Resumo final_eliana - PUC

Anais do XIX Encontro de Iniciação Científica – ISSN 1982-0178
Anais do IV Encontro de Iniciação em Desenvolvimento Tecnológico e Inovação – ISSN 2237-0420
23 e 24 de setembro de 2014
DESENVOLVIMENTO DE TRÊS BIOSSENSORES A BASE DE
TIROSINASE E DIFERENTES NANOPARTICULAS PARA
DETERMINAÇÃO DE COMPOSTOS FENÓLICOS.
Eliana Rezende Kray de Almeida
Renata Kelly Mendes Valente
Faculdade de Química
Ceatec
[email protected]
Metrologia Química,Quimiometria e Química
Analítica-Ceatec
[email protected]
RESUMO:
A utilização de nanopartículas no desenvolvimento de
biossensores permite uma amplificação da resposta
eletroquímica e, consequentemente, elevação da
sensibilidade do dispositivo. Na literatura, há diversos
estudos mostrando este efeito, mas não há um estudo comparativo entre os diferentes tipos de nanopartículas e sua influência na resposta avaliada. Neste
contexto, o trabalho tem como objetivo o estudo da
influência do uso de diferentes nanopartículas na
resposta de um biossensor para a determinação de
compostos fenólicos em amostras de interesse ambiental.
Palavras-chave: Biossensores, compostos fenólicos,
nanopartículas.
Área do Conhecimento: Ciências Exatas e da Terra
– Química - CNPq
1. INTRODUÇÃO
Fenol e seus derivados são encontrados em diversos processos industriais, como produção de: plásticos, corantes, tintas, drogas, polímeros sintéticos,
resinas, detergentes, desinfetantes, refinaria de petróleo, mas principalmente de papel e celulose, sendo também responsáveis pelas propriedades organolépticas de flores e frutas. Mesmo em baixa concentração, os compostos fenólicos são preocupantes,
devido sua alta toxicidade bem como gosto e odor
desagradáveis em águas de abastecimento público
[1].
Para proteção ambiental e controle destes efluentes
industriais, estão sendo cobradas medidas rápidas e
eficientes por órgãos governamentais ou pesquisadores ligados à área de poluentes e contaminação ambiental. Neste contexto, estudos envolvendo o uso de
biossensores para esta finalidade têm aumentado a
cada ano devido às suas características interessantes, tais como análises precisas, exatas, seletivas
envolvendo simplicidade e rapidez associadas a bai-
xos custos de obtenção. Um biossensor pode ser
definido como um dispositivo analítico que incorpora
um elemento biológico, como enzima, tecido animal
ou vegetal, microorganismo, antígeno ou anticorpo,
ácidos nucleicos, entre outros, com um transdutor
analítico que produz um sinal proporcional à concentração da espécie de interesse. O transdutor converte a reação entre o material biológico e o substrato
em uma resposta mensurável, como corrente elétrica, no caso se sensores eletroquímicos [2].
Dentre os biossensores, os mais utilizados são os
que usam enzima como bioreconhecedor e denominados de enzimáticos, devido à especificidade da
medida analítica e versatilidade na obtenção do dispositivo [3]. Podem ser utilizados vários tipos de enzimas, no caso do trabalho foi a tirosinase extraída
do inhame, que por sua vez foi designado o melhor
vegetal para detecção de compostos fenólicos em
efluentes industriais [4].
No entanto, na construção de biossensores, uma das
etapas mais críticas se refere à imobilização do bioelemento na superfície, de maneira que haja manutenção da atividade enzimática por um período longo
de resposta. O uso de nanopartículas no processo de
imobilização é uma metodologia que tem sido destacada, pois há comprovação de que os nanomateriais
aumentam a área superficial, permitindo que quantidades maiores de material biológico sejam incorporadas à superfície sensora, consequentemente, incrementando a sensibilidade do aparato, que permite
análises de fenóis com menores limites de detecção
[5].
Neste contexto, o trabalho teve como objetivo avaliar
a influência de diferentes nanopartículas (Fe2O3, ZnO
e SiO2) na resposta de biossensores para a determinação de compostos fenólicos em amostras de águas residuais, a fim de selecionar aquela que apresentou os melhores resultados analíticos.
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2. METODOLOGIA
2.1 Materiais e Equipamentos
Os equipamentos utilizados para a execução do
projeto foram: Balança de precisão Shimadzu AW
220, Centrífuga Excelsa II Modelo 206 MP Fanem,
Espectrofotômetro UV/Vis HP Agilent 8453, pHmetro
Digimed DM 20 e Potenciostato PGSTAT 101, Metrohm. Os reagentes utilizados foram: Solução
Guaiacol 2% (Dinâmica), Óleo Mineral Nujol®
(Mantecorp), Fosfato de sódio bibásico heptahidratado P.A (Synth) e Fosfato de potássio monobásico
P.A (Synth), Peróxido de Hidrogênio (Dinâmica), Pó
de Grafite (Aldrich).Nanopartículas de Fe2O3 ,ZnO e
SiO2 (cedidas pela Prof. Elizabeth F. de Souza)
2.2 Obtenção do extrato enzimático
Após a lavagem e secagem, 25 g de inhame descascado foram picados e homogeneizados em um
liquidificador com 100 mL de tampão fosfato 0,1
-1
mol.L – pH 6,5 e pH 7,0 - devido ao fato da enzima ser sensível a variações de pH do meio e
estas ocasionando a desprotonação de seus sítios ativos e a conseqüente inutilização da enzima. Em seguida, o extrato foi filtrado em quatro
camadas de tecido – gaze - e centrifugado a
25000xg – 1800 rpm – durante 20 min, a 4 oC. A
solução sobrenadante foi dividida em diversas
o
alíquotas, armazenadas em freezer a 5 C e usadas como fonte de tirosinase.
2.3. Preparação do biossensor usando partículas
magnéticas de Fe2O3
Antes de se adicionar as nanopartículas à pasta de
carbono, deve-se lavá-la com uma solução tampão
adequada. A lavagem foi feita com a adição de 100
µL de tampão a 50 µL da nanopartícula em um frasco Eppendorf. Agitou-se a mesma por um minuto e,
com o auxílio de um ímã, separou-se as partículas da
água de lavagem, umas vez que as mesmas são
magnéticas e, portanto, atraídas pelo imã [6]. Repetiuse a lavagem por três vezes. Após a lavagem, adicionou-se 200 µL de enzima às partículas. Agitou-se por
um minuto e o Eppendorf foi colocado na geladeira
por 30 minutos e a cada cinco minutos, agitou-se
para garantir que a enzima interagisse com as nanopartículas. Após completar-se o tempo, separaram-se
as partículas do líquido enzimático e adicionaram-se
as mesmas ao pó de grafite. A pasta de carbono foi
obtida a partir da homogeneização de 0,1875 g de pó
de grafite com a partícula modificada com a enzima,
em um almofariz com pistilo durante 20 minutos.
Em seguida, foram adicionados três gotas de óleo
aglutinante Nujol e homogeneizados por mais 20
minutos. A pasta resultante foi inserida em um tubo
de vidro e após isto, a ponta com a pasta foi alisada
em uma folha de sulfite e foi colocado na extremidade superior do tubo de vidro um fio de cobre para o
contato elétrico.
O pó de grafite foi escolhido devido ao seu baixo
custo, baixa capacidade de adsorção de oxigênio e
baixas impurezas eletroativas.
2.4. Preparação do biossensor usando nanopartículas de ZnO ou de SiO2
A imobilização foi feita da seguinte maneira: em um
Eppendorf, colocou-se 200 µL de nanoparticulas e
200 µL da enzima tirosinase, agitou-se por um minuto. O Eppendorf foi colocado na geladeira por 30 minutos e a cada cinco minutos agitou-se para garantir
que a enzima interagisse com as partículas. Após
completar-se o tempo, adicionaram-se as mesmas ao
pó de grafite. A pasta de carbono foi obtida da mesma maneira descrita na seção 2.3.
2.5 Estudo da repetibilidade de medidas dos biossensores
O estudo de repetibilidade foi realizado a fim de verificar qual nanopartícula construía biossensores que
apresentava respostas eletroquímicas mais estáveis,
ou seja, que não decresciam com o tempo nas
mesmas condições experimentais.
Para se realizar o estudo, construiu-se o biosssensor
com a melhor quantidade de nanopartícula e realizou
cinco medições na mesma solução, em sequencia,
sem a necessidade de troca da pasta. O estudo foi
realizado para biossensores contendo, cada um, nanopartícula de Fe2O3, ZnO e SiO2, respectivamente,
-1
em solução com 5 mL do tampão fosfato 0,1 mol.L
-1
pH 7,0 e 1,8 mmol.L de guaiacol.
2.6 Estudo da reprodutibilidade de preparação
dos biossensores
O estudo de reprodutibilidade é necessário para verificar se o procedimento de preparação dos dispositivos está sendo realizado corretamente e não causa
variações significativas nas medições quando usados
dispositivos preparados em momentos diferentes.
Para isso, foram construídos três biossensores para
cada nanoparticula avaliada (Fe2O3 , ZnO e SiO2) e
realizou uma medida eletroquímica para cada sensor
em solução tampão fosfato pH 7,0 contendo solução
-1
de guaiacol 1,8 mmol.L . Com isso, pode-se averiguar qual nanopartícula prepara biossensores com
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maior repetição de medida, mesmo sendo produzido
em períodos distintos.
2.7 Determinação de compostos fenólicos em
amostras de interesse ambiental
Contaminou-se uma amostra de água residual industrial com solução de guaiacol e mediu se a corrente elétrica desta amostra usando cada um dos
biossensores. Então, substituiu o valor desta corrente
na equação da reta do respectivo biossensor e encontrou-se o valor da concentração de guaiacol na
amostra. Os resultados dos biossensores de cada
nanopartícula foram comparados, a fim de se determinar o que produzia análises mais confiáveis.
Para este estudo avaliou-se a exatidão no uso dos
biossensores com nanopartículas de Fe2O3, ZnO e
SiO2 em amostras de águas residuais contaminadas
com compostos fenólicos. Para isso, foi necessário
construir uma curva de calibração para cada nanopartícula avaliada.
A curva de calibração foi obtida a partir de sucessi-1
vas adições de uma solução de guaiacol 1,8 mol.L a
-1
5 ml de tampão fosfato 0,1 mol L pH 7,0. Mediu-se
a corrente a cada adição. Com os valores de concentração no eixo x de corrente no eixo y construiu-se a
curva de calibração, obtendo-se a equação da reta.
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1 Obtenção da atividade enzimática
Foi feito o cálculo da atividade da tirosinase que é uma
etapa muito importante do processo, pois a partir dos
resultados obtidos, pode-se descobrir se a atividade
da enzima se mantém quando a biomolécula é transferida para uma solução aquosa. O resultado da
atividade enzimática foi de 4567,5U.mL-1.O resultado
obtido está acima do indicado em estudos similares
encontrados na literatura para biossensor de extrato
vegetal, indicando que o processo usado para extrair
as enzimas no inhame e levar a uma solução aquosa
foi realizado com eficiência.
3.2 Estudo da resposta de biossensores com e
sem partículas de Fe2O3, ZnO e SiO2 em solução
contendo o composto fenólico guaiacol
O uso de nanopartículas no processo de imobilização da enzima em biossensores tem como uma das
finalidades a amplificação do sinal analítico. Isso porque esse nanomaterial possui a importante propriedade de elevação da área superficial, que acarreta
na imobilização de uma maior quantidade de biomoléculas, aumentando as reações bioquímicas e, consequentemente, a resposta do dispositivo. Para testar se a resposta de biossensores em solução con-
tendo composto fenólico está sendo melhorada
com o uso de nanopartículas na pasta de carbono, foram realizadas medidas voltamétricas com uma
-1
solução contendo apenas tampão fosfato 0,1 mol L ,
-1
pH 7,0 e após a adição de guaiacol 1,8 mmol L . A
Figura 1 apresenta o resultado obtido para as nanopartículas de ZnO.
Figura 1 – Comportamento do biossensor, com e sem
nanopartículas de ZnO, em relação ao seu substrato.
Observando a Figura 1, percebe-se que apenas em solução tampão – linha azul – não há nenhum pico referente à atividade do biossensor devido à ausência de fenol.
Com a adição de guaiacol ocorre o aparecimento dos
picos de oxiredução, como visto na linha vermelha. A linha verde, obtida para o biossensor com as nanopartículas de ZnO, apresenta um aumento considerável nos valores de corrente, indicando que maiores quantidades de
enzima são imobilizadas na superfície sensora.
Este resultado de incremento no sinal analítco do dispositivo foi observado para as outras nanopartículas avaliadas
(Fe2O3 e SiO2). No entanto, o biossensor contendo ZnO
foi o que apresentou a maior variação na resposta quando comparado com o aparato contendo somente enzima
e pasta de carbono.
3.3 Estudo da reprodutibilidade do biossensor e
repetibilidade das medidas
A repetibilidade do biossensor é um parâmetro importante, pois estuda se a medida eletroquímica de
um biossensor decresce com o passar do tempo
nas mesmas condições experimentais. Portanto,
para o estudo da repetibilidade do biossensor, foram
realizadas cinco medições sem a troca da pasta ou
da solução, utilizando as nanopartículas de Fe2O3,
ZnO e SiO2, como suporte para tirosinase, em solu-1
-1
ção tampão 0,1 mol L pH7,0 contendo 1,8mmolL
de guaiacol. Com estes resultados foi possível calcular a precisão das medidas obtidas com os diferentes biossensores
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Tabela 1 Valores de corrente obtidos para os três biossensores estudados e os respectivos coeficientes
de variação obtidos.
Medidas
1
2
3
4
5
Fe2O3
I/A
2,63 x10
-6
2,66 x10
-6
2,63 x10
-6
2,66 x10
-6
2,58 x10
-6
ZnO
I/A
1,43 x 10
-5
1,46 x 10
-5
1,46 x 10
-5
1,46 x 10
-5
1,44 x 10
-5
SiO2
I/A
4,75 x 10
-6
5,90 x 10
-6
5,97 x 10
-6
6,12 x 10
-6
6,18 x 10
-6
1,09%
0,97%
1,02%
CV
Conforme observado na Tabela 1, os coeficientes de
variação encontrados para os três biossensores estudados foram baixos, indicando uma boa repetibilidade de medidas. Valores até 5% são aceitos para
biossensores obtidos a partir de extrato vegetal. No
entanto, quando os valores de coeficiente de variação são comparados entre os biossensores, verificase que o contendo as nanopartículas de ZnO foi o
que apresentou valor menor e, portanto, é o dispositivo com maior precisão entre suas medidas analíticas.
O estudo da reprodutibilidade de preparação é necessário para verificar se o procedimento de preparação
dos dispositivos está sendo realizado corretamente e
não causa variações significativas nas medições
quando usados dispositivos preparados em momentos diferentes. Então foram construídos três biossensores (para cada nanopartícula avaliada) nas mesmas condições experimentais. A finalidade é verificar
se dispositivos preparados em dias ou períodos distintos fornecem o mesmo sinal analítico, sem que haja
variações consideráveis. As medidas eletroquímicas
foram realizadas em solução tampão fosfato pH 7,0
-1
contendo solução de guaiacol 1,8 mmol.L
Com a finalidade de calcular a reprodutibilidade desses biossensores, os valores de corrente bem como o
cálculo do desvio padrão relativo (DPR) estão apresentados na Tabela 2.
Analisando os dados da Tabela 2, verifica-se que os
valores de reprodutibilidade de preparação para os
três biossensores (Fe2O3; ZnO e SiO2) são bons, visto
que não se está utilizando enzimas comerciais liofilizadas. No entanto, quando comparados entre si, verifica-se que o dispositivo contendo as nanopartículas
de ZnO é que apresentou maior reprodutibilidade de
preparação.
Tabela 2 – Valores de corrente obtidos para o estudo
da reprodutibilidade de preparação dos biossensores.
Biossensor Fe2O3
I/A ZnO
I/A
1
1,85 x10
-6
2
1,76 x10
-6
3
1,73 x10-6
média
1,78 10
-6
1,41x 10
desvio padrão
6,24.10
-8
4,4x10
DPR
3,51%
SiO2
I/A
6,42 x10
-6
1,44 x10
6,40 x10
-6
1,36 x10-5
5,44 x10-6
1,43 x10
-5
-5
-5
-7
6,08x10
-6
5,60x10
-7
3,09%
9,21%
3.4 Determinação de compostos fenólicos em
amostra de interesse ambiental
Na etapa final do trabalho, após a otimização dos
parâmetros analíticos, o biossensor está pronto para
ser aplicado em amostras contaminadas com compostos fenólicos. A análise foi iniciada pela construção da curva de calibração.
3.4.1 Construção da curva de calibração
A construção da curva de calibração para cada biossensor (Fe2O3; ZnO e SiO2) foi feita através de sucessivas adições da solução de guaiacol em 5 mL de
-1
solução tampão fosfato 0,1 mol L pH 7,0 e para cada adição, uma medida eletroquímica. A Figura 2
apresenta o resultado obtido para o biossensor contendo as nanopartículas de ZnO.
Com base na Figura 2, verifica-se que a região linear
de guaiacol para o biossensor com nanopartículas de
-1
ZnO foi de 1,08 a 7,20 mmol L , com equação da
-5
2
reta de y=0,0149591x + 3,5 10 (R =0,993525,
n=18). Para o biossensor de Fe2O3 a região linear foi
-1
de 3,24 a 8,28 mmol L com equação da reta de
-5
2
y=0,027133x + 5 10 (R =0,993801, n=15). Para SiO2
-1
a região linear foi de 1,44 a 7,20 mmol L , levemente
inferior aquela encontrada para o biossensor de ZnO,
-5
com equação da reta de y=0,019622x + 5,7 10
2
(R =0,990445, n=17).
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Para o Fe2O3, a corrente máxima obtida foi de 2,02
-4
10 A e a concentração de guaiacol correspondente,
-3
usando a respectiva equação da reta é de 5,5 10
-1
mol L . Sabendo-se que a concentração do compos-3
to fenólico adicionada à amostra foi de 5,4 10 mol L
1
-5
, o erro relativo é de 1,85%. foi de 1,20 10 A .
2,00E-04
1,80E-04
1,60E-04
1,40E-04
y = 0,019591x + 0,000035
R² = 0,993525
1,20E-04
I/A
Para o biossensor de SiO2 a concentração de guaiacol correspondente, usando a respectiva equação da
-3
-1
reta é de 3,21 10 mol L . Sabendo-se que a concentração do composto fenólico adicionada à amos-3
-1
tra foi de 3,24 10 mol L , o erro relativo é de 0,92%.
1,00E-04
8,00E-05
6,00E-05
4,00E-05
2,00E-05
0,00E+00
0,00E+00
1,00E-03
2,00E-03
3,00E-03 4,00E-03 5,00E-03
concentração guaiacol / mol L-1
6,00E-03
7,00E-03
8,00E-03
Figura 2 Curva de calibração obtida para o biosensor
contendo nanopartículas de ZnO em solução tampão
-1
fosfato 0,1 mol L , pH 7,0, com sucessivas adições de
guaiacol.
3.4.2 Determinação de compostos fenólicos em
amostras de interesse ambiental.
Após obtenção das curvas de calibração para os biossensores avaliados, foi possível a análise do composto fenólico em matriz ambiental. A amostra consistiu de água residual industrial que foi contaminada
com solução de guaiacol e mediu se a corrente desta
amostra usando cada um dos biossensores. A Figura
3 exibe o voltamograma resultante dessa análise para o ZnO.
A corrente máxima obtida na Figura 3 foi de 9,89 105
A e a concentração de guaiacol correspondente, usando a respectiva equação da reta é de 3,26 10-3
-1
mol L . Sabendo-se que a concentração do compos-3
to fenólico adicionada à amostra foi de 3,24 10 mol
-1
L , o erro relativo foi de 0,62%.
Figura 3 Voltamograma obtido na determinação de
guaiacol em amostras de águas residuais industriais
usando o biossensor baseado em nanopartículas de
ZnO.
Analisando os erros relativos obtidos com os três
biossensores, verifica-se que estão excelentes, com
valores bem baixos, indicando a boa exatidão dos
dispositivos. No entanto, quando os erros são comparados entre os biossensores, constata-se que o
contendo nanopartículas de ZnO foi o que apresentou os melhores resultados. Portanto, avaliando os
parâmetros estudados no trabalho, este nanomaterial
é o mais adequado para a construção de dispositivos
sensores, pois fornece sistemas que apresentam boa
precisão e exatidão e, além de tudo, confiabilidade
nos resultados.
4. CONCLUSÃO
No trabalho foram construídos três biossensores que
tinham como elemento de reconhecimento a enzima
tirosinase, extraída de inhame, imobilizadas sobre
distintas nanopartículas: de Fe2O3, ZnO e de SiO2.
Todas as nanopartículas avaliadas produziram dispositivos que apresentaram aumento de sinal analítico quando o nanomaterial estava presente. Além
disso, os dispositivos possuíram alta repetibilidade de
medidas e reprodutibilidade de construção, indicando
sua boa precisão. Quando usados para análise do
composto fenólico selecionado, no caso o guaiacol,
os erros relativos obtidos foram bem pequenos, atestando sua exatidão. Porém, de todas as nanopartículas avaliadas, as de ZnO foram as que apresentaram
os melhores valores em todos os estudos avaliados.
Por isso, esse seria um promissor suporte para o
preparo de biossensores para uso em detecção de
contaminantes em matrizes de interesse ambiental.
AGRADECIMENTO à PUC-Campinas pela oportunidade de realização da Iniciação Científica e bolsa
concedida.
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Silva, H.A.S. (2014) Remoção de compostos fenólicos de soluções aquosas utilizando carvão ativado
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estudo cinético e de equilíbrio termodinâmico. Quim.
Nova, vol.37, n.3, p. 447-453.
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S.K.; Fernandes, S.C.; Vieira, I.C. (2011) Incorporação de liquídos iônicos e nanoparticulas metálicas na
construção de sensores eletroquímicos. Quim. Nova,
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[4] Rosatto,S.S.;Freire, R.S.; Durán, N.; Kubota, L.T.
(2001) Biossensores amperométricos para determinação de compostos fenólicos em amostras de interesse ambiental. Quim. Nova, vol. 24, n. 1, p. 77-86.
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[6] Mendes, R.K.; Laschi, S.; Stach-Machado, D.R.;
Kubota, L.T.; Marrazza, G. (2012) A disposable voltammetric immunosensor based on magnetic beads
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Chemical vol. 166–167, p.135–140