desenvolvimento do

DESENVOLVIMENTO DO
EMBRIÃO DE GALINHA
Guia do Professor
Guia do Professor
Desenvolvimento
do embrião de galinha
Nesta atividade os alunos observam diferentes estádios do desenvolvimento embrionário de
vertebrados, recorrendo à galinha como organismo modelo.
NÍVEL ESCOLAR
Secundário (11º e 12º ano)
2
ÁREA CIENTÍFICA
Biologia do Desenvolvimento
Embriologia
PALAVRAS-CHAVE
Desenvolvimento
Embrião
Galinha
Morfogénese
Guia do Professor
Desenvolvimento
do embrião de galinha
OBJETIVOS DA ATIVIDADE
• Solidificar conceitos de desenvolvimento embrionário transmitidos
nas aulas (crescimento, morfogénese, diferenciação celular), através da
observação experimental de um modelo biológico.
• Integrar os alunos em contexto de laboratório, e desenvolver técnicas
experimentais.
• Desenvolver capacidades de observação, de registo, interpretação e
comunicação de resultados.
MATERIAL NECESSÁRIO
• Ovos de galinha fertilizados
• Suporte para ovos (p.ex., caixa em que são vendidos nos supermercados, ou
suporte de frigorífico)
• Pinça de ponta fina (1/grupo)
• Pinça de ponta grossa (1/grupo)
• Fita-cola
• Tesoura de pontas aguçadas (1/grupo)
• Caixa de petri (1/grupo)
• PBS (tampão fosfato, em inglês Phosphate Buffered Saline, à temperatura
ambiente)
• Seringa com agulha (opcional)
• Tinta-da-china (opcional)
• Saco para recolha do lixo
• Frigorífico (15 ºC)
• Incubadora ou estufa (35-40,5 ºC, humidade relativa)
• Lupas de disseção
DURAÇÃO PREVISTA*
Introdução da atividade aos alunos:
20 - 30 minutos
Explorar
30 - 40 minutos
Discussão dos Resultados e Conclusões:
20 - 30minutos
Tempo total necessário:
70 - 100 minutos
*Não inclui preparação prévia de material
Algumas escolas não dispõem do material
ao lado referido. Nesse caso, encorajamos à
improvisação desde que se mantenham as
condições ótimas de armazenamento, incubação
e manuseamento.
3
Guia do Professor
Desenvolvimento
do embrião de galinha
Questionar
4
Guia do Professor
Desenvolvimento
do embrião de galinha
"Será que existe alguma semelhança entre nós e os outros
vertebrados na forma como nos desenvolvemos?
Esta poderá ser a pergunta com a qual começará a envolver e a captar a atenção dos seus alunos para a temática
a explorar. Registe as respostas e detete eventuais erros de conceito. Conhecer o nível de conhecimentos
prévios na turma poderá guiá-lo na mediação das atividades experimentais e na adaptação das estratégias de
integração de novos conceitos durante o processo de aprendizagem.
A seguir, introduza ou relembre conceitos gerais sobre o desenvolvimento em humanos, explorando em maior
profundidade as fases mais precoces do desenvolvimento correspondentes ao embrião. Mostre ainda exemplos
de outros vertebrados adultos, focando o caso da galinha doméstica.
Oriente a discussão de forma a que surjam as seguintes questões-problema:
Por quantas fases de
desenvolvimento o
embrião da galinha
passa até nascer? O que
caracteriza cada uma
dessas fases?
Sugerimos que, anteriormente ao início das experiências, os alunos divididos em
grupos elaborem uma tabela
ou outra solução na qual possam registar textualmente ou
com imagens ou desenhos
as diferentes fases do desenvolvimento embrionário do
humano.
Será que o embrião da
galinha e o embrião humano
apresentam alguma
semelhança entre si ao longo
do seu desenvolvimento?
Seria este o mote para o início das experiências, sendo a nossa proposta estudar e conhecer as principais fases do desenvolvimento
da galinha onde são visíveis maiores diferenças, primeiro, e verificar se existem fases semelhantes anatómica e fisiologicamente no
desenvolvimento humano, depois.
Registe as respostas. Estas poderão ajudá-lo a, juntamente com os alunos, elaborar hipóteses passíveis de
serem testadas com a atividade aqui proposta.
5
Guia do Professor
Desenvolvimento
do embrião de galinha
Explorar
6
Guia do Professor
Desenvolvimento
do embrião de galinha
1. Antes de começar a experiência, contacte a quinta ou o aviário mais próximos da sua escola e encomende ovos
de galinha fertilizados. Para saber a quantidade de ovos a comprar, deverá prever:
a) o número de alunos para o qual a atividade será preparada;
b) a possibilidade de aborto dos embriões;
c) o número de estádios de desenvolvimento a observar.
Devido às condições climatéricas e/ou de transporte, quanto mais ovos encomendar, menor é o risco de perda da amostra experimental!
2. Uma vez entregues na sua escola, deve guardar os ovos no frigorífico a 15°C, durante todo o tempo até serem
incubados.
Quanto maior for o tempo de armazenamento, menor é a probabilidade dos embriões se desenvolverem normalmente. Por isso, os ovos não devem
ser comprados muito tempo antes da primeira incubação prevista - recomendamos que sejam adquiridos na semana antes da observação.
As leis de experimentação em vertebrados são
muito restritas quanto à utilização de embriões em estádios superiores ao último
terço da gestação normal
(i.e. depois dos 14 dias de incubação). Por isso, esta atividade foi planeada apenas
para estádios na primeira
semana do embrião.
Incubação & Observação
3. Retire os ovos do frigorífico e deixe-os à temperatura ambiente durante o tempo necessário para que a
temperatura corporal normalize.
4. Prepare uma solução de 1L de PBS, usando 800 mL de água destilada à qual deverá adicionar a seguinte
concentração de sais (tabela 1):
Tabela 1
Sal (fórmula química)
Sal (Nome)
Concentração (mmol/L)
Concentração (g/L)
NaCl
Cloreto de Sódio
137,00
8,00
KCl
Cloreto de Potássio
2,70
0,20
Na2HPO4
Fosfato de Sódio
10,00
1,44
KH2PO4
Fostato de Potássio
1,76
0,24
Não esquecer de identificar sempre os ovos com
a data da incubação e o estádio a observar. Usar uma
caneta de feltro e marcar na
própria casca do ovo.
PBS, do inglês Phosphate Buffered Saline, é
uma solução salina comummente usada na investigação biológica por
ser uma solução isotónica
e não-tóxica para as células, daí dizer-se que é uma
solução tampão.
Não se esqueça de acertar o pH = 7,4
7
Guia do Professor
Desenvolvimento
do embrião de galinha
5. Divida a turma em vários grupos. Cada grupo deverá replicar os seguintes passos da experiência:
a. Incubar um conjunto de ovos, previamente identificado, numa incubadora a 37,5°C. Os ovos devem ser colocados de pé num suporte
apropriado, com o pólo mais rombo virado para cima. Desta forma, o embrião desenvolver-se-á à superfície da gema, permitindo
facilmente manipulá-lo, pois estará imediatamente por debaixo da superfície da casca que estiver virada para cima.
Para que a taxa de desenvolvimento do embrião seja normal, isto é, nem demasiado lenta nem demasiado rápida, a temperatura da incubadora deve manter-se entre os 35ºC e os
40,5ºC. É também importante manter os ovos numa atmosfera húmida (55% de humidade relativa), de forma a evitar a sua desidratação. Para tal, deve certificar-se de que a incubadora
(ou outro equipamento improvisado) inclui um recipiente com água.
Nesta atividade, propomos que os alunos observem o embrião de galinha durante a primeira semana do seu desenvolvimento, período durante o qual sofre maior
número de transformações num curto espaço de tempo. Assim, aconselhamos a observação dos seguintes estádios:
I) estádio 10, que corresponde a um tempo de incubação de 33 horas;
II) estádio 20, que corresponde a um tempo de incubação de 72 horas-3,5 dias.
b. Retirar os ovos da incubadora às 33 horas de incubação e às 72 horas-3,5 dias de incubação e, em ambos os casos, colocá-los num
suporte apropriado para ovos.
c. Para cada uma das situações, fazer um pequeno furo no centro do pólo mais rombo, com a ajuda de uma pinça de pontas finas;
a seguir, partindo do furo e com a ajuda de uma pinça de pontas grossas, abrir cuidadosamente a casca e fazer uma "janela" com o
tamanho suficiente até se conseguir ver o embrião.
Definir o tamanho da janela guiando-se pelo tamanho da bolsa de ar que se forma entre a casca e a membrana externa do ovo (Figura 1). É importante ter cuidado para não romper
a membrana pois é ela que segura o embrião.
d. Usando a pinça de pontas finas, retirar a membrana esbranquiçada que está junto à membrana externa do saco amniótico.
e. Sem retirar o embrião de dentro do ovo, visualizar diretamente sob a luz de uma lupa de dissecção.
8
Guia do Professor
Desenvolvimento
do embrião de galinha
Para embriões com 33 horas de incubação, se se adicionar tinta da china possibilita-se um contraste melhor que permite visualizar com melhor nitidez a forma do embrião. Podem
fazê-lo, com a ajuda de uma agulha: injetar, com bastante cuidado, na região imediatamente abaixo do corpo do embrião, um pouco de tinta-da-china, previamente diluída de 1:5 em
PBS.
Embora não sejam tão bem observáveis certas funções fisiológicas (como os batimentos cardíacos), é possível estudar o embrião fora do ovo. Neste caso, corta-se a membrana à
volta do embrião assim como os vasos sanguíneos que o ligam ao ovo, segurando sempre o embrião com uma das pinças; depois, com a ajuda de uma colher, coloca-se o embrião
numa placa de Petri contendo PBS (tabela 1).
6. Cada grupo de alunos regista textualmente ou com imagens ou desenhos o que observou à lupa para cada um dos dois estádios de
desenvolvimento do embrião.
7. Distribua a cada grupo um conjunto das ilustrações do embrIão de galinha fornecidas em anexo (correspondem a apenas alguns dos
estádios). A partir dos desenhos, do que observaram à lupa e, possivelmente, com a ajuda de alguma pesquisa bibliográfica (já que esta
atividade está adaptada para apenas dois estádios), os alunos poderão tentar recriar o desenvolvimento cronológico do embrião da
galinha.
Figura 1: Interior do ovo da galinha
1 e 15 - Casca
2 - Membrana externa
3 - Membrana interna
4 e 13 - Calaza: 'cordas' de albumina, que prendem a gema às membranas do ovo.
5, 6 e 12 - Clara ou Albumina: fonte de água e alimento para o embrião.
7 - Membrana vitelina
8 - Núcleo Germinativo
9 - Disco Germinativo/ Blastoderme: o embrião propriamente dito.
10 - Gema amarela: contém proteínas, gorduras, vitaminas e minerais, essenciais ao
desenvolvimento do embrião.
11 - Gema branca
14 - Bolsa de ar
9
Guia do Professor
Desenvolvimento
do embrião de galinha
Descobrir
10
Guia do Professor
Desenvolvimento
do embrião de galinha
1. Cada grupo de alunos descreve à turma toda a representação textual ou imagética das duas fases de desenvolvimento observadas
assim como a sua proposta de posicionamento cronológico das diferentes fases usando as ilustrações fornecidas (em anexo).
2. Compare os resultados e, se necessário, corrija o posicionamento dos desenhos (ver solução correta em anexo). Complete as respostas
dos alunos com informação específica relativa a cada estádio e com imagens reais obtidas em laboratório (consultar anexo). Prossiga a
discussão com os alunos e possibilite a comparação dos resultados obtidos com o desenvolvimento embrionário humano. Complemente
a discussão com imagens de embriões de outros vertebrados (Consultar a bibliografia).
3. Oriente a discussão explicando, a partir das observações dos alunos, as conclusões finais:
O embrião de galinha passa por
várias fases de desenvolvimento
que são classificadas em função de
determinadas marcas morfológicas
que vão surgindo ou se alterando
desde o início da incubação até ao
nascimento do pinto.
Durante as fases mais precoces do
desenvolvimento, o embrião de pinto
e o embrião humano apresentam
várias semelhanças morfológicas.
O mesmo acontece com outros
vertebrados.
4. Termine a aula, abordando a Biologia do Desenvolvimento como disciplina que estuda os mecanismos subjacentes à transformação
do ovo fertilizado num organismo adulto e refira alguns modelos animais usados pela investigação científica nesta área e porquê,
focando o caso da galinha doméstica (consultar informação em anexo).
11
Guia do Professor
Desenvolvimento
do embrião de galinha
Anexos
12
Guia do Professor
Desenvolvimento
do embrião de galinha
- PREPARE-SE PARA AS PERGUNTAS DOS ALUNOS! Aqui disponibilizamos os conceitos teóricos e científicos mais importantes para que possa realizar autonomamente as atividades propostas. No entanto, não exclui a consulta de
bibliografia adicional.
I. Biologia do Desenvolvimento
A Biologia do Desenvolvimento é uma disciplina que estuda os mecanismos celulares e moleculares subjacentes à transformação
do ovo fertilizado (uma única célula) num organismo adulto (constituído, no caso do Homem por 10 biliões de células, de 200 tipos
diferentes).
São vários os animais modelo utilizados em Biologia do Desenvolvimento: a mosca da fruta (Drosophila melanogaster), o verme
(Caenarhabditis elegans), o sapo africano (Xenopus Laevis), o peixe-zebra (Danio rerio), a galinha doméstica (Gallus domesticus), o
ratinho (Mus musculus). Cada modelo tem as suas vantagens. Alguns, como o ratinho e a mosca da fruta, são poderosos modelos
genéticos, pois permitem manipulações na linha germinal transmissíveis de geração em geração. Outros, como o verme C. elegans e o
peixe-zebra, pela transparência do embrião, permitem acompanhar o nascimento de novas células e as suas migrações no embrião, ao
vivo. Já muitos dos mecanismos celulares e moleculares (i.e. genes) envolvidos nas primeiras fases do desenvolvimento embrionário (do
ovo à mórula, e ao blastocisto), foram desvendados nos embriões gigantes do sapo Africano.
Descrevemos aqui apenas algumas utilizações de cada animal modelo em Biologia do Desenvolvimento, não sendo esta listagem de todo exaustiva: hoje são possíveis manipulações
genéticas em peixe-zebra e existem vários métodos de regular (aumentar ou diminuir) a expressão de genes em galinha, apesar destas alterações genéticas não serem ainda transmissíveis
de geração em geração. Na verdade, as potencialidades dos modelos sobrepõem-se, de modo que, em laboratórios de Biologia do Desenvolvimento, recorre-se muitas vezes a dois ou
mais modelos complementares (por exemplo: galinha e ratinho, ou mosca da fruta e peixe-zebra).
A espécie de galinha mais conhecida do ser humano, Gallus domesticus, tem sido frequentemente utilizada em estudos de embriologia
de vertebrados, por várias razões:
1. Como as galinhas se reproduzem ao longo do ano, facilmente se obtêm ovos fertilizados em qualquer altura, sendo apenas necessário
uma deslocação ao aviário mais próximo.
2. Os embriões de galinha, por se desenvolverem fora do corpo da progenitora, são muito acessíveis (em comparação com mamíferos,
por exemplo, que se desenvolvem no útero da progenitora).
13
Guia do Professor
Desenvolvimento
do embrião de galinha
3. A forma pela qual é possível obter embriões vivos de galinha em diferentes estádios de desenvolvimento é
muito simples: consiste em armazenar os ovos fertilizados a 37,5-38 ºC, durante diferentes intervalos de tempo.
Este processo, ao qual chamamos de incubação artificial, permite simular as condições de desenvolvimento
do embrião de galinha na Natureza, desde a fertilização até ao nascimento do pinto - com a duração total de
21 dias.
De facto, o embrião de pinto tem muitas vantagens, principalmente em relação aos embriões de outros
amniotas como o ratinho:
- no início do desenvolvimento embrionário, o embrião de pinto é plano, ao contrário do de ratinho, que se
enrola sobre si próprio;
- o embrião de pinto é facilmente acessível dentro do ovo - basta fazer uma abertura na casca e o embrião
fica logo visível e acessível para cirurgias e manipulações; o embrião de ratinho, pelo contrário, desenvolve-se
dentro do saco uterino da mãe;
- é possível crescer, em cultura, tecido dissecado do embrião de pinto, para a realização de estudos in vitro
(estudar se duas populações diferentes de células se misturam ou não, por exemplo).
II. Descobertas científicas em Biologia do Desenvolvimento
A investigação que tem sido desenvolvida, utilizando a galinha como modelo animal, tem contribuído
marcadamente para o conhecimento sobre o desenvolvimento dos vertebrados, incluindo mamíferos como
o Homem. Alguns processos que ocorrem durante o desenvolvimento embrionário, elucidados recorrendo ao
embrião de pinto são (Wolpert, 2004):
- a distribuição assimétrica esquerda-direita dos órgãos do corpo;
- a origem e desenvolvimento do sistema nervoso central e periférico;
- a origem e formação do esqueleto do crânio;
- os processos pelos quais são especificados e formados os músculos intercostais, dos membros e das costas;
- a cartilagem entre as vértebras e entre as costelas e a parte superficial (a derme) da pele;
- o desenvolvimento dos membros.
14
Desde os anos 90 que
se realizam manipulações
in utero de embriões de
ratinho, e desde os anos 70
que se cultivam embriões de
ratinho in vitro, durante as
primeiras fases do desenvolvimento embrionário. Estes
estudos
têm
permitido elucidar os processos
celulares e moleculares que
ocorrem durante as fases de
gastrulação e fases iniciais da
organogénese em ratinho.
Guia do Professor
Desenvolvimento
do embrião de galinha
Em alguns casos, entender como se desenvolve o embrião de galinha, tem contribuído para uma melhor
compreensão de malformações em humanos, abrindo caminho ao desenvolvimento de terapias que as evitem.
Assimetria esquerda-direita no embrião
A aparência exterior de qualquer vertebrado é simétrica (com ligeiríssimas variações entre o lado esquerdo e
direito de um indivíduo). No entanto, no interior, a distribuição é assimétrica: do lado esquerdo encontra-se
o estômago, o pâncreas, o baço e grande parte do coração; do lado direito está grande parte do fígado e a
vesícula biliar. Ademais, o pulmão esquerdo tem menos lóbulos que o direito, e o intestino enrola-se em sentido
contrário ao dos ponteiros do relógio.
Dentro de cada espécie, esta distribuição assimétrica é mantida entre indivíduos, de tal forma que desvios na
distribuição (quer parcial quer de inversão total da posição dos órgãos) resultam em doenças e malformações
graves. Compreender de que forma é estabelecida esta assimetria esquerda-direita durante o desenvolvimento
embrionário é uma das questões base da biologia do desenvolvimento.
Foi no embrião de galinha, em 1995, que se identificaram os primeiros genes que controlam a assimetria
esquerda-direita (Levin, et al., 1996). Cientistas do grupo de Clifford Tabin (na Universidade de Harvard, EUA),
mostraram que no embrião de estádio HH5 (com 19 a 22 horas de incubação), há uma distribuição assimétrica
da expressão (atividade) de vários genes em torno do nó de Hensen, em relação ao eixo de simetria anteriorposterior: os genes sonic hedghog (Shh), Nodal e Pitx2 são expressos do lado esquerdo; FGF8 (Fibroblast Growth
factor 8) e SNR (snail-related) do lado direito. A expressão assimétrica do gene Nodal é comum a todos os
vertebrados estudados até ao momento (ratinho, peixe-zebra, coelho, sapos), como se mostrou em estudos
posteriores.
A distribuição assimétrica do gene Nodal estende-se depois a toda a parte esquerda do embrião (concretamente
à placa lateral da mesoderme), despoletando cascatas de genes “de direita” e genes “de esquerda”, que
transferem a informação esquerda-direita aos primórdios dos órgãos, assegurando que estes se desenvolvam
apropriadamente: quer o tipo de órgão, quer a orientação do órgão (Raya e Belmonte, 2006).
Desde a década de 90 que os estudos sobre os mecanismos que coordenam a assimetria esquerda-direita se
têm multiplicado e os conhecimentos têm acumulado de forma espantosa. No entanto, falta ainda conhecer
muito sobre este fenómeno biológico tão fundamental, nomeadamente qual o primeiro passo que quebra a
simetria do embrião, antes do estabelecimento da distribuição assimétrica dos genes Shh e Nodal (isto é, que
está a montante). Será um mecanismo comum a todos os vertebrados, com pequenas variações entre as
Nó de Hensen - estrutura
embrionária transiente, localizada na extremidade anterior da
linha primitiva em embriões
de amniotas (aves, répteis e
mamíferos). O nó funciona
como um centro organizador
do embrião, regulando o estabelecimento dos eixos de simetria
do embrião: antero-posterior (A-P), dorso-ventral (D-V) e
esquerda-direito (E-D).
Placa lateral da mesoderme - zona mais lateral da
mesoderme no embrião em
estádio de neurulação (formação do tubo neural, precursor do sistema nervoso central).
Dá origem a várias estruturas,
incluindo o coração, os vasos
sanguíneos e células do sangue,
o revestimento das cavidades
internas do corpo e componentes dos membros excluindo
os músculos.
15
Guia do Professor
Desenvolvimento
do embrião de galinha
espécies, ou terá cada espécie adotado um mecanismo diferente, ‘desembocando’ todos na expressão
assimétrica de Shh e Nodal? (Raya e Belmonte, 2006; Ibañes e Belmonte, 2009).
Desenvolvimento do sistema nervoso central
O sistema nervoso central (SNC) de vertebrados é constituído pela espinal medula, o cérebro, o nervo ótico e a
retina. Desenvolve-se a partir do tubo neural - um epitélio derivado da ectoderme, constituído inicialmente por
uma camada pseudo-estratificada de células com elevada capacidade proliferativa - são as células progenitoras
dos neurónios e das células da glia do sistema nervoso central adulto. A formação de um SNC adulto, funcional,
envolve uma série de etapas (que ocorrem sequencialmente, com alguma sobreposição):
Ectoderme - uma das três
folhas germinativas do embrião.
No embrião forma a camada mais exterior. Dá origem à
epiderme e aos nervos no adulto. As outras folhas germinativas
são a endoderme e a mesoderme.
1. Proliferação das células progenitoras;
2. Migração das células progenitoras para regiões específicas do SNC;
3. Diferenciação (maturação) das células progenitoras.
Estudos realizados no embrião de galinha têm elucidado os mecanismos celulares e moleculares subjacentes
a cada uma daquelas etapas.
Durante o desenvolvimento embrionário, na espinal medula estabelece-se uma distribuição bem definida de
subtipos de neurónios, ao longo do eixo antero-posterior e do eixo dorso-ventral. Este ‘mapa’ de neurónios
reflete-se depois, e serve de base, à rede de projeções neuronais (nervos) que entram e/ou saem da espinal
medula, enervando músculos e outros órgãos do corpo (Ulloa e Briscoe, 2007).
Hoje sabe-se que a distribuição dos subtipos de neurónios ao longo do eixo dorso-ventral é estabelecido por
ação de dois gradientes opostos de substâncias difusíveis: a proteína SHH (sonic hedgehog) libertado pela
placa ventral do tubo neural induz a formação de neurónios ventrais (maioritariamente neurónios motores
somáticos, que enervam músculos esqueléticos); as proteínas WNT e BMP, libertadas pela placa dorsal do tubo
neural, induzem populações dorsais (maioritariamente neurónios sensoriais). A identificação destes gradientes
foi feita, em grande parte, no embrião de galinha, em estudos realizados nos anos 90 (Price e Briscoe, 2004;
Ulloa e Briscoe, 2007).
16
Placa ventral do tubo
neural - zona mais ventral
do tubo neural. Tem propriedades sinalizadoras: é fonte
de sonic hedgehog (SHH),
uma das principais proteínas
sinalizadoras no embrião. .
Placa dorsal do tubo
neural - zona mais dorsal
do tubo neural. Tal como a
placa ventral do tubo neural,
também tem capacidades
sinalizadoras.
Guia do Professor
Desenvolvimento
do embrião de galinha
Formação dos membros (anteriores e posteriores)
Praticamente tudo o que hoje se sabe sobre o desenvolvimento dos membros provém de estudos feitos no
embrião de galinha. Os primeiros sinais visíveis do desenvolvimento de membros são pequenas protuberâncias
que surgem ao longo do eixo principal do corpo, no estádio 17 de desenvolvimento (52 - 64 horas de incubação)
em posições correspondentes às futuras asas e patas (no caso da galinha). Estas protuberâncias, de origem
mesodérmica , formam botões que se vão alongando, afastando-se do corpo. Na base dos botões começam-se a
formar o esqueleto do membro, de forma sequencial: primeiro os ossos mais próximos do corpo como o húmero
ou o fémur, e por fim os dígitos, nas extremidades.
Também nos membros ocorrem as etapas de proliferação, migração (reduzida) e diferenciação celular. Estas
etapas são coordenadas por sinais intrínsecos e extrínsecos às células, muitos destes provenientes de zonas
sinalizadoras, que conferem informação posicional às células ao longo de três eixos: antero-posterior (do polegar
ao dedo mindinho, numa mão humana), próximo-distal (do ombro à ponta dos dedos) e dorso-ventral (das
costas à palma da mão). Tudo isto foi identificado no embrião da galinha, e depois estendido ao desenvolvimento
embrionário de mamíferos.
O membro embrionário foi um dos sistemas modelo em que foi descoberto o processo de morte celular
programada (apoptose). A apoptose ocorre em várias fases do desenvolvimento do membro, sendo mais
espetacular (por ser em grande escala) na eliminação das membranas interdigitais no embrião de galinha. No
embrião de pato, a apoptose interdigital não ocorre, como seria de esperar.
Mesoderme - uma das
três
folhas
germinativas
do embrião. No embrião, a
mesoderme localiza-se entre
a endoderme e a ectoderme.
Dá origem ao sangue, osso,
coração, rim, gónadas e tecido conectivo.
Faça este pequeno
exercício com os seus alunos.
Observação: Os patos têm
membranas interdigitais. As
galinhas (e os humanos) não
têm. Porque será?
Os alunos respondem colocando uma hipótese testável.
Desenvolvimento das vértebras, dos músculos e da pele
No embrião de galinha no estádio 7, surgem dois blocos de tecido, um de cada lado do tubo neural - são os
primeiros sómitos. À medida que o desenvolvimento progride, surge, em cada 1,5hrs, um novo par de sómitos,
até se formarem 50 pares de sómitos, estendendo-se ao longo do eixo antero-posterior do corpo do embrião
(não existem sómitos ao longo da cabeça do embrião). Os sómitos são blocos de tecido de origem mesodérmica,
e dão origem à cartilagem das vértebras e costelas, à derme da pele, aos músculos intercostais, dos membros e
das costas.
17
Guia do Professor
Desenvolvimento
do embrião de galinha
Todo o processo pelo qual um bloco de tecido homogéneo, o sómito recém-formado, se diferencia de modo
a produzir populações de células com funções diferentes foi elucidado em estudos realizados no embrião de
galinha. Através de experiências de transplantação galinha-codorniz, identificaram-se regiões especializadas
dentro do sómito maduro, em que se diferenciam determinadas populações de células que depois adotam o
seu fenótipo final e/ou migram para os seus destinos finais. Foi também graças a estudos no embrião de galinha
que se identificaram os genes envolvidos na regionalização dos sómitos: Shh (sonic hedgehog), produzido
pelo placa ventral do tubo neural e pela notocorda, atua sobre a parte ventral do sómito; Wnt e BMP (Bone
Morphogenetic Protein), expressos na zona dorsal do tubo neural, especificam as populações dorsais do sómito
(Gilbert, 2000).
As múltiplas funções dos
genes Shh, Wnt e BMP durante
o desenvolvimento embrionário: no sistema nervoso,
nos membros, nos sómitos…
são, de facto, atores centrais
no desenvolvimento embrionário de vertebrados e invertebrados, tendo sido sucessivamente recrutados, ao longo
da evolução, para inúmeros
processos de sinalização.
Bibliografia:
- Wolpert, L. (2004) Much more from the chicken’s egg than breakfast - a wonderful model system. Mech. Dev. 121: 1015-17
- Raya, A e Izpisúa Belmonte, JC. (2006) Left-right asymmetry in the vertebrate embryo: from early information to higher-level integration. Nature Reviews
Genetics. 7: 283-293.
- Ibañes, M e Izpisúa Belmonte, J C (2009) Left–right axis determination. Wiley Interdisciplinary Reviews: Systems Biology and Medicine. 1: 210–219.
- Price, S e Briscoe, J. (2004) The generation and diversification of spinal motor neurons: signals and responses. Mech. Dev. 121: 1103-115
- Ulloa, F e Briscoe, J. (2007) Morphogens and the control of cell proliferation and patterning in the spinal cord. Cell Cycle 6:2640-2649
- Gilbert, SF (2000) Developmental Biology. Sinauer Associates. (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK10085/)
III. O Ciclo de Vida da Galinha
Desde que a galinha “põe o ovo” até que o pinto nasce, o embrião demora 21 dias a desenvolver-se. Logo após
a fertilização do ovo, as células embrionárias dividem-se, crescem e diferenciam-se em vários tecidos. Tudo
isto ainda dentro do oviducto da galinha-mãe e durante cerca de 20 horas. Quando a galinha “põe o ovo”, o
embrião deixa de se desenvolver permanecendo num estado inativo até que se estabeleçam as condições
favoráveis, características do processo de incubação. A partir daqui, e durante 21 dias, os diferentes tipos de
células embrionárias dão origem às diferentes estruturas do pinto: umas dão origem aos diferentes órgãos
vitais (p.ex., o coração), outras aos membros (isto é, asas e pernas), e outras estruturas do pinto. Ao fim de 3
semanas o pinto está pronto para nascer e, passados 2 meses, é já uma galinha adulta.
18
Consultar a Figura 1 para
rever a organização interna
do ovo da galinha.
Guia do Professor
Desenvolvimento
do embrião de galinha
IV. As Fases do Desenvolvimento Embrionário da Galinha
Dois cientistas, Victor Hamburger e Harold Hamilton, publicaram, em 1951, uma série de imagens de microscopia através da qual
fizeram uma análise morfológica detalhada do embrião de galinha, em diferentes estádios de desenvolvimento. Este estudo tornou-se
uma referência para os investigadores da área e ainda hoje a comunidade científica utiliza a notação por eles elaborada para classificar
e estudar os embriões de galinha.
Segundo Hamburger e Hamilton, as fases de desenvolvimento embrionário classificam-se em função de determinadas marcas
morfológicas que vão surgindo ou se alterando desde o início da incubação até ao nascimento do pinto. Analisemos a sequência de
algumas alterações importantes na morfologia do embrião apenas durante a primeira semana de incubação, período durante o qual o
embrião sofre maior número de transformações num curto espaço de tempo (acompanhar a leitura com a Figura 2, 3 e 4):
•
•
•
•
•
•
Nos estádios mais precoces do embrião, a forma e tamanho da linha primitiva são usados para classificar desde o estádio 1 ao
estádio 6 do embrião.
A partir do estádio 5, começa a formar-se a notocorda ou corda dorsal, as pregas neurais e o tubo neural. Estas estruturas darão
origem, ao longo do desenvolvimento, às várias partes que constituem o sistema nervoso.
A formação de sómitos (blocos de tecido que se formam aos pares, um de cada lado do tubo neural), surge no estádio 7 com o
aparecimento do primeiro par de sómitos. O número de sómitos é comummente usado para identificar os estádios 6 a 14: cada
novo estádio corresponde à adição de 3 novos pares de sómitos. Por exemplo: um embrião no estádio 8 tem 4 pares de sómitos, no
estádio 10 tem 10 pares de sómitos.
No estádio 14, é já visível a flexão do tronco e a formação dos primeiros arcos branquiais (que darão origem às mandíbulas, faringe
e laringe). Nesta altura, são já visíveis os vasos sanguíneos que ligam o embrião ao ovo e que tiveram origem nos ilhéus sanguíneos.
As primeiras evidências da formação dos membros superiores (asas) e membros inferiores (patas) surgem no estádio 16 e, até ao
final do desenvolvimento, são marcas morfológicas muitos importantes.
No estádio 20, o embrião tem 40 pares de sómitos (dificilmente contáveis, pois o tecido do embrião é já demasiado denso e opaco),
os maxilares estão a desenvolver-se e já completou a rotação; regiões específicas do cérebro estão também bastante diferenciadas
e é notório o aparecimento da pigmentação do olho.
19
Guia do Professor
Desenvolvimento
do embrião de galinha
Figura 2: Fases de desenvolvimento embrionário de galinha, segundo Hamburger e Hamilton (0 horas – 3,5 dias de incubação).
© Prof. Judy Cebra Thomas, Swarthmore College
Figura 2.1: Estádios
12-13h
de 3 a 9
18-19h1
Figura 2.2: Estádios de 10 a 17
9-22h
pregas
neurais
33-38h
23-25h
40-45h4
5-49h
48-52h
tubo
neural
pregas
neurais
ventrículo
10
pares de
sómitos
coração
ilhéus
sanguíneos
linha
primitiva
23-26h2
6h
26-29h2
9-33h
50-53h
olho
50-55h
51-56h
52-64h
arcos
branquiais
1 par de
sómitos
3
pares de
sómitos
medula
espinal
vasos
sanguíneos
Figura 2.3: Estádios de 17 a 21
64h
aurícula
72h
3-3,5 dias
3,5 dias
ventrículo
olho
botões dos
membros
20
botão do
membro
Guia do Professor
Desenvolvimento
do embrião de galinha
Figura 3: Morfologia do embrião com 33 horas de incubação (estádio 10)
© imagens retiradas de Embryo Atlas da Lawrence University
Figura 3.1 : vista dorsal
1 - Vesículas ópticas que, como o nome indica,
formarão mais tarde a lente do olho.
2 - Infundibulum que posteriormente se
diferenciará
na
neurohipófise,
glândula
responsável pelo armazenamento de hormonas
importantes na absorção de água nos rins,
contrações uterinas e libertação do leite em
mamíferos.
3 - Mesencéfalo é a região do tubo neural que,
futuramente no cérebro, será responsável pelo
processamento da informação visual e auditiva.
4 - Metencéfalo é a região do tubo neural que
irá formar o cerebelo, o coordenador da posição
e movimento do corpo, e de outras estruturas
responsáveis pelo envio de informação entre o
cérebro e o cerebelo.
5 - Mielencéfalo onde se desenvolvem nervos
motores e sensoriais, ligando o cérebro à espinal
medula, controlando sensações e movimentos.
6 - Sómito ou os vários pares de sómitos que
darão origem a estruturas como as vértebras e as
costelas, os músculos dos membros e costas, e
também à pele.
7 - Espaço entre dois sómitos.
8 - Notocorda ou corda dorsal é uma estrutura
temporária (não existe no adulto), mas crucial
na formação da espinal medula e da coluna
vertebral.
9 - Área pelúcida
Figura 3.2
1 - Proâmnio.
2 - Área vascular.
3 - Ilhéus sanguíneos que irão diferenciar-se nos vasos
sanguíneos que ligam o embrião à cavidade vitelina.
4 - Sómitos.
5 - Espinal medula é a região posterior do tubo neural
que, juntamente com o cérebro, formará o sistema
nervoso.
6 - Placas de segmentação onde se formam os blocos
de sómitos.
7 - Pregas Neurais que se irão fundir ao longo das
costas do embrião, formando o tubo neural. Nesta zona
junto à cauda, o tubo neural transformar-se-à na espinal
medula.
8 - Linha primitiva é uma das primeiras estruturas
que se formam durante as fases mais precoces do
desenvolvimento embrionário tanto de aves, como
répteis e mamíferos.
Figura 3.3
1 - Neuroporo anterior é uma abertura numa das extremidades do
tubo neural e que fecha por volta do estádio 25 (no humano).
2 - Vesículas ópticas.
3 - Diencéfalo é a região do tubo neural que está na origem da
formação das vesículas ópticas, do tálamo (região de integração
sensorial), do hipotálamo (região secretora de hormonas), do
coróide plexus (secretor de fluido no cérebro) e da glândula pineal
(secretora de melatonina).
4 - Infundibulum.
5 - Tecido precursor da pele (Ectoderme).
6 - Tecido precursor da cabeça (Mesênquima).
7 - Notocorda ou corda dorsal.
8 - Intestino anterior que se diferenciará no esófago, estômago,
duodeno, fígado, epitélio da traqueia, vesicular biliar e parte
superior do pâncreas.
9 - Ventrículo do coração.
10 - Região sinoatrial do coração.
21
Guia do Professor
Desenvolvimento
do embrião de galinha
Figura 4: Morfologia do embrião com 3-3,5 dias de incubação (estádio 20).
© imagens retiradas de Embryo Atlas da Lawrence University
Figura 4.2
1 - Telencéfalo
3 - Diencéfalo
4 - Mesencéfalo
6 - Metencéfalo
7 - Mielencéfalo
9 - Vesícula auditiva, que dará origem a um dos
ouvidos.
11 - Botão da asa
13 - Botão da cauda
14 - Artérias vitelinas
17 - Ventrículo
Figura 4.1
1 - Sómito
2. - Coração, sendo este o primeiro órgão vital a formar-se.
3 - Botão da asa, que como o nome sugere dará origem a
uma das asa.
4 - Veia vitelina
5 - Espinal medula
6 - Botão da pata, que como o nome sugere dará origem
a uma das patas.
7 - Botão da cauda, que como o nome sugere dará origem
à cauda.
8 - Artéria Vitelina, por onde circulam, através do sangue,
os nutrientes (e não só) entre o embrião e a cavidade
vitelina .
9 - Telencéfalo
10 - Dielencéfalo
11 - Olho
12 - Mesencéfalo
13 - Metencéfalo
22
Figura 4.3
5 - Aurícula
7 - Botão da pata
Figura 4.4
1 - Mielencéfalo
2 - Copo óptico
3 - Lente, estrutura do olho.
Guia do Professor
Desenvolvimento
do embrião de galinha
- FOLHA DE REGISTO (GRUPO OU INDIVIDUAL) Nome da atividade:
Membros do grupo:
O que sabemos sobre este
tema?
O que ainda não sabemos
e queremos descobrir?
Como podemos
descobrir?
O que observámos?
O que aprendemos?
Guia do Professor
Desenvolvimento
do embrião de galinha
Nome do aluno/ grupo:
FOLHA DE REGISTO (GRUPO e/ou INDIVIDUAL)
Distribuição cronológica do desenvolvimento embrionário da galinha
- Cola por ordem cronológica as diferentes fases de desenvolvimento do embrião da galinha, usando as ilustrações fornecidas. Em cada uma,
assinala a presença (com um X) ou ausência das estruturas embrionárias em baixo sugeridas.
1
Estádio nº_______________
Folha de Registo - PÁG.1
2
Estruturas
Estádio nº_______________
3
Estruturas
Estádio nº_______________
Estruturas
Cabeça
Cabeça
Cabeça
Tronco
Tronco
Tronco
Botão da
Asa
Botão da
Asa
Botão da
Asa
Botão da
Pata
Botão da
Pata
Botão da
Pata
Cérebro
Cérebro
Cérebro
Olho
Olho
Olho
Coração
Coração
Coração
Guia do Professor
Desenvolvimento
do embrião de galinha
4
Estádio nº_______________
5
Estruturas
Estádio nº_______________
Estruturas
Cabeça
Cabeça
Tronco
Tronco
Botão da
Asa
Botão da
Asa
Botão da
Pata
Botão da
Pata
Cérebro
Cérebro
Olho
Olho
Coração
Coração
Folha de Registo - PÁG.2
Guia do Professor
Desenvolvimento
do embrião de galinha
Distribuição cronológica das diferentes fases de desenvolvimento - RESULTADOS ESPERADOS
1
3
4
5
Estádio nº 14
Estádio nº 16
Estádio nº 20
x
x
x
x (estrutura primária, a notocorda)
x (início da flexão)
x
Botão da Asa
x (primeiras evidências)
x
Botão da
Pata
x (primeiras evidências)
x
Estádio nº 6
2
Estádio nº 10
Cabeça
Tronco
x (estrutura primária, a notocorda)
x (regiões específicas bastante
Cérebro
diferenciadas)
Coração
x (primeiras evidências)
x
Olho
x
x (aparecimento da pigmentação)
ESTÁDIOS DE DESENVOLVIMENTO PARA IMPRIMIR (para vários grupos)
© Ciência em Três, Instituto Gulbenkian de Ciência
ESTÁDIOS DE DESENVOLVIMENTO PARA IMPRIMIR (para vários grupos)
© Ciência em Três, Instituto Gulbenkian de Ciência
ESTÁDIOS DE DESENVOLVIMENTO PARA IMPRIMIR (para vários grupos)
© Ciência em Três, Instituto Gulbenkian de Ciência
Guia do Professor
Desenvolvimento
do embrião de galinha
Bibliografia
In Memory of Viktor Hamburger: 1900-2001
N O R M A L S TA G E S O F C H I C K E M B R Y O N I C D E V E L O P M E N T
Hamburger V. Hamilton H.L. 1951.
A series of normal stages in the development of the chick embyro. J Morph 88: 49-92.*
The stage series of normal
chick embryonic development
is one of the most frequently
cited and enduring biomedical
articles ever published, and set
the standards for amniote
species-specific stage series
that have followed. The
coauthor of this paper, Viktor
Hamburger, died in June, 2001,
just a few weeks prior to his
101st birthday. In recognition
of the tremendous importance
of this stage series to countless
research and teaching laboratories around the world, and in
tribute to Prof. Hamburger’s
many contributions to developmental biology spanning seven
decades, the editors and
publisher of Developmental
Dynamics commissioned the
poster that accompanies this
issue. Stages 1-35 (incubation
days 0 through 9) were scanned
from the original 1951 publication. Embryos have been
resized and cropped for this
poster format, and digitally
enhanced to better highlight
key features of each stage.
Sketches of early limb bud and
branchial (pharyngeal) arch
development are also included;
*Reprinted in Developmental Dynamics 195, 231-72 (1992).
Poster by Drew M. Noden, Cornell University; sponsored by the American Association of Anatomists; production by Wiley-Liss, Inc.
DEVELOPMENTAL
DYNAMICS
WWW.INTERSCIENCE.WILEY.COM/DEVELOPMENTALDYNAMICS
keys for these are in the
original publication.
A S E R I E S O F NORMAL STAGES I N T H E
DEVELOPMENT O F T H E
CHICK EMBRYO
VIKTOR HAMBURGER
Department of Zoology, Washington University, S t . Louis, Missouri
HOWARD L. HAMILTON
Depa?%n,ent of Zooloqy a d Entomology, Iowa State College, Ames
FORTY-FNE FIGURES
The preparation of a series of normal stages of the cliick
embryo does not need justification at a time when chick embryos are not only widely used in descriptive and experimental embryology but are proving to be increasingly
valuable in medical research, as in work on viruses and cancer.
The present series was planned in connection with the
preparation of a new edition of Lillie’s Deuelopiiaent of the
Chick by the junior author. It is being published separately
to make it accessible immediately to a large group of workers.
Ever since Aristotle “discovered” the chick embryo as the
ideal. object for embryological studies, the embryos have been
described in terms of the length of time of incubation, and
this arbitrary method is still in general use, except f o r the
first three days of incubation during which more detailed
characteristics such as the numbers of somites are applied.
The shortcomings of a classification based on chronological
age are obvious to every worker in this field, for enormous
variations may occur in embryos even though all eggs in a
setting are placed in the incubator at the same time. Many
factors are responsible €or the lack of correlation between
chronological and structural age. -4mong these are : genetic
differences in the rate of development of different breccls
(e.g., the embryo of the White Leghorn breed develops more
49
50
V. HAMBURGER AND H. L. HAMILTON
rapidly than that of the Barred Plymouth Rock and hatches
approximately a day earlier) ; seasonal differences in the
viability and vigor of embryos; differences in the stage of
development when incubation is started ; differences in the
“freshness” of eggs, i.e., the lapse of time between laying
and incubation; differences in the temperature of eggs when
placed in the incubator, and in the size of individual eggs;
differences in the temperature of incubation, and in type and
size of incubator.
The wide variations in external form which occur a t any
given chronological age are clearly seen in tables 1 and 2
which show the distribution of 296 embryos from the 4th day
until hatching when classified according to our series of
stages. F o r example, a “6-day” embryo may range anywhere
from stage 27 to stage 31 (table 1).It will also be noted that
the data in table 1are based on an illcubation-temperature of
103°F. (ca. 39.4”C.) whereas those in table 2 are based on
a temperature of 375°C. This difference has resulted in the
skipping of the “9-day” embryo altogether! It is not surprising, therefore, that the use of chronology with its lack of
precision in the designation of embryos has actually led to
misunderstandings and controversies which could readily
have been avoided by the use of an adequate series of morphological stages.
Keibel and Abraham (1900) worked out a series of stages
of the chick embryo based on morphological characters. This
series never became popular and it has been rarely used aiid
quoted. Among its shortcomings are its inadequate illustrations which often make the identification of an embryo
difficult, the incomplete coverage of older stages, and perhaps
also the format and relative inaccessibility of the Norrnentafeln. M. Duval’s masterful Atlas d’Embryologie (1889) with
its artistically perfect drawings is unfortunately incomplete
in that it does not go beyond the 8th day of incubation.
Our owii work covers the entire period of incubation. Its
aim is to serve the practical purpose of identifying and designating embryos on the basis of external characters. The un-
+
TABLE 1
8
8+
5
5
1
23
2
5
24
4
3
24+
2
5
25
4
25+
7
3
1
1
2
26 2 6 +
1
8
3
27
6
2
1
4
5
3
2
20
29+
3
1
2
30 3 0 +
7
2
4
2
1 4 2 2 2
4
28 2 X +
bTAUES Oh' D E V E L O P M E N T
27+
5
2
31
31
+
1
4
3
32 32+
3
F
HATION
IN cu-
DAYS
OF
18
19
2u
17
-.
1 0
11
12
13
14
15
36
9
3
1
36+ 37-
8
5
37 35
+
1
38-
8
5
1
3
38 3 8 + 3 9 -
2
8
1
1
2
1
:lY 3 9 + 4 0 -
9
1
1
1
40 4 0 + 4 1 -
STAGES O F Y E V P L O P M E N T
7
1
3
41 4 1 + 4 2 -
6
1
1
42
10
4:s
2
4:)
1
+ 44-
6
44
45
?i
B
0
I3
H
0
u)
m
0
r
46
8
8
1Xrtrib.ution of chick enibryos showing the relationship between stages of developnrent and days of incubation a t 3 7 5 ° C .
8
35
TABLE 2
1
1
:13 3 : l c 34
The omission of tlie 9th day is due to a shift in iiicuI~at.ion-teiril,cr,?turebet.weeii stages 35 :tnd 36 (see 1'. 5 0 ) .
INCUBATION
OF
DAYS
5
53
6
64
7
7:
44
4
33
22
-
Distribution of chick embryos showing the relationship between stages of development and d a y s of incubation a t 103°F. (39.4"C.)
52
1‘. HAMBURGER A N D H. L. H A M I LTO N
excelled series of stages of AinbEystoma by Harrison has
served as a model. Our series is independent of chronological
age and of size of embryos, as is the AmbZystomu series. The
photographs and drawings show most of the diagnostic
criteria ; this, we hope, will facilitate a rapid identification.
A brief text is added, in which the distinguishing criteria are
listed for each stage.
We are aware of the complications which derive from the
independent variations of different characters. For instance,
the progress of differentiation in the visceral arches may lag
behind that in the limb-buds, when compared with an average
seqneiice. For this reason, the amnion and allantois, and the
number of pairs of somites beyond 22 are of no diagnostic
value. We have tried to establish average or “standard”
types by comparing a considerable number of embryos in each
stage, and we have selected for illustrations those embryos
which appeared typical.
During the different phases of development, different characters become prominent, and therefore particularly useful
for the diagnosis. F o r the second day of incubation we have
adopted the conventional designatioii of embryos accordiiig
to numbers of pairs of somites. We have chosen intervals of
three somites as “stages”; this makes it possible to designate embryos with intermediate numbers of somites by a
or -. sign. Somites were not counted unless fully formed and
completely separated by clefts from the adjacent mesoderm.
The first somite was not included in the counts beyond stage
10 when it begins to dwindle away.
During the third day of incubation, or, more precisely,
from the stage of 22 somites onward (stage 14), the rapid
progress in development of the limbs provides the most convenient diagnostic criteria. Preliminary work on these stages
has been done by Hamburger (’38, ’42) and by Sannders
(’48). Our stages 15 to 21 are identical with stages 1 to 7 of
these authors. The original work was carefulmly rechecked
and detailed descriptions of all characters were added.
Stages 8 and 9 of Saunders are combined in o w stage 22;
+
NORMAL STAGES O F THE C H I C K
53
stage 10 of Saunders is identical with our stage 23. The developmental phase between 4 and 9 days of incubation is
characterized by rapid changes in the wings, legs, and visceral
arches. From the 8th to the 12th days, feather-germs and
eyelids provide the most useful criteria. The designation of
stages during the last phase of incubation is difficult because
practically no new structures are formed and there is mainly
just growth of what already exists. Hence, we have had to
make use of measurements of the lengths of the beak and of
the toes.
The senior author is responsible for stages 14 to 35 and the
junior author for all the others.
A11 illustrations and descriptions are based on material
fixed in Bouin's solution or formalin. It is possible that
minor distortions have occurred due to differential shrinkage, for instance in the amnion. The embryos used for stages
14 to 35 came from a flock of White Leghorns at St. Louis.
They were incubated in a small size Buckeye incubator (for
350 eggs) without forced draft, a t a temperature of 103°F.
(ca. 39.4"C.). The embryos used for the other stages were
of several breeds (White Leghorn, Barred Plymouth Rock,
and R.hode Island Red) from the Iowa State Colcllege Poultry
Farm, and were incubated in a forced-draft incubator at a
constant temperature of 37.5"C. During the course of this
work several hundred embryos have been examined and classified from the second day of incubation until hatching.
We wish to express our great appreciation of the expert
advice and help which Dr. Mary E. Rawles, Johns Hopkins
University, and Dr. Nelson T. Spratt, University of Minnesota, have given us in the difficult mafter of selecting stages
1t o 6. Dr. Rawles has generously supplied data on the range
of time within which a given stage may usually be obtained,
based on records of 700 embryos incubated at 38°C. Her
data are included in the text for stages 5-14 and 22. Dr.
Spratt has supplied photographs and slides for illustrating
54
V. HAMBURGER A N D R. L. HAMILTON
the pre-somitic stages and has given estimates of incubationtime for stages 2-4.
The photographic work for stages 22 to 35 was done by 111..
L. Pinkers and Nr. D. Bucklin at Washington University, and
that for the remaining stages by Mr. John Staby of the Iowa
State College Experiment Station. All drawings were made
by Nrs. Elsie Herbold Froeschner of Ames, Iowa. Additional
assistance was given by Miss Thelma Dunnebacke and Miss
Mary Lee Winkler, both of Washington University. We wish
to thank all our helpers f o r their efficient and untiring cooperation. The work was supported, in part, by a Research
Grant of the Rockefeller Foundation to the Department
of Zoology of Washington University, and by the Industrial
Science Research Institute of Iowa State College.
The description which follows should be used in conjunction with the illrustrations (plates 1-14) which are numbered
according to stages.
Slage 1. Pre-Streak: Prior to the appearance of the primitive
streak. An “embryonic shield” may be visible, clue to the accnmulation of cells toward the posterior half of the blastoderm.
(See Spratt, ’42, pp. 71-72.)
8tage 2. Initial Streak: (‘ ‘Short-broad beginning-streak” of Spratt,
’42). A rather transitory stage in which the primitive streak
first appears as a short, conical thickening, almost as broad as
long (0.3-0.5 mm in length), at the posterior border of the
pellucid area. Usually obtained after 6-7 hours of incubation.
Slage 3. Intermediate Streak: (12-13 hrs.). The primitive streak
extends from the posterior margin to approximately the center
of the pellucid area. The streak is relatively broad throughout
its length, and is flared out where it touches the opaque area. No
primitive groove.
Stage 4. Definitive Streak: (18-19 hrs.). The primitive streak has
reached its maximal length (average length = 1.88 mm, Spratt,
’46). The primitive groove, primitive pit, and Hensen’s node are
present. The area pellucida has become pear-shaped and the
streak extends orer two-thirds to three-fourths of its length.
Stage 5. Head-Process: (19-22 hrs.). The notochord or headprocess is visible as a rod of condensed mesoderm extending
55
N O R M A L STAGES O F THE CI-IICR
forward from the anterior edge of Hensen’s node. The head-fold
has not yet appeared. Since the length of the notochord increases
during this stage, it is suggested that the length of the notochord
in millimeters be appended to the number of the stage for further
precision ( e g , “Stage 5-0.2”
would designate a notochordal
blastoderm with notochord 0.2 mm i n length).
fYrfage 6. Head-Fold: (23-25 hrs.) . A definite fold of the blastoderm
anterior to the notochord now marks the anterior end of the
embryo proper. No somites have yet appeared in the mesoderm
lateral to the notochord. This is a transitory stage, since the
head-fold and the first pair of somites develop rather closely in
time.
Stages 7 to 14 are based primarily on the numbers of pairs of
somites which are clearly visible. The number of somites appears to
be the simplest criterion for staging this phase of development, and
i t is sufficiently accurate for practical purposes. A stage is assigned
to every third pair of somites which is added; embryos with inbetween numbers of somites are designated by adding a
or sign to the appropriate stage. Thus, stage 7 designates a n embryo
with one pair of somites; stage 7
= two pairs; stage 8 - = three
pairs; stage 8 = four pairs; etc. (See plates 2 and 3.)
Stage 7. One somite: (23-26 hrs.). This is actually the second
somite of the series; number one is not yet clearly defined.
Neural folds are visible in the region of the head.
Stage 8. Pour smaites: (26-29 hrs.). Neural folds meet a t level
of midbrain. Blood-islands are present in posterior half of
blastoderm.
Stage 9. Reven soinites: ( 2 9 3 3 hrs.). Primary optic vesicles are
present.. Paired primordia of heart begin to fuse.
Stage 10. Ten somites: (33-38 hrs.). The first somite is becoming
dispersed; i t is not included i n the counts for subsequent stages.‘
First indication of cranial flexure. Three primary brain-vesicles
are clearly visible. Optic vesicles not constricted a t bases. Heart
bent slightly to right.
Stage 22. Thirteen sontites: ( 4 0 4 5 hrs.). Slight cranial flexure.
Five neuromeres of hindbrain are distinct. Anterior neuropore
is closing. Optic vesicles are constricted a t bases. Heart bent
to right.
+
+
I I t is suggested t h a t embryos which hare gained one somite beyond Stage 10,
b u t have lost s. 1 i n the meantime, be designated as Stage 10 5 ; Stage 10
would then have 11s., not counting the rudimentary one; stage 11- = 12 s., not
counting the rudimentary one, etc.
+
56
V. HAMBURGER AND H. L. HAMILTON
Stage 12. Sixteen sonzites: (45-49 hrs.). Head is turning onto left
side. Anterior neuropore closed. Telencephalon indicated. Primary optic vesicles and optic stalk well established. Auditory
pit is deep, but wide open. Heart is slightly S-shaped. Headfold of amnion corers entire region of forebrain.
Stage 13. Nineteen somites: (48-52 hrs.). Head is partly to fully
turned to the left. Cranial and cervical flexures make broad
curves. Distinct enlargement of telencephalon. Slight narrowing of opening to deep auditory pit. No 'indication of hppophysis. Atrio-ventricular canal indicated by constriction.
Head-fold of amnion covers forebrain, midbrain, and anterior
part of hindbrain.
Stage 14. Twenty-two somifes: (50-53 hrs.).
Flexures and iotatiow. Cranial flexure: axes of forebrain and
hindbrain form about a right angle. Cervical flexure a broad
curve. Rotation of body back as far as somites 7-9. Behind
this level, a slight flexure makes its appearance which will be
referred to as " trunk-flexure.''
Visceral arches 1 and 2, and clefts 1 and 2 are distinct. Posterior
arches not distinct.
Primary optic vesicle begins to invaginate ; lens-placode is
formed. Opening of au&tory pit constricted. Rathke's pouch
can be recognized. Ventricular loop of heart now ventral to
atrio-ventricular canal. Anzm*on extends to somites 7-10.
Beyond stage 14 the number of somites becomes increasingly
difficult to determine with accuracy. This is due in p a r t to the dispersal of the mesoderm of the anteriormost somites, and, i n later
stages, t o the curvature of the tail. Total somite-counts given for
the following stages are typical, but sufficiently variable so as not to
be diagnostic. For these reasons, the limb-buds, visceral arches, and
other externally visible structures are used as identifying criteria
from stage 15 onward.
Stage 15. (Hamburger, '38 ; Saunders, '48, stage 1 ; ca. 50-55 hrs.) .
1. Lateral body-folds extend to anterior end of wing-level
(somites 15-17).
2. Limb-primordia: prospective limb-areas flat, not yet demarcated. Inconspicuous condensation of mesoderm in wing-level.
3. Sovnites: 24-27.
4. A m n i o n extends to somites 7-14.
5. Flexures and rotation. Cranial flexure: axes of forebrain
and hindbrain form a n acute angle. The ventral contours of
forebrain and hindbrain are nearly parallel. Cervical flexure
NORMAL STAGES OF THE CHICK
5T
a broad curve. The trunk is distinct. Rotation extends to
somites 11 to 13.
6. Visoeral arches: Visceral arch 3 and cleft 3 are distinct.
The latter is shorter than cleft 2 and usually oral in shape.
7. E y e : Optic cup is completely formed; double contour distinct in region of iris.
Stage If?. (Hamburger-Saunders stage 2 ; ca. 51-56 hrs.).
1. Lateral body-folds extend to somites 17-20, between levels
of wings and legs.
2. Limbs. Wing is lifted off blastoderm by infolding of lateral
body-fold. It is represented by a thickened ridge. Primordinm
of leg is still flat; represented by a condensation of mesoderm.
3. Somites: 26-28.
4. Amnion extends t o somites 10-18.
5. Flexures and rotattion: All flexures are more accentuated
than in stage 15. Rotation extends to somites 14-15.
6. Tail-bud a short, straight cone, delimited from blastoderni.
7. Visceral arches: Third cleft still oval in shape.
8. Forebraifi lengthened ; constrictions between brain-parts are
deepened. Epiphysis indistinct or not yet formed.
Stage 17. (Hamburger-Saunders stage 3 ; ca. 52-61 hrs.).
1. Lateral body-folds extend around the entire circumference
of the body.
2. Limb-buds: both wing- and leg-buds lifted off blastoderin
by infolding of the body-folds. Both are distinct swellings of
approximately equal size (see plate 5).
3. Xomites: 29-32.
4. A m n i o n : Considerable vasiability, ranging from a condition
in which posterior trunk and tail, from approximately somite
26, are uncovered, to complete closure except for a n o r a l hole
over somites 28-36. Intermediate stages with a n anterior fold
covering as f a r back as somite 25 and a posterior fold
covering part of the tail are common.
5. Flexures aind rotation: Cranial flexure is unchanged. Cervical flexure is more sharply bent than i n preceding stages,
but its angle is still larger than 90". Trunk-flexure is distinct
in brachial level. Rotation extends to somites 17-18.
6. Tail-bud bent ventrad. I t s mesoderm unsegmented.
7. Epiphysis: a distinct knob. Indication of nasal pits.
8. Allantois: not yet formed.
58
V. HAMBURGER A N D H. L. HAMILTON
Ptagp 18. (Hamburger-Saunders stage 4 ; ca. 65-69 hrs.) .
1. Limb-buds enlarged ; leg-buds slightly larger than wing-buds
(see plates 4 and 5 ) . L/W of wing = 6 or < 6 (L = length =
anterior-posterior dimension as measured along the body-wall ;
W = width = distance from body-wall to apex; see stage 20,
plate 5).
2. Somites: 30-36; extend beyond level of leg-bud.
3. Amnion: Usually closed ; occasionally an oval hole in lumbar
region.
4. Flexures a.nd rodation: A t the cervical flexure, the axis of
the medulla forms approximately a right angle to the axis of
the posterior trunk. The trunk-flexure has shifted to the
lumbar region. The rotation extends now to the posterior part
of the body ; hence, the leg-buds are no longer i n the horizontal
plane.
-5. The tail-bud is turned to the right, a t about a n angle of
90" to the axis of the posterior trunk.
6. Visceral arches: Maxillary process absent or inconspicuous.
Fourth visceral cleft in'distinct or absent.
7. Allantois: A short, thick-walled pocket ; not yet vesicular.
Stage 19. (Hamburger-Saunders stage 5 ; ca. 68-72 hrs.).
1. Limb-buds : Enlarged, symmetrical. Leg-buds slightly larger
and bulkier than wing-buds (see plate 5). L/W of wingbuds = 4-6.
2. Sonaites: 3 7 4 0 ; extend into tail; but the end of the tail
which is directed forward is unsegmented.
3. Flexures and rotation: I n the cervical flexure the axis of the
medulla forms an acute angle with the axis of the trunk. The
trunk-flexure has nearly or entirely disappeared due to the
rotation of the entire body. The contour of the posterior part
of the trunk is straight to the base of the tail.
4. Tail-bud curved, its tip pointing forward.
5 . Visceral arches: The maxillary process is a distinct swelling
of approximately the same length as the mandibular process.
The first visceral cleft is a n open narrow slit a t its dorsal
part. It continues into a shallow furrow. The second arch
projects slightly over the surface. The 4th cleft is a fairly
distinct slit a t its dorsal p a r t and continues ventrally as a
shallow groove. It docs not perforate into the pharynx as a
true (open) cleft, but is, nevertheless, homologous to the other
three clefts.
6. Alluntois: A small pocket of variable size ; not yet vesicular.
7. E y e s nnpigmented.
XORMAL STAGES O F T H E C H I C K
59
Singe 20. (Hamburger-Saunders stage 6 ; ca. 70-72 hrs.)
1. Linzb-buds enlarged ; leg-buds are ~distiiictlylarger from n o ~ v
on than wing-buds. The wing-buds are still approximately
symmetrical ; the leg-buds are slightly asymmetrical (see plate
5 ) . L/W of wing = 3 4 . 9 ; L/W of leg = 3-2.3.
2. Somites: 40-43 ; tip of tail still unsegmented.
3 . Plexures and rotatiort : Cervical flexure more accentuated
than in stage 19. The bend in the tail-region begins to extend
forward into the lumbo-sacral region. Contour of mid-trunk a
straight line. Rotation completed.
4. Visceral arches: Maxillary process distinct, equals or exceeds the mandibular process in length. Second arch projects
over surface. Fourth arch less prominent and smaller than
third arch. Fourth cleft shorter than third cleft; a narrow
slit a t its dorsal part, continuing into a shallow groove.
5 . Allantois: Vesicular, variable in size; on the average of the
size of the midbrain.
6. Eye-pigment. A faint grayish hue.
Stage 21. (Saunders stage 7 ; ca. 3fr days).
1. Limbs: Enlarged; both wing- and leg-buds are slightly
asymmetrical ; their proxiino-distal axes are directed caudad,
and the apex of the bud lies posterior to the midline bisecting
the base of the bncl. The posterior contours of wing- and
leg-buds are steeper than the anterior contours; they meet the
baseline a t a n angle of approximately 90". L/W of wing =
2.3-2.7 ; L/W of leg = 2.0-2.5.
2. Somites: 43-44; extreme tip of tail unsegmented.
3. Flexures: The posterior curvature includes the lumbo-sacral
region. The dorsal contour of the trunk is straight or slightly
bent.
4. Visceral arches: Maxillary process is definitely longer than
mandibular process, extending approximately to the middle
of the eye. The second arch extends distinctly over the surface and overlaps the third arch ventrally. Fourth arch
distinot; 4th cleft visible as a slit.
3. Allantois: Variable, usually larger than in stage 20; may
extend to head.
6. E y e p i g m e n t a t i o n : Faint.
Stage 22. (Saunders stages 8 and 9 combined; ca. 34 days).
1. L i m b s : Elongated buds, pointing caudad. The anterior and
posterior contours are neasly parallel a t their bases (see
plate 7). L/W of wing = 1.5-2; IJ/W of leg = 1.3-1.8.
60
V. HAMBURGER AND I€. L. HAMILTON
2 . Sonaites: Extend to tip of tail.
3. Flexures: Little change. The dorsal contour of the trunk is
a straight line or curved.
4. Visceral arches: Little change compared with stage 21.
Maxillary process enlarged; 4th cleft distinct as a slit.
5. Allarttois: Variable in size; extends to head and may overlap
the forebrain.
6. Eye-pignienta’tion: Distinct.
Stage 23. (Saunders stage 10 ; ca. 3 4 4 days).
1. Limbs: Longer than in stage 22; particularly the proximal
parts in which anterior and posterior contours run parallel
are lengthened ; otherwise, little change in shape. Both wingand leg-buds apprpximately as long as they are wide.
2. Visceral arches (see plates 7 and 8) : Maxillary process is
lengthened further. The first visceral cleft is represented by a
broken line. Its dorsal part is a distinct slit. A slight protuberance ( “ a ”) is iioticeable anterior t o the dorsal slit. The caudal
part of the second arch is distinctly elevated over the surface.
Arches 3 and 4 are still completely exposed. Visceral cleft 3 is
a distinct groove, and cleft 4 is reduced to a narrow oval pit at
its dorsal end.
3. Flexures: The dorsal contour from hindbrain to tail is a
curved line.
Stage 24. (ca. 4 days).
1. L i m b s : Wing- and leg-buds distinctly longer than wide.
Digital plate in wing not yet demarcated. Toe-plate in leg-bud
distinct. Toes not yet demarcated.
2. Visceral arches (see plates 7 and 8) : First visceral cleft a
distinct curved line. Slight indication of two protuberances
(‘ ‘a, ” ‘ ‘b ”) on mandibular process and of three protuberances
(“d,” “e,” “ f ” ) on second arch. Part “ c ” of rr-andibular
process is receding. Second arch longer ventrally (at “ f ”) and
much wider than mandibular process. Third arch reduced and
partly overgrown by second arch; 4th arch flattened. Both are
sunk beneath the surface. Thind visceral cleft is an elongated
groove. Fourth visceral cleft reduced to a small pit.
Stage 25. (ca. 44 days).
1. Limbs: Elbow and knee-joints distinct (in dorsal or ventral
view). Digital plate in wing distinct, but no demarcation of
digits. Indication of faint grooves demarcating the third toe
on leg.
2. Visceral arches (see plates 7 and 8) : Maxillary process lengthened; it meets the wall of the nasal groove (notice the notch at
NORMAL STAGES OF THE CHICK
61
point of fusion). Three protuberances on each side of first risceral cleft ( “ a ” to “ f ” ) . I n dorsal view, “ a , ” “b,” and “ d ”
appear as round knobs, and “c” as a flat ridge. P a r t “ f ” is
conspicuous and projects distinctly over the surface. It will be
referred to as the “collar.” Dorsal p a r t of third arch still
visible. Third and 4th visceral clefts reduced to small circular
pits.
Stage 26. (ca. 44-5 days).
I. Limbs: Considerably lengthened. Contour of digital plate
rounded. Indication of faint groove between second and
third digit. Demarcation of the first three toes distinct.
2. Visceral arches (see plates 8 and 9 ) : Contour of maxillary
process a broken line. Mandibular process lengthened ventrally.
Protuberances “ a ” and “ b ” project over the surface. The
middle protuberance ( “ b ” ) is subdivided by a shallow groore.
A small knob is distinct a t the dorsal edge of “c.” On the second arch, protuberances “ d ” and “ e ” are only slightly elevated
over the surfaoe. The “collarff ( “ f ” ) has broadened and overgrown visceral arches I11 and IV. A deep groove separates
“ f ” from “c.” The two pits represent,ing the 3rd and 4th
visceral clefts are no longer visible.
Stage 27. (ca. 5 days).
1. Limbs: Contour of digital plate angular in region of first
digit. Grooves between first, second, and third digits indicated. G m v e s between toes are distinct on outer and inner
surfaces of toe-plate. First toe projects over the tibia1 p a r t
a t a n obtuse angle. Tip of third toe not yet pointed.
2. Visceral arches (see plates 8 and 9 ) : Contour of maxillarjprocess is a curved, broken line. Mandibular process has broadened ventrally (at “ c ” ) and grown forward. Protuberances
“ a ” and “ b ” project over the surface. Parts “ d ” and “ e ”
are flat. Protuberances “ b ” and “ e ” are close to fusion, but a
separating line is still distinct. The ‘(collar’’ (‘ ‘ f ”) has broadened and continued its growth backward. It rises conspicuouslp
above the surface. The groove between “ c ” and “ f ” has
widened.
3. Beak: Barely recognizable.
Stage 28. (ca. 54 days).
1. Limbs: Second digit and third toe longer than others, which
gives the digital and toe-plates a pointed contour. Three
digits and 4 toes distinct. No indication of 5th toe.
2. Visceral arches (see plates 8 and 9 ) : Protuberance “ a ” still
projects over the surface. Mandibular process has lengthened
62
V. HAMBURGER A N D H. L. HAMILTON
and grown forward. Parts “ b ” and “ e ” have fused; a fine
suture line is occasionally still visible. Parts “b,” “ d , ” and
“el’ no longer project above the surface. External auditory
opening is now very distinct between “a,” “b,” and “d.”
“ Collar ’’ (‘ ‘ f ”) projects distinctly over the surface. The neck
between “collar ” and mandible has lmgthened.
3. B e a k : A distinct outgrowth is visible in profile.
Stage 29. (na. 6 days).
1. Limbs: Wing bent in elbow. Second digit distinctly longer
than the others. Shallow grooves between first, second, and
third digits. Second to 4t;h toes stand out as ridges separated
by distinct grooves, and u-ith indications of webs betxeen
them. Distal contours of W ~ J Sare straight lines, occasionally
with indication of convexity. Rudiment of 5th toe visible.
2. Visceral arches : Mandibular process lengthened (compare
with stage 28). Mandibular process and second arch are
broadly fused. Auditory meatus distinct at dorsal end of
fusion. All protuberaiices have flattened. Neck between
“collar” and mandibular process has lengthened. “Collar”
stands out conspiouously.
3. B e a k : More prominent than in stage 28. No egg-tooth
visible as yet.
Stage 30. (ca. 63 days).
1. Limbs: The three major segments of wing and leg are
clearly demarcated. Wing bent in elbow-joint. Leg bent in
knee-joint. Distinct grooves between first and second digits.
Contours of webs between first two digits and between all
toes are slightly curved concave lines.
2. Visceral arches: The mandibular process approaches the
beak, but the gap between the two is still conspicuous.
Lengthening of neck between “collar” and mandible is very
conspicuous. ‘‘ Collar’’ begins to flatten.
3. Peather-gemas: Two dorsal rows to either side of the spinal
cord a t the brachial level. Three rows a t the level of the
legs; they are rather indistinct at thoracic level. None on
thigh.
4. Scleral papillae: One on either side of choroid fissure; sometimes indistinct but never more than two.
5 . Egg-tooth distinct, slightly protruding. Beak more pronounced than in previous stage.
Stage 31. (ca. 7 days).
1. Limbs: Indication of a web between first and second digits.
Rudiment of 5th toe still distinct.
NORMAL STAGES OF T H E C H I C K
63
2. Visceral a.rohes: The gap between mandible and beak has
narrowed to a small notch. “Collar ” inconspicuous or absent.
3. Peather-germs: On dorsal surface, continuous from brachial
to lumbo-sacral level. Approximately 7 rows at hxmbo-sacral
level. Distinct feather papillae on thigh. One indistinct row
on each lateral edge of the tail.
4. S c l e r d papdlae: Usually 6 ; 4 on the dorsal side near the
choroid fissure, and two on the opposite side.
Stage 32. (ca. 79 days).
1. Limbs: All digits and 4 toes have lengthened conspicuously.
Rudiment of 5th toe has disappeared. Webs between digits and
toes are thin and their contours are concave. Differences in
size of individual digits and toes become conspicuous.
2. Visceral arches: Anterior tip of mandible has reached the
beak. “Collar’ ’ has disappeared or is faintly recognizable.
3. Peather-germs: Eleven rows o r more on dorsal surface a t
level of the legs. One row on tail distinct, second row inIdistinct. Scapular and flight feather-germs barely perceptible
a t optimal illumination or absent.
4. S c l e r d p a p i h e : Six to 8, in two groups; one group on
dorsal and one on ventral side. Circle not yet closed.
Stage 33. (ca, 79-8 days).
1. Limbs: Web on radial margin of arm and first digit becomes
discernible. All digits and toes lengthened.
2. Visceral arches: Mandible and neck have lengthened conspicuously. (Compare the ventral contour of body, from heartregion, along neck to tip of mandible, in this and the preceding
stages.)
3. Peather-germs: Scapular and flight feather-germs not much
advanced over stage 32. Tail: three rows distinct, the middle
row considerably larger than the others.
4. Scleral papillae: Thirteen, forming a n almost complete
circle, with gap for one missing papilla a t a ventral point near
the middle of the jaw.
Stage 34. (cu. 8 (days).
1. Liwbs: Differential growth of second digit and third toe
conspicuous. Contours of webs between digits and toes are
concave and arched.
2. Visceral arches: Lengthening of mandible and of neck continues (see previous stage).
3. Peather-germs: On scapula, on ventral side of neck, on procoracoid, and posterior (flight) edge of wing, feather-germs
are visible under good illumination. Feather-germs next to
64
V. HAMBURGER A N D H. L. HAMILTON
dorsal midline, particularly a t lumbo-sacral level, extend
slightly over surface when viewed in profile. Feather-germs
on thigh protrude conspicuously. One row on inner side of
each eye. None around umbilioal cord.
4. Scleral papillae: Thirteen or 14.
5. Nictitating membrane extends halfway between outer rim
of eye (eyelid) and scleral papillae.
Stage 35. (ca. 8-9 days).
1. Limbs: Webs between digits and toes become inconspicuous.
A transitory protuberance on the ulnar side of the second
digit is probably a remnant of the web. Phalanges in toes are
distinct.
2. Visceral arches: Lengthening of beak continues. Compare
the distance between the eye and the tip of the beak, in this
and the preceding stages.
3. Feather-germs: All are more conspicuous. Mid-dorsal line
stands out distinctly in profile view. A t least 4 rows on inner
side of each eye. New appearance of feather-germs near midventral line, cJose to sternum, and extending to both sides of
umbilical cord.
4. Nictitating membrane has grown conspicuously and approaches the outer scleral papillae. Eyelids (external to nictitating membrane) have extended towards the beak and have
begun to overgrow the eye-ball. The circumference of the eyelids has become ellipsoidal.
Xtage 36. (cal. 10 days).
1. Limbs: Distal segments of both wing and leg are proportionately much longer. Length of third toe, from its tip to the
middle of its metatarsal joint = 5.4 0.3 mm. Tapering primordia of claws are just visible on termini of the toes and on
digit, 1 of the wing. Protuberance on posterior side of digit
2 of wing is missing.
2. Visceral arches: Primordium of the comb appears as a prominent ridge with slightly serrated edge along the dorsal midline of the beak. A horizontal groove (the “labial groove”)
is clearly visible a t the tip of the upper jaw, but is barely
indicated on the tip of the mandible. Nostril has narrowed to
a slit. Length of beak from anterior angle of nostril to tip
of bill = 2.5 mm.
3. Feather-gernas: Flight-feathers are conspicuous ; coverts are
just visible in web of wing. Feather-germs now cover the tibiofibular portion of the leg. A t least 9-10 rows of feather-germs
between each upper eyelid and the dorsal midline. Sternal
tracts prominent, with 3 4 rows on each side of ventral mid-
NORMAL STAGES O F THE C H I C K
65
line when counted in anterior part of sternum, merging into
many rows around the umbilicus.
4. Eyelids : Nictitating membrane covers anteriormost scleral
papillae and approaches cornea. Lower lid has grown upward
to level of cornea. Circumference of lids is a narrowing ellipse
with its ventral edge flattened.
Stage 37. (ca. 11 days).
1. Limbs: Claws of toes are flattened laterally and curved ventrally ; dorsal tips are opaque, indicating onset of cornification.
Tip of claw on wing is also opaque. Pads on plantar surface
of foot are conspicuous. Transverse ridges along t,he superior
surfaoes of the metatarsus and phalanges are first indication
of scales. Length of third toe = 7.4 0.3 mm.
2. Visceral arches: Labial groove on mandible is now clearly
marked off. The comb is more prominent and clearly serrated.
Length of beak from anterior angle of nostril to t i p of bill =
3.0 mm.
3. Feather-germs: Much more numerous, and in most-advanced
tracts (e.g., along back and on tail) elongated into long,
much-tapered cones. External auditory meatus is nearly surrounded by feather-germs. Circumference of eyelids is bordered by a single row of just-visible primordia; none on
remainder of lids. Sternal tracts contain 5-6 prominent rows
when counted a t anterior end of sternum.
4. Eyelids: Nictitating membrane has reached anterior edge
of cornea. Upper lid has reached dorsal edge of cornea. Lower
lisd has covered one-third to one-half of cornea. Circumference
of lids now bounds a much-narrowed and ventrally-flattened
biconvex area.
Stage 38. (ca. 12 days).
1. Limbs: Primordia of scales are marked off over entire surface of leg; ridges have not yet grown out t o overlap surface.
Tips of toes show a ventral center of cornification as well as
the more extensive dorsal one. Main plantar pad is ridged
when seen i n profile. Length of third toe = 8.4 & 0.3 mni.
2. Visceral arches: Labial groove marked off by a deep furrow
a t the end of each jaw. Length of beak from anterior angle of
nostril to tip of bill = 3.1 mm.
3. Feather-gernas: Coverts of: web of wing are becoming conical. External auditory meat.us is surrounded by feather-germs.
Sternum is coi7ered with feather-germs except along midline.
TJpper eyelid is covered with newly-formed feather-germs ;
lower lid is naked except for 2-3 rows a t its edge.
66
V. HAMBURGER A N D €1. L. HAMILTOK
Eyelids: Lower lid covers tw-0-thirds to three-fourths of
cornea.. Opening between lids is much reduced.
Stage 39. (ca. 13 days).
1. Limbs: Scales overlapping on superior surface of leg. Major
pads of phalanges covered with papillae ; minor pads are
smooth. Length of third toe = 9.8 k 0.3 mm.
2 . Visceral a.rches: Mandible and maxilla cornified (opaque)
back as f a r as level of proximal edge of “egg-tooth.” The
ohannel of the auditory meatus can be seen only a t the posterior edge of its shallow external opening. Length of beak
from anterior angle of nostril to tip of bill = 3.5 mm.
3. Feather-germs: Coverts of web of wing are very long tapering cones. Note great increase in length of feather-germs in
major tracts. Four to 5 rows of feather-germs a t edge of
lower eyelid.
4. EyeZids: Opening between licls reduced t o a thin crescent.
Stages 40 to 44 are based mainly on the length of the beak and on
the length of the third (longest) toe, since other external features
have lost their diagnostic value. Of these two criteria, the length of
the beak is the better, because it is more easily and accurately measured (with calipers) and shows less variability.
&age 40. (ca. 14 days).
1. Visceral arches: Length of beak from anterior edge of nostril t o tip of bill = 4.0 mm. The main channel of the auditory
meatus is not visible in strictly lateral view of its external
chamber.
2. L i m b s : Length of third toe = 12.7 k 0.5 mm. Scales overlapping on inferior as well as superior surfaces of leg. Dorsal
and ventral loci of cornification extend to base of exposed
portion of toe-nail. Entire plantar surface of phalanges is
covered with well-developed papillae.
Stage 41. (ca. 15 days).
1. B e a k : Length from anterior angle of nostril to tip of upper
bill = 4.5 mm.
2. T h i r d toe: Length = 14.9 t 0.8 mm.
&age 42. (ca. 16 days).
1. B e a k : Length from anterior angle of nostril to tip of upper
bill = 4.8 mm.
2 . T h i r d toe: Length = 16.7 t 0 . 8 nim.
Stage 43. (ca. 17 days).
1. B e a k : Length from anterior angle of nostril to tip of upper
bill = 5.0 mm. “Labial grooves” are reduced to a white granular crust a t the edge of each j a w ; that of the lower jaw may
be partially or completely sloughed off.
4.
NORMAL STAGES OF T H E CHICK
6T
2. T h i r d toe: Length =18.6 & 0.8 mm.
Stage 44. (ca. 18 days).
1. B e a k : Length from anterior angle of nostril to tip of upper
bill = 5.7 mm. The translucent peridermal covering of the
beak is starting to peel off proximally.
2. T h i r d toe: Length = 20.4 r+ 0.8 mm.
Stage 45. (ca. 19-20 days).
1. B e a k : Length is no longer diagnostic; in fact, the beak is
usually shorter than in stage 44, due to a loss (by sloughing
off) of its entire peridermal covering. As a consequence, the
beak is now shiny all over and more blunt a t its tip. Both
labial grooves have disappeared with the periderm.
2. T h i r d toe: Average length is essentially unchanged from
that of stage 44, except in those breeds with a longer period of
incubation (21 days) and a heavier build of body. For these
latter, length of third toe = ca. 21.4 & 0.8 mm.
3. Extra-embryonic membranes: Yolk-sac is half-enclosed in
body-cavity. Chorio-allantoic membrane contains less blood
and is “sticky” in the living embryo.
Stage 46. Newly-hatched chick (20-21 days).
REFERENCES
DUVAL,MATHIAS 1889 Atlas d’Embryologie. (116 pp., 40 plates). Paris.
HAMBURGER, VIKTOR 1938 Morphogenetic a n d axial self-differentiation of
transplanted limb primordia of 2-day chick embryos. J . Exp. Zool.,
77: 379-399.
1942 A Manual of Experimental Embryology. 213 pp. Univerbity
of Chicago Press.
KEIBEL,F., AND K. ABRAHAM 1900 Normentafel zur Entwicklungsgeschichte
des Huhnes (Gallus domesticus). 132 pp. Jena.
SPRATT, NELSON T., JR. 1942 Location of organ-specific regions and their relationship to the development of the primitive streak in the early
chick blastoderm. J. Exp. Zool., 89: 69-101.
1946 Formation
,
of the primitive streak i n the explanted chick
blastoderm marked with carbon particles.. J. Exp. Zool., 203: 259304.
SAUNDERS,
JOHN W., JR.
1948 The proximo-distal sequence of origin of the
parts of the chick wing and the role of the ectoderm. J. Exp. Zool.,
108: 363-403.
EXPLANATION O F PLATES
All numbers in the following plates refer to the corresponding stage numbers in
the text. The description of each stage should be consulted for a more complete
explanation of the figures.
PLATE 1
EXPLANBTION OF FIGURES
Stages 1-3+, illustrated by photographs provided by Dr. Nelson T. Spratt, Jr.
(Stages 1 and 2 are published in J. Exp. Zool., 203: 265 and 274.) X 20.
68
NORMAL STAGES O F TIIE CHICK
V. HA.\IBUROER .4SD H. L. HAAIILTOS
A9
PLATE 2
EXPLANATION O F FIGURES
Stages 4-9, x 20. Stage 10, x 12. (Stages 4, .5, and 8- were photographed froin
slides provided by Dr. Nelson T. Spratt, J r . All others are f r o m the Iowa State
College collection.)
PLATE 2
71
72
PLATE 3
EXPLANATION OF FIGURES
Stages 11-14,
74
x
12.
75
1’LATE 4
EXPLANAIION OF FIGUEES
Stages 15-18, X 12. Contours of limbs f o r stages 1 7 and 18 are shown in the
drawings on plate 5.
76
NORMAL STAGES O F T H E CHICK
V. HAMBURGER AND H. L. HAMILTOX
77
PLATE 5
N O R M A L STAGES O F THE C H I C K
V. HAIIBCR(:ER .4SD H . 12. H.4ZIlLTOI\'
WINGS
LEGS
"i).:...........\:
....
. ::
..':
...
....
...
.;t.
STAGE 18
STAGE 17
.....
WINGS
.....
...
LEGS
..
STAGE 19
STAGE 2 0
Drawings of the contours of the riglit limbs of stages 1i-20, ca. x 10. In stage 20 the dottetl
lines indicate the leyels at nliicli tlie length (Li and \vitltli ( W ) are inensured (see text, stages
18-22).
Stages 19-21 (cleared eiiiltrjos), x 12. Stage 2 1 (opaque), X 8, \\.it11 contours of linibs
slioivn in the dm\viiigs below, cu. x 12.
PLATE i
ESPLASATION O F FIGURES
Stages 22-33, X 8. The liinhs f o r stage 2 2 are drawings, ca. x 1 2 ; all others
are pliotogrnplis, X 8. F o r details of Tisrernl arches of stnges 23-25, see plate 8.
80
PLATE 7
NORMAL ST-4GES O F THE CHICK
V. HAMBURGER AND H . L. HAXILTON
81
I'IATE 8
N O R M A L STAGES OF THE C I I I C K
Y . H A X B U R G R R A S D 11. 11. II.ZMILTOS
STAGE 23
STAGE 24
STAGE 25
STAGE 26
STAGE 27
STAGE 28
E-X-L-
Drawings of the rvgioii of the visceral arclies, made from camern 1ucid:i tracings. Stages
23-23, x T. Stages z(i-28, X 4.2. I-IV = visceral arches; nix., iiid. = i i i n s i l l n r ~and nianclibular processes of riscer.:rl arch I ; 4 = 4th visceral cleft. See test f o r ex1)l:iii:itioii of letters n-f.
N O R l I A L ST.\GES O F TIIE C H I C K
1
'
. HAXI3URGER A N D H. 1,. HABIILTON
Stage 26, e m b r ~ oand limhs, X 5. Stages 2T-28, X 3 .
83
PLATE 10
ESPLAKATION OF F I G U R E S
Stages 29-30,
x
5. Stages 31-32, X 4.
84
SORN.11, STAGES OF TIIE C H I C K
V. HAXUL‘RGER A S U H . L. IIAXILTON
I’L.iTE
10
PLATE 11
ESPLASATION OF FIGURES
Stages 33-33,
x
4.
V. H A M B U R G E R .4ND H. L. H A M I L T O X
N @ R M d L STdGES O F THE C H I C K
PLATE 1 1
88
NOR31A1, STAGES O F THE CHICK
V. H A Y R U K ( . K R
A S U H. L. HAMILTON
Stages 36-39,
89
x
2.
90
SORM-iL STAGES O F THE: C H I C K
V. H.43IUURUER 9 S I ) H . L. l I A 3 I I L T O N
I’I,.\TK
13
V. HAMBURGER AND H . L. HAMILTON
NORMAL STAGES O F THE CHICK
Stages 4445,
x 16.
PLATE 14