Imunopatologia da infecção rábica em camundongos

SAMIRA MARIA ACHKAR
Imunopatologia da infecção rábica em camundongos
geneticamente selecionados para máxima ou mínima
reação inflamatória aguda
Dissertação
apresentada
ao
Programa de Pós-graduação em
Ciências da Coordenadoria de
Controle
de
Doenças
da
Secretaria de Estado da Saúde
de São Paulo, para obtenção do
título de Mestre em Ciências.
Área de Concentração:
Pesquisas
Laboratoriais
Saúde Pública
em
Orientadora:
Profª. DRª. Cleide Aschenbrenner
Consales
SÃO PAULO
2006
“É preciso amar as pessoas como se não houvesse
amanhã...”
Renato Russo
DEDICATÓRIA
Aos meus pais, Zakhour e Yára,
por minha educação, dignidade
e caráter!
caráter!
Aos
meus
irmãos
Mônica,
Eduardo, Ricardo e Leila, pela
amizade e afeto, e por quem aqui
declaro meu eterno amor!
Aos
meus
Chady,
sobrinhos
Eduardo
Amo vocês!
e
Dhunia,
Fernanda.
AGRADECIMENTOS
À minha orientadora, Cleide Aschenbrenner Consales, pela demonstração
de confiança e incentivo ao meu trabalho.
À direção do Instituto Pasteur, em nome de Dra. Neide Yume Takaoka e
Dra. Ivanete Kotait.
À Dra. Maria Luiza Carrieri, por ter permitido a realização deste trabalho.
À Dra. Zélia Maria Pinheiro Peixoto, pelo incentivo, desde o ínicio de minha
carreira.
Aos meus cunhados, Tony e Marisa, por sempre demonstrarem apoio e
respeito ao meu trabalho.
Aos amigos André Barreto Wilke, Aline Garcia Barbosa e Elpídio Ferreira,
pela ajuda na revisão deste trabalho.
A todos os meus amigos, pela paciência e amizade, especialmente à:
Rosemary Gomes Souza, Karina Picirilli de Jesus, Alex Scartezini Carneiro,
Andréa Liza Mazutti, Soraya Sliker, Nancy Marçal Bastos, Marina Suarez,
Paulo Henrique Bertazzo, Rafael de Novaes Oliveira, Andréa de Cássia
Rodrigues, Graciane Medeiros Caporalle, Luciana Botelho Chaves, Vera
Lúcia Galvão, Alexandre Batista e Ana Helena Boamorte.
A todos os funcionários e estagiários do Instituto Pasteur, especialmente à
Gilberto Souza, Patrícia Januário, Karina da Silva, Dulce dos Santos, Maria
S. Cavalcante, Maria Luiza de Souza, Maria Aparecida da Silva e Geralda
Ribeiro Fraga.
À Maria das Graças Silva, pela colaboração na revisão bibliográfica deste
trabalho.
Ao Prof. Dr. Idércio Luiz Sinhorini, por ter acreditado na proposta deste
trabalho, enriquecendo-o com valiosas sugestões.
Ao Dr. Orlando Ribeiro e Dra. Neusa Gallinas, da Seção de Raiva do
Instituto Butantan, por terem cedido os animais utilizados nos experimentos.
RESUMO
ACHKAR, SM. Imunopatologia da infecção rábica em camundongos geneticamente
selecionados para máxima ou mínima reação inflamatória aguda. [Immunopathologic
in rabies infection in lines of mice selected for high or low acute inflammatory reaction].
2006. Dissertação de Mestrado em Ciências, Coordenadoria de Controle de Doenças da
Secretaria de Estado da Saúde de São Paulo.
A raiva é uma doença que apresenta sintomatologia clínica severa, além de
ser altamente letal, entretanto, a resposta inflamatória é pouco evidenciada.
Neste contexto, o objetivo deste estudo foi analisar os mecanismos
imunopatológicos que ocorrem no Sistema Nervoso Central (SNC) durante a
infecção rábica, utilizando como modelo experimental, linhagens de
camundongos
que
apresentam
resposta
inflamatória
aguda
(Acute
Inflammatory Reaction) máxima (AIRmax) e mínima (AIRmin). Foram
utilizadas duas amostras, sendo uma de morcego hematófago (V3) e uma de
vírus fixo (PV1 43/4). A titulação de anticorpos anti-rábicos e isótipos IgG1 e
IgG2a foi feita por meio da técnica imunoenzimática (ELISA), demonstrando
um discreto aumento na produção de IgG e do isótipo IgG1 nos animais
infectados da linhagem AIRmax. O período de incubação, determinado por
inoculações intracerebrais de suspensões virais contendo 100DL50, foi de 67 dias para a amostra PV1 43/4 e de 9-10 dias para a V3. A mortalidade foi
de 100% para ambas as linhagens e não houve diferença quanto à
replicação viral. A análise histopatológica de encéfalos e medulas dos
camundongos infectados mostrou focos inflamatórios em todas as regiões
do SNC, porém, não houve diferença significativa no número de neutrófilos.
Corpúsculos de Negri foram observados em praticamente todas as regiões
analisadas. Os resultados sugerem que a reação inflamatória aguda não é
um fator determinante na infecção pelo vírus rábico.
DESCRITORES: raiva, replicação viral, Sistema Nervoso Central/patologia,
inflamação, isótipos da imunoglobulina.
ABSTRACT
ACHKAR, SM. Immunopathologic in rabies infection in lines of mice selected for
high or low acute inflammatory reaction. [Imunopatologia da infecção rábica em
camundongos geneticamente selecionados para máxima ou mínima reação inflamatória
aguda]. 2006. Dissertação de Mestrado em Ciências – Coordenadoria de Controle de
Doenças da Secretaria de Estado da Saúde de São Paulo.
Rabies infection is a severe and lethal disease that presents a slight
inflammatory response during the infection process. We analyzed the
immunopathological mechanisms that occur in the CNS (Central Nervous
System) using two lines of mice genetically selected for maximal (AIRmax) or
minimal (AIRmin) acute inflammatory reactivity. As viral samples, we adopted
the antigenic variant 3 (AgV3) rabies virus from hematophagous bats and the
PV1 43/4 fixed virus strain. Titration of specific antibodies was performed by
Enzyme Immunosorbent Assay. We observed a slight increase in IgG and
IgG1 isotype in the infected AIRmax mice. The incubation period determined
by intracerebral inoculation with 100LD50 was 6-7 days for PV1 43/4 and 9-10
days for AgV3. No difference in viral replication was found between AIRmax
and
AIRmin
mice.
Mortality
was
100%
with
both
viral
strains.
Histopathological analysis of the brain and spinal cord tissues showed
inflammatory foci in all CNS, however, no differences were observed in the
number of neutrophils. Negri bodies were also observed in practically all sites
analyzed. Taken together, our results suggest that the inflammatory reaction
is not a determining factor in susceptibility to rabies infection.
DESCRIPTORS:
rabies,
virus
replication,
Central
System/pathology, inflammation, immunoglobulin isotypes.
Nervous
LISTA DE
ABREVIATURAS E
SIGLAS
ABLV
“Australian Bat Lyssavirus”
AIR
Acute Inflammatory Reaction
AIRmax
Camundongos selecionados para máxima reatividade inflamatória aguda
AIRmin
Camundongos selecionados para mínima reatividade inflamatória aguda
AV
“Aravan Virus”
BSA
Bovine Serum Albumin
CDC
Centers for Desease Control and Prevention (USA)
CVS
Challenge Virus Standard
DL50
Dose Letal 50%
DUVV
“DuvenhageVirus”
EBL1
“European Bat Lyssavirus 1”
EBL2
“European Bat Lyssavirus 2”
ec
encéfalo
g
grama
HE
Hematoxilina/Eosina
IC
Intracerebral
IgE
Imunoglobulina E
IgG
Imunoglobulina G
IgG1
Isótipo 1 da imunoglobulina G
IgG2a
Isótipo 2 da imunoglobulina G
IL
Interleucina
IM
Intramuscular
IV
“Irkut Virus”
K-S
Kolmogorov-Smirnov
KV
“Khujand Virus”
log
logarítimo
LBV
“Lagos Bat Virus”
Mab-N
Anticorpo monoclonal anti-nucleocapsídeo
md
medula
mg
miligrama
mL
mililitro
MOKV
“Mokola Virus”
N
Normal
NaOH
Hidróxido de Sódio
Ne
Neutrófilos
NIH
National Institute of Health
nm
nanômetro
OPAS
Organização Pan Americana da Saúde
PBS
Phosphate Buffered Saline
PCR
Reação em cadeia pela Polimerase
pH
potencial hidrogênio-iônico
PMN
Polimorfonucleares
PNPP
P-nitrophenil-phosphatase disodium hexahydrate
PV
“Pasteur Virus”
qsp
quantidade suficiente para
RABV
Vírus clássico da Raiva
RNA
Ribonucleic Acid
RNP
Ribonucleoproteína
s
desvio padrão
SNC
Sistema Nervoso Central
Th1
T helper type 1
Th2
T helper type 2
ThCD4+
T helper phenotype expression CD4+
V3
Variante 3
VERO
Células de rim de macaco verde da África
WCBV
“West Caucasian Bat Virus”
X
Média aritmética
ºC
Graus Celsius
%
Porcentagem
µ
micra
µg
micrograma
µL
microlitro
LISTA DE TABELAS
Tabela 1
Relação interlinhagens entre médias e desvios-padrões, durante
a replicação viral da amostra PV1 43/4 nos encéfalos e medulas.
Tabela 2
Relação interlinhagens entre médias e desvios-padrões, durante
a replicação viral da amostra V3 nos encéfalos e medulas.
Tabela 3
Relação interlinhagens entre médias e desvios-padrões, durante
titulação de IgG anti-rábica e isótipos IgG1 e IgG2a da amostra
59
59
64
PV1 43/4 no SNC
Tabela 4
Relação interlinhagens entre médias e desvios-padrões, durante
titulação de IgG anti-rábica e isótipos IgG1 e IgG2a da amostra V3
64
no SNC
Tabela 5
Porcentagens de neutrófilos encontradas em encéfalos e medulas
de camundongos infectados com as amostras PV1 43/4 e V3, em
diferentes dias pós-infecção.
66
LISTA DE FIGURAS
Figura 1
Cinética de replicação da amostra PV1 43/4 no SNC de
camundongos AIRmax
Figura 2
Cinética de replicação da amostra PV1 43/4 no SNC de
camundongos AIRmin
Figura 3
Cinética
de
replicação
da
amostra
V3
no
SNC
de
da
amostra
V3
no
SNC
de
camundongos AIRmax
Figura 4
Cinética
de
replicação
camundongos AIRmin
Figura 5
Título de anticorpos anti-rábicos e isótipos IgG1 e IgG2a após
infecção com amostra PV1 43/4 em camundongos AIRmax,
57
57
58
58
62
determinados pelo método imunoenzimático ELISA
Figura 6
Título de anticorpos anti-rábicos e isótipos IgG1 e IgG2a após
infecção com amostra PV1 43/4 em camundongos AIRmin,
62
determinados pelo método imunoenzimático ELISA
Figura 7
Título de anticorpos anti-rábicos e isótipos IgG1 e IgG2a após
infecção com amostra V3 em camundongos AIRmax,
63
determinados pelo método imunoenzimático ELISA
Figura 8
Título de anticorpos anti-rábicos e isótipos IgG1 e IgG2a após
infecção
com
amostra
V3
em
camundongos
AIRmin,
63
determinados pelo método imunoenzimático ELISA
Figura 9
MAX controle negativo. Corte histológico de hipocampo
67
Figura10
MIN controle negativo. Corte histológico de hipocampo
67
Figura 11
MAX PV1 43/4. Corte histológico de hipocampo com grande
68
quantidade de neutrófilos
Figura 12
MIN V3. Foco inflamatório com grande quantidade de
68
neutrófilos
Figura 13
Corte histológico evidenciando Corpúsculos de Negri
69
Figura 14
Corte histológico de cortex, mostrando foco inflamatório com
69
aspecto linfocitário
ÍNDICE
1
INTRODUÇÃO
25
2
OBJETIVOS
42
2.1
Objetivo geral
43
2.2
Objetivos específicos
44
3
MATERIAL E MÉTODOS
45
3.1
Animais
46
3.2
Amostras virais
46
3.3
Infecção
47
3.3.1
Determinação da DL50
47
3.3.2
Suscetibilidade à infecção
48
3.3.3
Replicação no SNC de camundongos AIRmax e AIRmin
48
3.3.4
Cinética de replicação viral
49
3.4
Titulação de anticorpos
49
3.4.1
Determinação dos títulos de anticorpos
49
3.4.2
Determinação dos títulos dos isótipos IgG1 e IgG2a
50
3.5
Estudo histopatológico
51
3.6
Análise estatística
52
4
RESULTADOS
54
4.1
Infecção viral
55
4.1.1
Determinação da DL50
55
4.1.2
Determinação da suscetibilidade
55
4.1.3
Cinética da replicação viral
55
4.2
Titulação de anticorpos IgG e isótipos IgG1 e IgG2a
60
4.3
Estudo histopatológico
65
5
DISCUSSÃO
70
6
CONCLUSÕES
77
7
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
79
ANEXOS
24
INTRODUÇÃO
1 INTRODUÇÃO
Por diversos aspectos a raiva é considerada a mais importante
antropozoonose, pois: apresenta letalidade de 100%, representa um alto
custo na assistência a indivíduos expostos, seus reservatórios são
particularmente eficientes na manutenção e disseminação do vírus e,
mesmo com todos os subsídios existentes e o advento da vacina anti-rábica,
ainda é um grave problema em Saúde Pública.
É, provavelmente, a zoonose conhecida mais antiga, datando do
século XXII a.C., tendo citações no Código de Eshunna, escrito na
Mesopotâmia (STEELE, 1975).
Em 1804, iniciou a denominada Era pré-Pasteuriana, quando
Zinke comprovou a infecção a partir da saliva de cães raivosos. Já em 1813,
Gruner e Salm constataram a presença de vírus na saliva de herbívoros e,
só em 1821, Magendie e Brescher evidenciaram a infecção na saliva de
humanos. Em 1879, a infecção em coelhos foi demonstrada por Galtier e
Duboué, que confirmaram os primeiros relatos sobre a patogenia da doença
(GALTIER, 1881).
A Era Pasteuriana iniciou em 1881, ano em que os primeiros
informes sobre a doença foram feitos. Deu-se início à utilização do sistema
nervoso de animais para o estudo da raiva e ocorreu o primeiro experimento
para atenuação do vírus. Em 1882, Louis Pasteur isolou a amostra PV
(Pasteur virus) de uma vaca contaminada e em 1885, obteve o vírus “fixo” e
a primeira vacina. Pasteur confirmou que apenas o Sistema Nervoso Central
(SNC) era alvo do processo infeccioso, após desafiar alguns cães com
26
inoculações de suspensões virais via intracerebral (IC), conseguiu imunizálos, através de inoculações subcutâneas de uma suspensão de vírus
atenuado preparada a partir de medulas de coelhos infectados. No mesmo
ano, este tratamento profilático foi aplicado em humanos. Pasteur testou a
primeira vacina em um garoto, vítima de graves mordeduras de um cão
raivoso, aplicando treze injeções de uma suspensão de vírus atenuado,
livrando-o da doença. Assim, o êxito da vacina foi alcançado, mesmo sem se
conhecer maiores detalhes acerca das propriedades do agente etiológico
(PASTEUR, 1885).
A raiva é transmitida por um vírus neurotrópico pertencente à
ordem
Mononegavirales,
que
é
constituída
por
quatro
famílias:
Paramyxoviridae, Bornaviridae, Filoviridae e Rhabdoviridae. A família
Rhabdoviridae está dividida em seis gêneros, dos quais apenas três causam
infecções
em
mamíferos:
o
gênero
Ephemerovirus,
tendo
como
representante o vírus da febre efêmera bovina; o gênero Vesiculovirus, ao
qual se incluem os vírus que causam a estomatite vesicular e vírus
relacionados, e o gênero Lyssavirus, dentro do qual se incluem o vírus
rábico e os vírus “aparentados” (VAN REGENMORTEL et al., 2000).
O vírus rábico possui uma fita simples de ácido nucléico (RNA),
não segmentado e tem sentido negativo (3`→ 5`), característica esta dos
Mononegavirales. Assim, o RNA serve como molde para uma transcrição
autônoma, o que originará moléculas complementares do RNA (sentido
positivo), as quais serão traduzidas em novas partículas virais. Possui
simetria helicoidal, com uma extremidade arredondada e outra plana, e
envoltório lipoprotéico. Seu capsídeo tem forma de projétil e suas dimensões
27
são, em média, de 75 nm de diâmetro por 200 nm de comprimento (VAN
REGENMORTEL et al., 2000).
Dois elementos estruturais principais constituem o vírus rábico: a
ribonucleoproteína (RNP) e o envelope viral, derivado de células
hospedeiras durante o brotamento e composto por uma bicamada lipídica, a
qual envolve a RNP. O genoma completo é composto por 11932 pb, que
codificam as cinco seqüências genômicas responsáveis pela tradução das
cinco proteínas que constituem o vírus. São eles:
gene N, responsável pela tradução da nucleoproteína N, a qual
contém 1750 pb e envolve o genoma viral e tem papel importante na
encapsidação (TORDO et al., 1986). A nucleoproteína é produzida em
abundância durante a replicação, além de ser o maior componente
estrutural do vírus e a maior proteína do complexo helicoidal
(WUNNER, 2002).
gene P, responsável pela produção da fosfoproteína (P, M1 ou NS),
que é constituída por 950 pb e é multifuncional, sendo importante na
replicação viral (LAFON & WIKTOR, 1985), além de estar associada à
proteína L;
gene L, responsável pela produção da proteína L, constituída de 20 a
150 pb. É importante nas atividades enzimáticas necessárias para a
tradução de uma polimerase para a síntese do RNA (TORDO et al.,
1988; RUPPRECHT et al., 2002).
28
gene M, responsável pela produção da proteína matriz M, que tem
1650 pb e interliga o envelope ao nucleocapsídeo. Por ter papel
multifuncional, ou seja, interage com as proteínas virais e com os
componentes protéicos da membrana celular, é importante na
regulação da replicação viral (DELAGNEAU et al., 1981);
gene G, responsável pela produção da glicoproteína G, que contém
1800 pb e é transmembranária e está intimamente relacionada com a
indução de anticorpos neutralizantes em indivíduos imunizados, além
de servir de receptor na superfície viral e como sítio de ligação de
anticorpos (COX et al., 1987).
Os lissavírus são sorologicamente distintos dos outros rabdovírus.
A característica biológica de muitos deles é que, no primeiro isolamento em
animais, eles manifestam um período de incubação longo e, após
sucessivas passagens, esse período torna-se mais curto e com duração fixa
(WHO, 1992).
O vírus da raiva era caracterizado como uma única unidade
antigênica, entretanto, a partir da década de 80, diversos estudos
sorológicos e antigênicos foram feitos, principalmente com o uso de
anticorpos monoclonais anti-nucleocapsídeo (Mab-N) e da técnica de reação
em cadeia pela polimerase (PCR). O gene N (gene mais conservado) de
setenta amostras de vírus rábicos e vírus relacionados, provenientes de
quarenta países, foi analisado para a construção de uma árvore filogenética.
Neste contexto, foram definidas as distribuições temporal e geográfica das
amostras em estudo, além de serem estabelecidas as espécies que servem
29
de reservatório para os vírus. A partir disto, foram classificados sete
diferentes genótipos do vírus (GOULD et al., 1998), os quais foram divididos
em dois filogrupos. O primeiro constituído de cinco genótipos:
genótipo 1: vírus clássico da raiva (RABV), correspondente ao vírus
rábico encontrado nas Américas, tendo a maior distribuição no
mundo, fato que o leva a ser o mais importante epidemiologicamente,
estando associado ao maior número de casos. Este sorotipo inclui
outros vírus fixos e vírus de “rua” anteriormente isolados de cães,
gatos e herbívoros entre os animais domésticos, e de animais
silvestres como raposas, gambás, guaxinins e morcegos frugívoros,
insetívoros e hematófagos (VELASCO-VILLA et al., 2002);
genótipo 4: Duvenhage Virus (DUVV), isolado primeiramente em 1970
de um homem em Warmbaths, no sul da África, infectado por um
morcego insetívoro (VELASCO-VILLA et al., 2002); e posteriormente
de morcegos insetívoros (Miniopterus schreibersii e Nycteris thebaica)
no Zimbabwe e África do Sul (MEREDITH et al., 1971; BINGHAM,
2001);
genótipo 5: European Bat Lyssavirus (EBL-1), constituído de
isolamentos feitos de morcegos insetívoros do gênero Eptesicus
(WHO, 1994);
genótipo 6: European Bat Lyssavirus (EBL-2), a partir de isolamentos
de morcegos insetívoros do gênero Myotis (WHO, 1994; KING, 2001;
POUNDER, 2003);
30
genótipo 7: Australian Bat Lyssavirus (ABLV), isolado de morcegos
frugívoros (Pteropus alecto) da costa leste da Austrália em 1996 (VAN
REGENMORTEL et al., 2000; GOULD et al., 1998; POUNDER, 2003;
TORDO et al., 1998). Ressalta-se que a Austrália foi considerada
como sendo um país livre da raiva desde 1867.
O segundo filogrupo é constituido por dois genótipos:
genótipo 2: Lagos Bat Virus (LBV), descoberto em 1956 na ilha de
Lagos, na Nigéria, isolado a partir de inoculação de um “pool” de
tecido cerebral e glândulas salivares de um morcego frugívoro
(Eidolon helvum) (KEMP et al., 1972);
genótipo 3: Mokola Virus (MOKV), isolado em 1968 a partir do “pool”
de órgãos de um mussaranho na Nigéria (TORDO et al., 1998), sendo
este o único lissavírus que não foi isolado em morcegos.
Posteriormente, foram feitos isolamentos em humanos na Nigéria e
em felinos na Etiópia e no Zimbabwe (KEMP et al., 1972; NEL, 2001).
Além destes sete genótipos, mais quatro variantes foram
propostas como membros do gênero Lyssavirus: Aravan Virus (AV), isolado
de um morcego insetívoro (Myotis blythi), em 1991, na região do Kyrgyztan,
Ásia Central (ARAI et al., 2003; KUZMIN et al., 2003); Khujand Virus (KV),
isolado de um morcego insetívoro (Myotis mystacinus), em 2001, na região
do Tajikistan, Ásia Central (KUZMIN et al., 2001); Irkut Virus (IV), isolado de
um morcego insetívoro (Murina leucogaster), em 2002, na cidade de Irkutsk,
Sibéria e West Caucasian Bat Virus (WCBV), isolado de um morcego
31
insetívoro (Miniopterus schreibersi), em 2002, na Rússia (BOTVINKIN et al.,
2003; KUZMIN et al., 2003).
A raiva é uma doença cíclica que é mantida por um hospedeiro
principal, fator este dependente da área geográfica. Dentre os mamíferos
suscetíveis, os das ordens Carnivora e Chiroptera são os principais
reservatórios.
O animal doente é a fonte de infecção, o qual transmite o vírus
por contato com eventuais ferimentos ou mucosas, através de lambeduras,
arranhaduras e/ou mordeduras; sendo esta última a maneira mais comum de
transmissão e de especial importância epidemiológica, pois possibilita uma
nova infecção. O vírus pode infectar o suscetível através do contato com
mucosas, como olhos, nariz e boca. A transmissão através da inalação de
aerossóis foi confirmada em cavernas densamente povoadas por morcegos
infectados e em acidentes laboratoriais (CONSTANTINE, 1962). A
transmissão oral também pode ocorrer através do manuseio ou consumo de
carcaças contaminadas (KUREISHI et al., 1992; TARIQ et al., 1991) ou
através de transplantes de órgãos (CDC, 1977; JACKSON, 2005). Na
literatura são descritos oito casos de transmissão inter-humana, através de
transplantes de córnea de doadores infectados (JAVADI et al., 1996).
Na Ásia, ocorrem de 30 a 55 mil casos humanos de raiva,
anualmente, sendo que cerca de 7 milhões de indivíduos recebem
tratamento contra a doença. Na África, o número de tratamentos profiláticos
anuais é de aproximadamente 500 mil, e o número estimado de óbitos, de 5
a 15 mil. Na Europa e América do Norte, os casos não chegam a 50 por ano
32
e o número de tratamentos atinge 100 mil (BELOTTO et al., 2005). Na
América Latina, estima-se que a média de número de casos é de 40 por ano
e o número de tratamentos, 500 mil. A distribuição da raiva animal é variável,
de acordo com a região e a espécie afetada, podendo existir áreas livres e
áreas endêmicas ou não, apresentando-se em alguns períodos de forma
epizoótica. Em países subdesenvolvidos da Ásia, da África e da América
Latina, existe um predomínio da raiva canina, e na América do Norte e
Europa, os animais silvestres são os principais reservatórios.
No Brasil, as médias anuais de casos de raiva humana notificados
têm oscilado, sendo 10 casos em 2002, 17 em 2003, 29 em 2004 e 45 em
2005. Até 2003, o cão era a principal espécie transmissora, sendo que a
partir de 2004, os morcegos hematófagos tornaram-se os principais
transmissores no Brasil e na América Latina (MINISTÉRIO DA SAÚDE,
2005).
Os morcegos habitam praticamente todo o globo, com exceção da
Antártica e algumas ilhas remotas, representando aproximadamente 24%
das espécies de mamíferos conhecidas (McCOLL et al., 2000). Pertencem à
ordem Chiroptera, a qual é constituída por 18 famílias, que se distribuem em
168 gêneros e mais de 1000 espécies (TADDEI, 1996). No Brasil, existem
aproximadamente 144 espécies de morcegos, distribuídas em nove famílias.
A família Phyllostomidae é constituída de 82 espécies, das quais apenas três
são hematófagas: Dyphilla ecaudata, Diaemus yungii e Desmodus rotundus.
Esta última habita apenas algumas regiões do Caribe e da América Latina.
33
Quanto à distribuição da raiva em quirópteros, todas as espécies,
hematófagas ou não, podem transmitir o vírus, entretanto, a que tem maior
importância epidemiológica é a Desmodus rotundus, pois estes animais se
alimentam preferencialmente de sangue de mamíferos, o que compromete a
sanidade dos animais de interesse econômico. A circulação do vírus em
colônias de morcegos não hematófagos tem sido demonstrada através do
isolamento da variante 3 (V3) de Desmodus rotundus nesses animais,
sugerindo a atuação dos mesmos como “sentinelas” para orientar o controle
da doença nos animais domésticos (CARRIERI et al., 2001), bem como de
outras variantes próprias de morcegos insetívoros. Dentre os 7 genótipos do
gênero Lyssavirus, 6 (1, 2, 4, 5, 6 e 7) têm os quirópteros como hospedeiros
principais (TORDO et al., 1996).
Outro fator relevante é a indistinção do aparecimento da doença
nestes animais em relação à localidade, representando assim um problema
emergente de Saúde Pública, além do fato dos morcegos serem animais
extremamente versáteis, a ponto de se adaptarem às áreas urbanas a
procura de alimento, devido à perda do habitat natural, expandindo, desta
maneira, a distribuição da enfermidade.
O perfil epidemiológico da raiva no Estado de São Paulo teve uma
mudança, com a diminuição de casos em cães e um aumento do número de
casos em morcegos, o que consequentemente refletiu na disseminação do
vírus em herbívoros e outros animais domésticos. Outro fator importante é o
constante isolamento da V3 como resultado de estudos antigênicos das
amostras isoladas de cães, gatos, herbívoros e outras espécies de
34
morcegos, o que confirma a presença do morcego hematófago em áreas
urbanas e a circulação do vírus no ciclo aéreo (CARRIERI et al., 2001).
Esta mudança no perfil epidemiológico da raiva, em que houve
uma diminuição dos casos humanos transmitidos por cães e um aumento da
transmissão por morcegos, requer uma investigação epidemiológica efetiva
já que fatores como: ter hábito noturno, ter maior abrangência geográfica
através do vôo e ser versátil à adaptação de novos abrigos, são
extremamente vantajosos para que estes animais se proliferem e,
consequentemente, disseminem a doença quando o vírus estiver circulante
na colônia.
Animais de laboratório infectados, experimentalmente, com o
vírus rábico morrem após apresentarem, por um período de tempo variável,
sintomas clínicos de comprometimento neurológico. A taxa de mortalidade
varia segundo a linhagem de animal empregada, idade, via de inoculação e
dose infectante do vírus (PERL, 1975).
Um dos aspectos surpreendentes da imunopatologia da raiva é a
baixa resposta inflamatória no SNC, em contraste com outras infecções
virais, em que a inflamação pode ser a maior característica do quadro
patológico. A resposta imune, que ocorre durante a infecção rábica, é
particular, devido ao SNC ser um sítio imunoprivilegiado, baseado
principalmente na restrição da migração de células T e na ausência de
células apresentadoras de antígeno específicas, indicando que a existência
de um estado imune é menos expresso neste órgão (BAER & YANGER,
1977). Isso ocorre devido à imparidade na circulação cerebral, caracterizada
35
pela barreira hematoencefálica, a qual previne o escape de células em
determinadas
regiões
consequentemente,
o
do
SNC,
restringindo
desenvolvimento
de
uma
a
diapedese
reação
e
inflamatória
(MEDAWAR, 1948).
Após a infecção experimental por via IC, o vírus rábico pode ser
encontrado em altas concentrações no SNC, sem causar grandes
modificações histopatológicas. A ocorrência de neurônios picnóticos e
modesta
infiltração
de
células
inflamatórias
perivasculares
e
subaraquinóides, são as principais observações patológicas em cortes de
cérebros infectados e corados pela técnica de Hematoxilina/Eosina (HE). Os
Corpúsculos de Negri podem ser reconhecidos nos neurônios infectados
quando
há
preservação
do
tecido.
São
massas
citoplasmáticas refringentes acidófilas, que podem ser redondas ou ovais,
com dimensões de 1 a 20 µ (PERL, 1975).
Alguns estudos demonstram o encontro do antígeno rábico em
células ependimais de animais inoculados, por via IC, com altas doses
infectantes de vírus rábico fixo (JACKSON & REIMER, 1989). Outros
estudos têm sugerido que, muitas descrições clínicas de condensação da
cromatina em neurônios infectados, podem refletir um processo de apoptose
(BOJA et al., 1993; JACKSON & ROSSITER, 1997; JACKSON & PARK,
1998; JACKSON, 1999).
Apesar de várias hipóteses apresentadas na literatura, a base
fundamental da disfunção neuronal na infecção rábica ainda não foi
determinada. Vários aspectos da patogenia da raiva são particularmente
36
importantes, em vista dos mecanismos imunológicos que podem limitar a
infecção.
A resposta inflamatória é representada por um conjunto de
alterações morfológicas e bioquímicas desencadeadas por diversos
estímulos e tem como objetivo, recompor a homeostase do tecido injuriado.
Para tanto, uma série de eventos se sucede, envolvendo a ação de células
fagocitárias, sistema complemento, sistema de coagulação, dentre outros
(GALLIN et al., 1988).
Outro mecanismo de proteção dotado de especificidade e
memória é operado pelo sistema imunológico, com a participação de células
imunocompetentes, anticorpos e outros fatores solúveis.
A resposta inflamatória e a imune específica estão intimamente
relacionadas. A resposta específica pode mobilizar uma reação inflamatória
que ocasionalmente, pode ser exacerbada ou destrutiva. Por outro lado, a
inflamação pode ser moduladora, aumentando ou diminuindo as reações
específicas do hospedeiro.
Algumas das células envolvidas na resposta inflamatória são
células
residentes
do
tecido
conjuntivo:
mastócitos
e
fagócitos
mononucleares teciduais. Outras células chegam à área injuriada através da
corrente sanguínea: polimorfonucleares (neutrófilos, eosinófilos e basófilos)
e as células mononucleares (monócitos e linfócitos). Estas células passam
do espaço intravascular para a matriz extracelular, atravessando a barreira
37
de células endoteliais, por mecanismos de adesão e de diapedese (GALLIN
et al., 1988).
Os neutrófilos, dentre os polimorfonucleares, são componentes
predominantes da resposta inflamatória aguda e a primeira linha de defesa
contra diferentes infecções. São leucócitos produzidos na medula óssea e, a
sua principal função fisiológica é a destruição de microorganismos. Os
neutrófilos maduros são células altamente móveis, e respondem a uma
variedade de estímulos quimiotáticos específicos, pois possuem moléculas
de aderência na superfície. Eles internalizam microorganismos pelo
processo conhecido por fagocitose e possuem inúmeros grânulos que
contém peptídeos antimicrobianos e enzimas oxidativas, que participam da
destruição dos microorganismos internalizados. Os receptores de superfície
identificam sinalizações do meio ambiente de onde se encontram. Estes
sinais extracelulares são traduzidos em mensagens intracelulares que
induzem: mobilidade, aderência, fagocitose, degranulação e produção de
superóxidos. (BAGGIOLINI, 1980).
O extravasamento do plasma, um fator crucial na inflamação, não
é, necessariamente, um processo nocivo; ele pode desempenhar um papel
importante na defesa do organismo. O plasma pode carrear fatores
hormonais que promovem a migração para o local da injúria, e ser drenado
do espaço extracelular, estimulando o sistema linfático. Os vasos linfáticos
vão desembocar nos linfonodos regionais ou tecidos linfóides, onde uma
resposta imune pode ser iniciada (CALICH & VAZ, 2001; ABBAS et al.,
2000).
38
Os linfócitos T auxiliares (ThCD4+), após estimulação antigênica,
e dependendo das interleucinas predominantes no microambiente, podem
diferenciar-se em subpopulações, com perfis distintos de produção de
citocinas. As células Th1 estão envolvidas com a resposta imune celular e as
células Th2, auxiliam os linfócitos B na produção de anticorpos (CALICH &
VAZ, 2001; ABBAS et al., 2000).
As citocinas secretadas pelos dois tipos de linfócitos TCD4+
podem regular o “switching” (inversão) e a expressão de isótipos de
imunoglobulinas IgG, em que Th1 regula o “switching” para IgG2a e Th2 para
IgG1 e IgE. As citocinas produzidas por linfócitos Th1 e Th2 agem de forma
antagonística,
estabelecendo
uma
regulação
mútua,
isto
é,
uma
subpopulação que é capaz de regular as funções da outra. Os mecanismos
que determinam se uma resposta será predominantemente do tipo Th1 ou
Th2 ainda não estão bem esclarecidos. Apesar da proteção contra a raiva
ser avaliada através da presença de anticorpos neutralizantes, induzidos
pela imunização pré ou pós-exposição, a resposta mediada por células tem
um papel importante na imunidade contra esta infecção (ROIT et al., 2003;
SIVEKE & HAMANN, 1998; ROMAGNANI, 1992).
Um modelo introduzido por Biozzi e colaboradores, na década de
sessenta, utiliza linhagens de camundongos bons e maus respondedores de
anticorpos aos imunógenos naturais complexos, administrados em doses
ótimas imunogênicas; nestas condições, a fase de reconhecimento de
epítopos imunodominantes é restritiva. Estas linhagens foram obtidas por
cruzamentos seletivos bidirecionais, a partir de populações geneticamente
39
heterogêneas, tendo como caráter fenotípico selecionador a produção
máxima e mínima de anticorpos (BIOZZI et al., 1979; BIOZZI et al., 1980).
Diferentes estudos de interação vírus rábico-hospedeiro têm sido
desenvolvidos,
utilizando
as
diferentes
seleções
independentes
desenvolvidas do trabalho conjunto entre os laboratórios de Imunogenética
do Instituto Curie de Paris e do Instituto Butantan de São Paulo (NILSSON et
al., 1979; CONSALES et al., 1990; De FRANCO et al., 1996).
Um novo processo de Seleção Genética Bidirecional para
obtenção de linhagens de camundongos para alta (AIRmax) e baixa
(AIRmin) resposta inflamatória aguda (AIR – Acute Inflammatory Reaction)
foi desenvolvido por estímulo com Biogel. O processo seletivo foi iniciado a
partir de uma população F0, geneticamente heterogênea, resultante do
cruzamento equilibrado de oito linhagens isogênicas, sendo: A/J, BALB/cJ,
CBA/J, C57BI/6J, DBA2/J, SJL/J, SWR/J e P/J, e desenvolveu-se nas
sucessivas gerações, pela escolha de casais com fenótipos extremos, com
base na determinação da concentração protéica e do número de leucócitos,
três dias após injeção subcutânea de partículas não imunogênicas e não
biodegradáveis de Biogel (microesferas de poliacrilamida). A partir da F17,
pôde-se chegar à população ideal, ou seja, animais que atingiram a
homozigose para a inflamação. Neste contexto, a principal característica
fenotípica selecionada foi a habilidade, destas linhagens de recrutarem
leucócitos polimorfonucleares ao foco inflamatório (STIFFEL et al., 1987;
STIFFEL et al., 1990; IBAÑES et al., 1992).
40
A caracterização do conteúdo celular presente no exsudato
inflamatório dos animais da AIR foi realizada através da técnica de citometria
de fluxo. Os resultados revelaram que, devido ao fato do exsudato presente
na linhagem AIRmax ser mais atrativo para propriedades quimiotáticas e
hematopoiéticas, eles apresentam um maior número de PMN e de proteínas,
além da atividade da medula óssea ser maior, pois estes animais
apresentam maior quantidade de precursores celulares a partir deste órgão.
Entretanto, as duas linhagens apresentaram mesmo nível de expressão de
moléculas de adesão e do processo de fagocitose. Os animais AIRmIn
apresentaram maior propensão a apoptose espontânea dos neutrófilos
(RIBEIRO et al., 2003).
Em vista da grande diferença quanto à reatividade inflamatória
aguda, estas linhagens selecionadas representam um modelo original para o
estudo dos possíveis mecanismos imunopatológicos que ocorrem no SNC
durante a infecção rábica.
41
OBJETIVOS
2 OBJETIVOS
2.1 Objeti vo geral
Analisar comparativamente, nas linhagens de camundongos para
máxima (AIRmax) e mínima (AIRmin) resposta inflamatória aguda, os
possíveis mecanismos imunopatológicos envolvidos na infecção rábica.
43
2.2 Objetivos específicos
Analisar a cinética de replicação das amostras de vírus fixo PV1 43/4
e da variante 3 (V3) isolada de morcego Desmodus rotundus;
Avaliar os anticorpos anti-rábicos IgG e dos isótipos IgG1 e IgG2a,
durante a cinética de replicação viral;
Analisar a presença de focos inflamatórios e de Corpúsculos de Negri
no SNC, durante a cinética de replicação viral.
44
MATERIAL E MÉTODOS
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Animais
Foram utilizados grupos de camundongos, machos e fêmeas, de
6 a 8 semanas de idade, das linhagens com reatividade inflamatória aguda
de máxima e mínima intensidade, provenientes das gerações F38 e F39,
cedidos
pelo
Laboratório
de
Imunogenética
do
Instituto
Butantan;
camundongos heterogêneos machos e fêmeas, de 11 a 14g N:NIH, do
Biotério Central do Instituto Butantan e camundongos heterogêneos albinos
suíços, machos e fêmeas, de 11 a 14g e lactentes, do Biotério do Instituto
Pasteur de São Paulo.
3.2 Amostras virais
Vírus rábico fixo PV inativado, produzido em células VERO (células
de rim de macaco verde da África), lote 06/03, com título de 106.0
DL50/0.03mL, cedido pela Seção de Raiva do Instituto Butantan.
Vírus rábico fixo PV1 43/4, suspensão a 20% de cérebro de
camundongo, liofilizado e diluído em tampão PBS/BSA a 0.075%
0,01M, com título de 105.67 DL50/0.03 mL, cedido pela Seção de Raiva
do Instituto Butantan.
46
Amostra 1957-M/2001, isolada de morcego hematófago (Desmodus
rotundus), procedente da área rural do município de Tapiratiba, São
Paulo e caracterizada no Instituto Pasteur de São Paulo, como
variante 3 (V3), através da técnica de imunofluorescência indireta,
utilizando o painel de anticorpos monoclonais anti-nucleocapsídeo
viral, produzido pelo CDC, Atlanta - USA, referencial definido pela
OPAS para a tipificação antigênica de amostras de vírus rábico
isoladas nas Américas. A suspensão preparada a partir de cérebros
de camundongos lactentes após duas passagens, apresentou título
de 10 4,25 DL50/0.03 mL.
3.3 Infecção
3.3.1 Determinação da DL50
A dose letal 50% (DL50) ideal para cada uma das amostras do
vírus rábico, foi previamente determinada na Seção de Raiva do Instituto
Butantan, em camundongos heterogêneos N:NIH e nas linhagens AIRmax e
AIRmin, no Instituto Pasteur. A DL50 foi calculada pelo método de Reed &
Muench (REED & MUENCH, 1938), sendo a dose de 100DL50, considerada
ideal para ambas as amostras virais.
47
3.3.2 Suscetibilidade dos camundongos das linhagens AIRmax e AIRmin, à
infecção com as amostras do vírus rábico
Camundongos das linhagens AIRmax e AIRmin foram inoculados
por via IC com 30µL das suspensões, contendo 100DL50 dos vírus PV1 43/4
e V3. Os animais foram observados por 30 dias, anotando-se diariamente a
mortalidade. O tempo médio de sobrevida, para as duas linhagens, foi
calculado em função da média de mortalidade ocorrida após a infecção.
3.3.3 Replicação das amostras do vírus rábico no SNC de camundongos
AIRmax e AIRmin
Grupos de 30 camundongos AIRmax e AIRmin foram infectados
com 30µL das amostras virais, contendo 100DL50. Os animais foram
anestesiados, sangrados por punção do plexo retro-orbital e eutanasiados
para posterior colheita dos cérebros, nos dias 3, 4, 5, 6 e 7 pós-infecção com
a amostra de vírus PV1 43/4 e nos dias 6, 7, 8, 9 e 10 com a V3. Os
encéfalos e medulas foram acondicionados em nitrogênio líquido, para a
determinação da cinética de replicação viral e estudo da histopatologia da
infecção e os soros foram acondicionados a -20ºC, para a titulação de
anticorpos anti-rábicos IgG e dos isótipos IgG1 e IgG2a.
48
3.3.4
Cinética
de
replicação
viral
determinada
em
camundongos
heterogêneos albinos suíços
A partir dos encéfalos e medulas dos camundongos AIRmax e
AIRmin acondicionados em nitrogênio líquido, para cada amostra viral e para
cada dia pós-infecção, foi realizado um “pool” de três amostras e preparadas
suspensões a 20% (peso/volume) em tampão PBS/BSA 0,075% 0,01M.
Grupos de 10 camundongos heterogêneos albinos suíços, com 11 a 14 g,
foram inoculados por via IC com 30µL de cada uma das suspensões virais
diluídas na razão 10 (10-1 a 10-5). Os animais foram observados diariamente,
sendo avaliada a progressão da doença, e o título viral determinado através
do método de Reed & Muench.
3.4 Titulação de anticorpos
3.4.1 Determinação dos títulos de anticorpos anti-rábicos durante o estudo
da cinética de replicação viral
Os soros dos camundongos AIRmax e AIRmin infectados e
acondicionados a temperatura de -20°C, conforme descrito no item 3.3.3,
foram descongelados e submetidos ao preparo de um “pool”, a partir de três
amostras de soros para cada um dos dias pós-infecção. Os títulos de IgG
foram
calculados
pela
técnica
imunoenzimática
(CONSALES, 1999).
49
(ELISA)
clássico
Microplacas foram sensibilizadas com 50µL/orifício do vírus rábico
PV lote 06/03, na concentração 1,25µg/mL em PBS pH 7.4 0,01M e
incubadas a 4°C por 18 horas. Após incubação, as microplacas foram
lavadas com PBS Tween 20, por cinco vezes, e os sítios livres, bloqueados
com 200µL de PBS-gelatina a 1% e então incubadas à temperatura
ambiente por três horas. Após este período e a cada etapa da reação, foram
realizadas lavagens como mencionado acima, e a seguir, adicionados 50µL
das amostras de soros e dos controles positivo e negativo, em duplicata,
diluídos na razão 2. As microplacas foram incubadas a 4°C por 18 horas. A
seguir, foram adicionados 50µL de anticorpo de cabra anti-IgG total de
camundongo, conjugado à fosfatase alcalina, diluído a 1:10000 em PBS
gelatina 0,1%. Após 1 hora de incubação à temperatura ambiente, foram
adicionados
50µL
do
substrato
P-nitrophenil-phosphatase
disodium
hexahydrate, diluído em tampão dietanolamina pH 9.8 na concentração de
1mg/mL. Após 30 minutos, a reação foi interrompida com solução de
hidróxido de sódio 1N, e a densidade óptica, determinada em leitor de
ELISA. A absorbância específica igual ou maior a 0,150 foi considerada
como reação positiva. Os títulos de anticorpos anti-rábicos foram expressos
como log2 da recíproca da maior diluição dos soros.
3.4.2 Determinação dos títulos dos isótipos IgG1 e IgG2a anti-rábicos, durante
o estudo da cinética de replicação viral.
Os títulos dos isótipos IgG1 e IgG2a foram determinados através
do método imunoenzimático (ELISA) de captura (CONSALES, 1999).
Microplacas foram sensibilizadas com 50µL/orifício do vírus rábico PV/VERO
50
06/03, na concentração de 1,25µg/mL e incubadas à 4°C por 18 horas. Após
incubação, as microplacas foram lavadas com PBS Tween 20 por cinco
vezes, e os sítios livres, bloqueados com 200µL de PBS-gelatina 1%, para
posterior incubação à temperatura ambiente por três horas. Após este
período e a cada etapa da reação, foram realizadas lavagens, como
anteriormente mencionado e, a seguir, adicionados 50µl das amostras de
soros e dos controles positivo e negativo em duplicata, diluídos na razão 2.
As microplacas foram mantidas à 4°C por 18 horas. A seguir, foram
adicionados 50µl dos anticorpos monoclonais biotinilados anti IgG1 e anti
IgG2a de camundongo, na concentração de 8µg/mL e as microplacas
mantidas a temperatura ambiente, por uma hora. Posteriormente, foram
adicionados 50µL de avidina conjugada à fosfatase alcalina, na diluição de
1:10000 em PBS-gelatina 0,1% e, após uma hora de incubação à
temperatura ambiente, foram adicionados 50µL do substrato P-nitrophenilphosphatase disodium hexahydrate diluído em tampão dietanolamina pH
9.8, na concentração de 1mg/mL. Após 30 minutos, a reação foi interrompida
com solução de hidróxido de sódio 1N e a densidade óptica determinada em
leitor de ELISA. A absorbância específica igual ou maior a 0,150 foi
considerada como reação positiva. Os títulos de anticorpos dos isótipos IgG1
e IgG2a foram expressos como log2 da recíproca da maior diluição dos soros.
3.5 Estudo histopatológico
Os encéfalos e medulas, conforme descrito no item 3.3.3, foram
retirados do nitrogênio líquido, colocados separadamente em 10mL de
fixador Karnowsky e a seguir, desidratados e incluídos em parafina. Cada
51
amostra foi submetida a cortes histológicos aleatórios, de 5µ de espessura,
para confecção das lâminas, as quais foram coradas pela técnica de
Hematoxilina-Eosina (HE), para a detecção de detalhes morfológicos e
corpúsculos de inclusão.
Os cérebros dos animais AIRmax e AIRmin, mantidos como
controles negativos, também foram submetidos ao preparo de lâminas e
corados pelo método de HE (Figuras 9 e 10).
As lâminas coradas por HE foram lidas em microscópio com
ocular de aumento de 10 vezes e objetivas com aumento de 400 vezes e as
imagens, capturadas com câmera fotográfica. Foram estabelecidos critérios
para a leitura e posterior contagem de neutrófilos, sendo que cada lâmina foi
dividida em 10 campos aleatórios, os quais foram diferenciados quanto à
região do SNC (hipocampo, córtex, cerebelo e medula). Com a finalidade de
evitar vícios de contagem sobre os campos comuns em um mesmo corte, foi
utilizado um esquema pelo qual se dividiram as lâminas em quadrantes,
fazendo-se a leitura num determinado sentido.
3.6 Análise estatística
Para a análise estatística, foram utilizados os testes de
Kolmogorov-Smirnov (K-S), Levene, t de Student e Mann-Whitney para
verificar se as diferenças interlinhagens foram estatisticamente significativas
durante a cinética de replicação viral das duas amostras no SNC e na
produção de igG anti-rábica e dos isótipos IgG1 e IgG2a.
52
Foi aplicada a relação AIRmaxec x AIRminec para expressar os
resultados de média e desvio padrão da replicação viral nos encéfalos e
AIRmaxmd x AIRminmd, nas medulas.
Para verificar a igualdade (homogeneidade) das variâncias, foi
utilizado o teste Levene, tendo como parâmetro o resultado de p< 0,05
(DAWSON & TRAPP, 2003).
Em seguida, foi aplicado o teste não paramétrico de K-S, para
verificar se a distribuição de freqüências de uma dada variável poderia ser
considerada normal, ou seja, p< 0,05 (SIEGEL, 1975).
Para comparar duas médias de amostras independentes, quando
houve igualdade de variâncias pelo teste de Levene (p< 0,05), foi aplicado o
teste paramétrico t de Student (DAWSON & TRAPP, 2003).
Quando a distribuição das freqüências de uma dada variável não
foi considerada normal, foi utilizado o teste não paramétrico Mann-Whitney,
que verifica a diferença entre a distribuição de duas populações.
Todos os testes foram feitos através de software estatístico SPSS
10.0 for windows, com nível de significância de 5%.
53
RESULTADOS
4 RESULTADOS
4.1 Infecção viral
4.1.1 Determinação da DL50 para as amostras virais PV1 43/4 e V3
Após inoculação IC com as amostras em estudo, foi confirmada
100DL50 como a dose ideal infectante.
4.1.2 Determinação da suscetibilidade de camundongos AIRmax e AIRmin,
após infecção via IC com as amostras virais PV1 43/4 e V3
Os animais inoculados foram observados diariamente quanto à
sintomatologia e não houve diferença na suscetibilidade à infecção entre as
duas linhagens para ambas as amostras virais, sendo o período de
incubação de 6 a 7 dias para a PV1 43/3 e de 9 a 10 dias, para a V3.
4.1.3
Cinética
da
replicação
viral
determinada
em
camundongos
heterogêneos albinos suíços
Após inoculação IC, observou-se que, para ambas as linhagens
de camundongos, a amostra PV1 43/4 replicou-se de forma crescente a
55
cada dia pós-infecção, apresentando maiores títulos virais nos encéfalos em
relação às medulas (Figuras 1 e 2). Entretanto, a amostra V3, replicou-se de
forma irregular, sendo que os títulos virais foram praticamente iguais nos
encéfalos e nas medulas (Figuras 3 e 4).
O teste de Levene é aplicado quando há igualdade das variâncias
e se a distribuição for normal (K-S). São condições para definir seu uso ou
não: teste t de Student e teste Mann-Whitney. São estes dois testes que irão
responder se há diferença estatisticamente significativa (p<0,05) entre as
médias.
Os resultados das médias e dos desvios padrões durante a
cinética de replicação viral, estão expressos nas tabelas 1 e 2.
A igualdade das variâncias, durante a cinética de replicação viral,
foi analisada através do teste Levene. Na análise da replicação viral, para a
amostra PV1 43/4, a variância foi de 0,9 e 0,6 para encéfalos e medulas
respectivamente e, para a amostra V3, de 1,0 e 0,7.
A distribuição de freqüências das variáveis foi analisada pelo teste
K-S, demonstrando que, nos encéfalos, a freqüência foi de 0,7 e 0,6 na
amostra PV1 43/4 e V3, respectivamente e, nas medulas, 0,8 e 0,9.
Para variâncias iguais observadas durante a cinética de
replicação viral, foi aplicado o teste t de Student, demonstrando que, para a
amostra PV1 43/4, a variância foi de 0,8 nos encéfalos e 0,7 nas medulas e,
para a amostra V3, 0,3 nos encéfalos e 0,6 nas medulas.
56
ec
md
6,0
5,0
Título Log10
4,0
3,0
2,0
1,0
0,0
3º dia
4º dia
5º dia
6º dia
7º dia
Dias pós-infecção
Figura 1 - Cinética de replicação da amostra PV1 43/4 no SNC de camundongos AIRmax
6,0
ec
md
5,0
Título Log10
4,0
3,0
2,0
1,0
0,0
3º dia
4º dia
5º dia
6º dia
7º dia
Dias pós-infecção
Figura 2 - Cinética de replicação da amostra PV1 43/4 no SNC de camundongos AIRmin
57
ec
md
6,0
5,0
Título Log10
4,0
3,0
2,0
1,0
0,0
6º dia
7º dia
8º dia
9º dia
10º dia
Dias pós-infecção
Figura 3 - Cinética de replicação da amostra V3 no SNC de camundongos AIRmax
ec
md
6,0
5,0
Título Log10
4,0
3,0
2,0
1,0
0,0
6º dia
7º dia
8º dia
9º dia
10º dia
Dias pós-infecção
Figura 4 - Cinética de replicação da amostra V3 no SNC de camundongos AIRmin
58
Tabela 1: Relação interlinhagens entre médias e desvios-padrões, durante a replicação viral
da amostra PV1 43/4 nos encéfalos e medulas.
AIRmax
AIRmin
PV
x
s
x
s
Ec
4,0
1,9
3,7
2,1
Md
2,5
1,3
2,2
1,0
x : média
s: desvio padrão
Levene
K-S
AIRmaxec X AIRminec
p= 0,9
AIRmaxmd X AIRminmd
p= 0,6
AIRmaxec X AIRminec
p= 0,7
AIRmaxmd X AIRminmd
p= 0,8
t de Student AIRmaxec X AIRminec
p= 0,8
AIRmaxmd X AIRminmd
p= 0,7
Tabela 2: Relação interlinhagens entre médias e desvios-padrões, durante a replicação viral
da amostra V3 nos encéfalos e medulas.
AIRmax
AIRmin
V3
x
s
x
s
ec
3,4
0,9
2,8
1,0
md
2,8
1,1
3,2
1,2
x : média
s: desvio padrão
Levene
K-S
AIRmaxec X AIRminec
p= 1,0
AIRmaxmd X AIRminmd
p= 0,7
AIRmaxec X AIRminec
p= 0,6
AIRmaxmd X AIRminmd
p= 0,9
t de Student AIRmaxec X AIRminec
p= 0,3
AIRmaxmd X AIRminmd
p= 0,6
59
4.2 Titulação de anticorpos IgG e isótipos IgG1 e IgG2a durante a
cinética de replicação viral
Os títulos de IgG nos soros de camundongos das linhagens
AIRmax e AIRmin, infectados com as amostra em estudo, conforme descrito
no item 3.3.3, foram titulados pelo método de ELISA clássico e os isótipos
IgG1 e IgG2a, pelo método de ELISA de captura.
Os títulos de IgG para a amostra PV1 43/4 mantiveram-se altos
durante todo o período de infecção e praticamente não houve diferenças
interlinhagens. Entretanto, em relação ao isótipo IgG1, a diferença foi três e
cinco vezes maior nos dias 6 e 7 pós-infecção, para os camundongos da
linhagem AIRmax, respectivamente. Para o isótipo IgG2a, os títulos
mantiveram-se constantes durante todo o período, não havendo diferença
entre as linhagens (Figuras 5 e 6).
Os títulos de IgG para a amostra V3 foram três vezes maiores nos
dias 8 e 10 pós-infecção para os camundongos AIRmax, e os títulos de IgG1,
cinco vezes maiores no dia 10, nos camundongos da linhagem AIRmax,
quando comparados aos AIRmin e, conforme ocorreu com a amostra PV1
43/4, pôde-se observar que com a amostra V3, os títulos do isótipo IgG2a
também mantiveram-se constantes e iguais para ambas linhagens de
camundongos (Figuras 7 e 8).
Através do teste Levene, foi analisada a igualdade das variâncias
para a titulação de anticorpos anti-rábicos, durante a cinética de replicação
viral, sendo de 0,9 e 0,01 na relação de encéfalos e medulas com a amostra
PV1 43/4 e de 0,7 e 0,02, para a amostra V3.
60
O teste K-S demonstrou que, a distribuição de freqüência das
variáveis a partir da titulação de IgG anti-rábica foi de 0,9 e 0,03 em
encéfalos e medulas infectados com a amostra fixa e, de 0,7 e 0,04, para a
amostra V3. Quanto à análise da diferença entre a distribuição de
populações de anticorpos anti-rábicos, foi aplicado o teste Mann-Whitney,
sendo para a amostra PV1 43/4, o resultado de U= 0,1 e para a V3, U= 0,3.
Os resultados das médias e dos desvios padrões na produção de
IgG e dos isótipos IgG1 e IgG2a durante a cinética de replicação viral, estão
expressos nas tabelas 3 e 4.
61
12,0
IgG
IgG1
IgG2a
10,0
Título log2
8,0
6,0
4,0
2,0
0,0
3º dia
4º dia
5º dia
6º
dia
7º dia
Dias pós-infecção
Figura 5 - Título de anticorpos anti-rábicos e isótipos IgG1 e IgG2a após
infecção com amostra PV1 43/4 em camundongos AIRmax, determinados
pelo método imunoenzimático ELISA
IgG
IgG1
IgG2a
14,0
12,0
Título Log2
10,0
8,0
6,0
4,0
2,0
0,0
3º dia
4º dia
5º dia
6º dia
7º dia
Dias pós-infecção
Figura 6 – Títulos de anticorpos anti-rábicos e isótipos IgG1 e IgG2a após
infecção com amostra PV1 43/3 em camundongos AIRmin, determinados pelo
método imunoenzimático ELISA
62
12,0
IgG
IgG1
IgG2a
10,0
Título Log2
8,0
6,0
4,0
2,0
0,0
6º dia
7º dia
8º dia
9º dia
10º dia
Dias pós-infecção
Figura 7 – Títulos de anticorpos anti-rábicos e isótipos IgG1 e IgG2a após
infecção com amostra V3 em camundongos AIRmax, determinados pelo
método imunoenzimático ELISA
IgG
IgG1
IgG2a
12,0
10,0
Título Log2
8,0
6,0
4,0
2,0
0,0
6º dia
7º dia
8º dia
9º dia
10º dia
Dias pós-infecção
Figura 8 – Títulos de anticorpos anti-rábicos e isótipos IgG1 e IgG2a após
infecção com amostra V3 em camundongos AIRmin, determinados pelo método
imunoenzimático ELISA
63
Tabela 3: Relação interlinhagens entre médias e desvios-padrões, durante titulação de IgG
anti-rábica e isótipos IgG1 e IgG2a da amostra PV1 43/4 no SNC.
AIRmax
PV
AIRmin
x
s
x
s
IgG
7, 6
2,8
1,0
2,0
IgG1
4,4
2,2
3,0
0
IgG2a
3,0
0
3.0
0
x : média
s: desvio padrão
Levene
K-S
AIRmaxec X AIRminec
p= 0,9
AIRmaxmd X AIRminmd
p= 0,01
AIRmaxec X AIRminec
p= 0,9
AIRmaxmd X AIRminmd
p= 0,03
Mann-Whitney U= 0,1
Tabela 4: Relação interlinhagens entre médias e desvios-padrões, durante titulação de IgG
anti-rábica e isótipos IgG1 e IgG2a da amostra V3 no SNC.
AIRmax
V3
AIRmin
x
s
x
s
IgG
10,2
1,1
8,4
1,5
IgG1
5,0
1,9
3,6
0,5
IgG2a
3,0
0
3,0
0
x : média
s: desvio padrão
Levene
K-S
AIRmaxec X AIRminec
p= 0,7
AIRmaxmd X AIRminmd
p= 0,02
AIRmaxec X AIRminec
p= 0,7
AIRmaxmd X AIRminmd
p= 0,04
Mann-Whitney U= 0,3
64
4.3 Estudo histopatológico
Foram feitas leituras das lâminas coradas através da técnica de
HE, conforme citado no item 3.5. As lâminas controles também foram
submetidas à coloração e fotografadas (Figura 9 e 10). A presença de focos
inflamatórios não foi limitante para a captura das imagens, as quais foram
fotografadas e, concomitantemente, feitas as contagens dos neutrófilos
(Figuras 11 e 12). A presença de corpúsculos de inclusão foi observada em
maior quantidade em neurônios infectados com a amostra fixa de vírus
rábico (Figura 13).
Durante a leitura das lâminas, além dos neutrófilos, foram
encontradas
evidências
de
focos
inflamatórios,
como:
manguitos
perivasculares, populações de linfócitos (Figura 14), infiltrados celulares,
entretanto, as evidências que compõem o quadro ilustrativo não contemplam
em alguns aspectos a resposta inflamatória aguda.
As
porcentagens
de
neutrófilos
encontradas
nos animais
inoculados com a amostra PV1 43/4 foram discretamente maiores na
linhagem AIRmin, fato que pode ser explicado devido aos animais AIRmax
apresentarem uma resposta inflamatória aguda muito rápida ao estímulo
antigênico. Praticamente não houve diferença entre as linhagens nos
camundongos inoculados com a amostra V3 (Tabela 5).
Quanto à região cerebral, para as duas amostras, houve maior
número de neutrófilos no encéfalo em relação à medula, entretanto, nas
lâminas infectadas com a amostra PV1 43/4, houve maior concentração de
65
neutrófilos no hipocampo e com a V3, no córtex, sendo que o número de
neutrófilos decresceu durante a evolução da infecção.
Tabela 5: Porcentagens de neutrófilos encontradas nos encéfalos e medulas de
camundongos infectados com as amostras PV1 43/4 e V3, em diferentes dias pós-infecção.
LINHAGEM
TECIDO
Ec
MAX
Md
Ec
MIN
Md
PV
V3
DIA
%Ne
DIA
%Ne
5
70
8
70
6
42
9
87
7
56
10
75
5
30
8
30
6
58
9
13
7
44
10
25
5
63
8
70
6
59
9
78
7
92
10
66
5
37
8
30
6
41
9
22
7
8
10
34
66
Figura 9 – MAX controle negativo. Corte histológico de hipocampo
Figura 10 – MIN controle negativo. Corte histológico de hipocampo
67
Figura 11 – MAX PV1 43/4. Corte histológico de hipocampo com grande
quantidade de neutrófilos
Figura 12 – MIN V3. Corte histológico de hipocampo evidenciando foco
inflamatório com grande quantidade de neutrófilos
68
Figura 13 – Corte histológico de córtex evidenciando Corpúsculos de
Negri em neurônios infectados
Figura 14 – Corte histológico de cortex, mostrando foco inflamatório
com aspecto linfocitário
69
DISCUSSÃO
DISCUSSÃO
Diversos modelos experimentais têm sido utilizados na tentativa
de esclarecer os possíveis mecanismos imunopatológicos envolvidos na
infecção
rábica.
Dentre
esses
modelos,
incluem-se
camundongos
isogênicos, entretanto, por não terem sido selecionados com base em
parâmetros imunológicos, estas linhagens apresentam um potencial imune
mediano, já que a freqüência de alelos com características extremas
encontra-se reduzida (LODMELL, 1985).
Estudos anteriores, nos quais foram utilizadas linhagens boas e
más respondedoras de anticorpos das Seleções III e IV, demonstraram que,
animais inoculados com amostra de vírus rábico fixo CVS, não apresentaram
diferenças interlinhagens, em relação à sensibilidade inata, porém, após a
imunização e desafio, foram observados índices de proteção superiores nas
linhagens boas respondedoras de ambas as seleções. A participação da
resposta humoral na resistência adquirida a este patógeno foi pela primeira
vez imunogeneticamente demonstrada (NILSSON et al., 1979; De FRANCO,
1996).
Na Seleção I, camundongos bons respondedores de anticorpos
apresentaram resistência inata significativamente superior, após infecção por
via IM (intramuscular) com a amostra de vírus rábico fixo PV. Esta
resistência aumentada foi atribuída à maior síntese de IFN-γ no SNC durante
a infecção, provavelmente pelo processamento mais lento do antígeno
rábico pelos macrófagos dos camundongos da linhagem boa respondedora
71
de anticorpos, permitindo assim, melhores condições de apresentação do
antígeno (CONSALES et al., 1990).
Sendo a reação inflamatória um importante mecanismo de defesa
que interage e até modula a expressão das reações imunes específicas,
foram utilizadas, neste estudo, linhagens com reatividade inflamatória aguda
de máxima e mínima intensidade, cuja principal característica fenotípica
selecionada, é a habilidade que estas linhagens têm em recrutar células
inflamatórias e mediadores ao sítio de agressão (IBAÑEZ et al., 1992).
Em estudos realizados com camundongos AIRmax e AIRmin
inoculados com proteínas heterólogas, antígenos bacterianos e veneno de
Bothrops jararaca, foi observado que o processo seletivo não afetou a
resposta imune específica, nem a mediada por células, entretanto, as
linhagens diferiram em relação à resposta inflamatória local, na qual os
camundongos da linhagem AIRmax apresentaram maior reatividade
inflamatória, com significante aumento de infiltrado celular no local da
inoculação. Esta diferença indica que a modificação geral da resposta
inflamatória local em animais desta seleção independe do agente utilizado
na indução deste tipo de resposta (ARAUJO et al., 1998; VIGAR et al., 2000;
CARNEIRO et al., 2002).
As infecções virais que acometem o SNC, na grande maioria são
letais, pois se trata de um sítio imunoprevilegiado, no qual as funções
imunes são restritas e os vírus têm desenvolvido mecanismos eficazes que
lhes permitem adaptarem-se e escapar da resposta imune, disseminando-se
pelo hospedeiro. O vírus rábico, após invadir o SNC, permanece invisível ao
72
sistema imune, provavelmente pelo mecanismo de apoptose, ou seja, a
morte programada de neurônios infectados (THEERASURAKARN & UBOL,
1998).
Na infecção natural pelo vírus rábico, são observadas poucas
lesões neuropatológicas e focos inflamatórios, entretanto, a sintomatologia
clínica é bastante severa, levando o indivíduo à morte. Isso pode ser
explicado devido ao fato de ocorrer uma disfunção dos neurônios e não a
morte destas células, dado aos mecanismos efetores imunes, incriminados
com o dano imunopatológico. Para tanto, a utilização de modelos animais
para estudar os mecanismos envolvidos na apoptose induzida pelo vírus
rábico, podem proporcionar um melhor entendimento desta disfunção
neurológica (JACKSON, 2002).
A progressão da infecção no SNC é acompanhada pela produção
de citocinas e de diferentes mediadores, como o óxido nítrico e outras
neurotoxinas endógenas. Isso resulta na migração de células T através da
barreira hematoencefálica, entretanto, sendo incapaz de controlar a
progressão da infecção. A produção de óxido nítrico em animais infectados
vem sendo investigada, sendo relacionada com a severidade dos sintomas
clínicos e à presença de células inflamatórias (AKAIKE et al., 1995).
Durante a infecção rábica, uma seqüência de estímulos físicos,
químicos e biológicos rompe a integridade do organismo através de
eventuais
lesões
acometidas
por
arranhaduras,
mordeduras
e/ou
lambeduras de animais infectados, podendo desencadear um processo
inflamatório, o qual pode se caracterizar por: febre, alterações sanguíneas
73
como a vasodilatação, leucocitose, aumento da permeabilidade vascular,
hemoconcentração e aumento da síntese protéica de fase aguda
(WEISSMAN, 1988; KOJ, 1985).
A infecção por amostra de vírus fixo CVS limita a inflamação do
SNC, estimulando a produção de agentes neuroprotetores, como a IL-6,
destruindo as células T migratórias. Em contrapartida, a infecção do SNC
por amostra de vírus PV desencadeia uma inflamação mais severa e,
consequentemente, os neurônios infectados são destruídos e a propagação
da infecção através do cérebro é interrompida. A destruição de células
infectadas com o vírus PV é um mecanismo dependente de células T para o
controle da neuroinvasão (GALELLI et al., 2000, BALOUL & LAFON, 2003).
Os morcegos são animais que, quando infectados, além de
causarem prejuízos para a pecuária, são responsáveis pela diminuição de
produtividade devido a repetidos ataques, causando: infecções secundárias
às feridas, anemia devido à perda de sangue, depreciação da pele, além de
serem uma ameaça à saúde humana. Atualmente, a raiva aparece com mais
freqüência em morcegos não-hematófagos e animais domésticos (cães e
gatos), fato confirmado através do isolamento da V3 destes animais.
Associações entre as variantes do vírus, hospedeiros e a área
geográfica, indicam a existência de uma sintonia entre a variante e a espécie
hospedeira; que se caracteriza pelos mecanismos de patogenia que
produzem manifestações clínicas singulares para a perpetuação do vírus,
além do equilíbrio natural ecológico (CHARLTON, 1994).
74
Durante o estudo da infecção rábica com as amostras PV1 43/4 e
V3, utilizando linhagens de camundongos AIRmax e AIRmin, pôde-se
observar diferenças na replicação viral nos encéfalos e medulas, para
ambas amostras virais; sendo que, para o vírus fixo PV, conforme esperado,
a replicação aumentou durante o período de infecção, atingindo o pico no
sétimo dia pós-infecção, sendo maior no encéfalo, comparado à medula.
Quanto à infecção das linhagens com a amostra V3, a replicação se
manteve praticamente igual durante quase todo o período de infecção, não
havendo diferença acentuada na replicação viral no encéfalo em relação à
medula, sendo o período de incubação de dez dias. Apesar das diferenças
observadas no período de incubação, a mortalidade para ambas as
linhagens foi de 100%.
Os dados histopatológicos foram compatíveis aos encontrados na
literatura. Em virtude da técnica de coloração por HE não ser adequada para
a diferenciação de células inflamatórias, este experimento restringiu-se à
observação de: vasos sanguíneos rodeados por PMN, neurônios em
degeneração, áreas com gliose focal, infiltrados perivasculares e a presença
de corpúsculos de inclusão. Entretanto, como foram utilizadas linhagens
reativas à inflamação aguda, estabeleceu-se as contagens de neutrófilos,
por serem células que fazem parte do processo inflamatório agudo.
Na análise de produção de IgG anti-rábica nos soros dos animais
infectados,
detectaram-se
discretas
diferenças
interlinhagens,
sendo
superior nos camundongos AIRmax. Em relação aos isótipos de IgG, houve
uma diferença interlinhagem dos títulos de IgG1 para os animais AIRmax,
sugerindo que a estimulação de população T helper 2 induziria a liberação
75
de IL-4, que ativa os linfócitos B na produção de anticorpos (ROMAGNANI,
1992).
De acordo com os testes estatísticos utilizados para verificar as
diferenças interlinhagens durante a infecção com as amostras PV1 43/4 e
V3, observou-se que, durante a replicação viral, houve igualdade das
variâncias, já que para ambas as linhagens, o resultado foi maior, sendo
p>0.05. A distribuição de freqüências das variáveis também foi considerada
normal, já que o resultado, para todos os parâmetros analisados, foi p>0.05.
Como houve igualdade nas variâncias, foi aplicado o teste t de
Student, demonstrando não haver diferença significativa entre os resultados
obtidos após infecção com as duas amostras em estudo.
Na análise de populações de anticorpos anti-rábicos feita através
do teste de Mann-Whitney, verificou-se não ter diferença significativa na
distribuição de IgG e os isótipos IgG1 e IgG2a, já que U>0.05.
76
CONCLUSÕES
6 CONCLUSÕES
Não houve diferença interlinhagens durante a cinética de replicação
viral para ambas as amostras em estudo, entretanto, a amostra PV1
43/4 replicou-se de forma crescente, apresentando maiores títulos
nos encéfalos e a V3, de forma irregular, com títulos praticamente
iguais nos encéfalos e medulas.
As linhagens AIRmax e AIRmin apresentaram poucas diferenças na
resposta imune humoral específica durante a cinética de replicação
das amostras de vírus rábico PV1 43/4 e V3. Houve superioridade da
linhagem AIRmax em produzir IgG1, o que pode estar relacionado a
uma tendência de estimulação preferencial de subpopulações Th2
nos animais desta linhagem.
Durante a cinética de replicação viral, foram observados Corpúsculos
de Negri em neurônios infectados com ambas as amostras virais,
porém, em maior quantidade nos infectados com a amostra PV1 43/4.
As duas amostras apresentaram focos inflamatórios, entretanto, em
relação às linhagens, houve um discreto aumento nos animais
AIRmin.
78
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90
ANEXOS
Soluções
Solução PBS pH 7.4 - 0,01M
Na2HPO4
7,6g
NaCl
4,8g
KH2PO4
H2O bidestilada qsp
1000mL
Solução salina tamponada pH7. 2 - 0,01M
NaH2PO4 H2O
0,36g
Na2HPO4 12H2O
2,65g
NaCl
8,17g
H2O bidestilada qsp
1,45g
1000mL
Solução diluente
NaCl
8,5g
Garamicina
1mL
Soro fetal bovino
H2O bidestilada qsp
20mL
1000mL
Solução de Hidróxido de sódio (NaOH) – 1N
Tampão PBS/BSA 0,075% 0,01M – Solução salina tamponada com
fosfatos, acrescida de soroalbumina bovina.
Tampão dietanolamina pH 9.8 1mg/mL
10% Dietanolamina Merk
0,5 Mmol/L MgCl2 Merk
Tampão de lavagem - PBS Tween 20
Concentração 50 vezes
0,5M Na2HPO4
0,5M KH2PO4
Concentração uma vez
Solução na concentração 50 vezes
100mL
Tween 20
2,5mL
H2O bidestilada qsp
Anticorpos
monoclonais
5000mL
biotinilados
anti-IgG1 e
anti-IgG2a de
camundongo
Produto Zymed 04-6140 e 04-6240, San Francisco, CA
Concentração: 8µg/mL
Anticorpo de cabra anti-IgG total de camundongo conjugado à
fosfatase alcalina
Produto: Sigma A2179, Saint Louis, USA
Substrato P-nitrophenil-phosphatase disodium hexahydrate
Produto: PNPP, Sigma 104®
Avidina conjugada à fosfatase alcalina
Produto: Sigma A 7294
Polyoxyethylenesorbitan monolaurate (Tween 20)
Produto: Sigma P 1379
Fixador Karnowsky
Paraformaldeído 40%
100mL
Água destilada
900mL
Fosfato monobásico de Sódio
Fosfato dibásico de Sódio (anidro)
Material
Microplacas de 96 orifícios
Produto: Nunc, Maxi Scorp, Denmark
Equipamentos
Leitor de ELISA com filtro 405nm
Produto: Multiskan®EX
Microscópio com aumento de 400x e retículo 10x10 na ocular
Produto: NIKON eclipse E800
Câmera
Produto: CoolSNAP – ProCF color
4g
6,5g