Biossensores: estrutura, funcionamento e aplicabilidade

Biossensores: estrutura, funcionamento e aplicabilidade
Simone Saad Calil1
Paulo Roberto Queiroz da Silva2
1
Farmacêutica. Especialista em Toxicologia pela Universidade Federal de Goiás. Aluna da Pós-Graduação
em Farmácia e Química Forense, pela Universidade Católica de Goiás/Ifar.
2
Biólogo. Doutor em Biologia Animal pela Universidade de Brasília – UnB. Professor do IFAR/PUC-GO.
Endereço: IFAR – Instituto de Estudos Farmacêuticos. SHCGN 716 Bl B Lj 05 Brasilia – DF CEP: 70770732. E-mail: [email protected]
Resumo
Biossensores são pequenos dispositivos que utilizam componentes biológicos como elementos de
reconhecimento, ligados a um sistema de detecção, transdução e amplificação do sinal gerado na reação com
o analito-alvo. Podem ser utilizados diversos elementos, sendo os principais, atualmente, aqueles baseados
em aptâmeros e nanomateriais, por sua alta especificidade e sensibilidade. Seu potencial de utilização varia
desde a detecção e tratamento de doenças ou a medição de componentes nos fluidos biológicos, até o
monitoramento ambiental e prevenção de contaminação e bioterrorismo. O objetivo deste trabalho foi
apresentar uma revisão de bibliografia descrevendo estrutura, funcionamento e aplicabilidade dos
biossensores em várias áreas tecnológicas. Para esta revisão, foram utilizados 63 artigos, uma dissertação de
mestrado e 3 livros relacionados ao tema proposto. Apesar da grande quantidade de pesquisa sobre novas
técnicas e materiais, pouco se fala sobre a toxicidade desses compostos para a saúde humana e para o meio
ambiente, sendo necessários mais estudos nesse sentido.
Palavras-chave: Biossensor. Transdutor. Aptâmero. Nanomateriais.
Biosensors: structure, function and applicability
Abstract
Biosensors are small devices that use biological components as recognition elements, which are connected to
a system that detect, transduct and amplify the generated signal from the reaction with the target analyte. Can
be used several elements, but the main, currently, are those based on aptamers and nanomaterials because of
their high specificity and sensitivity. Their potential use ranges from the detection and treatment of diseases
or measuring components in biological fluids, to the monitoring and prevention of environmental
contamination and bioterrorism. The aim of this study was to present a review of literature describing
structure, function and applicability of biosensors in several technology areas. For this review, were used 63
articles, a master thesis and three books related to the proposed theme. In spite of the considerable amount of
research about new techniques and materials, just a little is said about the toxicity of these compounds to the
human health and the environment, and further studies in this direction are needed.
Keywords: Biosensor. Transducer. Aptamer. Nanomaterials.
2
1 INTRODUÇÃO
Os biossensores são pequenos dispositivos que utilizam reações biológicas para
detecção de analitos-alvo (WANG, 2000). Tais dispositivos combinam um componente
biológico, que interage com um substrato alvo, a um transdutor físico, que converte os
processos de biorreconhecimento em sinais mensuráveis (WANG, 2000; PATHAK et al,
2007). Seu uso traz uma série de vantagens, pois são altamente sensíveis e seletivos,
relativamente fáceis em termos de desenvolvimento, além de acessíveis e prontos para uso.
Entretanto, há certas limitações, como interferências eletroquimicamente ativas na amostra,
pouca estabilidade a longo prazo e problemas de transferência de elétrons (MEHRVAR;
ABDI, 2004; SONG et al, 2006).
Os biossensores podem ser de detecção direta (sensor de detecção direta ou sistema
não reticulado), nos quais a interação biológica é medida diretamente, havendo uso de um
ligante não-catalítico, como receptores celulares e anticorpos, ou de detecção indireta
(sensor marcado ou sistema reticulado), em que há o uso de anticorpos fluorescentemente
marcados ou elementos catalíticos, como enzimas. O sistema reticulado tem uma maior
estabilidade e é mais simples para usar, mas o sistema não reticulado tem melhor
sensibilidade, tempo de operação mais curto e custos mais baixos (MEHRVAR; ABDI,
2004; PATHAK et al, 2007; LIU et al, 2009).
Há dois tipos de biossensores, dependendo da natureza do evento de
reconhecimento. Dispositivos de bioafinidade, que dependem da ligação seletiva do
analito-alvo ao ligante preso à superfície (por exempo, anticorpo ou sonda
oligonucleotídica) e dispositivos bioanalíticos, nos quais uma enzima imobilizada é usada
para o reconhecimento do substrato-alvo (WANG, 2000).
A partir dessas informações, o objetivo desse trabalho foi apresentar uma revisão de
bibliografia descrevendo estrutura, funcionamento e aplicabilidade dos biossensores em
várias áreas tecnológicas.
3
2 METODOLOGIA
Trata-se de uma revisão da literatura, sendo desenvolvida sob uma metodologia
teórica e conceitual, tendo como base livros especializados na área, tais como, imunologia
celular e molecular, entre outros, bem como o acesso a artigos publicados em periódicos
indexados e disponibilizados em bases de dados como, por exemplo, SciELO, PubMed,
MEDLINE e ScienceDirect.
Foram priorizados os artigos publicados ao longo dos últimos dez anos. Entretanto,
artigos com data de publicação anterior e que foram julgados relevantes para a pesquisa
também foram considerados para a construção do manuscrito.
3 ESTRUTURA DE UM BIOSSENSOR
Conforme apresentado na figura 1, os biossensores são construídos a partir de um
componente que introduz a amostra, um sistema de reconhecimento molecular, um
transdutor e uma unidade processadora de sinal (LEE et al, 2008).
Introdução da amostra
Analito-alvo
Saída do sinal
Unidade
Elemento de Transdutor processadora
reconhecimento
(B)
de sinal (C)
(componente
biológico) (A)
Figura 1 - Configuração de um biossensor, mostrando a organização dos seus componentes
funcionais. A detecção do analito-alvo é feita por um componente biológico que gera um sinal (A), o qual é
convertido (B) e processado (C). Adaptado por Calil, 2011.
Os principais sistemas de introdução de amostra são os canais microfluídicos e o
sistema de análise por injeção em fluxo (FIA – flow injection analysis) (ROY; GUPTA,
2003; JOO et al, 2007; YANTASEE et al, 2007; MCBRIDE; COOPER, 2008).
No sistema de reconhecimento está a parte que entra em contato com o analito de
interesse e produz um sinal. Pode ser um receptor, enzima, anticorpo, ácido nucléico,
4
aptâmero, entre outros (PATHAK et al, 2007; CHAMBERS et al, 2008; LEE et al, 2008).
Como esses reagentes já estão imobilizados no sistema, o sensor desempenha a tarefa de
identificar a composição de espécies com o mínimo de intervenção humana. As técnicas
mais comuns de imobilização são adsorção física (interações do tipo iônica e polar e
ligação de hidrogênio), ligação cruzada (reticulação), oclusão ou aprisionamento, ligação
covalente e covalente cruzada, encapsulamento e microencapsulamento. A estabilidade das
técnicas de imobilização determina a sensibilidade e confiabilidade do sinal do biossensor,
devido à preservação dos sítios ativos da molécula (MEHRVAR; ABDI, 2004;
YANTASEE et al, 2007; EMBRAPA AGROINDÚSTRIA TROPICAL, 2008; MELO,
2008).
O transdutor age como uma interface, medindo a mudança física ou química que
ocorre na reação com o biorreceptor, transformando essa energia em um produto
mensurável, como massa, carga, calor ou luz. Podem ser de diversos tipos, tais como,
eletroquímico, óptico, piezoelétrico e calorimétrico (MEHRVAR et al, 2000; PATHAK et
al, 2007; LEE et al, 2008).
A unidade processadora de sinal funciona como um detector que filtra, amplifica e
analisa o sinal transduzido, tranferindo-o para um monitor ou armazenando-o em algum
dispositivo (RAITERI et al, 2002; PATHAK et al, 2007).
4 COMPONENTES BIOLÓGICOS DOS BIOSSENSORES
Vários componentes biológicos apresentam-se como potenciais elementos a serem
usados em sistemas de biossensores, entre eles:
Enzimas. Elementos de reconhecimento baseados em enzimas catalíticas são muito
atraentes como biossensores devido à variedade de produtos de reação mensuráveis de um
processo catalítico, que incluem prótons, elétrons, luz e calor. A enzima urease tem sido
muito usada como um sensor para biorreconhecimento devido à necessidade de
determinação/monitoramento da uréia tanto em aplicações médicas quanto ambientais
(CHAMBERS et al, 2008). Os biossensores de bioluminescência ou bioanalíticos, por
exemplo, são baseados na utilização de certas enzimas com habilidade de emitir fótons
como um subproduto de suas reações. Tais biossensores possuem especificidade
extremamente alta e podem distinguir células viáveis de células não-viáveis. Sua principal
5
limitação é o tempo relativamente longo para análise e a falta de sensibilidade
(MEHRVAR; ABDI, 2004).
Anticorpos. São produzidos pelas células B e são funcionalmente definidos pelo
antígeno com o qual reagem. Assim, anticorpos gerais, com especificidade desconhecida
(por exemplo, imunoglobulina sérica IgM), são chamados de imunoglobulina até serem
definidos pelo antígeno específico (por exemplo, anti-sRBC IgM) (KLAASSEN, 2001).
Todos os cinco tipos de imunoglobulina (IgA, IgD, IgE, IgG e IgM) são
constituídas de cadeias pesadas (H) e leves (L) e regiões ou domínios constantes (C) e
variáveis (V) (KLAASSEN, 2001). É a região V que determina a especificidade do
anticorpo, pois a maioria das diferenças entre os anticorpos está em três pequenas
extensões (com aproximadamente dez aminoácidos) de suas cadeias pesada (VH) e leve
(VL). Essas pequenas extensões assumem estruturas em alça que, em conjunto, formam
uma superfície complementar à estrutura tridimensional do antígeno ligado, sendo
chamadas de segmentos hipervariáveis ou regiões determinantes de complementaridade
(CDR). São ao todo seis alças na extremidade distal dos domínios V do receptor, sendo
três de cada domínio (VH e VL). É possível ver, por análise cristalográfica dos complexos
antígeno/anticorpo, que os aminoácidos da região CDR formam múltiplos contatos com o
antígeno (JANEWAY et al, 2007; ABBAS et al, 2008).
O uso de anticorpos como elemento de reconhecimento se baseia na alta
sensibilidade e especificidade das interações antígeno/anticorpo. A maior vantagem dos
chamados biossensores imunológicos é que não é necessário purificar a amostra antes da
detecção (SONG et al, 2006; CHAMBERS et al, 2008).
Receptores. São alvos naturais para uma grande variedade de drogas e toxinas. São
proteínas de natureza transmembrana e se ligam a moléculas específicas chamadas
ligantes, induzindo uma resposta celular específica. A mudança conformacional no
receptor induzido dá lugar a eventos subsequentes, como a abertura do canal, geração do
segundo mensageiro adenil/guanil ciclase, e reações em cascata envolvendo um grande
número de outras proteínas, incluindo as proteínas G, tirosina quinases, fosfatases,
fosforilases e fatores de transcrição. Seu uso em biossensores é de grande interesse devido
à alta especificidade e afinidade pelo ligante (CHAMBERS et al, 2008).
Ácidos Nucléicos e Aptâmeros. O desempenho dos biossensores de DNA é
fortemente influenciado pelas propriedades físicas do DNA, como, por exemplo, pureza e
comprimento médio da cadeia (RAVERA et al, 2007). A maioria dos biossensores de
6
DNA é desenvolvida com base na imobilização de uma sonda feita a partir de uma fita
simples de DNA (ssDNA) na superfície de um eletrodo marcada com um indicador
eletroquímico que reconhece sua sequência-alvo complementar (WANG, 2000;
AHAMMAD et al, 2009).
Recentemente, os aptâmeros têm recebido grande atenção como componente de
reconhecimento em biossensores (HAN et al, 2010). Os aptâmeros são sequências curtas
de ácidos nucléicos (ssDNA ou ssRNA) (HASEGAWA et al, 2008; CHIU; HUANG,
2009; HAN et al, 2010; HUA et al, 2010), que se ligam a várias moléculas-alvo com alta
afinidade e especificidade (VESTERGAARD et al, 2007; HASEGAWA et al, 2008). São
oligonucleotídeos lineares sintéticos, geralmente com 15 a 40 nucleotídeos de extensão,
submetidos a
muitas interações intramoleculares,
as quais dobram
a
cadeia
oligonucleotídica (BELLUZO et al, 2008), fazendo-a adquirir uma conformação
tridimensional bem definida e tornando-a capaz de se ligar ao seu alvo com alta afinidade e
especificidade (ZHU et al, 2006; CHIU; HUANG, 2009). Têm sido usados na detecção de
diversos ligantes, desde pequenos íons ou moléculas até proteínas e células (BELLUZO et
al, 2008; CHIU; HUANG, 2009; HAN et al, 2010).
Eles são produzidos sinteticamente e são comumente identificados in vitro a partir
da vasta biblioteca de combinações que compreende trilhões de diferentes sequências, por
um processo conhecido como evolução sistemática de ligantes por enriquecimento
exponencial (Selex – systematic evolution of ligands by exponential enrichment) (CHIU;
HUANG, 2009; MAEHASHI; MATSUMOTO, 2009; MAIRHOFER et al, 2009; HUA et
al, 2010), que é um processo repetitivo de ligação, separação e amplificação de ácido
nucléico (LOU et al, 2009), como demonstrado na figura 2. Primeiramente, uma extensa
biblioteca de ácidos nucléicos (mais de 105 sequências aleatórias) é incubada com as
moléculas-alvo para que haja a ligação destas com os nucleotídeos mais afins. As
sequências ligadas e não ligadas são separadas, sendo estas descartadas, enquanto as
ligadas são dissociadas da molécula-alvo e submetidas a um processo chamado reação em
cadeia da polimerase (PCR – polymerase chain reaction) para amplificação. Então o ciclo
recomeça (LIU et al, 2009). Normalmente, após 5 a 15 ciclos do processo Selex, a
biblioteca é reduzida a um pequeno número de aptâmeros, os quais apresentam uma
afinidade particularmente alta por seu substrato (VESTERGAARD et al, 2007; CHIU;
HUANG, 2009). A constante de dissociação (kd) aptâmero/alvo é comparável à constante
anticorpo/antígeno, na ordem de picomolar a micromolar (CHIU; HUANG, 2009).
7
Sequências
não ligadas
Nucleotídeos
(A)
(B)
(C)
PCR
(D)
Sequências
ligadas
(E)
Moléculas-alvo
Figura 2 - Descrição do processo Selex. Os nucleotídeos são incubados com as moléculas-alvo (A),
as sequências ligadas são separadas das não ligadas (B) e são dissociadas da molécula-alvo (C). É feita a
amplificação por PCR (D) e o ciclo é reiniciado (E). Adaptado por Calil, 2011.
Apesar
da
afinidade
aptâmero/analito-alvo
ser
comparável
à
afinidade
anticorpo/antígeno (VESTERGAARD et al, 2007), os aptâmeros apresentam diversas
vantagens que os tornam preferíveis no desenvolvimento de biossensores (BELLUZO et
al, 2008). Algumas dessas vantagens são: possuem estrutura mais simples (ZHU et al,
2006); são de fácil armazenamento (YAO et al, 2010); sua síntese é fácil (LEE, 2008) e
leva a estruturas altamente reprodutíveis (VESTERGAARD et al, 2007), o que os torna
mais baratos (MAEHASHI; MATSUMOTO, 2009); são mais estáveis, por possuírem
maior resistência à desnaturação (LEE, 2008; CHIU; HUANG, 2009); possuem afinidade e
especificidade por ligantes que não são reconhecidos por anticorpos, como íons ou
pequenas moléculas (HAN et al, 2010); são quimicamente modificados com maior
facilidade (ZHU et al, 2006); e a função de aptâmeros imobilizados é regenerada mais
facilmente (YAO et al, 2010).
5 TRANSDUTORES
Várias também são as opções de transdutores a serem acoplados aos componentes
biológicos dos biossensores, entre eles:
Eletroquímicos – Movimento de íons e difusão de espécies eletroativas
(EMBRAPA AGROINDÚSTRIA TROPICAL, 2008). São os biossensores mais
comumente utilizados nos testes de monitoramento e diagnóstico em análises clínicas
(MEHRVAR; ABDI, 2004; GAUA et al, 2005). Suas principais vantagens são baixo custo,
alta sensibilidade, screening rápido e estabilidade (SONG et al, 2006). Podem ser
amperométricos, potenciométricos ou condutimétricos (MEHRVAR; ABDI, 2004).
8
 Amperométricos. Baseados na medida da corrente resultante da oxidação ou
redução eletroquímica de uma espécie eletroativa, momento em que ocorre a
transferência de elétrons do analito para o eletrodo ou vice-versa. A direção do
fluxo de elétrons depende das propriedades do analito e pode ser controlada pela
aplicação de um potencial elétrico no eletrodo. Uma célula amperométrica pode
conter dois ou três eletrodos (THÉVENOT et al, 2001; WANGet al, 2008).
 Potenciométricos. Baseados na determinação da diferença de potencial entre o
eletrodo indicador e o de referência ou dois eletrodos de referência separados por
uma membrana seletiva permeável, em que não há fluxo de corrente significativa
entre eles (THÉVENOT et al, 2001).
 Condutimétricos. Baseados na medição de mudanças na condutância, devido ao
uso de enzimas que, ao catalisar reações, produzem ou consomem espécies iônicas,
alterando a quantidade de portadores de carga móvel no eletrólito. A condutividade
é a função linear da concentração iônica, porém, não é específica para um dado tipo
iônico (MELO, 2008; WANG et al, 2008).
Ópticos – Fibra óptica, guia de onda planar, ressonância de superfície de plasma
(SPR – surface plasmon resonance) (THÉVENOT et al, 2001). São particularmente
atraentes para aplicação em sistemas de detecção direta. São baseados na medição da luz
observada ou emitida como um resultado de uma reação química ou biológica. Em tais
biossensores, fibras ópticas são usadas para guiar as ondas de luz a detectores adequados,
como um eletrodo ou semicondutor (MEHRVAR; ABDI, 2004).
Piezoelétricos – Alteração de massa ou microviscosidade, onda de cisalhamento e
superfície acústica (THÉVENOT et al, 2001; EMBRAPA AGROINDÚSTRIA
TROPICAL, 2008). Baseados no princípio de revestir a superfície do biossensor com uma
substância biologicamente ativa que se liga seletivamente. A superfície revestida é
colocada em uma solução contendo analitos, os quais se ligam à substância ligante. Então,
a massa do cristal aumenta enquanto a frequência de ressonância das oscilações diminui
proporcionalmente (MEHRVAR; ABDI, 2004). Cristais de quartzo têm sido muito
utilizados em sistemas piezoelétricos, pois sua frequência pode oscilar na faixa de
megahertz (106 ciclos/segundo) de maneira proporcional à massa do cristal, além de serem
muito sensíveis às variações de massa. Essa alta sensibilidade levou à criação de um sensor
denominado microbalanço de cristal de quartzo (QCMB), que é capaz de detectar as
9
variações de nanogramas que ocorrem em sua massa quando o alvo se liga ao sensor
(WANG et al, 2011).
Calorimétricos – Também chamados de termístor (THÉVENOT et al, 2001).
Detectam substratos baseados no calor envolvido nas reações bioquímicas do analito com
uma substância biológica ativa adequada, como uma enzima. A forma mais utilizada
acopla as substâncias diretamente ao termístor, que detecta o calor envolvido na reação
bioquímica. A maior parte do calor em reações enzimáticas é perdida para o meio sem ser
detectada. A perda do calor diminui a sensibilidade dos biossensores calorimétricos
(MEHRVAR; ABDI, 2004).
6 NANOTECNOLOGIA
Análises em nanoescala têm sido desenvolvidas para estudar interações em nível
celular e molecular em tempo real, fornecendo biossensores com sensibilidade muito alta
quando comparados aos métodos convencionais (KOHLES et al, 2011). Vários tipos de
dispositivos baseados nos princípios da nanotecnologia têm sido incorporados aos
biodispositivos para aumentar a relação sinal/ruído, reduzir o tempo de resposta, aumentar
a estabilidade e a sensibilidade, e obter um limite de detecção em concentrações entre
nanomolar e picomolar (CHOI et al, 2007; PERIASAMY et al, 2009). Nanopartículas,
nanofios e nanotubos têm sido largamente aplicados em biodispositivos como
nanomatrizes, nanobiossensores e sistemas microanalíticos (lab on a chip) (CHOI et al,
2007; WANG et al, 2009).
Nanobiossensores são nanosensores usados para a detecção de materiais químicos
ou biológicos. Esses sensores podem ser eletronicamente acoplados para responder à
ligação de uma única molécula. Protótipos demonstraram detecção de ácidos nucléicos,
proteínas e íons. Esses sensores podem operar em fase gasosa ou líquida e utilizam regimes
de medição de baixa tensão, além de detectar ligantes diretamente, não havendo
necessidade de marcadores caros e complicados, corantes fluorescentes e nem caros e
grandes sistemas de detecção óptica. Isso faz com que esses sensores sejam baratos e
portáteis, podendo ser aplicados em diversas situações para detecção e monitoramento
(JAIN, 2007).
10
Os nanossensores incluem sensores com nanoporo único, sensores com sondas
encapsuladas por incorporação biologicamente localizada (Pebble – probes encapsulated
by biologically localized embedding), sensores SPR, sensores mecânicos usando
nanocantilever, transístores de efeito de campo (FET – field-effect transistors) com
nanofios de silício ou carbono e sensores com nanoeletrodos eletroquímicos (CHOI et al,
2007).
6.1
Nanomateriais
Nanomateriais podem ser preparados utilizando-se diversos compostos, como
metais, polímeros, carbono e componentes biológicos (DRBOHLAVOVA et al, 2009). São
classificados como metálicos, semicondutores, magnéticos e baseados em carbono
(WANG et al, 2009).
Nanopartículas Metálicas –ouro (Au) e prata (Ag) – propriedade intrínseca: SPR.
São partículas metálicas quase esféricas, que exibem interessante propriedade óptica. As
ondas de luz que incidem nas nanopartículas metálicas podem produzir uma oscilação
coletiva dos elétrons condutores em seu núcleo. Isso ocorre por meio do acoplamento de
luz em uma forma ressonante para os elétrons livres no metal. Essas oscilações são
chamadas “superfície de plasma” e são dependentes do tamanho e forma da nanopartícula,
da constante dielétrica do meio e da distância entre as partículas. Nanopartículas de ouro
estão entre as mais estudadas e utilizadas, devido à sua fácil preparação, estabilidade,
funcionalização química da superfície bem estabelecida e propriedades óptico-eletrônicas
únicas (WALKEY et al, 2009; WANG et al, 2009).
Semicondutores – Chamados quantum dots, geralmente compostos por ZnS ou
CdSe – propriedade intrínseca: fluorescência e luminescência. Os quantum dots (QD) ou,
pontos quânticos, são cristais de tamanho nanométrico com, em média, 2 a 20 nm. Nessas
dimensões, esses nanocristais são considerados eletronicamente zero-dimensionais e
exibem um confinamento quântico nas três dimensões. São geralmente compostos de
alguns milhões de átomos, mas apenas um pequeno número de elétrons (≤ 100) é livre
(DRBOHLAVOVA et al, 2009; WALKEY et al, 2009; WANG et al, 2009). As vantagens
dos QD sobre os corantes fluorescentes são diversas, incluindo um amplo espectro de
absorção com um limite de emissão muito estreito, um alto rendimento quântico e uma
resistência à fotodegradação e à degradação óptica ou química (ERICKSON et al, 2008).
11
Magnéticos
–
Exemplo:
Fe3O4
–
propriedade
intrínseca:
magnetismo.
Nanopartículas magnéticas, como as de óxidos de ferro, possuem uma habilidade única de
se moverem simplesmente pela influência de um campo magnético externo. Além de
magnéticas, são não porosas e muito estáveis (WANG et al, 2009). As chamadas
nanopartículas superparamagnéticas de óxido de ferro (SPIO) contêm um ou vários
núcleos de óxido de ferro superparamagnético (magnetitas) suspensos em uma matriz não
magnética. Esses núcleos consistem em um grão único ou um conjunto de grãos
superparamagnéticos, os quais são magnetizados na presença de um campo magnético,
alinhando seus pólos na direção do campo externo. Quando o campo é removido, os
momentos magnéticos randomizam, de modo que a magnetização líquida do conjunto
retorna a zero. Esse processo é chamado relaxação e resulta das relaxações Browniana e de
Néel (ARRUDA et al, 2009; DEMAS; LOWERY, 2011).
Baseados em carbono – Exemplo: fulereno e nanotubos de carbono (CNT) –
propriedade intrínseca: condutividade e propriedades eletrônicas e mecânicas. Nanotubos
de carbono são uma rede hexagonal de átomos de carbono, que podem ser vistos como
uma ou mais camadas de folhas enroladas em um cilíndro com diâmetro em uma escala
nanométrica. Seu comprimento varia de alguns micrômetros até centímetros, e pode ser de
parede simples (SWCNT), de parede dupla (DWCNT) ou de parede múltipla (MWCNT).
Suas propriedades permitem que ele interaja com alguns compostos orgânicos aromáticos,
podendo ser usado na concepção de nanodispositivos com a ajuda de adsorção nãocovalente de enzimas e proteínas nas paredes laterais dos CNT, o que resulta em estruturas
contendo unidades químicas e bioquímicas (LU et al, 2006; YOGESWARAN et al, 2008;
WANG et al, 2009).
Os biossensores baseados em CNT podem ser de primeira geração (baseados na
detecção de H2O2 ou O2 envolvidos em reações enzimáticas), de segunda geração (por
meio da utilização de um mediador de transferência de elétrons) ou de terceira geração
(baseado na transferência direta de elétrons de enzimas ou proteínas) (GONG et al, 2005).
12
7 USOS/APLICAÇÕES
7.1
Detecção de microorganismos e toxinas – bioterrorismo e biossegurança
Na área de biodefesa, os agentes biológicos são considerados mais difíceis de serem
detectados e combatidos do que os agentes químicos. O interesse no desenvolvimento de
novos biossensores tem sido largamente direcionado pelos recentes avanços relacionados à
necessidade de se detectar e identificar rapidamente ameaças patogênicas (ERICKSON et
al, 2008; LUI et al, 2009).
Um sério problema é o risco de passageiros internacionais transportarem doenças
infecciosas. Uma ferramenta para atenuar os riscos seria a detecção desses patógenos ainda
dentro da aeronave, antes do desembarque de passageiros e tripulação. Um biossensor
apropriado para uso em aeronaves comerciais precisa ter alta probabilidade de detecção e
baixa probabilidade de falsos alarmes, ser capaz de detectar patógenos rapidamente e em
concentrações não letais, ser relativamente barato para ser produzido em larga escala e ser
compacto e leve (HWANG et al, 2011).
Outro aspecto importante na biossegurança é a detecção de patógenos e toxinas em
amostras de alimentos, amostras clínicas e ambientais. Utilizando uma célula
potenciométrica baseada em um chip de silício, com grânulos paramagnéticos como
portadores sólidos de sondas de DNA, Gabig-Ciminska et al (2004) detectaram células
vegetativas e esporos de estirpes de Bacillus, com base em seus genes codificadores de
toxinas, em amostras não purificadas de esporos e lisados celulares. Banerjee et al, em
2008, demonstraram ser possível a avaliação da citotoxicidade de microrganismos
patogênicos, no caso Listeria e Bacillus, e suas toxinas, com a utilização de um hibridoma
de células B de mamíferos imobilizado em uma matriz de colágeno. Os autores indicam
haver um grande potencial na utilização de sensores baseados em células na detecção de
patógenos e toxinas, segurança alimentar e toxicantes químicos.
Também em 2008, Stratis-Cullum et al desenvolveram um imunossensor com
sistema de detecção por quimioluminescência, que utilizou um teste como o ELISA
(enzyme-linked immunosorbent assays) para amplificação do sinal, e que teve como alvo
os esporos do Bacillus glogibii, uma espécie substituta do Bacillus anthracis. Em um teste
de ELISA, imobiliza-se um anticorpo específico para o alvo desejado em um suporte ou
plataforma, no qual se ligará o antígeno. Com a combinação de um método sensível com
13
baixo sinal de fundo (quimioluminescência) e de um amplificador de sinal (ELISA), foi
demonstrada a detecção de 5x105 esporos.
Já em 2009, McGovern et al fabricaram e examinaram três sensores piezoelétricos
microcantilever para detectar in situ e em tempo real esporos do Bacillus anthracis em uma
suspensão aquosa. Esses sensores consistiam de uma camada de zirconato de chumbo
ligado a uma camada de vidro, com anticorpos anti-Bacillus anthracis imobilizados na
superfície e apresentaram sensibilidade de detecção de 10 esporos/mL, especificidade de
1:1000 quando em suspensão com os interferentes Staphylococcus aureus e a
Pseudomonas aeruginosa, e confiabilidade (MCGOVERN et al, 2009).
7.2
Câncer: detecção e tratamento
Na tentativa de criar alternativas menos tóxicas para o tratamento do câncer, Papo
et al (2003) criaram um peptídeo catiônico curto diastereomérico composto de D- e Lleucinas, lisinas e argininas, que possuem toxicidade seletiva para células cancerígenas e
inibem significativamente a formação de metástase pulmonar em camundongos (86%),
sem efeitos colaterais detectáveis. Com a utilização de um biossensor com uma bicamada
lipídica aplicada sobre a superfície do chip, utilizando SPR para detectar mudanças em seu
índice de refração, investigou-se o mecanismo de ação do peptídeo, sendo demonstrada sua
alta seletividade para células cancerosas.
O fator de crescimento endotelial vascular A (VEGF-A) é um regulador da
angiogênese e estimula a vascularização em tumores sólidos. Seu nível sérico é um
indicador útil da presença de um tumor e biossensores baseados em aptâmeros, por
exemplo, podem ser utilizados para detectá-lo, o que favoreceria um diagnóstico mais
efetivo (NONAKA et al, 2010).
Já os nanodispositivos microfluídicos permitem um alto rendimento e uma análise
muito eficiente de sequências gênicas, expandindo grandemente a habilidade para
caracterização da composição genética e revolucionando a especificidade do diagnóstico e
dos tratamentos. Nanomateriais que tenham ao menos uma dimensão menor que 100 nm
são comparáveis em tamanho a muitas moléculas biológicas. Tais dimensões permitem que
sejam incorporados às células para detecção por imagem tanto in vitro quanto in vivo, para
mecanismos de entrega de drogas a alvos específicos e para o direcionamento de
quimioterápicos para células tumorais (WANG, X. et al, 2009).
14
Chen et al (2010) utilizaram nanobastões de ouro (GNR) revestidos com
multicamadas de polieletrólito como contraste óptico multifuncional para a detecção de
células tumorais por imagem. A modificação na superfície dos GNR aumenta sua
estabilidade química e facilita sua absorção por células do câncer por meio de interação
eletrostática. O experimento comprovou que GNR modificados podem ser utilizados como
agentes de contraste óptico para detecção por imagem in vitro de células de câncer,
apresentando grande potencial para futura utilização in vivo.
7.3
Análise de fluidos biológicos
Os testes atuais para glicose em pacientes diabéticos fazem um furo na pele para
retirada de sangue, o que, além de causar dor e inconveniente, limita o monitoramento
frequente de açúcar. Por isso, é bastante desejável o desenvolvimento e teste de um sensor
para glicose que seja não invasivo, de baixo custo, portátil e sem fio. Uma das alternativas
é testar a glicose utilizando-se o condensado do exalado pulmonar (EBC). Em 2010, Chu et
al desenvolveram um dispositivo de integração nitreto de gálio-alumínio/nitreto de gálio
(AlGaN/GaN) com transístores de alta mobilidade eletrônica (HEMT) baseado em
sensores de pH, glicose e íons cloreto em um único chip. Para glicose, foi imobilizada a
enzima glicose oxidase em nanobastões de óxido de zinco (ZnO). Apesar de a atividade da
enzima glicose oxidase ser altamente dependente do pH da solução, e poder ser reduzida
para 80% em pH de 5 a 6, em um tampão com pH de 7,4, o sensor apresentou uma resposta
rápida (menos de 5 segundos) e foi capaz de detectar uma ampla faixa de concentrações, de
0,5 nM a 125 μM.
Com o objetivo de criar um biossensor para medição de glicose que fosse insensível
às variações de pH, Garrett et al (2008) desenvolveram uma proteína indicadora de glicose
(GIP) com a união de uma proteína de ligação de glicose isolada de E. coli, uma proteína
fluorescente ciano e uma proteína fluorescente amarela pH-insensível. O resultado foi
medido pelo método FRET (fluorescence resonance energy transfer) e a resposta à glicose
foi quase inalterada para pH de 7,3 a 5,3. Os autores sugerem o uso de seu biossensor na
medição de glicose intracelular de maneira não invasiva, por meio dos níveis de glicose
intersticial.
Guarise et al desenvolveram, em 2006, um nanossensor baseado em colóides de
ouro, para detectar duas proteases: a trombina, envolvida na coagulação sanguínea e
15
trombose, e o fator letal, um componente da toxina produzida pelo Bacillus anthracis. Os
autores apontam que, apesar de não ser tão sensível quanto os métodos baseados em
ELISA ou imuno-PCR, seu sensor possui sensibilidade comparável ou até melhor que
aqueles baseados no método FRET e pode ser utilizado para análises preliminares de
fluidos biológicos.
Em outro estudo, utilizaram o tecido do cogumelo Agaricus bisporus como
elemento
de
reconhecimento
molecular
para
etanol
em
um
biossensor
por
quimioluminescência com sistema de detecção FIA. O método foi utilizado para
determinação de etanol em fluidos biológicos e bebidas, com resultados satisfatórios,
apresentando resultados lineares na faixa de 0,001 a 2 mmol/L, com limite de detecção de
0,2 μmol/L (HUANG; WU, 2006).
Em 2009, Laiwattanapaisal et al desenvolveram um sistema portátil on-chip para
determinação de baixos níveis de albumina na urina, que se baseou em uma reação de
imunoaglutinação, em que foi formado um complexo entre a albumina e anticorpos
imobilizados em esferas de látex. O imunossensor consistiu de um sistema microfluídico
de polidimetilsiloxano (PDMS), no qual foram inseridas amostras de urina diluídas e foi
detectada a mudança ocorrida na absorbância após a imunoaglutinação por meio de um
espectrômetro portátil miniatura de fibra óptica. O limite de detecção obtido foi 0,81 mg/L,
o que, apesar de ser considerado bem abaixo de outros métodos, é suficiente para a
detecção do estágio de microalbuminúria indicativo de nefropatia em pacientes diabéticos.
Os autores consideraram o método de fácil manuseio, baixo custo, boa reprodutibilidade e
total portabilidade para análises em campo (LAIWATTANAPAISAL et al, 2009).
8 CONSIDERAÇÕES FINAIS
O desenvolvimento e utilização de biossensores tem sido um importante avanço em
diversas áreas. Cada vez mais, novas técnicas e materiais são testados e as possibilidades
de aplicação aumentam. O uso de biossensores na detecção precoce e tratamento de câncer,
por exemplo, será uma importante ferramenta para uso na medicina e no desenvolvimento
de fármacos, pois, além de ser uma forma de tratamento menos invasiva e nociva ao
paciente, a detecção precoce aumenta as chances de sucesso no tratamento.
16
Destaque também para o uso na detecção de armas químicas e, principalmente,
biológicas, tanto em ambientes quanto em água, solo e alimentos. Como a detecção desses
agentes é, em geral, demorada, o risco de contaminação torna-se maior. Nesse caso, os
biossensores permitem uma análise em tempo real e in loco, o que favorece uma ação mais
rápida e efetiva das autoridades no combate ao terrorismo.
Entretanto, são necessários mais estudos relacionados à toxicidade desses novos
materiais, tanto para o meio ambiente quanto para a saúde humana. Os nanomateriais, por
exemplo, apresentam diversos metais pesados em sua composição que são conhecidamente
tóxicos. Além disso, por seu tamanho reduzido, esses compostos interagem grandemente
com o ambiente tanto externo quanto fisiológico.
REFERÊNCIAS
ABBAS, A. K.; LICHTMAN, A. H.; PILLAI, S. Imunologia Celular e Molecular. 6.ed.
Rio de Janeiro: Elsevier, 2008. 576 p.
AHAMMAD, A. J. Saleh; LEE, Jae-Joon; RAHMAN, Md. Aminur. Electrochemical
Sensors Based on Carbon Nanotubes. Sensors, v.9, p.2289-2319, mar 2009.
ARRUDA, D. L. et al. Microelectrical Sensors as Emerging Platforms for Protein
Biomarker Detection in Point-of-care Diagnostics. Expert Rev Mol Diagn, v.9, n. 7,
p.749-755, out 2009.
BANERJEE, P. et al. A Novel and Simple Cell-based Detection System with a Collagenencapsulated B-lymphocyte Cell Line as a Biosensor for Rapid Detection of Pathogens and
Toxins. Laboratory Investigation, v.88, p.196-206, fev 2008.
BELLUZO, M. S.; RIBONE, M. E.; LAGIER, C. M. Assembling Amperometric
Biosensors for Clinical Diagnostics. Sensors, v.8, p.1366-1399, fev 2008.
CHAMBERS, J. P. et al. Biosensor Recognition Elements. Curr. Issues Mol. Biol., v.10,
p.1-12, 2008.
CHARLES, P. T. et al. Fluorescence-based Sensing of 2,4,6-Trinitrotoluene (TNT) Using
a Multi-channeled Poly(methyl methacrylate) (PMMA) Microimmunosensor. Sensors,
v.10, p.876-889, jan 2010.
CHEN, Li-li et al. Multilayered Polyelectrolyte-coated Gold Nanorods as Multifunctional
Optical Contrast Agents for Cancer Cell Imaging. J Zhejiang Univ-Sci B (Biomed &
Biotechnol), v.11, n.6, p.417-422, 2010.
CHIU, Tai-Chia; HUANG, Chih-Ching. Aptamer-Functionalized Nano-Biosensors.
Sensors, v.9, p.10356-10388, dez 2009.
17
CHOI, Jeong-Woo et al. Nanotechnology in Biodevices. J. Microbiol. Biotechnol., v.17,
n.1, p.5-14, 2007.
CHU, B. H. et al. Aluminum Gallium Nitride (GaN)/GaN High Electron Mobility
Transistor-Based Sensors for Glucose Detection in Exhaled Breath Condensate, Journal of
Diabetes Science and Technology, v.4, n.1, p.171-179, jan 2010.
DEMAS, V.; LOWERY, T. J. Magnetic Resonance for in vitro Medical Diagnostics:
Superparamagnetic Nanoparticle-based Magnetic Relaxation Switches. New Journal of
Physics, v.13, fev 2011.
DRBOHLAVOVA, J. et al. Quantum Dots — Characterization, Preparation and Usage in
Biological Systems. Int. J. Mol. Sci., v.10, p.656-673, fev 2009.
EMBRAPA AGROINDÚSTRIA TROPICAL. Aplicações de Biossensores na Análise da
Qualidade de Alimentos. Fortaleza: Documentos, 2008. v.117.
ERICKSON, D. et al. Nanobiosensors: Optofluidic, Electrical and Mechanical Approaches
to Biomolecular Detection at the Nanoscale. Microfluid Nanofluidics, v.4, n.1-2, p.33-52,
2008.
GABIG-CIMINSKA, M. et al. Identification of Pathogenic Microbial Cells and Spores by
Electrochemical Detection on a Biochip. Microbial Cell Factories, v.3, n.2, abr 2004.
GARRETT, J. R. et al. pH-Insensitive Glucose Indicators. Biotechnol Prog, v.24, n.5,
p.1085-1089, 2008.
GAUA, V. et al. Electrochemical Molecular Analysis without Nucleic Acid Amplification.
Methods, v.37, n.1, p.73-83, set 2005.
GONG, K. et al. Electrochemistry and Electroanalytical Applications of Carbon
Nanotubes: A Review. Analytical Sciences, v.21, p.1383-1393, dez 2005.
GUARISE, C. et al. Gold Nanoparticles-based Protease Assay. PNAS, v.103, n.11,
p.3978-3982, mar 2006.
HAN, K.; LIANG, Z.; ZHOU, N. Design Strategies for Aptamer-Based Biosensors.
Sensors, v.10, p.4541-4557, mai 2010.
HASEGAWA, H. et al. Improvement of Aptamer Affinity by Dimerization. Sensors, v.8,
p.1090-1098, fev 2008.
HUA, M. et al. Label-free Electrochemical Cocaine Aptasensor Based on a Targetinducing Aptamer Switching Conformation. Analytical Sciences, v.26, p.1265-1270, dez
2010.
HUANG, Y.; WU, F. Plant Tissue-based Chemiluminescence Biosensor for Ethanol.
Analytical Sciences, v.22, p.965-969, jul 2006.
18
HWANG, G. M.; DICARLO, A. A.; LIN, G. C. An Analysis on the Detection of
Biological Contaminants Aboard Aircraft. PLoS ONE, v. 6, n. 1, jan 2011.
JAIN, K. K. Applications of Nanobiotechnology in Clinical Diagnostics. Clinical
Chemistry, v.53, n.11, p.2002-2009, 2007.
JANEWAY JR, C. A. et al. Imunologia; O Sistema Imune na Saúde e na Doença. 6.ed.
Porto Alegre: Artmed, 2007. 848 p.
JOO, S. et al. Integration of a Nanoporous Platinum Thin Film into a Microfluidic System
for Non-enzymatic Electrochemical Glucose Sensing. Analytical Sciences, v.23, p.277281, mar 2007.
KLAASSEN, C. D. (ED.). Casarett and Doull’s Toxicology; The Basic Science of
Poisons. 6.ed. New York: McGraw-Hill, 2001. 1236 p.
KOHLES, S. S. et al. A Multivariate Logistical Model for Identifying the Compressive
Sensitivity of Single Rat Tactile Receptors as Nanobiosensors. J Nanotechnol Eng Med,
v.2, n.1, fev 2011.
LAIWATTANAPAISAL, W. et al. On-Chip Immunoassay for Determination of Urinary
Albumin. Sensors, v.9, p.10066-10079, dez 2009.
LEE, Jeong-O et al. Aptamers as Molecular Recognition Elements for Electrical
Nanobiosensors. Anal Bioanal Chem, v.390, p.1023-1032, 2008.
LEE, T. Ming-Hung. Over-the-Counter Biosensors: Past, Present, and Future. Sensors,
v.8, p.5535-5559, set 2008.
LIU, J.; CAO, Z.; LU, Y. Functional Nucleic Acid Sensors. Chem Rev, v.109, n.5,
p.1948-1998, mai 2009.
LOU, X. et al. Micromagnetic Selection of Aptamers in Microfluidic Channels. PNAS,
v.106, n.9, p.2989-2994, fev 2009.
LU, D. et al. The Role of Molecular Modeling in Bionanotechnology. Phys Biol, v.3, n.1,
p.S40-S53, 2006.
LUI, C.; CADY, N. C.; BATT, C. A. Nucleic Acid-based Detection of Bacterial Pathogens
Using Integrated Microfluidic Platform Systems. Sensors, v.9, p.3713-3744, mai 2009.
MA, C.; HUANG, H.; ZHAO, C. An Aptamer-based and Pyrene-labeled Fluorescent
Biosensor for Homogeneous Detection of Potassium Ions. Analytical Sciences, v.26,
p.1261-1264, dez 2010.
MAEHASHI, K.; MATSUMOTO, K. Label-Free Electrical Detection Using Carbon
Nanotube-Based Biosensors. Sensors, v.9, p.5368-5378, jul 2009.
19
MAIRHOFER, J.; ROPPERT, K.; ERTL, P. Microfluidic Systems for Pathogen Sensing:
A Review. Sensors, v.9, p. 4804-4823, jun 2009.
MCBRIDE, J. D.; COOPER, M. A. A High Sensitivity Assay for the Inflammatory Marker
C-Reactive Protein Employing Acoustic Biosensing. Journal of Nanobiotechnology, v.6,
n.5, abr 2008.
MCGOVERN, John-Paul et al. Array Lead Zirconate Titanate/Glass Piezoelectric
Microcantilevers for Real-time Detection of Bacillus anthracis with 10 spores/ml
Sensitivity and 1/1000 Selectivity in Bacterial Mixtures. Review of Scientific
Instruments, v.80, dez 2009.
MEHRVAR, M. et al. Fiber-Optic Biosensors – Trends and Advances. Analytical
Sciences, v.16, p.677-692, jul 2000.
MEHRVAR, M.; ABDI, M. Recent Developments, Characteristics, and Potential
Applications of Electrochemical Biosensors. Analytical Sciences, v.20, p.1113-1126, ago
2004.
MELO, A. F. Desenvolvimento Preliminar de um Biossensor Enzimático para
Determinação de Taninos Hidrolisáveis. 2008. 104f. (Dissertação Mestrado em Ciências) –
Universidade Federal do Rio de Janeiro. Rio de Janeiro, 2008.
NONAKA, Y.; SODE, K.; IKEBUKURO, K. Screening and Improvement of an AntiVEGF DNA Aptamer. Molecules, v.15, p.215-225, 2010.
PAPO, N. et al. A Novel Lytic Peptide Composed of DL-Amino Acids Selectively Kills
Cancer Cells in Culture and in Mice. The Journal of Biological Chemistry, v.278, n.23,
p.21018-21023, jun 2003.
PATHAK, P.; KATIYAR, V. K.; GIRI, S. Cancer Research - Nanoparticles,
Nanobiosensors and Their Use in Cancer Research. AZojono Journal of Nanotechnology
Online, v.3, set 2007.
PERIASAMY, A. P.; UMASANKAR, Y.; CHEN, Shen-Ming. Nanomaterials Acetylcholinesterase Enzyme Matrices for Organophosphorus Pesticides Electrochemical
Sensors: A Review. Sensors, v.9, p.4034-4055, mai 2009.
RAITERI, R.; GRATTAROLA, M.; BERGER, R. Micromechanics Senses Biomolecules.
Materials Today, p.22-29, jan 2002.
RAVERA, M. et al. DNA-Metallodrugs Interactions Signaled by Electrochemical
Biosensors: An Overview. Bioinorganic Chemistry and Applications, v.2007, 2007.
ROY, I.; GUPTA, M. N. Smart Polymeric Materials: Emerging Biochemical Applications.
Chemistry & Biology, v.10, p.1161–1171, dez 2003.
SONG, S.; XU, H.; FAN, C. Potential Diagnostic Applications of Biosensors: Current and
Future Directions. International Journal of Nanomedicine, v.1, n.4, p.433-440, 2006.
20
STRATIS-CULLUM, D. N. et al. Intensified Biochip System Using Chemiluminescence
for the Detection of Bacillus globiggi spores. Anal Bioanal Chem, v.391, p.1655-1660,
2008.
THÉVENOT, D. R. et al. Electrochemical Biosensors: Recommended Definitions and
Classification. Biosensors & Bioelectronics, v.16, p.121-131, 2001.
VERMA, N.; SINGH, M. A Bacillus sphaericus Based Biosensor for Monitoring Nickel
Ions in Industrial Effluents and Foods. Journal of Automated Methods and
Management in Chemistry, v.2006, p.1-4, 2006.
VESTERGAARD, M.; KERMAN, K.; TAMIYA, E. An Overview of Label-free
Electrochemical Protein Sensors. Sensors, v.7, p.3442-3458, dez 2007.
WALKEY, C.; SYKES, E. A.; CHAN, W. C. W. Application of Semiconductor and Metal
Nanostructures in Biology and Medicine. American Society Of Hematology, p.701-707,
2009.
WANG, G. et al. A Living Cell Quartz Crystal Microbalance Biosensor for Continuous
Monitoring of Cytotoxic Responses of Macrophages to Single-Walled Carbon Nanotubes.
Particle and Fibre Toxicology, v.8, n.4, 2011.
WANG, J. From DNA Biosensors to Gene Chips. Nucleic Acids Research, v.28, n.16,
p.3011-3016, 2000.
WANG, X. et al. Engineering Nanomaterial Surfaces for Biomedical Applications. Exp
Biol Med, v.234, p.1128-1139, 2009.
WANG, Y. et al. Electrochemical Sensors for Clinic Analysis. Sensors, v.8, p.2043-2081,
mar 2008.
WEIMER, B. C. et al, Solid-Phase Capture of Proteins, Spores, and Bacteria. Applied and
Environmental Microbiology, v67, n.3, p.1300-1307, mar 2001.
YANTASEE, W. et al. Electrochemical Sensors for the Detection of Lead and Other Toxic
Heavy Metals: The Next Generation of Personal Exposure Biomonitors. Environmental
Health Perspectives, v.115, n.12, p.1683-1690, dez 2007.
YAO, C. et al. Development of a Quartz Crystal Microbalance Biosensor with Aptamers as
Bio-recognition Element. Sensors, v.10, p.5859-5871, jun 2010.
YOGESWARAN, U.; THIAGARAJAN, S.; CHEN, Shen-Ming. Recent Updates of DNA
Incorporated in Carbon Nanotubes and Nanoparticles for Electrochemical Sensors and
Biosensors. Sensors, v.8, p.7191-7212, nov 2008.
ZHU, H. et al. Aptamer Based Microsphere Biosensor for Thrombin Detection. Sensors,
v.6, p.785-795, ago 2006.