Gilson José Corrêa

UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS – UEA
FUNDAÇÃO DE MEDICINA TROPICAL DO AMAZONAS – FMTAM
MESTRADO EM DOENÇAS TROPICAIS E INFECCIOSAS
PREVALÊNCIA DO PAPILOMAVÍRUS HUMANO (HPV) EM
MULHERES PORTADORAS DE LESÕES INTRA-EPITELIAIS
ESCAMOSAS DE ALTO GRAU E CARCINOMA EPIDERMÓIDE
INVASOR DO COLO UTERINO
GILSON JOSÉ CORRÊA
MANAUS
2005
ii
GILSON JOSÉ CORRÊA
PREVALÊNCIA DO PAPILOMAVÍRUS HUMANO (HPV) EM
MULHERES PORTADORAS DE LESÕES INTRA-EPITELIAIS
ESCAMOSAS DE ALTO GRAU E CARCINOMA EPIDERMÓIDE
INVASOR DO COLO UTERINO
Dissertação apresentada ao Programa de Pós
Graduação em Medicina Tropical da Universidade
do Estado do Amazonas em convênio com a
Fundação de Medicina Tropical do Amazonas,
como requisito para obtenção do grau de Mestre
em Doenças Tropicais e Infecciosas.
Orientador: Prof° Dr. SINÉSIO TALHARI
Co-orientadora: Profa CRISTINA MARIA BORBOREMA DOS SANTOS
MANAUS
2005
iii
FICHA CATALOGRÁFICA
CORRÊA, Gilson José
Prevalência do Papilomavírus humano (HPV) em mulheres portadoras de
lesões intra-epiteliais escamosas de alto grau e carcinoma epidermóide invasor do
colo uterino / Gilson José Corrêa. Manaus – AM: UEA; FMT-AM; 2005.
ix, 70 p.: il.
Dissertação (Mestrado em Doenças Tropicais e Infecciosas)
1. HPV 2. PCR 3. Câncer do colo uterino I. Título
iv
Este trabalho foi desenvolvido na Fundação de Medicina Tropical do
Amazonas-FMTAM, com recursos parcialmente providos pela Fundação Centro
de Controle de Oncologia (FCECON) e Superintendência da Zona Franca de
Manaus através do convênio nº 035/2002
v
Aos meus pais (in memorian), minha eterna
gratidão pela educação e ensinamentos de vida.
Aos meus filhos, Gabriela, Juliana, Giovanna
e Gilson Junior, razão da minha existência.
À minha esposa Kátia Socorro,
amiga e companheira de todos os momentos.
vi
AGRADECIMENTOS
À Universidade do Estado do Amazonas, Fundação de Medicina Tropical do
Amazonas e Fundação Centro de Oncologia pela construção deste ideal.
Ao Professor Doutor Sinésio Talhari, meu orientador e amigo, pela
transmissão dos conhecimentos, pelo estímulo ao desenvolvimento da pesquisa,
pela exigência de cumprir metas e alcançar objetivos, pelo exemplo de vida médica.
À Professora Cristina Borborema dos Santos, dedicada co-orientadora que
abriu as portas do laboratório de biologia molecular e não mediu esforços para a
realização deste trabalho.
Ao Professor Paulo Costa, odontólogo da Fundação Centro de Controle de
Oncologia, pelo apoio incondicional no trabalho de pesquisa biomolecular, sem o
qual não seria possível a concretização deste projeto.
Ao Dr. Manoel Jesus Pinheiro Coelho, Presidente da Fundação Centro de
Controle de Oncologia, amigo e parceiro, pelo seu incansável esforço na construção
de um hospital humano e na valorização da formação acadêmica e profissional.
Ao Professor Doutor Spartaco Astolfi Filho, por compartilhar o conhecimento
entre as instituições de pesquisa, o que engrandece e dignifica o trabalho do
Laboratório de Biologia Molecular da UFAM.
À
Professora
Doutora
Maria
das
Graças
Vale
Barbosa,
dinâmica
coordenadora do curso de mestrado da UEA-FMTAM, pela dedicação, carinho,
estímulo e apoio, durante todo o desenvolvimento do nosso curso.
A Felicien Gonçalves Vasquez, pelo trabalho estatístico dos dados.
À Maria da Conceição Santos Tufic, secretária do Curso de Mestrado, pela
prestimosidade.
Aos funcionários da Fundação Centro de Controle de Oncologia, a gratidão.
Aos meus colegas do curso de mestrado, Alex, Claudia, Franklin, Gastão,
Gildo, Ione, Iran, Luiza Anne, Magela, Marianna, Rauíres, Silvia, Socorro Salazar e
Viviane, pelo convívio fraterno e inesquecível.
As pacientes portadoras de câncer do colo uterino, as quais dedicamos este
trabalho, pelo testemunho da fé no Ser Supremo e pelo ensino da valorização do
maior dos bens - a preciosidade da vida humana.
vii
RESUMO
O câncer do colo uterino constitui um importante problema de saúde pública
nos países em desenvolvimento. No Brasil, as maiores taxas de incidência e
mortalidade concentram-se nas capitais das regiões norte e nordeste. Vários
estudos epidemiológicos associam o Papilomavírus humano (HPV) com o
desenvolvimento do câncer do colo uterino. Objetivo: no presente estudo, procurouse investigar a presença do HPV em mulheres portadoras de lesão intra-epitelial
escamosa de alto grau e carcinoma epidermóide invasor do colo uterino, visando
estimar a prevalência da infecção e pesquisar fatores sóciodemográficos associados
com a doença. Método: estudo transversal, descritivo, prospectivo, com 42 mulheres
entre 18 e 73 anos, incluindo 32 lesões intra-epiteliais escamosas cervicais e 10
carcinomas epidermóides invasores do colo uterino. As seqüências de DNA de HPV
foram pesquisadas, utilizando-se a reação em cadeia da polimerase (PCR) com
iniciadores MY09/MY11 e GP5+/GP6+. Procurou-se, ainda, identificar o sorotipo
infectante, via seqüenciamento do DNA viral, por comparação das seqüências de
nucleotídeos encontradas e as armazenadas no Gene Bank. Os fatores
sociodemográficos associados à neoplasia do colo uterino foram estudados a partir
da análise de correspondência, sendo empregado o programa Statistica versão 6.0
for Windows. Conclusões: detectou-se o HPV, por PCR, nas 42(100%) mulheres
portadoras de lesão intra-epitelial escamosa de alto grau e carcinoma epidermóide,
invasor do colo uterino. Em 24(57,1%) destas amostras conseguiu-se realizar o
seqüenciamento e identificar o sorotipo de HPV. Foram identificados, por ordem
descendente de freqüência, os tipos 16, 33, 31, 56, 66 e 6. O mais comum foi o HPV
16 em 18(75,0%) casos. Na avaliação estatística dos fatores sociodemograficos
pesquisados, tais como a idade do primeiro coito antes dos 16 anos, número maior
que três parceiros sexuais, multiparidade, fumo e baixo nível socioeconômico
demonstraram significativa associação com a população do presente estudo.
Palavras chaves: HPV. PCR. Câncer colo uterino. Lesão intra-epitelial alto grau.
FCECON.
viii
ABSTRACT
In developing countries uterine cervical cancer constitute a real public health
problem. In Brazil, the highest rate of incidence and mortality are concentrated in the
capital cities of the north and northeast regions. Several epidemiological studies
associate Human Papillomavirus (HPV) with the development of uterine cervical
cancer. Objective: the present study with sought to investigate the presence of HPV
in women, carries of a high grade squamous intraepithelial lesions and invasive
epidermoide carcinoma cervical. Seeking to estimate the prevalence of the infection
and to research the socialdemographic factors associated with the disease. Method:
transversal, descriptive, prospective study with 42 women between 18 and 73 years,
including 32 high grade squamous intraepithelial lesions and 10 invasive
epidermoide carcinoma cervical. The sequences of DNA of HPV were researched,
using the polymerase chain reaction (PCR) with primers MY09/MY11 and
GP5+/GP6+. It was also tried to identify the infection serum type, through the sequel
of the viral DNA, for comparison of the sequences of nucleotides found and stored in
the Gene Bank. The social demographic factors associated to the uterine cervical
cancer were studied starting from a correspondence analysis, by program Statistic
6.0 version for Windows. Conclusions: HPV was detected, by PCR, in the 42
(100%) women carriers of high grade squamous intraepithelial lesions and invasive
epidermoide carcinoma cervical. In 24 (57,1%) of the these samples it was able to
accomplish the sequels and to identify the serum type of HPV. They were indentified,
by order of descendent and frequency, the types 16, 33, 31, 56, 66, and 6. The most
common was HPV 16 out of 18 (75,0%) cases. In the statistical evaluation of the
socialdemographic factors researched, such as the first sexual intercourse before the
age of 16, women having up to or more than tree sexual partners, multipary, smoking
history and social economic low level of life demonstrated a significant association
with the population in the present study.
Key words: HPV. PCR. Uterine cervical cancer. High grade squamous
intraepithelial lesion. FCECON.
ix
LISTA DE TABELAS
TABELA 1
Brasil. Estimativas para o ano 2005 das taxas brutas de
incidência por 100.000 e de números de casos novos por
câncer, em mulheres, segundo localização primária.
2
TABELA 2
Distribuição das 10 neoplasias malignas, mais freqüentes
no período de 1997 a 2001 – sexo feminino. Manaus. AM.
3
TABELA 3
Probabilidades de regressão, persistência e progressão
das lesões intra-epiteliais cervicais.
15
TABELA 4
Comparação entre métodos de detecção de genomas de
HPV.
21
TABELA 5
Prevalência de Papilomavírus humano (HPV) em mulheres
portadoras de lesões intra-epiteliais escamosas de alto
grau e carcinoma epidermóide invasor do colo uterino.
Distribuição segundo a idade da população do estudo.
30
TABELA 6
Prevalência de Papilomavírus humano (HPV) em mulheres
portadoras de lesões intra-epiteliais escamosas de alto
grau e carcinoma epidermóide invasor do colo uterino.
Distribuição segundo o estado civil.
31
TABELA 7
Prevalência de Papilomavírus humano (HPV) em mulheres
portadoras de lesões intra-epiteliais escamosas de alto
grau e carcinoma epidermóide invasor do colo uterino.
Distribuição segundo a renda familiar.
33
TABELA 8
Prevalência de Papilomavírus humano (HPV) em mulheres
portadoras de lesões intra-epiteliais escamosas de alto
grau e carcinoma epidermóide invasor do colo uterino.
Distribuição segundo a procedência.
33
TABELA 9
Prevalência de Papilomavírus humano (HPV) em mulheres
portadoras de lesões intra-epiteliais escamosas de alto
grau e carcinoma epidermóide invasor do colo uterino.
Distribuição segundo a idade da primeira relação sexual.
34
TABELA 10 Prevalência de Papilomavírus humano (HPV) em mulheres
portadoras de lesões intra-epiteliais escamosas de alto
grau e carcinoma epidermóide invasor do colo uterino.
Distribuição segundo a idade da primeira gestação.
35
x
TABELA 11 Prevalência de Papilomavírus humano (HPV) em mulheres
portadoras de lesões intra-epiteliais escamosas de alto
grau e carcinoma epidermóide invasor do colo uterino.
Distribuição segundo o número de partos por via vaginal.
36
TABELA 12 Prevalência de Papilomavírus humano (HPV) em mulheres
portadoras de lesões intra-epiteliais escamosas de alto
grau e carcinoma epidermóide invasor do colo uterino.
Distribuição segundo o uso de anticoncepcional hormonal
oral.
36
TABELA 13 Prevalência de Papilomavírus humano (HPV) em mulheres
portadoras de lesões intra-epiteliais escamosas de alto
grau e carcinoma epidermóide invasor do colo uterino.
Distribuição segundo o fumo.
37
TABELA 14 Prevalência de Papilomavírus humano (HPV) em mulheres
portadoras de lesões intra-epiteliais escamosas de alto
grau e carcinoma epidermóide invasor do colo uterino.
Distribuição segundo sangramento anormal.
38
TABELA 15 Prevalência de Papilomavírus humano (HPV) em mulheres
portadoras de lesões intra-epiteliais escamosas de alto
grau e carcinoma epidermóide invasor do colo uterino.
Distribuição segundo sangramento ao coito.
38
TABELA 16 Prevalência de Papilomavírus humano (HPV) em mulheres
portadoras de lesões intra-epiteliais escamosas de alto
grau e carcinoma epidermóide invasor do colo uterino.
Caracterização das amostras e respectivos acessos ao
Gene Bank.
43
xi
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1
Representação esquemática do genoma do HPV.
7
FIGURA 2
Demonstração do método de coleta da citologia cervical.
18
FIGURA 3
Escova utilizada para coleta de material ecto e endocervical.
24
FIGURA 4
Prevalência de Papilomavírus humano (HPV) em mulheres
portadoras de lesões intra-epiteliais escamosas de alto grau
e carcinoma epidermóide invasor do colo uterino.
Distribuição segundo a escolaridade.
32
FIGURA 5
Prevalência de Papilomavírus humano (HPV) em mulheres
portadoras de lesões intra-epiteliais escamosas de alto grau
e carcinoma epidermóide invasor do colo uterino.
Distribuição segundo a idade da primeira relação sexual.
34
FIGURA 6
Prevalência de Papilomavírus humano (HPV) em mulheres
portadoras de lesões intra-epiteliais escamosas de alto grau
e carcinoma epidermóide invasor do colo uterino. Análise de
correspondência.
39
FIGURA 7
Prevalência de Papilomavírus humano (HPV) em mulheres
portadoras de lesões intra-epiteliais escamosas de alto grau
e carcinoma epidermóide invasor do colo uterino.
Distribuição segundo o resultado do exame histopatológico.
40
FIGURA 8
PCR - Demonstração dos fragmentos de 450 pb de HPV
com MY09/MY11, através da eletroforese em gel de agarose
(amostras 1 a 40).
41
FIGURA 9
PCR - Demonstração dos fragmentos de 450 pb de HPV
com MY09/ MY11através de eletroforese em gel de agarose
(amostras 41 e 42).
42
FIGURA 10
PCR - Demonstração dos fragmentos de 150 pb para HPV
com GP5+/GP6+ (Nested-PCR), através de eletroforese em
gel de agarose.
42
FIGURA11
Prevalência de Papilomavírus humano (HPV) em mulheres
portadoras de lesões intra-epiteliais escamosas de alto grau
e carcinoma epidermóide invasor do colo uterino. Resultado
dos sorotipos de HPV identificados nas amostras PCR
positivas.
45
xii
LISTA DE ABREVIATURAS
HPV
Papilomavírus humano
NIC
Neoplasia intra-epitelial cervical
LIEBG
Lesão intra-epitelial escamosa de baixo grau
LIEAG
Lesão intra-epitelial escamosa de alto grau
IARC
Agência Internacional para o Controle do Câncer
INCA
Instituto Nacional do Câncer
FCECON
Fundação Centro de Controle de Oncologia
FMTAM
Fundação de Medicina Tropical do Amazonas
UEA
Universidade do Estado do Amazonas
UFAM
Universidade Federal do Amazonas
PCR
Reação em cadeia da polimerase
xiii
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO
O CÂNCER DO COLO UTERINO
1.1 Epidemiologia
1.1.1 Incidência
1.1.2 Mortalidade
1.1.3 Fatores de Risco
1.2 Papilomavírus Humano (HPV) e Câncer do Colo Uterino
1.2.1 Genoma do HPV
1.2.2 Patogênese e Papel Oncogênico do HPV
1.3 Lesões Precursoras do Câncer do Colo Uterino
1.3.1 Lesões Intra-epiteliais Escamosas
1.3.2 Lesões Intra-epiteliais Glandulares
1.3.3 Terminologia
1.3.4 História Natural das Lesões Precursoras
1.4 Métodos Diagnósticos
1.4.1 Colposcopia
1.4.2 Colpocitologia (Teste de Papanicolaou)
1.4.2.1 Sistema de Coleta com Base Líquida
1.4.3 Exame Histopatológico
1.4.4 Métodos Moleculares
1.4.4.1 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
1
1
1
1
4
4
6
7
8
10
10
11
12
14
15
16
17
2. OBJETIVOS
2.1 Geral
2.2 Específicos
22
22
22
3. METODOLOGIA
3.1 Modelo de Estudo
3.2 Universo de Estudo
23
23
18
19
19
20
23
3.2.1 População de Estudo
23
3.2.2 Critério de Inclusão
23
3.2.3 Critério de Exclusão
23
3.2.4 Número de Mulheres Participantes do Estudo
23
3.3 Procedimentos
23
3.3.1 Seleção de Pacientes
23
3.3.2 Orientações às Pacientes
24
xiv
3.3.3 Coleta de Material para PCR
24
3.4 Exame Histopatológico
24
3.5 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
25
3.5.1 Primers (iniciadores)
25
3.5.2 Extração de DNA
25
3.5.2.1 Amostras sem Sangue
25
3.5.2.2 Amostras com Sangue
26
3.5.3 PCR
26
3.5.3.1 PCR para controle do DNA
26
3.5.3.2 PCR para detecção do HPV
27
3.5.3.3 Purificação dos produtos da PCR
27
3.5.4 Seqüênciamento dos Produtos da PCR
3.5.4.1 Reação de Sequenciamento
28
28
3.5.4.2 Precipitação do Produto da Reação de Seqüenciamento 28
3.5.4.3 Eletroforese para Seqüênciamento
29
3.5.4.4 Alinhamento das Amostras Seqüenciadas
29
3.5.5 Análise do Resultado das Sequências Nucleotidicas
4. RESULTADOS
29
30
4.1 Características da População
30
4.2 Análise dos Dados Sociodemográficos
38
4.3 Resultados dos Exames Histopatológicos
40
4.4 Detecção e Identificação de HPV por PCR
41
4.4.1 Reação de Amplificação por PCR
41
4.4.2 Reação de Seqüênciamento
43
5. DISCUSSÃO
46
6. CONCLUSÃO
57
7. BIBLIOGRAFIA
58
8. ANEXOS
68
1
1 INTRODUÇÃO
O Câncer do Colo Uterino
1.1 Epidemiologia
1.1.1 Incidência
Em mulheres, em todo o mundo, o câncer do colo uterino é a segunda
neoplasia maligna; a primeira é o câncer de mama. Anualmente, aproximadamente,
400.000 novos casos de câncer cervical são diagnosticados e mais de 200.000
mulheres morrem em conseqüência desta neoplasia (PARKIN et al., 2005). Em
média, 80% destes eventos ocorrem nos países em desenvolvimento (MUNOZ,
2003).
Segundo os dados do “Câncer Incidence in Five Continents”, da Agência
Internacional para o Controle do Câncer (IARC), da Organização Mundial de Saúde,
fica evidente a diferente incidência entre países europeus e americanos e países da
América do Sul, da Ásia e da África. A taxa de incidência mundial é de 16,0/100.000
mulheres (IARC, 2002).
As taxas de incidência mais elevadas encontram-se no Caribe (Haiti –
64.7/100.000), América do Sul (Bolívia – 42,0/100.000, Guyana – 40.7/100.000 e
Peru – 40.5/100.000) e Sul da África (Lesotho – 46,1/100.000). As menores taxas
encontram-se nos países do oeste asiático (Síria – 1,4/100.000; Iraque –
2,1/100.000; Qatar e Jordânia – 2,4/100.000) (IARC, 2002).
Na Europa, as taxas de incidência mais elevadas encontram-se na Sérvia e
Montenegro (34,4/100.000), Bósnia (26,6/100.000) e Romênia (30,3/100.000). As
menos elevadas encontram-se na Finlândia (6,2/100.000), Irlanda (8,4/100.000) e
Islândia (9,2/100.000) (IARC, 2002).
Nos Estados Unidos e no Canadá as taxas de incidência foram de
9,0/100.000 e 9,5/100.0000 mulheres, respectivamente (IARC, 2002).
2
No Brasil, segundo o Instituto Nacional do Câncer (INCA), órgão do Ministério
da Saúde, o número de casos novos de câncer de colo do útero esperados para o
Brasil em 2005 é de 20.690, com risco estimado de 22 casos para 100 mil habitantes
(Tabela 1) (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2004).
Sem considerar os tumores de pele, não melanoma, o câncer do colo do útero
é o mais incidente na região Norte (23/100.000). Nas regiões Sul (31/100.000),
Centro Oeste (23/100.000), Sudeste (22/100.000) e Nordeste (18/100.000)
representa o segundo tumor mais incidente, superado pelo câncer de mama
(MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2004).
Tabela 1. Brasil. Estimativas para o ano 2005 das taxas brutas de incidência por
100.000 e de números de casos novos por câncer, em mulheres, segundo a
localização primária (Ministério da Saúde, 2004).
Estimativa dos Casos Novos
Localização Primária
Neoplasia Maligna
Brasil
Estado
Capital
Casos
Taxa Bruta
Casos
Taxa Bruta
Pele, não melanoma
56.600
60,53
15.010
68,58
Mama Feminina
49.470
52,93
18.220
82,55
Traquéia, Brônquio e Pulmão
8.680
9,31
2.855
12,78
Estômago
7.975
8,62
2.520
11.62
Colo do útero
20.690
22,14
6.600
30,03
Cólon e Reto
13.640
14,60
5.295
23,80
Esôfago
2.450
2,61
525
2,33
Leucemias
4.075
4,35
1.275
5,90
Cavidade Oral
3.895
4,18
1.255
5,66
Pele Melanoma
3.065
3,27
1.010
4,40
67.290
71,96
21.945
99,97
237.830
254,35
76.510
348,63
Outras Localizações
Total
3
No Estado do Amazonas, segundo estimativa do INCA para o ano 2005, a
taxa de incidência para o câncer do colo uterino esperada é de 32,99/100.000, com
530 novos casos de doença (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2004).
Em Manaus, capital do estado do Amazonas, a taxa de incidência estimada
para o ano 2005 será a segunda maior do país, com 56,44/100.000 e 470 novos
casos, superada por Belém do Pará, com 56,54/100.000 e 430 novos casos
(MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2004).
A Fundação Centro de Controle de Oncologia (FCECON), em Manaus,
referência para o tratamento de câncer na Amazônia Ocidental, registra que no
período de 1997 a 2001, o câncer do colo uterino foi a neoplasia maligna que
apresentou maior incidência: 2.194 (52,1%) casos, entre as localizações primárias
de câncer em pacientes do sexo feminino (Tabela 2). É importante ressaltar que os
maiores percentuais de câncer da pele não estão registrados na FCECON, porque
os casos são atendidos nas clínicas/serviços dermatológicos do município
(FCECON, 2004).
Tabela 2. Distribuição das 10 neoplasias malignas, mais freqüentes no período de
1997 a 2001 – sexo feminino. Manaus-AM (FCECON, 2004).
Localização Topográfica
Nº de casos
Percentual
Colo uterino
2.194
52,1%
Mama
740
17,6%
Pele (*)
166
3,9%
Ovário
120
2,8%
Estômago
95
2,3%
Brônquios/Pulmão
83
2,0%
Linfonodos
79
1,9%
Laringe
13
0,3%
Sistema hematopoético e
48
1,1%
reticuloendotelial
Outros tipos
675
16,0%
TOTAL
4.213
100,0%
(*) A FCECON não é referência para câncer de pele em Manaus.
1.1.2 Mortalidade
4
Segundo a IARC, a taxa de mortalidade mundial é de 8,9/100.000 mulheres.
As maiores taxas de mortalidade ocorrem na África oriental (20,6/100.000) e as
menores são verificadas na Ásia ocidental (2,2/100.000) e Austrália (2,8/100.000)
(IARC, 2002).
Na Europa, a maior taxa de mortalidade ocorreu em países do centro e leste
europeu - (10,9/100.000); a menor no norte europeu (5,8/100.000) (IARC,2002) .
Dados fornecidos pela “American Câncer Society” mostram que nos Estados
Unidos, na década de 40, a mortalidade era aproximadamente de 14/100.000.
Paulatinamente, esse valor foi decrescendo, atingindo, no final dos anos 80, a cifra
de 5/100.000 (FOCCHI et al, 2000).
De acordo com dados da IARC, a taxa de mortalidade nos Estados Unidos é
de 3,6/100.000 e no Canadá é de 3,7/100.000 (IARC, 2002).
A taxa de mortalidade continua elevada no Brasil e, ao longo dos anos, vem
aumentando: em 1979, a taxa, que era de 3,44/100.000, aumentou para
4,59/100.000 no ano 2000; no período, a variação percentual relativa foi de +33,1%
(MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2003).
Segundo dados do INCA, a taxa de mortalidade por câncer do colo uterino,
por 100.000 mulheres, entre 1995 e 1999 foi maior nos estados do Amapá (6,74) e
Amazonas (6,53) (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2003).
1.1.3 Fatores de risco
Vários estudos epidemiológicos realizados no decorrer do século XX
indicaram consistentemente que o risco de câncer cervical está fortemente
influenciado pelo comportamento sexual e o baixo nível sócio econômico. A idade
prematura do início da vida sexual, a multiplicidade de parceiros e a co-infecção com
outras DST, em mulheres com carcinoma cervical, levaram à pesquisa de possíveis
fatores transmissíveis, sexualmente (DE PALO, 1996).
Nestes estudos, foram identificados vários fatores de risco, associados ao
câncer do colo uterino.
Dentre eles, destaca-se os tipos oncogênicos de
5
Papilomavirus humano (HPV), relação sexual precoce, múltiplos parceiros sexuais,
multiparidade, uso prolongado de anticoncepcionais orais, tabagismo, baixo nível
socioeconômico, infecção por Chlamydia trachomatis, deficiência de micronutrientes
e dieta deficiente em vegetais e frutas (BOSCH et al., 1995; SCHIFFMAN et al.,
1996; WALBOOMERS et al., 1999; FRANCO et al., 1999; FERENCZY e FRANCO,
2002, IARC 2005).
No Quadro 1 são apresentados os principais fatores de risco, associados com
o câncer cervical.
Comportamento sexual
•
•
•
•
•
Múltiplos parceiros sexuais
Início precoce das atividades sexuais
Não uso dos métodos de barreira
Parceiro promíscuo
Parceiro não-circuncisado
Infecções sexualmente transmissíveis
•
HPV de alto risco, Chlamydia trachomatis, HSV-2, HIV
Fatores ambientais e biológicos
•
•
•
•
•
•
•
Tabagismo
Imunocomprometimento
Deficiência de Vitaminas A, C e E
Uso prolongado de anticoncepcionais orais
Paridade
Idade avançada
Predisposição genética?
Fatores socioeconômicos
•
•
•
•
Baixo poder aquisitivo
Difícil acesso a programas de saúde
População rural
Não realização de exames periódicos
Quadro 1. Fatores de risco para lesão intra-epitelial cervical e câncer do colo
uterino. (Adaptado de Figueiredo, 2004).
6
1.2 Papilomavírus Humano (HPV) e Câncer do Colo Uterino
Com a introdução das técnicas de biologia molecular foi possível detectar
seqüências de DNA viral, o que resultou na descoberta e clonagem molecular do
Papilomavírus humano (HPV) em biópsias de câncer cervical. Este achado levou à
suspeita de que este vírus seria importante na carcinogênese (PFISTER,1997). Os
primeiros trabalhos foram publicados por Hausen et al. (1981), na Alemanha e
Meisels e Morim (1981), no Canadá (FOCHI et al., 2000).
Diversos estudos utilizando PCR (reação em cadeia da polimerase), uma
técnica de alta sensibilidade e especificidade, descrita por Mullis, Faloona, Scharf et
al., (1986) foram fundamentais para estabelecer a associação do HPV com lesões
verrucosas genitais e aos cânceres cervical, vulvar, vaginal, peniano, perianal e anal
(WIELAND e PFISTER, 1999).
Através de estudo realizado em 22 países, com 1.000 amostras de câncer
cervical, constatou-se que em 93% dos casos havia a presença de DNA do HPV.
Acredita-se que as amostras negativas correspondam a tipos ainda não genotipados
ou outros fatores causais desconhecidos (BOSCH et al., 1995).
Um painel de consenso patrocinado pela Agência Internacional para o
Controle do Câncer (IARC), da Organização Mundial de Saúde, concluiu que
existem evidências de peso, tanto do ponto de vista biológico quanto epidemiológico,
para considerar a infecção pelo HPV como a causa do câncer cervical (FRANCO,
1997).
Além do HPV, vários agentes de doenças sexualmente transmissíveis (DST)
têm sido relatados como fatores de risco para o carcinoma cervical. Entre eles
podemos destacar: Chlamydia trachomatis, herpes, citomegalovírus, vírus EpsteinBarr, Trichomonas vaginalis, vírus da hepatite B e C, Neisseria gonorrhoeae,
Treponema pallidum e HIV, entre outros (MANDELBLATT et al., 1999; GROSS e
BARRASSO, 1999).
7
1.2.1 Genoma do HPV
Os papilomavírus são pequenos vírus DNA tumorais (55 nm), de dupla hélice,
com aproximadamente 8.000 pares de bases nitrogenadas e uma estrutura
icosaédrica não envelopada, composta de 72 capsômeros, pertencente à família
Papovaviridae (DORES, 1994).
O genoma circular é constituído por nove regiões codificadoras dividido em
três segmentos: uma região de ação precoce, por ser a primeira a se expressar
denomina-se early (E), compreendendo seis genes, E1 a E7, necessárias à
replicação viral e com propriedades de transformação oncogênica; uma região de
ação tardia, denominada late (L), que codifica duas proteínas estruturais, as
proteínas L1 e L2 do capsídio viral. A região não codificadora, regulatória, conhecida
como large control region (LCR), contém as sequências de controle para a
replicação e expressão genética do HPV (Figura 1) (TUREK, et al, 1994; DORES,
1994;CARVALHO, 2000).
Figura 1. Representação esquemática do genoma do HPV (Dôres, 1994)
8
Estes vírus têm sido detectados em grande número de vertebrados; porém,
são altamente específicos da espécie. Atualmente, mais de 100 tipos de HPV são
conhecidos; destes, em torno de 30 tipos estão associados com infecções do trato
anogenital. Os tipos de HPV variam no seu tropismo tecidual, nas suas associações
a lesões diferentes e no seu potencial oncogênico (GROSS e BARRASSO, 1999;
MENENDEZ, 2002; QUINT et al., 2002).
De acordo com a sua capacidade de transformação neoplásica, os HPV
podem ser classificados em grupos de baixo e alto risco. Doze tipos de HPV foram
classificados como de baixo risco: 6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 70, 72, 81 e
CPC6108. Quinze tipos foram classificados como de alto risco: 16, 18, 31, 33, 35,
39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73 e 82. Os tipos 26, 53 e 66 devem ser considerados
provavelmente carcinogênicos (MUNOZ, 2003).
1.2.2 Patogênese e Papel Oncogênico do HPV
Os
Papilomavírus
humanos
(HPV)
são
inoculados
através
de
microtraumatismos ou soluções de continuidade nos epitélios pavimentosos íntegros
da pele ou mucosas do hospedeiro. Os vírions perdem o seu invólucro proteíco e o
genoma viral atinge o núcleo da célula, onde ele se estabelece de forma epissomal.
Quando o vírus infecta a célula, existem três possíveis evoluções: a) o organismo
consegue eliminar o vírus; b) a infecção pode permanecer de forma latente, onde o
DNA viral reside no núcleo e a replicação fica ligada ao ciclo celular e c) a infecção
pode ser subclínica ou clínica (PEREYRA, 2000).
Na maioria das mulheres, as infecções pelo HPV são transitórias. Em geral, a
prevalência da infecção pelo HPV é variável, atingindo aproximadamente 20 - 30%
das mulheres entre 20 e 24 anos de idade. À seguir, diminui para aproximadamente
3% a 10% das mulheres com mais de 30 anos de idade (HERRERO et al., 1997a;
HERRERRO et al., 1997b; SELLORS et al., 2000). Em torno de 80% das mulheres
9
jovens que contraem o HPV, as infecções são transitórias, com resolução
espontânea em 12 a 18 meses (HO et al., 1998; FRANCO et al, 1999; THOMAS et
al., 2000, LIAW et al, 200, IARC, 2005).
Geralmente, o câncer se desenvolve à partir de várias alterações genéticas,
que levam à ativação dos oncogenes ou à inativação dos genes supressores de
tumor (GROSS e BARRASSO, 1999).
Experimentos genéticos demonstraram atividade oncogênica dos genes virais
E6, E7 e E5 interagindo com os mecanismos de controle do ciclo celular
(PFISTER,1977).
A proteína E6 dos HPVs genitais de alto risco formam complexos com p53
(proteína de 53KDa). Estudos comprovaram que o gene 53, está localizado no
cromossomo 17 e o produto do gene, a proteína p53, está envolvida nas vias de
reparo ao dano do DNA, levando a uma interrupção do ciclo celular na fase G1 ou
induzindo a apoptose. Por esta atividade de supressão do crescimento tumoral a
p53 tem sido chamada de “guardiã do genoma”. A degradação e inativação de p53
resultam em aumento da instabilidade genética e em acúmulo das mutações
oncogênicas (GROSS e BARRASSO, 1999).
A proteína E7 do HPV 16 forma complexos de alta afinidade com pRB
(proteína do gene supressor do tumor retinoblastoma). O gene RB está localizado no
cromossomo 13 e o produto do gene, a proteína pRB (105KDa) interage com o fator
de transcrição celular E2F na fase G0 e G1 do ciclo celular. Tal interação inibe a
trancrição induzida por E2F dos genes celulares ciclo-regulados, como a timidina
cinase, c-myc, polimerase alfa, necessária para a entrada na fase S do ciclo celular.
A proteína viral E7 pode dissociar o complexo da pRB/E2F. A inativação da pRB e a
liberação do fator de transcrição E2F que passa a ser ativo em todas as fases do
ciclo celular, explica o encurtamento da fase G1 e o crescimento celular
desordenado das células tumorais HPV-positivas (CHELLAPPAN et al., 1992;
GROSS & BARRASSO, 1999; PFISTER, 1977; FOCCHI, 2000).
10
As proteínas E5 (8-10KDa) do HPV podem ser encontradas dentro das
membranas intracelulares do aparelho de Golgi, no retículo endoplasmático e nas
membranas nucleares. A superexpressão somente das proteínas E5 pode modificar
o crescimento celular e resultar em uma franca transformação neoplásica em alguns
sistemas experimentais. Suas atividades transformantes são devido à estimulação
mitogênica através do sinal das vias de transdução dos receptores do fator de
crescimento. Os ceratinócitos que expressam E5 mostraram ter número aumentado
de fator de crescimento epidérmico (EGFRs - epidermal growth factor receptors)
(TUREK e SMITH, 1997;GROSS e BARRASSO, 1999).
Os genes L1 e L2, codificam as proteínas do capsídio viral (DÔRES, 1994).
Estes genes possuem seqüências altamente conservadas entre todos os tipos de
papilomavírus (BERNARD, 1994).
A instabilidade genética provocada por oncoproteínas virais e o aumento
catalítico na expressão da oncoproteína provocada por mutações no genoma viral e
celular identificam o vírus como importante força impulsionadora de progressão
tumoral (PFISTER, 1997).
1.3 Lesões Precursoras do Câncer do Colo Uterino
1.3.1 Lesões Intra-epiteliais Escamosas
O conceito dos precursores do câncer do colo uterino remonta ao final do
século XIX, quando Williams (1888) notou, nas margens dos cânceres invasores,
áreas de epitélio atípico, reconhecidas como sendo não invasoras. Broders (1932)
introduziu o termo carcinoma in situ para designar o padrão microscópico no qual
toda a espessura do epitélio escamoso cervical é completamente substituída por
células anormais indiferenciadas, morfologicamente indistinguíveis do câncer, não
ocorrendo invasão do estroma subjacente (RICHART e WRIGHT, 1995).
11
Reagan et al. (1953) introduziram o termo displasia para distinguir o grupo de
lesões em que os distúrbios da diferenciação epitelial não se estende por toda a sua
espessura. Esta classificação graduava as lesões em três grupos – leve, moderada
e acentuada, de acordo com o grau de atipia celular e da arquitetura epitelial (DE
PALO, 1996).
Com base em estudos epidemiológicos de risco para evolução para o câncer
e pelas características morfológicas de um processo único, contínuo e progressivo,
estas lesões foram agrupadas como “neoplasia intra-epitelial” (NIC), denominação
aplicada por Richart (1968) que classificou-as em três graus, de acordo com a
intensidade das alterações , correspondente às displasia leve ou NIC I, displasia
moderada ou NIC II e displasia acentuada/carcinoma in situ ou NIC III (RICHART e
WRIGHT, 1995).
A neoplasia intra-epitelial cervical grau I (NIC I) é definida pela presença de
células com diferenciação alterada presentes no terço inferior do epitélio. A
neoplasia intra-epitelial cervical grau II (NIC II) é diagnosticada quando as células
com diferenciação alterada ocupam os 2/3 inferiores do estrato epitelial. A neoplasia
intra-epitelial grau III (NIC III) é diagnosticada quando as células indiferenciadas
comprometem mais de 2/3 ou toda a espessura do epitélio, quando a lesão seria
indistinguível do carcinoma in situ (DE PALO, 1996).
Nas últimas décadas, a associação com o Papilomavírus humano (HPV)
ficou bem estabelecida com base em estudos epidemiológicos e métodos
biomoleculares (FIGUEIREDO,2004).
1.3.2 Lesões Intra-epiteliais Glandulares
A lesão precursora reconhecida como tendo sido originada do epitélio
cilíndrico cervical é o adenocarcinoma in situ, que se caracteriza histologicamente
pela substituição total ou parcial do epitélio endocervical por células glandulares de
aspecto neoplásico; mostra aumento da relação núcleo/citoplasma, hipercromasia,
mitoses freqüentes e depleção de muco. Pode assumir vários tipos de diferenciação
celular (CARVALHO, 2000).
12
O adenocarcinoma in situ pode estar associado ao NIC do epitélio escamoso
em um a dois terços dos casos (IARC, 2005).
1.3.3 Terminologia
Em 1988, o National Cancer Institute de Bethesda reuniu, na cidade de
Bethesda (EUA), especialistas em colpocitologia e patologia cervical, com o objetivo
de elaborar uma classificação citopatológica usando terminologia estandartizada.
Deste encontro resultou o “Bethesda System”. Revisada em 1991 e 2001, o Sistema
Bethesda constitui-se, atualmente, no principal meio de comunicação entre o clínico
e o citopatologista (CARVALHO, 2000).
Nesta classificação são consideradas como lesões intra-epiteliais escamosas de
baixo grau – LSIL (do inglês: low grade squamous intraepithelial lesion), as
displasias leves ou NIC I e as alterações citopáticas do HPV. As lesões intraepiteliais escamosas de alto grau – HSIL (do inglês: high grade squamous
intraepithelial lesion), as displasias moderadas ou NIC II, as displasias acentuadas
ou NIC III e o carcinoma in situ (BETHESDA SYSTEM, 2001).
Em 1999, a Sociedade Brasileira de Patologia, publicou o Manual de padronização
de laudos histopatológicos, baseado no Sistema Bethesda. Foi incluída a
terminologia “lesão escamosa intra-epitelial cervical”, em associação com o termo
“neoplasia intra-epitelial cervical” (HORTA e FONSECA, 1999).
O Ministério da Saúde, através do Instituto Nacional do Câncer (INCA), em
Seminário Nacional, realizado no Rio de Janeiro em 2003, implantou a
Nomenclatura Brasileira para Laudos Citopatológicos Cervicais. Foi adotada a
terminologia de lesão intra-epitelial em substituição ao termo neoplasia , além de
estabelecer dois níveis, baixo e alto graus, separando as lesões com potencial
morfológico de progressão para neoplasia daquelas mais relacionadas com o efeito
citopático viral, com potencial regressivo ou de persistência. Foi incluída a
13
possibilidade diagnóstica de suspeita de micro-invasão (MINISTÉRIO DA SAÚDE,
2003).
No Quadro 2, apresentamos a nomenclatura adotada pelo Ministério da Saúde
(2003). Por ter a anuência das sociedades científicas envolvidas com a confirmação
diagnóstica e ter sido incorporada pelos serviços do Sistema Único de Saúde
(SUS), escolhemos esta nomenclatura para ser utilizada no presente trabalho.
Quadro 2. Nomenclatura para laudos citopatológicos cervicais – lesões intraepiteliais e neoplasias invasoras do colo uterino (Ministério da Saúde, 2003).
NOMENCLATURA
BRASILEIRA
PARA
LAUDOS
CITOPATOLÓGICOS
CERVICAIS – lesões intra-epiteliais e neoplasias invasoras do colo uterino
Lesão em células escamosas
Lesão intra-epitelial escamosa de compreendendo efeito citopático pelo HPV e
baixo grau
neoplasia intra-epitelial cervical grau
Lesão intra-epitelial escamosa de compreendendo
alto grau
neoplasias
intra-epiteliais
cervicais grau II e III
Lesão intra-epitelial escamosa de alto grau, não podendo excluir micro-invasão
Carcinoma epidermóide invasor
Lesão em epitélio glandular
Adenocarcinoma “in situ”
Cervical
Adenocarcinoma invasor
endometrial
Sem outras especificações
Outras neoplasias malignas
Presença de células endometriais (na pós menopausa ou acima de 40 anos, fora
do período menstrual
14
1.3.4 História natural das lesões precursoras
Nas últimas décadas vários estudos trataram de avaliar a história natural da
NIC, com ênfase na regressão, persistência e progressão da doença. (McINDOE et
al., 1984; OSTÖR et al, 1993; MITCHELL et al., 1994; MELNIKOW et al., 1998;
HOLOWATY et al., 1999). Os resultados são influenciados pela metodologia
diagnóstica, critérios morfológicos, localização e extensão da lesão e outros fatores
não relacionados (FIGUEIREDO, 2004).
Estes estudos revelaram que a maioria das lesões de baixo grau é transitória.
Podem regredir espontaneamente em períodos curtos ou não progredirem, enquanto
as lesões de alto grau tem probabilidade muito maior de persistir ou progredir
(IARC, 2005).
Segundo Mitchell et al. (1994), as possibilidades acumulativas para todos os
graus de NIC, seguidos tanto por citologia como histologia, foram de 45% para
regressão, 31% para persistência e 23% para progressão (IARC, 2005).
Syrjänen (1990) acompanhou mais de 500 mulheres infectadas num período
de 8 anos. As lesões genitais foram avaliadas pela colposcopia, citologia, biópsias e
tipificação do HPV, sem qualquer terapia. Observou regressão em 40%, persistência
em 45% e progressão em 15% dos casos (SILVEIRA e PESSINI, 2000).
Ostör et al.(1994), em revisão de estudos publicados sobre o assunto, no
período de 1950 a 1993, demonstrou que a NIC I têm taxa de regressão de 57,0%,
persistência de 32,0%, progressão para NIC III de 11,0% e evolução para invasão
de 1,0%.
As NIC II têm taxa de regressão em 43,0%, persistência em 35,0%,
progressão para NIC III em 22,0% e para invasão, em 1,5%. As NIC III têm taxa de
regressão em 32,0%, persistência de 56,0% e progressão para invasão em 12,0%
(Tabela 3) (IARC,2005).
15
Tabela 3. Probabilidades de regressão, persistência e progressão da NIC
(Adaptado de Ostör et al., 1994 – IARC, 2005).
Categoria
Regressão Persistência
da NIC
NIC I
57,0%
32,0%
NIC II
43,0%
35,0%
NIC III
32,0%
56,0%
Progressão à
NIC III
11,0%
22,0%
-
Progressão à
neoplasia invasiva
1,0%
1,5%
12,0%
Em relação ao tempo de progressão parece que o intervalo médio para a
progressão das lesões precursoras cervicais à neoplasia invasiva é de 10 a 20
anos, podendo evoluir relativamente mais rápido, entre um a dois anos, se houver
persistência de infecção com HPV de alto risco e associação de co-fatores
(PEREYRA, 2000).
1.4 Métodos Diagnósticos
O diagnóstico das lesões precursoras e da neoplasia invasora do colo do
útero baseia-se no triplé clássico: citopatologia (teste de Papanicolaou), colposcopia
e exame histopatológico (JACYNTHO, 2001).
Novos métodos de rastreamento alternativos ou aditivos vem sendo
apresentados e desenvolvidos com o intuito de melhorar a acurácia diagnóstica.
Entre
eles
podemos
destacar:
citologia
em
meio
liquido,
cervicografia,
especuloscopia, polarprobe, fluorescência induzida pelo laser, colposcopia digital
computadorizada e os métodos moleculares para a detecção da infecção pelo HPV
(captura híbrida, hibridização in situ, reação em cadeia da polimerase - PCR, Dot
blot, Southern blot) (LORINCZ, 1997).
16
1.4.1 Colposcopia
A colposcopia foi introduzida por Hinselmann (1925) e consiste de um
aparelho óptico com magnificação iluminada, permitindo visualização com aumento
de até 40 vezes; sendo possível reconhecer e delimitar os aspectos normais e
anormais da ectocervice, vagina e genitália externa (SINGER,1995).
As características do epitélio cervical podem ser observadas, em detalhes,
depois da aplicação sucessiva de solução salina isotônica, solução de ácido acético
a 3% ou 5% e solução iodo-iodada (solução de Lugol) (IARC,2005).
Sua sensibilidade é da ordem de 80%, com baixa especificidade; os índices
de falso-positividade são de 10 a 15%. Atualmente o método tem adquirido
importância fundamental na identificação das lesões HPV induzidas, possibilitando
precisão diagnóstica bem próxima a 100% dos casos de patologia cervical maligna
ou precursora do carcinoma do colo do útero (FOCCHI, 2000).
A Federação Internacional de Patologia Cervical e Colposcopia aprovou uma
classificação colposcópica revisada e terminologia colposcópica básica no 11º
Congresso Mundial em Barcelona em 2002 Esta nomenclatura foi adotada pela
Associação Brasileira de Genitoscopia, sendo utilizada no Brasil (WALKER, et al.,
2002).
No Quadro 3, estão classificados os achados colposcópicos, segundo a
Nomenclatura de Barcelona, 2002.
17
Quadro 3. Nomenclatura colposcópica (Federação Internacional de
Patologia Cervical e Colposcopia – Barcelona, 2002).
I. Achados Colposcópicos Normais
Epitélio escamoso original
Epitélio colunar
Zona de transformação
II. Achados Colposcópicos Anormais
Epitélio acetobranco plano
Epitélio acetobranco denso *
Mosaico fino
Mosaico grosseiro *
Pontilhado fino
Pontilhado grosseiro *
Iodo parcialmente positivo
Iodo negativo *
Vasos atípicos *
III. Alterações colposcópicas sugestivas de câncer invasivo
IV. Colposcopia insatisfatória
Junção escamocolunar não visível
Inflamação severa, atrofia severa, trauma,
Cervix não visível
V. Miscelânea
Condiloma
Queratose
Erosão
Inflamação
Atrofia
Deciduose
Pólipos
* achados maiores
1.4.2 Colpocitologia (Teste de Papanicolaou)
Papanicolaou e Traut (1943) introduziram a técnica da citologia, baseada na
esfoliação espontânea ou induzida de células normais ou patológicas do colo
uterino. O exame é utilizado em campanhas de massa, na população, para
detecção precoce (screening) de lesões precursoras e neoplasia do colo uterino
(JONES, 1988; MONTANARI e STEFANON, 1996).
18
A coleta cervical é realizada sob controle visual, após a colocação de um espéculo
vaginal, com espátula de madeira (Ayre), que possui uma extremidade moldada
para raspar a ectocérvice em uma amplitude de 360°. Para a coleta endocervical
utiliza-se a citobrush (escovinha de náilon) (Figura 2) (JONES, 1988; SANTOS,
2002).
Segundo Dotters (1988), apenas 1,4% dos esfregaços endocervicais com citobrush
não contém células cervicais. As amostras são espalhadas, rapidamente, sobre
uma lâmina de microscopia e fixadas em alcool etílico a 95% para envio ao
laboratório, onde são coradas e lidas por citotécnicos e citopatologistas. (JONES,
1990; MONTANARI e STEFANON, 1996).
Figura 2. Demonstração do método de coleta de citologia cervical.
1.4.2.1 Sistema de Coleta com Base Líquida
O
sistema
consiste
em
amostras
celulares
esfoliadas,
colocadas
imediatamente em fixador e transportadas para o laboratório. Um processador
(ThinPreps) filtra as amostras até que sejam obtidas células suficientes para
preparar uma lâmina de única camada. As células são transferidas para uma área
circular em lâmina de vidro e coradas pelo método de Papanicolaou. As vantagens
desse método são as concentrações de células em pequena área, o não
obscurecimento por sangue, inflamações ou superposições celulares. O maior
problema é a necessidade de repetição da citologia, quando estiverem ausentes os
elementos da zona de transformação. (SHERMAN e KURMAN, 1997).
19
1.4.3 Exame histopatológico
A biópsia dirigida pela colposcopia permite biopsias nas zonas francamente
neoplasica ou colposcopicamente suspeitas, poupando zonas não suspeitas.
(MONTANARI e STEFANON, 1996).
Nas amostras obtidas por conização ou amputação cervical, o material deve
ser inteiramente submetido a exame histológico para minimizar a possibilidade de
perda de algum foco de invasão estromal. As margens cirúrgicas devem ser
adequadamente identificadas nos cortes histológicos, avaliando sua localização
topográfica e extensão da lesão para criptas glandulares (CARVALHO, 2000).
Segundo o tipo histológico, a grande maioria é do tipo escamoso
(epidermóide), responsável por cerca de 94% das neoplasias malignas primárias do
colo uterino. Pode ser subclassificado em: carcinoma de grandes células
queratinizado; de grandes células não queratinizado e de pequenas células não
queratinizado. O adenocarcinoma representa 5% dos casos. Outros tipos
histológicos podem comprometer o colo uterino: adenoescamoso, sarcomas,
linfomas, melanomas, tumores mistos, indiferenciados e tumores metastáticos
(CARVALHO, 2000; RIVOIRE et al, 2001, BERTRAND, 2002).
1.4.4 Métodos moleculares
Atualmente, os testes de exploração com base no ácido nucléico são a forma
mais avançada de metodologia de testagem com base diagnóstica bioquímica nos
estudos HPV. Na análise do DNA ou RNA, os métodos podem ser divididos,
genericamente em três grandes grupos: (1) testes não amplificados, (2) testes
amplificados pelo alvo, (3) testes amplificados pelo sinal. O Quadro 4 mostra os
diversos testes utilizados para detecção do DNA do HPV (LÖRINCZ, 1997).
20
Quadro 4. Métodos de testes para alvos DNA ou RNA HPV (Lörincz, 1997).
Categorias
de
Nome do teste
do
Reação em cadeia da polimerase (PCR)
testes
Amplificação
alvo
Reação em cadeia da ligase (LCR)
Amplificação com base na seqüência do ácido nucléico
(NASBA)
Amplificação do deslocamento da cadeia (SDA)
Amplificação
do
Sistema de captura híbrida (HCS)
sinal
DNA ramificado (bDNA)
Não amplificados
Southern blot (SB)
Dot blot
Hibridização com filtro in situ
Southern blot reverso
Northern blot (NB)
Hibridização in situ (ISH)
O método mais simples é a captura híbrida e a reação em cadeia da polimerase
(PCR), por sua alta sensibilidade e especificidade, em detectar seqüências de HPV,
ainda que estas estejam em baixo número nas amostras (BERUMEN et al., 1997).
1.4.4.1 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
A PCR é técnica utilizada para a amplificação in vitro de quantidades diminutas de
seqüências de DNA especificas, através de ciclos repetidos de desnaturação,
hibridização e extensão do primer (LÖRINCZ, 1997).
Em comparação direta, a PCR é comparável ao Southern Blot em sensibilidade e
especificidade. Na tabela 7, a PCR é comparada com os principais métodos
moleculares utilizados na detecção de DNA do HPV (BAUER e MANOS, 1998;
VILLA, et a.l, 1997).
21
Tabela 4. Comparação entre métodos de detecção de genomas de HPV (Adaptado
de Villa, 2003).
Hibridização Southern
in situ
blot
Sensibilidade +
+++
(*)
(20-50)
(0,01-1)
Especificidade ++
+++
Praticidade
+
+
Morfologia
+++
(*) número de cópias do genoma viral/célula
Captura
híbridos
++
(1-10)
+++
++
-
PCR
++++
(<0,01)
+++
+++
-
PCR
in situ
+++
(1)
+++
+
-
Basicamente, cada ciclo da PCR consiste de três etapas onde ocorrem
eventos distintos: a) desnaturação do DNA-molde (abertura da dupla fita) em alta
temperatura (94ºC - 100ºC); b) anelamento (hibridização dos iniciadores) dos
primers ao DNA-molde em temperatura mais baixa, definida conforme tamanho e a
composição de bases dos oligonucleotídeos iniciadores e c) extensão do primer ou
síntese (reação de polimerização da fita complementar pela DNA polimerase na
temperatura ótima da enzima para a síntese (72ºC para a Taq DNA polimerase). Ao
final de cada ciclo (conjunto das três etapas descritas), ocorre em princípio a
duplicação do DNA-alvo (BAUER e MANOS, 1989; LORINCZ, 1997; GROSS e
BARRASSO, 1999).
A técnica da PCR tem sido aplicada na identificação de DNA do HPV nos
diversos estudos epidemiológicos mundiais e foi escolhida como método para este
trabalho pelo fato de estar entre os melhores diagnósticos e poder ser realizada em
Manaus - Laboratório de Biotecnologia, da Universidade Federal do Amazonas.
22
2. OBJETIVOS
2.1
Geral
Investigar a prevalência de Papilomavírus Humano (HPV) em mulheres
portadoras de lesões escamosas de alto grau e carcinoma epidermóide invasor do
colo uterino, atendidas na FCECON.
2.2 Específicos
•
2.2.1 Estimar a prevalência do HPV, utilizando a reação em cadeia da
polimerase (PCR) nas mulheres envolvidas neste estudo;
•
2.2.2 Identificar, utilizando a PCR, os diferentes tipos de HPV nas amostras
analisadas;
•
2.2.3. Descrever a relevância dos fatores sociodemográficos associados com
a população estudada: idade, raça, estado civil, escolaridade, idade da
primeira relação sexual, número de parceiros sexuais, idade da primeira
gravidez, número de partos, uso de anticoncepcionais hormonais, fumo,
sangramento anormal, sangramento ao coito.
23
3. METODOLOGIA
3.1 Modelo de Estudo
Estudo transversal descritivo, não-controlado, prospectivo.
3.2 Universo de Estudo
3.2.1 População de estudo
Mulheres portadoras de lesões intra-epiteliais escamosas de alto grau e
carcinoma epidermóide invasor do colo uterino atendidas na Fundação Centro de
Controle de Oncologia (FCECON), na cidade de Manaus, capital do estado do
Amazonas, Brasil.
3.2.2 Critério de inclusão
Mulheres portadoras de lesões escamosas de alto grau e carcinoma
epidermóide invasor do colo uterino, confirmado por exame histopatológico.
3.2.3 Critério de exclusão
Mulheres submetidas previamente a crio ou termocauterização, laserterapia,
histerectomia, quimioterapia ou radioterapia.
3.2.4 Número de mulheres participantes do estudo
Foram
estudadas
42
mulheres
portadoras
de
lesões
intra-epiteliais
escamosas de alto grau e carcinoma epidermóide invasor do colo uterino, atendidas
no período de 01 de setembro a 30 de dezembro de 2004.
3.3 Procedimentos
Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa no Comitê de
Ética da Fundação Centro de Controle de Oncologia (FCECON).
3.3.1 Seleção de pacientes
24
No período de 01 de setembro a 30 de dezembro de 2004, foram incluídas no
estudo, mulheres portadoras de lesões intra-epiteliais escamosas de alto grau e
carcinoma epidermóide invasor do colo uterino, comprovadas através de exames
histopatológicos, atendidas na FECON.
3.3.2 Orientações às pacientes
As participantes do estudo foram esclarecidas quanto ao objetivo do trabalho,
riscos e benefícios associados ao estudo e assegurado a inteira confidencialidade
dos registros. Após consentirem, assinaram a declaração do Termo de
Consentimento Livre e Esclarecido (Anexo I), e responderam a uma Ficha de
Triagem e Questionário padrão (Anexo II) (modificado de ALENCAR et al.,1993)
3.3.3 Coleta de Material para PCR
As amostras do estudo foram coletadas da região cervical uterina (ecto e
endocérvice), com o auxílio de escovas do tipo citobrush (Figura 3) e acondicionadas
em tubos eppendorf de 1,5 ml contendo 400 µl de solução tampão TE (Tris-HCl 10
mM pH=8,0 e EDTA 1 mM) e mantidas a -20ºC até o momento do manuseio no
laboratório.
Figura 3. Escova utilizada para coleta de material ecto e endocervical.
3.4 Exame Histopatológico
Os exames histopatológicos foram realizados nos Serviços de Patologia do
Sistema Único de Saúde.
25
3.5 Reação em cadeia da polimerase (PCR)
As amostras foram submetidas à reação em cadeia da polimerase,
conforme técnica descrita por Bauer e Manos (1988).
3.5.1 Primers (iniciadores)
Na reação de PCR foram utilizados os iniciadores consenso MY11 e MY09
que amplifica um fragmento de 450 pb da região de transcrição tardia L1 (Manos et
al, 1989) e os inciadores gerais GP5+/GP6+, que amplificam 140 a 150 pb da região
L1, que se superpõe com MY (de Roda Husman et al., 1995). No Quadro 5 são
apresentados as seqüências de base nitrogenadas dos iniciadores usados neste
estudo.
Quadro 5. Sistemas de iniciadores MY09/MY11 e GP5+/GP6+.
Autor
Designador
Manos et L1, 448-454 pb
al, 1989
degenerado
de Roda
L1, 140-150 pb
Husman
não degenrado
et al, 1995
Iniciador
Seqüência
MY09
MY11
GP5+
5’-CGTCCMAARGGAWACTGATC -3’
5’-GCMCAGGGWCATAAYAATGG-3’
5’-TTTGTTACTGTGGTAGATACTAC-3’
GP6+
5’- GAAAAATAAACTGTAAATCATATTC-3
M = A+C; R = A+G; W = A+T; Y = C+T
3.5.2 Extração de DNA
O protocolo utilizado para a extração do DNA das amostras foi descrito por
Bauer e Manos (1998):
3.5.2.1 Amostras sem Sangue
26
Para a extração do DNA, foram adicionados 400 µL de “TPK” aos 400 µL da
amostra coletada. Essa mistura foi levada ao banho–maria a 55-60º C por 60
minutos e depois fervida por dez minutos. As amostras preparadas ficaram
congeladas a – 20° C até sua utilização.
3.5.2.2 Amostras com Sangue
As amostras com sangue foram submetidas a extração do DNA pelo método
fenol:clorofórmio, conforme técnica descrita por Sambrook et al. (1989). Utilizou-se
400 µL das amostras preparadas anteriormente, aos quais foram adicionados 400 µL
de fenol, homogeneizadas por dez minutos e centrifugadas a 6.000 rpm por dez
minutos. Coletou-se o sobrenadante (cerca de 360 a 400 µL) e adicionou-se 400 µL
de fenol:clorofórmio;álcool isoamílico (25:24:1). Homogeinizadas por 10 minutos e
centrifugadas a 10.000 rpm. Coletou-se o sobrenadante (cerca de 100 a 290 µL) e
adicionou-se (10%) do volume total de cada amostra de NaCl 3M mais 4 µL de
glicogênio 1µg/ml. Adicionou-se 1000 µL de etanol a 100% e misturou-se até a
homogeneização.Deixou-se precipitando por doze horas a - 20º C. Centrifugou-se a
10.000 rpm por quinze minutos. O sobrenadante foi descartado com o auxílio de
uma micropipeta. A seguir, lavou-se o sedimento com aproximadamente 500 µL de
etanol a 70 % gelado. Centrifugou-se a 10.000 rpm por cinco minutos. Descartou-se
o sobrenadante com cuidado para não perder o concentrado de DNA. Deixou-se
secar e diluiu-se em 30 µL H20. A amostra permaneceu sob temperatura de – 20° C
até sua utilização.
3.5.3 PCR
3.5.3.1. PCR para controle do DNA
O sistema de reação foi composto de: 2,2 µL de água Milli-Q; 2,5 µL de Tp
10x (500 mM KCl e 100 mM Tris-HCl (pH 8,5)); 2,5 µL de MgCl 2 50 mM 2,5 µL do
“pool” de dNTP (10 mM); 2,5 µL do iniciador MY09 (5pmol); 5,0 µL do iniciador
ISO4M (PONTES, 2003); 0,3 µL da Enzima Taq polimerase 5U/µL e 5,0µL da
solução contendo a amostra de DNA, totalizando um volume final de 20µL,
conforme a técnica de Bauer e Manos, 1998.
27
As reações de PCR foram realizadas com 35 ciclos de amplificação em
aparelho termociclador Eppendorf - Mastercycler Gradient, conforme o seguinte
programa: um minuto à 95ºC para desnaturação, um minuto à 55ºC para anelamento
e um minuto à 72ºC para a síntese. Após os 35 ciclos, seguiram-se cinco minutos a
72ºC para extensão.
3.5.3.2 PCR para detecção do HPV
Os produtos da PCR foram analisados por eletroforese, em gel de agarose a
1,5%, corado com brometo de etídio (1,0µg/ml) por vinte minutos, visualizados sob
luz ultravioleta e fotografados com equipamento da Pharmacia Biotech, Image Master
VDS FTI-500.
3.5.3.3 Purificação dos produtos da PCR
As amostras que revelaram a amplificação do fragmento de 450 pb foram
submetidas à purificação em colunas “QIAquick PCR Purification Kit – QIAGEN”,
conforme o seguinte procedimento: a) em um tubo de 600 µL adicionou-se 35 µL da
amostra amplificada, acrescentou-se 175µL de solução de binding (cinco vezes o
volume da amostra). Colocou-se esta mistura na coluna de purificação e centrifugouse por um minuto. O tampão que passou pela coluna, contido no tubo suporte foi
descartado após a centrifugação. Nesta mesma coluna, adicionou-se 500 µL do
tampão de lavagem e centrifugou-se por um minuto. Descartou-se o volume
centrifugado, contido no tubo suporte da coluna. Centrifugou-se por mais um minuto,
afim de retirar o excesso de álcool. Trocou-se o tubo suporte da coluna por um tubo
Eppendorf de 2 mL limpo e adicionou-se 30 µL do tampão de eluição no centro da
coluna, e deixou-se embeber por dois minutos. Centrifugou-se por dois minutos. O
produto centrifugado constituiu-se no material purificado. Nestes procedimentos de
purificação utilizou-se uma microcentrífuga tipo Eppendorf-Centrifuge 5410 e as
centrifugações processaram-se a 12.000 giros. Do volume de 30 µL eluido retirou-se
3 µL para análise por meio de eletroforese, em gel de agarose. A amostra foi
preparada adicionando-se aos 3 µL, 5 µL de água e 2 µL de tampão TEB 5X.
Guardou-se o restante para fins de sequenciamento de nucleotídeos da amostra.
28
3.5.4 Sequenciamento dos Produtos da PCR
3.5.4.1 Reação de Sequenciamento
As amostras foram seqüenciadas utilizando-se os iniciadores MY09 ou
MY11, e GP5+ ou GP6+ em seqüenciador automático MegaBace 1000 (Amersham
Biociences).
Para o seqüenciamento foi utilizado o seguinte sistema de reação: 5,0 µL do
DNA; 4,0 µL do pré – mix DYEnamic ET – terminator Kit; 1,0 µL do iniciador MY09
ou MY11 ou GP5+ ou GP6+, 5 pmol/µL, cumprindo o seguinte programa: 95ºC por
vinte e cinco segundos; 95ºC por quinze segundos; 50ºC por vinte segundos; 60ºC
por um minuto, repetidos por 30 ciclos de amplificação.
Nas amostras seqüenciadas com GP5+/GP6+, que amplificam um fragmento
de aproximadamente 140 a 150 pb, específicos da região L1QLA (quadro de leitura
aberta) – Nested PCR, utilizou-se 1,0 µL do iniciador.
3.5.4.2 Precipitação do Produto da Reação de Seqüenciamento
Após a reação de seqüenciamento foi realizada a precipitação. Ao produto da
reação de seqüenciamento foi adicionado 1µL de acetato de amônia e 27,5 µL de
etanol absoluto. Este sistema foi misturado, utilizando-se o agitador por um minuto e
incubado durante vinte minutos à temperatura ambiente, envolvida em papel
alumínio para evitar a incidência de luz.
Após incubação, a placa foi centrifugada a 4.000 rpm por quarenta minutos,
em centrífuga refrigerada Eppendorf 5804R. Descartou-se o sobrenadante. A placa
foi centrifugada invertida a 1.000 rpm por um pulso de alguns segundos. Em
seguida, deixou-se secar por quinze minutos, para evaporar o etanol. O DNA foi
ressuspendido adicionando-se 10 µL de tampão (fornecido com o Kit). A placa foi
vedada e agitada em vortex por dois minutos. Foi realizada mais uma centrifugação
a 1.000 rpm por um pulso de alguns segundos.
29
Após esta amplificação foi realizada a reação de precipitação. Em seguida as
amostras foram submetidas ao seqüenciador automático MegaBace (Amershan
Pharmacia Biotech). O método original do seqüenciador foi descrito por Sanger e
Coulson (1977).
3.5.4.3 Eletroforese para Seqüênciamento
As decodificação da seqüência nucleotídica do fragmento amplificado foi
realizado em seqüenciador automático MegaBace 1000 (Amershan Pharmacia
Biotech). A eletroforese capilar em gel de poliacrilamida foi realizada segundo as
recomendações padrão do fabricante. Para injeção utilizou-se 3 KV por oitenta
segundos. A corrida processou-se a 6KV, por 200 minutos, sob temperatura de
44ºC.
3.5.4.4 Alinhamento das Amostras Seqüenciadas
Para o alinhamento das seqüências de nucleotídeos obtidas foi utilizado o
programa de computador CLUSTAL W (BioEdit).
3.5.5 Análise do Resultado das Sequências Nucleotidicas
Para a confirmação e identificação do tipo do HPV, foi realizada comparação
de todas as seqüências nucleotídicas das amostras seqüenciadas, submetendo-as
ao Banco de Dados Mundial de Nucleotídeos – GeneBank. Utilizou-se o programa
BLAST (Altschul et al.,1997).
3.5.5 Análise dos Dados
Os dados pesquisados foram tabulados em planilhas Excel e realizado
análise multivariada, onde se calculou as freqüências absolutas simples, relativas e
acumuladas para os dados qualitativos e médias, medianas e desvio-padrão (DP)
para os dados quantitativos. O software utilizado na análise foi o programa Epi-Info
3.0 for Windows.
30
Agregados, os dados sociodemográficos foram submetidos à Análise de
Concordância, utilizando-se o programa Statistica versão 6.0.
4. RESULTADOS
4.1 CARACTERÍSTICAS DA POPULAÇÃO
A população do estudo foi composta de 42 mulheres sexualmente ativas,
sendo constituída de 100% de mulheres pardas, cor característica da maioria da
população que habita o Estado do Amazonas.
A faixa etária média foi de 40,8 (DP:4,1) anos (Tabela 5). A idade mínima
registrada foi de 18 anos - uma mulher portadora de lesão escamosa de alto grau
(LIEAG), e a idade máxima de 73 anos - uma mulher com carcinoma epidermóide
invasor.
Um caso de carcinoma epidermóide invasor do colo uterino foi diagnosticado
em mulher de 24 anos.
Tabela 5. Prevalência de Papilomavírus humano (HPV) em mulheres portadoras de
lesões intra-epiteliais escamosas de alto grau e carcinoma epidermóide invasor do
colo uterino. Distribuição segundo a idade da população do estudo.
Idade (anos)
< 35
35 |--- 50
≥ 50
Total
Média: 40,8;
n
15
15
12
42
DP: 14,1;
Mediana: 39;
%
35,7
35,7
28,6
100,0
Acumulada (%)
35,7
71,4
100,0
-
Mín.: 18
Máx.: 73
31
Segundo o estado civil, 14 (33,3%) das mulheres eram casadas e 10 (23,8%)
mantinham união estável, totalizando 24 (57,1%) com relação conjugal sob o mesmo
teto (Tabela 6).
Tabela 6. Prevalência de Papilomavírus humano (HPV) em mulheres portadoras de
lesões intra-epiteliais escamosas de alto grau e carcinoma epidermóide invasor do
colo uterino. Distribuição segundo o estado civil.
Estado civil
Solteira
Casada
União estável
Viúva
Divorciada/separada
Total
n
%
9
21,4
14
33,3
10
23,8
7
16,7
2
4,8
42
100,0
O maior nível de escolaridade da população do estudo foi o ensino médio,
não havendo registro de mulheres com nível superior. Do total, 31 (73,3%) tinham
cursado parcialmente ou concluído o ensino fundamental, 10 (23,8) concluíram o
ensino médio e 1(2,4%) era analfabeta (Figura 4).
32
35,0
73,3% (31)
30,0
25,0
%
20,0
15,0
23,8% (10)
10,0
5,0
2,4% (1)
0,0
Não Alfabetizada
Fundamental
Medio
Figura 4. Prevalência de Papilomavírus humano (HPV) em mulheres portadoras de
lesões intra-epiteliais escamosas de alto grau e carcinoma epidermóide invasor do
colo uterino. Distribuição segundo a escolaridade.
A renda familiar de 27 (64,3%) da população foi de um salário mínimo - R$
260,00 (duzentos e sessenta reais) – ref.12/2004 (Tabela 7). A maioria, 36 (85,7%),
relatou renda entre um a três salários mínimos. Importante salientar que esta é a
clientela do Sistema Único de Saúde, em Manaus – renda baixa.
33
Tabela 7. Prevalência de Papilomavírus humano (HPV) em mulheres
portadoras de lesões intra-epiteliais escamosas de alto grau e
carcinoma epidermóide invasor do colo uterino. Distribuição segundo a
renda familiar.
Renda (salários
1
2a3
4a6
>6
Total
n
%
Acumulada
27
64,3
64,3
9
21,4
85,7
4
9,5
95,2
2
4,8
100,0
42
100,0
-
Segundo a procedência, 22(52,4%) eram do interior do estado do Amazonas,
sendo 11(26,2%) da cidade de Manaus. (Tabela 8). A Fundação Centro de Controle
de Oncologia (FCECON), em Manaus, é referência para o tratamento oncológico na
região norte.
Tabela 8. Prevalência de Papilomavírus humano (HPV) em mulheres
portadoras de lesões intra-epiteliais escamosas de alto grau e
carcinoma epidermóide invasor do colo uterino. Distribuição segundo a
procedência.
Procedência
Manaus
Interior do Amazonas
Outro Estado do Norte
Outro Estado da Federação
Total
n
%
11
26,2
22
52,4
6
14,3
3
7,1
42
100,0
34
Na Tabela 9 verifica-se que 32(76,2%) da população do estudo tiveram a
primeira relação sexual antes dos 16 anos de idade. A idade mínima foi de 12 anos.
Tabela 9. Prevalência de Papilomavírus humano (HPV) em mulheres portadoras de
lesões intra-epiteliais escamosas de alto grau e carcinoma epidermóide invasor do
colo uterino. Distribuição segundo a idade da primeira relação sexual.
Idade da primeira relação
≤ 16
> 16
Total
Média: 15,7;
DP: 2,2;
Mediana: 15;
n
%
32
76,2
10
23,8
42
100,0
Mín.: 12
Máx.: 22
Quanto ao número de parceiros sexuais, 7(16,7%) tiveram um parceiro
sexual, 14(33,3%) dois parceiros e 21(50%) três ou mais parceiros sexuais (Figura
5).
25
50,0%(21)
20
33,3%(14)
15
10
16,7%(7)
5
0
1
2
3
Figura 5. Prevalência de Papilomavírus humano (HPV) em mulheres portadoras de
lesões intra-epiteliais escamosas de alto grau e carcinoma epidermóide invasor do
colo uterino. Distribuição segundo o número de parceiro sexual.
35
Do total de pacientes do estudo, 41(97,6%) informaram a idade da primeira
gestação: 34,1% tiveram a primeira gestação antes dos 16 anos e 65,9% após 16
anos. A mediana foi 17 anos e a idade mínima, 13 anos (Tabela 10). Uma mulher
não engravidou.
Tabela 10. Prevalência de Papilomavírus humano (HPV) em mulheres
portadoras de lesões intra-epiteliais escamosas de alto grau e
carcinoma epidermóide invasor do colo uterino. Distribuição segundo a
idade da primeira gestação.
Idade da primeira gestação
≤ 16
> 16
Total
Média: 17,8;
DP: 3,0;
Mediana: 17;
n
%
14
34,1
27
65,9
41
100,0
Mín.: 13
Máx.: 27
Segundo o número de partos, por via vaginal, 40(95,2%) responderam:
33(82,5%) – três ou mais partos (Tabela 11). Duas mulheres não tiveram partos:
uma não engravidou; a outra engravidou uma vez, evoluindo com abortamento
(Tabela 11).
36
Tabela 11. Prevalência de Papilomavírus humano (HPV) em mulheres
portadoras de lesões intra-epiteliais escamosas de alto grau e
carcinoma epidermóide invasor do colo uterino. Distribuição segundo o
número de partos por via vaginal.
Número de partos
<3
≥3
Total
Média: 5,3;
DP: 3,0;
Mediana: 5;
n
%
7
17,5
33
82,5
40
100,0
Mín.: 1
Máx.: 12
Na Tabela 12 são apresentados os dados segundo a utilização de
anticoncepcional
oral.
Verifica-se que
26(61,9%) não
utilizaram
anticoncepcional hormonal oral. Nas 16(38,1%) que usaram o método, a
utilização foi de forma irregular nos últimos 10 anos.
Tabela 12. Prevalência de Papilomavírus humano (HPV) em mulheres
portadoras de lesões intra-epiteliais escamosas de alto grau e
37
carcinoma epidermóide invasor do colo uterino. Distribuição segundo o
uso de anticoncepcional hormonal oral.
Uso de anticoncepcional
Sim
Não
Total
n
%
16
26
42
38,1
61,9
100,0
Em relação ao tabagismo, as mulheres participantes do estudo relataram que
utilizavam cigarros em quantidades que variavam de cinco a vinte cigarros/dia. Ao
todo, 9 (21,4%) eram fumantes ativas, 15(35,7%) ex-fumantes e 16(42,9%) não
fumavam (Tabela 13).
Tabela 13. Prevalência de Papilomavírus humano (HPV) em mulheres
portadoras de lesões intra-epiteliais escamosas de alto grau e
carcinoma epidermóide invasor do colo uterino. Distribuição segundo o
fumo.
Fumo
Fumante
Ex-fumante
Não fuma
Total
n
%
9
15
18
42
21,4
35,7
42,9
100,0
Nas tabelas 14 e 15 observa-se que 27(64,3%) da população não relatava
sangramento anormal, nem sangramento ao coito no último ano antes do
diagnóstico de neoplasia maligna do colo uterino.
38
Tabela 14. Prevalência de Papilomavírus humano (HPV) em mulheres
portadoras de lesões intra-epiteliais escamosas de alto grau e
carcinoma epidermóide invasor do colo uterino. Distribuição segundo
sangramento anormal.
Sangramento anormal
Sim
Não
Total
n
%
15
27
42
35,7
64,3
100,0
Tabela 15. Prevalência de Papilomavírus humano (HPV) em mulheres
portadoras de lesões intra-epiteliais escamosas de alto grau e
carcinoma epidermóide invasor do colo uterino. Distribuição segundo
sangramento ao coito.
Sangramento no coito
Sim
Não
Total
n
%
15
35,7
27
64,3
42
100,0
4.2 Análise dos dados sociodemográficos
Na Figura 6, é apresentado o resultado da Análise de
Correspondência (AC), tendo como objetos as características sócio-econômicas e
como descritores as pacientes. A interpretação deste gráfico deve ser feita na
seqüência, a Dimensão 1 primeiro e depois a Dimensão 2.
39
1,2
1,0
PACIENTES
Características Sócio-Econômicas
rf
0,8
0,6
proc
Dimensão 2
0,4
fu
san
0,2
id
0,0
esc
ant
sin
ec
-0,2
pg
nf
np
-0,4
-0,6
pr
-0,8
-1,0
-1,2
-1,0
-0,8
-0,6
-0,4
-0,2
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
Dimensão 1
id=idad; ec= estado civil; proc=procedência; esc= escolaridade; rf= renda
familiar;
ant= uso de anticoncepcional;
pr=primeira relação;
np= número de
parceiros;
pg=primeira gestação; nf=número de partos; san=sangramento anormal;
fum=fumantes.
Figura 6. Prevalência de Papilomavírus humano (HPV) em
mulheres portadoras de lesões intra-epiteliais escamosas de alto
grau e carcinoma epidermóide invasor do colo uterino. Análise de
Correspondência
das
características
sociodemográficas
da
população do estudo.
Deste modo, um grupo de pacientes (representados pelas bolas) e situados a
esquerda do gráfico apresentam características comuns de estado civil (ec),
40
sinusorragia (sin), idade (id), uso de anticoncepcional (ant) e sangramento (san).
Enquanto que, outro grupo, situado à direita do gráfico, tem características comuns
de número de parceiros (np) e renda familiar (rf).
As características que ficam no centro do gráfico: escolaridade (esc), número
de partos (nf), primeira gestação (pg) e primeira relação (pr) são comuns aos dois
grupos.
Na Dimensão 2, é possível observar que existem pacientes com
características comuns de renda familiar (rf), procedência (proc) e fumantes (fum),
situados na porção superior do gráfico.
4.3 RESULTADOS DOS EXAMES HISTOPATOLÓGICOS
Em relação ao exame histopatológico, critério básico de inclusão no estudo,
(32) 76,2% eram portadoras de lesões intra-epiteliais escamosas de alto grau
(LIEAG) e 10 (23,8%) portadoras de carcinoma invasor do colo do útero (Figura 7).
■ LIEAG
76,2% (32)
■ Câncer invasor
23,8% (10)
Câncer invasor
Lesão de alto grau
41
Figura 6. Prevalência de Papilomavírus humano (HPV) em mulheres portadoras de
lesões intra-epiteliais escamosas de alto grau e carcinoma epidermóide invasor do
colo uterino. Distribuição segundo o resultado do exame histopatológico.
4.4 Detecção e Identificação de HPV por PCR
4.4.1 Reação de amplificação por PCR
Das 42 amostras testadas, 100% foram positivas para DNA HPV.
Dentre estas, 59,5% (25/42) foram positivas na primeira reação usando
os iniciadores consenso MY09 e MY11 (Figura 8 e 9). As demais
amostras, 40,5% (17/42) foram positivas na segunda reação, utilizandose os iniciadores GP5+/GP6+ (Figura 10).
01 02 03
04 05 06 07
08 09 10 M
11 12 13 14
15 16 17
18 19 20
450 pb
21
22 23 24 25 26
27 28 29 30 M 31 32 33 34 35 36
37 38 39 40
Figura 8. PCR - Demonstração dos fragmentos de 450 pb de HPV com MY09/MY11,
através da eletroforese em gel de agarose (amostras 1 a 40).
42
41
42
43
44
M
B1
B2
B3
C1
C2
C3
C4
450 pb
Figura 9. PCR - Demonstração dos fragmentos de 450 pb de HPV com MY09/MY11
através de eletroforese em gel de agarose (amostras 41 e 42).
03
05
06
12
13
14
15 Lad. 16 17
18
20
22 23
27
30
150 pb
32
36
39
B1
B2
B3 Lad. BR C1
C2
C3
C4
Figura 10. Demonstração dos fragmentos de 150 pb para HPV com GP5+/GP6+
(Nested-PCR), através de eletroforese em gel de agarose.
43
4.4.2 Reação de Sequenciamento
Foram seqüenciadas 24(57,1%) das amostras e através da
comparação de nucleotídeos com as seqüências depositadas no Gene
Bank, por meio do programa BLAST, foram identificados os seus tipos
virais (Tabela 16).
Tabela 16. Prevalência de Papilomavírus humano (HPV) em mulheres
portadoras de lesão intra-epitelial escamosa de alto grau e carcinoma
invasor do colo uterino. Caracterização das amostras e respectivos
acessos ao Gene Bank.
AMOSTRA
ACESSO AO GENEBANK
TIPO DE HPV
B08
AF534061
16
C02
AF536179
16
C04
U45887
33
D02
AF534061
16
D04
AF402678
16
44
D05
X744831
56
D08
AF534061
16
E01
AF534061
16
E08
AY147908
66
E10
AF534061
16
E11
AF534061
16
E12
AF534061
16
F01
AF402678
16
F02
AF402678
16
F10
Af534061
16
F12
AF534061
16
G01
AF534061
16
G08
HPU45896
33
G10
X00203
6
G11
AF402678
16
G12
DQ057331
31
H01
AF534061
16
H02
AF536179
16
H12
AF534061
16
Na figura 11 são apresentados os resultados das amostras
positivas pela PCR e os percentuais de sorotipos mais prevalentes de
HPV. Do total de 24 amostras, 18(75%) eram HPV tipo 16 e 2(8%) HPV
tipo 33. As demais amostras, 4(17%) foram positivas para os tipos 31,
56, 66 e 6.
45

HPV 33
8% (2)

HPV 31, 56, 66, 6
17% (4)

HPV 16
75% (18)
Figura 11. Prevalência de Papilomavírus humano (HPV) em mulheres
portadoras de lesões intra-epiteliais escamosas de alto grau e
carcinoma escamoso invasor do colo uterino. Resultado dos sorotipos
de HPV identificados nas amostras PCR positivas.
46
5. DISCUSSÃO
A prevalência de 100% de HPV, através da PCR, em 42 mulheres portadoras
de lesões intra-epiteliais escamosas de alto grau e carcinoma epidermóide invasor
encontradas neste estudo, situa-se na faixa dos achados da literatura mundial.
Estatisticamente, o tamanho desta amostragem é pequeno, considerando a
média anual de 450 casos de câncer do colo uterino registrados na FCECON e a
expectativa para 2005 ser de 530 novos casos no Amazonas – 470 casos ocorreriam
em Manaus (INCA, 2004).
Em estudos realizados na última década, conduzidos por diversos autores,
utilizando a PCR, foram encontradas prevalências de DNA HPV situando-se na faixa
de 90% a 100% em lesões intra-epiteliais de alto grau e câncer invasor (BOSCH et
al.,1995; LIAW et al.,1995; KONYA et al.,1995, CHEN et al., 1999; WALBOOMERS
et al., 1999; DEPUYDT et al., 200; MUNOZ, et al.,2003, CHANG et al.,2005).
Bosch et al. (1995), realizando estudo multicêntrico em 22 países, com 1000
amostras de câncer cervical constatou que em 93% dos casos havia a presença do
DNA do HPV. Naquela época, acreditava-se que as amostras negativas
correspondiam a tipos não genotipados ou outros fatores causais desconhecidos.
Liaw et al. (1995), observou prevalência de 92% no estudo de mulheres com
lesões intra-epiteliais de alto grau e câncer cervical invasor. Konya et al. (1995),
encontrou a presença de HPV em 98% de amostras obtidas de biópsias de câncer
cervical invasor. Chen et al. (1999), revelou prevalência de HPV em 91,9% (171/186
casos) de mulheres com câncer cervical.
Walboomers et al. (1999), relatou que o HPV está presente em 99,7% de
pacientes com câncer do colo uterino. Depuydt et al. (2001), demonstrou prevalência
de HPV de 95,4% em 109 pacientes com lesão intra-epitelial cervical.
Munoz et al. (2003), estudando 3.846 pacientes em 9 países, encontrou
prevalência de HPV em 90,7% de 1.918 amostras de câncer cervical; foram
47
histologicamente confirmadas, e o grupo controle de 1928 mulheres, sem doença
maligna, a incidência foi de 13,4%.
Em recente trabalho, com amostragem inferior ao nosso estudo, Chang et al.
(2005), analisando 25 amostras biopsiadas de câncer cervical, utilizando os métodos
da PCR e Southern blot , encontraram prevalência de 100% para DNA do HPV.
Em comparação com estudos realizados no Brasil, por Eluf-Neto et al. (1994),
Noronha et al. (1999) , Santos et al. (2001) e Oliveira et al.(2003), verificamos que
esses autores encontraram prevalência de HPV em 84%, 70,3%, 76% e 95%,
respectivamente.
Eluf Neto et al.(1999), em São Paulo, estudando 199 casos confirmados
histologicamente de câncer invasivo e 225 controles, utilizando a PCR, revelou
prevalência de HPV em 84% nos casos de câncer invasor, e 17% nos controles.
Noronha et al. (1999), em Belém do Pará, estudou 228 mulheres portadoras
de lesões em cérvice uterina, através da PCR e hibridização dot blot . Distribuidos
em três grupos, conforme o diagnóstico exame histopatológico, o grupo A constituído
de 155 mulheres com carcinoma epidermóide invasor ou com adenocarcinoma, o
grupo B com 54 portadoras de lesão intra-epitelial cervical de alto grau e o grupo C
de 19 pacientes com doença benigna (cervicite crônica) observaram-se prevalências
de HPV em 70,3%, 63,0% e 36,8%, respectivamente.
Santos et al. (2001), analisou 74 mulheres em Goiás, sendo 18 portadoras de
lesão intra-epitelial de alto grau, 48 câncer escamoso invasor, 4 adenocarcinomas e
1 carcinoma adenoescamoso. Foi detectado DNA HPV em 56/74 (76%) dos casos.
Oliveira et al. (2003), em Niterói , estudou 43 mulheres com lesões benignas e
malignas do colo uterino, incluindo 14 lesões intra-epiteliais de alto grau e 8
carcinomas. Detectou a presença de DNA HPV em 41/43 (95%) dos casos. Esta
amostragem não é comparável aos nossos dados, considerando o número inferior
de lesões malignas estudadas.
48
No Amazonas, em dois trabalhos distintos realizados anteriormente, Castro
(2001) e Souza (2004) relacionaram o HPV com a cérvice uterina, utilizando o
método da PCR, para estimar taxas de prevalência.
Castro (2001), no estudo de 144 pacientes em Manaus, em dois grupos de 83
e 61 pacientes encontrou DNA de HPV em 39,28% e 6,45%, respectivamente.
Souza (2004) detectou HPV em 10 amostras (14,2%) de 70 pacientes HIV positivas
atendidas na FMTAM.
Em ambos os trabalhos, realizados em Manaus, não havia comprovação
histológica de patologia cervical, o que pode ter contribuído para taxas de
prevalência inferiores às estatísticas mundiais.
Em nossa casuística o percentual de HPV detectado foi de 100%. Deste total,
24(57,1%) das 42 amostras tiveram seus seqüênciamentos realizados. As 14
amostras restantes não puderam ser seqüenciadas por não apresentarem leitura
satisfatória, algumas possivelmente em razão de ajustes na metodologia.
Para a confirmação e identificação do tipo do HPV foi realizada comparação
de todas as seqüências nucleotídicas das amostras seqüenciadas, submetendo-as
ao Banco de Dados Mundial de Nucleotídeos – GeneBank. Utilizou-se o programa
BLAST (Altschul et al.,1997).
No presente estudo, dentre as amostras seqüenciadas, os tipos de HPV
foram assim distribuídos: HPV 16 - 18(75%) amostras, HPV 33 - 2(8%) e os tipos 31,
56, 66 e 6, uma amostra de cada, com percentual inferior a 5%.
Os tipos de HPV detectados no presente estudo estão de acordo com o
referido na literatura. Todos os tipos de HPV detectados são considerados de risco
oncogênico por vários autores (WALBOOMERS et al., 1999; GROSS E BARRASSO,
2000; QUINT et al., 2002; MUNOZ et al.,2003; IARC, 2005).
49
Bosch et al. (1995), detectaram 50% de prevalência para o HPV 16 nas
amostras positivas. No trabalho de Munoz et al. (2003), o HPV 16 foi também, o tipo
mais comum encontrado nos casos de câncer cervical, seguindo-se por ordem
decrescente os tipos 18, 45, 31, 33, 52, 58 e 35. Em nosso trabalho, a freqüência do
HPV 16 foi de 75%.
Em recente estudo, realizado por Andersson et al.(2005), avaliando 215
amostras de biópsias positivas para HPV, associadas com lesões benignas, premalignas e malignas do colo uterino, foram identificados 15 tipos oncogênicos de
HPV. Nos 45 casos de carcinoma escamoso invasor os tipos detectados mais
freqüentes foram os HPV 16 e 18 (76%) e os menos freqüentes foram HPV 31, 33,
52, 56, 67,70 e 73 (2 a 4%). Neste estudo não foi observada infecção por mais de
um tipo de HPV. Com exceção do HPV 18, estes dados percentuais estão similares
aos obtidos em nosso trabalho.
A nítida predominância do tipo 16, encontrada em lesões intra-epiteliais
escamosas de alto grau e carcinoma epidermóide invasor (figura 11), demonstra
semelhanças com outros trabalhos realizados em diferentes regiões geográficas do
Brasil (ELUF NETO et al., 1999; NORONHA et al., 1999; LORENZATO et al., 2000;
SANTOS et al., 2001; OLIVEIRA et al., 2003).
No Amazonas, Castro (2001) encontrou uma representatividade de 66,6%
para o HPV 16 em 19 amostras seqüenciadas, no grupo de pacientes com lesões
sugestivas de malignidade no colo uterino. Nossos dados não são discordantes dos
obtidos por Castro; ao todo observamos do total de 24 amostras, 18(75%) eram HPV
tipo 16.
Em recente estudo realizado por Chang et al. (2005), em Taiwan, analisando
25 amostras de biópsias de câncer cervical, através da PCR e Southern blot, foi
encontrado prevalência de 100% para DNA do HPV tipo 18 e a associação com HPV
tipo 16 em 7 das 25(28%) amostras.
Segundo Pfister (1997), o HPV 16 é o tipo mais prevalente em amostras de
câncer cervical, existindo flutuação geográfica. O HPV 18 predomina no sudeste da
50
Ásia e o HPV 45 tem maior incidência na África Ocidental. O HPV 39 e o 59 parecem
estar restritos às Américas Central e do Sul.
Nas amostras seqüenciadas não detectamos a presença do HPV 18, tipo este
predominante nos adenocarcinomas e nos tumores adenoescamosos, responsáveis
por aproximadamente 5% dos cânceres cervicais (BERTRAND, 2002). Vale ressaltar
que não obtivemos amostras de adenocarcinomas.
Segundo Pfister (1997), o HPV 66 parece ocorrer infreqüentemente, não
atingindo percentual significativo em estudos de grande amostragem. Tawheed et al.
(1991), analisando 160 biópsias de lesões anogenitais encontrou 4 amostras de
neoplasia intra-epitelial contendo DNA do HPV tipo 66, dentre as quais 3 estavam
associadas com outros tipos de HPV.
Muñoz et al. (2003), consideram o HPV 66, juntamente com o HPV 26 e 53,
tipos provavelmente oncogênicos. O sorotipo HPV 66 foi encontrado em 1(4,1%) das
amostras seqüenciadas de nossas pacientes. Não detectamos o HPV tipo 26 e HPV
tipo 53.
O HPV tipo 6 representou 4,1%(1) do nosso trabalho. De acordo com o
potencial oncogênico, é considerado como tipo de baixo risco, tendo sido encontrado
associado o HPV tipo 6 com lesões anogenitais benignas e malignas (Gross e
Barrasso, 1999).
Quanto aos fatores sociodemográficos pesquisados, em relação a raça, a cor
parda (100%) representada nesta amostra, é uma característica própria da maioria
da população que habita o Estado do Amazonas.
Várias estatísticas mostraram maior número de casos de câncer do colo do
útero em populações negras, índias americanas, americanas espanhóis e latinoamericanas
que
vivem
no
território
sudoeste
norte-americano
(DISAIA
e
CREASMAN, 1997; GOODMAN et al., 1986; JORDAN E KEY, 1981; MORROW e
TOWNSEND, 1987).
51
A incidência do carcinoma do colo uterino é menor, em relação à população
geral, na população muçulmana, mas é ainda menor na população hebraica (DE
PALO, 1996).
Ao contrário disso, as mulheres judias e as mulheres Amish parecem ter um
risco menor que o médio (PRIDAN e LILIENFELD, 1971; CROSS et al., 1968).
É possível que a disponibilidade de cuidados de saúde e práticas sexuais de
uma classe social, religião ou grupo étnico possa representar os papéis principais no
risco evidente de aparecimento da neoplasia cervical (JONES, 1988).
Em relação à faixa etária, a idade das 42 mulheres variou de 18 a 73 anos,
com mediana de 39 anos. Um caso de lesão intra-epitelial escamosa de alto grau
ocorreu em idade de 18 anos e um caso de câncer invasor na idade de 24 anos.
Hatch (1989) demonstrou que o câncer do colo do útero incide entre mulheres
com média de idade de 52,2 anos, mostrando distribuição de casos bimodal, com
picos entre 35 e 39 anos e 60 e 64 anos. Para outros autores, a faixa etária do
câncer invasivo é de 45 a 55 anos (média 48 anos) e a fase de lesão de alto grau
acontece cerca de 10 anos antes. (GUSBERG e MCKAY, 1971; FOCCHI et.al.,
(2000).
No Brasil, segundo o Instituto Nacional do Câncer (INCA) a incidência por
câncer do colo do útero torna-se evidente na faixa etária de 20 a 29 anos e o risco
aumenta rapidamente até atingir seu pico geralmente na faixa etária de 45 a 49
anos.
A renda familiar das pacientes do presente estudo foi menor ou igual a um
salário mínimo – R$ 260,00 (Ref. Dez/2004), representada por 64,3% da população
estudada; isto reflete a baixa condição sócio econômico das mulheres acometidas
pela doença. Vale a pena ressaltar que a FCECON atende predominantemente a
clientela do SUS e isto pode representar um viés em relação às pacientes com
melhor condição socioeconômica que procuram as clínicas particulares.
52
O baixo poder aquisitivo, tem implicações com o estado nutricional e talvez
possa parecer ter influências negativas, diminuindo a imunidade do hospedeiro do
HPV e contribuindo como co-fator no desenvolvimento de lesões precursoras do
câncer cervical.
Estudos de caso-controle demonstraram que a elevada ingestão de alimentos
contendo beta-caroteno e vitamina C, e em menor extensão a vitamina A, pode ter
ação protetora contra o câncer cervical. (VERREAULT, et al.,1989 e HERRERO et
al., 1991). Por outro lado, em grande estudo, caso-controle, conduzido nos Estados
Unidos não se conseguiu identificar qualquer efeito relacionados com estes fatores
dietéticos (ZIEGLER et al., 1990).
Em estudo epidemiológico demonstrou-se que a determinação dos níveis de
vitamina E, tidos como normais no grupo-controle, decresciam à medida que
aumentava a gravidade de lesão intra-epitelial cervical (CUZICK et al., 1990).
Segundo Focchi et al.(2000), é provável que a dieta possa influenciar
diferenças regionais na incidência do câncer cervical entre países ou que as trocas
metabólicas no organismo das hospedeiras de câncer invasivo possam influenciar a
ingestão destes nutrientes, levando aos distúrbios detectados.
Em relação ao nível de escolaridade, (31)73,3% das nossas pacientes
estavam cursando ou concluíram o ensino fundamental; (10)23,8% estavam
cursando ou concluíram o ensino médio e (1)2,4% era analfabeta, não havendo
registro de pacientes com nível superior.
A desinformação sobre programas de detecção do câncer cervical, a
dificuldade de acesso aos serviços de atenção primária e a associação com fatores
comportamentais sexuais em populações não esclarecidas quanto aos riscos de
infecções sexualmente transmissíveis, podem contribuir para o aumento da
incidência desta doença.
A maioria da população estudada (32)76,2% teve a primeira relação sexual
antes dos 16 anos e (21)50,0%, três ou mais parceiros sexuais.
53
Diferentes autores chegaram à mesma constatação, caracterizando a
associação do câncer do colo uterino com a atividade sexual. Estudos conduzidos
durante os últimos 25 anos, indicam consistentemente que o risco de câncer cervical
é fortemente influenciado por duas medidas da atividade sexual: o número de
parceiros sexuais e a idade do primeiro intercurso, e pelo comportamento sexual do
marido ou dos parceiros masculinos da mulher (FRANCO, 1997).
Usando o instrumento estatístico da análise de risco relativo, demonstrou-se
risco aumentado para o aparecimento de neoplasia cervical em mulheres com
múltiplos parceiros sexuais e pouca idade no início da atividade sexual. (HARRIS et
al.,1980).
Quando comparado com mulheres com apenas um parceiro sexual, o risco de
carcinoma in situ, atualmente incluído na terminologia de lesão intra-epitelial de alto
grau, aumentou 8 vezes entre as mulheres com três a cinco parceiros sexuais e,
quando o número foi maior que seis parceiros, o risco aumentou para 14,2 vezes.
(HARRIS et al.,1980).
Outros fatores de risco, tais como história conjugal instável, gestações
multiplas, casamento precoce e idade precoce da primeira gravidez, são
provavelmente relacionados com os dois fatores principais de múltiplos parceiros e
início precoce das relações sexuais. (JONES, 1990).
A idade da primeira gestação ocorreu depois dos 16 anos em (27)65,9%. Em
relação ao número de partos, a maioria (33)82,5% da população estudada relatou
antecedentes de 3 ou mais partos via vaginal.
Segundo Franco (1997), dois grandes estudos caso-controle multicêntricos
demostraram efeito independente para a paridade. Um desses estudos foi conduzido
em quatro regiões metropolitanas dos Estados Unidos e, o outro, em quatro países
latino-americanos. Ambos os estudos, mostraram tendência linear na relação risco e
paridade, mais evidente no estudo latino-americano, onde é maior a proporção de
mulheres multíparas.
54
Figueiredo (2004), refere estudos controlados que demonstram um aumento
de 5 vezes no risco de desenvolvimento de câncer cervical em mulheres multíparas mais de dez gestações.
Na presente investigação, (26)61,9% das mulheres não fizeram uso de
anticoncepcional hormonal oral. Nas (16)38,1% que utilizaram o método, não foi
assegurada a utilização regular e contínua nos últimos 10 anos.
Vários estudos evidenciaram risco aumentado, principalmente entre as
usuárias de anticoncepcionais orais de longo prazo, após o ajuste dos maiores
fatores de discrepância (CLARKE et al., 1985; BRINTON et al., 1986; BRINTON et
al., 1987; SHIFFMANN et al., 1996, FRANCO et al., 1999; FERENCZY e FRANCO,
2002).
Vale ressaltar que Irwin et al.(1988), interpretava esta associação como uma
possível tendenciosidade de detecção, pois as usuárias de pílulas submetem-se a
exames ginecológicos mais freqüente do que as não usuárias, portanto tendo uma
taxa de detecção precocemente aumentada da doença (JONES, 1988).
Segundo Trindade (2001), a maior exposição sexual ou a diminuição do uso
dos métodos de barreira podem contribuir para o aumento de risco nas usuárias de
anticoncepcionais hormonais.
Em relação ao tabagismo, o número de mulheres fumantes de cigarros
representou (9)21,4% do total de mulheres pesquisadas. Um percentual maior
24(57,1%) ocorreu quando acumulamos o número de fumantes com ex-fumantes.
Winkelstein (1977), levantou a hipótese de que o tabagismo estivesse
relacionado ao carcinoma do colo uterino. Esta hipótese baseava-se na observação
de que o tabagismo estivesse estreitamente relacionado ao mesmo tipo histológico
(carcinoma epidermóide) predominante no pulmão, laringe e colo do útero (DE PALO
e VECCHIONE, 1996).
55
Lyon et al (1983), estudando 217 mulheres com carcinoma in situ
encontraram risco relativo de 3.0 para as fumantes de cigarros, depois de controlar
outros fatores de risco entre os quais, os sócio-econômicos e sexuais (JONES,
1988).
Em estudo semelhante, realizado por Harris et al. (1980), verificou-se
risco três a quatro vezes aumentado de NIC entre as mulheres que fumavam 20 ou
mais cigarros por dia (JONES, 1988).
Barton et al. (1988), demonstrou a associação do tabagismo com nítida
depleção numérica das células de Langerhans do epitélio cervical normal. A
imunodepressão local que se instaura após a diminuição das células de Langerhans
pode explicar como o tabagismo contribui para o desenvolvimento da neoplasia
cervical (DEPALO, 1996).
Uma ação carcinogênica direta dos metabolitos da nicotina, sobre o epitélio
da cérvice uterina e a diminuição da resposta imune com diminuição de células
“natural Killer” e dos níveis de IgG e IgA parecem contribuir para o desenvolvimento
oncogênico na cérvice, anus e vulva. O número de cigarros e o tempo de consumo
apresentam correlação positiva. (GOODMAN et al.,1986; SCHIFFMAN et al., 1987;
YORDAN e WILBANKS, 1989; MEANWELL, 1991; HERBST et al.,1992).
No estudo realizado a concentração de nicotina e de seu maior
metabólito, a cotinina, observou-se maior concentração sérica no muco cervical do
que no plasma de mulheres fumantes ativas, não ocorrendo nas fumantes passivas
ou não fumantes (HELLBERG et al.,1988).
A
4-(metilnitrosamino)-1-(3-piridil)-1-butanona
(NNK),
poderoso
carcinógeno do tabaco, pode ser agente carcinogênico independente, não só para
tumores do colo do útero como, também, para os de outros órgãos. (HELLBERG et
al.,1988).
56
Em revisão de literatura, concluiu-se que, dos 33 estudos publicados, a
maioria confirmava a associação positiva entre fumo e câncer do colo do útero
(WINKESLTEIN, 1990).
Em relação ao sangramento anormal e/ou sangramento ao coito, o mesmo
percentual (15)35,7% de mulheres responderam afirmativamente ter apresentado
estas sintomatologias. Considerando o alto percentual de mulheres assintomáticas
27(64,3%) acreditamos que as lesões intra-epiteliais cervicais e o câncer do colo
uterino em fases iniciais de invasão possam ter passado despercebidos pela maioria
da população.
Segundo Carvalho (2000), o câncer do colo uterino se desenvolve sem
qualquer sintomatologia específica, nas suas etapas iniciais pré-invasivas,
manifestando-se por sangramentos, somente quando o tumor invade o estroma
cervical.
O acesso das mulheres aos programas de detecção precoce e o tratamento
adequado das lesões precursoras do câncer do colo uterino, têm sido reconhecido
como a melhor estratégia para reduzir a mortalidade e controlar a doença.
57
6. CONCLUSÕES
1. Detectou-se, através da PCR, a presença de DNA do HPV em 100% das 42
pacientes.
2. Na análise de homologia foram identificados os sorotipos de HPV 16, 31, 33 e
56, considerados de alto potencial oncogênico; o sorotipo HPV 66, tipo
considerado provavelmente oncogênico e o sorotipo HPV 6, classificado
como de baixo risco .
3. O sorotipo HPV-16, foi o mais prevalente em 18 (75%) das 24 amostras
seqüenciadas.
4.
A relação sexual precoce (antes dos 16 anos), múltiplos parceiros sexuais,
multiparidade (igual ou maior que 3 partos via vaginal), baixo nível de
escolaridade, baixa renda familiar e fumo foram os principais fatores
sociodemográficos associados com a população estudada.
5. Os dados obtidos através deste trabalho confirmam os dados existentes na
literatura mundial e indicam a importância da prevenção da transmissão
sexual do HPV, o fator principal para o desenvolvimento das lesões intraepiteliais de alto grau e câncer epidermóide invasor do colo uterino nestas
pacientes.
58
7. BIBLIOGRAFIA
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68
ANEXO I
FICHA TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
INVESTIGADOR: Gilson José Corrêa
INSTITUIÇÃO: Fundação Centro de Controle de Oncologia
TELEFONE: (92) 3656-1211
TÍTULO: Prevalência de HPV em mulheres portadoras de lesões intra-epiteliais
escamosas de alto grau e carcinoma epidermóide invasor.
DESCRIÇÃO E OBJETIVO DO ESTUDO
Este é um estudo epidemiológico.
Seu objetivo é investigar a presença de Papillomavírus humano (HPV) em
mulheres portadoras de lesões intra-epiteliais escamosas de alto grau e carcinoma
epidermóide invasor do colo uterino em pacientes atendidas na FCECON, na cidade
de Manaus, através do método da PCR, visando estimar a prevalência da infecção
na população pesquisada.
Eu recebi a explicação de que eu serei uma das pacientes participantes do
projeto. Minha participação será absolutamente voluntária. Este estudo foi
desenhado para avaliar quantas mulheres são portadoras de HPV no grupo
pesquisado e assim determinar a prevalência da infecção. Se eu voluntariamente
concordar, eu permitirei que sejam feitos os exames necessários, inclusive a PCR,
para identificar a presença do HPV com descrição dos tipos específicos, para
confirmação diagnóstica. Estou ciente da importância de ser questionada sobre mim
mesmo no que se refere a algumas questões de saúde e condições de vida.
Todos os procedimentos serão realizados na FCECON.
RISCOS ASSOCIADOS AO ESTUDO
Fui orientada que os exames da PCR podem dar resultados falso-positivos e
falso-negativos, induzindo a erros de interpretação.
BENEFÍCIOS
Participando neste estudo, estarei me beneficiando do exame da PCR,
importante para verificar a presença ou não do HPV e sua associação com o câncer
do colo uterino. Além disso, estarei contribuindo para o conhecimento de quantas
pessoas são afetadas por este tipo de doença.
69
CONFIDENCIALIDADE E AVALIAÇÃO DOS REGISTROS
Minha participação neste estudo será confidencial e os registros ou resultados
ao estudo serão divulgados ao nível científico e autoridades de saúde pública a fim
de que sejam tomadas atitudes que garantam a saúde da população.
Minha identidade permanecerá sempre em confidencialidade.
DIREITO A RETIRADA DO ESTUDO
Eu tenho direito de fazer qualquer pergunta referente aos riscos potenciais ou
conhecidos para mim durante minha participação neste estudo.
Eu serei notificada com referência a qualquer nova informação relacionada
com o estudo. Eu serei capaz de contatar o Dr. Gilson José Corrêa, cujo número de
telefone é (92)236-5069 ou (92) 81285023.
PARTICIPAÇÃO VOLUNTÁRIA
A minha participação neste estudo é voluntária. Se eu recusar a participação
neste estudo, não haverá qualquer tipo de retaliação ou perda de benefícios a que
tenha direito.
Eu tenho o direito de manter uma cópia assinada deste documento.
CONSENTIMENTO PÓS-INFORMAÇÃO
Após ter recebido informações claras, eu concordo com minha participação no
estudo.
/
Assinatura do Paciente do Estudo
/
Data
/
Assinatura da 1ª Testemunha
/
Data
/
Assinatura da 2ª Testemunha
/
Data
/
Assinatura do Investigador
/
Data
70
ANEXO II
FICHA DE TRIAGEM E QUESTIONÁRIO
I. TRIAGEM
1. Informações sobre o estudo e confiabilidade do estudo
2. Consentimento da paciente em participar do estudo
2.1 ( ) Sim
2.2 ( ) Não
3. Identificação com as iniciais da paciente_____________
4. Data de nascimento _____/_____/_____
5. Ultima menstruação _____/_____/_____
5.1 ( ) não sabe informar
5.2 ( ) menopausada
6. Qual a sua procedência?
6.1 (
6.2 (
6.2 (
6.3 (
) Manaus
) Interior do estado do Amazonas
) Outro estado da região norte
) Outro estado da federação
7. Você já teve seu útero removido (histerectomia)? Fez crio ou termocauterização,
laserterapia, quimioterapia ou radioterapia?
7.1 ( ) Sim
7.2 ( ) Não
7.3 ( ) Não sabe informar
8. Resultado do exame colpocitológico:
Data do exame:____/____/____
8.1. ( ) NIC III/Ca “in situ”
8.2 ( ) Carcinoma microinvasor
8.3 ( ) Carcinoma escamoso invasor
8.4 ( ) Adenocarcinoma
9. Resultado de biópsia/exame histopatológico:
9.1 (
9.2 (
9.3 (
9.4 (
) NIC III/Ca “in situ”
) Carcinoma microinvasor
) Carcinoma escamoso invasor
) Adenocarcinoma
II. QUESTIONÁRIO
10. Qual seu estado civil?
10.1 (
10.1 (
10.2 (
10.3 (
10.4 (
) Solteira
) união estável
) Casada
) Divorciada/separada
) Viúva
11. Qual o nível mais elevado de escolaridade que você completou?
11.1 (
11.2 (
11.3 (
11.4 (
11.5 (
11.6 (
) Primeiro grau incompleto
) Primeiro grau completo
) Segundo grau incompleto
) Segundo grau completo
) Curso profissionalizante após o segundo grau
) Universidade
71
12. Qual a sua renda familiar?
12.1 (
12.2 (
12.3 (
12.4 (
12.5 (
) 1 salário mínimo
) 2-3 salários mínimos
) 3-4 salários mínimos
) 5-6 salários mínimos
) acima de 6 salários mínimos
13. Idade da 1ª relação sexual__________
14. Idade da 1ª gestação_____________
15. Você está grávida no momento?
15.1 ( ) Sim
15.2 ( ) Não
15.3 ( ) Não sabe informar
16. Nº total de abortos ____________
17. Nº de partos normais _____________
18. Nº de partos cesáreos _____________
19. N° total de partos
20. Você utilizou anticoncepcional oral ou injetável nos últimos 10 anos?
20.1 ( ) sim
20.2 ( ) não
21. Qual das seguintes situações melhor descrevem o seu hábito de fumar?
21.1 (
21.2 (
21.3 (
21.4 (
) Eu nunca fumei
) Eu fumei no passado, mas não fumo atualmente
) Eu geralmente fumo menos de uma carteira por dia
) Eu geralmente fumo em torno de uma carteira ou mais por dia
22. Qual o número de parceiros sexuais que você já teve na vida?
22.1 (
22.2 (
22.3 (
22.4 (
22.5 (
) um
) dois
) três
) quatro
) cinco ou mais
23. Sangramento uterino anormal no último ano?
23.1 ( ) Sim
23.2 ( ) Não
24. Sangramento ao coito no último ano?
24.1 ( ) Sim
24.2 ( ) Não
25. Pesquisa para HIV:
25.1 ( ) nunca fez exame
25.2 ( ) negativo
25.3 ( ) positivo
1. OBSERVAÇÕES:
2. RESULTADO DO EXAME HISTOPATOLÓGICO:
3. RESULTADO DA PCR: