Apresentação do PowerPoint
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Universidade Federal de Pelotas Programa de Pós Graduação em Agronomia Disciplina de Biotecnologia Aplicada ao Melhoramento Marcadores Moleculares MARCADORES MOLECULARES: AFLP E RFLP Prof. PhD. Antonio Costa de Oliveira Gabriela Lemos Mendes – Doutoranda PPG Biotecnologia Pelotas, abril de 2015 Biotecnologia Aplicada ao Melhoramento Marcadores Moleculares Produção agrícola/agropecuária Variedades com desempenho superior Seleção com base no fenótipo Seleção de indivíduos superiores com base no genótipo Alta produtividade e qualidade MARCADORES MOLECULARES Biotecnologia Aplicada ao Melhoramento Marcadores Moleculares Melhoramento Convencional P1 x Seleção Fenotípica P2 F1 F2 Estresses abióticos e bióticos Biotecnologia Aplicada ao Melhoramento Marcadores Moleculares Com o advento das técnicas de biologia molecular, surgiram metodologias alternativas para detectar o polimorfismo diretamente ao nível de DNA. Biotecnologia Aplicada ao Melhoramento Marcadores Moleculares MARCADORES MOLECULARES Fragmentos de DNA associados/responsáveis por uma característica genética, apresentando uma variação detectável entre indivíduos da população testada (marcador genético) São sequências de DNA que revelam polimorfismos entre indivíduos geneticamente relacionados Um marcador genético ideal deve apresentar uma série de atributos: Alto nível de polimorfismo Herança codominante Estabilidade em diferentes ambientes Distribuídos em todo genoma Biotecnologia Aplicada ao Melhoramento Marcadores Moleculares APLICAÇÕES DOS MARCADORES MOLECULARES Genotipagem de organismos Detecção variabilidade genética Seleção assistida por marcadores Proteção de cultivares Mapas genéticos Biotecnologia Aplicada ao Melhoramento Marcadores Moleculares Bioquímicos Hibridização • Isoenzimas • RFLP • VNTR Enzimas de Restrição • RFLP • AFLP PCR • • • • AFLP SSR RAPD SCAR Etapas da tecnologia dos Marcadores moleculares Hibridização RFLP/ VNTR Amplificação RAPD SCAR SSR AFLP 2-3 2-3 Extração de DNA Corte do DNA com Enzimas de Restrição Separação por Eletroforese dos frag cortados Transferência dos frag DNA para membrana Obtenção e tratamento de Sondas Hibridização da sonda na membrana Exposição da membrana a filme de Raio X Ligação de adaptadores Obtenção/ desenvolvimento primers Amplificação via PCR Separação dos fragmentos amplificados Visualização dos fragmentos em gel agarose Visualização dos fragmentos em gel poliacril. Tempo para resultados Etapa necessária 7-21 1-2 Etapa não necessária 1-2 Biotecnologia Aplicada ao Melhoramento Marcadores Moleculares ENZIMAS DE RESTRIÇÃO Biotecnologia Aplicada ao Melhoramento Marcadores Moleculares ENZIMAS DE RESTRIÇÃO Endonuclease que cliva a dupla fita de DNA sempre que identificar uma sequência particular de nucleotídeos que seja o sítio de reconhecimento da enzima Classificação com base na estrutura, atividade e sítios de reconhecimento • I e III são menos atraentes para biologia molecular • II: Proteínas monoméricas e diméricas e clivam o DNA dentro do sítio de reconhecimento Mecanismo de defesa de bactérias contra bacteriófagos Biotecnologia Aplicada ao Melhoramento Marcadores Moleculares ENZIMAS DE RESTRIÇÃO Biotecnologia Aplicada ao Melhoramento Marcadores Moleculares ENZIMAS DE RESTRIÇÃO Sítio específico de clivagem: 4 a 8 pb Biotecnologia Aplicada ao Melhoramento Marcadores Moleculares Enzimas Organismo Sequência de reconhecimento Tipo de extremidade EcoRI Escherichia coli GAATTC Coesiva BamHI Bacillus amyloliquefaciens GGATCC Coesiva PvuI Proteus vulgaris CGATCG Coesiva PvuII Proteus vulgaris CAGCTG Cega HindIII Haemophilus influenzae AAGCTT Coesiva AluI Arthrobacter luteus AGCT Cega NotI Nocardia otitidis-caviarum GCGGCCGC Coesiva SfiI Streptomyces fimbriatus GGCCNNNNGGCC Coesiva A sequência mostrada corresponde à de uma das fitas, representada na direção 5’ para 3’. As sequências de reconhecimento são palíndromos: quando as duas fitas são consideradas, elas são lidas da mesma maneira em ambas as direções. Biotecnologia Aplicada ao Melhoramento Marcadores Moleculares AMPLIFICAÇÃO DNA Biotecnologia Aplicada ao Melhoramento Marcadores Moleculares PCR- Reação em Cadeia da Polimerase Amplificação do DNA ou cDNA in vitro Kary Mullis - 1993 – Prêmio Nobel de Química 1985 – Primeiras publicações utilizando a técnica Componentes da reação: Água: diluente. Kary Mullis dNTP: A,T,C e G. Taq DNA polimerase: Thermus aquaticus (117 °C / t ótima: 72 °C) MgCl2 Tampão Primers: correspondentes ao gene de interesse. DNA Molde: referente a amostra que se deseja estudar. Biotecnologia Aplicada ao Melhoramento Marcadores Moleculares PCR- Reação em Cadeia da Polimerase ETAPAS DA REAÇÃO Melting (desnaturação): Separação da dupla fita do DNA a ser amplificado Annealing (anelamento ou hibridização) : Primer + DNA a ser amplificado Extension (extensão): Polimerização da cadeia de DNA Etapas da reação de PCR Biotecnologia Aplicada ao Melhoramento Marcadores Moleculares HIBRIDIZAÇÃO DE ÁCIDOS NUCLEICOS Biotecnologia Aplicada ao Melhoramento Marcadores Moleculares Hibridização de ácidos nucléicos Formação de um duplex (dupla fita estável) entre moléculas de fita simples complementares; DNA/DNA (Southern Blot) DNA/RNA (Northern Blot) RNA/RNA (Western Blot) Molécula alvo + Sonda (DNA de fita simples complementar à molécula alvo, conjugada a um repórter) Sonda quente: Radioatividade – 32P Sonda fria: Fluorescência – digoxigenina ou fluoresceína RNA t Biotecnologia Aplicada ao Melhoramento Marcadores Moleculares Hibridização de ácidos nucléicos Visualização da sequência de interesse molécula repórter emite um sinal (cor ou radiação) que poderá ser capturado; Processo de hibridização é influenciado por: N° bases da molécula alvo e conteúdo GC Tempo / Temperatura Especificidade da hibridização Temperatura: Tampão: t especificidade Presença de sais favorece a hibridização cargas são neutralizadas Biotecnologia Aplicada ao Melhoramento Marcadores Moleculares Hibridização de ácidos nucléicos Vídeo Biotecnologia Aplicada ao Melhoramento Marcadores Moleculares MARCADORES MOLECULARES Biotecnologia Aplicada ao Melhoramento Marcadores Moleculares RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism Polimorfismo no comprimento de fragmentos de restrição Enzimas de restrição Hibridização de Ácido Nucléicos Biotecnologia Aplicada ao Melhoramento Marcadores Moleculares RFLP Digestão do DNA genômico com ER Separação dos fragmentos gerados por eletroforese Transferência dos fragmentos desnaturados para suporte sólido Hibridização e visualização mediante autoradiografia Biotecnologia Aplicada ao Melhoramento Marcadores Moleculares RFLP RFLP Polimorfismos gerados Variação na sequência de nt Perdas, inserções ou substituições de sequencias de nt Alterações dos sítios de ER Detectado por diferenças no peso molecular dos fragmentos gerados Biotecnologia Aplicada ao Melhoramento Marcadores Moleculares RFLP Expressão co-dominante Elevado n° distribuídos ao longo do genoma Alta reprodutibilidade Avaliação em qualquer estádio de desenvolvimento Protocolo extenso Mão de obra especializada Grande quantidade de DNA Construção de sonda Estrutura adequada de laboratório Biotecnologia Aplicada ao Melhoramento Marcadores Moleculares RFLP APLICAÇÕES Biotecnologia Aplicada ao Melhoramento Marcadores Moleculares RFLP Biotecnologia Aplicada ao Melhoramento Marcadores Moleculares RFLP Biotecnologia Aplicada ao Melhoramento Marcadores Moleculares AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism Polimorfismo no comprimento de fragmentos amplificados Amplificação de DNA via PCR para detectar diferenças e um conjunto de fragmentos selecionados e digeridos com enzimas de restrição Biotecnologia Aplicada ao Melhoramento Marcadores Moleculares AFLP Digestão TOTAL DNA genômico com 2 ER Ligação de adaptadores Pré- amplificação e amplificação seletiva via PCR Visualização em gel em poliacrilamina Biotecnologia Aplicada ao Melhoramento Marcadores Moleculares AFLP Biotecnologia Aplicada ao Melhoramento Marcadores Moleculares AFLP Vídeo Biotecnologia Aplicada ao Melhoramento Marcadores Moleculares AFLP Grande número de fragmentos Amostragem ampla e simultânea do genoma Flexibilidade Detecção de variabilidade genética (polimorfismo) Não requer informação prévia de sequência de DNA Alta reprodutibilidade Marcadores dominantes Mão-de-obra especializada Pureza do DNA genômico Biotecnologia Aplicada ao Melhoramento Marcadores Moleculares AFLP APLICAÇÕES Biotecnologia Aplicada ao Melhoramento Marcadores Moleculares AFLP Biotecnologia Aplicada ao Melhoramento Marcadores Moleculares AFLP Biotecnologia Aplicada ao Melhoramento Marcadores Moleculares http://cgfufpel.org/ Biotecnologia Aplicada ao Melhoramento Marcadores Moleculares OBRIGADA [email protected]
