sítios anatômicos com menor frequência (BOSCH et al., 2002; HERRERO, 2003; PALAZZI et al., 2003; PFISTER, 2003; SYRJÃNEN, 2003). M ais de 20 tipos de HPV(s) fazem parte deste grupo, destacando-se entre eles os tipos HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73 e 82 (HERRERO et al., 2000, BURD, 2003; M UÑOZ et al., 2003; VILLA, 2003), que apresentam estreita relação com o câncer do colo uterino e suas lesões precursoras (Zur HAUSEN, 1996; VINCE et al., 2001). O HPV 16 é o tipo mais prevalente no mundo inteiro, exceto na Indonésia, onde o tipo mais proeminente é o HPV 18 (SCHELLEKENS et al., 2004). Figura 1. Representação esquemática do genoma do HPV mostrando o arranjo dos genes precoces E ou genes não estruturais, dos genes do capsídeo (L1 e L2) e da região não codificante URR. Fonte: MUÑOZ et al., 2006. 26 2.3. Patogênese 2.3.1. Persistência versus Eliminação A infecção com HPV(s) de alto risco dura tipicamente de 12 a 18 meses e, eventualmente, os vírus são eliminados pelo sistema imune (RICHARDSON et al., 2003). No entanto, aproximadamente 10% das mulheres não conseguem eliminar o HPV, resultando em uma infecção persistente. A principal consequência da infecção persistente com HPV(s) de alto risco é o desenvolvimento de lesões que podem evoluir para câncer, e isso constitui o fator de risco mais importante para o desenvolvimento de câncer cervical (STANLEY, 2008; M OODY; LAIM INS, 2010; BODILY; LAIM INS, 2011). Os detalhes sobre a resposta imune que resulta na eliminação da infecção por HPV ainda são desconhecidos. A eliminação do HPV parece resultar em proteção humoral e/ou celular, em longo prazo, contra a reinfecção pelo mesmo tipo de HPV, se a proteção é ao longo da vida ainda não é conhecido (STANLEY, 2006). Embora o termo eliminação seja usado quando uma infecção por HPV já não pode ser detectada utilizando métodos de ensaio sensíveis, a presença do HPV não pode ser completamente descartada, pois o estado de latência do HPV ainda é pouco compreendido. O reaparecimento do HPV a partir da latência, mesmo na ausência de imunossupressão definitiva é comum, mas na maioria dos casos são provavelmente benignos (GONZÁLEZ et al., 2010). Em contraste, em infecções pelo HPV, que são eliminadas, o risco de câncer aumenta dramaticamente quando comparado às infecções persistentes do HPV (SCHIFFM AN et al., 2011). É importante lembrar que não é fácil diferenciar uma infecção persistente pelo HPV e de uma infecção persistente seguida por reinfecção, embora a reinfecção com o mesmo tipo de HPV aparente ser pouco frequente. M uitos estudos classificam a infecção pelo HPV como persistente se o vírus foi detectado em duas visitas de acompanhamento com intervalo de 4 a 6 meses. No entanto, porque o intervalo entre as visitas de acompanhamento varia entre os estudos e há muitas questões desconhecidas sobre a história natural do HPV, é complicado distinguir infecções persistentes e transitórias. Além disso, uma infecção pelo HPV não detectável pode ser um período de latência viral, em que os níveis de HPV são inferiores ao limiar detectável dos ensaios 27 correntes de DNA do HPV, em vez de representar um hospedeiro limpo do vírus (BASEM AN; KOUTSKY, 2005). A natureza persistente da infecção pelo HPV e a integração do DNA viral no genoma da célula hospedeira contribui para aumentar o risco de lesões de alto grau e malignas devido à instabilidade genômica gerada. As proteínas E6 e E7 podem provocar anomalias centrossomais resultando em reduplicação anormal do centrossomo, levando a um número anormal de centrossomos. Além disso, a perda dos pontos de verificação do ciclo celular através das alterações em p53 e pRb permite a retenção de células com anormalidades cromossômicas (M ÜNGER et al., 2004). Essas modificações podem resultar em alterações genéticas que se acumulam durante um longo período de tempo, até que resultem numa combinação de anormalidades genéticas, permitindo o desenvolvimento do câncer (BODILY; LAIM INS, 2011). Em lesões por HPV(s) de alto risco e baixo risco, a proliferação celular aumenta a demanda por nutrientes, gerando uma competição por nutrientes e oxigênio. Para superar esta limitação, a proteína E7, tanto de um quanto do outro tipo de HPV, aumenta os níveis do fator de transcrição induzido por hipóxia-1 (HIF-1), bem como induz o aumento da expressão dos genes alvo do HIF-1 sob condições de hipóxia (NAKAM URA et al., 2009). O aumento da atividade do HIF-1 resulta em elevação da transcrição de um subconjunto de genes que favorecem a angiogênese, que é essencial para a persistência e o crescimento de lesões pelo HPV (BODILY; LAIM INS, 2011). 2.3.2. Mecanismos de Evasão Imune As infecções pelo HPV são crônicas, exclusivamente locais e intraepiteliais em que o vírus permanece no hospedeiro por vários meses, até mesmo anos, durante os quais os mecanismos de defesa do hospedeiro, aparentemente, permanecem ignorantes ao patógeno por um longo período de tempo (STANLEY, 2009b). Assim, a resposta imunitária à infecção pelo HPV é muitas vezes insuficiente para eliminar o vírus de modo que os indivíduos infectados não curam e desenvolvem uma infecção persistente. A principal razão para isto é uma estratégia engenhosa desenvolvida por este vírus na qual a replicação de DNA viral e a montagem dos vírions ocorrem em uma célula que será terminalmente diferenciada e morre por causas naturais (STANLEY, 2008). Para alcançar esse estilo de replicação, o HPV deve evitar o sistema de defesa do hospedeiro 28 e a chave para entender como isso ocorre é o ciclo de replicação do vírus, o qual por si mesmo, já se constitui um mecanismo de evasão imune que inibe a detecção do vírus pelos mecanismos de defesa do hospedeiro. A infecção pelo HPV e o seu crescimento vegetativo são absolutamente dependentes do programa completo de diferenciação dos queratinócitos (DOORBAR, 2005). Os genes tardios do papilomavírus também contêm códons que células de mamíferos raramente utilizam, implicando que a produção abundante de proteínas do capsídeo do papilomavírus está inibida em células epiteliais basais de mamíferos pela disponibilidade limitada dos RNA(s) transportadores (RNA-t) apropriados. As proteínas virais precoces localizam-se principalmente no núcleo, e elas são produzidas em quantidades insuficientes e/ou não estão acessíveis para o reconhecimento imunológico (TINDLE, 2002). Além disso, a ausência de citólise induzida por vírus ou necrose e, portanto, não há inflamação. Durante a maior parte do ciclo infeccioso do HPV, existe pouca ou nenhuma liberação para o meio local de citocinas pró-inflamatória, que são importantes para a ativação e a migração das células apresentadoras de antígeno (APC). Desta forma, os sinais centrais de gatilho da resposta imune nos epitélios escamosos estão ausentes (STANLEY, 2006). M esmo na ausência de alterações celulares, tais como a citólise, necrose, ou morte celular, queratinócitos infectados pelo HPV devem ativar a produção de interferons do tipo 1, um poderoso antiviral genérico do sistema de defesa imune inato. Os interferons do tipo 1, IFN-α e IFN-β, tem propriedades antivirais, antiproliferativas, antiangiogênicas e imunoestimuladoras que atuam como uma ponte entre a imunidade inata e adaptativa, ativando células dendríticas (DCs) imaturas (Le BON; TOUGH, 2002). Alguns tipos de HPV de alto risco inibem ativamente a resposta de interferon endógeno, regulam negativamente os receptores semelhantes à Toll (TLR) e isto combinado aos baixos níveis de proteína viral gerados durante o ciclo infeccioso e na ausência de inflamação conduz à ativação ineficiente da resposta imune inata, com a ineficácia consequente da resposta imune adaptativa. Assim, o meio torna-se operacionalmente antígeno-tolerante ao HPV e as defesas do hospedeiro tornam-se irremediavelmente comprometidas. As células efetoras antígeno-específicas ao HPV são ambas pobremente/mal recrutadas para o foco infeccioso e sua atividade é regulada negativamente (STANLEY, 2009b). 29 Figura 2. Estrutura do HPV. Salientando a localização das proteínas do capsídeo L1 e L2 e a maneira como o DNA genômico e as histonas se agrupam. Fonte: adaptado de Swiss Institute of Bioinformatics, Viral Zone – disponível em http://viralzone.expasy.org/all_by_species/5.html Foi demonstrado que a infecção com HPV(s) de alto risco, em especial HPV 16, regula negativamente a expressão do gene de IFN-α induzível, por meio de proteínas E6 e E7, que interagem diretamente com os componentes das vias de sinalização do interferon (KANODIA; FAHEY; KAST, 2007). As células infectadas com o HPV na forma epissomal são eliminadas após a exposição ao IFN-β, mas as células com DNA de HPV integrado são resistentes a este efeito antiviral (PETT et. al., 2006). A resposta de células T a E2 e E6 são perdidas ou reduzidas em NIC-3 e no carcinoma invasivo. Assim, mesmo que células T citotóxicas antígeno-específicas para o HPV tenham sido geradas, células T reguladoras cada vez mais dominam a lesão e anulam a resposta de defesa das células “natural killers” (NK) (KOBAYASHI et. al., 2004). Os queratinócitos cervicais infectados pelos HPV(s) de alto risco apresentam nível elevado das oncoproteínas E6 e E7 não serem eliminadas neste meio tolerante imunossupressor, e pode resultar em progressão para lesão de alto grau e câncer (STANLEY, 2009b). Além disso, as proteínas E6 e E7 interferem nos efeitos de várias citocinas inibidoras de crescimento, que são induzidas após a infecção. Proteínas de HPV(s) de alto risco reprimem a transcrição de muitos genes induzíveis por IFN (CHANG; 30 LAIM INS, 2000; TINDLE, 2002; KANODIA; FAHEY; KAST, 2007) e inibem a formação do complexo de sinalização indutor de morte bloqueando a ligação desse ao receptor 1 de TNF e, por conseguinte, a transdução de sinais apoptóticos (FILIPPOVA et. al., 2002b). A exposição de E7 num ambiente epitelial não inflamatório pode também ser suficiente para induzir uma tolerância periférica a E7 na população de linfócitos T citotóxicos (TINDLE, 2002). Como infecções pelo HPV são exclusivamente intraepiteliais, teoricamente, um ataque do HPV seria detectado pelas células APC profissionais dos epitélios escamosos, pelas células Langerhans (LCs), que são as células dendríticas intraepiteliais. A entrada do capsídeo do vírus é normalmente um sinal de ativação para as DCs, mas há evidência de que LCs não são ativadas pela captura de capsídeos de HPV. O ciclo de vida do HPV está organizado de modo a formar uma síntese de antígenos virais limitada em células indiferenciadas, e a alta expressão está restrita às células altamente diferenciadas (STANLEY, 2009a). A replicação e liberação do HPV não causam a inflamação e morte celular uma vez que o queratinócito diferenciado já está programado para morrer e esta morte por causas naturais não age como um sinal de perigo no local infectado (STANLEY, 2009b). Além disso, a ausência de viremia, lise celular, necrose, ou qualquer outro sinal para desencadear uma resposta inflamatória reduz a possibilidade de uma resposta imune eficaz neste sítio (STANLEY, 2009a). Assim, o vírus torna-se praticamente invisível para o hospedeiro que permanece indiferente à infecção por longos períodos de tempo, o que facilita a persistência viral (STANLEY, 2009b). A cicatrização das lesões induzidas pelo HPV é dependente dos mecanismos da resposta imunitária mediada por células, e é acompanhada pela interação de linfócitos CD8 + e CD4+. As células de Langerhans (LCs) são as principais células dendríticas (DCs) encontradas em epitélios escamosos, e estes são provavelmente responsáveis por desencadear uma resposta imune contra o HPV. A função das células de Langerhans é interrompida pelo HPV em vários níveis. Tem sido demonstrado que a infiltração de tecido infectado com HPV pelas LCs e DCs é inibida pelas alterações induzidas pelo HPV no padrão de expressão de citocinas (STANLEY, 2008). A proteína L2 do HPV é capaz de suprimir a maturação, migração e secreção de citocinas pelas LCs. Além disso, a interação entre LCs e queratinócitos pode ser rompida pela redução dos níveis de Ecaderina induzidos pela proteína E6 de HPV (GHITTONI et. al., 2010). 31 Em pacientes imunossuprimidos, a infecção por HPV frequentemente leva ao aparecimento de abundantes lesões induzidas pelo HPV, indicando que o sistema imune atua para limitar a infecção por HPV (SCOTT; NAKAGAWA; M OSCICKI, 2001). Portanto, a fim de persistir, o HPV deve suprimir ativamente tanto a resposta imune inata quanto a adaptativa. Um mecanismo importante da via inata, que é alvo do HPV, e que age de várias formas, é a resposta via interferon (SAM UEL, 2001; STANLEY, 2008). Os queratinócitos expressam constitutivamente um baixo nível de genes induzíveis por interferon na ausência de interferon adicionado. As células infectadas com HPV(s) de alto risco expressam E6 e E7, que reprimem a transcrição de muitos genes alvo do interferon incluindo STAT-1, um ativador transcricional de genes induzíveis por interferon (NEES et. al., 2001). A proteína E6 pode se ligar e bloquear a ação de IRF-3, um regulador da via do interferon e também bloqueia a ativação da proteína quinase R (PKR), bem como a atividade da quinase Tyk2, responsável pela ativação de STAT-1, enquanto a proteína E7 pode se ligar a IRF-1, que também é um regulador da via do interferon (HEBNER; LAIM INS, 2006; STANLEY, 2009b). Ambas as proteínas E6 e E7 podem inibir a expressão do receptor semelhante à Toll (TLR9), que é importante para a detecção de DNA dupla fita (HASAN et. al., 2007). Adicionalmente, foi mostrado que a E6 de HPV(s) de alto risco interage com duas proteínas que fazem parte da resposta imune inata à infecção viral: fator regulatório de interferon 3 (IFR-3) e receptor semelhante a TOLL-9 (TLR9). Na expressão exógena de E6/E7 de HPV16 foi observada a inibição da transcrição de TLR9, levando a uma perda funcional das vias de sinalização TLR9 dentro da célula (HASAN et. al., 2007). É bem conhecido que os queratinócitos expressam constitutivamente nível baixo de várias citocinas que são reguladas positivamente no decorrer de uma infecção viral (GHITTONI et. al., 2010). Quando estas células são infectadas com o HPV, elas mostram significativamente reduzida a expressão de grande variedade de citocinas inflamatórias incluindo IL-1, IL-6, TNF-α e TGF-β, ao mesmo tempo, a expressão da citocina antinflamatória IL- 10 é aumentada (ALCOCER-GONZALEZ et. al., 2006; GHITTONI et. al., 2010). Consequentemente, a infecção pelo HPV induz alterações na produção de citocinas, reduzindo a capacidade das células do sistema imunológico para infiltrar o tecido infectado. Os queratinócitos expressam constitutivamente níveis baixos de interferon α, β e κ. A expressão de interferon κ é suprimida em células positivas para 32 HPV e isto pode contribuir para a inibição da expressão de genes induzíveis por interferon (RINCON-OROZCO et. al., 2009). O desenvolvimento de uma resposta imune mediada por células T específicas para HPV é reprimida ou atrasada em pacientes infectados com o HPV, sendo este efeito mais pronunciado em infecções por HPV(s) de alto risco em comparação com infecções por HPV(s) de baixo risco (Van Der BURG; PALEFSKY, 2009). Uma razão para esta deficiência é provavelmente a regulação negativa da expressão do complexo de histocompatibilidade principal de classe I (M HC-I), provavelmente devido a interações que ocorrem entre as proteínas virais E6, E7 e E5 com a célula hospedeira. Além disso, a proteína E7 foi relatada como regulador negativo do transportador associado com o processamento de antígeno interferindo, portanto, com a apresentação de antígenos através da via de M HC I (GHITTONI et. al., 2010). A expressão de E7 do HPV em células epiteliais não prejudica diretamente, mas sim aumenta ligeiramente, a expressão de M HC de classe I. A expressão de E7 está, no entanto, associada a uma redução de IFN-γ induzido por aumento da apresentação de antígenos endógenos para os linfócitos T citotóxicos (ZHOU; LEGAATT; FRAZER, 2011). M ecanismos adicionais de escape imune mediado pelo HPV envolvendo proteínas virais são, por exemplo: a E7 do HPV tem similaridade alta e generalizada para várias proteínas de seres humanos, causando uma imunogenicidade limitada (NATALE et. al., 2000.); a E6 pode regular negativamente a expressão de IL-18 (CHO et. al., 2001); a E5 media a acidificação de endossomos, afetando o processamento e apresentação de antígenos em células apresentadoras de antígeno (STRAIGHT; HERM AN; M cCANCE, 1995); a E5 também regula negativamente CD1d, uma glicoproteína semelhante a M HC-I, que apresenta auto-antígenos lipídicos ou antígenos lipídicos microbianos as células NK – a regulação negativa desta molécula é utilizada por uma variedade de microrganismos para escapar da detecção imunológica (M IURA et. al., 2010). Finalmente, a atividade das células NK também está reduzida em pacientes infectados com HPV(s) de alto risco (STANLEY, 2009a; O'BRIEN; CAM POS, 2002). 33 2.4. 2.4.1. Imunologia do Trato Genital Imunidade da Mucosa Anogenital Na tentativa de resolver as diversas infecções as quais os organismos podem ser submetidos, o sistema imunológico dispõe de muitas ferramentas que são utilizadas conforme a resposta vai se desenvolvendo. Inicialmente, entra em ação a imunidade inata que reconhece e responde a presença de agentes patogênicos. Esse tipo de imunidade está presente em todos a qualquer tempo, não aumenta com a repetida exposição a um dado microrganismo e não discrimina entre os vários agentes infecciosos, atua por meio de citocinas e quimiocinas produzidas por macrófagos promovendo o recrutamento e produção de fagócitos e moléculas opsonizantes (TAKEUCHI; AKIRA, 2010). Enquanto a imunidade inata atua, a resposta imune adaptativa se desenvolve. A imunidade adaptativa acentua alguns mecanismos da resposta inata e os direciona com maior precisão visto que sua ação se dá principalmente, por meio de linfócitos antígenoespecíficos (seleção clonal) levando à formação de memória imunológica. Esse tipo de imunidade também conta com a participação de citocinas e quimiocinas que induzem uma resposta inflamatória promovendo o influxo de anticorpos e linfócitos efetores aos locais de infecção (M URPHY; TRAVERS; WALPORT, 2009). 2.4.2. Imunidade Adaptativa A mucosa da ectocérvice caracteriza-se pela ausência de M ALT (tecido linfoide associado à mucosa). Então, inicialmente ocorre exclusivamente a drenagem para os linfonodos. O canal vaginal é drenado por vários linfonodos, incluindo o ilíaco comum, o interilíaco, o ilíaco externo e o femoral inguinal; enquanto, o pênis é drenado pelos linfonodos inguinais (IWASAKI, 2010). Durante o curso natural da infecção, o vírus infecta as células alvo especificas e são capturados pelas células apresentadoras de antígeno locais. As células de Langerhans no epitélio vaginal diferenciam-se dos seus precursores circulantes derivados da medula óssea por expressar baixos níveis de Langerina e por não participar do “priming” de células Th1. Além disso, as células de Langerhans da vagina 34 mostraram ser indutoras de células T CD8+ secretoras de IL-17, as quais suprimem a respostas dos linfócitos T citotóxicos (HERVOUET et al., 2010). A infecção natural pelo HPV induz a imunidade fraca, moléculas codificadas pelo HPV comprometem múltiplos mecanismos a fim de prevenir a iniciação de uma resposta imune robusta. Dentre eles podemos citar a depleção das células de Langerhans pela proteína E6, a regulação negativa das moléculas de M HC de classe I pela proteína E5 e o bloqueio de sinalização da via de IFN do tipo I pela E7 (IWASAKI, 2010). Consequentemente, os antígenos do HPV provavelmente sofrem apresentação cruzada somente por células dendríticas (DCs) não infectadas, cuja maquinaria de apresentação de antígenos não foi afetada pelos mecanismos de evasão do vírus. Presumivelmente, tais DCs são ativadas por mecanismos extrínsecos a células através do reconhecimento de células infectadas pelo vírus pelos receptores de reconhecimento de padrão (PRR) endossomais (IWASAKI; M EDZHITOV, 2010). A natureza das DCs que são responsáveis por esse “priming” é desconhecida, porém as células de Langerhans da camada epitelial e possivelmente as DCs da submucosa que estendem seus dendritos em direção à camada epitelial são provavelmente as células participantes desse processo (IWASAKI, 2010). Uma vez gerados, os linfócitos efetores e de memória, os quais são específicos para um dado patógeno, podem migrar para vários sítios no corpo e fornecer proteção contra a infecção. Anticorpos neutralizantes é um mecanismo efetor preferido porque estabelece uma imunidade estéril e fornece proteção completa contra a maioria das infecções virais. Em virtude dos anticorpos circularem por todo o corpo e acessarem a maioria dos tecidos mucosos, não se faz necessário gerar células locais produtoras de anticorpos. Como as células da ectocérvice não podem transportar IgA, os anticorpos do lúmen vaginal são provenientes de duas fontes: 1) IgA secretada a partir da cérvice e do útero; 2) difusão paracelular de IgG, produzido localmente e derivado do soro, através da ectocérvice da vagina (BRANDTZAEG, 1997). Além de anticorpos neutralizantes, a imunidade mediada por células (linfócitos CD4+ e CD8+) tem um papel crucial na defesa antiviral. As células T CD4+ auxiliam os linfócitos B na produção de anticorpos, elas são também necessárias para as respostas de células T CD8+ durante a fase inicial de diferenciação de linfócitos T efetores; além de estarem envolvidas com a geração de células T de memória, as quais montam uma resposta secundária mais robusta. Os linfócitos T CD4+ auxiliares são requeridas para a entrada de células T CD8+ na mucosa genital durante a fase efetora da resposta imune. 35 Enquanto que, as células T CD4+ efetoras apresentam papel antiviral direto, por si mesmas. Já os CTL(s) são as principais células efetoras antivirais que bloqueiam a disseminação do vírus por meio da eliminação direta das células infectadas através da ação citolítica mediada por perforinas e granzimas (NAKANISHI et al., 2009). A resolução da infecção genital por HPV envolve a resposta imune celular e humoral, onde linfócitos T CD8+ controlam a infecção viral na camada basal do epitélio da cérvice uterina, eliminando as células infectadas, e os anticorpos neutralizantes impedem a penetração do vírus nas células epiteliais. Dependendo do mecanismo de imunorregulação, em relação ao controle da resposta imune, da replicação viral e consequentemente, da infecção produtiva, as pacientes podem desenvolver displasias de diferentes graus (FERENCZY et al., 2003). Este mecanismo de controle imunológico envolve a produção de IFN-α, IFN-β, IFN-γ, TGF- β, TNF-α e interleucinas (IL-1, IL-6, IL-10, IL-12 e IL-15) (STERN, 2005). A ideia anterior era de que IL-12 é fundamental para levar a expressão do fator transcricional T-Bet e governar o processo de diferenciação em relação ao padrão Th1, enquanto que, IL-4 leva a expressão de GATA-3 e a diferenciação no perfil Th2, caracterizados pela indução de diferentes mecanismos efetores e produção de citocinas e/ou anticorpos. As células Th1 por produzirem IFN- são mediadoras de imunidades celulares, essenciais para a defesa do hospedeiro a infecções intracelulares e contra tumores, ao passo que, as células Th2 por produzirem principalmente IL-4, IL-5 e IL13, atuam nas respostas humorais. Além da função efetora, linfócitos T CD4 + modulam a resposta imune inata e adaptativa. Assim, Th1 modula negativamente a função de Th2 via produção de IFN-, enquanto IL-4 e IL-10 produzidas por Th2 inibem a função de Th1 (GAJEWSKI; FITCH, 1988; ABBAS; M URPHY; SHER, 1996). Outro perfil de resposta imune adaptativa descrita importante para o controle da resposta imunológica, porém envolvida com a persistência de patógenos e a proliferação de tumores, são os linfócitos T reguladores, que podem ser principalmente Th3 e Tr1, caracterizados pela produção de IL-10 e TGF-β, respectivamente. Células apresentadoras de antígeno (células dendríticas, basófilos e macrófagos) apresentam antígeno via M HC de classe II a linfócitos T imaturos, combinado à coestimulação envolvendo citocinas (IL-12 e IL-4) e moléculas coestimulatórias (CD80, CD86 e CD40), conduzindo a sua diferenciação em linfócitos T efetores (Th1 ou Th2). A informação integrada adquirida por células dendríticas pode regular a subsequente 36 resposta imune mediada por células T em: T helper tipo 1 (Th1) ou tipo 2 (Th2) ou T regulatória (Treg) (WONG et al., 2004). A resposta Th1 favorece a produção de células T citotóxicas efetoras as quais são importantes para eliminação de células infectadas por vírus, enquanto que a resposta Th2 facilita a estimulação de células B e suas mudanças de isotipos com produção de anticorpos neutralizantes. Células dendríticas imaturas também podem induzir respostas para antígenos não específicos ou tolerância (NIEDERGANG et al., 2004). M ais recentemente um novo subtipo de resposta imune, sendo distinta das já existentes (Th1, Th2, Th3, Tr1 e linfócito T regulador) e, chamada Th17, foi descrita. Este perfil de resposta imune adaptativa é caracterizado principalmente pela produção de IL-17A, mas também IL-17F, IL-21, IL-22, IL-26 e TNF-α. A produção de IL-1β, IL-6, IL-21, IL-23 e TGF-β ativa o fator transcricional STAT-3, que ativa RORt e RORα culminando na diferenciação de Th17 (LAURENCE; O’SHEA, 2007). É sabido que as células T CD4 + (Th1) são capazes de promover a sobrevivência, induzir memória de células T CD8 + citotóxicas e destruir células tumorais e partículas virais (HUANG et al., 2007). Dessa forma, deficiências na resposta imune Th1 em pacientes com câncer podem facilitar a progressão de lesões pré-malignas para tumores e limitar a eficiência dos tratamentos imunoterápicos (WESA et al., 2007). Entretanto o papel da resposta Th17 na patogênese do tumor de colo de útero causado pelo HPV, bem como o seu papel no controle viral e no balanço da resposta imunológica em pacientes ainda não foi elucidado. 37 3. OBJETIVOS 3.1. Objetivo Geral Avaliar a prevalência de infecção genital pelo HPV, em mulheres grávidas e não grávidas, e o perfil da resposta imune desses dois grupos de mulheres, visando estabelecer correlações entre a resposta imune e a ocorrência de lesões da cérvice uterina. 3.2. Objetivos Específicos Avaliar a prevalência da infecção genital por HPV em mulheres grávidas e não grávidas. Avaliar a possível influência do estado gestacional frente à infecção genital pelo HPV e a expressão de citocinas das respostas Th1, Th2, Th17 e de linfócitos T reguladores, com base na ocorrência de lesões da cérvice uterina. Avaliar a influência dos fatores de risco clássicos para doenças sexualmente transmissíveis na população estudada. Analisar a participação da resposta imune Th17 no controle da infecção por HPV, estabelecendo comparação desse tipo de resposta nas mulheres grávidas e não grávidas, correlacionando com a presença ou ausência de lesão. Comparar a eficiência da colposcopia e da citologia em detectar lesões causadas pelo HPV em mulheres grávidas e não grávidas. Propiciar a obtenção de informações a respeito do perfil epidemiológico da infecção por HPV nesse segmento da população, visando à obtenção de informações necessárias para a adoção de medidas de prevenção mais efetivas. 38 4. DELINEAMENTO EXPERIMENTAL 05/2010 à 09/2011 Unidade de Saúde Básica Alberto Calafange, Cidade Satélite, Natal/RN 91 grávidas 130 não grávidas 221 pacientes 01 – 09/2011 Maternidade Escola Januário Cicco, Natal/RN Entrevista com questionário padronizado Coleta de espécimes da cérvice uterina Biologia Molecular Citologia RNA - Trizol Coloração de Papanicolaou DNA – PBS (acrescido com 5 µg/mL vancomicina e 25 U/mL de nistatina) 215 pacientes Extração KIT Sociodemográfica Atividade sexual e reprodutiva Atitude comportamental Colposcopia 86 grávidas QIAGEN® 209 pacientes RNA em cDNA KIT HIGH CAPACITY cDNA REVERSE TRANSCIPTION® 129 não grávidas 81 grávidas 128 não grávidas Extração KIT QIAGEN® RT-PCR IFNγ, TNF-α, IL-17, IL-10, TGF-β PCR convencional β-globina PCR convencional HPV 8 grupos Teste do 2 simples Regressão logística RC e IC 95% Programa Sistema R (sistema livre) s/inflamação, s/HPV, não grávida (controle) s/inflamação, c/HPV, não grávida c/inflamação, s/HPV, não grávida c/inflamação, c/HPV, não grávida s/inflamação, s/HPV, grávida s/inflamação, c/HPV, grávida c/inflamação, s/HPV, grávida c/inflamação, c/HPV, grávida Significativos valores de p < 0,05 Teste de Mann-Whitney bicaudal Software GraphPad Prism 5.0 39 5. PACIENTES E MÉTODOS 5.1. Local do Estudo e Obtenção das Amostras O estudo foi realizado durante o período de M aio de 2010 à Setembro de 2011, na Unidade de Saúde Básica Alberto Calafange, Cidade Satélite, Natal/RN, e Janeiro à Setembro de 2011, na M aternidade Escola Januário Cicco, Natal/RN. Durante esse período foram arroladas mulheres grávidas e não grávidas que, voluntariamente, se submeteram a uma entrevista e uma consulta com o ginecologista para a coleta dos espécimes cervicais para análise. Todas as pacientes consentiram em participar do estudo e assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido (TCLE). Na entrevista, as pacientes responderam um questionário padronizado cuja análise gerou informações sobre características sócio-demográficas, atividades sexual e reprodutiva, atitudes comportamentais. Para a análise citológica e molecular foram coletados três espécimes cervicais de cada paciente, por meio de escova ginecológica e/ ou espátula de Ayre – endocérvice e ectocérvice, respectivamente. A primeira amostra foi transferida para um criotubo contendo 500 µL de Trizol (Invitrogen , Carlsbad, CA, EUA) – destinada a extração de RNA, visando à obtenção de RNA mensageiro para as citocinas e fatores de transcrição pesquisados –, a segunda foi destinada a preparação da lâmina para o citológico e a terceira foi colocada num tubo de 15mL contendo 1 mL de PBS (acrescido com 5 µg/mL vancomicina e 25 U/mL de nistatina) - destinada à detecção de DNA do HPV. 5.2. 5.2.1. Exames Citomorfológicos Citologia Foram preparados esfregaços a partir de células descamadas do epitélio da cérvice uterina das pacientes os quais foram encaminhados pelas respectivas unidades de saúde aos laboratórios credenciados ao Sistema Único de Saúde (SUS), para análise 40 citológica. As lâminas contendo os esfregaços foram coradas pelo método descrito por Papanicolaou (1942), que permite observar alterações celulares associadas à infecção pelo HPV, e examinadas ao microscópio óptico. 5.2.2. Colposcopia A colposcopia foi realizada pelos ginecologistas colaboradores da pesquisa. Por definição, temos que a colposcopia é o exame de todo trato genital feminino, da vulva ao canal endocervical na sua porção inicial, incluindo-se a exploração de períneo e região perianal. Esse exame consiste na inspeção visual utilizando o colposcópico que permite detectar a presença de lesões na cérvice uterina. Foi aplicada inicialmente uma solução a 5% de ácido acético sob o colo do útero seguida da inspeção visual utilizando o colposcópio. Após a retirada do excesso do ácido acético, foi aplicada uma solução de lugol e realizada nova inspeção (DEXEUS; CARARACH; DEXEUS, 2002; NAUD et al., 2006; FEBRASGO, 2010). O fluxograma em anexo resume os procedimentos e condutas básicos do exame. 5.3. Extração do DNA das Células Cervicais As amostras destinadas à extração de DNA obtidas de células ecto e endocervicais foram mantidas em geladeira, ~ 4ºC, até o momento da extração. As amostras coletadas passaram por intensa agitação em vórtex, por alguns minutos, para que o material se desprendesse da escova ginecológica. Cessada a agitação, o conteúdo dos tubos de 15mL foi transferido para microtubos de 1,5mL a fim de se iniciar a extração do ácido nucleico. O DNA foi obtido com o auxílio do KIT QIAGEN ® pelo método da proteinase K, o protocolo utilizado foi o recomendado pelo fabricante. Ao fim do processo, as amostras foram estocadas em microtubos de 1,5mL em freezer, ~ 20ºC. 41 5.4. Reação em Cadeia da Polimerase para a Análise e Detecção do DNA de HPV A qualidade do DNA foi avaliada pela amplificação de uma sequência do gene da β-globina de 110 pb, utilizando os seguintes iniciadores PCO3+/PCO4+ (SAIKI et. al., 1985). As condições da reação foram: ciclo 1) 5 min a 95 ºC; ciclos 2 – 37) 1 min a 95 ºC, 1 min a 58 ºC, 1 min a 72 ºC; ciclo 38) 10 min a 72 ºC; temperatura de manutenção (holding) de 20 ºC. O resultado foi visualizado após eletroforese vertical em gel de poliacrilamida a 8% (SAM BROOK et. al., 1992), em tampão TBE, revelado pela prata (SANGUINETTI et. al., 1994). Como critério de comparação das bandas, utilizou-se um padrão de peso molecular de 100 pb. Todas as amostras positivas para β-globina foram submetidas ao teste de triagem para a presença de DNA do HPV utilizando iniciadores genéricos GP5+/GP6+, na reação foi gerado um amplicon de 140 pb (De RODA HUSM AN et. al., 1995). As condições da reação foram: ciclo 1) 5 min a 95 ºC; ciclos 2 – 42) 1 min a 95 ºC, 2 min a 50 ºC, 1 min a 72 ºC; ciclo 43) 7 min a 72ºC; temperatura de manutenção (holding) de 20 ºC. O resultado foi visualizado em eletroforese vertical semelhante à descrita acima. Abaixo se encontra uma tabela com a sequência dos primes. 5.5. Quantificação de Citocinas e Fatores Transcricionais das Respostas Th1, Th2, Th17 e de Linfócitos T Reguladores 5.5.1. Extração de RNA e Síntese de cDNA A extração de RNA total foi realizada a partir de amostras obtidas de células cervicais da ectocérvice de cada paciente utilizando o KIT QIAGEN ® para extração de RNA. As amostras foram mantidas em freezer -70ºC até a realização do experimento, o procedimento ocorreu segundo o protocolo recomendado pelo fabricante e o RNA extraído foi armazenado, ~ -70ºC. A etapa seguinte foi a realização da reação de conversão do RNA em cDNA utilizando o KIT HIGH CAPACITY cDNA REVERSE TRANSCIPTION ®, o 42 procedimento ocorreu segundo o protocolo recomendado pelo fabricante. Realizadas essas etapas as amostras foram armazenadas em freezer -20ºC até a execução da reação em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real. 5.5.2. Análise da Expressão de Citocinas através de PCR em Tempo Real Foram analisadas amostras de 77 pacientes selecionadas de forma aleatória considerando-se os seguintes critérios: condição (grávida ou não), presença ou ausência do HPV, presença ou ausência de lesão. Foram consideradas sem lesão as mulheres que apresentaram tanto a colposcopia quanto a citologia dentro dos padrões de normalidade e consideradas como portadoras de lesão aquelas que apresentaram qualquer alteração em pelo menos um dos exames. A tabela 2 apresenta os agrupamentos realizados. A expressão quantitativa relativa do RNA-m, das seguintes citocinas: IL-10, TGF-β, IL-17, IFN-, TNF-α (lista de primers abaixo na tabela 3), foi analisada através de PCR em tempo real, tendo como controle positivo interno a β-actina, utilizando-se o sistema M aximaT M SYBR Green qPCR M aster M ix® e o aparelho Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System® (Applied Biosystems, Warrington, Reino Unido). As condições das reações foram 2 minutos a 50ºC, 10 minutos a 95 ºC, 40 ciclos de 15 segundos a 95 ºC e 1 minuto a 56 ºC. Um ciclo final de 20 minutos com temperatura crescente de 60 a 95ºC foi empregado para a obtenção de uma curva de dissociação dos produtos da reação, utilizada para a análise da especificidade de amplificação. As condições de PCR para cada oligonucleotídeo utilizado foram padronizadas de acordo com a concentração, temperatura de anelamento, ausência de formação de dímeros, eficiência de amplificação dos genes alvos e controle interno (gene constitutivo). Para a análise da expressão gênica foi utilizado o método Delta-Delta CT (ΔΔ CT ) (LIVAK; SCHM ITTGEN, 2001). Calculou-se inicialmente o ΔCT de cada amostra, subtraindo-se os valores de CT (thersohld cycle ou limiar do ciclo) do gene controle (βactina) dos valores de CT do gene alvo (citocinas). Após a determinação do ΔCT da amostra, escolheu-se um grupo controle (sem inflamação, sem HPV, não grávida) para servir como agente normalizador. Para o cálculo de ΔΔCT utilizou-se a formula a seguir: [ΔCT (amostra)-ΔCT (grupo controle)]. Uma vez determinado o ΔΔCT , aplicou-se a formula 2-ΔΔCT , que resultou no valor da expressão gênica relativa. 43 Tabela 2. Categorização dos grupos para análise de citocinas. Grupos 1 (controle) 2 3 4 5 6 7 8 Lesão/Inflamação Sem inflamação Sem inflamação Com inflamação Com inflamação Sem inflamação Sem inflamação Com inflamação Com inflamação Presença de HPV Sem HPV Com HPV Sem HPV Com HPV Sem HPV Com HPV Sem HPV Com HPV Condição da paciente Não grávida Não grávida Não grávida Não grávida Grávida Grávida Grávida Grávida Tabela 3. Sequência de primers usados no estudo. Nome do primer Sequência do primer (5’ - 3’) PCO3+ (SENSE) CTT CTG ACA CAA CTG TGT TCA CTA GC PCO4+ (ANTISENSE) TCA CCG CAA CTT CAT CCA CGT TCA CC GP5+ (SENSE) TTT GTT ACT GTG GTA GAT ACT AC GP6+ (ANTISENSE) CTT TTT ATT TGA CAT TTA GTA TAA G Hu B-actina (SENSE) TGA CTC AGG ATT TAA AAA CTG GAA Hu B-actina (ANTISENSE) GCC ACA TTG TGA ACT TTG GG Human IL-10 (SENSE) AGA TCT CCG AGA TGC CTT CA Human IL-10 (ANTISENSE) ATT CTT CAC CTG CTC CAC GG HUMAN IFN-GAMA (SENSE) ATG CAG AGC CAA ATT GTC TCC HUMAN IFN-GAMA (ANTISENSE) GG CAG GAC AAC CAT TAC TGG TGF-beta Hu 10 (SENSE) TT GAG GGC TTT CGC CTT AG TGF-beta Hu 10 (ANTISENSE) TGT GTT ATC CCT GCT GTC ACA G IL-17 Hu 50 (SENSE) CAA TGA CCT GGA AAT ACC AA IL-17 Hu 50 (ANTISENSE) TGA AGG CAT GTG AAA TCG AGA Hu TNF-a (SENSE) TTC TGG CTC AAA AAG AGA ATT G Hu TNF-a (ANTISENSE) TGG TGG TCT TGT TGC TTA AAG Nota: os primers antisense já são os inversos complementares . 5.6. Análise Estatística Os resultados obtidos a partir dos questionários foram tabulados e submetidos à análise estatística para avaliar a existência ou não de associação entre a presença de infecção por HPV e as variáveis consideradas. Nesse intuito, foram empregados os testes do 2 simples e de regressão logística para cálculo de razão de chance (RC) e de seus respectivos intervalos de confiança (IC) utilizando o Programa Sistema R (sistema livre). Foram considerados como estatisticamente significativos valores de p < 0,05. A análise dos dados de expressão de citocinas foi realizada no software GraphPad Prism 5.0 e o teste estatístico utilizado foi o teste de M ann-Whitney bicaudal. 44 6. RESULTADOS A análise dos questionários individuais que continham os dados das pacientes permitiu estabelecer o perfil sociodemográfico do segmento da população estudado. As mulheres incluídas no estudo tinham idade entre 14 e 72 anos, média de 31 anos, com desvio padrão de + 11anos, sendo a maioria de mulheres jovens com até 30 anos de idade. A maioria das participantes tinha grau de instrução menor ou igual ao ensino fundamental, era casada, com renda familiar até um salário mínimo, não estava grávida no momento do estudo, teve a primeira relação sexual com idade menor ou igual a 18 anos, teve mais de um parceiro sexual ao longo da vida, nunca usou ou usou raramente preservativo nas relações sexuais, teve a primeira gravidez com mais de 18 anos, teve uma a duas gestações e era não fumante (Tabela 4). Foram coletados espécimes cervicais de um total de 221 mulheres sendo 91 (41,2%) provenientes de pacientes grávidas e 130 (58,8%) de pacientes não grávidas. A prevalência global de infecção por HPV no segmento da população estudado foi de 28,1%, sendo 31,9% em pacientes grávidas e 25,4% em mulheres não grávidas. Não foi observada diferença significativa entre os índices de prevalências da infecção pelo HPV nos dois grupos de pacientes (Tabela 5). A grande maioria das pacientes foi submetida a dois tipos de exames citomorfológicos utilizados no diagnóstico de doenças do trato genital. A colposcopia foi realizada em 209 pacientes, das quais 81 grávidas e 128 não grávidas. No grupo das mulheres grávidas 34 (42,0%) não apresentaram alterações visíveis ao exame colposcópico e 47 (58,0%) apresentaram algum tipo de alteração. No grupo das mulheres grávidas 73 (57,0%) não apresentaram alterações e 55 (43,0%) apresentaram alterações. Em 11,0% das mulheres grávidas e 1,5% das não grávidas a colposcopia não foi realizada. No grupo das mulheres grávidas, a taxa de prevalência da infecção pelo HPV foi de 32,4% nas que não apresentavam alterações colposcópicas e em 29,8% naquelas com alterações visíveis ao exame colposcópico. Nas mulheres não grávidas o HPV foi detectado com taxas de prevalência de 20,5% nas que não tinham alterações colposcópicas e em 30,9% naquelas com alterações. Não se observou associação entre a presença de alterações colposcópicas e a detecção do DNA do HPV, tanto no grupo das mulheres grávidas quanto no grupo das não grávidas. 45 Tabela 4. Perfil sociodemográfico das participantes do estudo. Variáveis Condição das pacientes Grávidas Não grávidas Idade < 30 31- 45 > 45 Escolaridade < Fundamental > Médio Estado civil Casada Solteira Renda familiar Até 1 salário 2 - 3 salários > 3 salários Idade na 1ª relação sexual < 18 > 19 Múltiplos parceiros sexuais Não Sim Uso do preservativo Nunca/raramente Na maioria das vezes/sempre Idade na primeira gravidez Nunca engravidou < 18 > 19 Número de gestações Nenhuma 1—2 >3 Hábito de fumar Não Sim Pacientes analisadas (N= 221) % 91 130 41,2% 58,8% 116 82 23 52,5% 37,1% 10,4% 108 113 48,9% 51,1% 159 62 71,9% 28,1% 135 76 10 61,1% 34,4% 4,5% 171 50 77,4% 22,6% 86 133 38,9% 60,2% 163 58 73,8% 26,2% 14 99 108 6,3% 44,8% 48,9% 14 117 90 8,0% 52,9% 40,7% 166 55 75,1% 24,9% O exame citológico foi realizado em 214 mulheres, sendo 86 grávidas e 128 não grávidas. Em 5,5% das mulheres grávidas e 0,8% das não grávidas o exame citológico não foi realizado. No grupo de mulheres grávidas 90,7% apresentaram citologia normal ou tinham somente inflamação e em apenas 9,3% delas foram detectadas alterações citológicas. As taxas de prevalência de infecção pelo HPV foram de 30,8% nas mulheres sem alterações citológicas e 50,0% naquelas com citologia alterada, não sendo 46 observada diferença. No grupo das mulheres não grávidas 58,9% apresentaram citologia normal ou tinha apenas inflamação e 41,1% delas apresentaram citologia alterada. As taxas de prevalência da infecção pelo HPV foram de 22,4% nas mulheres sem alterações citológicas e 30,2% naquelas com alterações citológicas, não sendo observada associação entre a presença de alterações citológicas e a detecção do HPV (Tabela 6). Tabela 5. Prevalência da infecção genital por HPV em mulheres grávidas e não grávidas. Pacientes analisadas Condição das pacientes PCR para HPV N= 221 % Positivo % p Grávidas 91 41,2% 29 31,9% 0,291 Não grávidas 130 58,8% 33 25,4% Total 221 100,0% 62 28,1% Comparou-se a peformance apresentada pela colposcopia e a citologia no que diz respeito a correlação entre os resultados positivos obtido por esses dois métodos e a detecção do HPV, em um total de 56 pacientes com resultado positivo na PCR. Constatou que em 52,0% das pacientes com teste positivo para HPV apresentaram-se também positivas na colposcopia enquanto que apenas 36,0% das pacientes infectada pelo HPV apresentaram alterações citológicas. Desta forma observou-se que a colposcopia alterada apresentou uma maior correlação com a presença do HPV, quando comparada a citologia com alteração (Tabela 7). Quanto se analisou a distribuição das taxas de prevalência da infecção genital pelo HPV de acordo com variáveis socio demográficas, atividade sexual e reprodutiva foi observada taxa de prevalência da infecção significativamente maior nas mulheres com idade até 30 anos (p=0,010), as quais apresentaram risco seis vezes maior, quando comparadas aquelas com idade acima de 45 anos. Associação significativa (p=0,021) foi também observada em relação ao grau de escolaridade, onde as mulheres com menor escolaridade apresentaram chance duas vezes maior de adquirir a infecção. A renda familiar, estado de gravidez, idade do primeiro intercurso sexual, relacionamento com mais de um parceiro sexual ao longo da vida, o uso de preservativo nas relações sexuais e hábito de fumar não apresentaram neste estudo, qualquer associação com a ocorrência de infecção pelo HPV. Costatou-se uma associação negativa entre gravidez e a ocorrência de infecção genital pelo HPV, um vez que as mulheres que nunca 47 engravidaram apresentram taxa de prevalência da infecção significativamente maior (p=0,024) quando comparadas com as que tiveram gravidez (Tabela 8). Tabela 6. Correlação entre o resultado dos exames citomorfológicos e a presença de HPV em mulheres grávidas e não grávidas. Pacientes analisadas N= 221 Exame colposcópico Grávida % N= 91 PCR para HPV Positivo % p N= 29 Sem alteração 34 42,0% 11 32,4% Com alteração 47 58,0% 14 29,8% Não realizado 10 11,0% 4 40% Não grávida N= 130 Sem alteração 73 57,0% 15 20,5% Com alteração 55 43,0% 17 30,9% Não realizado 2 1,5% 1 50,0% 0,818 N= 33 0,297 Exame citológico Grávida N= 91 N= 29 Sem alteração 78 90,7% 24 30,8% Com alteração 8 9,3% 4 50,0% Não realizado/sem resultado 5 5,5% 1 20,0% Não grávida N= 130 Sem alteração 76 58,9% 17 22,4% Com alteração 53 41,1% 16 30,2% Não realizado/sem resultado 1 0,8% 0 0,0% 0,454 N= 33 0,509 Na tentativa de entender os mecanismos imunológicos envolvidos na proteção à infecção por HPV, bem como os mecanismos imunopatogênicos envolvidos na geração das lesões da cérvice uterina e do câncer, foram coletadas amostras de cérvice uterina de pacientes grávidas e não grávidas; com e sem lesão na cérvice uterina; infectadas e não infectadas por HPV; e realizado PCR em tempo real para quantificação a expressão de RNA mensageiro para as citocinas (IFN-γ, TNF-α, IL-17, IL-10 e TGF-β). Nossos resultados mostram uma maior produção de IFN-γ (P0,05) em pacientes portadoras de lesão na cérvice uterina não infectada por HPV, quando comparado àquelas com lesão e infectadas por HPV (Figura 3A). Entretanto, não foi observada diferença na expressão de RNA-m da citocina IFN-γ quando comparado entre si, todos os subgrupos de pacientes gestantes (Figura 3B). Em relação à produção 48 de TNF-α, foi observada maior expressão de RNA-m (P0,05) nas pacientes não infectadas por HPV que apresentavam alterações citomorfológicos, tanto nas gestantes quanto nas não gestantes (Figuras 3C e 3D). De maneira surpreendente, a citocina de perfil inflamatório, IL-17, teve sua expressão aumentada (P0,05) em pacientes não gestantes e sem alteração do exame citomorfológico, infectadas por HPV, quando comparadas aquelas não infectadas pelo HPV (Figura 3E). Não foi observada diferença na expressão desta citocinas entre os subgrupos de pacientes gestantes. (Figura 3F). De modo geral, as citocinas inflamatórias importantes para ativar os mecanismos microbicidas (linfócito T CD8 e T CD4) responsáveis pela eliminação de vírus encontram-se suprimidas. Em relação à produção da citocina de perfil antinflamatório IL-10, não observamos diferença significativa entre os subgrupos de pacientes não gestantes (Figura 4A). De forma semelhante ao observado com as citocinas de perfil Th1, a expressão de RNA-m da citocina IL-10 foi reduzida (P0,05) em pacientes gestantes infectadas por HPV e portadoras de lesão na cérvice uterina, quando comparado àquelas onde a infecção por HPV não foi detectada (Figura 4B). Por outro lado, observamos que as pacientes não grávidas infectadas pelo HPV e com alteração citomorfológica, apresentam aumento (P0,05) na expressão da citocina TGF-β (fator de transformação do crescimento) (Figura 4C). O mesmo foi observado para as mulheres grávidas infectadas pelo HPV e sem lesões (Figura 4D). A elevação dos níveis de TGF-β em pacientes infectadas por HPV poderia contribuir para a persistência do vírus com maior tendência a transformação maligna da célula parasitada. Tabela 7. Comparação da eficiência de dois exames citomorfológicos para a detecção de lesão por HPV em 56 com PCR positiva para HPV. Resultados dos exames citomorfológicos N= 56 Exames Com alteração % Sem alteração % p Citologia 20 36% 36 64% 0,0909 Colposcopia 29 52% 27 48% 49 Tabela 8. Associação entre a infecção genital por HPV com características socioeconômicas e fatores de risco clássicos para doenças sexualmente transmissíveis Prevalência de HPV Análise Univariada p N= 221 Positivo N= 62 % RC IC 95% < 30 116 42 36,2% 5,96 [1,25; 38,76]* 0,010 31- 45 82 18 21,9% 2,95 [0,58; 20,11] 0,153 > 45 23 2 8,7% 1 - < Fundamental 108 38 35,2% 2,01 [1,06; 3,83]* > Médio 113 24 21,2% 1 - Casada 159 40 25,2% 1 - Solteira 62 22 35,5% 1,64 [0,83; 3,22] 0,125 Até 1 salário 135 43 31,9% 0,70 [0,16; 3,15] 0,595 2 - 3 salários 76 15 19,7% 0,37 [0,08; 1,81] 0,147 > 3 salários 10 4 40% 1 - < 18 171 48 28,1% 1,02 [0,47; 2,15] > 19 50 13 26,0% 1 - Não 86 20 23,3% 1 - Sim 133 42 31,6% 1,52 [0,79; 2,97] 0,182 Nunca/raramente 163 43 26,4% 0,74 [0,37; 1,48] 0,353 Na maioria das vezes/sempre 58 19 32,8% 1 - Nunca engravidou 14 8 57,1% 1 - < 18 99 27 27,3% 0,28 [0,08; 1,00]* 0,024 > 19 108 27 25,0% 0,25 [0,07; 0,89]* 0,012 Variáveis Idade Escolaridade 0,021 Estado civil Renda familiar Idade na 1ª relação sexual 0,992 Múltiplos parceiros sexuais Uso do preservativo Idade na primeira gravidez Número de gestações Nenhuma 14 8 57,1% 1 - 1—2 117 33 28,2% 0,29 [0,08; 1,03]* 0,027 >3 90 21 23,3% 0,23 [0,06; 0,83]* 0,009 Não 166 46 27,7% 1 - Sim 55 16 29,1% 1,07 [0,52; 2,21] Hábito de fumar 0,843 50 Figura 3. A infecção por HPV reduziu a expressão de IFN-γ e TNF-α na cérvice uterina. 51 Figura 4. Pacientes infectadas por HPV apresentaram aumento da expressão de TGF-β e redução na expressão de IL-10 na cérvice uterina. 52 7. DISCUSSÃO O segmento da população estudado foi composto por mulheres jovens, sexualmente ativas grávidas e não grávidas, casadas, com baixa escolaridade e baixa renda familiar e que tiveram vários filhos, o que caracteriza um perfil típico de uma população carente do ponto de vista socioeconômico. A taxa de prevalência global da infecção genital pelo HPV foi de 28,1%, um pouco acima da observado por FERNANDES et al., 2011, em estudo anterior (24,5%) em mulheres de Natal, no período de abril de 2001 a junho de 2002. Sendo, no entanto, muito semelhante àquela relatada por NONNENM ACHER et al., 2002, em um estudo realizado em mulheres de Porto Alegre, cuja prevalência de HPV foi de 27%. A taxa de prevalência da infecção genital pelo HPV encontrada nas mulheres gestantes deste estudo foi 31,9%, mostrando-se abaixo daquela encontrada por ARM BRUSTERM ORAES et al., 2000, que foi de 48,0%, mas bem acima da relatada por RAM A et al., 2008b, em um estado realizado em São Paulo, que foi de 17,8% para HPV de alto risco. A taxa de prevalência da infecção genital pelo HPV encontrada nas mulheres gestantes foi um pouco maior nas mulheres grávidas quando comparada as não grávidas, contudo essa diferença não foi significativa. Este resultado se mostra semelhante ao encontrado por CZEGLÉDY et al., 1989, que encontraram taxas de prevalência de 34.6% e 20.4% em grávidas e não grávidas, respectivamente, sendo, no entanto, discordantes dos resultados obtidos por BANDYOPADHYAY & CHATTERJEE, em 2006, que encontraram taxas de prevalência de 68% em gestantes e 25% nas não gestantes na Índia. Constatou-se a existência de associação entre a aquisição da infecção genital pelo HPV e a idade cronológica das participantes, observando-se uma taxa de prevalência significativamente maior nas mulheres jovens com até 30 anos de idade. Isto ratifica resultados anteriores obtidos por FERNANDES et al., 2011 em mulheres de Natal e se constitui uma característica epidemiológica da infecção pelo HPV, observada em qualquer parte do mundo. A maioria das mulheres adquire a infecção logo nos primeiros anos após o início da atividade sexual, tendo em vista que a população adolescente apresenta comportamentos de risco além de riscos biológicos devido a maior exposição da junção escamocolunar em consequência da imaturidade do epitélio e resposta imune local 53 incompleta. Isso torna as mulheres jovens mais vulneráveis aos vírus que muitas vezes se tornam infectadas por vários genótipos do vírus ao mesmo tempo. (M OSCICKI, 2007; BODILY; LAIM INS, 2011; SOTO; CARRANZA; PLASCENCIA, 2011). Assim, a infecção por HPV é mais prevalente em adultos jovens, atingindo o pico entre 25 e 30 anos, havendo em seguida um declínio nas taxas de prevalência até por volta dos 45 anos, provavelmente devido à redução da atividade sexual e ao desenvolvimento de uma resposta imune contra o vírus (CASTLE et al., 2005; SM ITH et al., 2008; FERNANDES et al., 2008; CHAN et al., 2010). Na população avaliada neste estudo, as mulheres que iniciaram a vida sexual com idade até 18 anos e que tiveram múltiplos parceiros sexuais, apesar de apresentarem taxas de prevalência de 28,1% e 31,6%, respectivamente, essas variáveis não foram caracterizadas como fator de risco, tomando-se como parâmetro as mulheres que tiveram o primeiro intercurso sexual com mais de 18 anos e a aquelas que se declararam monogâmicas. Estes resultados são divergentes daqueles obtidos por NONNENM ACHER et al.,2002, para mulheres gaúchas, nas quais foi observada uma associação positiva com múltiplos parceiros sexuais ao longo da vida e início precoce da atividade sexual. No entanto são concordantes com aqueles obtidos por FERNANDES et al., 2008, em mulheres de Natal no que se refere à idade do primeiro intercurso sexual, porém discordante em relação ao número de parceiros sexuais. Uma possível explicação para esta falta de associação entre múltiplos parceiros sexuais e risco de infecção pelo HPV poderia ser a informação não verdadeira por parte de algumas mulheres que se declararam monogâmicas, ou devido ao comportamento de seus parceiros. M esmo a mulher sendo monogâmica, se o seu parceiro é promíscuo ela está submetida ao risco de adquirir a infecção pelo HPV, semelhante àquelas que tiveram múltiplos parceiros. As mulheres com escolaridade igual ou menor que o ensino fundamental apresentaram maior taxa de prevalência da infecção pelo HPV quando comparadas aquelas com ensino médio. Estes resultados são concordantes com aqueles obtidos por M ENDONÇA et al., 2010, em mulheres do Recife. Não se observou neste estudo, associação positiva entre estado civil, e renda familiar, com maior prevalência da infecção pelo HPV, embora tenham sido encontradas taxas de prevalência da infecção ligeiramente maiores nas mulheres solteiras e com menor renda familiar. Nossos resultados são discordantes daqueles encontrados M ENDONÇA et al., 2010, no que se refere à renda familiar. 54 Constatou-se para as mulheres participantes deste estudo que, ter gravidez independentemente da idade que engravidou pela primeira vez e do número de vezes que engravidou serviu como um fator de proteção contra a infecção pelo HPV. Isso se opõe a alguns estudos que classificam essas variáveis como fatores de risco para a infecção por HPV. Contudo, os dados da literatura a esse respeito são conflitantes. Em seu estudo, M ENDONÇA et al., 2010, relatam que ter um número de gestações igual ou superior a quatro configura-se como risco intermediário para a aquisição do vírus. No entanto para M URTA et al., 2001, a diferença quanto ao número de gestações anteriores não foi significativa. Resultado semelhante foi encontrado FERNANDES et al., 2008 para mulheres de Natal. O uso de preservativos nas relações sexuais não apresentou, neste estudo qualquer evidencia de redução do risco de infecção pelo HPV, o que não representa nenhuma surpresa, tendo em vista que o preservativo oferece proteção apenas à área coberta, não impedindo a transmissão pelo contato das superfícies desprotegidas. Em um estudo de meta-análise, M ANHART; KOUTSKY, em 2002, não encontraram qualquer evidência de que o uso do preservativo reduza o risco de uma pessoa adquirir a infecção pelo HPV. No entanto, o uso do preservativo se mostrou eficaz na redução global das verrugas genitais, displasia cervical e câncer, associados ao HPV. Tem sido proposto que o contato do sêmen com a mucosa do trato genital feminino está associada a uma resposta inflamatória pós-coital, marcada pela presença de TGF- que parece desempenhar um papel importante na indução de baixa reatividade imune local (ROBERTSON; SHARKEY, 2001). Esta hipótese é reforçada pela observação de uma ligação entre os níveis mais elevados de utilização do preservativo com a maior possibilidade de cura da infecção pelo HPV (SHEW et al., 2006). Além disso, tem sido observado que o uso do preservativo é associado com regressões mais rápidas de neoplasia intraepitelial cervical (HOGEWONING et al., 2003). Assim, mesmo que não seja eficaz na protecção contra a aquisição da infecção, o uso do preservativo é indicado na prevenção de neoplasias cervicais e cânceres associado ao HPV. A prática do tabagismo também não apresentou qualquer associação com aumento de risco da infecção pelo HPV. Esse resultado corrobora com aqueles obtidos em estudos anteriores realizados por FERNANDES et al., 2008, 2011 e está dentro do esperado, tendo em vista que o fumo não aumenta o risco de aquisição da infecção em si, mas de que as pessoas infectadas possam vir a desenvolver câncer, em função de vários 55 componentes químicos presentes no tabaco, incluído a nicotina, que podem atuar como cofatores aumentando o risco de câncer associado ao HPV. Neste estudo, a colposcopia se mostrou mais eficiente que a citologia para a detecção de lesões da cérvice uterina associadas ao HPV. De acordo com NAUD et al., em 2006, a colposcopia assumiu papel intermediário entre a citologia e a histopatologia no diagnóstico de lesões causadas pelo HPV. Alguns autores têm mostrado sensibilidade elevada da colposcopia, sugerindo que esta seja empregada como método de rastreio do câncer de colo do útero (NAUD et al., 2006; M ASSAD et al., 2009). No entanto, a sua especificidade tem sido questionada. TUON et al., 2002, observaram que a capacidade da colposcopia em identificar a presença de lesão foi de 51%, tomando como parâmetro o exame histopatológico, enquanto que a citologia 50%. Em uma análise retrospectiva de prontuários, STIVAL et al., 2005, constataram que a concordância entre achados colposcópicos e citológicos foi de 92% e entre citológicos e histopatológicos foi de 69% concluindo que a citologia é um bom método para o rastreamento de lesões precursoras do câncer de colo uterino. Contudo, TUON et al., 2002, verificaram que a colposcopia apresentou sensibilidade de 96%, especificidade de 19% e valor preditivo positivo foi de 65% e valor preditivo negativo de 75% tendo como referência. A citologia apresentou menor sensibilidade 41%, mas maior especificidade 77% e maior valor preditivo positivo 74%, porém menor valor preditivo negativo 45%. Quando os dois métodos foram associados à capacidade de detecção foi de 63%. Esses dados corroboram com os nossos, em relação a maior sensibilidade da colposcopia. Contudo a citologia pela sua maior especificidade aumenta e muito a acurácia do diagnóstico das lesões precursoras do carcinoma do colo uterino. Portanto os dois exames se complementam. Nosso estudo revelou também uma alta prevalência de infecção por HPV em mulheres sem quaisquer alterações cervicais tanto no exame colposcópico quanto no citológico. Na colposcopia de mulheres grávidas com teste positivo para HPV 32,4% delas não apresentaram quaisquer alterações; já em mulheres não grávidas esse índice foi de 20,5%. Na citologia de mulheres grávidas com teste positivo para HPV 30,8% apresentaram resultado do exame dentro da normalidade enquanto que nas mulheres não grávidas, 22,4 não tinham alterações citológicas, não havendo diferença significativa entre as taxas de prevalência observadas para mulheres com ou sem alterações, analisadas pelos dois métodos. Essa alta taxa de prevalência da infecção por HPV em 56 mulheres com citologia normal, confirmam os resultados de estudos anteriores realizados por FERNANDES et al., 2011, que relatam índices de 24,5%. Estudos sugerem haver uma tendência de maior gravidade das lesões decorrentes da infecção pelo HPV e progressão mais rápida para a malignidade, nas pacientes com algum grau de supressão da resposta imune, inclusive aquela que ocorre naturalmente durante o período de gravidez (COELHO et al., 2004; SILVEIRA et al., 2008). Nossos dados corroboram com esses estudos visto que a análise geral dos padrões de citocinas revelou que todas elas se encontram, de certa forma, suprimidas nas pacientes grávidas e infectadas pelo vírus. O IFN-γ é uma citocina de perfil inflamatório, produzida por células NK e T CD4, e participa efetivamente da eliminação de vírus do organismo (M ILLIGAN; BERNSTEIN, 1997). Observou-se neste estudo, que o nível de expressão do RNA-m para IFN-γ nas pacientes com lesão e sem infecção pelo HPV foi significativamente maior quando comparado aquele apresentado pelas pacientes com lesão e infectadas pelo HPV. (Figura 3A). Contudo, no grupo de mulheres grávidas não foi observada diferença significativa nos níveis dessa citocina, apesar de um aparente aumento nas pacientes sem HPV (Figura 3B). A elevação da produção do IFN-γ nas pacientes sem infecção pelo HPV pode ser devido ao fato de estas mulheres estarem infectadas por outros agentes infecciosos, tais como o HSV-2, onde uma das citocinas responsáveis pela eliminação do vírus, é o IFN-γ (M ILLIGAN; BERNSTEIN, 1997; JOHSON et al., 2010). Dentre as citocinas liberadas durante a vigência de infecção pelo HPV está o TNF-α, que é um dos principais mediadores da inflamação na pele e mucosas. O TNF-α possui um potente efeito citostático tanto em queratinócitos normais quanto naqueles imortalizados por alguns tipos de HPV, exceto nos queratinócitos imortalizados com HPV18 e/ou transformados por HPV 16 e 18 (PIERULIVO, 2002; BALDI, 2008). Assim, a expressão dos oncogenes dos HPV 16 e 18, provavelmente suprime a produção do TNF-α favorecendo a carcinogênese através da indução de proliferação, invasão e metástase de células tumorais (CASTELLETTI, 2006). No presente estudo foi observada uma maior expressão de RNA-m para o TNF-α nas pacientes não infectadas pelo HPV, mas que apresentavam alterações nos exames citomorfológicos, tanto nas gestantes quanto nas não gestantes quando comparada com aquelas que estavam infectadas pelo HPV. (Figuras 3C e 3D). Este resultado é diferente daquele obtido por ALI et al., 2012 que não encontraram diferença entre os níveis de 57 TNF-α nas secreções cervicais de pacientes com lesões induzidas pelo HPV, em comparação com aqueles com lesões semelhantes sem a presença do HPV. Contudo, nossos resultados são compatíveis com a ideia proposta por BALDI et al., em 2008, de que o HPV tende a escapar da resposta imune por não induzir inflamação acentuada e suprimir a produção do TNF-α. A citocina de perfil inflamatório, IL-17, teve sua expressão aumentada em pacientes não gestantes e sem alteração nos exames citomorfológico, mas infectadas pelo HPV, quando comparadas aquelas sem infecção (Figura 3E). As informações sobre o comportamento desta citocina na infecção por HPV são ainda escassas. Porém, JOHSON et al., 2010, observaram, em modelo murino de infecção por HSV-2 que, células deficientes para produção de IFN-γ quando infectadas por este vírus apresentaram um aumento na expressão de algumas citocinas, incluindo IL-17, como rota efetora alternativa de combate a infecções pelo vírus. Baseados nessa ideia e no fato de que a infecção pelo HPV ser também localizada no trato genital, podemos supor que possa ter ocorrido algo semelhante nas mulheres não gestantes com infecção assintomática pelo HPV participantes deste estudo. Uma possível evidência de que isto tenha ocorrido, é o fato de que em nenhum outro subgrupo foi observada diferença estatisticamente significativa na expressão desta citocina, mesmo nos grupos de pacientes gestantes (Figura 3F). Embora não tenha sido encontrada significância estatística, o aumento do nível de RNA-m para IL-17 no grupo de pacientes não grávidas, sem HPV e portadoras de inflamação na cérvice uterina (Figura 3E) pode ser explicando como um aumento frente a uma colpite fúngica uma vez que o perfil TH17 está envolvido na eliminação de infecções fúngicas (KONKEL; CHEN, 2011). A IL-10 é uma citocina que apresenta efeito supressivo sobre resposta mediada por células (SCOTT, 1993; BOLPETTI, 2009). A ocorrência de NIC(s) bem como a sua progressão para o câncer da cérvice uterina está associada ao aumento dos níveis sorológicos dessa citocina (LEVY et al., 1978; SCOTT, 1993). De forma semelhante à relatada anteriormente para as citocinas de perfil Th1, a expressão de RNA-m de IL-10, que tem perfil anti-inflamatório, foi também reduzida em pacientes gestantes infectadas pelo HPV e portadoras de lesão na cérvice uterina, quando comparadas aquelas onde a infecção por HPV não foi detectada (Figura 4B). Esse achado sugere que a imunossupressão induzida pelo HPV concomitante àquela decorrente da gestação 58 poderia beneficiar, pelo menos em parte, a mulher infectada por HPV, reduzindo a chance de progressão das lesões. Em nosso estudo observamos também não haver diferença significativa no nível de expressão de IL-10 entre os subgrupos de pacientes não gestantes com ou sem infecção pelo HPV, apesar dos níveis elevados dessa citocina em pacientes portadoras de lesões com ou sem infecção pelo HPV (Figura 4A). A elevação dos níveis desta citocina frente à infecção pelo HPV poderia favorecer o crescimento dos tumores. Em um estudo recente realizado por ALI et al., em 2012, observou-se que os níveis de IL10 nas secreções cervicais de pacientes com lesões induzidas pelo HPV, foram maiores em relação aqueles obtidos de pacientes com lesão semelhante sem HPV. Além disso, níveis mais elevados de IL-10 foram observados em secreções de pacientes que tiveram lesões cervicais que progediram para lesões intraepiteliais de alto grau e câncer associados ao HPV. Em geral, os níveis mais elevados de IL-10 do que de TNF-α sugerem uma provável modulação negativa da resposta imune específica ao tumor induzidos pelo HPV. Esta condição parece criar um microambiente favorável para a progressão das lesões associadas ao HPV, aumentando o risco de desenvolvimento de tumores em pacientes infectados com HPV(s) de alto risco (ALI; ALI; JUBRAEL, 2012). Utilizando o modelo murino de infecção pelo HPV, BOLPETTI et al., em 2009, constaram que a IL-10 tem papel supressor da resposta celular mediada por linfócitos T CD8+ uma vez que em animais deficientes de IL-10 houve uma maior quantidade de infiltrado de linfócitos T CD8+ específicos para E7 do HPV 16. Além disso, na ausência de IL-10 os tumores TC-1 cresceram mais lentamente, e apresentaram quantidade reduzida de linfócitos T regulatórios nos linfonodos dos animais. Observou-se que nas pacientes não gestantes infectadas pelo HPV e que apresentavam alteração citomorfológica, houve um aumento significativo (P0,05) da expressão da citocina TGF-β (Figura 4C). Um aumento significativo dessa mesma citocina foi também observado nas pacientes gestantes infectadas por HPV, porém sem alteração citomorfológica (Figura 4D). Em ambos os casos, a elevação dos níveis de TGF-β poderia contribuir de alguma forma, para a persistência do vírus, aumentando a tendência para a imortalização e transformação maligna da célula parasitada, uma vez que as citocinas inflamatórias importantes para ativar os mecanismos microbicidas mediados por linfócito T CD8 e T CD4 encontram-se suprimidos. 59 8. CONCLUSÕES Nesse estudo, a prevalência da infecção genital pelo HPV foi de 28,1%, sendo 31,9% em pacientes grávidas e 25,4% em mulheres não grávidas. A colposcopia apresentou melhor correlação com a detecção do DNA do HPV por PCR quando comparada à citologia. Tanto o exame colposcópico quanto o citológico detectou uma menor frequência de alterações nas mulheres grávidas quando comparado com aquelas não grávidas. Dos fatores de risco analisados a idade e a baixa escolaridade exerceram influência, observando-se uma maior prevalência da infecção entre as mulheres mais jovens. De um modo geral, as pacientes infectadas pelo HPV, grávidas ou não, apresentaram uma redução da expressão de RNA-m tanto para as citocinas próinflamatórias (IFN-γ, TNF-α) quanto para a antinflamatória (IL-10) em relação às pacientes não infectadas com HPV. Nas pacientes não grávidas e infectadas, a expressão de RNA-m de IL-17 mostrou-se aumentada nas pacientes sem lesões, e a expressão de RNA-m de TGF-β foi maior naquelas com lesões. Nas pacientes grávidas infectadas com HPV, se observou um aumento na expressão de TGF-β naquelas sem lesão. 60 9. REFERÊNCIAS ABBAS, A.K.; MURPHY, K.M.; SHER, A. Functional diversity of helper T lymphocytes. Nature. 383(6603): 787-793, 1996. ALI, K. S.; ALI, H. Y.M.; JUBRAEL, J. M. S. Concentration levels of IL-10 and TNFα cytokines in patients with human papilloma virus (HPV) DNA+ and DNA− cervical lesions. Journal of Immunotoxicology. Vol. 9, No. 2, p. 168-172, doi:10.3109/1547691X.2011.642419, 2012. ALCOCER-GONZALEZ, J.M. et al. In vivo expression of immunosuppressive cytokines in human papillomavirus-transformed cervical cancer cells. Viral Immunology, Vol. 19, No. 3, pp. 481-491, 2006. ALENCAR, T.R. et al. New HPV-16 European and non-European variants in Central Brazil. Virus Genes. 35: 1-4, 2007. ARMBRUSTER-MORAES, E. et al. Prevalence of ‘high risk’ human papillomavirus in the lower genital tract of Brazilian gravidas. International Journal of Gynecology & Obstetrics. vol. 69 (3), p. 223-227, 2000. BALDI, C. V. M. Efeito do fator de necrose tumoral (TNF) em queratinócitos humanos que expressão as proteínas E6 e E7 de papilomavírus humano tipo 16 (HPV16). Tese de Doutorado. Universidade de São Paulo (USP), 2008. BANDYOPADHYAY, S.; CHATTERJEE, R. HPV viral Load determination during pregnancy as a possible cervical cnacer risk. J Exp Clin Cancer Res 25 (1): 29-38, 2006. BASEMAN, J.G.; KOUTSKY, L.A. The epidemiology of human papillomavirus infections. Journal of Clinical Virology, Vol. 32, No.4 – Suppl 1, pp. S16-S24, 2005. BODILY, J.; LAIMINS, L.A. Persistence of human papillomavirus infection: keys to malignant progression. Trends in Microbiology, Vol. 19, No. 1, pp. 33-39, 2011. BOLPETTI, A. N. Estudo da progressão tumoral e perfil de expressão de citocinas em modelos tumorais associados ao HPV-16 em camundongos. Tese de Doutorado. Fundação Antônio Prudente.São Paulo, 162p, 2009. BOSCH, F. X. et al. Prevalence of human papillomavirus in cervical cancer: a worldwide perspective. Journal of the National Cancer Institute, Vol 87 (11), 796 – 802, 1995. BOSCH, F.X. et al. The cause relation between human papillomavirus and cervical cancer. Journal of Clinical Pathology, 55: 244-265, 2002. BOSCH, F.X.; De SANJOSÉ, S.; CASTELLSAGUÉ, X. Chapter 4 HPV and genital cancer: the essential epidemiology. Vaccines for the Prevention of Cervical Cancer, 1: med -9780199543458chapter-4. DOI: 10, 2008. BRANDTZAEG, P. Mucosal immunity in the female genital tract. J. Reprod. Immunol. 36, 23-50, 1997. BURD, E.M. Human Papillomavirus and cervical cancer. Clinical Microbiology Reviews, 16: 117, 2003. CASTELLETTI, C. H. M. Possíveis regiões gênicas de interesse para o desenvolvimento do papilomavírus humano. Tese de Mestrado, Universidade Federal de Pernambuco (UFPE), Brasil, 99p, 2006. CASTLE, P. E. et al. A prospective study of age trends in cervical Human Papillomavirus acquisition and persistence in Guanacaste, Costa Rica. The Journal of Infectious Diseas e, Vol.191, No. 11, pp. 1808-1816, 2005. CERQUEIRA, D. M. et al. New variants of human papillomavirus type 18 identified in central Brazil. Virus Genes 37: 282-287, 2008. CHAN, P.K. et al. Age distribution of human papillomavirus infection and cervical neoplasia reflects caveats of cervical screening policies. International Journal of Cancer, Vol. 126, No. 1, pp. 297-301, 2010. 61 CHAN, W.K.; KLOCK, G.; BERNARD, H.U. Progesterone glucocorticoid response elements occur in the long control regions of several human papillomavirus involved in anogenital neoplasia. Journal of Virology, 63: 3261-3269, 1989. CHANG, Y.E.; LAIMINS, L.A. Microarray Analysis Identifies Interferon-Inducible Genes and Stat-1 as Major Transcriptional Targets of Human Papillomavirus Type 31. J. Virol. 74 (9): 4174-4182, 2000. CHO, Y.S. et al. Down modulation of IL-18 experssion by human papillomavirus type 16 E6 oncogene via binding to Il-18. FEBS Letters, Vol. 501, No 2-3, pp. 139-145, 2001. CLIFFORD, G. M. et al. Worldwide distribution of human papillomavirus types in cytologically normal women in the International Agency for Research on Cancer HPV prevalence surveys: a pooled analysis. THE LANCET, Volume 366 (9490), p. 991–998, 2005a. CLIFFORD, G. M. et al. Human Papillomavirus Genotype distribution in Low-Grade Cervical Lesions: Comparison by Greographic Region and Cervical Cancer. Cancer Epidemiology, Biomakers Prev, 14(5), 1157-64, 2005b. COELHO, F. R. G. et al. Estrogen and progesterone receptors in human papilloma virus -related cervical neoplasia. Brazilian Journal Medicine Biology Review, 37: 83 – 88, 2004. CRAWFORD, L.V.; CRAWFORD, E.M. A comparative study of polyoma and papilloma viruses. Virology, 21: 258-263, 1963. CUSCHIERI, K. S. et al. Persistent high risk HPV infection associated with development of cervical neoplasia in a prospective populati on study. J Clin Pathol; 58: 946-950, 2005. CZEGLÉDY, J.; GERGELY, L.; ENDROEDI, I. Detection of human papillomavirus deoxyribocucleic acid by filter in situ hybridization during pregnancy. J Med Virol 28: 250-254, 1989. De RODA HUSMAN, A. M. et al. The use of general primers GP5/GP6 elongated at their 3’ ends with adjacent highly conserved sequence improves human papillomavirus detection by PCR. Journal of General Virology, 76:1057-1062, 1995. De SANJOSÉ et al. Worldwide prevalence and genotype distribution of cervical human papillomavirus DNA in women with normal cytology: a meta-analysis. Lancet Infectious Diseases, Vol. 7, No. 7, pp. 453-459, 2007. DEXEUS, S.; CARARACH, M.; DEXEUS, M. The role of colposcopy in modern gynecology. Eur J Gynaecol Oncol, 23 (4): 269-277, 2002. DOOBAR, J. The papillomavirus life cycle. J. Clin. Virol. Vol. 32, pp 7-15, 2005. ELUF-NETO, J. et al. Human papillomavirus and invasive cervical cancer in Brazil. Br. J. Cancer, 69, 114-119, 1994. FAVRE, M. et al. Chromatin-like structures obtained after alkaline disruption of bovine and human papillomavirus. Journal of Virology, 21: 1205-1209, 1977. FEBRASGO (Federação Brasileira das Associações de Ginecologia e Obstetrícia). Manual de Orientação: Trato Genital Inferior. pp 9-27, 2010. FERNADES, J. V. et al. Human papillomavirus infection in women attended at a cervical cancer screening service in Natal, Brazil. Brazilian Journal of Microbiology 39: 573-578, 2008. FERNANDES, J. V. et al. Prevalence of HPV infection by cervical cytologic status in Brazil. Int J Gynecology and Obstetrics 105, 21-24, 2009. FERNADES, J. V. et al. Human papillomavirus prevalence in women with normal cytology and with cervical câncer in Natal, Brazil. Moleculae Medicine Reports 4: 1321-1326, 2011. FIFE, K. H. et al. Cancer-associated human papillomavirus types are selectively increased in the cervix of women in the first trimester of pregnancy. Am J Obstet Gynecol 174: 1487-1493, 1996. FILIPPOVA, M. et al. The Human Papillomavirus 16 E6 Protein Binds to Tumor Necrosis Factor (TNF) R1 and Protects Cells from TNF-induced Apoptosis. The Journal Biological Chemistry, Vol. 277, No. 24, pp. 21730 – 21739, 2002b. 62 FRANCO, E. L. et al. Transmission of Cervical Human Papillomavirus Infection by Sexual Activity: Differences between Low and High Oncogenic Risk Types. J Infect Dis. 172 (3): 756763. doi: 10.1093/infdis/172.3.756, 1995. FRANCO, E.L. et al. Epidemiology of cervical human papillomavirus infection. In: FRANCO, E.L.; MONSONEGO, J., Editors. New Developments in Cervical Cancer Screenin g and Prevention. London (U.K.): Blackwell 14-22, 1999. GAJEWSKI, T.F.; FITCH, F.W. Anti-proliferative effect of IFN-gamma in immune regulation. I. IFN-gamma inhibits the proliferation of Th2 but not Th1 murine helper T lymphocyte clones. J Immunol. 140 (12): 4245-4252, 1988. GHITTONI, R. et al. The biological properties of E6 and E7 oncoproteins from human papillomaviruses. Virus Genes, Vol. 40, No. 1, pp. 1-13, 2010. GONZÁLEZ, P. et al. Behavioral/Lifestyle and Immunologic Factors Associated with HPV Infection among Women Older Than 45 Years. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 19(12); 30443054, 2010. HASAN, U.A. et al. TLR9 expression and function is abolished by the cervical cancerassociated human papillomavirus type 16. Journal of Immunology, Vol. 178, No. 5, pp. 31863197, 2007. HEBNER, C.M.; LAIMINS, L.A. Human papillomaviruses: basic mechanisms of pathogenesis and oncogenicity. Reviews in Medical Virology, Vol. 16, No 2, pp. 83-97, 2006. HERRERO, R. et al. Population-based study of human papillomavirus infection and cervical neoplasica in rural Costa Rica. Journal of the National Cancer Institute, 92: 464-474, 2000. HERRERO, R. Chapter 7: Human papillomavirus and cancer of the upper aerodigestives tract. Journal of the National Cancer Institute Monographs, 31: 37-51, 2003. HERVOUET, C. et al. Langerhans cells prime IL-17-producing T cells and dampen genital cytotoxic responses following mucosal immunization. J. Immunol. 184, 4842-4851, 2010. HOGEWONING, C. J. et al. Condom use promotes regression of cervical intraepithelial neoplasia and clearance of human papillomavirus: a randomized clinical trial. Int J Cancer. 107(5):811-6, 2003. IWASAKI, A. Antiviral immune responses in the genital tract: clues for vaccines. Natures Reviews Immunology, Vol 10, pp. 699-711, 2010. IWASAKI, A.; MEDZHITOV, R. Regulation of adaptative immunity by the innate immune system. Science 327, 291-295, 2010. JOHSON, A.J. et al. Herpes simplex virus (HSV)-specific T cells activated in the absence of IFNgamma express alternative effector functions but are not protective against genital HSV-2 infection. Journal of Reproductive Immunology, 84, 8-15, 2010. KANODIA, S.; FAHEY, L.M.; KAST, W.M. Mechanisms used by human papillomaviruses to escape the host immune response. Current Cancer Drug Targets. Vol. 7, No. 1, pp. 79-89, 2007. KIVIAT, N. B. et al. Prevalence of genital papillomavirus infection among women attending a college student health clinic r a sexually transmitted disease clinic. J Infect Dis, 158: 293 – 302,1989. KLUG, A.; FINCH, J.T. Structure of viruses of the papilloma-polyoma type 11 human warts virus. Journal Molecular Biology, 11: 403-423, 1965. KOBAYASHI, N. et al. Down-regulation of CXCR4 expression on human CD8+ T cells during peripheral differentiation. European Journal of Immunology, Vol. 34, No. 12, pp. 3370-3378, 2004. KONKEL, J. E.; CHEN, W. Balancing acts: the role of TGF-β in the mucosal immune system. Trends in Molecular Medicine. Vol. 17, n. 11, 668-676, 2011. LAURENCE, A.; O'SHEA, J.J. T (H)-17 differentiation: of mice and men. Nat Immunol. 8(9): 903-905, 2007. Le BON, A.; TOUGH, D.F. Links between innate and adaptive immunity via type I interferon. Current Opinion in Immunology, Vol. 14, No 4, pp. 432-436, 2002. 63 LEVY, S. et al.Cellular immunity in squamous cell carcinoma of the uterine cervix. Am J Obstet Gynecol., 130:160-4, 1978. LIVAK, K.J.; SCHMITTGEN, T.D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitati ve PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. Vol. 25(4), pp. 402-8, 2001. LONGWORTH, M.S.; LAIMINS, L.A. Pathogenesis of human papillomavirus in differentiating epithelia. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 68: 362-372, 2004. LORENZATO, F. et al. The use of human papillomavirus typing in detection of cervical neoplasia in Recife (Brazil). International Journal of Gynecological Cancer. Volume 10, Issue 2, pages 143–150, 2000. LOWY, D.R.; KIRNBAUER, R.; SCHILLER, J.T. Genital human papillomaviruses. Proceeding National Academic Science USA, 91: 2436-2440, 1994. MALHORTA, S. Impact of the sexual revolution: consequences of risky sexual behaviors. J Am Physi Surge 13 (3): 88 – 90, 2008. MANHART, L. E.; KOUTSKY, L. A. Do condoms prevent genital HPV infection, external genital warts, or cervical neoplasia? A meta-analysis. Sex Transm Dis. 29(11):725-35, 2002. MASSAD, L.S. et al. The accuracy of colposcopic grading for detection of high grade cervical intraepithelial neoplasia. J Low Genit Tract Dis. 13 (3), 137-144, 2009. MENDONÇA, V. G. et al. Infecção cervical por papilomavírus humano: genotipagem viral e fatores de risco para lesão intraepitelial de alto grau e câncer de colo do útero. Rev. Bras. Ginecol. Obstet., vol. 32(10):476-485, 2010. MILLIGAN, G. N.; BERNSTEIN, D.I. Interferon-γ Enhances Resolution of Herpes Simplex Virus Type 2 Infection of the Murine Genital Tract. Virology, Vol. 229; 259-268, 1997. MISTRY, N.; WIBOM, C.; EVANDER, M. Cutaneous and mucosal human papillomaviruses differ in net surface charge, potential impact on tropism. Virology Journal, 5:118, 2008. MIURA, S. et al. CD1d, a sentinel molecule bridging innate and adaptative immunity, is downregulated by the human papillomavirus (HPV) E5 protein: a possible mechanism for immune evasion by HPV. Journal of Virology, Vol 84, No 22, pp. 1114-11623, 2010. MONSONEGO, J. et al. Cervical cancer control, priorities and dew directions. International Journal of cancer, 108: 329 – 333, 2004. MOODLEY, M. et al. The role of steroid contraceptive hormones in the pathogenesis of invasive cervical cancer: A review. Int J Gynecol Cancer, 13, 103-110, 2003. MOODY, C.A.; LAIMINS, L.A. Human papillomavirus oncoproteins: pathways to transformation. Nature Reviews Cancer, Vol. 10, No. 8, pp. 550-560, 2010. MOSCICIKI, A. B. HPV infection in adolescents. Disease Markers 23 : 229-234, 2007. MUÑOZ, N. Human papilloma virus and cancer: the epidemiological evidence. Journal of Clinical Virology, 19: 1- 5, 2000. MUÑOZ, N. et al. Epidemiologic classification of human papillomavirus types associated with cervical cancer. The New England Journal of Medicine, 348: 518-527, 2003. MUÑOZ, N. et al. Chapter 1: HPV in the etiology of human cancer. Vaccine 24 s3: s3/1 – s3/10, 2006. MURPHY, K.; TRAVERS, P.; WALPORT, M. Imunobiologia de Janeway. 7ª Edição. Editora ArtMed, 2009. MURTA, E. F. C. et al. Infecção pelo Papilomavírus Humano durante a Gravidez: Relação com Achados Citológicos. RBGO - v. 23, nº 6, 2001. MÜNGER, K. et al. Mechanisms of human papillomavirus -induced oncogenesis. Journal of Virology, Vol. 78, No. 21, pp. 11451-11460, 2004. NAKAMURA, M. et al. Hypoxia-specific stabilization of HIF-1alpha by human papillomaviruses. Virology, Vol. 387, Issue 2, pp. 442–448, 2009. NAKANISHI, Y. et al. CD8+ T lymphocyte mobilization to virus -infected tissue requires CD4+ T-cell help. Nature 462, 510-513, 2009. 64 NATALE, C. et al. Computer-assisted analysis of molecular mimicry between human papillomavirus 16 E7 oncoprotein and human protein sequences. Immunology Cell Biology, Vol. 78, No. 6, pp. 580-585, 2000. NAUD, P. et al. História da Colposcopia: do Invento de Hinselmann aos Ensaios Clínicos Atuais. Femina, Vol. 34, n. 9, 2006. NAZEER, S.; SHAFI, M.I. Objective perspective in colposcopy. Best Pratice & Research Clinical Obstetrics and Gynaecology 25, 631-640, 2011. NEES, M. et al. Papillomavirus type 16 oncogenes downregulate expression of interferonresponsive genes and upregulate proliferation-associated and INF-κB-responsive genes in cervical keratinocytes. Journal of Virology, Vol. 75, No. 9, pp. 4283-4296, 2001. NIEDERGANG, F. et al. Dendritic cells: the host Achill´s heel fot mucosal pathogens? Trends Microbiol. 12 : 78-88, 2004. NONNENMACHER , B. et al. Identificação do papilomavírus humano por biologia molecular em mulheres assintomáticas. Rev Saúde Pública; 36(1):95-100, 2002. O'BRIEN, P.M.; CAMPOS, M.S. Evasion of host immunity directed by papillomavirus -encoded proteins. Virus Research, Vol. 88, No. 2, pp.103-117, 2002. OPPELT, P. et al. Correlation of high-risk human papilloma viruses but not of herpes viruses or Chlamydia trachomatis with endometriosis lesions. Fertility and Sterility, 2009. PAESI, S. et al. High prevalence of human papillomavirus type 58 in patients with cervical premalignant lesions in southern Brazil. J Med Virology 81: 1270-1275, 2009. PALAZZI, M.A. et al. Detection of oncogenic human papillomavirus in sporadic retinoblastoma. Acta Ophthalmology Sacndinavia, 81 (4): 396-398, 2003. PAPANICOLAOU, G. N. A New Procedure for Staining Vaginal Smear. Science, n.95, p. 438439, 1942. PEREYRA, E.A.G.; GERRA, D.M.M.; VILLA, L.L. Papillomaviroses Humanas. In: Veronesi R, Focaccia R, (Eds). Tratado de Infectologia, Ed. Atheneu: São Paulo – SP, p. 457-463, 1997. PETT, M.K. et al. Selection of cervical keratinocytes containing integrated HPV16 associates with episome loss and an endogenous antiviral response. PNAS, Vol. 103, No. 10, pp. 3822-3827, 2006. PFISTER, H.; ZUR HAUSEN, H. Characterization on protein of human papillomavirus (HPV) and antibody response to HPV1. Medical Microbiology Immunology, 166: 13-19, 1978. PFISTER, H. Chapther 8: Human papillomavirus and skin cancer. Journal of the National Cancer Institutes Monographs, 31: 52-56, 2003. PIERULIVO, E. M. B. Efeito do fator de necrose tumoral-alfa (TNF-α) sobre células imortalizadas por papilomavírus humano (HPV). Tese de Doutorado. Universidade de São Paulo (USP), 2002. RAMA, C.H. et al. Opportunity for catch-up HPV vaccination in young women after first delivery. J Epidemiol Community Health d oi:10.1136/jech.2008.086439, 2008a. RAMA, C. H. et al. Prevalência do HPV em mulheres rastreadas para o câncer cervical. Rev. Saúde Pública v.42 n.1 São Paulo, 2008b. RICHARDSON, H. et al. The natural history of type-specific human papillomavirus infections in female university students. Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention, Vol. 12, No. 6, pp. 485-490, 2003. RINCON-OROZCO, B. et. al. Epigenetic silencing of interferon-κ in human papillomavirus type 16–positive cells. Cancer Research, Vol. 69, No. 22, pp. 8718-8725, 2007. ROBERTSON, S. A.; SHARKEY, D. J. The role of semen in induction of maternal immune tolerance to pregnancy. Semin Immunol. 13(4):243-54, 2001. SAIKI, R.K. et al. Enzimatic amplification of b-globina genomic sequence and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. Science, 230:1350 –1354, 1985. SAMBROOK, J.; FRITSCH, E. F.; MANNIATIS, T. Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2 Ed., New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1992. 65 SAMUEL, C.E. Antiviral actions of interferons. Clinical Microbiology Reviews, Vol. 14, No. 4, pp. 778-809, 2001. SANGUINETTI, C. J.; DIAS NETO, E.; SIMPSON, A. J. G. Rapid silver staining and recovery of PCR products separated on polyacrylami de gels. Biotechniques, 17: 915 –919, 1994. SASAGAWA T, TAKAGI H, MAKINODA S. Immune responses against human papillomavirus (HPV) infection and evasion of host defense in cervical cancer. J Infect Chemother. Published online: DOI 10.1007/s10156-012-0485-5, 2012. SCHELLEKENS, M.C. et al. Prevalence of single and multiple HPV types in cervical carcinomas in Jakarta, Indonesia. Gynecologic Oncology, v. 93, p. 49-53, 2004. SCHIFFMAN, M. et al. Human papillomavirus testing in the prevention of cervical cancer. Journal of the National Cancer Institute, Vol. 103, No. 5, pp. 368-383, 2011. SCOTT, P. IL-12 Initiation citokyne for cell mediated immunity. Sciences, 260:496-7, 1993. SCOTT, M.; NAKAGAWA, M.; MOSCICKI, A.B. Cell-mediated immune response to human papillomavirus infection. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology, Vol. 8, No. 2, p. 209 220, 2001. SELLORS, J.W. et al. Incidence, clearance and predictors of human papilomavírus infection in women. Canada Medicine Association Journal, 68 (4): 421–425, 2003. SHEW, M. L. et al. Association of Condom Use, Sexual Behaviors, and Sexually Transmitted Infections with the Duration of Genital Human Papillomavirus Infection among Adolescent Women. Arch Pediatr Adolesc Med.160:151-156. 2006. SHIELDS, T. S. et al. A case-control study of risk factors for invasive cervical cancer among U.S women exposed to oncogênico types of human papillomavirus. Cancer Epidemiology Biomarkers & Prevention, 13: 1574 – 1582, 2004. SILVEIRA, L. M. S. et al. Gestação e papilomavirus humano: influência da idade materna, período gestacional, número de gestações e achados microbiológicos. RABC 40(1): 43 – 47, 2008. SMITH, J. S. et al. Age-specific prevalence of infection with human papillomavirus in females: A Global Review. Journal of Adolescent Health. Vol. 43, pp. S5–S25, 2008. SOTO, S. S.; CARRANZA, A. O. P.; PLASCENCIA, J. L. Virus del papiloma humano y adolescencia. Ginecol Obstet Mex 79 (4):214-222, 2011. SOUZA, P.S.A.; VILLA, L.L. Genetic susceptibility to infection with human papillomavirus and development of cervical cancer in women in Brazil. Mutation Research/Reviews in Mutation Research. vol. 544(2-3), p. 375-383, 2003. STANLEY, M.A. Immune responses to human papillomavirus. Vaccine, Vol. 24, Suppl 1, pp. S16-22, 2006. STANLEY, M.A. Immunobiology of HPV and HPV vaccines. Ginecologic Oncology, Vol. 109, Suppl 2, pp. S15–21, 2008. STANLEY, M.A. Immune responses to human papilloma viruses. Indian Journal Medicine Research, Vol. 130, No. 3, pp. 266-276, 2009 a. STANLEY, M.A. Immunobiology of genital HPV infection. CME Journal of Gynecologic Oncology, Vol. 14, pp. 36-43, 2009 b. STERN, P.L. Immune control of human papillomavirus (HPV) associated anogenital disease and potential for vaccination. J Clin Virol. 32S: S72-S81, 2005. STIVAL, C.O. et al. Avaliação Comparativa da Citologia Positiva, Colposcopia e Histopatologia: Destacando a Citopatologia como Método de Rastreamento do Câncer do Colo de Útero. RBAC, Vol. 37(4): 215-218, 2005. STRAIGHT, S.W.; HERMAN, B.; McCANCE, D.J. The E5 oncoprotein of human papillomavirus type 16 inhibits the acidification of endosomes in human keratinocytes. Journal of Virology, Vol. 69, No.5, pp. 3185 – 3192, 1995. Swiss Institute of Bioinformatics, Viral Zone – disponível em http://viralzone.expasy.org/all_by_species/5.html 66 SYRJÃNEN. K.J. HPV infections in benign and malignant sinonasal lesions. Journal Clinical Pathology, 56 (3): 174-181, 2003. TAKEUCHI, O.; AKIRA, S. Pattern recognition receptors and inflammation. Cell 140, 805-820, 2010. TINDLE, R.W. Immune evasion in human papillomavirus -associated cervical cancer. Nature Reviews Cancer, Vol. 2, pp. 1-7, 2002. TUON, F. F. B. et al. Avaliação da sensibilidade e especificidade dos exames citopatológico e colposcópico em relação ao exame histológico na identificação de lesões intra-epiteliais cervicais. Rev. Assoc. Med. Bras., vol.48 no.2, São Paulo, 2002. TROTTIER, H.; FRANCO, E. L. The Epidemiology of genital human papillomavirus infection. Vaccine 24 (Suppl 1): 4-15, 2006. Van Der BRULE, A.J.C. et al. Rapid detection of human papillomavirus in cervical scrapes by combined general primers-mediated and type-specific polymerase chain reaction. Journal Clinical Microbriology, 28: 2739-2743, 1990. Van Der BURG, S.H.; PALEFSKY, J.M. Human immunodeficiency virus and human papilloma virus - why HPV-induced lesions do not spontaneously resolve and why therapeutic vaccination can be successful. Journal of Translational Medicine, Vol. 7, No 108, pp. 1-8, 2009. Van REGENMORTEL, M.H.V. et al. Family Papillomaviridae. In Virus Taxonomy. Seventh Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. Virology Division, International Union of Microbiological Societies, UK, Academic Press, p. 247-251, 2000. VILLA, L.L. Human papillomavirus and cervical cancer. Advances in Cancer Research, Vol. 71, Academic Press, San Diego. p. 321-441, 1997. VILLA, L.L. Molecular variability of human papillomavirus and susceptibility to cervical neoplasia. Journal of the Brazilian Association for the Advancement of Science, 51: 212-217, 1999. VILLA, L. L. Vaccines against papillomavirus infections and disease. Salud Publica Mexico, Suppl 3: S443 – 448, 2003. VINCE, A. et. al. Molecular detection of human papillomavirus in women with minor-grade cervical cytology abnormalities. Journal of Clinical Virology. 20: 91-94, 2001. WESA, A. et al. Polarized type-1 dendritic cells (DC1) producing high levels of IL-12 family members rescue patient TH1-type antimelanoma CD4+ T cell responses in vitro. J Immunother. 30(1): 75-82, 2007. WONG, H.Y. et al. Tumor-especific human CD4+ regulatory t cells and their ligands: implications for immunotherapy. Immunity. 20: 107-118, 2004. YOSHIKAWA, H. et al. Detection and typing of multiple genital human papillomavirus by DNA amplification with consensus primers. Japan Journal Cancer Research. 82: 524-531, 1991. ZHOU, F.; LEGAATT, G.R.; FRAZER, I.H. Human papillomavirus 16 E7 protein inhibit inteferon-γ-mediated enhancement of keratinocyte antigen processing and T-cell lysis. FEBS Journal, Vol. 278, No 6, pp. 955-963, 2011.3. Zur HAUSEN, H. Papillomavirus infections a major cause of human cancers. Biochim Biophys Acta. v.1288, n.2, Oct 9, p.F55-78, 1996. 67 10. ANEXOS 10.1. Nomenclatura Atual para Descrição e Classificação dos Achados Colposcópicos 68 10.2. Fluxograma de colposcopia Informar a paciente Prepara-la para a colposcopia Posiciona-la corretamente Inserir o espéculo Inspecionar rapidamente a cérvice inteira Procurar por leucoplasia ou vasos anormais Limpar a cérvice com solução salina Usar filtro verde para ressaltar os vasos sanguíneos Cérvice suspeita de malignidade Aplicação de ácido acético 3 a 5 % Exame sob pequeno e grande aumento Identificação da JEC Não visualização da JEC Visualização da JEC Colposcopia insatisfatória Colposcopia satisfatória Lesões visualizadas Avaliação do local e tamanho das lesões Lesões não visualizadas Aplicação da solução de lugol (Teste de Schiller) Uso do sistema de avaliação da colposcopia para definir a extensão e as características dos achados do exame Biópsia cervical Curetagem endocervical? Fonte: adaptado de NAZEER; SHAFI, 2011. 69 10.3. Categorização das Citocinas Analisadas no Estudo Família Interferons Citocina (nome alternativo) Tamanho (numero de AA e forma) Receptores (“c” significa uma subunidade comum) 143, homodímero CD119, IFNGR2 IL-10 (fator inibidor da síntese de citocina) 160, homodímero IL-10Rα + IL10-10Rβc (CRF2-4, IL-10R2) IL-17A (mCTLA-8) 150, homodímero IL-17-AR (CD217) IL-17F (M L1) 134, homodímero IL-17AR (CD217) IFN-γ Interleucinas Família TNF Indeterminado TNF-α (caquectina) TGF-β1 157, trímeros 112, homo e heterodímero Células produtoras Ações Efeito da citocina ou do receptor (quando conhecido) Células T, células NK Ativação de macrófagos, aumento da expressão de moléculas M HC e dos componentes do processamento de antígenos, mudança de classe de Ig, supressão de T H2. IFN-γ, CD119: diminui a resistência a infecções bacterianas e tumores. M onócitos Potente supressor das funções dos macrófagos IL-10, IL10Rβc: crescimento reduzido, anemia, enterocolite crônica. TH17, células T CD8, células NK, células T γ:δ, neutrófilos Induz a produção de citocinas pelas células epiteliais, pelo endotélio e pelos fibroblastos, proinflamatória. IL-17R: reduz a migração de neutrófilos ao local da infecção. p55 (CD120a), p75 (CD120b) M acrófagos, células NK, células T Inflamação local, ativação endotelial. p55: resistência ao choque séptico, susceptibilidade a Listeria STNF-αR: ataques febris periódicos TGF-βR Condrócitos, monócitos, células T Inibe o crescimento celular, antiinflamatório, induz mudança para a produção de IgA TGF-β: inflamação letal Fonte: adaptada de MURPHY; TRAVERS; WALPORT, 2009. 70 10.4. Considerações Éticas 10.4.1. Questionário MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS DEPARTAMENTO DE MICROB IOLOGIA E PARASITOLOGIA Pesquisa: Prevalência da Infecção por HPV, Chlamydia trachomatis e Herpes Simples Tipo 2 em mulheres. Questionário Epidemiológico: As informações aqui prestadas serão absolutamente confidenciais e acessíveis apenas às pessoas envolvidas, diretamente nesta pesquisa. Não será usado em nenh um momento, nomes das pacientes em qualquer tipo de divulgação. Nome: _________________________________________________________ Amostra No : _______ Data da primeira coleta: _____/_____/_______ Data da segunda Coleta: _____/______/_________ 1. Idade da paciente: _______ anos: 2. Município onde mora: _______________________________ 3. Escolaridade: ( ) Nunca estudou ( ) Ensino médio incompleto ( ) Ensino fundamental incompleto ( ) Ensino médio completo ( ) Ensino fundamental completo ( ) Ensino superior incompleto ( ) Ensino superior completo 4. Estado civil: ( ) Solteira 5. Etnia (cor da pele): ( ( ) Casada ou vive com o parceiro em relação estáve l ) Branca ( ( ) Outros ) Não Branca 6. Renda familiar aproximada em salários mínimos: ( ) Menos de um ( ) Um ( ) Dois ( ) Três ( ) Quatro ( ) Cinco ( ) Mais de cinco 7. Qual a sua religião: ( ) Católica ( ) Evangélica 8. Já iniciou a atividade sexual: ( ( ) Espírita ( ) Outras ( ) Não tem religião ) Não ( ) Sim. Se a resposta for SIM, com que idade você teve a primeira relação sexual:_______ anos. 9. Já teve ou tem, relacionamento sexual com mais de um parceiro, ao longo da vida: ( )Não ( )Sim, Se SIM, quantos? ( ) Dois ( ) Três ( ) Quatro ( ) Cinco ( ) Seis ( ) Mais de seis 10. Já teve alguma gravidez: ( ) Não ( ) Sim. Se resposta for SIM, quantas vezes? _____ e com que idade você engravidou pela a primeira vez? _______ anos. 11. Com que freqüência você usa preservativo nas relações sexuais: ( ) Nunca ( ) Raramente 12. Você é ou já foi fumante: ( ( ) Sim ( ) A maioria das vezes ( ) Sempre ) Não, Se a resposta for SIM, há quanto tempo _____ anos 13. Você está tomando algum tipo de medicamento no momento: ( ) Sim ( ) Não Se a resposta for SIM, qual: ________________________________________________________________________ 14. Você tem conhecimento da existência de um exame ginecológico que as mulheres precisam fazer periodicamente: ( ) Sim ( ) Não Se a reposta for SIM A. Qual é o nome deste exame: _______________________________________________________ B. Você sabe para que serve este exame: ______________________________________________ C. Quem lhe informou a respeito deste exame ou de que forma você ficou sabendo da existência dele: ( ) O médico ( ) O agente ( ) Amigas ou parentes ( ( ) Colegas de trabalho ( ) Na escola ( ) Na igreja ) No rádio / TV ( ) Outros 71 15. Antes desta consulta você tinha ido ao ginecologista nos últimos 12 meses: ( ) Sim ( ) Não Se a reposta for SIM, qual foi a principal razão para você realizar esta consultar: ( ) Fazer pré-natal ( ) Fazer controle de natalidade ( ( ) Realizar o exame citológico de prevenção do câncer de colo do útero ) Estava com sintomas de doença ( ) Outras 16. Com relação à realização periódica do exame citológico de Papanicolaou como você considera? ( ) Necessária ( ) Desnecessária ( ) Não sabe responder A. Se a resposta for DESNECESSÁRIA, qual a principal razão para considerá-la desnecessária? ( ) Porque não sente nada ( ) Porque este exame não evita doença ( ) Não sabe dizer B. Se a resposta for NECESSÁRIA, qual a principal razão para considerá-la necessária? ( ) Para prevenir doença sexualmente transmissíveis ( ( ) Para prevenir câncer de colo do útero ( ) Para prevenir câncer em geral ) Não sabe dizer 17. Já fez o exame citológico de Papanicolaou alguma vez na sua vida? ( ) Sim ( ) Não A. Se a reposta for NÃO, qual a principal razão para deixar de fazê-lo ? ( ) Não sente nada ( ) Sente vergonha ( ) Tem medo de sentir dor ( ) Falta de tempo ( ) Não consegue marcar ( ) O posto de saúde fica distante ( ) Não pode faltar ao trabalho ( ) Não tem com quem deixar as crianças ( ) O médico não solicita B. Se a resposta for SIM, há quanto tempo você realizou esse exame pela última vez? ( ) Até 1 ano ( ) 2 anos ( ) 3 anos ( ) 4 anos ( ) Mais de 4 anos 18. Você já ouviu falar alguma vez, sobre o vírus do papiloma humano (HPV)? ( ) Não ( ) Sim. Se a resposta for SIM, o que você acha que ele pode causar? _________________ ( ) Não sabe dizer. 19. Na sua opinião qual a principal forma de se adquirir infecção do trato genital pelo HPV? ( ) Contato casual ( ) Por meio de roupas íntimas ( ) Em acentos de banheiros ( ) Não sabe dizer ( ) Pelo contato sexual 20. Qual é a sua opinião ou como você considera a prevenção da infecção genital pelo HPV? ( A. ) Desnecessária ( ) Necessária ( ) Não sabe responder Se a resposta for DESNECESSÁRIA, qual a principal razão para considerá-la desnecessária? ( ) Acha que não corre risco de se infectar por esse vírus ( ) Não sabe dizer ( ) A infecção por HPV é rara na população local ( ) A infecção por HPV cura espontaneamente B. Se a resposta for NECESSÁRIA, qual a principal razão para considerá-la necessária? ( ) A infecção por HPV sempre causa lesões ( ) A infecção por HPV não cura se não for tratada ( ) A infecção por HPV pode tornar-se latente por tempo indeterminado ( ) A infecção por HPV pode causar lesões cervicais que podem evoluir ao câncer de colo do útero 21. Qual das alternativas abaixo você acha que representa a forma mais adequada da mulher se prevenir da infecção genital pelo HPV? ( ) Não é preciso se preocupar com isso ( ) Realizar o exame citológico periodicamente ( ) Usar preservativo nas relações sexuais ( ) Evitar relações sexuais com múltiplos parceiros ( ) Consultar o ginecologista periodicamente ( ) Fazer higiene após as relações sexuais 22. Que grau de preocupação você tem em relação à possibilidade de vir a ter câncer de colo do útero : ( ) Nenhuma ( ) Pequena ( ) Média ( ) Grande ( ) Não sabe dizer 23. Na sua opinião, que chance você acha que tem de vir a desenvolver um câncer de colo do útero , se não realizar o exame preventivo periodicamente: ( ) Nenhuma ( ) Pequena ( ) Média ( ) Grande ( ) Não sabe dizer 72 10.4.2. Termo de Consentimento Livre e Esclarecido UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS DEPARTAMENTO DE MICROB IOLOGIA E PARASITOLOGIA Responsável pela pesquisa: Prof. Dr. José Veríssimo Fernandes Telefones: 3211 - 9210 ou 3215 - 34 37, Ramal 205, E-mail: [email protected] TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDOO Esclarecimentos Este é um convite para você participar da pesquisa: “Estudo de Prevalência da Infecção pelo Vírus do papiloma humano (HPV), Vírus Herpes Simples e Chlamydia trachomatis em mulheres de Natal” que é coordenada pelo Professor Dr. José Veríssimo Fernandes. Sua participação é voluntária, o que significa que você poderá desistir a qualquer momento, retirando seu consentimento, sem que isso lhe traga nenhum prejuízo ou penalidade. Como essa pesquisa pode envolver a participação de sujeitos menores de idade, neste caso, esse termo do consentimento deverá ser assinado pelo tutor ou responsável pela adolescente. Objetivo: Essa pesquisa procura avaliar o conhecimento atitude e prática do exame de Papanicolaou e do Papilomavírus, além de analisar a frequência com que as infecções por Papilomavírus, Herpes Simples e Chlamydia. trachomatis ocorrem na população feminina local; identificar os tipos do vírus existentes na comunidade e comparar a distribuição dos tipos de vírus detectados com as de outras regiões do país; identificar possíveis fatores que favorecem a infecção por esses agentes e sugerir medidas de prevenção. Justificativa: Os Papilomavírus humanos são agentes sexualmente transmissíveis muito comuns em mulheres do mundo inteiro e alguns deles são responsáveis por lesões do colo do útero que podem evoluir para câncer. A atividade sexual e variabilidade de parceiros, se constituem fatores de alto risco para a infecção por esse vírus e outros agentes sexualmente transmissíveis, entre eles, Chlamydia trachomatis e Herpes simples. Alguns tipos do Papilomavírus estão diretamente relacionados com o câncer de colo do útero que representa a segunda causa de morte por câncer em mulheres do mundo inteiro, esp ecialmente nas regiões menos desenvolvidas, devido a falhas dos programas de prevenção para o diagnóstico precoce e tratamento, ainda na fase inicial. A ocorrência da infecção por esses vírus e do câncer de colo uterino, dependem de fatores próprios de cada indivíduo, fatores ambientais, além de hábitos, costumes e atitudes comportamentais da população. Assim, é importante o conhecimento do índice de cobertura do exame citológico, da prevalência dos vírus nas comunidades, bem como dos tipos de vírus mais frequente e dos fatores que favorecem a infecção. Tais informações são essenciais para a definição de políticas públicas voltadas para a prevenção do câncer de colo do útero. Procedimento a ser realizado: Caso decida aceitar o convite, você passará por um exame colposcópico para verificar se existe alguma lesão e será submetida a um raspado da superfície externa do colo do útero por meio de espátula ou escova ginecológica, para obtenção do material para exame. Nesta coleta não será realizado nenhum procedimento diferente daquele que você já teria de se submeter, para fazer o exame preventivo de rotina, apenas será coletada uma amostra a mais. A coleta será feita pelo ginecologista responsável pelo serviço e não acarretará nenhum desconforto e não existe método alternativo para obtenção do material para este exame. Será necessária a obtenção de informações sobre seus hábitos, costumes e atitudes comportamentais. Para isso você terá que responder a uma entrevista feita por meio de um questionário. Os questionários com as informações prestadas serão guardados em lugar seguro, sob a responsabilidade do coordenador da pesquisa com total garantia de sigilo. Não serão utilizados em nenhum momento, nomes, ou qualquer tipo de informação que possa identificar as participa ntes da pesquisa. 73 Riscos: Os possíveis riscos de sua participação são mínimos, tendo em vista que o procedimento a ser realizado é um ato rotineiro utilizado para obtenção de material destinado à realização do exame de prevenção ao câncer de colo do útero, ao qual toda mulher deve submeter-se pelo menos uma vez por ano. Minimização dos riscos: As informações obtidas serão sigilosas e seu nome não será identificado em nenhum momento da pesquisa. Os dados serão guardados em local seguro e a divulgação dos re sultados será feita de forma que não haja possibilidade de identificação das participantes. Benefícios: Os benefícios da pesquisa serão individuais e coletivos, tendo em vista que cada paciente será analisada individualmente, porém os resultados obtidos permitirão a geração de conhecimentos que poderão ser importantes para a melhor compreensão de uma doença que se constitui um grave problema de saúde pública que afeta a toda a comunidade. Participação voluntária: A adesão é voluntária e sem ônus ou qualquer tipo de pagamento pela participação. Como pode envolver a participação de sujeitos menores de idade, esse termo de consentimento deverá ser, neste caso, assinado pelo tutor ou responsável pela adolescente. Será assegurado o direito às participantes de se recusar a responder perguntas que julguem trazer constrangimento ou prejuízos à sua imagem e direitos individuais. Será também assegurado às participantes da pesquisa, o direito de desistir dela, no momento que assim desejar, bastando solicitar ao responsável que destrua suas amostras e os resultados obtidos de suas análises, bem como as informações pessoais obtidas por meio do questionário. Por outro lado, a voluntária poderá solicitar os resultados de seus exames em qualquer momento, desde que estes já es tejam disponíveis. Remuneração, Ressarcimento e Indenização: A participação nesta pesquisa será espontânea e voluntária, portanto, não está previsto nenhum tipo de pagamento as participantes. No entanto, poderá ser feito ressarcimento, no caso de haver des pesas decorrentes da participação referentes a passagens e alimentação. Contudo, as participantes do estudo, terão direito à indenização por eventuais danos físicos ou morais, que sejam comprovadamente decorrentes da pesquisa. Obs: Você ficará com uma cópia deste Termo e toda a dúvida que você tiver a respeito desta pesquisa, poderá perguntar diretamente para o professor José Veríssimo Fernandes, coordenador da pesquisa, no endereço: Departamento de Microbiologia e Parasitologia, Centro de Biociências. Camp us Universitário – Lagoa Nova, Natal, RN, CEP: 59.072 – 970, ou pelo telefone: 3215 - 3437, Ramal - 205, Fax 3211-9210, ou pelo E-mail [email protected] . Dúvidas a respeito da ética dessa pesquisa poderão ser questionadas ao Comitê de Ética em Pesquisa da UFRN no endereço: Praça do Campus Universitário, Lagoa Nova. Caixa Postal 1666, CEP 59072-970, Natal/RN Telefone/Fax (84)215-3135. Consentimento Livre e Esclarecido: Declaro que compreendi os objetivos desta pesquisa, como ela será realizada, os riscos e benefícios envolvidos e concordo em participar voluntariamente da pesquisa intitulada, “Estudo de Prevalência da Infecção pelo Vírus do papiloma humano (HPV), Vírus Herpes Simples e Chlamydia trachomatis em mulheres de Natal” Nome: _________________________________________________________________ ------------------------------------------------------------------------------Assinatura da PARTICIPANTE ____________________________________________________________ Assinatura do tutor ou responsável (no caso das menores de idade) Natal, ______/_______/________ _________________________________________ Assinatura do Pesquisador Polegar direito 74 10.4.3. Parecer do Comitê de Ética 75
