Potência imunogênica de uma vacina preventiva das

Potência
imunogênica de uma
vacina preventiva das
mastites bovinas e sua
ação como adjuvante
no aumento da cura
expontânea das
mastites subclínicas
Realizamos o estudo de potência imunogênica de uma
vacina inativada e hidrolisada para bovinos “MastiplusBR®” contendo 13 antígenos bacterianos (dos principais agentes causadores de Mastites) e glândula mamária, fornecendo
aminoácidos e polipeptídeos extraídos pelo processo de
hidrólise. O estudo foi realizado em camundongos. Foram
aplicadas 4 doses do produto pela via subcutânea na dosagem correspondente à indicada aos bovinos. Foram
quantificados os anticorpos IgG total através de EnzymeLinked Immunoabsorbent (ELISA) nos soros dos animais.
Foi quantificada a resposta imune celular pela técnica de
proliferação de linfócitos por citometria de fluxo(FACScan),
utilizando diferentes estímulos: Meio de cultura RPMI (controle negativo), Concanavalina A (ConA – controle positivo)
e estímulo específico representado pela solução vacinal - lote
Teste. Observou-se que no meio/RPMI controle negativo não
houve proliferação. Nos grupos positivo da ConA e do grupo
Teste, houve proliferação, demonstrando desta forma a
estimulação da resposta imune celular. Demonstramos ainda pelo método de Western Blot a imunogenicidade de cada
uma das 13 cepas bacterianas presentes na vacina.
I.CORRÊA1, C. E. J. FONSECA2, M. G. P. CORRÊA3
INTRODUÇÃO
MATERIAL E MÉTODO
RESULTADOS
DISCUSSÃO
CONCLUSÃO
INTRODUÇÃO
1
Inivaldo Corrêa, Diretor Técnico Laboratório Vitafort Ltda, Ribeirão Preto, SP, BRASIL.
2
Carlos Eduardo Junqueira
Fonseca, Responsável Técnico
Laboratório Vitafort Ltda, Ribeirão Preto, SP, BRASIL.
3
Maria da Graça Portantiolo
Corrêa, Responsável pelo Departamento de Microbiologia do
Lab. Vitafort Ltda, Ribeirão Preto, SP, BRASIL.
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As vacinas são compostas, de maneira
geral, por agentes infecciosos mortos ou
inativados, ou por alguns de seus componentes como as proteínas, polissacarídeos e
lipopolissacarídeos, entre outros. Essas estruturas vacinais são, genericamente, denominadas de antígenos. Além disso, as vacinas podem conter outros componentes, como os
adjuvantes e imunomoduladores, que potenciam o poder imunogênico das vacinas. Para
estimular o sistema imunológico, o antígeno,
assim como os adjuvantes e imunomoduladores, tem que ser obrigatoriamente reconhecidos por receptores localizados na superfície das células apresentadoras de antígenos
(APCs), que são, principalmente, os macrófagos e as células dendríticas. A ligação dos
antígenos, adjuvantes e imunomoduladores
aos receptores das APCs induz um processo
de sinalização química intracelular, que resulta na estimulação de uma cascata de enzimas,
levando a ativação da célula APC a produzir e
secretar potentes mediadores imunológicos
como as citocinas, que têm a propriedade de
modular a ativação da resposta imune humoral
(mediada por linfócitos B e produção de
anticorpos que são as imunoglobulinas) e da
resposta imune celular (mediada pelos
linfócitos T CD4 e T CD8).
Uma resposta imune específica, como a
produção de anticorpos a um determinado
agente infeccioso, é conhecida como resposta imune adaptativa. Os anticorpos são produzidos pelos linfócitos B (ou células B) em
resposta a infecções, e sua presença em um
indivíduo reflete as infecções às quais o mesmo já foi exposto. Os linfócitos são capazes
de desenvolver uma memória imunológica, ou
seja, reconhecer o mesmo estímulo antigênico
caso ele entre novamente em contato com o
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organismo, evitando assim o reestabelecimento da doença
(Sprent, 1994; Ahmed & Sprent, 1999). É o caso de dois grandes grupos de bactérias que estão constantemente em contato com os animais, grupos das bactérias ambientais e grupos
das bactérias contagiosas. Assim, a resposta imune adaptativa
aperfeiçoa-se a cada encontro com um antígeno. Cada linfócito
virgem que penetra na corrente circulatória é portador de receptores de antígeno com uma única especificidade. A especificidade
destes receptores, contudo, é determinada por um mecanismo
de rearranjo gênico especial que atua durante o desenvolvimento linfocitário na medula óssea e no timo, a fim de gerar
centenas de diferentes variantes dos genes codificadores das
moléculas receptoras. Assim, embora um linfócito individual
seja portador de um receptor de especificidade única, a
especificidade de cada linfócito é diferente, e os milhões de
linfócitos do organismo podem apresentar milhões de
especificidades distintas. Os linfócitos sofrem, então, um processo parecido com a seleção natural durante a vida do indivíduo (Lederberg, 1988; Klein, 1995): somente aqueles que encontram um antígeno com o qual seu receptor pode interagir
serão ativados para proliferar e se diferenciar em células efetoras.
Foram usados os seguintes equipamentos: Espectrofotômetro µQuant – Bio-tek, Lavadora de placas – Bio-tek, Sistema de Elletroforese MiniProtean3 BioRad, Sistema de fotodocumentação MiniBis (DNR) - Bio-tek, Citômetro de Fluxo
FACScan, Centrífugas, Balanças analíticas, Câmaras de segurança biológica Tecnal.
- Animais
Foram utilizados 12 camundongos não isogênicos da
linhagem Swiss de 6 a 8 semanas de idade e peso médio de 26
g no início do experimento, obtidos do Biotério Geral do
Campus da USP em Ribeirão Preto/SP. Os animais selecionados foram alocados randomicamente em 2 grupos de 6 animais
e acondicionados em caixas individualizadas com micro isoladores com livre acesso a água e ração. Um grupo recebeu a
vacina e o outro grupo recebeu solução salina como controle
do experimento.
Produto utilizado:
O produto utilizado foi o Mastiplus BR® part. 001/12
data fabricação 25/01/2012, com sua composição conforme
Tabela 1 abaixo:
MATERIAL E MÉTODO
Os estudos de potência imunogênica da vacina MastiplusBR® foram executados na Unidade de Ensaios Pré-Clínicos da
Empresa Farmacore Biotecnologia Ltda., no período de 8 de
março 2012 a 26 de abril de 2012. A Farmacore conta com
infraestrutura e capacitação tecnológicas adequadas, para a
condução de ensaios de citotoxicidade in vitro, para avaliar
inocuidade e toxicologia em animais de pequeno e médio porte
(roedores) e para a realização de estudos de imunogenicidade e
de eficácia terapêutica de vacinas. Os estudos foram realizados
dentro das normas regulatórias ABNT NBR ISO IEC 17025:2005,
ABNT ISO 9001:2000, MAPA e INMETRO-BPL. Nesta área foi
garantida uma rotina de trabalho setorizada contendo área comum de laboratório para desenvolvimento analítico equipada
com sistema HPLC, sala de cultura de células com fluxo laminar,
freezer e incubadora de CO2 e ambiente separado para experimentação animal com fluxo laminar exclusivo para pequenas
intervenções cirúrgicas, além de racks de animais com micro
isoladores. A empresa conta também com área de segurança
biológica nível P3 (Biosafety level 3) classificada e validada
pela CTNBio para trabalhos com organismos patogênicos e
geneticamente modificados (OGMs). O corpo técnico da Empresa é composto por: Prof. Dr. Celio Lopes Silva – Farmacêutico; Rosiane Peripato – Farmacêutica; Fabiana Testa Moura de
Carvalho Vicentini - Doutora em Ciências Farmacêuticas. Pesquisador Principal: Prof. Dr. Celio Lopes Silva – Farmacêutico (CRFSP 7045) e Professor Titular de Imunologia da FMRP-USP.
Materiais e equipamentos
Rack micro-isolada específica para camundongos, com
suprimento de ar filtrado dentro da caixa (individualizado),
sala com temperatura controlada (25±2ºC) e luz 12 horas/dia.
As caixas dos animais possuem filtro para remoção de cheiro
e são totalmente separadas uma das outras, não havendo possibilidades de interferência de resultados.
Informações Técnicas sobre Hidrolisados:
Na fabricação da Mastiplus-BR®, a glândula mamária e
as bactérias (após inativadas) contidas em sua formulação
passam pela hidrolise ácida enzimática, que após processo de
purificação, fornecem aminoácidos e peptídeos de baixo peso
molecular. Os lisados de órgãos têm como característica principal a restauração e reativação das funções biológicas pelo
uso de hidrolisados de tecidos e órgãos animais (Kazakov,
1942). A qualidade e as características finais do hidrolisado
proteico dependem de vários fatores que devem ser controlados para se alcançar os resultados desejados, entre eles encontram-se a natureza e associação de enzimas, pH, temperatura, tempo de hidrólise, tipo e concentração de substrato,
relação enzima/substrato, inativação enzimática ao final do
processo (Adler Nissen, 1981; Chobert et al.,1988a,b; Silvestre et al., 1994a,b; Cândido, 1998).
A relação enzima substrato (E:S) exerce influência na
velocidade da reação e no tamanho dos peptídeos produzidos
no final do processo de hidrólise (Gauthier et al., 1986). Diversos autores têm demonstrado que fórmulas contendo um ele-
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vado teor de oligopeptídeos, especialmente, di- e tripeptídeos,
são utilizadas mais efetivamente pelo organismo do que uma
mistura equivalente de aminoácidos livres ou a proteína intacta,
apresentando assim um maior valor nutritivo (Keohane et al.,
1985; Grimble et al., 1986; Rérat, 1993; Boza et al., 2000).
Vários autores têm demonstrado que hidrolisados com
peptídeos de baixo peso molecular, podem ativar a proliferação de linfócitos e macrófagos com atividade imunomoduladora
na produção de citocinas (XiangZhen Kong et al., 2008). Entretanto, sob a forma de di- e tripeptídeos, estes aminoácidos
apresentam boa solubilidade e estabilidade, o que mostra a
importância do isolamento destes peptídeos de hidrolisados
proteicos (Furst et al., 1990; Anantharamam & Finot, 1993).
Segundo Moosman and Behl (2002), os hidrolisados com
maior valor de grau de hidrólise apresentam uma maior quantidade de peptídeos de baixo peso molecular, e consequentemente um maior potencial de inibição da oxidação em relação aos hidrolisados com baixo grau de hidrólise. Tem se demonstrado também que os peptídeos bioativos são cadeias
sequenciais de aminoácidos de pequeno tamanho, contendo
entre dois e quinze resíduos, inativos dentro da proteína, mas
que podem ser liberados, e exercer efeitos benéficos para o
organismo (Vioque et al., 2006).
Informações Técnicas sobre Mastiplus-BR®:
- Entre os meios não antibióticos para o controle e tratamento da mastite bovina não podem isolar-se os fatores de
produção de defesas específica, isto é o Sistema Imunológico
da vaca leiteira, tanto no que se refere à resposta imunológica
sistêmica, como a resposta local da própria glândula mamária.
- Mastiplus-BR®, como Vacina Mista, inclui os agentes
considerados como causadores de mais de 80% de todas as
mastites bovinas, (Grupo dos agentes contagiosos e o grupos dos agentes da contaminação ambiental) especialmente
aqueles que são os responsáveis pela maioria das perdas:
Streptococcus agalactiae e Staphylococcus aureus. Com o
aumento da leucocitose e das imunoglobulinas séricas os
mesmos são carreados ao local do foco infeccioso (úbere),
promovendo um aumento da reação inflamatória proporcionando a elevação da cura espontânea das mastites subclínicas.
- Não deve ser utilizados simultaneamente com Mastiplus
BR® produtos a base de corticóides, por sua ação imunodepressora.
- Mastiplus-BR® é um produto que promove a leucocitose e o aumento da taxa de imunoglobulinas. Nas mastites
subclínicas, pela presença do foco infeccioso, existe um quimiotactismo positivo carreando as células de defesas e anticorpos
até a glândula mamária, podendo promover um edema, ou seja,
uma reação inflamatória normal. Devido a esta reação, nos tratamentos das mastites subclínicas poderão ocorrer sintomas de
mastite clínica, num percentual médio de 5% das vacas.
- O teste de rotina para identificação da mastite subclínica
(CMT, WMT, CCS, Condutividade elétrica, etc.), deverá ser
negativo somente após transcorridos de 15 a 20 dias da última
aplicação do tratamento realizado com Mastiplus-BR®.
- Com o uso de Mastiplus-BR® na prevenção de vacas
sadias, não ocorre nenhuma reação no úbere nem tão pouco
variação na Contagem de Células Somáticas (CCS) do leite.
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- Para realizar o tratamento preventivo das vacas em
lactação, deve-se certificar que o animal esteja sadio através
dos testes de rotina, citados acima, caso estejam com mastite
subclínica utilizar o esquema de dosagens como coadjuvante
ao tratamento.
- MASTIPLUS-BR® é Licenciado no Ministério da Agricultura sob nº 7.215 em 14/02/2000.
Período Pré-teste.
Os animais foram aclimatados em micro-isoladores por
pelo menos uma semana até o inicio do experimento, os quais
permaneceram até o término. Durante essa fase, e a de experimento propriamente dito, as condições de alimentação, luz e
temperatura ficaram estáveis e os mesmos foram manipulados
de acordo com as instruções da Sociedade Brasileira de Ciência em Animais de Laboratório. Neste período, os animais foram observados quanto ao estado de saúde e comportamental
e não foram observadas alterações significativas que justificassem a exclusão de qualquer um deles do Estudo.
Antes da aplicação do produto teste, em todos os animais
foi realizado uma coleta de sangue para extração de soro e posterior análise de produção de anticorpos (dados pré-vacinais).
Aplicação do Produto Teste
O produto teste foi administrado por via subcutânea
conforme recomendação e dosagem de bula. Para o procedimento, realizou-se antissepsia da pele no local de aplicação
com algodão embebido em álcool iodado e o produto foi aplicado com auxílio de seringas e agulhas descartáveis.
Os animais do Grupo Teste receberam o produto
Mastiplus BR® part. 001/12 no volume de 0,1 mL por via subcutânea (3,75 µL da vacina e completados para 0,1 mL com
solução fisiológica estéril), em duas séries, nos dias 0 (zero) e
02 (correspondentes à primeira série) e 09 e 11 (correspondentes à segunda série), totalizando 4 aplicações por animal.
Os animais do Grupo Controle receberam solução fisiológica estéril, no volume de 0,1 mL por via subcutânea, em duas
séries, nos dias 0 (zero) e 02 (correspondentes à primeira série)
e 09 e 11 (correspondentes à segunda série), totalizando 4 aplicações por animal. Os animais do grupo controle não foram
tratados com o produto teste, sendo mantidos nas mesmas condições de manejo e ambiente que os animais tratados, durante o
estudo.
Avaliações laboratoriais
As avaliações laboratoriais do estudo foram realizadas
no Laboratório de Experimentação Animal da Farmacore. Todos os animais do grupo teste e do grupo controle quinze dias
após a administração da última dose foram sangrados e
coletados os soros, individualmente, para avaliação da imunidade humoral. Nesse mesmo dia, após o sacrifício dos animais, os baços de cada um deles foram retirados para obtenção de células (esplenócitos totais) para avaliação da imunidade celular.
Foram feitas dosagens de proteínas do lote do produto
vacinal para servir como parâmetro quantitativo nas dosagens usadas na realização dos testes imunológicos. As amostras do produto teste da vacina Mastiplus-BR® foram submeA Hora Veterinária – Ano 33, nº 195, setembro/outubro/2013
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tidas ao protocolo de dosagem de proteínas pelo método de
Bradford (Manual de ensaio de Proteína Bradford, da
BioAgency).
Para os estudos de imunidade celular e cultura de células foi determinada previamente a citotoxicidade do lote vacinal
sobre cultura de células do baço provenientes de um animal
controle não imunizado.
Avaliação da Imunidade Humoral
Nas amostras de soro de cada um dos animais de todos
os grupos foram feitas:
i) dosagens de anticorpos IgG total por ELISA (EnzymeLinked Immunoabsorbent Assay);
ii) avaliação de resposta de anticorpos por Western Blot;
iii) avaliação da resposta imune humoral induzida por
cada uma das cepas bacterianas presentes na vacina MastiplusBR por Western Blot.
Dosagens de anticorpos IgG total por ELISA
A padronização do ensaio de ELISA foi realizada a partir
da dosagem das proteínas do lote teste da vacina MastiplusBR®. A cobertura das placas de ELISA (coating) foram feitas
com diferentes concentrações de proteínas (5; 10; 20 e 60 µg/
mL) e incubadas por uma noite a 4ºC. Posteriormente, procedeu-se a lavagem das placas e bloqueio das ligações inespecíficas. Em seguida foram adicionadas as diferentes diluições
do soro dos animais vacinados (1:10; 1:100; 1:500 e 1:1000) e o
ensaio realizado até a revelação total de acordo com o procedimento preconizado na empresa Farmacore. A leitura das placas foi feita a 450 mm em espectrofotômetro µQuant e os dados analisados no programa computadorizado Gen5 (Bio-tek).
Como controle positivo do ensaio foi utilizado ovalbumina e
um soro anti-ovalbumina previamente padronizado. Os dados
obtidos estão descontados do controle negativo (branco).
Depois de padronizado o ensaio, as dosagens foram
feitas usando-se de uma concentração de proteína de 10 µg/
mL do lote do produto para a realização do coating das placas
de ELISA e diluição 1:10 dos soros de cada um dos animais
vacinados.
Para a realização do ensaio, as seguintes soluções foram
utilizadas:
a) Solução de bloqueio (PBS1X, 10% soro bovino fetal,
0,05% Tween20);
b) Solução de carbonato/bicarbonato (solução de carbonato/bicarbonato v/v);
c) Solução de estreptoavidina-biotina (Vecstain – Vector
Laboratories);
d) Solução de revelação TMB (BD Opteia – lote 59475 );
e) Solução de interrupção de reação de revelação (ácido
sulfúrico 16%);
f) Solução bloqueio com anti-IgG total (Sigma – lote
074K6130).
Análise da produção de anticorpos por Western Blot
Amostras do lote da vacina foram aplicadas em gel de
poliacrilamida 15%, para análise do perfil eletroforético dos
antígenos vacinais após coloração por coomassie blue e/ou
prata. O ensaio foi realizado de acordo com os protocolos
preconizados na empresa Farmacore. Em seguida foi feito
Western Blot para: 1) avaliar a presença de anticorpos contra
antígenos específicos do lote vacinal; 2) avaliar a resposta
imune humoral induzida por cada uma das cepas bacterianas
presentes na vacina.
Ao término do processo de eletroforese os géis foram
fotografados em analisador de imagem Mini-bis (DNR) através de câmera digital.
Avaliação da imunidade celular
– Avaliação da ativação de linfócitos T - teste de
proliferação celular
O estudo para se avaliar a resposta imunológica celular
provocada pelo produto em todos os animais do grupo teste e
no grupo controle foi realizado pela determinação da proliferação de linfócitos do baço dos animais imunizados com o lote
vacinal, e dos animais controle, na presença de meio de cultura RPMI-C (controle negativo), ConA (potente mitógeno de
linfócitos – controle positivo) e dos antígenos específicos do
lote teste. Analisado através de citometria de fluxo (FACScan).
RESULTADOS
Quantificação de proteínas
A quantificação das proteínas pelo método de Bradford
revelou no lote teste da vacina Mastiplus-BR® a concentração 165 µg/mL. (Manual de ensaio de proteína Bradford, da
BioAgency).
Imunidade humoral
Quantificação de anticorpos IgG total no soro dos
animais vacinados
A detecção dos anticorpos IgG total foi realizada seguindo o protocolo para ensaio de ELISA de anticorpos descrito no procedimento da Empresa Farmacore. Os soros dos
animais foram coletados no tempo zero (antes da 1ª dose
vacinal) e 15 dias após a última imunização e denominados pré
e pós-imunização, respectivamente.
Os resultados sobre a produção de anticorpos IgG total
em cada animal do grupo experimental e do grupo controle são
mostrados na Tabela 2 e na Figura 1.
Figura 1 mostra os
níveis de
anticorpos
IgG
específicos
para lote
teste
MastiplusBR® e
Controle
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Análise sobre a produção de anticorpos por Western Blot
A resposta imunológica humoral provocada pela Vacina
Mastiplus-BR®, no lote teste partida 001/12, foi avaliada através da análise da produção de anticorpos no soro dos animais
vacinados pelo método de Western Blot. (Método descrito
por, Bloom et. al., 1987) na Figura 2 A em gel de poliacrilamida
15% após eletroforese. A Figura 2 B mostra o mesmo gel de
eletroforese da Figura 2 A colocado na presença de anticorpos
presentes no soro de animais vacinados com o lote teste partida 001. A Figura 2 B mostra o mesmo padrão e similaridade
de reconhecimento de antígenos por anticorpos de animais
vacinados com o lote teste da vacina.
Figura 4. Resposta imune humoral induzida por antígenos presentes
em cada uma das cepas bacterianas, avaliada por Western Blot.
Figura 2 - (A) Perfil eletroforético dos antígenos vacinais do lote
001, após coloração por prata. (B) Avaliação da presença de
anticorpos contra antígenos específicos do lote vacinal.
Análise por Western Blot da resposta imune humoral
induzida por cada uma das cepas bacterianas presentes na Vacina Mastiplus-BR®.
A resposta imunológica humoral induzida por cada uma
das cepas bacterianas presentes no produto Vacina MastiplusBR®, foi avaliada através da análise da produção de anticorpos
contra cada uma das cepas pelo método de Western Blot.
(Método descrito por Bloom et. al., 1987). A Figura 3 mostra o
perfil antigênico (proteico) de cada uma das cepas bacterianas
e a Figura 4 mostra a reatividade de anticorpos presentes no
soro dos animais vacinados contra antígenos presentes em
cada uma das cepas bacterianas. Os resultados mostram que
as 13 cepas bacterianas presentes na vacina Mastiplus-BR®
são imunogênicas.
Figura 3. Perfil eletroforético dos antígenos das cepas
bacterianas após coloração por prata.
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Resposta imune celular
A resposta imune celular foi avaliada pelo teste de proliferação de linfócitos com CFSE por citometria de fluxo (FACScan).
(Trabalhos científicos publicados por Silva C.L. et al.)
Na Figura 5 A-C é mostrado um resultado demonstrativo da resposta de proliferação de linfócitos por citometria de
fluxo de um animal pertencente ao Grupo TESTE (Lote 001/12
da vacina Mastiplus BR®) frente aos diferentes estímulos testados. Cerca de 25 mil células foram lidas na região P3
(linfócitos). A região P4 representa a porcentagem de linfócitos
que proliferaram na presença dos estímulos utilizados: Meio
de cultura RPMI (controle negativo), Concanavalina A (ConA
– controle positivo) e estímulo específico representado pela
solução vacinal.
DISCUSSÃO
Siddique & Shah (1990) discutem que as vacinas não
induzem uma mesma resposta sorológica contra todos os
sorovariedades nelas contidas, podendo isso ocorrer devido
a uma diferença na concentração antigênica final, ou pela supressão da resposta antigênica causada por uma sorovariedade
sobre outra. No presente trabalho foi observada uma ação
imunogênica de todos os agentes bacterianos da formulação
(Figura 2B). O poder imunogênico segundo a amostra utilizada também deve ser levado em consideração, devido ao fato
de que existem diferenças entre elas (Bolin et al. 1989, Bolin et
al. 1991, Tabata, 2002). Confirmando esta afirmação foi
verificada a resposta imunológica humoral induzida por cada
uma das cepas bacterianas presentes no produto Vacina
Mastiplus-BR®, onde a Figura 3 mostra o perfil antigênico de
cada uma das cepas bacterianas e a Figura 4 mostra a
reatividade de anticorpos presentes no soro dos animais vacinados contra antígenos presentes em cada uma das cepas
bacterianas.
O sistema imunológico em sua capacidade de reconhecer antígenos é completo. As moléculas de anticorpos e os
receptores de linfócitos T podem, em essência, reconhecer
qualquer molécula própria ou não própria, até mesmo aquelas
artificialmente sintetizadas. A ideia por trás da
multiespecificidade é a de que um anticorpo específico é caA Hora Veterinária – Ano 33, nº 195, setembro/outubro/2013
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paz de reconhecer antígenos com formas relativamente distintas, desde que
uma quantidade mínima de
interações complementares
ocorra entre um epítopo
deste antígeno e a regiãoV da molécula de anticorpo
(Inman, 1978; Perelson &
Weisbuch, 1997).
Bey & Johnson 1986,
afirmam que vários fatores
podem influenciar a eficácia das vacinas como, os
esquemas de vacinação
empregados, a qualidade e
a quantidade de microrganismos imunizantes, grau
de semelhança antigênica
entre os antígenos que
compõem a bacterina. Procurando atender todos estes fatores é preparado à
vacina mista (bacterina)
Mastiplus-BR® com volume diferenciado de cada
cepa de acordo com sua
imunogenicidade, com esquema de vacinação condizente com a estimulação
adequada do sistema imunológico, sendo a aplicação de duas doses em dias
alternados, espaçando uma
semana para a aplicação de
mais duas doses em dias
alternados, confirmando
por Ada & Nossal, (1987)
onde afirmaram que durante a evolução do sistema
imunológico, um organismo encontra um dado
antígeno repetidas vezes.
Uma resposta imune adaptativa à exposição inicial de
um dado antígeno é composta por um conjunto pequeno de clones de células B, cada um produzindo
anticorpos de diferentes
especificidades (afinidades). A eficiência da resposta adaptativa a encontros secundários poderia
ser consideravelmente aumentada através do armazenamento de células produtoras de anticorpos com
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Figura 6 Resposta de
proliferação
de linfócitos
nas células
do baço dos
animais dos
grupos
experimentais
e controle
frente aos
diferentes
estímulos.
alta afinidade àquele antígeno, denominadas de células de memória, de forma que se tenha um grande clone inicial nos encontros subsequentes. Reforçado por (Perelson et al., 1978,
Farmer et al., 1986) que ao invés de “partir do começo” toda vez
que um dado estímulo antigênico é apresentado, essa estratégia garante que a velocidade e eficácia da resposta imunológica
se aperfeiçoe após cada infecção ou vacinação. Este esquema é
característico de uma estratégia de aprendizagem por reforço
(Sutton & Barto, 1998), onde o sistema está continuamente melhorando a capacidade de executar sua tarefa.
O hidrolisado de Glândula mamária e de bactérias fornece à Vacina Mastiplus-BR® um pool de aminoácidos e
peptídeos de baixo peso molecular disponibilizando ao organismo do animal em momento de maiores necessidades, quando da multiplicação celular pela ativação do sistema
imunológico, conforme afirmação por (Chuang et all, 1990). Os
aminoácidos essenciais que não podem ser sintetizados pelo
organismo, têm de ser consumidos como nutrientes, e pode
limitar a síntese de proteínas. O consumo de aminoácidos essenciais é maior em células em crescimento rápido, uma vez
que a replicação de DNA e divisão celular requer síntese contínua de proteínas. Os linfócitos são especialmente sensíveis
a privação de aminoácidos, uma vez que a sua função depende de proliferação rápida. Portanto, o que limita a disponibilidade de aminoácidos essenciais podem interferir com a função do sistema imunitário, (Calder PC 2006). Assim, diminuindo a disponibilidade local de alguns ou todos os aminoácidos
essenciais em um tecido pode permitir-lhe adquirir privilégio
imunitário, e este mecanismo é utilizado por um certo número
de tecidos imunologicamente privilegiados.
Vacinas de células inteiras são difíceis de serem avaliadas quantitativamente para a potência imunogênica. Embora
o número de células presentes possa ser conhecido, a relação
entre o número de células e a massa celular nem sempre é
constante (Bey et al. 1974).
O desenvolvimento de vacinas contendo os antígenos
semi-purificados poderá beneficiar, principalmente, as indústrias nacionais no sentido da transferência de tecnologia a ser
implantada e da facilidade de ser a mesma absorvida, evitan24
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do-se a importação de vacinas sofisticadas ou a necessidade
de aquisição de equipamentos específicos ou demasiadamente dispendiosos (Garcia, M, 1992). A vacina poderá facilmente
ser padronizada através de provas de microhemaglutinação
manose-resistente, levando a partidas homogêneas bem como
conteúdo extremamente baixo ou quase nulo de toxina, evitando-se as reações adversas que podem ocorrer com
bacterinas. (Garcia, M, 1992). Pelos testes de inocuidade e
toxicidade realizados com a Vacina (bacterina) Mastiplus-Br®
mostrou-se um nível de purificação muito seguro, onde com
dose três vezes maior que a indicada aplicada em animais prenhe não provocou abortos.
A proteção que o organismo tem aos tecidos ou células
contra as respostas imune exacerbadas, denomina-se Privilegio Imunitário, (Naoki Ichiryu, et al., 2013). Foi descrito pela
primeira vez como um factor importante em termos de privilégio imunitário, a enzima intracelular, Indoleamina 2,3dioxigenase (IDO) durante a gravidez, devido a inibição da
sua atividade enzimática conduz a uma falha na implantação
de alogénicos, mas não isogénica, em embriões no rato. (Munn
DH, et al., 1998). Apresentação de antigénio no contexto do
triptofano privação não só desativa as funções efetoras de
linfócitos mas também polariza as células T CD4 + para um
fenótipo Treg. Mais recentemente, a arginina por catabolismo
NOD e arginase 1 e 2 enzimas também tem sido implicado no
estabelecimento de privilégio imune, (Bronte V, Zanovello P,
2005). Além disso, parece que este efeito não se restringe ao
triptofano e arginina, mas é mais amplamente usados para
muitos dos aminoácidos essenciais que modulam respostas
de linfócitos T via mTOR quando esgotados, (Cobbold SP,
Adams E, Farquhar CA et al., 2009). Aminoácidos, os blocos
de construção das proteínas em um organismo, circulam distribuído entre os tecidos. Os aminoácidos essenciais que não
podem ser sintetizados pelo organismo, têm de ser consumidos como nutrientes, e pode limitar a síntese de proteínas. O
consumo de aminoácidos essenciais é maior em células em
crescimento rápido, uma vez que a replicação de DNA e divisão celular requer síntese contínua de proteínas. Os linfócitos
são especialmente sensíveis a privação de aminoácidos, uma
vez que a sua função depende de proliferação rápida.. Portanto, o que limita a disponibilidade de aminoácidos essenciais
podem interferir com a função do sistema imunitário, (Calder
PC 2006). Assim, diminuindo a disponibilidade local de alguns
ou todos os aminoácidos essenciais em um tecido pode permitir-lhe adquirir privilégio imunitário, e este mecanismo é utilizado por um certo número de tecidos imunologicamente privilegiados.
CONCLUSÃO
Com base nos dados de imunogenicidade apresentados
neste trabalho da Partida 001/12 da Vacina Mastiplus-Br®
constatou-se que:
1) A Vacina induziu produção de anticorpos IgG específicos para os antígenos vacinais;
2) A vacina induziu imunidade celular específica aos
antígenos vacinais avaliada pela mensuração da ativação de
linfócitos T.
A Hora Veterinária – Ano 33, nº 195, setembro/outubro/2013
24
19/08/2013, 08:30
3) Ficou demonstrado que os antígenos presentes nas
13 cepas bacterianas da vacina Mastiplus-BR® são
imunogênicos.
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