resumo expandido indução experimental de recombinação gênica

RESUMO
19ªEXPANDIDO
RAIB
156/387 169
INDUÇÃO EXPERIMENTAL DE RECOMBINAÇÃO GÊNICA ENTRE ESTIRPES DO
VÍRUS DA BRONQUITE INFECCIOSA EM FRANGOS DE CORTE
I.L. Santos, D.G. Conceição, A.G. Caetano, M.F.S. Montassier, H.J. Montassier
Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, Departamento de Patologia
Veterinária, Laboratório de Virologia e Imunologia Veterinária, Via de Acesso Prof. Paulo Donato Castellane
s/no, CEP 14884-900, Jaboticabal, SP, Brasil. E-mail: [email protected]
RESUMO
O presente projeto de pesquisa teve como propósito principal investigar o fenômeno da
recombinação gênica entre estirpes isoladas de campo do vírus da bronquite infecciosa (VBI) e a
amostra de referência M41 desse mesmo vírus. Para tanto, foram realizados protocolos de coinfecção combinando-se as estirpes de campo VBIPR06 e VBISP02 com a de referência do VBI
(M41) em frangos de corte, oas 21 dias de idade que foram mantidos em isoladores com pressão
positiva. Amostras de traquéia foram colhidas, 5 dias após a co-infecção para o re-isolamento de
vírus e também para a extração do RNA genômico viral, seguindo-se a preparação do cDNA (RT)
e a amplificação do gene de glicoproteína S1 do VBI. O produto amplificado foi posteriormente
purificado e submetido à análise por RFLP com as enzimas de restrição Hae III, Bsty I e Xcm I.
Duas das estirpes derivadas da co-infecção demonstraram perfis de RFLP distintos das estirpes
parentais que foram combinadas para fazer a co-infecção, indicando que houve recombinação in
vivo, após a realização do protocolo de co-infecção em frangos de corte de criações comerciais
que foram inoculados com uma estirpe de referência do VBI (M41) juntamente com um dos
isolados de campo deste mesmo vírus.
PALAVRAS-CHAVE: Vírus da bronquite infecciosa, recombinação gênica, técnica RFLP.
ABSTRACT
EXPERIMENTAL INDUCTION OF GENETIC RECOMBINATION BETWEEN STRAINS OF
THE INFECTIOUS BRONCHITIS VIRUS IN BROILERS. The objective of this study was to
investigate the phenomenon of genetic recombination between IBV strains, analyzing the coinfection of a field isolate of infectious bronchitis virus (IBV) combined with the reference strain
M41 of this virus. Protocols of co-infection combining the field isolates VBIPR06 and VBISP02
with the reference M41 strain were performed in chickens housed in isolators maintained under
positive pressure and air filtration. Samples of trachea were collected, after 5 days of co-infection,
for virus re-isolation and for extraction of viral RNA, which was processed by RT-PCR in order
to amplify the entire gene of S1 glycoprotein of IBV. The amplicons were purified and submitted
to RFLP analysis, using the enzymes Hae III, Bsty I and Xcm I. Two of the viral strains derived
from the co-infection showed RFLP profiles different from those recorded for the IBV parental
strains which were originally combined, indicating that the recombination occurred in vivo
after the co-infection of commercial broilers with a reference IBV strain and a field isolate of this
virus.
KEY WORDS: Infectious bronchitis virus, protection test, field variants.
INTRODUÇÃO
O vírus da bronquite infecciosa das galinhas
(VBIG) pertence à ordem Nidovirales, e à família
Coronaviridae, estando classificado no gênero
Coronavírus. Quanto à morfologia, o VBIG é
pleomórfico, apesar da predominância de partículas
esféricas, com aproximadamente 120 nm de diâmetro
(CAVANAGH & NAQI, 1997). O genoma do VBI é forma-
do por RNA fita simples cauda de poli-adenosina e
não é segmentado com polaridade positiva e tem aproximadamente 27,6 Kb, codificando 3 proteínas estruturais mais importantes: a nucleoproteína (N), uma
proteína fosforilada do nucleocapsídeo interno e externamente, pelas glicoproteínas da matriz (M) e da
espícula (S), sendo essa última é clivada após ser
traduzida em duas subunidades, S1 e S2. Salienta-se
que o glicopolipeptídeo S1 é responsável pela
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infectividade viral e que possui determinantes
antigênicos que induzem a formação de anticorpos
neutralizantes. A variação na composição de
aminoácidos de algumas regiões da glicoproteína S é
a principal estratégia do VBIG para escapar dos mecanismos de defesa do hospedeiro (CAVANAGH et al.,
1992; C OOK et al., 1999; M URPHY et al., 1999). A
glicoproteína S possui um papel biológico de elevada
relevância para o patógeno viral por ser a principal
indutora da resposta imune protetora contra a infecção pelo VBI, sendo por isto, de fundamental importância na imunoprofilaxia para a BIG e, em segundo
lugar, ela é a base dos testes de diagnósticos que têm
sido utilizados para identificar e caracterizar as diferentes amostras desse vírus (COOK et al., 1999; ROCHA,
2000; RESENDE, 2003).
Várias amostras de VBIG isoladas em plantéis
vacinados no Estado de São Paulo, durante 1987 a
1991, apresentaram pouca relação sorológica com o
sorotipo Massachusetts, especialmente a estirpe M41
(ROCHA, 2000). RESENDE (2003), avaliando 15 isolados
de VBIG oriundos de surtos de BIG que ocorreram em
diferentes granjas do Estado de Minas Gerais, entre
1972 a 1989, através da técnica de RT-PCR/RFLP
(polimorfismo do comprimento de fragmentos de restrição), tendo classificado os isolados em 3 grupos,
sendo que nove desses isolados foram reunidos no
genótipo Massachusetts e os outros 2 genótipos agruparam seis isolados considerados variantes por esse
estudo. Nesse trabalho de genotipificação, nenhum
dos 15 isolados foi classificado no genotipo/sorotipo
Connecticut ou Arkansas. Como descrito anteriormente
o uso da técnica RT-PCR no gene S1 (KWON et al., 1993)
e da RT-PCR/ RFLP no gene S1 (LIN et al., 1991) são
métodos comumente utilizados no diagnóstico
laboratorial do VBI.
Ainda dentro do contexto da variabilidade genética desenvolvida pelo VBIG, que possui um extenso
genoma, sabe-se que ela ocorre principalmente através de mutação e recombinação gênica. Essa variabilidade confere a esse agente viral uma vantagem
evolutiva considerável uma vez que esse vírus além
de manter a sua estabilidade genética, é capaz de gerar uma progênie com grande diversidade antigênica
superficial, que favorece esse patógeno a sobrepujar
mais facilmente os mecanismos de imunidade do hospedeiro (MURPHY et al., 1999; RESENDE, 2003). A pressão
seletiva induzida pelo “status imunitário” dos organismos hospedeiros pode contribuir significativamente para o surgimento de amostras variantes
(MARTINS, 1992) e, pequenas variações nas regiões
hipervariáveis podem resultar em diferenças
detectáveis em teste de vírus-neutralização (VN). Algumas amostras que foram consideradas sorotipos
diferentes nesses testes, mostraram diferença de apenas 2% a 3% na seqüência de aminoácidos da
subunidade S1 (CAVANAGH et al., 1992).O vírus da bronquite infecciosa (VBI) é o agente etiológico da bronquite infecciosa (BI) e causa uma enfermidade aguda
e altamente contagiosa em galinhas, afetando de forma mais acentuada o sistema respiratório e uro-genital
das aves acometidas. A infecção pelo VBI está distribuída amplamente em várias regiões do mundo. Trata-se, também de um patógeno viral cujas conseqüências da infecção por ele produzidas, trazem sérios
prejuízos econômicos à atividade avícola industrial
(CAVANAGH & NAQI, 1997).
Várias amostras japonesas, européias e americanas do VBI têm sido descritas como sendo
recombinantes (CAVANAGH et al., 1992; JIA et al., 1995;
WANG et al., 1993). Foi demonstrado que os isolados
americanos apresentavam uma homologia de 95%
com a seqüência da proteína S1 do sorotipo
Massachussets 41, sendo que as recombinações
sugeridas para o VBI ocorreram mais freqüentemente
no gene da proteína S (CAVANAGH et al., 1992; JIA et al.,
1995).
Em vista desses fatos que evidenciam a importância do fenômeno de variabilidade genética entre estirpes do VBIG, foi realizado o presente estudo, em aves
SPF, com o objetivo principal de se induzir experimentalmente e estudar a recombinação gênica entre
uma estirpe de referência (M41) e outra isolada de
campo desse mesmo vírus, como por exemplo as estirpes VBIPR06 e VBISP02, sendo para tanto utilizada as técnicas de RT-PCR e de RFLP (“Restriction
Fragment Length Polymorphism”), seguido pela análise dos mapas de restrição do gene S das estirpes
geradas por co-infecção em comparação com as estirpes de referência do VBI, interpretando os resultados
da RFLP e do processo de indução de estirpes
recombinantes do VBI, possibilitando que o fenômeno da recombinação entre diferentes estirpes do VBI
seja evidenciado.
MATERIAL E MÉTODOS
Na tentativa de induzir recombinação gênica no
VBI, foram realizados diversos protocolos de co-infecção combinando-se estirpes de campo do VBI
(VBIPR06 e VBISP02) com uma de referência desse
mesmo vírus (M41) em frangos de corte com 21 dias
de idade mantidos em isoladores com pressão positiva e fornecimento de ar purificado por filtração absoluta. O processo de co-infecção nessas aves foi feito
através da inoculação das estirpes de referência M41
e do isolado de campo VBIPR06 por via óculo-nasal
em 8 aves de corte com 21 dias de idade, que foram
alojadas em um isolador com pressão positiva e fornecimento de ar purificado por filtração absoluta.
Como o título da estirpe M41 era igual a 109,74 DIE50/
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mL, este vírus foi ressuspendida na razão 1:550.000,
de forma que fossem inoculadas de 104 DIE50/mL. Já,
da estirpe VBIPR02 cujo título infectante era igual a
107,86 DIE50 /mL, foram preparadas duas diluições (I e
II), sendo que a diluição I correspondeu a razão 1:72
enquanto que a diluição II correspondeu a razão
1:7200. No isolador 1 foram co-infectadas 4 aves contendo a suspensão com a diluição final da estirpe M41
juntamente com a diluição I da estirpe VBIPR06 e as
outras 4 aves foram co-infectadas com a mesma estirpe de referência (M41), porém este vírus foi reunido a
diluição II da estirpe VBISP02. Em ambas combinações foram inoculados 100 mL dessa mistura por ave.
Procedimentos similares foram realizados para se fazer a co-infecção da estirpe de referência M41 com
duas outras isoladas de campo, como a VBIPR06 e
VBISP02 e, foi ainda realizada uma tentativa de coinfecção de contato, colocando-se 2 aves dentro do
isolador onde havia aves infectadas separadamente
com uma dessas três estirpes. Em todos os grupos
experimentais de co-infecção descritos acima foi
sacrificada metade das aves no terceiro dia pós-infecção (dpi) e a outra metade foi sacrificada no quinto dia
pós-infecção por deslocamento cervical, uma vez que
os tecidos que servem para análise da patogenicidade
viral (traquéia , pulmão e rim) não podem sofrer qualquer modificação durante a eutanasia. Amostras
teciduais foram colhidas para serem processadas nas
técnicas de biologia molecular (extração de RNA, RTPCR) e tentativa de re-isolamento, por meio da
inoculação em ovos embrionados SPF.
As extrações de RNA total foram realizadas a partir de amostras teciduais e de LCA através da utilização de um kit de extração (Trizol) conforme as
especificações do fabricante. Cada pool de órgãos
obtidos das aves infectadas experimentalmente foi
processado como uma amostra. O RNA total extraído
foi submetido à reação de transcrição reversa (RT) com
kit Superscript e Random Primers, em seguida à reação de RT-PCR com a utilização do kit Platinum PCR
e um par de primers KWON+ e KWON - obtidos através do trabalho realizado por KWON et al. (1993) - que
estão localizados nas extremidades 5’ e 3’ do gene S1
do VBI, sendo a reação conduzida em um
termociclador. Os produtos amplificados foram detectados após eletroforese em gel de agarose a 1%, que
foi corado com brometo de etídeo e depois observado
em transiluminador UV e foto-documentado.
Os produtos amplificados foram quantificados e
depois de purificados para depois serem analisados
pela técnica de RFLP, consoante recomendam KWON
et al. (1993), tendo sido, em resumo, submetidos à digestão separadamente com as enzimas HaeIII, XcmI
ou BstyI e seguindo-se as instruções dos fornecedores
de tais enzimas. Os fragmentos finais da digestão com
essas enzimas de restrição foram separados por
eletroforese em gel de agarose e processados como foi
descrito acima.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Foram observados nas aves vivas e principalmente com 5 dpi, a presença de sinais clínicos evidentes
de bronquite infecciosa, como dificuldade respiratória, tosse, espirro e estertores e, após o sacrifício, foram observadas ainda lesões macroscópicas na traquéia e, principalmente, a aerossaculite.
A extração de RNA genômico viral e a técnica de
RT e a de PCR demonstraram-se eficazes conforme
nosso propósito, sobretudo com relação aos primers
escolhidos que permitiram a amplificação do gene S1
que se constitui numa região de grande variabilidade
antigênica do VBI, que resultou na amplificação de
um fragmento com cerca de 1720 pb em todas as amostras testadas neste experimento. As bandas dos produtos das amostras de PCR ficaram muito fortes, em
comparação com o padrão Low Mass, possibiltando
uma diluição posterior adequada para realização da
restrição enzimática desse material (Fig. 1).
De algumas das amostras de traquéia provenientes
das aves submetidas à co-infecção foram detectados
produtos amplificados do gene da glicoproteína S1 do
VBI, que, na técnica de RFLP, revelaram diferenças
marcantes nos perfis dos fragmentos gerados pela
clivagem com as enzimas de restrição nesse caso usadas. Assim, verifica-se que no protocolo de co-infecção
múltiplo com a combinação das estirpes M41, VBIPR06
e VBISP02, obteve-se uma estirpe viral com perfil, à
clivagem com a enzima HaeIII bem distinto daqueles
que são apresentados pelas estirpes parentais. Nesse
caso, foi detectadas a presença de produtos de clivagem
com a enzima HaeIII diferentes daqueles que são normalmente gerados pela ação dessa mesma enzima sobre o gene S1 de cada uma dessas estirpes parentais
(M41 x Isolados de campo do VBI). Houve, assim a
presença, de algumas bandas cortadas em locais diferentes, daqueles esperados para as estirpes parentais
usadas no processo de co-infecçção, como no caso da
ave que não foi inoculada e funcionou como contato
desse processo de co-infecção com as estirpes virais
M41, VBIPR06 e VBISP02, o que representa um forte
indício de que o fenômeno da recombinação gênica
possa ter ocorrido (Figura 2). Ficou evidenciado nesse
estudo que o gene codificador da glicoproteína S1 é o
principal alvo da ocorrência de recombinação tal como
havia sido observado em investigações anteriores
(CAVANAGH et al., 1992; JIA et al., 1995) e foi destacado
que este fenômeno pode ocorrer em condições de campo, já que um dos protocolos de co-infecção, simulou a
via natural de contágio, que se dá por contato com aves
infectadas com o VBI.
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Fig. 1 - Gel de agarose 1,5%, da reação do produto de
PCR, realizada com os primers sense Kwon + e Kwon Legenda: (M) Marcador 1Kb plus, (1)Estirpe M41; (2) Isolado VBIPR06; (3) Isolado VBIPR02; (4)Produto Amplificado do protocolo I da co-infecção em ovos embrionados
(M41 + VBISP02); (5)Produto Amplificado do protocolo II
da co-infecção em ovos embrionados (M41 + VBISP02);
(6) Produto Amplificado do protocolo I da co-infecção
em ovos embrionados (M41 + VBIPR06; (7) Produto Amplificado do protocolo II da co-infecção em ovos
embrionados (M41 + VBIPR06); (8) Produto Amplificado
do protocolo I da co-infecção em ovos embrionados (M41
+ VBIPR02. 9) Low Mass e (10) Controle de LCA.
CONCLUSÃO
Ficou, neste estudo, comprovado que, com a utilização das diluições descritas anteriormente para
combinar diferentes estireps do VBI para realizar o
protocolo de co-infecção, o fenômeno da
recombinação tenha ocorrido, podendo-se concluir as
estirpes virais tiveram facilidade de interação e de
fazer trocas de seqüências gênicas (recombinação),
uma vez que a digestão com pelo menos uma das três
enzimas testadas produziram clivagens no gene S1
em diferentes regiões daquelas que são clivadas nas
estirpes parentais, embora deva-se salientar que para
confirmar a ocorrência do fenômeno da recombinação
gênica deve-se fazer o seqüenciamento genético das
estirpes parentais e das estirpes recombinantes, avaliando-se de forma comparativa as seqüências obtidas, principalmente do gene S1, nos pontos que estão
mais sujeitos à ocorrência de recombinação.
AGRADECIMENTOS
À FAPESP, ao CNPq e à MERIAL.
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Fig. 2 - Gel de agarose 1 %, da reação de RFLP do produto
PCR purificado proveniente de co-infecções em aves. Legenda: (M) Marcador 1Kb plus, (1) (8) (15) Amostra tecidual
de ave contato / co-infecção (M41 + VBISP02 + VBIPR06);
(2) (9) (16) Ave co-infectada com M41 + VBIPR06; (3) (10)
(17) Ave co-infectada com M41 + VBISP02 I; (4)(11)(18)
Ave co-infectada com M41 + VBISP02 II; (5) (12) (19) Ave
co-infectada com M41 + VBISP02 II; (6) (7) (13) (14) Amostra Controle. (
) Fragmentos novos contendo possíves
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