Unidade II: Métodos de Estudo em Biologia Celular

24/02/2012
I. Histórico
• 1590 - 1608: Midelburg, Holanda
Unidade II: Métodos de
Estudo em Biologia Celular
• Hans e Zacharias Janssen;
• Lentes Convexas;
• Aumento de 9 vezes;
25 cm
Disciplina: Biologia Celular e Molecular
Centro de Ciências da Saúde
Profa. Dra. Marilanda Ferreira Bellini
[email protected]
Pró Reitoria de Pesquisa e de Pós Graduação – Bloco L
5 cm
http://www.curiosityscience.com/microscope-optical-microscope/
http://www.explicatorium.com/CFQ8-Jogo-As-lentes-concavas-e-convexas.php
Conteúdo
I. Histórico
II. Limite e poder de resolução
III. Planos de Corte
I. Histórico
• 1612, Itália:
• Galileu Galilei
20 cm
IV. Microscopia
a) de luz
b) eletrônica
http://www.curiosityscience.com/microscope-optical-microscope/
http://www.educadores.diaadia.pr.gov.br/modules/mylinks/viewcat.php?cid=48&letter=L&min=40&orderby=titleA&show=10
I. Histórico
• 400 a.C.: 1ª. Lente
• Sir Austin Henry Layard (1847)
• Escavações em Ninive (antiga Mesopotâmia)
• Lente de cristal plano-convexa, entalhada em
pedra bruta.
I. Histórico
• 1665: Inglaterra;
• Robert Hooke
Pedaços de Cortiça (tecido vegetal morto)
Compartimentos vazios.
Célula, do latim cella cavidade.
http://www.feiradeciencias.com.br/sala09/09_26.asp
http://www.learn-math.info/romanian/historyDetail.htm?id=Hooke
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I. Histórico
• Court Collection, Science Museum
• Livro:
I. Histórico
•1833 – Robert Brown
Orchidae
• Microphagia
“Em cada célula da epiderme ... uma única aréola,
geralmente mais opaca que a membrana da célula,
é observável... Essa aréola, ou núcleo da célula
como talvez possa ser cunhado,não está confinada
à epiderme (Brown, 1833, p. 710)”
pt.wikipedia.org/wiki/Robert_Brown
I. Histórico
• 1674, Holanda:
• Anton van Leeuwenhoek
• Descreveu protozoários, bactérias, espermatozóides e
células sanguíneas Células Vivas
• Apenas 1 lente convexa
• Pequeno (cabia na mão)
• Aumento de 275 vezes
http://www.curiosityscience.com/microscope-optical-microscope/
I. Histórico
• 1877, Alemanha:
• Karl Abbe e Carl Zeiss:
• Desenho otimizado;
• Óleo de Imersão;
• Microscópio de Luz: 0,2µm limite teórico
http://www.uv.es/~bertomeu/material/museo/instru/refra/refrac2.htm
http://www.victoriaphippsphotography.co.uk/2011/06/27/adventures-in-photography-contax-and-zeiss/
I. Histórico
• 1689:
• Marcelo Malpighi
I. Histórico
•1882 – Walther Fleming
Anilina (corante básico)
• Introdução da microscopia à medicina;
• Estudo anatômico dos capilares;
“ Nossa opinião é que a anatomia de uma
estrutura sumamente pequena, interna de
uma víscera, que foi exaltada nestes
tempos, é de uso a nenhum médico”
Estruturas Altamente Basófilas
Cromatina Cromossomos
Fases da Divisão Celular
http://www.biometria.gov.ar/acerca-de-la-biometria/historia-de-la-biometria.aspx
http://en.wikipedia.org/wiki/Walther_Flemming
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II. Poder de Resolução X Limite de Resolução
Bom microscópio:
1) Poder de Resolução (PR): “Capacidade de uma lente (ou do
próprio microscópio) em formar imagens com detalhes mínimos”
IV. Microscópio
• Do Grego:
micron= Pequeno
skopein = Observar
2) Limite de Resolução (LR): “Menor distância entre 2 pontos
distintos do objeto, que poderão ser individualizados na imagem
final”
> PR < LR
http://www.portalsaofrancisco.com.br/alfa/capas/biologia/microscopio.php
http://adaemebiologia.blogspot.com/2010_02_01_archive.html
II. Poder de Resolução X Limite de Resolução
Quanto < o LR de uma lente > o PR do microscópio
IV. Microscópio
• Fundamento: Sistema combinado de
lentes, que são colocadas de forma a
ampliarem a imagem do objeto.
ou
Quanto melhor for a capacidade de individualizar 2
pontos distintos do objeto (< LR) maior será a
definição da imagem formada no aparelho ( > PR).
III. Planos de Cortes
•Planos de cortes
Interação da Luz com o espécime
Absorção
Refração
IV. Microscópio
• Principal instrumento da Biologia Celular e
Histologia;
• produção de imagens aumentadas de
objetos não visualizados à olho nú;
Imagem microscópio = bidimensional
Objeto de estudo = tridimensional
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IV. Microscópio
de Luz
IV. Microscópios de Luz
•Trajetória da Luz
• Fonte luminosa →
luz branca
(tungstênio)
Centralização do feixe de luz
“Iluminação de Köhler”
(aula Prática)
• Óptica → lentes
ampliação
condensação
Iluminação perfeita
• Mecânica
• Sistema de
iluminação
Menos ocorrência de
aberrações e irregularidades no
trajeto luminoso
IV. Microscópio de Luz
Os modelos microscópicos variam na forma e no desenho
IV. Microscópios de Luz
• Objetiva (s) = próxima ao objeto
Corrige aberrações = ⇑ qualidade da imagem
Tipos: acromática, semi-apocromática, apocromática, planacromática,
planapocromática
Projeta imagem real e invertida
Aumentos: 4x / 10x / 20x / 40x / 100x (imersão)
IV. Microscópio de Luz
•Princípios da formação da imagem ao ML
Imagem II
F
C
Fonte
de luz
•Ocular (es) = ⇑ imagem projetada pela objetiva
Aumentos: 10x, 12x
Imagem I
objeto
F
IV. Microscópios de Luz
F
C
C
objetiva
condensadora
ocular
Fonte de luz → Lente condensadora → Lentes objetivas → Lente ocular
O posicionamento estratégico das lentes no
microscópio proporcionam a formação de uma imagem
Invertida
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IV. Microscópios de Luz
IV. Tipos de Microscópios
Microscopia de Luz
Microscopia convencional
Microscopia de contraste de fase
Microscopia de contraste interferencial
Microscopia de campo escuro
Microscopia de polarização
Microscopia de fluorescência
Microscopia confocal a laser
•Aumento
Final
Microscopia eletrônica
Microscopia eletrônica de
transmissão
Microscopia eletrônica de
alta voltagem
Microscopia eletrônica de
varredura
Outros tipos de microscópio
Microscopia de tunelamento quântico
Microscopia de força atômica
IV. Microscopia de Luz: Contraste de fase
IV. Microscópios de Luz
•Objetivas
Princípios da Difração da Luz
•Anéis metálicos colocados no caminho da
luz (Zerniké, 1950)
•Objetivas de contraste de fase: Ph
(Phase)
4x = Vermelha
10x = Amarela
40x = Azul claro
100x = Preta / branca
Retardo óptico e
Refração da luz
IV. Microscopia de Luz: Contraste de fase
IV. Microscópios de Luz
•Abertura Numérica
4X
2º Anel
10X
40X
AN = n.senα
AN = Abertura numérica
n = Índice de refração do meio de montagem
sen = Fornecido pelo fabricante da lente
A = Ângulo de abertura da objetiva
100X
AN = 0,12 (4x)
AN = 0,34 (10x)
1º Anel
AN = 0,60 (40x)
AN = acima de 1 (100x)
α = Ângulo correspondente à metade de A
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IV. Microscopia de Luz: Contraste de fase
Aplicação:
Análise do material biológico sem coloração prévia:
1. Culturas de células
2. Exames parasitológicos
3. Esfregaços e Raspagens de mucosas (Consultórios)
4. Sangue
5. Protozoários de ambientes aquáticos
6. Algas
7. Bactérias
IV. Microscopia de Luz: Contraste Interferencial
Diferenças de índices
de refração
Os prismas modificam a fase da onda luminosa
Sem coloração
Bactérias
Cultura de células: neurônios
IV. Microscopia de Luz: Contraste de fase
Análise do material com coloração prévia
Contraste com o meio em que se encontra o material a
ser analisado
IV. Microscopia de Luz: Contraste Interferencial
Microscopia de Normarski
Defasagem dos comprimentos de onda
Gera uma “deformação” na imagem
Princípio
Permite contraste interferencial
Aumentando o relevo das
superfícies do material
analisado
Esfregaço de Sangue
Divisão Celular em Raiz de
Cebola
IV. Microscopia de Luz: Contraste Interferencial
IV. Microscopia de Luz: Contraste Interferencial
Aplicações:
Observação de materiais biológicos sem coloração:
1. Parasitologia: Interpretação de estruturas e apêndices dos
parasitos (taxonomia)
2. Análise de massa seca celular – organização e compactação de
material biológico
3. Monitoramento de culturas celulares
Algas
Escamas
Prismas ópticos posicionados no caminho da luz
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IV. Microscopia de Luz: Contraste Interferencial
IV. Microscopia de Luz: Polarização
Anisotropias Ópticas
Fenômenos de ordem espectral
Cultura Celular: macrófago
Ácaro
IV. Microscopia de Luz: Polarização
• 2 Filtros ou Prismas:
1º Polarizador → Entre a fonte de luz e o condensador
Dicroísmo
(1 filtro polarizador)
Birrefringência
(2 filtros polarizadores
cruzados perpendiculares)
IV. Microscopia de Luz: Polarização
Birrefringência
ocorre
Cruzamos perpendicularmente os 2
filtros (polarizador e analisador)
2º Analisador → Entre a objetiva e a ocular
Componentes macromoleculares
Filtros:
Birrefringentes:
Anisotrópicos (brilho colorido ou não)
Promovem a seleção de apenas um plano de direção de vibração das
ondas luminosas Plano da luz polarizada (PLP)
Observação:
Microscopia de luz comum → feixe de ondas luminosas → direção de
vibração em todos os planos
IV. Microscopia de Luz: Polarização
Material realçado
Outros componentes
Não refringentes:
Isotrópicos
Indistintos em fundo escuro
IV. Microscopia de Luz: Polarização
2º
PLP
1º
Filtros polarizadores, quando colocados no caminho da luz e
rotacionados a 90o permitem a distinção de macromoléculas ditas
anisotrópicas (birrefingentes ou dicróicas)
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IV. Microscopia de Luz: Polarização
• Aplicações da Microscopia de Polarização
IV. Microscopia de Luz: Polarização
Coloração: Picro-sirius / Luz polarizada
1. Análise de macromoléculas que apresentam graus ordenados de
agregação: DNA, colágenos fibrilares, celulose, tubulina
2. Análise de células que apresentem organização interna de suas
macromoléculas altamente cristalinas: célula muscular esquelética,
espermatozóides (ordem molecular)
3. Análise de tecidos biológicos com ordem molecular nos arranjos
macromoleculares: tecidos ósseos, cartilagens, dente
4. Análise de componentes cristalinos dos minerais
5. Outros: parede celular; amido.
Tecido ósseo : sistema de Havers ou
ósteon / fibras colágenas
IV. Microscopia de Luz: Polarização
Tecido ósseo: osso esponjoso /
fibras colágenas
IV. Microscopia de Luz: Polarização
Materiais biológicos podem apresentar:
Birrefringência dependendo do grau de agregação de cristalinidade
Tecido ósseo
A observação e a medida das propriedades anisotrópicas
(dicroísmo e birrefringência)
Importantes para:
a) Diagnóstico de patologias
b) Estabelecimento ordem molecular
Fases da vida celular
Grãos de Amido
IV. Microscopia de Luz: Polarização
Exemplos:
Birrefringência
pode ser
intensificada por
corantes
Colágeno
- Xylidine Ponceau
- Picro-sirius
Cromatina / Matriz Extracelular
- Azul de toluidina
(ordem e agregação molecular )
IV. Microscopia de Luz: Campo Escuro
• Condensador - inclina a luz
de tal modo que ela não
atravessa o objeto
• A luz se dispersa
• Apenas os feixes desviados
pelo objeto percorrem o resto
do sistema (objetivas e
oculares)
Mesentério de rato. Coloração: Picro-sirius (fibras
de colágeno: intensa birrefringência / brilhante /
amarelo)
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IV. Microscopia de Luz: Campo Escuro
É empregada para estudos de pequenos
materiais:
Plâncton
Bactérias
Cristais
Estruturas subcelulares
(fimbrias e flagelos)
Grãos de pólen
IV. Microscopia de Luz: Fluorescência
Outros componentes:
Se ligam a substâncias fluorescentes → fluorocromos → emitem
brilho contra fundo escuro
DNA - verde
Microscopia de campo escuro
da bactéria Leptospira spp
IV. Microscopia de Luz: Fluorescência
Alaranjado de acridina
(fluorocromo)
Divisão celular
RNA - vermelho
Células do testículo de triatomíneos
IV. Microscopia de Luz: Fluorescência
1. Sistema óptico interage com pouca luz:
Propriedade física de
algumas substâncias
absorverem a luz, em
um determinado
comprimento de onda, e
emitirem luz com
comprimentos de onda
maiores e níveis
energéticos mais baixos
Microscopia de fluorescência
mostrando uma célula embrionária de
Caenorhabditis elegans em divisão
IV. Microscopia de Luz: Fluorescência
Luz de mercúrio de alta pressão
2. Sistemas de filtros requeridos para detectar o brilho do material
contra o fundo negro (a. Filtro de excitação; b. Filtro de barragem)
Fonte de luz → Fótons →
Filtro de excitação (seleciona
os fótons de determinado
comprimento) → Objeto →
Emite luz fluorescente →
Filtro de barragem (luz de
excitação é bloqueada) →
Imagem observada (formada
pela luz que atravessa o filtro
de barragem)
Ocular
b. Filtro de barragem
Fonte
de luz
a. Filtro de excitação
Objetiva
IV. Microscopia de Luz: Fluorescência
Fluorescência natural:
Existem componentes celulares ou moleculares naturalmente
fluorescentes
Clorofila
Lignina de parede
vegetal
Elastina
Colágeno
A fluorescência visível neste nudibranqueo é dupla: os
pigmentos verdes próprios da lesma e as algas
vermelhas no seu intestino
Algas (clorofila)
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IV. Microscopia de Luz: Fluorescência
Devido a especificidade de cada tipo de filtro e devido ao
desenvolvimento de vários corantes (fluorocromos) →
muitas são as utilizações da microscopia e fluorescência
Fluorocromos:
Alaranjado de acridina
Eosina
DAPI
Rodamina
Fluoresceina
IV. Microscópios
Princípios da formação da imagem ao Microscópio
Sem
coloração
Diferenças
de índices
de refração
Com
coloração
Cores de
interferência
Emitem brilho contra
fundo escuro
IV. Microscopia de Luz: Fluorescência
Com coloração
fluorescente
IV. Microscopia de Luz: Confocal a laser
Identificação de compostos naturalmente fluorescentes
• 1987 - Disponível mundialmente;
Quantificação (Fluorometria): citoquímica normal e patológica
• Utiliza laser como fonte de luz;
Imunofluorescência: conjugação de anticorpos a fluorocomos que
permite identificação de moléculas específicas
• Visualização: materiais espessos;
corpos inteiros sem coloração prévia
(vivos ou pré-fixados);
Imunocitoquímica
Hibridação “in situ” (FISH)
IV. Microscopia de Luz: Fluorescência
Campo
escuro
• Reconstrução do objeto 3D →
Vários planos focais ou cortes ópticos
(programas computacionais).
IV. Microscopia de Luz: Confocal a laser
Aplicações:
1. Todas as possibilidades já descritas para a microscopia de fluorescência
convencional;
2. Reconstrução 3-D de organismos microscópicos;
3. Aumento de sinais de fluorescência de estruturas subcelulares.
Exs: microtúbulos, miofilamentos, filamentos intermediários e elementos
finos da matriz extracelular
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IV. Microscopia Eletrônica
IV. Microscopia de Luz: Confocal a laser
Início:
Estudos do comportamento ondulatório dos elétrons
Semelhantes a fótons
num sistema de vácuo
Primeiros experimentos:
Década de 1920 → Busch
(elétrons conduzidos por lentes eletromagnéticas)
1931 → Ruska → Primeiro M.E. → Poder de
resolução: 0,5 nm → 25 mil vezes a capacidade do
olho humano
Células em prófase
Ernst August
Friedrich Ruska
Células em apoptose:
condrócitos
IV. Microscopia de Luz: Confocal a laser
IV. Microscopia
Microscopia de Luz
e
Microscopia Eletrônica
Protozoário
Questões importantes: Ampliação e Resolução
Macrófago
IV. Microscopia de Luz: Confocal a laser
Principais
diferenças
Microscópio de luz (ML)
Fonte
Divisão celular / Fuso mitótico
Grãos de Pólen
Microscópio eletrônico
de transmissão (MET)
Luz
(porção inferior)
Elétrons
(porção superior)
Lentes
Vidro
Eletromagnéticas
Lentes de aumento
(principal)
Objetivas e oculares
Eletromagnéticas
Suporte para
amostra
Lâmina de vidro
Grade de metal
(telinha)Cobre ou níquel
Limite de
resolução
0,2 µ
0,0002 µ
Formação da
imagem
Transparência e coloração
Variações de densidade e
contrastação
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IV. Microscopia Eletrônica
O avanço da microscopia eletrônica se deu a partir da descoberta de
que os elétrons tinham comportamento ondulatório semelhante aos
fótons de luz.
IV. Microscopia Eletrônica: Transmissão (MET)
Imagem final ao MET
Eletrodensa (escura) → os elétrons encontram elementos como: ferro,
ósmio, chumbo, ouro
Eletrolúcida (clara) → os elétrons encontram elementos como:
hidrogênio, carbono, oxigênio, nitrogênio
Microscópio Eletrônico de
Transmissão (MET)
Microscópio Eletrônico de Varredura
(MEV)
IV. Microscopia Eletrônica: Transmissão
IV. Microscopia Eletrônica: Transmissão (MET)
Coloração negativa:
vírus
Tecido muscular
Células epiteliais
Cílio
IV. Microscopia Eletrônica: Transmissão (MET)
Principais etapas da preparação das amostras para MET
•Fixação
(glutaraldeído / tetróxido)
•Desidratação
•Inclusão (resinas)
Hepátócito:
Complexo de Golgi
IV. Microscopia Eletrônica: Varredura (MEV)
Scanning Electron Microscopy (SEM)
• Revela feições topográficas da superfície (detalhes)
•Imagens tridimensionais:
- Vermes
- Insetos
- Células livres (animais/vegetais)
- Embriões
- Fragmentos geológicos
• Elétrons secundários / refletidos na superfície da amostra
•Cortes
•Contrastação com
•metais pesados
Guelras de
um peixe
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IV. Microscopia Eletrônica: Varredura (MEV)
Scanning Electron Microscopy (SEM)
• Preparação das Amostras:
• Fixação (glutaraldeído / tetróxido de ósmio;)
• Desidratação;
• Secagem (“ponto crítico”);
IV. Microscopia Eletrônica:
de Alta Voltagem ou Alta Aceleração
• Descrição de estruturas subcelulares (µ)
Ex.: Citoesqueleto
• Aparelho grande: equivalente a um edifício de três andares
- Alta aceleração eletrônica (500 a 1.000 KV)
- Permite estudos de corte grossos
- Reconstrução tridimensional
• Evaporação com ouro na
superfície a ser analisada;
•Não necessita de contrastação.
IV. Microscopia Eletrônica: Varredura (MEV)
Scanning Electron Microscopy (SEM)
IV. Microscopia Eletrônica:
Tunelamento Quântico
• Década de 1980
• Potência visual do olho humano: 1 milhão de vezes
• (100x a capacidade do MET) = Estrutura atômica
• Benning / Rohrer (1986): Prêmio Nobel de Física
• Princípio: todos os corpos:
- Características ondulatórias
- Emissão de energia
Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)
IV. Microscopia Eletrônica:
Tunelamento Quântico
• Agulha que dista da superfície da amostra em 1Å (1 milionésimo de mm)
• Agulha: percorre a superfície da amostra → corrente elétrica (tunelamento)
• Corrente atrai elétrons do material para a agulha → “tunel”
• Agulha passa sobre um átomo → corrente ↑
• Agulha percorre os espaços entre os átomos → corrente ↓
Title: “An Army of One"
Category: Photo Microscopy
Photographer: Freder Medina
• Esses sinais (↑ e ↓) são transmitidos para o computador → imagens ≈ à
superfície de vales e montanhas
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IV. Microscopia Eletrônica:
Tunelamento Quântico
IV. Microscopia Eletrônica: de Força Atômica
Luciano Paulino da Silva, (Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia)
2º. lugar na primeira edição do Prêmio Internacional de Imagens de Microscopia de
Força Atômica.
Superfície
das
células
vermelhas do sangue depois do
tratamento
com
peptídeos
antibióticos,
Única imagem não européia
premiada dentre as mais de 250
inscritas.
Molécula de miosina
Cromossomos
1 milhão de Vezes (100x a capacidade do MET)
=
ESTRUTURA ATÔMICA
O prêmio visa o reconhecimento
da importância das imagens de
microscopia para os avanços da
nanotecnologia em todo o
mundo.
Reportagem publicada no dia 10/09/2007
IV. Microscopia Eletrônica: de Força Atômica
• É semelhante ao Microscópio de Tunelamento Quântico
•Diferença:
- Presença de microespelho
- Feixe de “laser” sobre a agulha
• Menor agressividade à amostra
• Detecção de detalhes de superfície
•Aplicações:
- Obtenção de imagens em solução
- Sequências de reações químicas ou modificações estruturais ao
longo do tempo
http://iecdpgolhosdafe.webnode.com.br/forum/
- Estrutura atômica de biomoléculas
IV. Microscopia Eletrônica: de Força Atômica
Bibliografia Sugerida
• CARVALHO, H. F.; RECCO-PIMENTEL, S. M. A
célula 2001. São Paulo: Manole, 2001. – Capítulo 2
• JUNQUEIRA, L. C.; CARNEIRO, J. Biologia celular e
molecular. 7. ed. Rio de Janeiro: Guanabara
Koogan, 2000. – Capítulo 2
• De ROBERTIS, E. M. F.; HIB, J. Bases da biologia
celular e molecular. 3. ed. Rio de Janeiro:
Guanabara Koogan, 2001.
Imagem de uma plaqueta
obtida por microscopia de
força atómica
Imagem de eritrócitos
obtida por microscopia
de força atómica
• ALBERTS, B. et al. Fundamentos da biologia celular.
Porto Alegre: Artmed, 2004.
14