Palestra - CBCPD 2016

Avaliação de estrutura genética e de
misturas de genomas em plantas daninhas
reveladas com o uso de marcadores
moleculares
Dra. Claudete Aparecida Mangolin
[email protected]
Laboratório de Genética e Biotecnologia Vegetal
Departamento de Biotecnologia, Genética e Biologia Celular
Universidade Estadual de Maringá
Expectativa:
Conferindo competência
para uma ampla dispersão.
Resistência a pressões de seleção,
como pela ação de herbicidas
aplicados para o seu controle.
Formam um grupo de plantas com
alta diversidade genética.
Plantas Daninhas
Pressões de seleção (ação de herbicidas aplicados) para o controle
Leva a uma redução da variabilidade genética
Qual a importância prática do conhecimento da
diversidade genética de populações de daninhas?
Premissa: Diversidade genética alta confere competência
para ampla dispersão.
- Podendo requerer diversidade para o método de controle;
presença de diferentes genótipos podem escapar da pressão
de seleção.
Qual a importância prática de conhecer a forma
como as populações de daninhas estão
geneticamente estruturadas?
Premissa: Populações geneticamente estruturadas refletem
grupos geneticamente divergentes
1- Podem requerer formas de controle divergentes.
2- Para populações com divergência genética baixa podem
ser aplicadas formas similares de controle.
Espécies analisadas:
1- Euphorbia heterophilla (“wild poinsettia” = amendoim bravo;
leiteiro)
12 populações
1 do Mato Grosso (MT)
e 11 do Paraná (PR)
Populações de Euphorbia heterophylla coletadas de diferentes plantas
em 12 localidades de nove cidades em dois estados do Brasil (Mato
Grosso - MT e Paraná - PR)
Grupo 1
Grupo 2
Dendrograma e a relação entre as plantas das 12 populações
de Euphorbia heterophylla, baseado nas medidas de distância
genética e obtido pelo método de UPGMA e análise de
agrupamento realizada para o polimorfismo dos alelos dos loci
Est-1, Est-3, Est-4, Est-5, Est-6 e Est-7 utilizando
do
coeficiente de Jaccard.
Número de loci polimórficos (N(pl)), proporção de loci
polimórficos (%P), proporção de alelos por locus (A),
proporção de alelos para os loci polimórficos Est-1, Est-3,
Est-4, Est-5, Est-6, and Est-7 (AP), heterozigosidade
média observada (Ho) e esperada (He) em plantas de
Euphorbia heterophylla descendentes das 12 populações.
Coeficientes de fixação F (F(IS), F(IT), F(ST); Wright, 1965) e o
valor do fluxo gênico (Nm), para plantas descendentes de 12
populações de Euphorbia heterophylla.
1- Diversidade genética alta (He = 0,3887).
2- Divergência genética alta (Fst = 0,1663) – formando dois
grandes grupos divergentes no dendrograma.
3- Fluxo gênico alto (Nm ˃ 1.0) - dispersão de sementes.
4- Déficit de heterozigotos de 12,40% - pressão de
seleção.
Euphorbia heterophylla com marcadores ISSR (Inter Simple
Sequences Repeats – 10 populações.
Localização
dos 10 pontos
de coleta de
sementes de
Euphorbia
heterophylla oito no Estado
do Paraná, um
no Rio Grande
do Sul e um
em São Paulo.
132
Primers para ISSR, sequências de nucleotídeos dos primers,
número de segmentos amplificados por primer nas 132 amostras
de E. heterophylla com suas respectivas temperaturas de
anelamento
9 ISSR
Número de alelos observados (Na), Número efetivo de alelos
(Ne), Índice de Shannon (I), Diversidade genética de Nei
(1973) (He), número de locos polimórficos e porcentagem de
locos polimórficos para cada amostra de Euphorbia
heterophylla estudada.
Ht = 0,3611
GsT = 0,3607
Nm = 0,8864 (moderada)
Análise da estrutura Bayesiana (K = 6; ΔK = 31,7853).
Bar Plot das 132 amostras de Euphorbia heterophylla
agrupadas em 6 grupos.
Grupo1
Grupo2
Grupo3
Grupo4
Grupo5
Grupo6
Mistura de
genomas
ancestrais
Mistura de
genomas
ancestrais
Predomínio de grupos ancestrais para amostras de cada
localidade em decorrência de prováveis “efeitos
fundadores” de cada um dos genomas ancestrais.
Dendrograma da distância genética entre as amostras de plantas
de Euphorbia heterophylla coletadas em 10 localidades
construído utilizando o método UPGMA. 4 grupos divergentes,
com Pato Branco I e Pato Branco III formando 2 grupos isolados.
Esterases e ISSR confirmaram a premissa de diversidade
genética alta, divergência genética alta com populações
geneticamente estruturadas em E. heterophyla.
2- Conyza canadensis x Conyza bonariensis
Sementes das duas espécies foram coletadas de várias
plantas, em diferentes campos de soja, na área rural de
Engenheiro Coelho – SP (Brasil).
Sementes de cada espécie de Conyza foram casualmente
distribuidas para germinação em vasos separados de 500-ml
contendo solo estéril.
As plantas obtidas foram usadas para os experimentos.
- Isoenzimas Esterase (EST;
EC 3.1.1._)
Isoenzimas Malato
desidrogenase (MDH;
EC 1.1.1.37)
Isoenzimas Fosfatase ácida (ACP;
EC 3.1.3.2)
Número de alelos (Na) e número efetivo de alelos (Ne) por locos
polimórficos, heterozigosidade média observada (Ho) e
heterozigosidade esperada (He), em amostras de C. bonariensis
e C. canadensis.
Evidências:
Diversidade genética alta em ambas espécies:
Conyza bonariensis He = 0,5461
Conyza canadensis He = 0,5386
Divergência genética baixa (Fst = 0,0199) indicando mistura de
amostras, confirmada pelo valor muito alto do fluxo gênico (Nm =
12,32); Nm = Fst = 0.25(1 - Fst)/Fst.
Dispersão de sementes na mesma área rural e mistura de plantas
das duas espécies nos campos.
Marcadores microssatélites - análise de polimorfismo em
locos SSR
Divergência genética alta entre C. canadensis e C. bonariensis
pode ser observada em amostras para as duas espécies
coletadas no continente Norte americano – Califórnia, onde
estas plantas têm morfologias diferentes e bem definidas.
C. canadensis - (Dinuba, CA)
C. bonariensis - (Parlier, CA)
Amostras de Conyza sumatrensis (SF) obtidas de vários locais
(Campo Mourão, Floresta, Cascavel, Cafelândia, Peabiru e
Toledo) no Estado do Paraná, Brasil e amostras de Conyza
canadensis (HW) e Conyza bonariensis (BH) obtidas de Dinuba,
Fresno, e Parlier no Vale Central – Califórnia, USA.
Amostras de Conyza sumatrensis (SF) obtidas de vários locais
(Campo Mourão, Floresta, Cascavel, Cafelândia, Peabiru e
Toledo) no Estado do Paraná, Brasil e amostras de Conyza
canadensis (HW) e Conyza bonariensis (BH) obtidas de Dinuba,
Fresno, e Parlier no Vale Central – Califórnia, USA.
Doze pares de primers de SSR (Simple Sequence Repeat)
usados para análises de plantas de Conyza sumatrensis, C.
canadensis e C. bonariensis, e o número de alelos para cada
loco.
C. canadensis x C. bonariensis x C. sumatrensis
Número de alelos (Na) e número de alelos efetivos (Ne) por
loco SSR polimórfico, heterozigosidade média observada (Ho)
e heterozigosidade média esperada (He), e a porcentagem de
locos polimórficos (%P), nas amostras das três espécies de
Conyza (C. canadensis, C. bonariensis e C. sumatrensis).
Análise da estrutura Bayesiana
Bar plot de amostras de Conyza canadensis (1) obtidas de Fresno (HWS
156) e Dinuba (HWR), C. bonariensis (2) obtidas de Parlier e C.
sumatrensis obtidas de Campo Mourão (3), Floresta (4), Cascavel (5),
Cafelândia (6), Peabiru (7) e Toledo (8)
Cada barra vertical representa uma planta com a proporção de cada um
dos genomas ancestrais em seus segmentos coloridos.
Cada cor
representa um
grupo
genômico
ancestral.
Proporção de amostras de Conyza canadensis, C. bonariensis e C.
sumatrensis em cada grupo (K = 3) e o número de plantas por
amostras.
Número de alelos (Na) e número de alelos efetivos (Ne) por loco
SSR polimórfico, heterozigosidade média observada (Ho) e
heterozigosidade média esperada (He), porcentagem de locos
polimórficos (%P) nas amostras de Conyza sumatrensis de seis
diferentes locais do Paraná, sul do Brasil.
Aliada com a diversidade de morfologias e
diversidade molecular - suspeita de ocorrência de
mais de uma espécie e de mistura de genomas.
a) Conyza spp em área urbana – Zona 07 – Maringá-PR. b) Infestação em área de Citrus
– Município de Castelo Branco-PR. c) Conyza spp em plantação de soja. – Município de
Floresta-PR. d) e e) Conyza spp no campus da Universidades Estadual de Maringá. f)
Área rural no município de Mandaguari-PR totalmente infestada por buva.
Proposta de ampliar as investigações e analisar exemplares de buva
agora denominados Conyza spp. de diferentes origens, e de estados
diferentes.
50 localidades - Dos estados de Rio Grande do Sul, Santa Catarina,
Paraná, São Paulo e Mato Grosso do Sul - Total de 500 plantas
1 - São José do Ouro (RS)
2 - Saldanha Marinho (RS)
3 - Lagoa Vermelha (RS)
4 - Santo Ângelo (RS)
5 - Campos Novos1 (SC)
6 - Campos Novos2 (SC)
7 - Abelardo Luz (SC)
8 - Curitibanos1 (SC)
9 - Curitibanos2 (SC)
10 - Quilombo (SC)
11 - Luiziana (PR)
12 - Janiópolis (PR)
13 Goioerê (PR)
14 Mariluz (PR)
15 Rancho Alegre D’Oeste (PR)
16 - São João do Ivaí (PR)
17 - Quinta do Sol (PR)
18 - Alto Piquiri (PR)
19 - Toledo (PR)
20 - Marechal Cândido Rondon (PR)
21 - Guaíra1 (PR)
22 - Guaíra2 (PR)
23 - Palotina1 (PR)
24 - Palotina2 (PR)
25 - Brasilândia do Sul (PR)
26 - Francisco Alves (PR)
27 - Maringá (PR)
28 - Céu Azul (PR)
29 - Ouro Verde do Oeste1 (PR)
30 - Ouro Verde do Oeste2 (PR)
31 - Lindoeste (PR)
32 - Londrina1 (PR)
33 - Londrina2 (PR)
34 - Sertanópolis (PR)
35 - Bela Vista do Paraiso (PR)
36 - Cambé (PR)
37 - Mamborê1 (PR)
38 - Mamborê2 (PR)
39 - Pato Branco (PR)
40 - Cambira (PR)
41 - Francisco Beltrão (PR)
42 - Santa Helena (PR)
43 - Tamboara (PR)
44 - Assaí (PR)
45 - Rolandia (PR)
46 - Palmital (SP)
47 - Campos Novos Paulistas (SP)
48 - Caarapó (MS)
49 – Itaporã (MS)
50 – Itaquiraí (MS)
Dez pares de primers de Microssatélites usados para a análise
de plantas de Conyza spp. Repetições amplificadas para cada
microssatélite e o número de alelos por locos
He = 0.6287
Ho = 0.2222
Déficit de heterozigotos [evidência da pressão de seleção]
Hom obs = 0.7778
Análise da variância molecular (AMOVA), valores de grau de liberdade
(GL), soma dos quadrados (SQ), variância e porcentagem de variância
molecular dentro e entre as amostras de Conyza spp.
Valores muito próximos de variância dentro e entre as amostras
Parâmetros médios de coeficiente de endogamia (Fis), proporção
de diversidade gênica entre as amostras (Fst), fluxo gênico entre
as amostras (Nm) avaliados para os dos dez locos SSRs
Diversidade genética alta = 0.6287
Divergência genética muito alta = 0,4208;
Fluxo gênico baixo = 0.3441 [Nm < 0.5]
Excesso de homozigotos = 0,3899
Resultado de pressão de seleção diferencial;
# Seleção divergente contribuindo para gerar diversidade
genética alta
- Seleção
diferencial que
levou a formação
de 11 grupos de
genomas
ancestrais.
- Populações
com predomínio
de um dos
grupos de
genomas.
- Populações
com mistura de
grupos de
genomas.
Evidentes
principalmente
no PR com
número maior de
populações
analisadas
A pressão selecionou 7 grupos de genomas diferentes,
6 deles Resistentes ao Glyphosate, mostrando que a
resistência pode surgir entre grupos de genomas
ancestrais diferentes
Resistente
Pouco
Suscetível
Medianamente
Suscetível
Suscetível
A seleção para Resistência não parece estar
associada com um genótipo específico
Esta Tabela mostra que a R também está presente em plantas
apresentando mistura de genomas ancestrais; isto confirma que a R
não está associada com grupos de genomas ancestrais
predominantes.
Resistente
Pouco
Suscetível
Medianamente
Suscetível
Suscetível
População de Ouro Verde do Oeste1-PR - Evidência de população com
polimorfismo alto, heterozigosidade observada alta, plantas Resistentes com
apenas 1.25% de controle ao glyphosate.
Confere competência para ampla
dispersão de diferentes genótipos com
genes para Resistência
Polimorfismo alto
Heterozigosidade esperada
alta
Para Conyza spp.
Resistência:
-Presente em populações com diversidade genética baixa
e
- Presente em populações com diversidade genética alta
3- Digitaria insularis - Capim amargoso
Outra evidência de seleção de plantas Resistentes independente
do seu genótipo foi observada no capim amargoso
20 primers para ISSR
ISSR
primers, sequences
of
nucleotides of the ISSR primers, and
number of segments amplified per
primer in the individuals of the five
populations of Digitaria insularis
Geographical representation of the collection
locations for the five populations of Digitaria
insularis. PY-R: Paraguay resistant; PR-R:
Paraná resistant; PR-S: Paraná susceptible;
SP-S: São Paulo susceptible; and SP-R: São
Paulo resistant.
Origin and geographical coordinates of the five populations of Digitaria insularis
Primeiro caso de resistencia ao glyphosate in D. insularis – em 2005 na cidade de
Caaguazú, provincia de Alto Paraná province, Paraguai (Heap, 2016).
Em 2007 – No município de Guaíra - Paraná, aproximadamente 350 km do
primeiro foco de resistência ao glifosato no Brasil (Heap, 2016).
No início de 2009, populações de D. insularis resistentes ao glyphosate foram
identificadas em pomares de citrus no Estado de São Paulo (Carvalho et al., 2011).
Bar plot das cinco populações de Digitaria insularis. PY-R: Paraguai
resistente; PR-R: Paraná resistente; PR-S: Paraná suscetível; SP-S:
São Paulo suscetível; e SP-R: São Paulo resistente.
Proporção de plantas de Digitaria insularis em cada grupo (K = 4),
e o número de plantas analisadas de cada população (PY-R:
Paraguay resistente; PR-R: Paraná resistente; PR-S: Paraná
suscetível; SP-R: São Paulo resistente; e SP-S: São Paulo
suscetível).
Indicação de que a seleção para a Resistência não está associada
com um Genótipo específico
Representa um grupo de
plantas com
alta diversidade genética.
Conferindo competência
para uma ampla dispersão.
Plantas Daninhas
Observamos que pressões de
seleção (ação de herbicidas
aplicados) para o controle.
Levando a uma redução da variabilidade genética (Ho)
Seleção para Resistência a herbicidas não parece estar associada
com o genótipo
Obrigada