DETECÇÃO DE Chlamydia trachomatis EM ESTUDANTES

UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
FACULDADE DE BIOMEDICINA
MARIA RENATA MENDONÇA DOS SANTOS
DETECÇÃO DE Chlamydia trachomatis EM ESTUDANTES
UNIVERSITÁRIAS ATENDIDAS NO LABOTATÓRIO DE CITOPATOGIA/
UFPA: ANÁLISE CITOLÓGICA E MOLECULAR.
BELÉM- PARÁ
2012
MARIA RENATA MENDONÇA DOS SANTOS
DETECÇÃO DE Chlamydia trachomatis EM ESTUDANTES
UNIVERSITÁRIAS ATENDIDAS NO LABOTATÓRIO DE CITOPATOGIA/
UFPA: ANÁLISE CITOLÓGICA E MOLECULAR.
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado a
Faculdade de Biomedicina da Universidade Federal
do Pará, como requisito parcial para a obtenção do
grau de Bacharel em Biomedicina.
Orientadora: Profª Drª Mihoko Yamamoto Tsutsumi
Co- orientadora: Profª Drª Maisa Silva de Sousa
BELÉM- PARÁ
2012
MARIA RENATA MENDONÇA DOS SANTOS
DETECÇÃO DE Chlamydia trachomatis EM ESTUDANTES
UNIVERSITÁRIAS ATENDIDAS NO LABOTATÓRIO DE CITOPATOGIA/
UFPA: ANÁLISE CITOLÓGICA E MOLECULAR.
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado
a Faculdade de Biomedicina da Universidade
Federal do Pará, como requisito parcial para
a obtenção do grau de Bacharel em
Biomedicina, aprovado com o conceito
________________________.
Belém (PA), 14 de Dezembro de 2012.
Banca examinadora:
___________________________________
Profª Drª Mihoko Yamamoto Tsutsumi
(ICB- UFPA/ Orientador)
_________________________________
Profª Drª Maisa Silva de Sousa
(NMT- UFPA/ Co- orientadora)
_________________________________
Profª Drª Karla Tereza silva Ribeiro
(UFPA- Membro)
___________________________________
Prof. Dr. Marcelo de Oliveira Bahia
(UFPA- Membro
___________________________________
Prof. Dr. Moisés Batista da Silva
(UFPA- Suplente)
i
Suba o primeiro degrau com fé. Não é necessário que você
veja toda a escada. Apenas dê o primeiro passo.
Martin Luther King
ii
DEDICATÓRIA
À Deus, meu Criador e Salvador. Aos meus
pais, por todo amor e que sempre estiveram ao meu
lado em todas as etapas de minha vida. À minha
irmã por toda confiança e apoio e que sempre me
motivou.
iii
AGRADECIMENTOS
Primeiramente agradeço à Deus, o qual é o segredo de todas vitórias e conquistas de
minha vida. Agradeço a minha família que foram a base de sustentação em todos os tempos.
Meu pai, Luiz Antônio; Minha mãe, Ruth; minha irmã Roberta, amo vocês.
Às minhas orientadoras, Drª Mihoko Tsutsmi e Drª Maisa Sousa que contribuíram
para a realização deste trabalho me ensinando e incentivando ao conhecimento.
Ao meu querido Robson, mesmo estando longe sempre me fortaleceu. À Pra. Joana
minha mãe- amiga, sempre direcionando bênçãos na minha vida. Às minhas amigas Ruth e
Maiana, juntas nós vivemos momentos de alegrias e tristezas, mas no final sempre tudo dá
certo.
À minha maravilhosa turma de biomedicina, foram muito felizes e divertidos esses
anos de convivência. Aos amigos do Núcleo de Medicina Tropical: Jackeline, Ildson,
Henrique e Jeniffer, cada um fez parte dessa história. Às meninas de citopatologia: Tânia e
Josi, desejo sucesso à vocês. Enfim, agradeço a todos que de alguma forma contribuíram para
minha formação.
iv
LISTA DE FIGURAS E TABELAS
Figura
01
-
Modelo
da
parede
celular
ou
envelope
da
Chlamydia
trachomatis................................................................................................................................4
Figura 02 - Representação do cromossomo circular da Chlamydia trachomatis D/UW3
genome annotation [GenBank: AE001273]................................................................................5
Figura
03
-
Reconstrução
filogenética
dos
sorotipos
de
Chlamydia
trachomatis...................................................................................................................6
Figura 04 - Ciclo biológico da Chlamydia trachomatis.............................................................7
Figura 05. Distribuição de estudantes por faixa etária.............................................................20
Figura 06 - Vacúolo sem inclusão intracitoplasmática............................................................22
Figura 07. Resultados citológicos...........................................................................................23
Figura 08 - Frequência de Chlamydia sp e achados citológicos, de acordo com a
idade............................................................................................................................24
Quadro 1. Sorotipos de Chlamydia trachomatis e principais doenças associadas....................3
Quadro 2. Métodos de diagnóstico..........................................................................................12
Tabela 01- Oligonucleotídeo utilizados na amplificação das sequências de CT no gene
ompA.........................................................................................................................................18
Tabela 02 - Distribuição percentual das estudantes segundo perfil sexual..............................21
Tabela 03 - Perfil sóciodemográfico e fatores de risco das estudantes infectadas...................22
v
LISTA DE ABREVEATURAS
ASC-US: Atipia de Células Escamosa de Significado Indeterminado
ASC-H: Atipia Escamosa, sem excluir HSIL
CDC: Center of Disease Control
CT: Chlamydia trachomatis
DIP: Doença Inflamatória Pélvica
EB: Corpúsculo elementar
HSIL: Lesão Intraepitelial Escamosa de Alto Grau
IST: Infecções Sexualmente Transmissíveis
LSIL: Lesão Intraepitelial Escamosa de Baixo Grau
LPS: Lipopolisacarídeo
LVG: Linfogranuloma venério
MOMP: Proteínas de Membrana Externa
NMT: Núcleo de Medicina Tropical
RB: Corpúsculo Reticular
PCCU: Preventivo do Câncer do Colo Uterino
PCR: Reação em Cadeia Polimerase
vi
SUMÁRIO
RESUMO.........................................................................................................................VI
1. INTRODUÇÃO...........................................................................................................01
2. Chlamydia trachomatis ........................................................................................... 03
2.1. Epidemiologia ............................................................................................... 03
2.2. Classificação taxonômica .............................................................................. 03
2.3. Características gerais ..................................................................................... 04
2.4. Aspecto genômico ......................................................................................... 05
2.5. Ciclo biológico .............................................................................................. 08
2.6. Patogênese .................................................................................................... 09
2.7. Infecção por Chlamydia trachomatis na mulher............................................. 10
2.8. Chlamydia trachomatis e câncer .................................................................... 11
2.9. Fatores de risco para a infecção ..................................................................... 12
2.10. Diagnóstico laboratorial .............................................................................. 13
2.11. Prevenção e tratamento ............................................................................... 14
3. OBJETIVOS ........................................................................................................... 16
3.1. Objetivo geral ................................................................................................... 16
3.2. Objetivos específicos ....................................................................................... 16
4. METODOLOGIA ................................................................................................... 17
4.1. Tipo de estudo e delineamento .......................................................................... 17
4.2. População alvo ................................................................................................. 17
4.3. Amostra ............................................................................................................ 17
4.4. Critério de inclusão e exclusão .......................................................................... 17
4.5. Aspectos éticos ................................................................................................. 18
4.6. Questionário ..................................................................................................... 18
4.7. Análises laboratoriais ........................................................................................ 18
4.7.1. Coleta......................................................................................................... 18
4.7. 2. Confecção, montagem e coloração da lâmina. ........................................... 18
4.7. 3. Avaliação Citológica ................................................................................. 18
vii
4.7. 4. Extração e purificação de DNA genômico ................................................. 18
4.7.5. Protocolos de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) ............................... 19
4.7.6. Eletroferese ................................................................................................ 21
4.8. Análise estatística ......................................................................................... 21
5. RESULTADOS ...................................................................................................... 22
6. DISCUSÃO ............................................................................................................ 27
7. CONCLUSÕES ...................................................................................................... 31
8. REFERÊNCIAS BILIOGRÁFICAS ....................................................................... 32
9. ANEXOS ................................................................................................................ 40
viii
RESUMO
Introdução: No ano de 2009 foram registrados 1.244,180 casos da infecção
sexualmente transmissível causada por Chlamydia trachomatis (Ct). Infecções repedidas por
Ct podem aumentar o risco de Doença Inflamatória Pélvica, da mesma forma, infecções
recorrentes também podem aumentar o risco de infertilidade e gravidez ectópica. Importantes
taxas de positividade são reveladas, em mulheres sexualmente ativas, nas rotinas realizadas
anualmente em países desenvolvidos. Objetivo: estimar a prevalência de infecção por
Chlamydia trachomatis em estudantes universitárias que realizam o exame preventivo de
câncer de colo do útero no laboratório de Citopatologia/ UFPA. Metodologia: No período de
Agosto de 2011 a Setembro de 2012 foi realizada paralelamente ao exame preventivo de
câncer colo uterino (PCCU) a pesquisa de Chlamydia trachomatis em estudantes
universitárias atendidas no laboratório de Citopatologia/ UFPA. O estudo incluiu aplicação de
questionários e exame laboratorial. O material biológico de secreção cérvico vaginal foi
utilizado para amplificação da região OMP1 da Chlamydia trachomatis por reação em cadeia
polimerase (PCR) e para análise citológica. Resultados: Do total de 95 amostras, três
apresentaram positividade pelo método PCR, o que revelou uma prevalência de infecção entre
as jovens universitárias de 3,16%. Observou-se a presença de vacúolos intracitoplasmáticos
sem inclusões em células metaplásicas de uma amostra positiva para CT.
As amostras
positivas foram identificadas em estudantes solteiras, com idade média de início da vida
sexual de 17 anos e com média de 4,33 parceiros sexuais. Nenhuma variável mostrou
associação com a infecção (p>0,05). Os resultados da avaliação citológica com alteração
(n=40) tiveram em maior porcentagem os quadros inflamatórios com 77,5% (n= 31). Entre os
resultados alterados 87,5% (n= 35) relataram ter corrimento vaginal. Dos resultados positivos,
as três apresentavam corrimento, mas a associação não foi estatisticamente significante (p=
0,120). Conclusão: A população de jovens universitárias possui um perfil de mulheres não
fumantes, com vida sexual ativa, media de quatro parceiros sexuais ao longo da vida, inicio de
vida sexual na fase de adolescência, utiliza métodos contraceptivos e realiza anualmente o
exame preventivo.
A prevalência de CT em estudantes universitárias atendidas no
Laboratório de Citopatologia/UFPA foi considerada próxima ao encontrado na literatura com
relação a trabalhos em estudantes universitárias.
Palavras- chaves: Prevalência, Chlamydia trachomatis, Universitárias, UFPA.
1
1. INTRODUÇÃO
As infecções sexualmente transmissíveis (IST) são consideradas um problema de saúde
pública de ordem mundial está entre as causas mais comuns de doenças em vários países,
possuem vastas consequências na esfera sanitária, econômica e social (OMS, 2005).
Estão inclusas na lista nacional de doenças de notificação compulsória apenas casos
relacionados a síndromes de imunodeficiência adquirida (AIDS), gestantes HIV positivas,
crianças expostas ao HIV, gestantes com sífilis e crianças com sífilis congênita. A ausência de
notificação do restante das IST dificulta a investigação dos impactos na sociedade e o
desenvolvimento de políticas de intervenção e efetividade ao combate (BRASIL, 2008;
BELDA JUNIOR et al., 2009).
A infecção por Chlamydia trachomatis tem elevada incidência e prevalência em todo o
mundo. Importantes taxas de positividade para Chlamydia trachomatis são reveladas, em
mulheres sexualmente ativas, nas rotinas realizadas anualmente em países desenvolvidos
(PASSOS et al., 2010).
Estima-se a ocorrência 340 milhões de novos casos por ano de IST curáveis, causadas
por
Treponema
pallidum
(sífilis), Neisseria
gonorrhoeae, Chlamydia
trachomatis
e Trichomonas vaginalis, ocorrentes em homens e mulheres com idade entre 15 e 49 anos,
dentre as regiões com maior proporção está a América Latina (OMS, 2007).
Foi demonstrado em um estudo nacional em 2004 que o uso de preservativo nas
primeiras relações sexuais foi de 53,2%, sendo menor nas regiões Norte e Nordeste; o uso na
última relação sexual foi de 57,3%. As estratégias de prevenção primária (uso de
preservativo) e secundária (diagnóstico e tratamento) buscam o controle das IST e suas
consequências, mas as diretrizes para diagnóstico e tratamento precoce ainda é pouco
difundida no sistema de saúde (BRASIL, 2005).
Mulheres jovens e adolescentes são consideradas mais vulneráveis a IST devido à
exposição a fatores de risco comportamentais e biológicos. Nas IST do trato genital feminino,
ocasionalmente a resposta imune pode não corresponder adequadamente e não promover
resposta de memória suficiente, permitindo quadros de reinfecção em intervalos de tempo
mínimo (LIMA & ALVES, 2008).
2
A alta transmissibilidade, bem como a ausência de sintomatologia e as particularidades
da infecção por CT, contribuem para o crescimento exponencial da cadeia epidemiológica
atingindo
principalmente
jovens
independentemente
do
nível
socioeconômico
(GONÇALVES et al. 2009).
Baseado na incidência anual, a probabilidade de infecção persistente, risco relativo de
Doença Inflamatória Pélvica (DIP), custos relacionados aos testes e tratamento de
complicações em longo prazo associadas a persistência ou reinfecção, as recomendações para
o rastreio de Ct e testes relacionados levam em consideração a relação de custo eficássia
significativa para a análise (DELPHINE, 2004). É frequente no quadro de infecção por Ct
fatores de risco para IST como a ausência de parceiro sexual fixo, baixa idade e
concomitância com outras IST (CARVALHO et al., 2010).
As jovens universitárias fazem parte de uma demanda diferenciada da população por
estarem em processo de aquisição de conhecimento e informação em diferentes aspectos.
Porém, na prática, esta característica pode ou não contribuir para seu modo de vida, maneira
de prevenção e cuidado à saúde. Nessa época da vida, a exposição a fatores de risco, e
consequentemente, as chances de contrair IST são mais elevadas.
De
acordo
com
a
Organização
Mundial
de
Saúde 70-75%
das
mulheres infectados com Chlamydia trachomatis não apresentam sintomas. A associação da
incidência maior com a idade jovem resalta o papel importante da triagem em mulheres
sexualmente ativas, com atuação na prevenção da infertilidade.
3
2. Chlamydia trachomatis
2.1. EPIDEMIOLOGIA
De acordo com Centro de Controle de Doenças e Prevenção (CDC, 2010) no ano de
2009 foram registrados 1.244,180 casos da infecção sexualmente transmissível causada por
Chlamydia trachomatis (Ct), isto representa o maior número de casos registrados até o
momento. Existem variações entre os países em relação às atividades de controle de Ct, as
quais são relatadas através de taxas de infecção e diagnósticos hospitalares de casos
associados às doenças do trato reprodutivo (BENDER et al., 2011).
Existe uma frequente coexistência de infecção entre Chlamydia sp e Neisseria sp, foram
verificado nos Estados Unidos e na Europa que 35-50% das mulheres com gonorreia
apresentam infecção simultânea por Ct. Foi verificada a taxa de prevalência de Ct em 20-40%
das mulheres e jovens adolescentes sexualmente ativas que frequentavam clinicas de IST e em
25% de todas as mulheres atendidas em clínicas ginecológicas (LEVY, 2004).
A situação epidemiológica de Ct no Brasil não é evidente devido à escassez de
informações na literatura científica, que é baseada em estudos específicos e populações
restritas (PASSOS et al., 2003). O Mistério da Saúde, através do Programa Nacional de DST
e Aids ( PN DST/ Aids), estima a ocorrência de 1.967,200 casos novos por ano, verificandose uma incidência de Ct igual a 3,5% no sexo feminino e 2,3% no sexo masculino ( BRASIL,
2005).
Em um estudo populacional da prevalência de anticorpos específicos para Ct realizado
por Ishak et al. (1998) verificaram entre os três grupos investigados no Brasil: Serra do
Norte, Belém e Indios Xincrins, as respectivas frequências 76,2%; 53,6% e 51,3%.
2.2. CLASSIFICAÇÃO TAXONÔMICA
Na classificação taxonômica o gênero Chlamydia pertence à família Chlamydiaceae,
compreendendo quatro espécies: C. trachomatis, C. pneumoniae, C. psittaci, C. pecorum,
sendo esta última não relacionada a infecções humanas (TRABULSI & MENEZI, 2005).
4
Devido sua condição de parasita celular obrigatória e sua dimensão, essas bactérias foram
classificadas como vírus, entretanto a complexidade estrutural acabou aproximando-as na
classificação das bactérias (EJZENBERG, 1991). Na espécie C. trachomatis são reconhecidas
15 sorovariantes classificadas: as relacionadas ao tracoma endêmico são A, B, Ba e C; as
relacionadas com doenças sexualmente transmitidas são D- K; e as causadoras de
linfogranuloma venério são L1, L2 e L3 (JAWETZ et al., 2000). O quadro seguinte mostra os
sorotipos de Ct as principais doenças associadas, de acordo com o Ministério da Saúde
(BRASIL, 1997).
Quadro 1. Sorotipos de Chlamydia trachomatis e principais doenças associadas.
Sorotipos
Principais doenças associadas
A,B, Ba, C
Tracoma
L1, L2, L3
Linfogranuloma venério (LVG)
D, E, F, G, H, I e K
Uretrite não gonocócica (UNG), uretrite
pós- gonocócica (UPG), cervicite, doença
inflamatória pélvica (DIP), endometrite,
paratracoma, conjutivite de inclusão,
pneumonia do recém nascido.
Fonte: BRAIL, 1997.
2.3. CARACTERÍSTICAS GERAIS
A bactéria tem aproximadamente 0,2 a 0,8 µm de diâmetro, possui membrana celular
externa e interna, é considerada uma bactéria Gram- negativa devido à ausência da camada de
peptídioglicano. São bactérias intracelulares obrigatórias com incapacidade de produzir ATP,
necessitando de uma célula hospedeira para seu crescimento e replicação (TRABULSI &
MENEZI, 2005).
A célula eucariótica principalmente células epiteliais cilíndricas são o alvo de infecção
da Ct. Ela difere de outras bactérias intracelulares obrigatórias por não ser parasita primário
de hospedeiros invertebrados e possuir ciclo de desenvolvimento de replicação bifásico único
entre os procariontes (CEVENINI et al., 2002).
A bactéria apresenta-se na forma de corpúsculo elementar (infeccioso) e corpúsculo
reticular (metabolicamente inativo). O corpúsculo elementar possui maior quantidade de RNA
5
em relação ao DNA, enquanto que o corpúsculo reticular tem aproximadamente a mesma
quantidade de ambos, o DNA é encontrado em maior concentração no nucleóide central e o
RNA nos ribossomos (JAWETZ et al., 2000).
A parede celular é trilaminar composta por 1/3 de proteína e 2/3 lípide, não contêm
ácido urâmico, peptidoglicano e proteínas ligáveis a penicilina (EJZENBERG et al., 1991).
As proteínas de membrana (MOMP) externa formam ligações cruzadas extensas através de
ligações por pontes de sulfeto entre os resíduos de cisteina. O lipopolissacarídeo (LPS)
constituído principalmente de ácido cetodeoxietanóico é específico do gênero. As MOMP
altamente antigênica são espécie e subespécie-específicas (MURRUY et al., 2006; SEADI et
al., 2002). A figura seguinte representa o modelo da parede celular da Ct, de acordo com
ORTIZ et al., 2003.
Figura 1. Modelo da parede celular ou envelope da Chlamydia trachomatis.
FONTE: ORTIZ et al., 2003.
2.4. ASPECTO GENÔMICO
A CT possui cromossomo circular de tamanho pequeno com aproximadamente 1,04
kb (DEMARS & WEINFURTER, 2008). No genoma cromossômico 58% dos pares de base
são A-T, são codificadas aproximadamente 857 proteínas, das quais 70 são exclusivas da
espécie CT (ORTIZ & SÁNCHES, 2003).
Estudos relacionam o plasmídio na mediação da infecção devido à sua conservação em
estipes humana, evidenciando a importância do plasmídeo na patogênese de infecção
(CARLSON, 2008). O plasmídio críptico possui 7,493 pb, a região de conservação
6
intergênica entre ORF1 e ORF8 sugere sua importância no processo transcricional (ORTIZ &
SÁNCHES, 2003).
Nunes et al. (2008) caracterizou em seu estudo a representação cromossômica de
51,000 bp de 51 locus polimórficos dispersos no cromossomo. Foram classificadas as
seguintes categorias: 16 regiões intergenicas (IGRs), 16 genes codificadores de proteínas do
envelope celular (CEPs), 13 genes de limpeza (HKs) e 6 genes que codificam proteínas
hipotéticas ou não classificadas (HPs).
Figura 2. Representação do cromossomo circular da Chlamydia trachomatis D/UW3
genome annotation [GenBank: AE001273].
FONTE: Nunes et al., 2008.
O conhecimento que se tem hoje sobre as variantes do genoma da Ct é baseado no
antígeno de superfície primaria, a MOMP, e o gene que codifica a MOMP, ompA. As
tipagens sorológicas tradicionais utilizam uma serie de anticorpos contra diferentes epitopos
na MOMP. Novas abordagens em pesquisas recente tem utilizado genotipagem através da
sequencia do gene ompA (HARRIS et al., 2012; BYRNE, 2010).
Novas ideias sugerem o envolvimento da variabilidade da proteína MOMP na
diferença de virulência entre as estirpes e a formação de mosaicos de MOMP relacionadas
com o potencial patogênico entre as estirpes, sugerindo que a recombinação natural
desempenha um papel na geração de variabilidade entre cepas do trato genital (BYRNE,
2010).
7
A base ompA nested-PCR não somente detecta a infecção, como também é utilizada
para genotipar variantes de Ct por fragmento de restrição de longitude polimórfica (PCRRFLP) e sequenciamento do gene ompA amplificado (NAZER et al., 2008).
As proteínas Pmp já foram detectadas na superfície do corpo elementar, o papel destas
proteínas ainda não é totalmente conhecido, mas sabe-se que as Pmps B, D e H são
imunogênicas e podem provocar resposta de citoquinas pró inflamatórias (BYRNE, 2010).
Apesar de historicamente ser considerada incomum a transferência horizontal de gene
devido às raras oportunidades para recombinação por ser um micro-organismo de vida
intracelular obrigatória, recentemente as pesquisas mostraram que as Chlamydias sp. não
somente possuem todo o aparato de recombinação necessário, como podem recombinar após
uma infecção mista tanto no hospedeiro humano quanto no tecido de cultura (HARRIS et al.,
2012).
Joseph & Read (2012) mostra a filogenia dos biovares da C. trachomatis (LGV,
ocular, e urogenital 1 e 2. A representação das principais vias de recombinação dentro e
entre os biovares através de um estudo de identificação de 24 eventos de recombinação entre
o biovar LGV e tracoma (1 ocular e urogenital e 2), 12 eventos de recombinação dentro da
biovar LGV e 162 eventos de recombinação dentro dos biovares tracoma.
Figura 3. Reconstrução filogenética dos sorotipos de Chlamydia trachomatis.
FONTE: Adaptado de Joseph & Read, 2012.
8
A troca de material genético ainda não é totalmente definida, mas entende-se que para
ocorrer recombinação deve haver frequentes infecções mistas com potencial de invasão para
células individuais. As infecções de repetição ocorrem numa taxa de 56,9% e as infecções
mistas ocorrem numa taxa de até 15% ou mais (JOSEPH & READ, 2012).
2.5. CICLO BIOLÓGICO
O ciclo de desenvolvimento da Ct é bifásico, a forma infecciosa é o corpúsculo
elementar (EB) que possui morfologia semelhante a um esporo, é extracelular e
metabolicamente inativo, têm aproximadamente 0.3 µm de diâmetro e é caracterizado por um
núcleo de nucleoproteína descondensada. Ao se desenvolver no interior da célula hospedeira
se reorganiza em corpúsculo reticular (RB), forma não infecciosa de maior tamanho e
atividade metabólica ativa, possuem aproximadamente 1.0 µm de diâmetro (LEVINSON &
JAWETZ, 2005; FIELDS & HACKSTADT, 2002).
A bactéria tem a característica de induzir atividade fagocitária da célula hospedeira e
permanecer dentro da vesícula fagocítica, ao passo que inibe a fusão fago-lisossoma
(EJZENBERG et al., 1991). O ciclo tem duração de 24- 48 horas, durante o processo de
infecção, o corpúsculo elementar é fixado na célula hospedeira através do glicosamioglicano
presente na superfície da Chlamydia sp (JAWETZ et al., 2000). Após a bactéria ser fagocitada
pela célula, o endossoma contendo o EB se estabiliza em pH 6.6, com isso, a maturação do
endossomo contendo o EB para lisossomo é inibida. As vesículas com os EB se fusionam
uma com a outra e escapam da via endocítica para a exocítica, os endossomas são
redistribuídos na região perinuclear transportado por auxílio dos microtubúlos, a organização
do vacúolo contendo vários EB forma a chamada inclusão citoplasmática (WYRICK, 2000 ).
No interior do vacúolo o EB se reorganizada para RB, ocorre aumento de tamanho,
seguida de sucessivas divisões binárias para a geração de novos corpúsculos elementares que
serão liberados da célula hospedeira para a infecção de novas células (JAWETZ et al., 2000).
O esquema abaixo representa as etapas do ciclo de biológico da Ct.
9
Figura 4. Ciclo biológico da Chlamydia trachomatis.
FONTE: SEADI et al., 2002.
2.6. PATOGÊNESE
A resposta imune é do tipo celular e humoral, com produção de anticorpos de combate
ao LPS e a proteína MOMP, também ocorre o envolvimento das células de defesa CD4 e CD8
(TRABULSI & MENEZI, 2005).
A ativação de citosinas inflamatórias como Fator de
Necrose Tumoral – alfa (TNF-alfa) e Interleucina- 1 (IL-1), além de células como linfócitos
TH1 podem induzir danos teciduais irreversíveis através de intensas respostas inflamatórias e
a formação de fibroses (WUNDER & CAJUEIRO, 2005).
Formas persistentes de Ct podem ser desenvolvidas por indução durante a inibição do
ciclo de desenvolvimento, por ação de agentes antimicrobianos e limitação de nutrientes,
também através dos mediadores imunológicos como em situações de níveis baixos de
interferon gama (STRATTON & MITCHELL, 1996).
Comumente são evidenciadas resoluções espontâneas da infecção por Ct, os
mecanismos utilizados pela resposta imune ou as características próprias da bactéria que
contribuem para o combate a infecção ainda são alvo de estudo. Apesar de a resposta imune
ter capacidade de eliminar espontaneamente a infecção, em certos casos não ocorre resposta
suficiente para a eliminação do patógeno, resultando em infecção persistente (GEISLER et
al., 2008).
10
Os antígenos reconhecidos da célula bacteriana do gênero Chlamydia são:
a. Antígenos específicos de grupo: formado principalmente pelo complexo
polissacarídeo termoestável que envolve o LPS e o glicolipideo (GLXA), todas as
espécies de Chlamydia possuem este antígeno;
b. Antígenos específicos da espécie: estes antígenos variam nas espécies e são
determinados principalmente por proteínas de membrana externa, representado 60%
das MOMP, demais proteínas de 60, 62 e 155 kDa e proteínas clamidiais de choque
térmico (C-HSP)
c.
Antígenos tipo especifico: relacionados aos sorotipos da espécie são polipeptídeos
de 30 kDa
d.
Antígenos específicos da subespécie, com base na presença de estruturas
polipeptídicas, os sorotipos da Ct são classificados nas subespécies do grupo B ou C
(WUNDER & CAJUEIRO, 2005).
Estudos que utilizam modelos animais infectados por Ct foi a estratégia encontrada
pelos pesquisadores para dar prosseguimento nas pesquisas analisando a natureza e o tempo
de resposta inflamatória que ocorre no trato genital feminino após infecção in vivo. Sugestões
revelam associação entre respostas especificas do sistema imunológico e susceptibilidade à
infecção por Ct (DARVILLE & HILTKE, 2010).
2.7. INFECÇÃO POR Chlamydia trachomatis NA MULHER
O micro-organismo tem a capacidade de invadir o epitélio colunar e manter-se em
estado latente na região endocervical, caso não haja diagnóstico e tratamento pode
permanecer meses neste estado e ascender ao trato genital feminino assintomaticamente
(CARVALHO et al., 2004). Embora muitas mulheres não apresentem sintomas, algumas
apresentam corrimento vaginal mucoide, inodoro e geralmente sem prurido externo. A
infecção por Ct não pode ser distinguida de outras infecções urogenitais somente por sintomas
(MILLER, 2006).
De diferentes formas a Ct pode ascender para o trato genital feminino. In vitro, a
bactéria tem demonstrado capacidade de incidir no espermatozoide, desta forma possibilita
11
rápida ascensão para o trato genital superior. A produção de muco cervical, característica que
promove proteção conta microrganismos invasores, pode ser alterada devido flutuações
hormonais durante o ciclo menstrual, o nível de hormônios durante a menarca induz um
aumento de ectopia cervical em mulheres jovens, assim promove maior área susceptível a
ação da bactéria. As contrações endoteliais, as quais são amplificadas durante o período de
ovulação, também podem promover ascensão da Ct (TAYLOR & HAGGERTY, 2011).
As complicações decorrentes da infecção por Ct são mais graves na mulher, além do
risco de afetar o recém nascido. No trato genital superior a infecção pode causar esterilidade
ou predispor à uma gravidez ectópica (LEVY, 2004). Nas manifestações clínicas as mulheres
podem apresentar além dos quadros de ectopia, fragilidade com sangramento fácil da mucosa
cervical, também é comum endocervicites com muco cervical semelhante ao ocorrido na
uretrite masculina (PASSOS & GIRALDO, 2010).
A infecção por Ct pode variar desde uma colonização assintomática até uma cervicite
severa, que se não tratada pode levar uma infecção crônica causando processos com maior
grau de gravidade como salpingite, podendo resultar em infertilidade ou gravidez ectópica
(WUNDER & CAJUEIRO, 2005). O fator tubário é responsável por 15% a 35% dos casos de
infertilidade, a infecção por Ct é a maior causa de Doença Inflamatória Pélvica (DIP) não
associada à gestação ou procedimentos cirúrgicos. Mulheres com história de DIP têm de sete
a dez vezes mais risco de gestação tubária (BONETTI & SILVA, 2008).
Infecções repedidas por Ct podem aumentar o risco de DIP, da mesma forma, infecções
recorrentes também podem aumentar o risco de infertilidade e gravidez ectópica
(HAGGERTY et al., 2010). Outra complicação rara decorrente desta infecção não tratada é
síndrome de Reiter: uma artrite severa que inclui uretrite (em mulheres ocasionalmente ocorre
cervicite), conjuntivite e lesão mucocutânea indolor (MILLER, 2006).
2.8. Chlamydia trachomatis E CÂNCER DO COLO DO ÚTERO
O câncer do colo do útero é o segundo tipo de câncer mais incidente na região Norte
(24/100 mil), em países menos desenvolvidos a incidência é cerca de duas vezes maior se
comparado com países mais desenvolvidos (INCA, 2011).
12
O principal agente relacionado ao câncer do colo do útero é o Papiloma Vírus Humano
(HPV), mas a infecção nem sempre progride para um câncer, devem ser considerados os
fatores risco que incluem: fumo, início de vida sexual precoce, uso de anticoncepcional oral,
múltiplos parceiros sexuais e IST concomitantes (KHOSLA, 2012).
A infecção por Ct é uma das principais IST, vários estudos tem determinado
associação da infecção com o desenvolvimento de câncer cervical (KHOSLA, 2012). Os
mecanismos biológicos da Ct ainda não são bem conhecidos, a bactéria facilita acesso do
vírus às células epiteliais através de micro- abrasões (FERNANDES et al., 2009). O DNA
celular é danificado através do estresse oxidativo causado pela infecção bacteriana, ocorre
modificação da resposta inflamatória e imunológica ao vírus de um organismo já infectado
intracelularmente, tanto na infecção aguda como na persistente (LINHARES et al., 2008).
2.9. FATORES DE RISCO PARA A INFECÇÃO
A maior incidência de infecção é em mulheres adolescentes e adultas jovens, o CDC
recomenda a triagem em mulheres jovens com vida sexual ativa com idade de 25 anos ou
mais jovens, também em mulheres mais velhas que apresentam fatores de risco como parceiro
novo ou múltiplos parceiros sexuais e mulheres grávidas.
Dentre os principais fatores de risco no quadro de infecção pela Ct estão: inicio
precoce da atividade sexual, ausência de parceiro fixo, multiplicidade de parceiros, baixa
idade, concomitância com outra IST, não uso de preservativo, uso de contraceptivos
hormonais orais em mulheres jovens e presença de ectopia cervical (WEIR, 2004;
CARVALHO et al., 2010).
Dentre características mais comuns em mulheres com cervicite por Ct estão: primeira
relação sexual antes dos 17 anos, primeiro parceiro sexual mais velho, grande número de
parceiros, relação sexual durante encontro casual e alta frequência de relações (CARVALHO
et al., 2004).
13
2.10. DIAGNÓSTICO LABORATORIAL
Devido a infecção por Ct não apresentar sintomas específicos este parâmetro não pode
ser considerado na hipótese diagnóstica (MELLES et al., 2000). Na análise de um método
diagnóstico são relevantes os parâmetros de especificidade e sensibilidade.
A cultura é considerada o método padrão, possui 100% de especificidade e sensível
até 80%. Entretanto a complexidade da técnica, demora em obtenção de resultado (tempo de
inoculação), cuidados para o transporte, manter a viabilidade do micro-organismo e limitação
na apropriação de amostras desfavorece o método. O meio de cultura McCoy é o mais
utilizado rotineiramente (MICHELON et al., 2005; BE´BE´AR & BARBEYRAC 2009).
Os métodos que apresentam maior sensibilidade e especificidade e menor risco são os
de detecção de ácido nucleico, entre esses a Reação em Cadeia Polimerase (PCR) é o mais
difundido (SEADI et al., 2002). A PCR de Chlamydia sp é um método de sensibilidade
comparável com a cultura, apesar das chances de haver resultados falso-positivos (GEISLER,
et al. 2008). Na PCR também pode ser empregada a genotipagem, que são reações de PCR
mais específicas, apesar da perda de sensibilidade esta técnica é menos trabalhosa em
comparação com a sorotipagem (SEADI & ROSSETTI, 1999). Testes de amplificação de
ácido nucleico são recomendados para a detecção de infecções do trato reprodutivo feminino
e masculino utilizando- se amostra de swab genital e urina, respectivamente, causadas por Ct
e N. gonorrhoeae (CDC, 2009).
A sorologia não é considerada o melhor método de diagnóstico na infecção por Ct,
exceto nas infecções em neonatais, pacientes com infertilidade tubária e certos casos de
infecções de LVG (CHERNESKY, 2005). No processo de infecção prévia os níveis séricos
de anticorpos podem estar elevados e isto dificulta a distinção temporal do processo
infeccioso; reações cruzadas com outras espécies de Chlamydia sp também podem alterar o
resultado (MICHELON et al., 2005).
As principais técnicas de pesquisa de antígenos são a imunofluorescência direta (DFA)
e ensaio imunoenzimático (EIA). A imunofluorescência utiliza anticorpos monoclonais
reagentes específicos para proteína MOMP da Ct, possui sensibilidade de 80 a 90% e
especificidade 98 a 99% com relação à cultura. O imunoensaio detecta o LPS da Chlamydia
14
sp a partir de anticorpos monoclonais ou policlonais marcados com uma enzima (CARDER et
al., 2006; BLACK, 1997). Os métodos de diagnóstico estão descritos na quadro 2 de acordo
com Seadi et al. (2002).
Quadro 2. Métodos de diagnóstico para Chlamydia sp.
Cultura celular
 Pesquisa de antígenos
Imunoflorescência direta (DFA)
Ensaio imunoenzimático (EIA)
 Pesquisa de ácidos nucléicos
Sonda de DNA
Amplificação (PCR, LCR, TMA)
 Pesquisa de anticorpos
Imunofluorescência indireta (IFI)
Microimunofluorescência indireta (MIF)
Ensaio imunoenzimático (EIA)
2.11. PREVENÇÃO E TRATAMENTO
A natureza assintomática da Ct dificulta o diagnóstico, tratamento e prevenção de
sequelas. No desenvolvimento de vacinas tem sido sugerido que um único antígeno não seria
o ideal e que os antígenos de superfície são os principais candidatos para a vacina (TAYLOR
& HAGGERTY, 2011).
Os programas de rastreamento são mais efetivos se as estratégias forem voltadas para
a redução da incidência de novos casos de infecção na população, mesmo assim o
rastreamento de infecções assintomáticas tem contribuído no controle da infecção através da
prevenção de sequelas e complicações em longo prazo (GOTTLIEB et al., 2010).
O tratamento da infecção também envolve a prevenção de transmissão para o parceiro
sexual, além disso, o CDC recomenda o uso antibiótico como Azitromicina (dose única) ou
doxiciclina (duas vezes por dia durante uma semana).
Os riscos de infecção podem ser diminuídos através do correto uso de preservativo,
porém a melhor maneira para garantir a prevenção seria não manter relações sexuais ou
manter relações com um parceiro fixo e não infectado. Lavar a genitália, urinar ou fazer
15
ducha interna após a relação sexual não previne IST. Três meses após o tratamento é
necessário nova triagem para a confirmação de eliminação da infecção (CDC, 2012).
16
3. OBJETIVOS
3.1. OBJETIVO GERAL
Estimar a prevalência de infecção por Chlamydia trachomatis em estudantes
universitárias que realizam o exame preventivo de câncer de colo do útero no Laboratório de
Citopatologia/ UFPA.
3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Identificar o perfil comportamental das estudantes quanto à prática sexual e
suscetibilidade às IST.

Verificar concordância entre os resultados da pesquisa de Chlamydia trachomatis
entre os métodos molecular e citológico.
17
4. METODOLOGIA
4.1. TIPO DE ESTUDO E DELINEAMENTO
A pesquisa caracteriza-se como tipo de estudo transversal. No período de agosto de
2011 a setembro de 2012 foi realizada paralelamente ao exame preventivo de câncer de colo
uterino (PCCU) a pesquisa de Chlamydia trachomatis em estudantes universitárias atendidas
no laboratório de Citopatologia/ UFPA.
4.2. POPULAÇÃO ALVO
A população alvo do estudo foram estudantes universitárias da UFPA que realizam o
exame preventivo no Laboratório de Citopatologia, o convite para as participantes foi
mediante envio de e-mails para as turmas e divulgação de cartilhas contendo e-mail e telefone
para contato.
4.3. AMOSTRA
Foram analisadas amostras de material endocervical coletadas no Laboratório de
Citopatologia/ ICB/UFPA, no mesmo foi realizada a análise citológica e preenchimento dos
questionários. Para o processamento molecular, o material coletado foi transportado para o
Laboratório de Biologia Celular e Molecular (LBCMOL) do Núcleo de Medicina Tropical
(NMT) da Universidade Federal do Pará (UFPA). O número de amostras incluídas no estudo
foi determinado por critérios de adequabilidade de amostra e eliminação de amostras repetidas
da mesma paciente coletadas em períodos diferentes ao longo da pesquisa.
4.4. CRITÉRIO DE INCLUSÃO E EXCLUSÃO
Critérios de Inclusão: Foram incluídas no trabalho estudantes da UFPA regularmente
matriculadas nos cursos de graduação, que concordaram participar voluntariamente da
pesquisa.
Critérios de Exclusão: foram excluídas do estudo voluntárias que não estavam
regularmente matriculadas na UFPA, que não se sujeitaram a pesquisa, cujas amostras não
estiveram viáveis para a avaliação laboratorial e aquelas que não apresentaram as informações
necessárias para que fossem alcançados os objetivos propostos.
18
4.5. ASPECTOS ÉTICOS
O presente foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa em Seres Humanos do
Núcleo de Medicina Tropical (CEP/NMT) da Universidade Federal do Pará (UFPA) parecer
Nº 103.571, seguida da autorização prévia das participantes através do Termo do
Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE).
4.6. ANÁLISES LABORATORIAIS
4.6.1. Coleta
A coleta consistiu na introdução do espéculo (sem lubrificante) no canal vaginal em
mulheres nas seguintes condições: não menstruadas, três dias de abstinência sexual e sem
utilizar duchas e cremes vaginais na véspera do exame. A escova citológica foi introduzida no
canal endocervical e girada em 360 graus, evitando-se contato com a parede vaginal.
4.6. 2. Confecção, montagem e coloração da lâmina.
O esfregaço foi confeccionado na lâmina e fixado em álcool 95%. A coloração seguiu
de acordo com o modelo de Papanicolaou usando-se os corantes: Hematoxilina, EA e Orange
G. Após este procedimento, as lâminas foram secadas na estufa por 10 min a 100°C e
montadas com lamínulas utilizando-se Bálsamo do Canadá ou Entelan.
4.6. 3. Avaliação Citológica
Os resultados citológicos foram identificados de acordo com a Nomenclatura
Brasileira para laudos cervicais e condutas preconizadas que inclui: atipia de células escamosa
de significado indeterminado (ASC-US); lesão intraepitelial escamosa de baixo grau (LSIL);
atipia escamosa, sem excluir HSIL (ASC-H); lesão intraepitelial escamosa de alto grau
(HSIL), esfregaço dentro dos limites da normalidade (Normal) e alterações benignas
(esfregaços inflamatórios).
4.6. 4. Extração e purificação de DNA genômico
A amostra foi colocada em microtubo (1,5 mL) para exame molecular, armazenadas
em conservante T.E 1X (Tris- HCL 10 mM, pH=8; EDTA 1 Mm). Do material processado,
19
foi retirada uma alíquota de 300 µl (microlitros) e transferido para outro microtubo estéril de
1,5 ml. O DNA genômico foi extraído das células contidas no material endocervical pelo
método do fenol clorofórmio, utilizando a metodologia descrita por ISOLA et al (1994). Foi
acrescentado 300 μl de tampão de lise de células (NaCl 1M; TRIS-HCL pH 8,0 1M; EDTA
0,5 M pH 8,0; SDS 10%) estéril e proteinase k na concentração final de 10 μg/mL. Os
microtubos foram mantidos em banho maria por 45°C durante uma hora para ocorrer a
completa dissolução do precipitado de células. Foi adicionado 300 μl de fenol tamponado
(Tris- HCL 10 mM, pH=8; EDTA 1 Mm) e de clorofórmio- álcool Isoamílico (24:1) e
homogeneizados por inversão durante 10 minutos e centrifugados por 5.000 rpm durante 10
minutos. Após isso foi retirado 600 μl do sobrenadante e transferido para novo tubo estéril de
1,5 ml. Foi adicionado 600 μl de clorofórmio- álcool isoamílico, posteriormente,
homogeneizado por 10 minutos e centrifugado por 5.000 rpm durante 10 minutos. Foi retirada
uma alíquota de 500 μl do sobrenadante e transferido para tubo estéril de 2,0 ml. Neste tubo,
foram adicionados 1.000 μl de álcool absoluto e 50 μl de acetato de sódio e homogeneizado
gentilmente por inversão. As amostras foram centrifugadas por 14.000 rpm durante 15
minutos e o sobrenadante foi descartado por inversão. Posteriormente foram adicionados 500
μl de Álcool a 75% gelado, seguido de agitação no vortex por 10 segundos e centrifugados
por 15.000 rpm durante 5 minutos e descartados o sobrenadante por inversão. Esta etapa foi
realizada três vezes, a fim de eliminar restos de impurezas e reagentes das etapas anteriores da
extração de DNA. Após este etapa, estas fotam estocadas a 45 graus por 30 minutos na estufa
e reidratadas com TRIS-EDTA (Tris- HCL 10 mM, pH=8; EDTA 1 mM).
4.6.5. Protocolos de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
A. Amplificação da região do gene da β-globina.
Posterior a purificação do DNA genomico, foi realizada a amplificação do material
extraído para um gene da β-globina humana com os oligonucleotídeos G73 (5’GAAGAGCCAAGGACAGGTAC-3’)
e
G74
(5’-CAACTTCATCCACGTTCACC-3’)
(GREER et al., 1991), numa concentração de 5 pmol/μL (picomoles por microlitro). A
amplificação foi realizada no termo-ciclador da Biocycler MJ96G. Para esta reação foi
utilizado 3.5μL Go Taq® Green Master Mix, 2.0μL de água, 0.25μL dos primers G73/ 74
20
(cada) e 1μL do DNA molde, para um volume final de 7μL, onde foi multiplicado pelo
número amostral, incluindo um controle positivo, afim de verificar a eficiência da reação, e
um controle negativo contendo somente os reagentes de PCR, usado para monitorar a
contaminação. O produto das reações serão submetidas em corrida horizontal (100V/ 1Hora)
em gel de agarose a 2% submerso em TAE 1X(TRIS-HCL 10Mm, pH=8; EDTA 1mM;
Acetato), com brometo de etídio (0,5mg/mL), visualizadas sob Luz ultravioleta (UV).
B. Amplificação da região ompA da Chlamydia trachomatis
A etapa seguinte consiste na amplificação do gene da região ompA da Ct (JALAL et
al, 2007) e foi realizada apenas nas pacientes que apresentarem positividade para o gene da βglobina humana. Para a primeira reação foi utilizado 6.0μL Go Taq® Green Master Mix,
0,5μL dos oligoculeotideos Ct P1/ P2 (cada) e 2μL de DNA genômico, 3μL Água estéril, para
um volume final de 12μL. Posteriormente, na segunda reação, foi utilizado 6.0 μL Go Taq®
Green Master Mix, 4,5 μL de Água estéril, 0,5 μL dos oligonucleotídeos C.T P3/ P4 (cada) e
0,5 μL do produto da primeira reação.O produto da segunda reação foi visualizado em gel de
agarose a 2%, sob luz UV. Os oligonucleotídeos, em uma concentração de 5 pmol/μL,
apresentam as seguintes sequências:
Tabela 01- Oligonucleotídeo utilizados na amplificação das sequências de Ct no gene ompA
Oligonucleotídeo
Sequência
Ct 1/OMP
5'- GACTTTGTTTTCGACCGTGTT -3’
Ct 2/OMP
5’AGCRTATTGGAAAGAAGCBCCTAA- 3’
Localização
OMP 199
OMP 657
Ct 3/OMP
5'-AAAC GATGTGAATAAAGARTT-3
OMP 224
Ct 4/OMP
5’ -TCCCASARAGCTGCDCGAGC-3,
OMP 617
Fonte: adaptado de JALAL et al. 2007.
Nas duas reações, se seguirá o seguinte protocolo: desnaturação a 94°C por 4 minutos;
seguida de 35 ciclos (repetições), onde a temperatura de desnaturação será 94°C por 40
segundos, de anelamento à 54°C durante 30 segundos , temperatura de extensão à 72°C por 1
minuto, seguida de temperatura de extensão de 72°C por 10 minutos e por fim esfriamento a
10°C por 3 minutos.
21
4.6.6. Eletroferese
O produto a amplificação Nested PCR foi visualizado por eletroforese horizontal em
gel de agarose a 2% contendo brometo de etídio (0,5mg/mL) em TAE 1x (Trisbase 1,6 M,
Acetato de Sódio 0,8 M, EDTA- Na2 40 mmM/ 1L de água deionizada) nas condições de 50
volts a 100 ampéres por aproximadamente 1 hora. Utilizou-se o peso molecular de 1 Kb
(invitrogen) e amostras de controle positivo e negativo para cada corrida de eletroforese. As
bandas foram visualizadas pelo sistema de fotodocumentação em géis, em câmara escura com
transluminador (Vilber Loumat) duplo de 312 nm e luz ultra violeta. O tamanho da banda de
DNA da Chlamydia trachomtis corresponde ao fragmento de 548 pb.
4.7. ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os dados foram armazenados na planilha do Excel 2007. O cálculo de prevalência foi
aplicado, indicando o número de pessoas com a característica pesquisada, em um grupo
populacional, em determinado ponto do tempo. O programa Bioestat 5.0 foi utilizado para a
análise descritiva e aplicação do teste estatístico. Os valores de p menores ou iguais a 0,05
foram considerados estatisticamente significante, a análise univariada e multivariada com
regressão logística foram realizadas para detecção dos fatores associados com infecção
clamidial.
22
5. RESULTADOS
Foram processadas 102 amostras de secreção para a extração de DNA, destas três
amostras foram eliminadas da análise final devido à baixa qualidade do DNA extraído e
quatro por repetição de coleta.
Um total de 95 amostras, de estudantes que buscaram atendimento no Laboratório de
Citopatologia/ UFPA, foi processado para a pesquisa molecular de Ct, e destas três
apresentaram positividade pelo método PCR, o que revelou uma prevalência de infecção entre
as jovens universitárias de 3,16%.
Do total de estudantes analisadas, a faixa etária concentrou-se entre a idade de 20 a 25
anos (50, 5%), média de 24, 0 ± 5,4 anos, com valores extremos entre 17 e 42 anos. Entre os
casos positivos a média de idade foi de 25,0 anos, não houve associação entre idade e
infecção. Com relação ao estado civil, 87,4% (n= 83) das estudantes são solteiras. Quanto à
maternidade, 27,7% (n= 18) possuem filhos. A idade média do primeiro parto foi de 19,5
anos, com idade mínima de 15 anos. O gráfico a seguir indica a distribuição das estudantes de
acordo com a faixa etária.
Figura 05. Distribuição de estudantes por faixa etária, UFPA, Belém-Pará.
FONTE: Laboratório de Citopatologia/ UFPA.
23
O início da vida sexual das estudantes foi em média aos 18,1 ± 2, 60 anos, tiveram a
primeira relação com idade entre 16 e 20 anos 71,6% (n=68). O número médio de parceiros
sexuais foi de 4,08 ± 3, 6 variando de 1 a 20, enquanto que 75,8% (n= 72) relataram possuir
parceiro fixo. Conforme a tabela 02, verificamos o perfil de comportamento sexual das
estudantes.
Tabela 02 - Distribuição percentual das estudantes segundo perfil sexual.
Total de estudantes
n
%
Sim
75
79,0
Não
20
21,0
Até 18 anos
59
62,1
Acima de 18
36
37,9
Sim
72
75,8
Não
23
24,2
1 parceiro
20
21, 3
De 2 a 3 parceiros
43
45.7
Vida sexual ativa
Idade de início sexual
Parceiro fixo
Nº de parceiros sexuais na vida
Acima de 3
31
FONTE: Laboratório de Citopatologia/UFPA.
32,6
Na descrição do perfil comportamental das estudantes observou-se, em relação ao uso
de métodos contraceptivos, que 47,4% (n=45) utilizam somente preservativo, 17,9% (n= 17)
utiliza somente anticoncepcional e 17,9% % (n= 17) utilizam ambos. Verificou-se que 96,9%
(n= 92) não eram fumantes, 60% (n= 57) realizam o exame preventivo anualmente e 13,6 %
(n= 13) fizeram exame pela primeira vez.
As amostras positivas foram identificadas em estudantes solteiras, com idade média de
início da vida sexual de 17 anos e com média de 4,33 parceiros sexuais. Quanto ao uso de
24
preservativo e parceiro fixo, uma relatou não utilizar preservativo e uma relatou não possuir
parceiro fixo (tabela 03). Nenhuma variável mostrou associação com a infecção (p>0,05).
Tabela 03 - Perfil sóciodemográfico e fatores de risco das estudantes infectadas.
Paciente 1
Paciente 2
Paciente 3
Média/ Moda
23
25
28
25,0
Solteira
Solteira
Solteira
Solteira
Idade de início da vida sexual
16
21
14
17, 00
Nº de parceiros na vida
6
3
4
4,33
Preservativo
Sim
Sim
Não
Sim
Parceiro fixo
Não
Sim
Sim
Sim
Idade
Estado civil
FONTE: Laboratório de Citopatologia/ UFPA.
Nos resultados citológicos, duas amostras positivas indicaram quadro inflamatório e a
terceira apresentou resultado sugestivo de lesão intraepitelial escamosa de alto grau.
Observou-se a presença de vacúolos intracitoplasmáticos sem inclusões em células
metaplásicas de uma amostra positiva para Ct (figura 1). Uma amostra apresentou células
metaplásicas com vacúolos intracitoplasmáticos com inclusões, mas o resultado foi negativo
na PCR. Não houve associação estatisticamente significante (p= 0,287) entre a citologia
inflamatória e infecção.
Figura 06. Vacúolo sem inclusão intracitoplasmática. Fonte: Laboratório de
Citopatologia/UFPA.
25
A figura abaixo mostra o resultado geral da citologia incluindo: normalidade,
inflamatório, lesão e atipia.
Normal- 57,9%
Inflamatorio- 31,6%
ASC- 5,3%
SIL -5,3%
Legenda: *ASC- Atipia de Célula Escamosa; *SIL- Lesão de Célula Escamosa.
Figura 07. Resultados citológicos.
Fonte: Laboratório de Citopatologia/ UFPA.
Não foi encontrada associação estatística entre citologia de quadro inflamatório e
infecção por Ct (p>0,05). Os resultados da avaliação citológica com alteração (n=40) tiveram
em maior porcentagem os quadros inflamatórios com 77,5% (n= 31), seguido de atipias de
células escamosas com 12,5% (n= 5) e lesões intraepiteliais escamosas com 10% (n= 4).
Dentre os principais problemas ginecológicos, 67,4% (n= 64) possuíam corrimento e
dentre essas, 61,0% (n= 58) possuem corrimento com odor, frequentemente de cor branca
68,8% (n= 44). Outros sintomas como, prurido e ardência ao urinar tiveram taxa de 29,5%
(n= 28) e 12,6% (n= 12), respectivamente.
Entre os resultados alterados 87,5% (n= 35) relataram ter corrimento vaginal. Dos
resultados positivos, as três apresentavam corrimento, mas a associação não foi
estatisticamente significante (p= 0,120). O prurido foi referido em um dos casos, sangramento
durante o ato sexual em um e sangramento fora do período menstrual em um.
26
A figura seguinte em Box-Plot indica a distribuição de Chlamydia sp e achados
citológicos, por faixa estaria.
Figura 08. Frequência de Chlamydia sp e achados citológicos, de acordo com a idade.
FONTE: Laboratório de Citopatologia/ UFPA.
27
6. DISCUSÃO
Considerando a população em estudo, composta por estudantes universitárias
predominantemente jovens, a idade média investigada (24 anos) é correspondente à faixa
etária sugerida pelo CDC para triagem de Ct, que varia entre 25 anos ou menos. No Brasil, as
mulheres jovens são um dos grupos de maior risco para a aquisição de IST, as altas taxas de
gravidez, sintomas de IST e o baixo uso de preservativos, são indicativos da vulnerabilidade e
baixa percepção dos riscos dessas infecções (Miranda et al. 2004). Programas que visam à
triagem em mulheres na faixa etária que apresenta maior risco e principalmente mulheres que
já possuem histórico de infecção são mais efetivos (Hu et al., 2004).
No presente estudo, a taxa de prevalência em universitárias equivalente a 3,16% é
próxima do que se encontra em outros estudos envolvendo universitárias. Na África Central,
Ngandjio et al. realizou em 2003 uma pesquisa em universitários analisando a prevalência de
Ct, utilizando amostra de urina e secreção endocervical em homens e mulheres,
respectivamente, foi observada uma prevalência de 3,62% nos homens e de 3,96% e nas
mulheres. Outro estudo em universitários da Bélgica com idade entre 18 e 39 anos, realizado
por Colliers et al. em 2009, verificou uma prevalência de infecção entre homens e mulheres
igual a 2,9%. Patten et. al. (1998) analisou 274 estudantes universitários australianos através
de amostra de urina, do total de 178 mulheres a prevalência foi de 1,13%. Tábora et al., em
Honduras, verificou a taxa de infecção de Chlamydia em universitárias e das 100 mulheres
testadas 6% foram positivas para infecção por Ct, sendo que nenhuma dessas jovens possuía
histórico de recidiva de infecção por Ct.
De acordo com a população estudada e o método de diagnóstico utilizado, a prevalência
de Ct é variada (BORGES, et al., 2011). Benzakenm et al. no ano de 2010 realizou um estudo
na cidade de Manaus, onde foi observada uma taxa de prevalência considerada elevada, 13%
das amostras de mulheres que espontaneamente se dirigiram a uma clinica especializada em
DST tiveram resultado positivo para Ct. Ishak et al. em 2001 investigou a prevalência de
anticorpos para as espécies
C. trachomatis e C. pneumoniae em índios amazônicos
brasileiros e identificou a prevalência de Ct em torno de 14,41%. Na Europa dependendo do
contexto e país, a prevalência de Ct em mulheres assintomáticas varia de 1,7 a 17% (Wilson
et al., 2002).
28
Ao relacionar os resultados entre as técnicas de biologia molecular e citologia, as
amostras
positivas
na
PCR
não
demonstraram
na
citologia
nítidas
inclusões
intracitoplasmáticas característica de infecção por Ct. Em vários campos foram encontradas
apenas células metaplásicas vacuolizadas sem inclusões. As vacuolizações são tipicamente
encontradas em células metaplásicas, no processo de degeneração mucóide, as células
proliferadas podem formar massas que enchem as glândulas, a contínua atividade secretora
das células cilíndricas podem distender as células, formando vacúolos (SILVA FILHO &
LONGATTO FILHO, 2000).
O método citológico possui limitações e depende da percepção do especialista para a
identificação de achados celulares característicos de infecção por Ct. Entretanto, a citologia
não é inválida, esta ferramenta pode ser utilizada na triagem através da identificação de
inflamações que possivelmente possam ser decorrentes de alguma IST, aliada a outras
metodologias mais específicas. Considerando o fato de que o exame citológico é
rotineiramente incluído nos serviços de assistências medica básica, sempre que é sugerida a
infecção por Ct através do método de Papanicolaou, um exame complementar mais específico
deve ser adicionamento na confirmação do diagnóstico (CORNETTA et al., 2006). A
investigação rotineira para Ct em pessoas sexualmente ativas é recomendada, pela Associação
Medica do Canadá, através de Reação em Cadeia Polimerase, por ser um método de melhor
sensibilidade e especificidade (WEIR, 2004).
Neste estudo, não foi encontrada associação estatística entre citologia de quadro
inflamatório e infecção por Ct. Já o trabalho de Oliveira et al. (2008) identifica associação
entre infecção por Ct e alterações citológicas na cérvice uterina, e como principal fator de
associação, historias pregressa de IST tiveram maior relação com as infecções. Em
contrapartida, encontramos outros estudos onde não se observa esta relação, como é o caso de
Edelman et al. (2000) que não correlacionou a prevalência de Ct e a citologia oncótica
anormal. Reesink-Peters et al.(2001) não encontrou associação de infecção por Ct com a
gravidade da lesão neoplásica e progressão da neoplasia cervical.
Apesar do corrimento vaginal ser um fator em comum entre os casos positivos,
estatisticamente não houve significância. O fato de ser na maioria das vezes assintomática e a
falta de conhecimentos sobre Ct são um dos fatores que contribuem para a transmissibilidade
29
desta infecção. Mesmo assim, sinais como corrimento com odor, ardência ao urinar ou
sangramento fora do período menstrual podem ser indicativo de uma IST (CDC, 2012).
Embora não tenha sido verificada associação estatisticamente significante entre o uso de
preservativo e a infecção, mulheres que não utilizam preservativo possuem maiores chances
de adquirir uma IST. O preservativo é considerado o melhor método preventivo de IST, o uso
tem aumentado desde a epidemia da AIDS e intensificou a partir da década de 90 (Parker,
1994). Na população de universitárias em estudo, foi demonstrado que 65,3% (n= 62)
utilizam preservativo nas relações sexuais, porém este número ainda não é considerado
suficientemente satisfatório.
Em nosso estudo, fatores como idade, início de vida sexual, número de parceiros e
parceiro fixo, não tiveram associação com a infecção. Atualmente, o conceito de IST é
discutido por não ser aplicado apenas a pessoas de vida promíscua, pessoas consideradas de
vida cotidiana normal e sem necessariamente múltiplos parceiros sexuais são portadores de
IST (GONÇALVES et al., 2009).
Ao comparar os resultados do presente estudo com
investigações de desenho similar encontramos diferentes resultados, no caso de Benzakenm et
al. (2010) utilizando uma população de clínica de IST, com variáveis incluídas no modelo de
regressão múltipla como, o número e tipo de parceiros e uso de preservativo, não foi
encontrada associação à infecção cervical por clamídia de maneira consistente. Araújo (2002)
aplicou a análise univariada e multivariada com regressão logística, em uma população de
adolescentes e jovens, concluindo que a idade menor que 20 anos e o fato de ter mais que um
parceiro sexual foram os fatores de risco relacionados com infecção. Skjeldestad et al. (2009)
mostrou em seu estudo que a incidência de Ct em mulheres da Noruega está relacionada à
idade e a troca de parceiro sexual. Portanto, entende-se que dependendo do tipo de população
e as variáveis trabalhadas, os resultados podem variar entre os estudos.
Identificamos um perfil de estudantes em sua maioria não fumante, com vida sexual
ativa, com parceiro fixo, em média possui quatro parceiros sexuais ao longo da vida, utiliza
método contraceptivo, realiza periodicamente o exame preventivo, uma porcentagem realizou
o exame preventivo pela primeira vez. De acordo com o autor Flores et al. (2011), levando em
consideração o comportamento sexual das populações nos últimos anos, o controle sob a
expansão de IST é inviável, sem a interferência de programas educacionais, vacinação e
rastreamentos adequados. Conforme observada a experiência em outros países, programas de
30
detecção em massa refletem na diminuição da incidência de DIP e suas complicações, isto
favorece para a economia de recursos da saúde pública (MARQUES et al., 2005). Repetidas
infecções por Chlamydia sp aumentam os riscos de DIP, assim como infertilidade e gravidez
ectópica (HAGGERTY et al., 2010).
O baixo numero encontrado de amostras positivas e a cobertura do exame em uma
pequena população voluntária representativa da comunidade de estudantes universitárias
foram limitações da pesquisa. É importante não apenas a identificação de positividade para a
infecção, mas também notificação do individuo sobre a infecção para a busca de orientação
médica e tratamento. No campo da prevenção e triagem, tais atividades buscam minimizar as
consequências da infecção por Ct na população estudantil, seja através da notificação nos
casos de positivos ou por meio de trabalhos de conscientização dos riscos das IST.
31
7. CONCLUSÃO
Através deste estudo, concluímos que a prevalência de Ct em estudantes universitárias
atendidas no Laboratório de Citopatologia/UFPA foi considerada próxima ao encontrado na
literatura com relação a trabalhos em estudantes universitárias.
A população de jovens universitárias do estudo possui um perfil de mulheres não
fumantes, com vida sexual ativa, média de quatro parceiros sexuais ao longo da vida, início de
vida sexual na fase de adolescência, utiliza métodos contraceptivos e realiza anualmente o
exame preventivo.
Os resultados positivos pelo
método
molecular
não
apresentaram achados
citomorfológicos característicos de infecção por Ct, apesar de possuírem indícios de
inflamação.
32
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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40
ANEXO A: PARECER CONSUBSTANCIADO DO COMITÊ DE ÉTICA
41
ANEXO B: TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Projeto: Detecção de Chlamydia trachomatis em estudantes universitárias atendidas no
laboratório de Citopatologia/ UFPA: análise citológica e molecular.
Senhora________________________________________________________________
Solicitamos sua participação voluntariamente nesta pesquisa que tem como objetivo
investigar Infecções sexualmente transmissíveis em estudantes universitárias. Caso você
aceite participar, serão coletados dois espécimes cervicais, um para o exame de biologia
molecular e outro para exame citológico. Serão tomados todos os cuidados necessários para
que a coleta seja o menos incômoda possível, pois esta será realizada por profissional
capacitado.
Seus resultados serão tratados de forma anônima e confidencial, isto é, em nenhum
momento serão divulgados seus dados em qualquer fase do estudo. Quando for necessário
exemplificar determinada situação, sua privacidade será assegurada uma vez que seu nome
será substituído de forma aleatória. Os dados coletados serão utilizados apenas nesta pesquisa
e os resultados divulgados em eventos e/ou revistas científicas.
Sua participação nesta pesquisa consistirá em responder as perguntas a serem realizadas
sob a forma de questionário. E a doação de material biológico (secreção cérvico- vaginal).
Não haverá nenhum custo ou quaisquer compensações financeiras, nem riscos de qualquer
natureza relacionada a sua participação. O benefício direto relacionado à sua participação será
a obtenção dos resultados dos exames, além do beneficiamento à comunidade científica
através dos resultados da pesquisa.
Fica claro que o sujeito da pesquisa, ou o seu representante legal, pode a qualquer
momento retirar seu consentimento, não tendo nenhum tipo de ônus ou pagamento, e que sua
desistência em nada compromete o seu atendimento junto aos serviços oferecidos pela equipe
do projeto.
____________________________________________
Maísa Silva de Sousa (Pesquisador responsável)
Consentimento:
Declaro que li e compreendi as informações sobre a pesquisa, que me sinto perfeitamente
esclarecido sobre o conteúdo da mesma, assim como os seus riscos e benefícios. Declaro ainda que,
por minha livre vontade, aceito participar da pesquisa cooperando com a coleta de material para
exame.
Belém,_______/________/________.
Assinatura do participante
Ambulatório do Núcleo de Medicina Tropical - Av. Generalíssimo Deodoro, nº 92, Umarizal -fone:
3201-6812.
42
ANEXO C: QUESTIONÁRIO
UNIVERSIDADE FEREDERAL DO PARÁ
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
LABORATÓRIO DE CITOPATOLOGIA
LABORATÓRIO DE BIOLOGIA MOLECULAR E CELULAR
Registro:_______________
Coletora:______________
Data da coleta: __/__/__
Data de entrega: __/__/__
1- Dados pessoais
Nome: ______________________________________________________________
Idade: ________________________ Estado civil: ____________________________
Matrícula:____________________ Telefone:___________________________
2- Dados da anamnese
Fumante: ( ) Sim ( ) Não
Início da vida sexual: _____ ano
Idade da primeira menstruação: _____
Nº de parceiros desde o início da vida sexual: ____
Possui vida sexual atualmente: ____
Possui parceiro fixo: ( ) Sim ( ) Não
Uso de preservativo: ( ) Sim ( ) Não
Não
Gestante: ( ) Sim ( )Não Possui filhos: ( ) Sim ( )
Quantos?____
N° de partos normais:_____
Idade do primeiro parto____
Aborto: ( ) Sim ( ) Não
Uso de anticoncepcional: ( ) Sim ( ) Não
Quantos?____
Período:_____
Já apresentou algum problema ginecológico? (Ex: corrimento, sangramento, dores ou outros)
( ) Sim ( ) Não
Qual?______________________
Faz exame preventivo ginecológico anualmente? ( ) Sim ( ) Não
Quando fez o último:___________
3- Sintomatologia
Apresenta corrimento: ( ) Sim ( ) Não
Cor: ( )Amarelo
( ) Branco
Odor: ( ) Sim ( ) Não
( )outros: verde, pardo, etc.
Prurido/coceira: ( ) Sim ( ) Não
Ardência ao urinar: ( ) Sim ( ) Não
Dor durante o ato sexual: ( ) Sim ( ) Não
Sangramento durante o ato sexual: ( ) Sim ( ) Não
Sangramento fora do período menstrual: ( ) Sim ( ) Não
43
ANEXO D: FORMULÁRIO DE DADOS
UNIVERSIDADE FEREDERAL DO PARÁ
NÚCLEO DE MEDICINA TROPICAL
LABOTATÓRIO DE BIOLOGIA MOLECULAR E CELULAR
Formulário de dados de biologia molecular
1Responsável:______________________Tipo de Gel________________ Perc.:
_____%Tampão:______
Data da Eletroforese: ____.____._____ Data da PCR: ____._____._____
Condições: Volt:_____, Amperagem:_____, Duração____
Imagem(1ª foto):_____ Imagem (2ª foto)_____
Pasta/ Arq. no computador:_______________________ Gene
alvo(Primer)________________________
Amostras
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16 17
Master
mix
DNA
Vol.
Total
Master
mix
DNA
Vol.
Total
Descrição
da
amostra
Resultado
2Reagentes
H2O
M-Q
Inj.
Primer
CT1.
___p mol
Primer
CT2
___p mol
1 reação (vol = µL)
Reagentes
2 reação (vol = µL)
H2O
M-Q
Inj.
Primer
CT3
___p mol
Primer
CT4.
___p mol
18
19
20