EXPRESSÃO DE CITOCINAS E FATORES DE TRANSCRIÇÃO

MESTRADO EM ODONTOLOGIA
Área de Concentração em Periodontia
JADSON ALMEIDA LIMA
EXPRESSÃO DE CITOCINAS E FATORES DE TRANSCRIÇÃO
RELACIONADOS ÀS RESPOSTAS Th17 E T REGULATÓRIA EM
LESÕES DE PERIODONTITE CRÔNICA DE DIABÉTICOS TIPO 2
Guarulhos
2012
JADSON ALMEIDA LIMA
EXPRESSÃO DE CITOCINAS E FATORES DE TRANSCRIÇÃO
RELACIONADOS ÀS RESPOSTAS Th17 E T REGULATÓRIA EM
LESÕES DE PERIODONTITE CRÔNICA DE DIABÉTICOS TIPO 2
Dissertação apresentada à Universidade Guarulhos
para obtenção do título de Mestre em Odontologia
Área de Concentração: Periodontia
Orientadora: Profa. Dra. Poliana Mendes Duarte
Co-orientadora: Profa. Dra. Marta Ferreira Bastos
Guarulhos
2012
DEDICATÓRIA
Em memória de meus pais, Geraldo e Maria do Carmo, que desde mais tenra idade me ensinaram
valores como: honestidade, humildade, honra, persistência, lealdade, mansidão e amor; princípios
que sigo até hoje e se Deus um dia assim permitir os passarei também a meus filhos. Se hoje
estou onde estou e sou quem sou devo isso a eles que me deram a vida, me criaram, me
educaram, e que por vontade Divina hoje não estão presentes em matéria, entretanto sei sem
sombra de dúvidas que estão vibrando por mim, as mais puras, sublimes e amorosas energias
positivas.
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente à Deus por me dar saúde e coragem para enfrentar todos os obstáculos
que surgiram em meu caminho.
À Solange, minha irmã, que nos momentos mais difíceis pelos quais passamos nestes dois anos
nunca me deixou desistir e sempre tinha uma palavra de incentivo. Ela foi e é meu alicerce.
Ao meu amigo Prof. Dr. Antonio R. S. Costa que sempre foi um incentivador a fim de que eu
ingressasse no meio acadêmico.
À minha querida orientadora, Prof.ª Drª Poliana M. Duarte, um exemplo de profissional e de
pessoa. Não só apenas atuou como professora e orientadora, mas também como amiga, me dando
os conselhos e as repreensões necessárias nos momentos certos e os elogios merecidos em outras
oportunidades. Agiu como faz com todos seus orientados de maneira quase maternal. Com esta
mulher aprendi que sim posso ser uma “flecha” atirada rumo ao sucesso. Aprendi ter amor à
pesquisa, pois é uma apaixonada pelo que faz e contagia todos ao seu redor.
À minha querida co-orientadora, Prof.ª Drª Marta F. Bastos que me guiou pelo mundo tão
fascinante da imunologia de maneira tão clara e elucidativa.
A todo corpo docente do Centro de Pós-Graduação, Pesquisa e Extensão do Curso de
Odontologia da UnG: Prof.ª Drª Magda Feres, Prof.ª Drª Luciene Figueiredo, Prof. Dr. Marcelo
de Faveri, Prof. Dr. José Augusto Rodrigues, Prof. Dr. Jamil W. Shibli, Prof. Dr. André F. Reis,
Prof.ª Drª Alessandra Cassoni, Prof.ª Drª Claudia Ota-Tsuzuki e Prof. Dr. Cesar Arrais, os meus
mais sinceros agradecimentos por todo o conhecimento concedido nesses anos.
À secretária da pós-graduação Cristina Zoucas por toda a paciência e carinho.
Às funcionárias da Clínica de Estudos Avançados: Cinthia Lobo, Adriana Rose, Samantha A. C.
Silva e Regina L. da Silva pela amizade e presteza no auxílio quando era solicitado.
À bióloga Izilvânia Barreto pela competência e dedicação nos trabalhos laboratoriais.
A toda a equipe do Laboratório de Análises Clínicas da UnG que foi de importância ímpar nos
exames glicêmicos.
Às minhas companheiras de pesquisa: Prof.ª Drª Fernanda V. Ribeiro, Prof.ª Vanessa Santos,
Prof.ª Drª Gláucia Zimmermann, obrigado pela ajuda e principalmente pelos ensinamentos.
Aos alunos de iniciação científica: Tiago Gonçalves, Tamires Szeremeske, Ariane de Siqueira,
Fernanda Sampaio e Fernanda Colombo pelo trabalho duro nas triagens, organização das fichas,
auxílio às cirurgias e trabalhos laboratoriais, trabalhos radiológicos e também orientações aos
pacientes, minha eterna gratidão.
Aos meus colegas da turma de mestrado em periodontia: Marcela Tucci, Renata Mairink,
Raphael Andreto e Marcelo Guerra, por toda a ajuda, pelos momentos de descontração e por tudo
mesmo. Nunca esquecerei vocês.
A todos os alunos e amigos do mestrado e doutorado em odontologia da UnG que direta ou
indiretamente me ajudaram na realização deste trabalho.
Um agradecimento especial a minha amiga Prof.ª Josefa Mestnik que mesmo não envolvida
diretamente neste estudo, esteve sempre presente, com uma palavra amiga nos momentos mais
difíceis pelos quais passei tanto referente ao curso quanto a vida pessoal. Obrigado, nunca vou
agradecer suficiente por toda luz que me deu.
Aos pacientes que participaram deste estudo, obrigado pela compreensão e colaboração na
pesquisa, sem os quais nada teria se realizado.
À Universidade Guarulhos que foi a instituição que me acolheu durante todos esses longos anos
desde a graduação até o mestrado me dando todo o apoio estrutural para meu crescimento pessoal
e intelectual.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e à Fundação de
Amparo à Pesquisa de São Paulo (FAPESP) pelo apoio financeiro para realização deste estudo.
A todas as pessoas que direta ou indiretamente contribuíram de alguma forma para realização
deste trabalho, meu muito obrigado.
“Professor, uma profissão. Educador, a mais nobre de todas as missões.”
Antônio Gomes Lacerda
“A essência do conhecimento consiste em aplicá-lo, uma vez possuído.”
Confúcio
RESUMO
Embora o diabetes melito (DM) seja um fator de risco bem reconhecido para as
periodontites, os mecanismos celulares e moleculares que relacionam ambas as doenças ainda
não foram totalmente elucidados. Poucos estudos avaliaram, até o presente momento, os papéis
das células T auxiliares (Th) 17 e T regulatórias (Treg) em pacientes diabéticos com periodontite
crônica (PC). Assim, o objetivo do presente estudo foi avaliar, por meio de PCR quantitativo, a
expressão de genes relacionados às respostas Th17 e Treg [interleucina (IL)-10, IL-17, IL-23, IL6, fator de necrose tumoral (TNF)-α, fator de transformação do crescimento (TGF)-β, fator de
transcrição forkhead box P3 (FOXP3) e fator nuclear orphan do receptor (RORC2)] em sítios
com PC avançada em diabético tipo 2 com melhor (hemoglobina glicada [HbA1c] ≤ 8%) e pior
(HbA1c > 8%) controle glicêmico. Biópsias de tecido gengival foram obtidas de indivíduos
sistemicamente saudáveis sem periodontite (n=15; grupo 1), sistemicamente saudáveis com PC
(n=15; grupo 2), diabéticos com melhor controle (HbA1c ≤ 8%) e PC (n=15; grupo 3) e,
diabéticos com pobre controle (HbA1c > 8%) e PC (n=15; grupo 4). Os níveis de RNAm para
interleucina IL-17, IL-6, IL-23, IL-10, TNF-α, TGF-β, FOXP3 e RORC2 foram avaliados por
PCR quantitativo. Todos os grupos com PC apresentaram nível mais elevado de RNAm para IL17 e uma maior frequência de amostras gengivais positivas para o RNAm da IL-17 quando
comparado ao grupo 1 (p<0,05). Houve uma maior frequência de detecção de RNAm para
RORC2 nas biópsias de ambos os grupos diabéticos (grupos 2 e 3), em comparação aos grupos 1
e 2 (p<0,05). Não houve diferenças significativas entre os grupos quanto a frequência e níveis de
RNAm para IL-6, IL-23, IL-10, TNF-α, TGF-β e FOXP3 (p>0,05). Em conclusão, sítios com PC
avançada em diabético tipo 2, independente do estado glicêmico, não apresentaram diferenças
significativas na expressão de genes relacionados às respostas Th17 e Treg, quando comparados
aos indivíduos não diabéticos.
Palavras-chave: diabetes melito; periodontite crônica; expressão gênica; citocinas; reação em
cadeia de polimerase.
ABSTRACT
Although diabetes mellitus (DM) is a well-recognized risk factor for periodontitis, the
cellular and molecular mechanisms that link both diseases were not completely elucidated. To
date, few studies have evaluated the role of T helper (Th) 17 and T regulatory (Treg) cells in
diabetic subjects with chronic periodontitis (CP). Therefore, the aim of this study was to evaluate,
using quantitative PCR, the expression of genes related to Th17 and Treg responses [(IL)-17, IL6, IL-23, IL-10, tumor necrosis factor (TNF)-α, transforming growth factor (TGF)-β,
transcription factor forkhead box p3 (FOXP3) and transcription factor orphan nuclear receptor C2
(RORC2)] in sites with advanced CP in type 2 diabetic subjects with good (glycated hemoglobin
[HbA1c] ≤ 8%) and poor (HbA1c > 8%) glycemic control. Gingival biopsies were harvested
from systemically healthy non-periodontitis subjects (n=15; group 1), systemically healthy
subjects with CP (n=15; group 2), better-controlled (HbA1c ≤ 8%) diabetic subjects with and CP
(n=15; group 3) and, poorly-controlled (HbA1c > 8%) diabetic subjects with and CP (n=15;
group 4). The levels of mRNA of interleukin IL-17, IL-6, IL-23, IL-10, TNF-α, TGF-β, FOXP3,
RORC2 were evaluated by quantitative PCR. All CP groups presented higher levels of mRNA of
IL-17 and a higher frequency of IL-17 mRNA-positive biopsies when compared to group 1
(p<0.05). There was a higher frequency of detection of mRNA of RORC2 in the biopsies from
both diabetic groups, when compared to groups 1 and 2 (p<0.05). There were no differences
among groups for the frequency and levels of IL-6, IL-23, IL-10, TNF-α, TGF-β and FOXP3
(p>0.05). In conclusion, advanced periodontitis sites in type 2 diabetic subjects, independent of
glycemic status, did not present significant differences in the expression of genes related to Th17
and Treg responses, when compared to non-diabetic subjects.
Key words: diabetes mellitus; chronic periodontitis; gene expression; cytokines; polymerase
chain reaction.
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO
10
1.1. Respostas T auxiliares (Th) 17 e T regulatória (Treg) nas doenças periodontais
10
1.1.1. Th17
12
1.1.2. Treg
14
1.2. Mecanismos biológicos envolvidos na doença periodontal associado ao diabetes
melito (DM)
16
1.3. Justificativa
20
2. PROPOSIÇÃO
21
3. MATERIAL E MÉTODOS
22
3.1. População estudada
22
3.2. Critérios de inclusão/exclusão gerais
22
3.3. Critérios de inclusão/exclusão específicos
23
3.4. Exames de HbA1c e glicemia em jejum
23
3.5. Avaliação clínica periodontal
23
3.6. Grupos experimentais
24
3.7. Coletas de biópsias de tecido gengival
25
3.8. Tratamento periodontal
25
3.9. Avaliação da expressão gênica
26
3.10. Análises Estatísticas
29
4. RESULTADOS
30
4.1. Resultados clínicos e demográficos
30
4.2. Resultados de expressão gênica
32
5. DISCUSSÃO
35
6. CONCLUSÕES
39
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
40
ANEXOS
51
10 1. INTRODUÇÃO
1.1. Respostas T auxiliares (Th) 17 e T regulatória (Treg) nas doenças periodontais
As doenças periodontais são doenças infecciosas, causadas por espécies bacterianas
específicas, que desencadeiam um processo inflamatório que se inicia nos tecidos de
proteção e posteriormente atinge os tecidos de sustentação dos dentes. Quando a doença
se restringe aos tecidos gengivais, sem perda de inserção de ligamento periodontal e de
tecido ósseo alveolar, recebe o nome de gengivite. Em algumas situações, como
resultado da progressão do processo inflamatório, ocorre o comprometimento dos
tecidos de sustentação do elemento dental (osso, cemento e ligamento) e a gengivite
evolui para uma periodontite (Page & Schroeder 1976, Taichman & Lindhe 1992).
Embora o agente etiológico das doenças periodontais seja o biofilme bacteriano
específico, já existe um consenso na comunidade científica de que a resposta do
hospedeiro frente ao desafio bacteriano é essencial para o desenvolvimento da doença.
Isso significa que a resposta imunológica e inflamatória apresenta grande importância
na destruição tecidual dos indivíduos acometidos pelas doenças periodontais (Taichman
& Lindhe 1992).
Assim como em outras doenças imune-inflamatórias, com o aprimoramento das técnicas
imunológicas e de biologia molecular foi possível constatar que diversos mediadores
pró-inflamatórios e anti-inflamatórios estão envolvidos no processo de destruição dos
tecidos periodontais. Entre eles, proteínas regulatórias de baixo peso molecular ou
glicoproteínas secretadas pelas células de defesa e outras células do corpo em resposta à
diferentes estímulos são coletivamente designadas citocinas (Evans 1993). As citocinas
podem compartilhar tanto efeitos sinérgicos como também antagônicos, onde uma
citocina é capaz de inibir ou anular o efeito de outra. Algumas citocinas são
denominadas interleucinas, uma vez que são secretadas especialmente por leucócitos e
atuam sobre leucócitos. As citocinas regulam a intensidade e a duração de uma resposta
imune-inflamatória estimulando ou inibindo a ativação, proliferação e/ ou diferenciação
de várias células e regulando a secreção de anticorpos e outras citocinas (Evans 1993,
Kindt et al. 2008).
Citocinas importantes na inflamação e na imunidade inata, como a interleucina (IL)-1β,
IL-6 e o fator de necrose tumoral (TNF)-α, vêm sendo estudadas no campo da
11 periodontia por muitos anos. As mesmas são secretadas principalmente por macrófagos,
monócitos, neutrófilos, células endoteliais e epiteliais e, apresentam importantes ações
biológicas como a produção de moléculas de adesão, metaloproteinases e outras
citocinas pró-inflamatórias e estimuladoras da reabsorção óssea (Dower et al. 1992,
Dinarello 1996, Wajant et al. 1998, Boyce et al. 2005). Em geral, a IL-1β, IL-6 e o
TNF-α têm sido encontrados em níveis elevados nos tecidos e fluido crevicular de
indivíduos com periodontite, principalmente em grupos de riscos para as doenças
periodontais como diabéticos e fumantes (Gamonal et al. 2000, Gamonal et al. 2003,
Holmlund et al. 2004).
Em 1986, Mossman et al. observaram que os linfócitos T CD4+ se diferenciavam em
duas subpopulações de acordo com o padrão de citocinas produzidas: as células Th1 e
Th2. As células Th1 são caracterizadas pela produção de interferon (INF)-γ e IL-12 e,
induzem uma resposta imune mediada por células, ativam macrófagos e são eficazes na
eliminação de patógenos. As células Th2, por sua vez, produzem a IL-4, IL-5, IL-13 e
IL-25 e promovem a imunidade humoral pela produção de fatores de crescimento e
diferenciação para linfócitos B (Gemmell & Seymour 2004, Tesmer et al. 2008). Assim,
foi sugerido que as subpopulações Th1 e Th2 poderiam direcionar a resposta imune
frente à agressão bacteriana periodontal pelo desequilíbrio entre a liberação de
mediadores pró-inflamatórios e anti-inflamatórios. Neste contexto, muitos esforços
foram dispensados para explicar a patogênese das doenças periodontais no eixo das
respostas Th1/Th2 (Seymour & Gemmell 2001, Gemmell & Seymour 2004).
Este paradigma foi mantido até o reconhecimento de que outras subpopulações de
células T, com perfis de citocinas e/ou funções imunossupressoras distintas de Th1 e
Th2, denominadas Th17 e Treg, também poderiam estar associadas às doenças
periodontais. As células Th17 e Treg desempenham diferentes papéis na patogênese das
doenças infecciosas; entretanto, ambas populações de linfócitos T são provenientes das
mesmas células precursoras (Bettelli et al. 2006). Células T precursoras expostas ao
fator de transformação do crescimento (TGF)-β aumentam a síntese do fator de
transcrição forkhead box P3 (FOXP3) e se diferenciam em células Treg. Por outro lado,
células precursoras expostas ao TGF-β e à IL-6 se diferenciam em células Th17, sendo
o fator nuclear orphan do receptor 2 (RORC2) o principal fator de transcrição associado
às células Th17 em humanos (Tesmer et al. 2008). Desta maneira, quando o sistema
12 imune está inativo, o TGF-β proporciona a proliferação de células Treg na tentativa de
regular o processo inflamatório. Entretanto, quando existe uma infecção estabelecida, há
produção de IL-6 pelo sistema imune inato o qual inibe a formação de células Treg e
induz a diferenciação de células Th17 pró-inflamatórias (Bettelli et al. 2006). Além
disso, após diferenciação celular, a IL-23 é importante para a expansão, proliferação e
sobrevivência da população de células Th17 no sítio infectado (Harrington et al. 2005).
Aggarwal et al., em 2003, demonstraram que com o aumento dos níveis de IL-23 em
cultura de células, ocorre também um aumento significativo dos níveis de IL-17.
1.1.1. Th17
Resultados sobre o papel das células Th17 nas doenças inflamatórias e infecciosas
parecem superar os achados previamente obtidos pelos estudos conduzidos na hipótese
Th1/Th2. As células Th17 representam uma subpopulação de linfócitos produtores de
IL-17 que não apresentam relação com os linfócitos Th1 e Th2 (Korn et al. 2007). A IL17, por sua vez, é uma citocina pró-inflamatória que compartilha as ações biológicas da
IL-1β e do TNF-α, incluindo o estímulo para a produção de mediadores próinflamatórios como IL-1, IL-6, TNF-α, metaloproteinases e quimiocinas por diferentes
tipos celulares (Yao et al. 1995). Nos últimos anos, a IL-17 foi associada ao
desenvolvimento de doenças autoimunes como a artrite reumatóide, esclerose múltipla,
doença inflamatória intestinal e asma (Fujino et al. 2003). Mais recentemente, o papel
da resposta Th17 em lesões periodontais tem sido investigado por meio de diferentes
desenhos experimentais e metodologias.
Oda et al., em 2003, observaram que a Porphyromonas gingivalis foi capaz de aumentar
os níveis e a expressão gênica de IL-17 por células sanguíneas mononucleares
periféricas. Em 2004, Johnson et al. demonstraram, por meio de ensaio
imunoenzimático (ELISA), que as mais altas concentrações de IL-17 estavam presentes
em sítios com profundidade de sondagem (PS) entre 4-5mm, quando comparado as
demais PS. Takahashi et al. (2005) também observaram elevada produção de IL-17 por
células T em sítios com doença periodontal. Em 2005, Vernal et al. demonstraram que a
quantidade total de IL-17 estava mais elevada em cultura de células e no fluido gengival
provenientes de sítios com periodontite em relação aos sítios saudáveis. Beklen et al.
(2007) detectaram por meio de imunohistoquímica níveis mais elevados (~ 6x) de IL-17
em sítios com periodontite quando comparados aos periodontalmente saudáveis. Honda
13 et al. (2008) estudaram e compararam o perfil de citocinas Th17 nos tecidos com
gengivite e periodontite e observaram que a expressão de IL-17 foi mais alta na
periodontite.
Em 2009, Cardoso et al. observaram a presença de células Th17 e elevados níveis de
RNAm e da proteína IL-17 em sítios com periodontite quando comparados aos
saudáveis. Dutzan et al. (2009) observaram maior expressão de IL-17 em lesões
periodontais ativas quando comparadas as inativas, bem como correlação positiva entre
IL-17 e ligante do receptor do ativador do fator nuclear kappa-ß (RANKL), um
importante fator relacionado a osteoclastogênese e reabsorção óssea. Ohyama et al.
(2009) observaram que a expressão do receptor da IL-23 induzida por Th17 relativa à
expressão de IL-12 foi significativamente maior em lesões periodontais quando
comparada à um grupo controle sem doença. Além disso, houve maior expressão de IL17 nas lesões periodontais, principalmente adjacente à destruição óssea, em relação aos
locais sem doença. Os resultados sugeriram que a produção de IL-23, induzida via
Th17, estava estimulada em lesões inflamatórias periodontais.
Schenkein et al. (2010), utilizando ELISA, mediram as concentrações séricas de IL-17
em indivíduos periodontalmente saudáveis, com periodontite agressiva localizada e com
periodontite agressiva generalizada. Os resultados demonstraram que a IL-17 foi
indetectável nos sujeitos saudáveis. Entretanto, a mesma estava em concentrações
significativamente altas em ambos os grupos de periodontite agressiva. Uma correlação
positiva entre as concentrações de IL-17 e a perda de inserção periodontal também foi
verificada neste estudo. Behfarnia et al. (2010) avaliaram, por meio de ELISA, os níveis
de IL-4, INF-γ e IL-17 em amostras de tecido gengival de indivíduos com periodontite
crônica (PC) moderada (PS entre 5 e 7 mm), em comparação aos indivíduos saudáveis.
Os níveis de INF-γ e IL-4 estavam significativamente menores, enquanto os níveis IL17 de estavam maiores, nas amostras de sujeitos com periodontite quando comparados
aos saudáveis.
Zhu et al. (2011) avaliaram a hipótese de que a IL-17 poderia atuar em fibroblastos
especializados do ligamento periodontal humano (hPDLFs) e induzir a produção de IL23 p19, uma subunidade chave da IL-23. Os resultados demonstraram que a IL-17 foi
capaz de estimular a expressão de RNAm e da proteína IL-23 p19 pelas hPDLFs
cultivadas. Assim, estes resultados forneceram evidências de que hPDLFs são um alvo
14 das células Th17, e que a IL-17 parece regular a expressão de IL-23 p19 por essas
células periodontais. Em conjunto, os resultados sugeriram que a interrupção da
interação IL-17/IL-23 pode ser uma possível abordagem terapêutica para o tratamento
da periodontite. Em 2011, Zhao et al. avaliaram os efeitos da terapia periodontal na
expressão das citocinas relacionadas às respostas Th17/ Th1/ Th2 no fluido gengival de
sujeitos com PC, por meio de ELISA. Os resultados demonstraram que os níveis de IL17 e IL-21 estavam diminuídos e os de IL-4 aumentados após tratamento. Os resultados
sugeriram que as células Th17, mais que as Th1, desempenham papel destrutivo no
equilíbrio imunológico relacionado à periodontite enquanto as células Th2 possuem um
efeito protetor. Um estudo recente analisou a presença de células dendríticas,
macrófagos e células B, bem como suas relações com as células Th17, em biópsias de
mucosa oral e regiões coronárias e profundas de elementos com periodontite crônica,
por meio de imunohistoquímica, imunofluorescência, citometria de fluxo e PCR em
tempo real. Os resultados demonstraram predominância de macrófagos, células B e
Th17 em regiões de lesões de periodontite profundas, enquanto as células dendríticas
prevaleciam nas regiões coronárias (Allam et al. 2011). Recentemente, Konermann et
al. (2011) verificaram, por meio de um estudo in vitro, o impacto imunoregulatório das
células do ligamento periodontal no infiltrado leucocitário na inflamação periodontal,
particularmente em relação às células Th17. Células de ligamento periodontal foram
sensibilizadas com citocinas pró-inflamatórias (IL-1β, IL-17A e IFN-γ) e, a expressão
de mediadores envolvidos no processo imunoinflamatório periodontal foram avaliadas
(IL-6,
IL-23A,
TGFβ1).
Houve
um
aumento
significativo
das
citocinas
imunoinflamatórias estudadas quando as células de ligamento periodontal foram
submetidas ao efeito das citocinas pró-inflamatórias. Assim, os resultados sugeriram
que as células do ligamento periodontal podem estar envolvidas nos mecanismos
inflamatórios crônicos dos tecidos periodontais por meio da produção de citocinas.
1.1.2. Treg
Treg são subpopulações de linfócitos T que regulam a indução e a atividade de células T
efetoras. Segundo Nistala et al. (2009), estas células expressam os marcadores de
superfície CD4 e CD25 e são capazes de prevenir uma resposta imune exagerada e o
desenvolvimento de várias doenças autoimunes. As células Treg são também capazes de
regular a resposta imune durante um processo infeccioso (Mittrucker et al. 2004). As
funções regulatórias dos linfócitos Tregs são mediadas pelo fator de transcrição FOXP3
15 e envolvem a supressão de células T, B e exterminadoras naturais e por meio das
moléculas de superfície como CTLA-4 ou pela produção de citocinas anti-inflamatórias
como a IL-10 e o TGF-β (Shevach 2002, Shevach et al. 2008). Ainda que alguns
experimentos tenham observado a presença de células FOXP3+ em lesões periodontais,
o papel regulatório destas células no desenvolvimento da periodontite ainda permanece
controverso. Nakajima et al., em 2005, sugeriram que as células Treg ocupam um papel
fundamental regulatório na patogênese das doenças periodontais, observando níveis
mais altos de células CD4+CD25+CTLA-4+ e mais elevada expressão de FOXP3 em
lesões de periodontite em relação à gengivite. Em 2005, Ito et al. (2005) demonstraram
que aproximadamente 90% de clones de células T derivadas de lesões com periodontite
expressaram FOXP3. Cardoso et al. (2008) observaram que tecidos provenientes de
sítios com periodontite apresentavam maior acúmulo de células CD4+CD25+ quando
comparados aos sítios saudáveis. Além disso, essas células apresentavam marcadores
fenotípicos de células Treg como FOXP3 e CTLA-4. Okui et al. (2008) propuseram que
as células T FOXP3+ presentes em lesões de periodontite (clones de células T
gengivais) poderiam ser células efetoras ao invés de exercer um papel regulatório, pois
as mesmas apresentavam baixa expressão de CD25 na membrana. Similarmente, Dutzan
et al., em 2009, sugeriram que embora houvesse altos níveis de expressão de FOXP3 em
lesões periodontais ativas, as células FOXP3+ não estavam exercendo funções
regulatórias, uma vez que foram observadas expressões baixas de IL-10 e TGF-β,
predominando a alta expressão de RANKL e IL-17, marcadores diretamente
relacionados às células Th17. Por outro lado, um estudo em camundongos infectados
por Aggregatibacter actinomycetemcomitans demonstrou que a presença das células
Treg é capaz de atenuar a severidade da periodontite experimental sem impedir o
controle da infecção (Garlet et al. 2010). Recentemente, Kobayashi et al. (2011)
infectaram ratos com P. gingivalis e analisaram, em 1, 7, 15 e 30 dias após a infecção,
os níveis de expressão de citocinas. Os resultados demonstraram altos níveis de IL-6 e
TNF-α em 7 dias pós-infecção e um aumento de células T RANKL+CD4+ em 15 dias.
Além disso, o número de células Treg CD4+CD25+FOXP3+ estava aumentado no
grupo infectado em 30 dias. Os resultados revelaram ainda uma maior na produção de
IL-10 pelas célula T CD4+ no tecido gengival inflamado quando comparado ao
controle.
16 1.2. Mecanismos biológicos envolvidos na doença periodontal associado ao diabetes
melito (DM)
Estudos clínicos e experimentais têm demonstrado que alguns fatores sistêmicos e
hábitos são capazes de influenciar a resposta do hospedeiro frente ao desafio bacteriano.
Exemplos clássicos são o tabagismo e o DM que desempenham um papel deletério na
resposta do hospedeiro frente a agressão bacteriana periodontal.
DM é um distúrbio crônico caracterizado pela utilização ou produção deficiente de
insulina que resulta em hiperglicemia e, como consequência, em diversas complicações
sistêmicas e bucais (Brownlee 1994). Dentre as alterações bucais, o DM está
relacionado a diversas alterações imunológicas e inflamatórias em níveis moleculares,
celulares e vasculares, que podem predispor à doença periodontal. Diversos estudos
demonstraram que o DM é um verdadeiro fator de risco para as doenças periodontais,
influenciando negativamente o estabelecimento e progressão das mesmas (Emrich et al.
1991, Taylor et al. 1998, Novak et al. 2008). Estudos epidemiológicos da década de 90
em populações com alta prevalência de DM demonstraram que a prevalência e a
gravidade da perda de inserção periodontal são maiores em diabéticos (Emrich et al.
1991, Löe 1993). Em 1991, Emrich et al., estudando uma população de índios Pima no
Arizona, evidenciaram que o DM estava significativamente relacionado a prevalência e
severidade das doenças periodontais, mesmo após ajuste estatístico para variáveis
demográficas e índice de placa. Taylor et al. (1998) observaram que a progressão da
periodontite, em dois anos, foi 4,23 vezes maior em indivíduos diabéticos quando
comparados aos não-diabéticos. Os achados desses estudos clássicos foram
comprovados por estudos mais recentes. Novak et al. (2008) também demonstraram que
diabéticos tipo 2 apresentaram maior gravidade e extensão de destruição periodontal.
Kaur et al., em 2009, confirmaram a associação entre DM tipo 1 e 2 e a perda óssea e
periodontite em indivíduos pomeranos. Em 2010, Susanto et al. avaliaram uma
população da Indonésia e notaram que a prevalência e a gravidade da periodontite foi
significativamente maior em diabéticos tipo 2 comparado aos indivíduos sem DM.
Estudos clínicos têm sugerido que o controle glicêmico de diabéticos pode estar
relacionado à gravidade das doenças periodontais. Assim, indivíduos diabéticos com
controle glicêmico precário apresentam uma condição de periodontite mais grave que
diabéticos bem-controlados (Tsai et al. 2002, Campus et al. 2005, Lim et al. 2007). Um
17 estudo epidemiológico demonstrou que diabéticos tipo 2 com pobre controle glicêmico
(hemoglobina glicada [HbA1c] > 9%) apresentaram aproximadamente três vezes maior
prevalência de doença periodontal avançada que indivíduos não-diabéticos (Tsai et al.
2002). Em 2007, Lim et al. evidenciaram que diabéticos tipo 1 e 2 com níveis de HbA1c
< 8% apresentaram melhores condições periodontais (menor porcentagem de sítios com
sangramento e PS > 5mm) que indivíduos com níveis de HbA1c > 8%. Santos et al.
(2009a) observaram que diabéticos tipo 2 bem-controlados apresentaram menor perda
de inserção em relação aos indivíduos com controle glicêmico precário em 6 meses após
raspagem e alisamento radicular. Em 2010, Bandyopadhyay et al. demonstraram que
sítios periodontais de indivíduos diabéticos não-controlados apresentaram maiores
chances de progressão de doença quando comparado aos indivíduos bem-controlados.
Como uma via de mão dupla, a presença de periodontite parece contribuir também para
a dificuldade do controle glicêmico pelos indivíduos diabéticos. Chen et al. (2010)
demonstraram que a média de PS de boca-total é uma variável preditora para níveis
elevados de HbA1c, após ajustes para fatores de confundimento como tabagismo, idade,
gênero e índice de massa corporal. Além disso, meta-análises demonstraram que
terapias periodontais apresentam efeitos positivos no controle glicêmico de indivíduos
diabéticos (Darré et al. 2008, Simpson et al. 2010, Teeuw et al. 2010). Em 2008, Darré
et al. relataram que a terapia periodontal não-cirúrgica contribui para a melhora do
controle glicêmico após avaliar uma série de estudos controlados intervencionais
randomizados realizados em diabéticos tipo 1 e 2. Da mesma forma, Simpson et al. e
Teew et al., ambos em 2010, propuseram que existe uma moderada, mas significante,
melhora no controle glicêmico em indivíduos diabéticos tipo 2 após o tratamento
periodontal. Recentemente, Koromantzos et al. (2011) realizaram estudo clínico
controlado e randomizado em diabéticos tipo 2 com periodontite moderada-avançada e
avaliaram o efeito da terapia periodontal no controle glicêmico. Alguns diabéticos
receberam raspagem e alisamento radicular, enquanto os outros não receberam
tratamento por 6 meses. Os resultados demonstraram que todos os parâmetros clínicos
melhoraram significativamente nos pacientes submetidos ao tratamento, o que
contribuiu para melhora do controle glicêmico em 1, 3 e 6 meses após a terapia.
Os mecanismos moleculares e celulares que explicam a exacerbação das doenças
periodontais em diabéticos ainda não está totalmente elucidado. Entretanto, alguns
estudos envolvendo técnicas de biologia molecular e imunologia apresentam indícios de
18 que o processo inflamatório e imunológico em sítios periodontais de indivíduos
diabéticos está alterado em relação aos sujeitos não-diabéticos. Segundo Brownlee
(1994), em nível celular e molecular, a hiperglicemia crônica gera glicolisação
progressiva das proteínas corpóreas, formando os produtos finais avançados de
glicolisação denominados AGEs (advanced glycation end products). Estes compostos,
também presentes nos tecidos periodontais (Katz et al. 2005), estão associados a uma
piora da destruição periodontal em diabéticos (Takeda et al. 2006) uma vez que
estimulam respostas inflamatórias exacerbadas pela elevada liberação de mediadores
pró-inflamatórios, comprometimento do metabolismo de colágeno, aumento da
permeabilidade vascular e espessamento da membrana basal dos capilares (Salvi et al.
1997a, Salvi et al. 1997b, Salvi et al. 1998, Naguib et al. 2004, Bulut et al. 2001,
Duarte et al. 2007a,b). Indivíduos diabéticos com doença periodontal apresentaram
maiores níveis de prostaglandina, IL-1ß e TNF-α no fluido gengival quando
comparados aos não-diabéticos (Salvi et al. 1998). Bulut et al. (2001) observaram níveis
aumentados de IL-1ß no fluido gengival de diabéticos com periodontite quando
comparados aos sistemicamente saudáveis. O mesmo foi observado por Kurtis et al.
(1999) em relação à IL-6. Engebretson et al. (2004) observaram que um controle
glicêmico precário está associado a um nível mais elevado de IL-1ß. Por meio de PCR
quantitativo, Duarte et al. (2007a) demonstraram menor expressão gênica de IL-10
(citocina anti-inflamatória) e de osteoprotegerina (OPG, fator relacionado ao controle da
reabsorção óssea) no tecido gengival de diabéticos com periodontite quando comparado
aos não-diabéticos. Duarte et al. (2007b), utilizando ELISA, encontraram níveis mais
altos de IL-1ß e IL-6 nos tecidos gengivais com periodontite de diabéticos em relação
aos não-diabéticos.
Correa et al. (2010) avaliaram o efeito do tratamento periodontal no controle metabólico
e níveis circulantes de proteína C reativa, fibrinogênio, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10 e TNF-α
em diabéticos tipo 2 com PC. Em 3 meses pós-terapia, todos os parâmetros clínicos
melhoraram e houve tendência para diminuição dos mediadores inflamatórios, proteína
C reativa e HbA1c. Em 2010, Costa et al. mensuraram as concentrações de IL-6, matriz
metaloproteinase-8 e OPG na saliva de indivíduos com PC e DM tipo 2. As
concentrações de IL-6 salivar estavam elevadas nos sujeitos com periodontite, com ou
sem DM. Por outro lado, MMP-8 e OPG estavam elevadas nos diabéticos, independente
da presença de inflamação periodontal. Venza et al. (2010) demonstraram por meio de
19 PCR quantitativo e Western blot que diabéticos tipo 2 apresentavam maior expressão de
TNF-α e receptores de quimiocinas em sítios com PC. Em 2011, Sun et al. avaliaram
pacientes diabéticos não-compensados com PC tratados e não-tratados em relação aos
níveis séricos de adiponectina, proteína C reativa, TNF-α, IL-6, perfil lipídico, glicose e
insulina. Foi observado que os níveis de proteína C reativa, TNF-α e IL-6 diminuíram
em 3 meses nos sujeitos tratados em comparação aos não-tratados. Aspriello et al.
(2011) compararam os níveis séricos de proteína C reativa e as taxas de IL-1β, IL-6 e
TNF-α no fluido gengival entre diabéticos tipo 1 e tipo 2 com PC. Os autores
verificaram que os níveis de IL-1β e TNF-α estavam significativamente maiores em
sujeitos com DM tipo 1 em comparação aos com DM tipo 2 e que, a duração do DM
tipo 1 afetava os níveis destas citocinas. Kardesler et al. (2011) avaliaram os efeitos da
terapia periodontal nos níveis de IL-6, ativador de plasminogênio, inibidor do ativador
do plasminogênio-2 e albumina em sujeitos diabéticos tipo 2 e sistemicamente
saudáveis com PC. De forma geral, os níveis de albumina, IL-6, tPA e PAI-2
diminuíram significativamente nos diabéticos após o tratamento (1 e 3 meses). Por outro
lado, apenas PAI-2 diminuiu nos não-diabéticos em 3 meses. Duarte et al. (2011)
avaliaram os níveis teciduais de células IL-17+, IL-15+, FOXP3+, fibrose e células B
em sítios com PC de fumantes, diabéticos tipo 2 e não-diabéticos e não-fumantes. Um
maior número de células IL-17+, IL-15+ e FOXP3+ e uma maior quantidade de fibrose
foi observada nos diabéticos tipo 2, sugerindo que o desenvolvimento de periodontite
nestes indivíduos pode ser influenciada pelos eixos Th17 /Treg.
Apesar das evidências clínicas de que o controle glicêmico interfere na condição
periodontal, em geral, os níveis de marcadores inflamatórios em sítios com periodontite
crônica em sujeitos com DM tipo 2 têm sido avaliado como um todo, sem examinar
separadamente os indivíduos de acordo com sua condição glicêmica (controlados ou
não-controlados). Alguns estudos avaliaram a influência do controle glicêmico nos
níveis de marcadores inflamatórios, tais como IL-1β, IL-8 e TNF-α, em sítios com
periodontite em pacientes diabéticos tipo 2 (Engebretson et al. 2004, 2006, 2007).
Santos et al. (2009a) compararam os níveis de RANKL e OPG no fluido gengival de
sítios com periodontite crônica em diabéticos tipo 2 com bom e precário controle
glicêmico. Os resultados demonstraram que diabéticos com níveis de HbA1c > 8%
apresentaram
desequilíbrio
na
proporção
RANKL/OPG,
favorecendo
a
osteoclastogênese quando comparados aos com HbA1c ≤ 8%. Esses achados sugeriram
20 que diabéticos com pior controle glicêmico apresentam maior risco para perda óssea
alveolar. Kardesler et al. (2010) avaliaram os efeitos do tratamento periodontal no
controle glicêmico e níveis séricos de TNF-α, IL-6, proteína C reativa, molécula de
adesão, adiponectina e leptina em sujeitos com DM controlados, não-controlados e
sistemicamente saudáveis, todos portadores de PC. Após tratamento, houve melhora no
controle glicêmico em pacientes DM mal-controlados e diminuição dos níveis de IL-6,
TNF-α, proteína C reativa e leptina. Além disso, houve aumento nos níveis de
adiponectina, um mediador anti-inflamatório. Santos et al. (2010) compararam os níveis
de TNF-α, INF-γ, IL-4, IL-17 e IL-23 no fluido gengival antes e após terapia
periodontal básica em diabéticos tipo 2 controlados e não-controlado com PC. Os níveis
de IL-17 estavam maiores nos sujeitos mal-controlados enquanto os níveis de INF-γ
mais altos nos bem-controlados em todos os tempo experimentais. Além disso, as taxas
de IL-4 estavam menores nos sujeitos bem-controlados que nos mal-controlados no
tempo inicial. Esses resultados sugeriram uma polarização para uma resposta Th17 ou
Th1 nos tecidos com periodontite de diabéticos de acordo com o controle glicêmico.
Ribeiro et al. (2011) compararam os níveis de TNF-α, IL-4, IFN-γ, IL-23, IL-17,
RANKL e OPG no fluido gengival de sítios com PC de indivíduos com DM tipo 2
compensados, não-compensados e sistemicamente saudáveis. Níveis aumentados de
citocinas pró-inflamatórias e RANKL foram observados no fluido de ambos os grupos
com DM tipo 2 quando comparados ao grupo não-diabético.
1.3. Justificativa
Embora os efeitos do DM sobre diversos mediadores imunoinflamatórios relacionados à
inflamação, resposta imune inata e respostas Th1 e Th2 já tenham sido estudados nas
doenças periodontais, existem poucas informações na literatura sobre a influência do
DM e do controle glicêmico nas respostas Th17 e Treg em lesões de periodontite. O
entendimento do papel das diferentes subpopulações de linfócitos em diabéticos pode
trazer informações muito relevantes sobre a influência do DM na patogênese da
periodontite crônica e contribuir para um melhor entendimento da exacerbação da
gravidade e progressão de doenças periodontais neste grupo de risco. Desta forma,
parece importante determinar o impacto do DM tipo 2, forma mais frequente de DM, no
perfil de biomarcadores relacionados às Treg e Th17 em lesões de periodontite crônica,
tipo mais comum de periodontite entre a população adulta.
21 2. PROPOSIÇÃO
O objetivo do presente estudo foi avaliar, por meio de PCR quantitativo, a expressão de
genes relacionados às respostas Th17 e Treg (IL-10, IL-17, IL-23, IL-6, TNF-α, TGF-β,
FOXP3 e RORC2) em sítios com periodontite crônica avançada em diabéticos tipo 2
com pobre (HbA1c > 8%) e melhor (HbA1c ≤ 8%) controle glicêmico.
22 3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. População estudada
Foram selecionados 60 sujeitos (gênero masculino ou feminino, idade mínima de 35
anos e máxima de 60 anos) das clínicas de periodontia dos cursos de graduação ou pósgraduação da Universidade Guarulhos, de janeiro à julho de 2010. Trinta indivíduos
eram diabéticos tipo 2 com PC, sendo 15 deles com HbA1c > 8% e 15 com HbA1c ≤
8% (ver item, Avaliação da taxa de HbA1c). Quinze indivíduos eram não-diabéticos
com PC e 15 não-diabéticos sem periodontite. Para que o total de 60 sujeitos fosse
obtido, 357 indivíduos foram triados. Os indivíduos que preencheram os critérios de
inclusão descritos abaixo foram convidados para participar do estudo. Todos os
participantes foram informados verbalmente e por escrito, por uma pessoa não
envolvida no estudo, sobre os objetivos, riscos e benefícios dos procedimentos a que
seriam submetidos. Os pacientes que concordaram em participar do estudo assinaram
um Termo de Consentimento Livre e Esclarecido, estando de acordo com as diretrizes e
normas do Conselho Nacional de Saúde (Resolução n° 196/96). O estudo em questão
foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa em seres humanos da Universidade
Guarulhos (Parecer 186/ 2009 - Anexo 1).
3.2. Critérios de inclusão/exclusão gerais
Foram excluídos os indivíduos fumantes, grávidas, lactantes, obesos (IMC ≥ 30 kg/m2
e/ou circunferência da cintura > 102 cm para homens e > 88 para mulheres), bem como
os que apresentassem doenças sistêmicas (osteoporose, desordens imunológicas,
hepatite, etc.) que pudessem influenciar na progressão das doenças periodontais. Foram
excluídos também os sujeitos que tivessem recebido qualquer tratamento para
periodontite nos últimos 12 meses ou tinham feito uso de qualquer tipo de antibióticos
sistêmicos nos últimos 6 meses. Uso de corticóides, antinflamatórios não-esteróides,
drogas imunossupressoras, estrógeno e moduladores dos receptores de estrógeno,
alentronato e calcitonina durante os 6 meses anteriores ao estudo também foram
considerados fatores de exclusão. Foram excluídos ainda indivíduos que relatarem,
durante a anamnese, fazer uso contínuo de enxaguatórios contendo antimicrobianos (por
exemplo, clorexidina, óleos essenciais, cloreto cetilpiridíneo e triclosan) nos últimos 2
meses. Não foram incluídos indivíduos portadores de aparelhos ortodônticos.
23 3.3. Critérios de inclusão e exclusão específicos
Indivíduos com PC: Os indivíduos eram portadores de periodontite crônica
generalizada, baseado nos critérios adotados pela Academia Americana de Periodontia
(Armitage, 1999). Os mesmos deveriam apresentar um número mínimo de 15 dentes,
excluindo terceiros molares, e mais que 30% dos sítios com PS e nível clínico de
inserção (NCI) ≥ 4mm. Os sujeitos portadores de periodontite deveriam ter ainda pelo
menos um elemento dental indicado para extração por motivo de periodontite avançada
[PS e concomitante NCI ≥ 7mm com sangramento à sondagem (SS), mobilidade grau II
ou III, envolvimento de bifurcações grau II avançada ou grau III; ver item, Coleta de
tecido gengival].
Indivíduos diabéticos: Os diabéticos deveriam ser portadores de DM tipo 2 por no
mínimo 5 anos, diagnosticada previamente por um médico e teste de tolerância oral à
glicose e, poderiam fazer controle de dieta, uso de hipoglicemiantes (metformina ou
glibenclamida). Só foram incluídos diabéticos mediante autorização médica para os
tratamentos propostos.
Indivíduos sem PC: Os indivíduos sem periodontite deveriam apresentar índice de
sangramento marginal (SM) e à sondagem de boca-total < 20% e não poderiam
apresentar nenhum sítio com PS e NCI > 3mm. Os mesmos deveriam apresentar ainda
indicação para gengivoplastia. em pelo menos um dente anterior por motivo estético.
3.4. Exames de HbA1c e glicemia em jejum
Os sujeitos diabéticos realizaram exame sanguíneo no Laboratório de Análises Clínicas
da Universidade Guarulhos para obtenção da taxa de HbA1c e glicemia em jejum. Essa
medida foi feita pelo método da cromatografia líquida de alta eficiência e expressa em
porcentagem. Os indivíduos foram subsequentemente categorizados em HbA1c > 8% e
HbA1c ≤ 8%. A glicemia em jejum foi obtida pelo método da oxidase de glicose e
expressa em mg/dl.
3.5. Avaliação clínica periodontal
A avaliação clínica foi realizada em todos os dentes por meio de sondas periodontais
manuais (Carolina do Norte, Hu-friedy, Co Inc. Chigago IL) por um mesmo examinador
treinado e calibrado (aluno de doutorado). A calibração foi baseada na metodologia
24 proposta por Araujo et al. (2003) para obtenção do erro padrão da medida. A
variabilidade intra-examinador foi 0,20 mm para PS e 0,21 para NCI. Os parâmetros
dicotômicos como SS e supuração (SUP) foram calculados pelo teste Kappa-Light e a
concordância intra-examinador foi > 85%.
Os seguintes parâmetros clínicos foram avaliados em 6 sítios por dente (mesiovestibular,
médio-vestibular,
disto-vestibular,
mesio-lingual/palatino,
médio-
lingual/palatino, disto-lingual/palatino): Índice de placa visível (IPV) (Ainamo & Bay,
1975): Presença ou ausência de placa supragengival visível passando a sonda
periodontal; PS: Distância, em milímetros, entre a margem gengival livre e a porção
mais apical do sulco/bolsa periodontal; NCI: Distância, em milímetros, entre a junção
amelocementária e a porção mais apical do sulco/bolsa periodontal; SS: Presença ou
ausência de sangramento até 20 segundos após sondagem com a sonda milimetrada;
SM (Ainamo & Bay, 1975): Presença ou ausência de sangramento da gengiva marginal
após percorrer levemente o margem gengival com a sonda periodontal; SUP: Presença
ou ausência de supuração espontânea ou em até 20 segundos após a sondagem
periodontal.
O objetivo deste exame clínico foi traçar um perfil da condição periodontal da
população a ser estudada bem como dos sítios de coletas de tecidos gengivais. Os
indivíduos realizaram exame radiográfico periapical de arcos completos na Clínica de
Radiologia da Universidade Guarulhos para complementação do exame clínico e
diagnóstico de saúde periodontal ou periodontite.
3.6. Grupos experimentais
De acordo com o exame clínico periodontal e exame de HbA1c, os indivíduos foram
divididos em um dos seguintes grupos experimentais:
Grupo 1 - Não-diabéticos sem PC (n=15): Indivíduos não-diabéticos que não
apresentassem sítios com perda de inserção e concomitante PS > 3 mm e que
apresentassem < 20% dos sítios com SS ou SM.
Grupo 2 - Não-diabéticos com PC (n=15): Indivíduos não-diabéticos com mais de 30%
dos sítios com PS e NCI > 4mm e pelo menos um dente com indicação de exodontia por
motivo de periodontite avançada.
25 Grupo 3 - Diabético tipo 2 com HbA1c ≤ 8% e PC (n=15): Indivíduos diabéticos tipo 2
com níveis de HbA1c ≤ 8%, mais de 30% dos sítios com PS e NCI ≥ 4mm e pelo menos
um dente com indicação de exodontia por motivo de periodontite avançada.
Grupo 4 - Diabéticos tipo 2 com HbA1c > 8% e PC (n=15): Indivíduos diabéticos tipo 2
com níveis de HbA1c > 8%, mais de 30% dos sítios com PS e NCI ≥ 4mm e pelo menos
um dente com indicação de exodontia por motivo de periodontite avançada.
3.7. Coletas de biópsias de tecido gengival
Biópsias de tecido gengival foram coletadas para análise de expressão gênica dos
diferentes marcadores e fatores de transcrição de acordo com os seguintes critérios:
Biópsias sem PC (grupo 1): Regiões sem perda de inserção clínica, SM e SS indicados
para gengivoplastia. O tecido saudável ao redor de um dente foi obtido por indivíduo.
Biópsias com PC (grupo 2, 3 e 4): Com objetivo de obter biópsia de uma área
representativa do processo inflamatório periodontal, o tecido gengival foi removido ao
redor de dentes com periodontite avançada (PS e concomitante NCI ≥ 7mm com SS),
indicados para exodontia. O tecido ao redor de um dente foi obtido por indivíduo com
periodontite. Se o paciente apresentasse mais de um dente com essas características, a
biópsia de apenas um dente com o pior diagnóstico foi obtida.
Todas as amostras incluíam o epitélio oral, juncional e sulcular e o tecido conjuntivo
gengival. As biópsias coletadas foram acondicionadas em uma solução para evitar a
degradação do RNA (RNAlater®, Ambion Inc., Austin, TX, USA), resfriadas a 4ºC por
24 horas e congeladas a -20ºC para posterior avaliação por meio do PCR quantitativo.
3.8. Tratamento periodontal
Com o objetivo de contemplar os aspectos éticos, todos os sujeitos da pesquisa
receberam tratamento periodontal. Os indivíduos periodontalmente saudáveis receberam
uma profilaxia e a gengivoplastia. Os sujeitos com periodontite receberam inicialmente
uma adequação do meio bucal (selamento de cavidades dentárias abertas, remoção de
restaurações e próteses em excesso, exodontias, remoção de cálculo supragengival,
instruções de higiene bucal e instalação de próteses provisórias). Em seguida, os
mesmos receberam raspagem e alisamento radicular com curetas manuais e ultrassom.
26 Os indivíduos foram engajados em um programa de manutenção periodontal, onde
foram realizadas novas raspagens subgengivais quando necessárias. Outras necessidades
odontológicas foram encaminhadas para as clínicas de graduação e pós-graduação da
Universidade Guarulhos.
3.9. Avaliação da expressão gênica:
Todos os procedimentos foram realizados no Laboratório de Pesquisa em Odontologia
II da Universidade Guarulhos.
Extração do RNA: Após descongelar as amostras, o RNA total foi isolado pelo método
do reagente TRIZOL (Gibco BRL, Life Technologies, Rockville, MD, USA).
Primeiramente, a solução de RNA later foi aspirada e o tecido, acondicionado em
nitrogênio líquido, foi triturado. A amostra triturada foi então colocada no reagente
TRIZOL, agitado por 30 segundos e incubada por 5 minutos em temperatura ambiente.
Após esse período, foi adicionado clorofórmio (Sigma, St. Louis, MO, USA), agitado e
centrifugado a 10.000 rpm por 15 minutos em uma temperatura de 4oC. A porção
aquosa foi transferida para um outro tubo ao qual foi adicionado isopropanol, agitado,
incubado por 20 minutos a uma temperatura de -20oC e centrifugado da mesma maneira
acima descrita. Finalizado esse processo, foi formado um pellet que foi lavado com
etanol gelado a 75% e seco em temperatura ambiente. As amostras de RNA foram resuspensas em aproximadamente 50µl de água tratada com dietilpirocarbonato (DEPC) e
armazenadas a -80oC. A concentração de RNA foi determinada por meio de um
espectrofotômetro.
Tratamento com DNAase: As amostras de RNA total foram tratadas para a eliminação
de qualquer resíduo de DNA (DNA-free™, Ambion Inc., Austin, TX, USA), conforme
recomendação do fabricante. Nos microtubos contendo o RNA, foram adicionados o
tampão e o turbo DNAase baseado na concentração de RNA determinada pelo
espectrofotômetro.
Após agitação e centrifugação, os mesmos permaneceram em
banho-maria a 37ºC por 30 minutos. Finalmente, foi acrescentado o inativador e a
solução foi agitada e centrifugada. A concentração de RNA foi novamente quantificada
por meio de um espectrofotômetro.
27 PCR quantitativo (Real-time PCR):
Transcrição reversa: 1µg da amostra de RNA livre de DNA foi utilizado para a síntese
de 20 µl de cDNA. Para isto, as reações foram realizadas utilizando-se o kit first-strand
cDNA synthesis (Roche Diagnostic Co., Indianápolis, IN, USA), seguindo as
recomendações do fabricante para um volume final de 45 µl (2.25 µg de RNA)
necessário para “corridas” de PCR dos 8 genes estudados e gene de referência. As
amostras foram incubadas por 10 minutos a 25oC e por 60 minutos a 42oC. Concluído o
segundo ciclo de incubação, as amostras foram incubadas por 5 minutos a 99oC e então
por 5 minutos a 4 oC para resfriamento. Os reagentes utilizados e suas respectivas
concentrações foram: solução tampão (1x), MgCl2 (5mM), mistura de deoxinucleotídeos
(1mM), “primers” randomizados - p[dN]6 (3,2µg), inibidor de Rnase (50U), e
transcriptase reversa – AMV (20U).
Desenho dos primers: Os primers para glicerol-3-fosfato desidrogenase (GAPDH, gene
de referência), IL-17, IL-6, IL-23, IL-10, TNF-α, TGF-β, FOXP3 e RORC2 foram
desenhados com o auxílio de um programa desenvolvido especificamente para desenhar
primers para o LightCycler (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany) (Tabela
1).
28 Tabela 1 – Sequência de primers, perfil de amplificação e tamanho do produto de PCR
estimado para cada gene.
Gene
Sequência (5’- 3’)
Perfil de amplificação
Tamanho
[temperatura
do produto
o
( C)/tempo (s)]
(bp)
IL-10
GCCTACATGACAATGAAGATACG
95/10, 56/5, 72/6
151
IL-17
GGTTTGACTGAGTACCAATTTGC
95/10, 56/5, 72/7
172
IL-23
CTGGGAGACTCAGCAGATTC
95/10, 56/7, 72/6
151
IL-6
GCAGGACATGACAACTCATC
95/10, 56/5, 72/6
159
TNF-α
CATCCAACCTTCCCAAACG
95/10, 56/5, 72/6
159
TGF-β
GCAACAATTCCTGGCGATAC
95/10, 56/10, 72/7
181
FOXP3
TTCATCTGTGGCATCATCCG
95/10, 56/7, 72/6
151
RORC2
GCACCCTACCCTTTACCTG
95/10, 56/10, 72/6
159
GAPDH
CTGAGTACGTCGTGGAGTC
95/10, 56/5, 72/7
187
IL: Interleucina; TNF-α: fator de necrose tumoral; TGF-β: fator de transformação do
crescimento; FOXP3: fator de transcrição forkhead box P3; RORC2: fator nuclear
orphan do receptor 2; GAPDH: glicerol-3-fosfato desidrogenase.
Otimização das reações: A eficiência das reações para cada primer foi otimizada
anteriormente ao início das reações propriamente ditas. Concentrações variando de 2 a
5mM de MgCl2 e de 0,2 a 0,5µM de cada primer foram utilizadas para determinar em
quais condições a reação teve a melhor eficiência, conforme sugestões do fabricante do
equipamento.
Reações de PCR: As reações de PCR foram realizadas com o sistema Light Cycler
(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany), por meio do kit Fast Start DNA
Master SYBR Green I (Roche Diagnostic Co., Indianápolis, IN, USA). O perfil das
reações foi determinado seguindo a fórmula sugerida pelo fabricante do equipamento.
Para cada uma das “corridas”, a água DEPC foi utilizada como controle negativo, e o
produto das reações foi quantificado utilizando o programa do próprio fabricante
(LightCycler Relative Quantification Software - Roche Diagnostics GmbH, Mannheim,
Germany). GAPDH foi utilizado como o gene de referência para a normalização dos
29 valores o obtenção da quantificação relativa por meio de do programa cedido pelo
próprio fabricante.
3.10. Análises Estatísticas
Para todas as avaliações foi adotado um nível de significância de 5%. Os dados foram
submetidos a um teste de normalidade de Kolmogorov-Smirnov para escolha de
métodos paramétricos ou não-paramétricos. Foram obtidas médias das porcentagens de
IPV, SS, SUP e das medidas PS e NCI para cada dente e, em seguida, para cada
indivíduo e grupos experimentais. As diferenças nos parâmetros clínicos periodontais
(boca-total e sítios de coletas) e idade entre os grupos experimentais foram comparadas
pela ANOVA. Em casos onde foram detectadas diferenças entre os grupos pela
ANOVA, o teste de Tukey foi utilizado para comparação entre grupos. As diferenças
nos níveis de RNAm entre os grupos experimentais foram comparadas pelo teste de
Kruskal-Wallis. Em casos onde foram detectadas diferenças entre os grupos pelo teste
de Kruskal-Wallis, o teste de Dunn foi utilizado para comparação entre dois grupos. A
frequência de detecção de cada gene entre os grupos foi comparada pelo teste Exato de
Fisher. As diferenças entre os parâmetros glicêmicos e duração do DM entre os grupos
diabéticos (grupos 3 e 4) foram comparadas pelo teste t. Ajustes para comparações
múltiplas foram realizados para comparação dos níveis de RNAm para 8 biomarcadores
em uma mesma amostra. Resumidamente, um p de 0,05=1-(1-k)8 foi computado, onde k
foi o valor de p individual desejado para a presente análise. Desta forma, para as
comparações da expressão gênica dos biomarcadores, um valor de p <0,006 foi
considerado significante.
30 4. RESULTADOS
4.1. Resultados clínicos e demográficos
A tabela 2 apresenta as características demográficas e os parâmetros clínicos da
população estudada. Não houve diferenças entre os grupos para a média de idade e a
distribuição de gêneros (p>0,05). Como esperado, os níveis de todos os parâmetros
clínicos foram menores nos indivíduos sem PC (grupo 1) quando comparado aos grupos
com PC (grupo 2, 3 e 4) tanto em nível de boca-total como dentes coletados (p<0,05). O
grupo de diabéticos com HbA1c > 8% (grupo 4) apresentou um maior IPV quando
comparado aos demais grupos (grupos 2 e 3) com PC (p<0,05). Ambos grupos
diabéticos com PC (grupos 3 e 4) demonstraram maiores médias de PS em nível de
boca-total quando comparados aos não-diabéticos com PC (grupo 2; p<0,05).
31 Tabela 2 – Características demográficas e parâmetros clínicos (média ± DP) da
população estudada.
Grupo 1
(n=15)
Grupo 2
(n=15)
Grupo 3
(n=15)
Grupo 4
(n=15)
Idade (anos)
42,2 ± 6,3
49,0 ± 5,8
47,1 ± 6,8
48,3 ± 9,1
M/F
6/9
7/8
8/7
7/8
HbA1c (%)
___
___
7,1 ± 0,7*
11,5 ± 2,3
*
Glicemia em jejum (mg/dl)
___
___
128,8 ± 23,9
Duração DM (anos)
___
___
6,0 ± 0,5
6,2 ± 0,7
(n)
___
___
2
3
Dieta + Agentes
hipoglicemiantes orais (n)
___
___
13
12
Boca-total
12,1 ± 7,2 a
61,0 ± 12,4 b
60,8 ± 13,3 b
76,2 ± 12,1 c
Dentes coletados
5,7 ± 2,2 a
62,0 ± 18,0 b
64,9 ± 31,8 b
81,0 ± 29,6 c
Boca-total
2,4 ± 3,9a
46,7 ± 17,1b
45,3 ± 23,6 b
56,3 ± 24,9b
Dentes coletados
0a
67,6 ± 4,0 b
73,1 ± 28,4 b
61,0 ± 36,9 b
Boca-total
0a
3,3 ± 5,2 b
2,9 ± 7,4 b
3,1 ± 6,3 b
Dentes coletados
0a
9,1 ± 7,3 b
7,9 ± 17,0 b
14,0 ± 21,0 b
Boca-total
2,1 ± 0,5 a
3,4 ± 0,6 b
3,7 ± 0,7 c
3,7 ± 0,6 c
Dentes coletados
3,6 ± 0,5 a
6,6 ± 0,6b
6,5 ± 0,9 b
6,9 ± 0,6 b
Boca-total
2,1 ± 0,4 a
4,3 ± 0,8 b
4,3 ± 1,0 b
4,4 ± 0,9 b
Dentes coletados
2,3 ± 0,2 a
8,0 ± 1,6 b
7,7 ± 1,3 b
8,3 ± 2,5 b
222,4 ± 71,1
Tratamentos de DM
Dieta
IPV
(%)
SS
(%)
SUP
(%)
PS
(mm)
NCI
(mm)
* Diferenças significativas entre os grupos 3 e 4 (teste t; p<0,05).
Letras diferentes indicam diferenças significativas entre os grupos (ANOVA e teste de
Tukey; p<0,05).
Grupo 1: Não-diabéticos sem periodontite crônica (PC); Grupo 2: Não-diabéticos com
PC; Grupo 3: Diabéticos tipo 2 com HbA1c ≤ 8% e PC; Grupo 4: Diabéticos tipo 2
com HbA1c > 8% e PC; M: masculino; F: feminino; HbA1c: hemoglobina glicada;
DM: diabetes melito; IPV: índice de placa visível; SS: sangramento à sondagem; SUP:
supuração; PS: profundidade de sondagem; NCI: nível clínico de inserção.
32 4.2. Resultados de expressão gênica
A tabela 3 apresenta os resultados de expressão gênica para todos os biomarcadores
estudados. As biópsias dos grupos portadores de PC (grupos 2, 3 e 4) apresentaram
maiores níveis de RNAm para IL-17 quando comparado ao grupo 1 (p<0,05).
Tabela 3 – Médias (± DP) dos níveis de RNAm para os genes estudados relativo aos
níveis de RNAm para GAPDH.
Gene/GAPDH
Grupo 1 (n=15)
Grupo 2 (n=15)
Grupo 3 (n=15)
Grupo 4 (n=15)
IL-10 (x10-3)
2.41 (± 2.68)
12.85 (± 26.51)
7.04 (± 10.54)
4.44 (± 5.47)
IL-17 (x10-3)
0.03 (± 0.07)a
1.39 (± 2.72)b
1.66 (± 2.86)b
0.44 (± 0.63)b
IL-23 (x10-1)
0.56 (± 1.00)
3.63 (± 5.27)
2.35 (± 3.68)
1.83 (± 2.86)
IL-6 (x10-1)
2.38 (± 2.14)
11.30 (±12.87)
17.62 (±23.71)
8.64 (± 11.98)
TNF-α (x10-3)
0.50 (± 0.63)
2.21 (± 2.64)
2.51 (± 5.15)
2.52 (± 4.96)
TGF-β (x10-1)
0.00 (± 0.12)
0.11 (± 0.15)
0.42 (± 0.97)
0.88 (± 2.58)
FOXP3
0.95 (± 2.84)
1.24 (± 2.10)
0.87 (± 1.66)
0.98 (± 2.63)
RORC2 (x10-1)
0.15 (± 0.23)
1.67 (± 2.88)
1.02 (± 1.94)
0.65 (± 1.11)
Letras diferentes indicam diferenças significativas entre os grupos (teste de KruskalWallis e teste de Dunn; p<0,05).
Grupo 1: Não-diabéticos sem periodontite crônica (PC); Grupo 2: Não-diabéticos com
PC; Grupo 3: Diabéticos tipo 2 com HbA1c ≤ 8% e PC; Grupo 4: Diabéticos tipo 2 com
HbA1c > 8% e PC; IL: Interleucina; TNF-α: fator de necrose tumoral; TGF-β: fator de
transformação do crescimento; FOXP3: fator de transcrição forkhead box P3; RORC2:
fator nuclear orphan do receptor 2; GAPDH: glicerol-3-fosfato desidrogenase.
33 A figura 1 ilustra as porcentagens de amostras de tecido gengival que apresentavam
RNAm de cada um dos biomarcadores estudados. As frequências de amostras positivas
para RNAm de TGF-β, IL-10, IL-23, IL-6, TNF-α e FOXP3 foram similares entre os
grupos (p>0,05). A frequência de biópsias RNAm-positivas para IL-17 foi maior nos
grupos com PC (grupos 2, 3 e 4) em relação aos grupo sem periodontite (grupo 1;
p<0,05). Houve uma maior frequência de detecção de RNAm para RORC2 nas biópsias
dos diabéticos (grupos 3 e 4) quando comparado aos grupos não-diabéticos (grupos 1 e
2; p<0.05). A presença de RNAm para IL-6, IL-10 e TNF-α foi detectada em todas as
amostras, independente da condição periodontal ou glicêmica.
34 Figura 1 - Porcentagens de biópsias de tecido gengival positivas para cada um dos
biomarcadores.
100
!""#"$
%
100
%
!""#"$
IL-10
100
!""#"$
100
!""#"$
100
!""#"$
100
80
+)#)%
'"#"$
60
")#)%
&"#"$
40
!)#)%
20
*)#)%
60
46.7
!"#$%
40
0
"#"$
)*+$ 1 GRUPO
)+,*$ 2 GRUPO
-,,*$ 3 GRUPO
*,,*$ 4
GRUPO
%%
100
!""#"$
100
!""#"$
IL-23
93.3
%&#&$
100
!""#"$
100
!""#"$
0
)#)%
100
!""#"$
*"#"$
80
("#"$
80
)"#"$
60
'"#"$
60
40
("#"$
&"#"$
40
20
'"#"$
%"#"$
20
0
"#"$
GRUPO
+,-$ 1 GRUPO
+-.,$ 2 GRUPO
/..,$ 3 GRUPO
,..,$ 4
!""#"$
100
b
b
100
())#)%
%% 100
!""#"$
TNF-!
100
!""#"$
100
!""#"$
100
!""#"$
b
GRUPO
1 GRUPO
3 GRUPO
,-.%
,./-% 2 GRUPO
0//-%
-//-% 4
%% 100
!""#"$
0
"#"$
100
100
!""#"$
IL-6
'("($
'"#"$
60
!("($
&"#"$
40
*("($
20
)("($
100
!""#"$
TGF-"
%%
80
80
100
!""#"$
GRUPO
)*+$ 1 GRUPO
)+,*$ 2 GRUPO
-,,*$ 3 GRUPO
*,,*$ 4
&%"%$
93.3
+(("($
("#"$
66.7
!!"#$
80
'("($
73.3
#%"%$
60
40
20
%"#"$
0
"#"$
GRUPO
)*+$ 1 GRUPO
)+,*$ 2 GRUPO
-,,*$ 3 GRUPO
*,,*$ 4
0
("($
FOXP3
%
%
100
86.7
!"#$%
!"#$%
86.7
!&#&%
80
86.7
!"#$%
GRUPO
,-.$ 1 GRUPO
,./-$ 2 GRUPO
0//-$ 3 GRUPO
-//-$ 4
RORC2 100
%
80
!&#&%
%(#($
80
&(#($
60
(&#&%
40
40
'&#&%
20
)(#($
20
*(#($
GRUPO
*+,% 1 GRUPO
*,-+% 2 GRUPO
.--+% 3 GRUPO
+--+% 4
'((#($
'((#($
100
"&#&%
60
0
93.3
&'#'%
a
20
%"#"$
&#&%
93.3
&'#'%
80
("#"$
)&&#&%
IL-17
%
%
())#)%
0
(#($
100
'((#($
86.7
%&#!$
73.3
!"#"$
b
c
c
a
GRUPO
+,-$ 1 GRUPO
+-.,$ 2 GRUPO
/..,$ 3 GRUPO
,..,$ 4
Letras diferentes indicam diferenças significativas entre os grupos (teste Exato de
Fisher; p<0,05).
Grupo 1: Não-diabéticos sem periodontite crônica (PC); Grupo 2: Não-diabéticos com
PC; Grupo 3: Diabéticos tipo 2 com HbA1c ≤ 8% e PC; Grupo 4: Diabéticos tipo 2 com
HbA1c > 8% e PC; IL: Interleucina; TNF-α: fator de necrose tumoral; TGF-β: fator de
transformação do crescimento; FOXP3: fator de transcrição forkhead box P3; RORC2:
fator nuclear receptor 2 orphan; GAPDH: glicerol-3-fosfato desidrogenase.
35 5. DISCUSSÃO
É evidente a escassez de estudos científicos que objetivaram avaliar o papel das células
Th17 e Treg e seus fatores relacionados na PC, especialmente em grupos de riscos como
os indivíduos diabéticos. Assim, este estudo avaliou os níveis de RNAm de oito
biomarcadores, incluindo citocinas e fatores relacionados a transcrição, envolvidos na
resposta Th17 e Treg, em sítios com PC de pacientes diabéticos tipo 2 apresentando
controles glicêmicos mais e menos favoráveis. Em geral, os resultados demonstraram
que a expressão de IL-17, um importante marcador pró-inflamatório da resposta Th17,
foi maior nas biópsias com PC independente da presença de DM ou do estado
glicêmico. Estes achados sugerem que a presença de PC sobrepõe qualquer efeito da
hiperglicemia na expressão deste gene pró-inflamatório.
O reconhecimento dos padrões associados aos patógenos por receptores celulares
específicos desencadeia diversos mecanismos antimicrobianos da resposta imune inata,
incluindo a liberação de várias citocinas pró-inflamatórias, como TNF-α e IL-6 (Takeda
et al. 2005, Albiger et al. 2007). No presente estudo, os níveis das citocinas próinflamatórias TNF-α e IL-6 foram semelhantes entre os grupos. Estes resultados são
contrários a estudos anteriores (Duarte et al. 2007b, Cole et al. 2008, Venza et al. 2010)
que demonstraram que a presença de DM aumentou a expressão de genes ou de níveis
de proteína de TNF-α e IL-6 ao redor dos tecidos periodontais. De acordo com os
presentes resultados, Cole et al. (2008) não encontraram diferenças nos níveis de
RNAm para TNF-α entre os indivíduos diabéticos tipo 2 e não-diabéticos com PC e
controle saudável. No entanto, os autores observaram um aumento da expressão de IL-6
no tecido gengival de indivíduos diabéticos tipo 2 com PC. Vários fatores poderiam
explicar os resultados conflitantes entre os estudos, incluindo diferenças entre as
técnicas utilizadas para detecção dos mediadores, o momento de coleta da biópsia, a
duração e gravidade da PC e DM, os tipos de tratamento para DM e história prévia de
tratamento periodontal. Duarte et al. (2007b) e Cole et al. (2008), por exemplo, não
subdividiram os diabéticos de acordo com os níveis de HbA1c. Cole et al. (2008)
avaliaram um número reduzido de amostras, apenas 7 biópsias de diabéticos com
periodontite. Duarte et al. (2007b) utilizaram ELISA, e não PCR quantitativo, para
avaliação de IL-6. Além disso, os autores não relataram os níveis de HbA1c e os
possíveis tratamentos para o DM dos indivíduos estudados. Venza et al. (2010), por sua
36 vez, embora tenha utilizado PCR quantitativo e classificado os indivíduos em bom e
precário controle glicêmico, obtiveram amostras de sítios indicados para cirurgia
periodontal anti-infecciosa. Isso refletiu em níveis de PS e NCI inferiores aos dos sítios
de coletas do presente estudo. Além disso, é importante ressaltar que os diabéticos nãocontrolados incluídos no estudo de Venza et al. apresentavam complicações sistêmicas
do DM e as médias de HbA1c não foram apresentadas.
A resposta imune inata inicia o desenvolvimento de uma imunidade adaptativa de longa
duração através dos linfócitos B e T. Resumidamente, as células T CD4+ podem se
diferenciar em fenótipos de células Th1, Th2 e Th17, com perfis distintos de citocinas e
funções, ou na linhagem T Treg, com funções supressoras (Fietta & Delsante 2009).
Linfócitos Th1 e Th17 comandam respostas inflamatórias destrutivas e, funcionalmente,
antagonizam as células protetoras Th2 e Treg, respectivamente. As citocinas próinflamatórias IFN-γ e IL-17 são mediadores chaves das respostas Th1 e Th17,
respectivamente, enquanto que IL-4 e IL-10 são citocinas Th2 com propriedades antiinflamatórias. Células Treg exercem suas funções de regulação por meio da alta
expressão de citocinas supressoras, incluindo IL-10 e TGF-β. FOXP3 e RORC2 são
fatores de transcrição essenciais para o desenvolvimento e a função de Tregs e as
células Th17, respectivamente. A citocina IL-23 desempenha um papel na estabilização
da linhagem Th17 e expansão da resposta Th17. O TGF-β, por sua vez, regula FOXP3 e
gera as células Treg (Fietta & Delsante 2009). No entanto, quando uma infecção é
estabelecida, a presença de IL-6, produzida durante a resposta imune inata, inibe a
geração das células Treg e induz a diferenciação das células Th17 na presença de TGFβ (Bettelli et al. 2006). Recentemente, o papel das respostas Th1/Th2 como primordial
na periodontite foi reconsiderado e, as respostas Th17/Treg foram identificadas como
importantes na progressão das doenças periodontais (Dutzan et al. 2009, Ohyama et al.
2009, Cardoso et al.2009, Nakajima et al. 2005, Cardoso et al. 2008). Neste estudo, das
moléculas envolvidas nas respostas acima, somente a expressão e a frequência de IL-17
foram maiores nos tecidos doentes, quando comparados aos saudáveis. Estes resultados
suportam a hipótese sugerida recentemente por Zhao et al. (2011) de que células Th17
mais linfócitos Th1 podem desempenhar um papel mais destrutivo na PC. Além disso,
neste estudo, foi demonstrado que a expressão de IL-17 é fundamental para PC,
independente do desafio do DM. Estudos anteriores também observaram níveis
elevados de IL-17 em lesões de periodontite, quando comparado aos sítios saudáveis
37 (Ohyama et al. 2009, Cardoso et al.2009, Takahashi et al. 2005, Vernal et al. 2005).
Corroborando os presentes resultados, Dutzan et al. (2009) não encontraram diferenças
na expressão de RORC2 entre lesões de periodontite ativas e inativas. Digno de nota é
que todas as biópsias de indivíduos diabéticos expressaram RORC2 e que a frequência
de expressão deste fator de transcrição, que é essencial para diferenciação das células
Th17, foi maior em ambos os grupos diabéticos. Embora as expressões de IL-17 e
RORC2 não foram mais elevadas nos tecidos dos diabéticos, estes resultados podem
sugerir um possível papel da resposta Th17 na periodontite relacionadas com DM. Um
estudo recente (Ribeiro et al. 2011) demonstrou, por meio de ELISA, que o fluido
gengival de indivíduos com DM tipo 2 apresentaram níveis mais elevados IL-17 e IL23, quando comparados aos indivíduos não-diabéticos. Além disso, diabéticos
descompensados apresentaram níveis de IL-17 mais altos que diabéticos compensados e
não-diabéticos. Posteriormente, foi também demonstrado que o número de células
FOXP3+ e IL-17+ foi maior em indivíduos diabéticos tipo 2, quando comparados aos
não-diabéticos (Duarte et al. 2011). Desta forma, baseado na diferenças existentes entre
os achados dos níveis de RNAm e proteicos de um determinado mediador
imunoinflamatório, parece que o processo de transcrição do RNAm para a síntese final,
atividade e detecção de proteínas na periodontite não é essencialmente congruentes
entre os estudos.
É importante destacar que estudos desta natureza constituem passos iniciais para a
sugestão de estratégias imunoregulatórias capazes de modular a resposta do hospedeiro,
maximizando seu efeito protetor e minimizando seus efeitos destrutivos nos diferentes
tecidos. Existem muitos exemplos de terapias voltadas para diversas doenças que foram
possíveis de serem desenvolvidas após o entendimento dos mecanismos moleculares
que regem a patogênese das mesmas. Diante do conhecimento das funções das células
Th17 e Treg no processo imunoinflamatório, estudos têm sugerido que a inibição da IL17, por meio de agentes anti-IL-17, seja capaz de reduzir os sinais e sintomas
relacionados à artrite reumatóide, agindo também na diminuição de citocinas próinflamatórias (ex. IL-6, IL-1β e RANKL) (Lubberts et at. 2005, Yago et al. 2007, van
den Berg & Miossec 2009). Neste mesmo contexto, Rohn et al. (2006) avaliaram os
efeitos do
bloqueio da IL-17 em camundongos imunizados por meio do uso de
partículas virais conjugadas com recombinante da IL-17, revelando que esta estratégia
terapêutica é capaz de reduzir a incidência e progressão de patologias como artrite e
38 doenças autoimunes como encefalomielite.
Tendo em vista o papel da IL-23 na
manutenção e sobrevivência das células Th17, também foi relatado que agentes anti-IL23 atenuam os sintomas da artrite induzida por colágeno, prevenindo a inflamação e
destruição óssea em ratos (Yago et al. 2007). Adicionalmente, a indução e/ou expansão
da função de células Treg podem ter um papel positivo na modulação da resposta
imunoinflamatória (Hansen et al. 2008, Kelchtermans et al. 2009). Desta forma, a
utilização de tratamentos direcionados à modulação da resposta imunoinflamatória
poderia, futuramente, ser considerado como uma abordagem terapêutica adjunta a
terapia anti-infecciosa, podendo ser uma estratégia mais efetiva no controle da PC,
especialmente em pacientes de risco, como os diabéticos.
Em suma, a PC, independente do DM, afetou significativamente a expressão gênica de
IL-17, citocina pró-inflamatória relacionada à resposta Th17. No entanto, é importante
considerar que os níveis de RNAm nem sempre predizem os níveis de proteínas.
Portanto, análises complementares em biópsias teciduais e fluido gengival, incluindo a
caracterização dos fenótipos celulares, imunohistoquímica e ELISA, poderiam ser
realizadas em associação com as análises de expressão gênica. A correlação direta entre
os níveis de RNAm e de proteína poderia elucidar de maneira mais efetiva o papel de
cada um dos biomarcadores estudados na PC associada ao DM.
39 6. CONCLUSÕES
Sítios com PC avançada em diabéticos tipo 2, independente do estado glicêmico, não
apresentaram diferenças significativas na expressão de genes relacionados às respostas
Th17 e Treg, quando comparados aos indivíduos não-diabéticos.
40 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Aggarwal S, Ghilardi N, Xie MH, de Sauvage FJ, Gurney AL. Interleukin-23 promotes
a distinct CD4 T cell activation state characterized by the production of interleukin-17. J
Biol Chem. 2003; 278(3):1910-4.
Ainamo J, Bay I. Problems and proposals for recording gingivitis and plaque. Int Dent
J. 1975;25:229-35.
Allam JP, Duan Y, Heinemann F, Winter J, Götz W, Deschner J, Wenghoefer M,
Bieber T, Jepsen S, Novak N. IL-23-producing CD68(+) macrophage-like cells
predominate within an IL-17-polarized infiltrate in chronic periodontitis lesions. J Clin
Periodontol. 2011;38(10):879-86.
Albiger B, Dahlberg S, Henriques-Normark B, Normark S. Role of the innate immune
system in host defence against bacterial infections: focus on the Toll-like receptors. J
Intern Med 2007;261:511-528.
Aspriello SD, Zizzi A, Tirabassi G, Buldreghini E, Biscotti T, Faloia E, Stramazzotti D,
Boscaro M, Piemontese M. Diabetes mellitus-associated periodontitis: differences
between type 1 and type 2 diabetes mellitus. J Periodontal Res. 2011;46(2):164-9.
Araujo MW, Hovey KM, Benedek JR, Grossi SG, Dorn J, Wactawski-Wende J, Genco
RJ, Trevisan M. Reproducibility of probing depth measurement using a constant-force
electronic probe: analysis of inter- and intraexaminer variability. J Periodontol. 2003;
74:1736-1740.
Armitage GC. Development of a classification system for periodontal diseases and
conditions. Ann Periodontol. 1999;4:1-6.
Bandyopadhyay D, Marlow NM, Fernandes JK, Leite RS. Periodontal disease
progression and glycaemic control among Gullah African Americans with type2diabetes. J Clin Periodontol 2010;37(6):501-09.
Behfarnia P, Birang R, Andalib AR, Asadi S. Comparative Evaluation of IFNγ, IL4 and
IL17 Cytokines in Healthy Gingiva and Moderate to Advanced Chronic Periodontitis.
Dent Res J (Isfahan). 2010 Summer;7(2):45-50.
41 Beklen A, Ainola M, Hukkanen M, Gürgan C, Sorsa T, Konttinen YT. MMPs, IL-1,
and TNF are regulated by IL-17 in periodontitis. J Dent Res. 2007;86(4):347-51.
Bettelli E, Carrier Y, Gao W, Korn T, Strom TB, Oukka M, Weiner HL, Kuchroo VK.
Reciprocal developmental pathways for the generation of pathogenic effector TH17 and
regulatory T cells. Nature. 2006;441(7090):235-8.
Boyce BF, Li P, Yao Z et al. TNF-alpha and pathologic bone resorption. Keio J Med
2005;54:127-131.
Brownlee M. Glycosylation and diabetic complication. Diabetes 1994; 43: 836-841.
Bulut U, Develioglu H, Taner IL, Berker E. Interleukin-1 beta levels in gingival
crevicular fluid in type 2 diabetes mellitus and adult periodontitis. J Oral Sci.
200;43:171-177.
Campus G, Salem A, Uzzau S, Baldoni E, Tonolo G. Diabetes and periodontal disease:
a case–control study. J Periodontol 2005, 76, 418–425.
Cardoso CR, Garlet GP, Moreira AP, Júnior WM, Rossi MA, Silva JS. Characterization
of CD4+CD25+ natural regulatory T cells in the inflammatory infiltrate of human
chronic periodontitis. J Leukoc Biol. 2008;84(1):311-8.
Cardoso CR, Garlet GP, Crippa GE, Rosa AL, Júnior WM, Rossi MA, Silva JS.
Evidence of the presence of T helper type 17 cells in chronic lesions of human
periodontal disease. Oral Microbiol Immunol. 2009;24(1):1-6.
Chen L, Wei B, Li J, Liu F, Xuan D, Xie B, Zhang J. Association of periodontal
parameters with metabolic level and systemic inflammatory markers in patients with
type 2 diabetes J Periodontol 2010;81(3):364-71.
Cole CM, Sundararaj KP, Leite RS, et al. A trend of increase in periodontal interleukin6 expression across patients with neither diabetes nor periodontal disease, patients with
periodontal disease alone, and patients with both diseases. J Periodontal 2008;43:717722.
42 Correa FO, Gonçalves D, Figueredo CM, Gustafsson A, Orrico SR. The short-term
effectiveness of non-surgical treatment in reducing levels of interleukin-1beta and
proteases in gingival crevicular fluid from patients with type 2 diabetes mellitus and
chronic periodontitis. J Periodontol. 2008;79(11):2143-50.
Costa PP, Trevisan GL, Macedo GO, Palioto DB, Souza SL, Grisi MF, Novaes AB Jr,
Taba M Jr. Salivary interleukin-6, matrix metalloproteinase-8, and osteoprotegerin in
patients with periodontitis and diabetes. J Periodontol. 2010;81(3):384-91.
Darré L, Vergnes JN, Gourdy P, Sixou M. Efficacy of periodontal treatment on
glycaemic control in diabetic patients: A meta-analysis of interventional studies.
Diabetes Metab. 2008;34(5):497-506.
Dinarello CA. Biologic basis for interleukin-1 in disease. Blood. 1996; 15:2095-2147.
Dower SK, Sims JE, Cerretti DP, Bird TA. The interleukin-1 system: receptors, ligands
and signals. Chem Immunol. 1992; 51:33-64.
Duarte PM, de Oliveira MC, Tambeli CH, Parada CA, Casati MZ, Nociti FH Jr.
Overexpression of interleukin-1beta and interleukin-6 may play an important role in
periodontal breakdown in type 2 diabetic patients. J Periodontal Res. 2007b;42:377-381.
Duarte PM, Neto JB, Casati MZ, Sallum EA, Nociti FH Jr. Diabetes modulates gene
expression in the gingival tissues of patients with chronic periodontitis. Oral Dis.
2007a;13(6):594-9.
Duarte PM, Santos VR, Dos Santos FA, de Lima Pereira SA, Rodrigues DB, Napimoga
MH. Role of smoking and type 2 diabetes in the immunobalance of advanced chronic
periodontitis. J Periodontol. 2011;82(3):429-38.
Dutzan N, Gamonal J, Silva A, Sanz M, Vernal R. Over-expression of forkhead box P3
and its association with receptor activator of nuclear factor-kappa B ligand, interleukin
(IL) -17, IL-10 and transforming growth factor-beta during the progression of chronic
periodontitis. J Clin Periodontol. 2009;36(5):396-403.
Emrich LJ, Shlossman M, Genco RJ. Periodontal disease in non-insulin-dependent
diabetes mellitus. J Periodontol. 1991; 62:123-131.
43 Engebretson SP, Hey-Hadavi J, Ehrhardt FJ, Hsu D, Celenti RS, Grbic JT, Lamster IB.
Gingival crevicular fluid levels of interleukin-1beta and glycemic control in patients
with chronic periodontitis and type 2 diabetes. J Periodontol. 2004;75:1203-1208.
Engebretson S, Chertog R, Nichols A, Hey-Hadavi J, Celenti R, Grbic J. Plasma levels
of tumour necrosis factor-alpha in patients with chronic periodontitis and type 2
diabetes. J Clin Periodontol. 2007;34(1):18-24.
Engebretson SP, Vossughi F, Hey-Hadavi J, Emingil G, Grbic JT. The influence of
diabetes on gingival crevicular fluid beta-glucuronidase and interleukin-8. J Clin
Periodontol. 2006;33(11):784-90.
Evans
CH.
Cytokines:
molecular
keys
to
homeostasis,
development,
and
pathophysiology. J Cell Biochem. 1993 Dec;53(4):277-9.
Fietta P, Delsante G. The effector T helper cell triade. Riv Biol 2009;102:61-74.
Fujino S, Andoh A, Bamba S, Ogawa A, Hata K, Araki Y, Bamba T, Fujiyama Y.
Increased expression of interleukin 17 in inflammatory bowel disease. Gut.
2003;52(1):65-70.
Gamonal J, Acevedo A, Bascones A, Jorge O, Silva A. Levels of Interleukin- 1β, -8,
and -10 and RANTES in gingival crevicular fluid and cell populations in adult
periodontitis patients and the effect of periodontal treatment. J Periodontol. 2000;
10:1536-1546.
Gamonal J, Sanz M, O'Connor A, Acevedo A, Suarez I, Sanz A, Martínez B, Silva A.
Delayed neutrophil apoptosis in chronic periodontitis patients. J Clin Periodontol.
2003;30:616-623.
Garlet GP, Cardoso CR, Mariano FS, Claudino M, de Assis GF, Campanelli AP, AvilaCampos MJ, Silva JS. Regulatory T cells attenuate experimental periodontitis
progression in mice. J Clin Periodontol. 2010;37(7):591-600.
Gemmell E, Seymour GJ. Immunoregulatory control of Th1/Th2 cytokine profiles in
periodontal disease. Periodontol 2000. 2004;35:21-41.
44 Hansen W, Westendorf AM, Buer J. Regulatory T cells as targets for immunotherapy of
autoimmunity and inflammation. Inflamm Allergy Drug Targets. 2008;7(4):217-23.
Harrington LE, Hatton RD, Mangan PR, Turner H, Murphy TL, Murphy KM, Weaver
CT. Interleukin 17-producing CD4+ effector T cells develop via a lineage distinct from
the T helper type 1 and 2 lineages. Nat Immunol. 2005; 6(11):1123-32.
Holmlund A, Hanstrom L, Lerner UH. Bones resorting activity and cytokine levels in
gingival crevicular fluid before and after treatment of periodontal disease. J Clin
Periodontol. 2004; 31:475-482.
Honda T, Aoki Y, Takahashi N, Maekawa T, Nakajima T, Ito H, Tabeta K, Okui T,
Kajita K, Domon H, Yamazaki K. Elevated expression of IL-17 and IL-12 genes in
chronic inflammatory periodontal disease. Clin Chim Acta. 2008;395:137-141.
Ito H, Honda T, Domon H, Oda T, Okui T, Amanuma R, Nakajima T, Yamazaki K.
Gene expression analysis of the CD4+ T-cell clones derived from gingival tissues of
periodontitis patients. Oral Microbiol Immunol. 2005;20(6):382-6.
Johnson RB, Wood N, Serio FG. Interleukin-11 and IL-17 and the pathogenesis of
periodontal disease. J Periodontol. 2004;75(1):37-43.
Kardeşler L, Buduneli N, Cetinkalp S, Kinane DF. Adipokines and inflammatory
mediators after initial periodontal treatment in patients with type 2 diabetes and chronic
periodontitis. J Periodontol 2010;81(1):24-33.
Kardeşler L, Buduneli N, Çetinkalp S, Lappin D, Kinane DF. Gingival crevicular fluid
IL-6, tPA, PAI-2, albumin levels following initial periodontal treatment in chronic
periodontitis patients with or without type 2 diabetes. Inflamm Res. 2011;60(2):143-51.
Katz J, Bhattacharyya I, Farkhondeh-Kish F, Perez FM, Caudle RM, Heft MW.
Expression of the receptor of advanced glycation end products in gingival tissues of
type 2 diabetes patients with chronic periodontal disease: a study utilizing
immunohistochemistry and RT-PCR. J Clin Periodontol. 2005;32:40-44.
45 Kaur G, Holtfreter B, Rathmann W, Schwahn C, Wallaschofski H, Schipf S, Nauck M,
Kocher T. Association between type 1 and type 2 diabetes with periodontal disease and
tooth loss. J Clin Periodontol 2009;36(9):765-74.
Kelchtermans H, Geboes L, Mitera T, Huskens D, Leclercq G, Matthys P. Activated
CD4+CD25+ regulatory T cells inhibit osteoclastogenesis and collagen-induced
arthritis. Ann Rheum Dis. 2009;68(5):744-50.
Kindt TJ, Goldsby RA, Osborne BA. Mecanismos Efetores Imunes. In: Kindt TJ,
Goldsby RA, Osborne BA. Imunologia de Kuby. 6 ed. São Paulo: Artmed; 2008. Cap.
12: 331-32.
Kobayashi R, Kono T, Bolerjack BA, Fukuyama Y, Gilbert RS, Fujihashi K, Ruby J,
Kataoka K, Wada M, Yamamoto M, Fujihashi K. Induction of IL-10-producing CD4+
T-cells in chronic periodontitis. J Dent Res. 2011;90(5):653-8.
Konermann A, Beyer M, Deschner J, Allam JP, Novak N, Winter J, Jepsen S, Jäger A.
Human periodontal ligament cells facilitate leukocyte recruitment and are influenced in
their immunomodulatory function by Th17 cytokine release. Cell Immunol.
2012;272(2):137-43.
Korn T, Oukka M, Kuchroo V, Bettelli E. Th17 cells: effector T cells with
inflammatory properties. Semin Immunol. 2007;19(6):362-71.
Koromantzos PA, Makrilakis K, Dereka X, Katsilambros N, Vrotsos IA, Madianos PN.
A randomized, controlled trial on the effect of non-surgical periodontal therapy in
patients with type 2 diabetes. Part I: effect on periodontal status and glycaemic control.
J Clin Periodontol. 2011;38(2):142-7.
Kurtiş B, Develioğlu H, Taner IL, Baloş K, Tekin IO. IL-6 levels in gingival crevicular
fluid (GCF) from patients with non-insulin dependent diabetes mellitus (NIDDM), adult
periodontitis and healthy subjects. J Oral Sci. 1999;41:163-167.
46 Lim LP, Tay FB, Sum CF, Thai AC. Relationship between markers of metabolic
control and inflammation on severity of periodontal disease in patients with diabetes
mellitus. J Clin Periodontol, 2007, 34, 118-123.
Löe H. Periodontal disease. The sixth complication of diabetes mellitus. Diabetes Care.
1993;16:329-334.
Lubberts E, Koenders MI, van den Berg WB. The role of T-cell interleukin-17 in
conducting destructive arthritis: lessons from animal models. Arthritis Res Ther.
2005;7(1):29-37.
Mittrücker HW, Kaufmann SH. Mini-review: regulatory T cells and infection:
suppression revisited. Eur J Immunol. 2004;34(2):306-12.
Mosmann TR, Cherwinski H, Bond MW, Giedlin MA, Coffman RL. Two types of
murine helper T cell clone. I. Definition according to profiles of lymphokine activities
and secreted proteins. J Immunol. 1986;136(7):2348-57.
Naguib G, Al-Mashat H, Desta T, Graves DT. Diabetes prolongs the inflammatory
response to a bacterial stimulus through cytokine dysregulation. J Invest Dermatol
2004; 123:87-92.
Nakajima T, Ueki-Maruyama K, Oda T, Ohsawa Y, Ito H, Seymour GJ, Yamazaki K.
Regulatory T-cells infiltrate periodontal disease tissues. J Dent Res. 2005;84(7):639-43.
Nistala K, Wedderburn LR. Th17 and regulatory T cells: rebalancing pro- and antiinflammatory forces in autoimmune arthritis. Rheumatology. 2009;48(6):602-6.
Novak MJ, Potter RM, Blodgett J, Ebersole JL.
Periodontal disease in Hispanic
Americans with type 2 diabetes. J Periodontol. 2008;79:629-636.
Oda T, Yoshie H, Yamazaki K. Porphyromonas gingivalis antigen preferentially
stimulates T cells to express IL-17 but not receptor activator of NF-kappaB ligand in
vitro. Oral Microbiol Immunol. 2003;18(1):30-6.
47 Ohyama H, Kato-Kogoe N, Kuhara A, Nishimura F, Nakasho K, Yamanegi K, Yamada
N, Hata M, Yamane J, Terada N. The involvement of IL-23 and the Th17 pathway in
periodontitis. J Dent Res. 2009;88(7):633-8.
Okui T, Ito H, Honda T, Amanuma R, Yoshie H, Yamazaki K. Characterization of
CD4+ FOXP3+ T-cell clones established from chronic inflammatory lesions. Oral
Microbiol Immunol. 2008;23(1):49-54.
Page RC, Schroeder HE. Pathogenesis of inflammatory periodontal disease. A summary
of current work. Lab Invest. 1976;34(3):235-49.
Ribeiro FV, de Mendonça AC, Santos VR, Bastos MF, Figueiredo LC, Duarte PM.
Cytokines and bone-related factors in systemically healthy patients with chronic
periodontitis and patients with type 2 diabetes and chronic periodontitis. J Periodontol.
2011;82(8):1187-96.
Röhn TA, Jennings GT, Hernandez M, Grest P, Beck M, Zou Y, Kopf M, Bachmann
MF. Vaccination against IL-17 suppresses autoimmune arthritis and encephalomyelitis.
Eur J Immunol. 2006;36(11):2857-67.
Salvi GE, Beck JD, Offenbacher S PGE2, IL-1 beta, and TNF-alpha responses in
diabetics as modifiers of periodontal disease expression. Ann Periodontol 1998; 3:4050.
Salvi GE, Collins JG, Yalda B, Arnold RR, Lang NP, Offenbacher S Monocytic TNF
alpha secretion patterns in IDDM patients with periodontal diseases. J Clin Periodontol
1997a; 24:8-16.
Salvi GE, Yalda B, Collins JG, Jones BH, Smith FW, Arnold RR, Offenbacher S
Inflammatory mediator response as a potential risk marker for periodontal diseases in
insulin-dependent diabetes mellitus patients. J Periodontol 1997b; 68:127-135.
Santos VR, Lima JA, De Mendonça AC, Braz Maximo MB, Faveri M, Duarte PM.
Effectiveness of full-mouth and partial-mouth scaling and root planing in treating
48 chronic periodontitis in subjects with type 2 diabetes. J Periodontol. 2009a;80(8):123745.
Santos VR, Ribeiro FV, Lima JA, Napimoga MH, Bastos MF, Duarte PM. Cytokine
levels in sites of chronic periodontitis of poorly controlled and well-controlled type 2
diabetic subjects. J Clin Periodontol. 2010;37(12):1049-58.
Schenkein HA, Koertge TE, Brooks CN, Sabatini R, Purkall DE, Tew JG. IL-17 in sera
from patients with aggressive periodontitis. J Dent Res. 2010;89(9):943-7. Epub 2010
Apr 16.
Seymour GJ, Gemmell E. Cytokines in periodontal disease: where to from here. Acta
Odontol Sacand 2001; 59: 167-173.
Shevach EM. CD4+ CD25+ suppressor T cells: more questions than answers. Nat Rev
Immunol. 2002;2(6):389-400.
Shevach EM, Tran DQ, Davidson TS, Andersson J. The critical contribution of TGFbeta to the induction of FOXP3 expression and regulatory T cell function. Eur J
Immunol. 2008;38(4):915-7.
Simpson TC, Needleman I, Wild SH, Moles DR, Mills EJ. Treatment of periodontal
disease for glycaemic control in people with diabetes. Cochrane Database Syst Rev.
2010;(5):CD004714.
Sun WL, Chen LL, Zhang SZ, Wu YM, Ren YZ, Qin GM. Inflammatory cytokines,
adiponectin, insulin resistance and metabolic control after periodontal intervention in
patients with type 2 diabetes and chronic periodontitis. Intern Med. 2011;50(15):156974.
Susanto H, Nesse W, Dijkstra PU, Agustina D, Vissink A, Abbas F. Periodontitis
Prevalence and Severity in Indonesians With Type 2 Diabetes. J Periodontol. 2010.
Taichman N, Lindhe J. Patogênese da doença periodontal associada à placa. In: Lindhe
J. Tratado de Periodontologia Clínica. 2 ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan; 1992.
Cap. 5: 105-35.
49 Takahashi K, Azuma T, Motohira H, Kinane DF, Kitetsu S. The potential role of
interleukin-17 in the immunopathology of periodontal disease. J Clin Periodontol. 2005;
32:369-374.
Takeda M, Ojima M, Yoshioka H, Inaba H, Kogo M, Shizukuishi S, Nomura M,
Amano A. Relationship of serum advanced glycation end products with deterioration of
periodontitis in type 2 diabetes patients. J Periodontol. 2006;77:15-20.
Takeda K, Akira S. Toll-like receptors in innate immunity. Int Immunol 2005;17:1-14.
Taylor GW, Burt BA, Becker MP, Genco RJ, Shlossman M, Knowler WC, Pettitt DJ.
Non-insulin dependent diabetes mellitus and alveolar bone loss progression over 2
years. J Periodontol. 1998; 69: 76-83.
Teeuw WJ, Gerdes VE, Loos BG. Effect of periodontal treatment on glycemic control
of diabetic patients: a systematic review and meta-analysis. Diabetes Care.
2010;33(2):421-7.
Tesmer LA, Lundy SK, Sarkar S, Fox DA. Th17 cells in human disease. Immunol Rev.
2008;223:87-113.
Tsai C, Hayes C, Taylor GW. Glycemic control of type 2 diabetes and severe
periodontal disease in the US adult population. Community Dent Oral Epidemiol
2002;30(3):182-192.
van den Berg WB, Miossec P. IL-17 as a future therapeutic target for rheumatoid
arthritis. Nat Rev Rheumatol. 2009;5(10):549-53.
Venza I, Visalli M, Cucinotta M, De Grazia G, Teti D, Venza M. Proinflammatory gene
expression at chronic periodontitis and peri-implantitis sites in patients with or without
type 2 diabetes. J Periodontol. 2010;81(1):99-108.
Vernal R, Dutzan N, Chaparro A, Puente J, Antonieta Valenzuela M, Gamonal J. Levels
of interleukin-17 in gingival crevicular fluid and in supernatants of cellular cultures of
gingival tissue from patients with chronic periodontitis. J Clin Periodontol.
2005;32(4):383-9.
50 Wajant H, Pfeffer K, Pfizenmaier K, Scheurich P. Tumor necrosis factors in 1998.
Cytokine Growth Factor Rev 1998; 9:297-302.
Yago T, Nanke Y, Kawamoto M, Furuya T, Kobashigawa T, Kamatani N, Kotake S.
IL-23 induces human osteoclastogenesis via IL-17 in vitro, and anti-IL-23 antibody
attenuates collagen-induced arthritis in rats. Arthritis Res Ther. 2007;9(5):R96.
Yao Z, Painter SL, Fanslow WC, Ulrich D, Macduff BM, Spriggs MK, Armitage RJ.
Human IL-17: a novel cytokine derived from T cells. J Immunol. 1995; 155:5483-5486.
Zhao L, Zhou Y, Xu Y, Sun Y, Li L, Chen W. Effect of non-surgical periodontal
therapy on the levels of Th17/Th1/Th2 cytokines and their transcription factors in
Chinese chronic periodontitis patients. J Clin Periodontol. 2011;38(6):509-16.
Zhu L, Wu Y, Wei H, Xing X, Zhan N, Xiong H, Peng B. IL-17R activation of human
periodontal ligament fibroblasts induces IL-23 p19 production: Differential involvement
of NF-κB versus JNK/AP-1 pathways. Mol Immunol. 2011;48(4):647-56.
51