Clonagem e expressão em alta escala de transportadores ABC humanos em sistema Baculovírus/Célula de Inseto customizado para cristalografia de raio X Rafael O. Resende, Bio-Manguinhos/Fiocruz Rafael O. Resende, Bio-Manguinhos Transportadores ABC Thesgc.org Alberts et al. (2002) Cassete Ligante de ATP (ATP-Binding Cassete): proteínas integrais de membrana: alta complexidade estrutural Rafael O. Resende, Bio-Manguinhos Transportadores ABC Alto peso molecular (acima de 60kDa) Mais de 40 superfamílias de genes 7 subfamílias de proteínas (ABCA – G) Utilizam energia derivada de hidrólise de ATP Transporte de substâncias pelas membranas biológicas Homeostase de colesterol Influxo/efluxo de neurotransmissores Rafael O. Resende, Bio-Manguinhos Transportadores ABC Importância no sistema imune: Expressão de sinalizadores da imunidade inata Metabolismo em macrófagos Apresentação de peptídeos via MHC-1: células T CD8+ Potencialização da resposta humoral: autoimunidade Expressão de marcadores tumorais de superfície Rafael O. Resende, Bio-Manguinhos Ictiose Tipo Arlequim (ABCA) Gota (ABCG) Hipoglicemia infantil (ABCC) Merckmanual.com Esquizofrenia (ABCA) Rheumatology.org Livemedical.net (ABCA) soscuisine.com missjheintz.edublogs.org Trialx.com Doença de Tangier Fibrose Cística (ABCC) Sciencenewstoyou.blogspot.com Transportadores ABC Sideroblastose (ABCB) Rafael O. Resende, Bio-Manguinhos Telegraph.co.uk Transportadores ABC Asma/DPOC Hepatoma Câncer de cólon Rafael O. Resende, Bio-Manguinhos Objetivos Alvos estratégicos Transportadores ABC Clonar, expressar e purificar Baculovírus/Célula de inseto - High-Throughput Protocolo customizado para XRC Consórcio de Genômica Estrutural Universidade de Oxford, Reino Unido (SGC/Oxford) Rafael O. Resende, Bio-Manguinhos Tn 7L Clonagem por High-Throughput SV40 pA FBAC-2 BamHI (6058) Flag 10 His f1 origin BfuAI (5982) Pst I (5979) 9 Alvos estratégicos 95 Construções truncadas de DNA TEV Amp R 3'LIC BfuAI KpnI (5561) pFB-C T10HF-LIC Sac B 6721 bp pUC origin Vetor customizado pFB-CT10HF-LIC FastBac, Bac-To-Bac: Life Technologies BfuAI BfuAI (4052) 5'LIC Tn7R Bse RI (2962) FBAC-1 PH promoter Gm R C-terminal TEV-His10-Flag TEV PH promoter Lic 5’ Gene de interesse Lic 3’ 10 His FLAG Tn7L Vetor pFastBac modificado por SGC Oxford Rafael O. Resende, Bio-Manguinhos pFBCT10HF-LIC vector digested by BfuAI 1% Agarose E-gel from 95 constructs of an ABC transporter. 100% 92% 92% 90% 75% 75% 67% 69% 67% 1% agarose gel from a colony PCR using 95 different constructs from an ABC transporter T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 Rafael O. Resende, Bio-Manguinhos 96 poços Clonagem LIC Transformação em E. coli DH10Bac Bloco de 96 poços Seleção colônias azuis/brancas Miniprep Bacmid® Placa de 24 poços (96 h) Bloco de 24 poços (48-72 h) Transfecção em céls.Sf9 cells (vírus P0) Geração sequencial: vírus P1, P2 Expressão em pequena escala (Células P2) Rafael O. Resende, Bio-Manguinhos Teste de expressão em 3mL – Phynexus System Bloco de 24 poços Cultura céls. Inf. em placas de 24 poços Sonicação em paralelo (automatizada) Bloco de 96 poços Transferência para blocos de 96 poços Extração em detergente não-iônico Centrifugação 300 x g (debris) Ligação à Talon (IMAC Co2+) Lavagem com HEPES/NaCl + deterg. Eluição 300mM Imidazol 3mL Test Expression - 24 constructs (ABC transporter) Rafael O. Resende, Bio-Manguinhos Screening automatizado de detergentes • • • • 12 detergentes em paralelo Concentração Micelar Crítica (CMC) - 2X Aditivo lipídico: CHS Teste de Monodispersidade: Dionex Rafael O. Resende, Bio-Manguinhos Screening automatizado de detergentes * * * * Rafael O. Resende, Bio-Manguinhos Expressão: 3-46 L céls. Sf9 Preparação: gradiente NaCl Lise: 15.000PSI Extração DDM + CHS PD10 (remover imidazol) Cromatog. Afinidade – Co2+ Cromatog. Exclusão Molecular Clivagem His-tag - TEV protease Purificação reversa Concentração/Centricon Cristalização automatizada Rafael O. Resende, Bio-Manguinhos SDS-PAGE 4-12% Análise qualitativa 160,00 140,00 120,00 100,00 80,00 60,00 40,00 20,00 0,00 -20,00 0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00 Volume (ml) Alvo confirmado! Excisão e digestão tríptica LC-MS/MS Alvo confirmado! ESI-TOF/Q-TOF (UniProt_SwissProt/SGC databases) Rafael O. Resende, Bio-Manguinhos Conclusões • O sistema Baculovírus/Célula de Inseto se constitui de um excelente sistema para expressão de transportadores ABC humanos; • A possibilidade de inclusão de múltiplas construções truncadas de um mesmo alvo tem se mostrado eficiente na seleção de proteínas mais estáveis; • A clonagem e expressão em alta escala utilizando plamídeos customizados são importantes ferramentas na obtenção de clones susceptíveis para transportadores ABC humanos. Rafael O. Resende, Bio-Manguinhos Perspectivas • Execução da modelagem 3D a partir das proteínas que gerarem cristais difratados no Diamond (Sincrotron); • Síntese de inibidores/ligantes quimioterápicos para os alvos utilizados neste estudo pelas farmacêuticas investidoras no SGC; • Ampliação do rol de transportadores ABC humanos e receptores de membrana com foco em: rinite, asma e DPOC. Rafael O. Resende, Bio-Manguinhos Obrigado! Rafael O. Resende, Bio-Manguinhos