fisiologia animal - Universidade de Coimbra

DEPARTAMENTO DE ZOOLOGIA
FACULDADE DE CIÊNCIAS E TECNOLOGIA
UNIVERSIDADE DE COIMBRA
FISIOLOGIA ANIMAL
AULA 1
GERAÇÃO DE POTENCIAIS ELÉCTRICOS DE MEMBRANA
ARMANDO CRISTÓVÃO, PAULO SANTOS
2004
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Experiências a realizar
Parte A. Utilização da câmara de Ussing
1. Potenciais eléctricos de membrana gerados por gradientes de K+.
2. Desenvolvimento do equilíbrio electroquímico
3. Geração de potenciais eléctricos por gradientes iónicos de Na+ e de K+ existentes na
célula.
Parte B. Simulação com o programa de computador Goldman
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PARTE A
Geração de Potenciais Eléctricos de Membrana na Câmara de Ussing
O desenvolvimento do potencial eléctrico de repouso da célula nervosa pode ser estudado
com o modelo da câmara de Ussing que é constituída por dois compartimentos separados por
uma membrana selectivamente permeável (Fig.1).
Na aula prática irão ser determinados os potenciais através duma membrana selectivamente
permeável a catiões que separa duas soluções iónicas de concentrações diferentes. Para medir
os potenciais desenvolvidos, irão ser utilizados eléctrodos de AgCl ligados a um galvanómetro
(Fig.1). Os potenciais obtidos experimentalmente irão ser comparados com os valores calculados
com a equação de Nernst.
Figura 1 - Sistema para determinação de potenciais de membrana constituído pela
câmara de Ussing1, eléctrodos de AgCl2 e galvanómetro3.
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Experiência 1
Potenciais eléctricos de membrana gerados por gradientes de K
+
Procedimento experimental
Determine os potenciais eléctricos gerados através da membrana da câmara de Ussing nas
condições da Tabela I
1.1. Prepare as soluções de KCl de que necessita por diluição da solução 1 M de KCl.
1.2. Adicione, com uma proveta, 100 ml de cada uma das soluções indicadas na Tabela I às
câmaras de Ussing.
1.3. Introduza os eléctrodos nas câmaras e ligue o eléctrodo da câmara A à posição
“ELEKTRODE”, e o eléctrodo da câmara B à posição “BEZUGSELEKTRODE”.
1.4. Leia no galvanómetro o valor do potencial (seleccione a escala de 140 mV). Tenha atenção à
polaridade desta escala.
1.5. Repita a leitura ao fim de um minuto e anote os valores na Tabela I.
Tabela I
Potencial eléctrico (mV)
KCl (M)
Câmara A
Medido
Câmara B
0,01
0,01
0,01
0,001
0,1
0,001
0,1
0,01
0 min
Teórico
1 min
Concentração Actividade
Cálculo do potencial eléctrico
1.6. Calcule com a equação de Nernst os potenciais eléctricos esperados nas condições da
Tabela I. Considere que a câmara A corresponde ao meio intracelular e a câmara B ao meio
extracelular.
RT
[K+ ]
ext.
ln
Equação de Nernst : E K =
zF [K+ ]int.
R é a constante dos gases perfeitos (1,987 cal/ºK.mol ), T é a temperatura na escala de Kelvin
(0 ºC = 273 ºK), z é a valência do ião, e F é a constante de Faraday (23060 cal/V.mol).
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1.7. Provavelmente os valores dos potenciais que calculou são significativamente diferentes dos
valores determinados experimentalmente. Note que na equação de Nernst deve utilizar
actividades e não concentrações. Torne os seus cálculos mais exactos sabendo que a
actividade é igual à concentração do ião vezes o coeficiente de actividade. Utilize os valores
dos coeficientes de actividade da Tabela II para corrigir os seus cálculos na Tabela I.
Tabela II
Coeficientes de actividade de soluções de KCl e de NaCl
0,001 M
0,01 M
0,1 M
KCl
0,965
0,902
0,771
NaCl
0,966
0,906
0,786
1.8. Que factores são necessários para que haja desenvolvimento do potencial eléctrico através
da membrana? Que factor determinou a grandeza do potencial eléctrico?
Experiência 2
Desenvolvimento do equilíbrio electroquímico
Procedimento experimental
2.1. Adicione 100 ml de KCl 0,15 M à câmara A e 100 ml de H2O à câmara B
2.2. Coloque os eléctrodos nas câmaras e ligue o galvanómetro na escala de 140 mV.
2.3. Registe na Tabela III os potenciais obtidos nos tempos indicados.
Tabela III
Tempo
Potencial eléctrico (mV)
(min)
0
1
2
3
5
10
5
2.4. Explique as alterações do potencial eléctrico ao longo do tempo. Acha que o mesmo
aconteceria na mambrana celular? Porquê?
Experiência 3
+
+
Geração de potenciais eléctricos por gradientes iónicos de Na e de K existentes na célula
3.1. Planeie experiências para determinar os potenciais de equilíbrio devidos aos gradientes de
K+ e de Na+ existentes numa célula nervosa. Considere que a câmara A corresponde ao
meio intracelular e a câmara B ao meio extracelular. Complete a Tabela IV com os valores
obtidos.
3.2. Calcule os potenciais esperados com a equação de Nernst.
Tabela IV
Câmara A
Câmara B
Potencial eléctrico (mV)
(intracelular)
(extracelular)
Medido
Teórico
K+ (mM)
Na+ (mM)
3.3. Relacione os valores dos potenciais obtidos experimentalmente com os valores do potencial
de membrana da célula nervosa durante repouso e no pico do potencial de acção. Que
conclusões pode tirar acerca da permeabilidade da membrana durante repouso e durante o
potencial de acção?
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Simulação do desenvolvimento do potencial eléctrico de membrana
com o programa de computador Goldman
PARTE B
O potencial eléctrico de membrana de um neurónio pode ser determinado com a equação de
Goldman que considera as contribuições de todos os iões a que a membrana é permeável.
Equação de Goldman: Vm =
RT PK [ K + ]ext . + PNa [ Na + ]ext. + PCl [Cl − ]int.
ln
zF PK [ K + ]int. + PNa [ Na + ]int. + PCl [Cl − ]ext .
O programa "Goldman" permite determinar os potenciais de equilíbrio dos iões Na+, K+ e Cl-, e o
potencial de membrana quando se varia a concentração ou a permeabilidade da membrana
àqueles iões.
Experiência 1
1.1. Determine os potenciais eléctricos da membrana do axónio gigante da lula nas várias
condições indicadas na Tabela I. (Note os valores das concentrações intra- e extracelulares
de Na+ e K+ no caso dum animal marinho).
Tabela I
K+
[intra]
[extra]
(mM)
(mM)
1
400
20
2
400
3
Na+
g/g(K)
Vm
[intra]
[extra]
g/g(K)
(mM)
(mM)
1
50
440
0,04
40
1
50
440
0,04
400
60
1
50
440
0,04
4
400
20
1
50
220
0,04
5
400
20
1
50
110
0,04
6
400
20
1
50
220
20
7
400
20
1
50
220
0,01
(mV)
1.2. Relacione as alterações do potencial de membrana verificadas com as alterações das
concentrações de Na+ e de K+.
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1.3. Calcule, utilizando a equação apropriada, o potencial de membrana que se esperaria com os
parâmetros indicados na experiência 1 da Tabela I.
Experiência 2
2.1. Determine os potenciais eléctricos da membrana do axónio de um mamífero terrestre, obtidos
com as várias condições indicadas na Tabela II. (Nota: Altere a concentração intracelular de
Cl- para 4 mM, e a extracelular para 103 mM, e o quociente g/g(K) para 0,0).
Tabela II
K+
[intra]
[extra]
(mM)
(mM)
1
148
5
2
148
3
Na+
g/g(K)
Vm
[intra]
[extra]
g/g(K)
(mM)
(mM)
1
10
142
0,03
10
1
10
142
0,03
148
20
1
10
142
0,03
4
148
5
1
10
71
0,03
5
148
5
1
10
142
20
6
148
5
1
10
142
0,01
7
148
50
1
10
142
0,03
(mV)
2.2. Calcule, utilizando a equação apropriada, o potencial de membrana teórico que se esperaria
com os parâmetros indicados na experiência 1 da Tabela II. (Nota: Tenha em atenção a
temperatura do animal).
2.3. Um dos métodos utilizado para estimular neurónios em cultura é aplicar uma solução
contendo 50 mM de KCl. Tendo em atenção os resultados obtidos, explique como essa
solução estimula as células.
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