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fmvz-unesp
FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA - BOTUCATU
Curso de Pós-Graduação em Zootecnia – Nutrição e Produção Animal
ELETROFORESE
Joerley Moreira & Rodrigo Garófallo Garcia
Zootecnistas
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ELETROFORESE
1- INTRODUÇÃO
A eletroforese pode ser definida como o movimento de uma molécula
carregada (ion) em um campo elétrico. O termo eletroforese foi criado por Michaelis,
em 1909, para descrever a migração de colóides sob a influência de um campo
elétrico. Eletroforese representa, portanto, a migração de íons submetidos à corrente
elétrica. Seu princípio é simples: moléculas com carga negativa migram para o polo
positivo (anodo), e moléculas com carga positiva migram para o polo negativo
(catodo). Três componentes básicos são necessários para se realizar uma
eletroforese: um campo elétrico, que é obtido através de uma fonte de corrente
contínua, um suporte onde a molécula pode migrar e a própria molécula carregada.
1.1- IONIZAÇÃO DAS MOLÉCULAS
A carga de uma molécula é o resultado da ionização de seus grupos
dissociáveis. Essa ionização depende do pH do meio e do pK do grupo dissociável.
O grau de pH. O grau de dissociação pode ser estimado pela equação de HedersonHasselbalch.
pH = pK + log {base conjugada}/{ácido conjugado}
A migração diferencial das moléculas ou seja, a sua separação em um campo
elétrico, resulta das diferentes quantidades de ions carregados em um determinado
pH.
1.2- MIGRAÇÕES IONICAS
A eletroforese visa a separação de moléculas em função de suas cargas
elétricas, de seus pesos moleculares e de suas conformações, em suportes porosos
e tampões apropriados, sob a influência de um campo elétrico contínuo.
A carga preponderante de uma molécula protéica é função dos seus
aminoácidos. Em pH neutro, por exemplo, os componentes lisina (Lys), arginina
(Arg) e histidina (His) contribuem com carga positiva, enquanto os radicais de ácido
1
glutâmico (Glu) e ácido aspártico (Asp) exercem carga negativa. Sendo substâncias
anfólitas, as proteínas adquirem carga positiva ou negativa em função do pH. É,
portanto, conveniente manter o pH do meio estável durante a eletroforese, mediante
o uso de soluções-tampão. O sistema-tampão consiste de duas partes: o tampão do
gel, usado no preparo do gel, e o tampão dos eletrodos (catodo/anodo), usado nos
respectivos tanques.
Em virtude do contato elétrico dos pólos com as soluções-tampão dos
tanques haverá participação dos componentes dos respectivos tanques na
neutralização da base formada no catodo e do ácido formado no anoda. As
soluções-tampão estabilizam o pH do meio e permitem o fluxo da corrente elétrica,
mas geralmente elas são inertes no processo eletroforético.
O tampão deve, portanto , Ter acentuada condutividade elétrica.
É costume serem aplicados, para este propósito, eletrólitos de 0,05 e 0,5 M.
Em geral, soluções-tampão mais concentradas fornecem melhor resolução, embora
o tempo de separação seja maior.
Quando uma molécula com carga líquida “Q” é colocada em um campo
elétrico “S”, sofre efeito de uma força de campo “F” que depende do campo elétrico
e da carga da molécula.
F=S*Q
O campo elétrico “S” é a relação entre voltagem (V) e a distância entre os
eletrodos (d).
F = V/d*Q
A velocidade de migração de uma molécula carregada pode ser alterada,
portanto, mudando a distância entre os eletrodos bem como alterando a voltagem do
sistema.
Na ausência de uma força de resist6encia, a molécula acelera até encontrar o
eletrodo. Entretanto, isso não ocorre devido à resistência resultante da fricção com o
suporte. A força de fricção “F” é uma função do tamanho e da forma da molécula,
viscosidade da solução e velocidade de migração como mostra a equação de
STOKES.
F = 6π
πRNv
F = Força de fricção
R = Raio da molécula
N = Viscosidade do meio
2
v = Velocidade de migração
Quando a força de resistência excede a força de propulsão da molécula, não
ocorre a migração. Quando a força de propulsão excede a força de resistência,
ocorre a migração da molécula carregada. Os fatores que afetam a velocidade de
migração de uma molécula carregada podem ser obtidos quando a força de
propulsão e a força de resistência são iguais:
F = V/d*Q e F = 6π
πRNv
Igualando as forças:
V/d*Q = 6π
πRNv
Isolando a velocidade:
V = V*Q/6π
πRNv
A velocidade de migração de uma molécula carregada em um campo elétrico,
é diretamente proporcional a carga da molécula e a viscosidade da solução. Quando
o suporte utilizado for um gel de poliacrilamida, o efeito do tamanho dos poros
devem ser considerados.
Como cada molécula devem possuir carga e tamanho específicos, devem
migrar para uma única posição em um campo elétrico, em um dado intervalo de
tempo. Em uma mistura de ions (proteínas por exemplo), cada um deve posicionar
em um lugar único dentro do campo elétrico.
Submetendo-se extratos protéicos ao efeito da corrente elétrica, os seus
componentes ionizados migrarão com velocidades individuais.
Com vistas a uma definida enzima, em virtude de sua posição no gel depois
da corrida, essa enzima pode ser revelada, permitindo, em consequência,
identificações qualitativas (por sua posição) e quantitativas (pela intensidade de sua
banda).
1.3- CORRENTE ELÉTRICA
A eletroforese pode ser conduzida ora sob voltagem, ora sob amperagem
(corrente) ou, então, wattagem (potência) constantes reguladas pela fonte elétrica. À
medida que as moléculas migram no campo elétrico, a resistência geralmente
aumenta. Então, a amperagem diminui sob voltagem constante, ou esta aumenta
sob amperagem constante. As variações na intensidade da corrente ou na voltagem
3
podem ser detectadas na fonte de energia, anotando-se os respectivos valores no
início e no final da corrida eletroforética.
A escolha da voltagem, amperagem ou wattagem é feita empiricamente.
A temperatura elevada tende a desnaturar moléculas como as proteínas, o
que acarreta, não raro, alguma perda de atividade enzimática. Quanto mais alta a
voltagem ou a intensidade da corrente, maior será também o calor emanado.
Visando manter a temperatura baixa durante a eletroforese, o gel é resfriado com o
auxílio de uma coluna de água fria em dispositivo apropriado inserido na cuba ou
efetuando-se a corrida em geladeira.
1.4- SUPORTES DA ELETROFORESE
A eletroforese pode ser desenvolvida em suportes como papel-filtro, sílica-gel,
membranas de acetato de celulose e géis de agarosa, de amido ou de
poliacrilamida.
O suporte deve ser química e fisicamente inerte de modo a não interferir na
mobilidade das moléculas. O poder de resolução é importante na escolha do meio
suporte.
Para enzimas, géis de amido e poliacrilamida oferecem melhor separação do
que outro suportes. Além do efeito de carga, a separação dá-se de acordo com o
tamanho e a estrutura das moléculas (peneiramento molecular). Enquanto o
movimento de proteínas de alto peso molecular e retardado pelo pequeno diâmetro
dos poros do gel, proteínas de baixo peso molecular migram livremente de acordo
com as respectivas cargas.
A escolha do meio de suporte depende de preferências individuais i dos
objetivos, mas de modo geral, para proteínas, géis de poliacrilamida têm sido
preferidos por seu maior poder de resolução graças a ampla variação controlável no
diâmetro de seus poros. Além disso, géis de poliacrilamida são muito translúcidos, o
que possibilita quantificar a atividade enzimática por densitômetria. A eletroforese
em géis de amido é bem mais barata do que aquela em géis de poliacrilamida, mas
suas lâminas não tem porosidade rigorosamente controlável e a capacidade de
separação é, em consequência inferior.
Por outro lado, géis de amido são compatíveis com diferentes sistemastampão, o que permite otimizar a atividade e a distinção entre enzimas em função
4
dos componentes da solução-tampão e de seu valor de pH. Após a secagem, esses
géis tornam-se comparavelmente translúcidos aos géis de poliacrilamida.
1.5- POROSIDADE DE GÉIS
A fricção e, em consequência, a velocidade de migração de macromoléculas
em um campo elétrico dependem da porosidade do gel.
Em géis de amido, as cadeias de carboidratos ramificam-se e entrelaçam-se o
suficiente para formar uma textura semi-rígida, adquirindo assim, a estrutura de gel e
não de líquido viscoso. Ao contrário, a porosidade de géis de poliacrilamida é
definida pelo teor de seus componentes unitários: acrilamida e N, N’- metileno-Bisacrilamida (Bis). Uma solução de acrilamida apenas, uma vez polimerizada, forma
um líquido altamente viscoso. A concentração de Bis é que determinará a
porosidade dos géis.
Géis de agarosa apresentam porosidade bem além da obtida em géis de
poliacrilamida. A presença de agarosa, geralmente na concentração de 0,5 %,
imprime ao gel rigidez mecânica bem maior que a de géis de poliacrilamida sem
agarosa. A agarosa permite a separação de ácidos nucléicos, conforme seus pesos
moleculares, de ribossomos e de componentes de tamanhos até 200S.
1.6- MOBILIDADE DOS IONS
Extratos protéicos são obtidos por maceração da amostra em soluções
extratoras apropriadas. O extrato protéico é aplicado no gel e submetido à
eletroforese, após o que os géis, são removidos das molduras e revelados, visando
a detecção de proteínas totais ou de enzimas específicas. Para proteínas, os géis
são imersos numa solução de azul-brilhante-de-comssie ou corantes a base de
prata.
Para enzimas específicas, os géis são incubados em soluções, contendo os
componentes (substrato, coenzimas, solução-tampão e sais) necessários para
revelação das bandas de atividade enzimática.
2.0- ELETROFORESE EM GEL DE AMIDO
5
Géis naturais são de natureza química bem variada: proteínas como gelatina
e caseína, e polissacarídeos como amido, ágar e pectina. A água se difunde em géis
pela população de macromoléculas, rendendo porosidade uniforme do gel, o que
garante sua morfologia. Géis apresentam o fenômeno da desidratação, a qual
geralmente é lenta. Trata-se de uma forma de intemperismo, a sinerese. O gel,
entretanto, mantém sua morfologia, apesar de se encolher. Por esse motivo, géis
apropriados para eletroforese não se conservam bem por muitos dias.
A porosidade do gel de amido varia conforme sua origem e seu preparo. O
amido em seu estado nativo, é constituído de α-amilose e amilopectina. A α-amilose
é formada por longas cadeias (em torno de 300 unidades) não ramificadas de Dglucose, cujas unidades são interligadas por ligações α- 1, 4. Em água, a amilose
forma micelas hidratadas, cujas cadeias polissacarídicas assumen a forma
helicoidal. Já a amilopectina, embora apresente esqueleto similar ao da amilose, é
altamente ramificada, cujos pontos de ramificação são ligações α- 1, 6. Em água, a
amilopectina forma soluções coloidais ou micelares.
Sob aquecimento, a suspensão aquosa de amido torna-se viscosa.
Sua viscosidade aumenta acentuadamente a 65ºC, ponto em que os grânulos
de amido se desfazem; a partir daqui, à medida que a temperatura aumenta, a
viscosidade diminui abruptamente e atinge um valor mínimo e uniforme a 95ºC.
Neste ponto, a suspensão deve ser desgaseificada e vertida para as molduras
próprias. Após resfriamento, a suspensão geleifica-se, formando uma rede
tridimensional de polímeros de glucose com ligações glicosídicas α- 1, 6, originárias
da amilopectina. Quando frio, o gel está preparado para receber o extrato protéico e
ser submetido à eletroforese. A concentração de gel define a sua consist6encia e
porosidade. Seu preparo é relativamente empírico, o que requer habilidade do
pesquisador. Na eletroforese em gel de amido, as moléculas, ao migrarem entre as
malhas do gel, estão sujeitas ao efeito de fricção e peneiramento molecular,
proporcionando o fracionamento das amostras.
Conforme mencionado anteriormente, a eletroforese em gel de amido é
menos onerosa do que a em gel de poliacrilamida, mas suas lâminas não
apresentam porosidade controlada, não permitem preparo de gradientes de pH e
sua resolução é inferior. Por ser um polímero natural, a composição do amido pode
6
variar de lote para lote, o que pode afetar suas propriedades de geleificação e
resolução, tornando-se necessário, muitas vezes, recalibrar o sistema ao utilizar
diferentes lotes de produtos. Em pH alcalino, o gel de amido exibe ligeiro efeito
eletroendosmótico em direção oposta a da migração das proteínas.
Amido
hidrolizado
de
alta
qualidade,
próprio
para
eletroforese,
é
imprescindível e encontra-se, atualmente, disponível no mercado.
Todavia se necessário, a hidrólise do amido pode ser conduzida no
laboratório. Para isso, 300g de amido solúvel são suspensos em 600mL de solução
de acetona: HCl concentrado (100:1) a 38,5ºC.
Cuidados especiais devem ser tomados para impedir a volatilização da
solução em hidrólise. Após 45 minutos de repouso nesta temperatura, interrompe-se
a hidrólise pela adição de 150 mL de solução aquosa de acetato de sódio 1M. A
seguir. A suspensão é filtrada em funil de Buchner e lavada, cuidadosamente, com
água destilada. Para remover possíveis traços remanescentes de acetato,
resuspende-se o amido em água destilada e, após 12 horas de repouso, filtra-se a
suspensão em funil de Buchner, lava-se novamente com água destilada e, por
ultimo, com acetona. A seguir, seca-se o amido a 45-50ºC. Durante a hidrólise, a
temperatura deve ser rigorosamente controlada.
2.1- PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
Preparo Do Gel
1- Suspenda 39g de amido em 150mL de solução-tampão do gel (gel 13-14%), à
temperatura ambiente, em frasco Kitazato, sob agitação constante. A soluçãotampão do gel varia de acordo com a espécie estudada. Existem várias
composições que podem ser encontradas em livros de bioquímica ou biologia.
2- Adicione à suspensão 150 mL da mesma solução, procurando lavar as paredes
do frasco.
3- Cozinhe a suspensão em forno de microondas, agitando-a fortemente a cada 40
segundos no início e a cada 10 segundos após o aquecimento, antes de atingir a
fervura, para que o cozimento seja homogêneo. Após o cozimento, a suspensão
torna-se viscosa e transparente.
4- Mantenha a suspensão no forno de microondas até a fervura.
7
5- Tampe o frasco com uma rolha de borracha e adapte sua saída lateral a uma
bomba de vácuo, para eliminação das pequenas bolhas de ar formadas durante
o cozimento.
6- Verta cuidadosamente a suspensão de amido nas molduras de acrílico. A fim de
uniformizar a superfície do gel e evitar o excesso de evaporação, cubra o gel
com uma placa de vidro. Assim que o gel atingir a temperatura ambiente,
mantenha-o em geladeira pelo menos por 30 a 60 minutos antes de aplicar as
amostras e proceder à eletroforese.
2.1.1- APLICAÇÃO DAS AMOSTRAS E ELETROFORESE
1- Remova a placa de vidro que cobre o gel.
2- A cerca de 2.5 cm de uma das extremidades, corte o gel com auxílio de
escalpelo ou lâmina própria. O corte deve ser perpendicular e atingir a face
inferior do gel.
3- Afaste a menor porção do gel para facilitar a aplicação das amostras.
4- Triture pequena porção do tecido (que se deseja estudar) em pequeno volume
)10 a 20 µl) de tampão do gel ou aplique amostras previamente preparadas e
armazenadas em tubos Eppendorf a –85ºC. Alguns materiais exigem tampões de
extração mais complexos.
5- Aplique, sequencialmente, ao longo da face cortada do gel maior as amostras
adsorvidas nas tiras de papel-filtro (12 x 5mm), fazendo com estas cubram
completamente a espessura do gel. É conveniente aplicar também solução de
azul-de-bromofenol, quer em tira própria, quer juntamente com uma das
amostras, para monitorar a migração.
6- Apoie o suporte do gel sobre as cubas.
7- Empregue o sistema-tampão gel/eletrodo adequado, de acordo com o material
estudado.
8- Conecte o gel às cubas dos eletrodos, mediante uma ponte de pano, tipo Perfex,
ou similar, previamente embebida na solução tampão.
9- Ligue o aparelho e faça o devido controle elétrico, usando-se voltagem (V),
corrente (I) ou potência (W) constantes, dependendo do sistema-tampão
gel/eletrodo empregado.
8
10- Anote todos os dados da condição da corrida (V, A, W) aferidos no aparelho.
Isso é importante para monitorar a análise e diagnosticar possíveis problemas
durante a eletroforese.
11- Faça uma pré-corrida eletroforética durante 15 minutos, a fim de que o material
em estudo seja liberado das tiras de papel contendo o extrato para o gel.
12- Desligue o aparelho, desconecte o gel das cubas e remova as tiras do papel filtro
com o auxílio de uma pinça cirúrgica. Mediante o uso de cotonete, limpe a face
cortada do gel onde foram aplicados os extratos.
13- Apoie o suporte do gel sobre as cubas e cubra-o com um plástico, deixando livre
cerca de 2 cm em cada extremidade. Esse procedimento evita a evaporação de
água durante a eletroforese.
14- Conecte o gel às cubas e religue o aparelho, tendo o cuidado de anotar os dados
de voltagem, potência e corrente.
2.1.2-PROBLEMAS
COMUNS
NO
PREPARO
DO
GEL
E
DURANTE
A
ELETROFORESE
Problema
Causa Provável
Sugestão
Formação
de O amido não foi bem misturado Prepare nova suspensão, certificando-
grumos
na com a solução-tampão.
se de que o amido seja adicionado,
suspensão
pouco a pouco, à solução-tampão e
quente
sob constante agitação, a fim de se
obter
uma
suspensão
bem
homogênea.
Gel
flácido
aquoso
e Excesso
de
adicionada.
solução-tampão Adicionar
quantidade
certa
de
Cozimento solução-tampão. Aumentar o tempo
insuficiente do amido. Tempo de
cozimento.
Resfriamento
num
insuficiente para o resfriamento tempo adequado
do gel.
Gel
rígido
difícil de fatiar
e Congelamento do centro do gel Mudar o sistema de resfriamento.
devido ao gelo usado para Diminuir o tempo de cozimento de gel.
resfriá-lo. Cozimento excessivo
do amido.
9
Gel
de F6orma do gel fora de nível. Preparar
espessura
gel nivelando
Vazamento dos lados da fôrma. adequadamente a fôrma do gel e
irregular
Não
um novo
prender firmemente os grampos.
detecção Soluções corantes misturadas Uso
de bandas
impropriamente.
de
Deterioração apropriadas
corantes
e
na
e
soluções
quantidade
dos produtos químicos ou das adequada.
soluções-tampão.
Arraste
de Baixa força iônica do tampão Verificar a presença de bolhas de ar
bandas a partir da
da origem
amostra
insuficiente
ou
do
quantidade no gel. Rever as soluções tampão.
mesmo.
Presença de bolhas de ar no
gel. Presença de amilose no
extrato cru.
2.1.3- CORTE DO GEL EM FATIAS
Com o auxílio de guias e mediante o uso de um fio de náilon, corte o gel
horizontalmente em fatias de, aproximadamente, 1 mm de espessura. Retire,
cuidadosamente, as fatias e distenda-as em fôrmas tipo pirex, para receber soluções
corantes específicas.
10
Figura 1 – Preparo do gel de amido.
Eletroforese e coloração. A: desgaseificação
da suspensão de amido, B: adição da
suspensão de amido na forma de gel, C:
corte do gel, D: aplicação da amostra.
FIGURA 2 – Cont. E: gel sobre as
cubas, F e G: laminação do gel
após eletroferese, H: coloração.
2.1.4- REVELAÇÃO DE PROTEÍNAS EM GÉIS
Após a eletroforese, os géis são corados em soluções apropriadas para
revelação de bandas de proteínas totais ou enzimas específicas. Para proteínas
totais, a eletroforese é usualmente desenvolvida em géis de poliacrilamida, em
virtude de seu maior poder de resolução. Para enzimas, tanto o gel de amido quanto
o gel de poliacrilamida podem ser empregados satisfatoriamente, e os métodos de
revelação são essencialmente os mesmos.
Figura 3 – I: Coloração e revelação do gel. A: 6-fosfogluconato
desidrogenase, B: superóxido dismutase, C: segregação
aloenzimática em progênie de Tanatephorus cucumeris.
2.1.5- SECAGEM DO GEL
Os métodos empregados para secagem dos géis variam dos mais simples,
rápidos e baratos aos mais complexos, demorados e dispendiosos. O método usado
11
deve preservar a tonalidade de coloração das bandas e manter, ao máximo, a
integridade do gel, evitando rachaduras e encolhimento, que mascaram ao padrões
eletroforéticos. Há disponíveis no mercado e eficientes e sofisticados secadores de
géis que funcionam a vácuo e sob temperaturas relativamente elevadas.
2.1.5.1- Método do bastidor
Após coloração e fixação, o gel é mantido em solução constituída de metanol
(65%) e glicerol (0.5%), sob agitação lenta, durante 15 minutos, a fim de remover o
excesso de água contido nos poros do gel. Uma folha de papel-celofone bem
poroso, ou similar, encharcada de água, é estendida sobre o arco interno de um
bastidor de madeira, apoiado sobre um disco de isopor com espessura igual à
largura do bastidor e diâmetro ligeiramente inferior ao da sua circunferência interna.
O gel é colocado sobre a folha de papel-celofone e, a seguir, coberto com outra
folha de celofone, igualmente encharcada de água e de mesma dimensão. Para
facilitar a secagem, o conjunto gel-bastidor é mantido em posição vertical, à
temperatura ambiente, por 24 horas. Posteriormente o gel é removido dos
bastidores, etiquetado e arquivado para análise dos resultados.
2.1.5.2- Método da Placa de Vidro
Mergulha-se o gel em uma solução aquosa de metanol (65%) e glicerol
(0.5%), por 1 a 4 minutos. A seguir, o gel é colocado sobre uma lâmina de papelcelofone distendida sobre uma placa de vidro, sendo o excesso de água removido
por adsorsão, mediante o uso de papel-filtro. Uma Segunda folha de celofone de
mesma dimensão deve ser distendida sobre o gel, tendo-se o cuidado de remover
as bolhas que se formarem entre o gel e o celofone. O tempo de secagem pode ser
de duas a quatro horas, a 50ºC, em forno com ventilação forçada.
Figura
4
–
Representação
diagramática do aparato
utilizado para secagem
do
gel
de
amido
e
poliacrilamida
12
2.1.6- DOCUMENTAÇÃO DE RESULTADOS EM GEL
2.1.6.1- Fotografia Convencional
A câmera fotográfica é acoplada a um sistema de iluminação com luz
incidente e transmitida. Os braços flexíveis da luminária permitem a focalização da
luz sobre o gel. Muitas vezes apenas a luz transmitida é suficiente para sensibilizar o
filme e obter fotos de boa qualidade.
Figura 5 – Aparato utilizado para fotografias convencionais de géis: a-base, b-hastesuporte, c- luminária, d- lâmpadas de 200W, e- câmara fotográfica e ftransiluminador para luzbranca.
2.1.6.2- Fotografia Digital
A fotodocumentação digital é feita mediante o uso de um sistema
computadorizado que permite a captura, a visualização e o processamento de
imagens de bandas de proteínas e ácidos nucléicos reveladas em géis. O sistema
consiste de uma câmara escura de mesa, tendo internamente um transiluminador
móvel de luz ultravioleta (UV) para géis corados com brometo de etídio para ácidos
13
nucléicos ou transiluminador de luz branca para géis de proteínas ou enzimas
coradas.
Em virtude de seu alto custo atualmente, este sistema é ainda inacessível à
maioria dos laboratórios, mas suas consideráveis vantagens em relação aos
métodos convencionais de documentação de resultados em géis justificam o seu
uso.
Figura 6 – Sistema de fotodocumentação digital: a) câmara
escura de mesa, contendo internamente um transiluminador
de luz ultra violeta (UV) ou de luz branca; b) câmara de
vídeo, munida de lente “zoom”; c) monitor; d) impressora
térmica; e e) computador.
3.0- ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA
3.1- Fundamentos
Géis de poliacrilamida são formados por copolimerização de acrilamida e Bisacrilamida (Bis) na presença de persulfato de amônia e tetrametiletilenodiamina
(TEMED) ou riboflavina e TEMED sob luz ultravioleta ou fluorescente. O TEMED
catalisa a liberação de radicais livres de persulfato que, por sua vez, iniciam a
polimerização. O sistema riboflavina-TEMED exige fotoenergia para iniciar o
14
polimerização. A fotodecomposição da riboflavina libera radicais livres que
promovem a polimerização.
A polimerização ocorre pela formação de radicais livres de acrilamida obtidos
química ou fotoquimicamente. A polimerização para render géis, requer ligações
entre as cadeias de poliacrilamida geradas por moléculas de Bis. Na falta de Bis, por
copolimerização, causa reticulação entre as cadeias de poliacrilamida.
O diâmetro dos poros do gel é função das concentrações de acrilamida e Bis
(T%). Para separação de moléculas maiores, usam-se géis com menor teor de
acrilamida.
Para proteínas desnaturadas, empregam-se, comumente, géis com gradiente
de concentração. Analogamente a géis comuns, a concentração do gradiente é
escolhida de acordo com o peso molecular das proteínas em estudo. Na prática,
confeccionam-se géis em gradiente, na faixa de 7% a 16% de acrilamida. Na
eletroforese de proteínas desnaturadas, o SDS (dodecilsulfato de sódio)
e o
mercaptoetanol aniquilam o efeito de cargas das moléculas protéicas nativas. Neste
caso, as separações se dão segundo o peso molecular, e a migração é
consequência tão-somente das cargas negativas do SDS, causando efeito de
peneiramento molecular. Quanto maior a molécula, menor a mobilidade.
Figura 7 – Efeito da concentração de acrilamida sobre o
diâmetro dos poros do gel.
15
Tabela 1 – Faixa de concentração de acrilamida (T%) em relação ao peso molecular
das proteínas a serem separadas por eletroforese em gel de poliacrilamida.
Concentração de acrilamida (T%)
Faixa ótima de peso molecular (kDa)
3-5
>100
5-12
20-150
10-15
10-80
>15
<15
3.2- SISTEMAS DE ELETROFORESE
Géis em placa têm sido comumente usados por serem mais fáceis de
manusear e permitirem comparação de várias amostras num mesmo gel em
condições idênticas de eletroforese. Em algumas situações, contudo, géis em tubos
são ainda usados, especialmente na primeira direção da eletroforese bidimensional.
Quanto a posição do gel, o sistema de eletroforese pode ser vertical ou horizontal,
quanto aos tampões e respectivos valores de pH, o sistema pode ser contínuo ou
descontínuo.
No sistema contínuo, o gel tem porosidade uniforme e o tampão usado na
preparação da amostra e do gel é o mesmo utilizado nos tanques dos eletrodos. No
sistema descontínuo, os íons tamponante do gel são diferentes daqueles dos
eletrodos. O sistema descontínuo consiste de géis formados por fases de diferentes
porosidades e valores de pH. Além disso, a solução-tampão do gel é distinta
daquela dos eletrodos.
Figura 8 – Sistemas de eletroforese. A- vertical: a) tanque do eletrodo, b) cavidade do
gel, c) gel e d) eletrodo e B- horizontal: a) tanque do eletrodo, b) eletrodo, c) ponte
eletrolíca (Perfex), d) gel e e) ponto no gel de aplicação das amostras.
16
3.3- PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
Preparo das amostras
Efetue a extração de proteínas ou material desejado. Misture uma parte do
extrato (0.5mL) com outra (0.5mL) do tampão da amostra. No caso da análise de
proteínas desnaturadas, use tampão da amostra contendo SDS e β-mercaptoetanol
ou DTT e ferva as amostras por 10 minutos para completar a desnaturação.
Material
1- Estojo para preparo das placas do gel
2- Aparelho para controle elétrico (fonte de energia)
3- Vitrine vertical metalfrio ou geladeira comum
4- Pipetas automáticas com respectivas ponteiras, béqueres e provetas.
Componentes Acrílicos
Acrilamida/Bis (30% T; 2.6% C):
a) 73 g de acrilamida;
b) 2 g de Bis;
c) 250 mL de água deionizada.
Filtre a solução e armazene em geladeira (a 10ºC), no escuro.
Tampão do gel Separador ou de Corrida
Tris-HCl, pH 8.9:
a) 45.75 g de tris base.
b) Adicione aproximadamente 60mL de água deionizada, que deve ser previamente
aquecida para eliminar O2 dissolvido e facilitar a dissolução. Titule com HCl
concentrado para pH 8.9.
c) Complete o volume para 100 mL, filtre a solução e armazene-a em geladeira.
Tampão do gel Empilhador
Tris-HCl 0.6173 M, pH 6.8:
a) 7.475 g de tris base.
b) Adicione aproximadamente 80 mL de água deionizada e titule com HCl para pH
6.8.
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c) Complete o volume para 100 mL, filtre a solução e armazene-a á temperatura
ambiente.
Tampão do Tanque (Eletrodo)
Tris-glicina, pH 8.9:
a) 63.2 g de Tris base.
b) 39.9 g de glicina.
c) Adicione aproximadamente 900 mL de água.
d) Complete o volume para 1.000 mL. O pH da solução fica em torno de 9.2. Não
ajuste o pH. Filtre a solução e armazene-a em geladeira (10ºC). Dilua a solução a
1:10 antes do uso; o pH cairá, aproximadamente, para 8.9.
Solução-Estoque de SDS
a) 10 g de SDS.
b) Complete o volume para 100 mL com água deionizada.
Tampão da amostra
a) Para Proteínas nativas
a) 5 mL de glicerol.
b) 2.5 mL de Tris-HCl 0.6173 M, pH 6.8
c) 2.5 mL de azul-de-bromofenol.
d) Complete o volume para 25 mL e armazene a solução, em alíquotas, em
congelador a –20ºC.
b) Para Proteínas Desnaturadas
a) 5 mL de glicerol.
b) 2.5 mL de Tris-HCl 0.6173 M, pH 6.8.
c) 0.5 mL de β-mercaptoetanol ou 0.39 g de ditiotreitol (DTT).
d) 5 mL de solução de SDS 10%.
e) 2.5 mL de azul-de-bromofenol.
f) Complete o volume para25 mL e armazene a solução, em alíquotas, em
congelador a –20ºC.
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Persulfato de Amônia
a) 0.05 g de persulfato de amônia.
b) 0.5 mL de água desmineralizada.
Obs:. Use sempre solução fresca, preparada imediatamente antes do uso.
3.4- PREPARO DO GEL
Sistema PAGE
O termo PAGE representa eletroforese em gel de poliacrilamida.
É usado para análise do padrão de enzimas e outras proteínas nativas. A
concentração de acrilamida do gel separador depende do peso molecular dos
componentes que se deseja analisar.
Rotineiramente, usam-se géis na faixa de 7.5 a 10%. Para variar a
concentração de acrilamida no gel, para um mesmo volume de solução, basta alterar
o volume da solução estoque de acrilamida-Bis em relação ao da água, as
quantidades dos demais componentes do gel permanecem inalteradas.
Tão logo sejam preparadas as soluções de persulfato e TEMED, deve-se
aplicar a solução nas molduras do gel. A geleificação se processa dentre de poucos
minutos.
Com o auxílio de uma seringa, aplique a solução do gel separador no espaço
entre as placas de vidro até a altura de 1.5 cm abaixo da extremidade inferior do
pente. Imediatamente após, complete com água destilada o espaço entre as duas
placas para uniformização da parte superior do gel e para sua proteção contra
oxigênio, que inibe a polimerização. Após a polimerização em temperatura ambiente,
remova a água sobrenadante por decantação e uso de papel-filtro e introduza a
solução do gel empilhador. A seguir, insira um pente de “teflon” nessa solução. Em
seguida á polimerização, remova o pente e enxágüe as cavidades resultantes com
solução-tampão do tanque, diluída à razão de 1:10. Remova também o excesso de
tampão com o auxílio de papel adsorvente (papel higiênico ou papel-filtro).
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Sistema SDS-PAGE
Este sistema é aplicado no estudo de proteínas desnaturadas por
aquecimento na presença de SDS e β-mercaptoetanol ou ditiotreitol (DTT). Ele visa
à determinação do peso molecular de proteínas. O método empregado é similar a ao
anterior, PAGE, exceto que SDS é adicionado às soluções do gel, e aos tanques dos
eletrodos. A cada 30 mL de solução do gel separador e 15 mL do empilhador, usamse respectivamente, 200 e 100 mL de SDS a 10%.
Aos tanques adicionam-se 10 mL da mesma solução para cada 1.000 mL de
solução-tampão diluída a 1:10. Amostras fervidas contendo SDS e β-mercaptoetanol
ou DTT são aplicadas no gel.
Figura 9 – Preparo do gel de poliacrilamida,
eletroforese e coloração: A) suporte para placas,
espaçadores e pente de “teflon”, B) cuba para
eletroforese, C) montagem das placas, D)
aplicação da solução de acrilamida.
Figura 10 – Cont... E) colocação do
pente de “teflon”, F) remoção do
excesso de solução de acrilamida e
lavagem das cavidades com solução-
tampão do tanque, G) aplicação das
3.5- APLICAÇÃO DAS AMOSTRAS E ELETROFORESE
amostras e eletroforese, H) remoção
do gel, I) coloração e J) conjunto de
Em cada cavidade do gel aplique, cuidadosamente 75 µL do extrato de
bandas de proteínas reveladas no
proteína. A quantidade de amostra a ser aplicada depende da concentração de
gel.
proteína e da atividade enzimática. Complete os volumes das cavidades com
solução-tampão de tanque diluída (1:10) e adicione, respectivamente, nos tanques
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superior e inferior 500 e 1.000 mL dessa mesma solução. Calibre o aparelho para
100 V.
Quando a linha frontal do azul-de-bromofenol atingir o gel separador, regule o
aparelho para 200 V.
3.6- PROBLEMAS NO PREPARO DO GEL E DURANTE A ELETROFORESE
Problema
Gel
Causa Provável
Sugestão
não Má qualidade de acrilamida ou Use reagentes com alto grau de
polimeriza
Bis.
Solução
velha
de pureza e com idoneidade. Usar
acrilamida/Bis ou de persulfato soluções
de amônia.
recém-preparadas.
A
solução de persulfato deve ser
preparada no momento do uso.
Gel
Concentração excessiva de Bis Verifique as concentrações e pesos
esbranquiçado
Gel quebradiço
de acrilamida e Bis.
Concentração excessiva de Bis Verificar a concentração adequada
de Bis.
Rachaduras
gel
no Expansão
acrilamida
e
contração
provocadas
da Reduza a concentração de Bis. Use
pela placas devidamente limpas
produção de calor durante a
polimerização.
Fraca
coloração Receita inadequada
de bandas
ocorrência de erros em receitas.
Não detecção de Polaridade
bandas
Verifique a receita, pois é comum a
concentração
reversa.
de
Baixa Verifique a polaridade. Aumente a
amostra. concentração da amostra. Verifique
Corrida muito rápida ou muito as concentrações das soluçãodemorada.
tampão
e
se
a
corrente
adequada.
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é
3.7- REVELAÇÃO, FOTOARQUIVAMENTO E SECAGEM DE GÉIS
Assim que a linha frontal do azul-de-bromofenol atinja aproximadamente 0.5
cm da extremidade inferior do gel, a eletroforese, por via de regra, será interrompida.
Para moléculas de baixa mobilidade anodal, entretanto, torna-se conveniente
prolongar a corrida mesmo após a saída do azul-de-bromofenol do gel. Após a
eletroforese, os géis são removidos cuidadosamente, das placas e imersos numa
solução de coloração. A revelação de bandas protéicas é, usualmente, feita com
azul-de-coomassie (“Brilliant Blue”)0.1%.
Outros corantes recomendados para proteínas baseiam-se no emprego de
prata coloidal ou na redução de Ag+. Ainda apreciadas técnicas que se valem de
amido “black, fucsida básica e preto B de Sudam”. Para enzimas, os géis são
imersos em soluções apropriadas contendo substrato, coenzimas, etc. necessários à
atividade de cada enzima.
Após a revelação, os géis são fixados em solução aquosa de glicerol 10% e, a
seguir, fotoarquivados ou desidratados.
4.0- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ALFENAS, A. C. Eletroforese de Isoenzimas e Proteínas Afins. Fundamentos e Aplicações em
Plantas e Microorganismos. Editora Viçosa, Viçosa, Universidade Federal de Viçosa, 1998, 574p.
ALFENAS, A. C. et ali. Eletroforese de Proteínas e Isoenzimas de Fungos e Essências
Florestais. Viçosa, Universidade Federal de Viçosa, 1991, 242p.
CONN, E. E. & STUMPPF, P.K. Introdução à Bioquímica. 4ª Edição – São Paulo, Edgard Blucher,
1980, 525p.
LEHNINGER, A. L.; NELSON, D. L.; COX, M. M. Princípios de Bioquímica. 2ª Edição – São Paulo,
Sarvier, 839p., 1995.
SANTOS, C. D. Apostila de Bioquímica Prática Aplicada à Agricultura. Lavras, Universidade
Federal de Lavras, 1997, 89p.
STRYER, L. Bioquímica. 4ª Edição – Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 1000p., 1996.
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