Streptococcus mutans

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA
NÚCLEO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA
PAULA FRASSINETTI COELHO NASCIMENTO
AVALIAÇÃO in vitro DO POTENCIAL
ANTIMICROBIANO DO ÓLEO ESSENCIAL DE Hyptis
pectinata (L.) Poit. E DE COLUTÓRIOS SOBRE OS
Streptococcus mutans
Aracaju/SE
2005
PAULA FRASSINETTI COELHO NASCIMENTO
AVALIAÇÃO in vitro DO POTENCIAL
ANTIMICROBIANO DO ÓLEO ESSENCIAL DE Hyptis
pectinata (L.) Poit. E DE COLUTÓRIOS SOBRE OS
Streptococcus mutans
Dissertação apresentada ao Núcleo de Pósgraduação em Medicina da Universidade
Federal de Sergipe, para obtenção do grau de
Mestre em Ciências da Saúde.
Orientadora: Profª. Drª. Rita de Cássia Trindade
Aracaju/SE
2005
PAULA FRASSINETTI COELHO NASCIMENTO
AVALIAÇÃO in vitro DO POTENCIAL ANTIMICROBIANO DO ÓLEO
ESSENCIAL DE Hyptis pectinata (L.) Poit. E DE COLUTÓRIOS
SOBRE OS Streptococcus mutans
Dissertação apresentada ao Núcleo de Pósgraduação em Medicina da Universidade
Federal de Sergipe, para obtenção do grau de
Mestre em Ciências da Saúde.
Data da aprovação: ___/___/___
BANCA EXAMINADORA
________________________________________________________
Orientadora: Profª. Drª. Rita de Cássia Trindade
________________________________________________________
1ª Examinadora: Profª. Drª. Celuta Sales Alviano
________________________________________________________
2° Examinador: Prof. Dr. Ângelo Roberto Antoniolli
À irreverência
sempre viva de
Newman Sucupira
Agradeço...
Ao tempo... tempo... tempo....
Ao tempo que não pára e, no entanto, nunca envelhece.
Àquela infância simples,
dos sonhos simples.
Às dificuldades
de cada dia.
Aos amigos
que apostaram em mim,
ou não!
Aos muitos outros que adquiri
durante toda essa minha trajetória.
Aos companheiros, aos cúmplices, inclusive
àqueles que além de amigos ou amigas, são
irmãos, irmãs, tios, tias, cunhados, cunhadas e agregados.
Aos que contribuíram sem até se aperceber disso
positiva ou “negativamente” (lições de aprendizado).
Aos mestres. Estes sim! Culpados por tudo isso (rsrs).
Catedráticos ou não!
Obrigada a todos!
Aos nomináveis:
Pereira, Aguiar, Cruz, Moraes, Maciel, Tirado, Azevedo, Silveira, Hermínia, Souza, Santos,
Resende, Novais, Barbosa, Lemos, Piva, Almeida, Moura, Melo, Garcia, de Jesus, Oliveira
Obrigada!
manda um alô pra mim aê!
Às Marias, aos Josés, Joões, inclusive aos ninguém.
Especialmente à Maria Mãe. Obrigada Heroína!
E ao Paulo Pai. Obrigada por tudo!
Aos que ficaram e aos que se foram,
aos achados, aos perdidos, conquistados e construídos.
ao meu maior achado, Santana Krupka,... com “K”.
Saudades!
Aos meus queridos e lindos!
Thiago, Carol, Felipe, Alinne e Marcela pelas alegrias e magia.
Ao meu irmão e amigo maior: DEUS
Obrigada! Obrigada! Obrigada!
Hoje, sou um pouco de todos vocês.
Descobri como é bom chegar
quando se tem paciência. E para se chegar,
aprendi que não é preciso dominar a ansiedade
ou o tempo, mas a perseverança. Aqueles que
chegam e colaboram com o tempo
podem vangloriar-se de
uma longa série de
sucessos.
Josenilton Santos Bonfim
RESUMO
A odontologia moderna enfatiza a importância do controle do biofilme dental para melhorar a
saúde oral. O uso na terapêutica odontológica de colutórios tem um papel crucial na redução
do biofilme. A eficácia destas substâncias foi extensivamente avaliada em vários estudos. A
pesquisa farmacológica de plantas medicinais é necessária diante de sua capacidade
terapêutica e da sua larga utilização. Óleos essenciais e extratos de plantas há muito tempo
têm sido base para diversas aplicações na medicina popular, entre elas como antimicrobianos
e anti-sépticos tópicos. Existem vários métodos descritos na literatura para mensurar a
atividade antimicrobiana dos óleos essenciais. Entretanto, a ausência de métodos
padronizados, faz com que a comparação entre os estudos seja praticamente impossível, além
de incapacitar sua reprodutibilidade. O presente trabalho pesquisou in vitro a eficácia do óleo
essencial Hyptis pectinata frente ao Streptococcus mutans. Este apresenta atividade
antimicrobiana equivalente à clorexidina, o que demonstra o uso deste óleo como alternativa
promissora nos regimentos de saúde oral. Validando as propriedades antimicrobianas do óleo
essencial de Hyptis pectinata, desenvolveu-se um experimento utilizando a técnica de difusão
em disco, com algumas variações nos diluentes do óleo, dos quais, o Tween 20 e o Tween 80
são os mais indicados para a emulsificação do óleo de Hyptis pectinata. Os dados obtidos
ressaltam um considerável interesse pelo desenvolvimento de métodos confiáveis para
avaliação e comparação da atividade antimicrobiana de óleos essenciais.
Palavras-Chave: óleo essencial; atividade antimicrobiana; biofilme dental; bochecho;
Streptococcus mutans.
ABSTRACT
The modern dentistry emphasizes the importance of the control of the dental biofilm to
improve the oral health. The use in the odontologic therapeutics rinses has a crucial paper in
the reduction of the biofilm. The effectiveness of these substances was appraised extensively
in several studies. The pharmacologic research of medicinal plants is necessary due to its
therapeutic capacity and use. Essential oils and extracts of plants have been used for several
applications in the popular medicine, among them as antimicrobial and antiseptic topics.
There are several methods described inside the literature for size the antimicrobial activity of
the essential oils. However the measure of this activity is hindered by the absence of
standardized methods, what dificults the comparison among the studies. Besides, disables its
reproduction. The present work researched in vitro the susceptibility of Streptococcus mutans
to the Hyptis pectinata essential oil. It presents antimicrobial activity equivalent to the
chlorhexidine, what demonstrates the use of this oil as promising alternative in the regiments
of oral health. Validating the antimicrobial properties of the Hyptis pectinata essential oil, an
experiment was developed using the diffusion technique in disk with some variations in the
diluents of the oil, among them Tween 20 and Tween 80 are the most suitable for the
emulsification of the Hyptis pectinata oil. The obtained data emphasize a considerable interest
for the development of reliable methods for evaluation and comparison of the activity
antimicrobial of essential oils.
Key Words:
essential oil; antimicrobial activity; dental biofilm; mouthwash;
Streptococcus mutans.
LISTA DE ABREVIATURAS
ADA – American Dental Association
ATCC – American Type Collection Culture
CBM – Concentração Bactericida Mínima
CDT – Council on Dental Therapeutics
CG/EM – Cromatografia Gasosa/Espectrômetro de Massa
CIM – Concentração Inibitória Mínima
DMSO – Dimetil sulfóxido
FDA – Food and Drug Administration
IRR – Índice de Retenção Relativa
ISO – International Standard Organization
MRS – Methicillin-Resistant Staphylococci
MSS – Methicillin-Susceptible Staphylococci
NCCLS – National Committee for Clinical Laboratory Standard
OMS – Organização Mundial da Saúde
S. mutans – Streptococcus mutans
TR – Tempo de Retenção
TTO – Tea Tree Oil
UFC – Unidade Formadora de Colônia
UFS – Universidade Federal de Sergipe
UI – Unidade Internacional
LISTA DE QUADROS
QUADRO 1 (Capítulo II) – Critérios para participação de voluntários...............................82
QUADRO 2 (Capítulo II) – Soluções-controle e Soluções-teste utilizadas no ensaio.........86
QUADRO 1 (Capítulo III) - Critérios para participação de voluntários...............................96
QUADRO 2 (Capítulo III) - Soluções-controle e Soluções-teste utilizadas no ensaio........100
LISTA DE TABELAS
TABELA 1 (Capítulo II) – Constituintes químicos do óleo essencial de Hyptis
pectinata...................................................................................85
TABELA 2 (Capítulo II) - Diâmetro (mm) do halo de inibição de S. mutans produzido pelo
hidrolato e o óleo essencial de Hyptis pectinata em variadas
concentrações,
utilizando-se
o
método
de
difusão
em
disco.........................................................................................88
TABELA 3 (Capítulo II) -– Médias dos diâmetros (mm) dos halos de inibição de S. mutans
produzidos em diferentes concentrações do óleo essencial de
Hyptis pectinata e a clorexidina (controle positivo) pelo método
de difusão em disco..................................................................89
TABELA 1 (Capítulo III) – Constituintes químicos do óleo essencial de Hyptis
pectinata...................................................................................99
TABELA 2 (Capítulo III) - Diâmetro (mm) do halo de inibição de S. mutans produzido pelo
óleo essencial de Hyptis pectinata suspenso em diluentes
diversos (DMSO, Tween 20 e 80 e Propileno glicol) através do
método de difusão em disco....................................................102
TABELA 3 (Capítulo III) - Médias dos diâmetros (mm) dos halos de inibição de S. mutans
produzidos pelo óleo essencial Hyptis pectinata suspenso em
diversos diluentes (Tween 80, Tween 20, DMSO e Propileno
glicol) através do método em disco.........................................103
SUMÁRIO
RESUMO ............................................................................................................................. 6
ABSTRACT ......................................................................................................................... 7
LISTA DE ABREVIATURAS............................................................................................. 8
LISTA DE QUADROS ........................................................................................................ 9
LISTA DE TABELAS ....................................................................................................... 10
SUMÁRIO.......................................................................................................................... 11
CAPÍTULO I ..................................................................................................................... 12
1. INTRODUÇÃO.............................................................................................................. 14
2. REVISÃO DA LITERATURA...................................................................................... 18
2.1 CENÁRIO DA DOENÇA CÁRIE: DOMÍNIO MICROBIOLÓGICO. ................ 18
2.2 COLUTÓRIOS DE USO ODONTOLÓGICO........................................................ 25
2.2.1 Clorexidina ........................................................................................................ 26
2.2.2 Listerine ............................................................................................................. 30
2.3 ASPECTO SÓCIO–ECONÔMICO DOS FITOTERÁPICOS............................... 34
2.3.1-Hyptis pectinata (L.) POIT.: Matéria Prima Vegetal. ...................................... 40
2.4 ÓLEOS ESSENCIAIS: ATIVIDADE ANTIMICROBIANA................................. 42
2.5 ÓLEOS ESSENCIAIS NOS REGIMENTOS DE SAÚDE ORAL......................... 56
3. OBJETIVOS .................................................................................................................. 64
4. REFERÊNCIAS............................................................................................................. 66
CAPÍTULO II .................................................................................................................... 77
CAPÍTULO III .................................................................................................................. 92
CAPÍTULO IV................................................................................................................. 106
5. CONSIDERAÇÕES FINAIS....................................................................................... 121
APÊNDICE 1 ................................................................................................................... 124
APÊNDICE 2 ................................................................................................................... 125
ANEXO ............................................................................................................................ 129
CAPÍTULO I
Alternativa Terapêutica no Processo Saúde Doença.
INTRODUÇÃO
14
1. INTRODUÇÃO
A saúde é direito humano básico, sendo a saúde bucal essencial para a conservação
da saúde geral do indivíduo, e, não podem ser compreendidas dissociadas, bem como de
outros problemas sócio-econômico-culturais que o acometem, definindo sua relação com o
meio ambiente. As patologias bucais, geralmente, não se apresentando como ameaças à vida,
constituem um grande problema de saúde pública por sua alta prevalência, e, também, por sua
importância em termos de dor, desconforto e limitações funcionais e/ou sociais que afetam a
qualidade de vida. Dentro deste aspecto, é válido lembrar que o papel da odontologia
preventiva é essencial como instrumento para proporcionar melhores níveis de saúde bucal à
população, não apenas levando assistência para resolvermos problemas já instalados, mas para
prevenir o aparecimento de alterações patológicas nas estruturas bucais. A promoção de saúde
envolve atividades gerais do profissional e do paciente, bem como ações específicas de cada
um, tanto em nível de manutenção da saúde, como de diagnóstico precoce de qualquer desvio
para seu controle em fase de maior facilidade e segurança.
O controle do biofilme dental, que consiste na colonização e no crescimento de
microrganismos nas superfícies dos dentes e nos tecidos orais, é assunto de bastante interesse
para a odontologia preventiva, por ser este, o agente etiológico preponderante no surgimento
da cárie dentária e da doença periodontal. Portanto, a saúde bucal depende em grande parte do
controle da formação e desenvolvimento do biofilme bacteriano através da higienização e
utilização de um arsenal de produtos, tais como: dentifrícios, anti-sépticos orais, fio dental,
uma boa escova, que nem sempre são disponíveis à grande parte da população.
A cárie dentária é uma doença de índices elevados na população, constituindo,
portanto, uma pandemia. Sendo de natureza multifatorial, está na dependência da interação de
15
Introdução
vários fatores: microrganismo, hospedeiro, substrato e o tempo. Segundo Newbrun (1988), o
principal microrganismo envolvido no processo é o Streptococcus mutans pela sua capacidade
de metabolizar carboidratos, produzindo ácidos que formam a cavitação dentária da doença.
Associado ao papel precípuo da odontologia, a tecnologia farmacêutica é uma
forte e poderosa aliada no combate às patologias bucais, com todo um aparato de insumos e
medicamentos tais como: creme dental e colutórios bucais. O desenvolvimento de pesquisas
científicas tem contemplado a utilização de plantas medicinais de forma racional, aliando
menores custos, maior eficácia terapêutica e menores efeitos colaterais. O estudo das espécies,
utilizadas há muito pelas comunidades, se dá por meio de equipes multidisciplinares
propiciando um modelo de medicina a ser seguido que permita assegurar o uso dessas plantas
nos serviços de saúde. Necessário se faz, no entanto, garantir a qualidade dos fitoterápicos,
iniciando-se com a caracterização da matéria-prima vegetal, que inclui identificação botânica
e farmacognóstica, determinação das propriedades físico-químicas e biológicas, quantificação
da(s) substância(s) marcadora(s) e toxicidade. Assim, a padronização torna-se imprescindível
para a produção racional de medicamentos oriundos de plantas medicinais, visando
reprodutibilidade dos métodos utilizados, garantindo desta forma, a qualidade do produto
final.
Neste sentido, dois fatores favorecem as pesquisas voltadas para a área
etnofarmacológica no Brasil: a enorme biodiversidade da flora medicinal e a diversidade
etnocultural. As práticas de cura foram incorporadas e assimiladas através dos conhecimentos
transmitidos pelos inúmeros povos que habitaram o Brasil. Isso contribuiu para a formação de
uma medicina popular bastante rica e original. Dessa forma, a utilização de plantas como
medicinais faz parte da cultura do povo, interage com o conhecimento popular, e é passado de
geração em geração sob diversas formas. Investimentos nessa área poderão contribuir com o
16
Introdução
banco de dados genéticos, com a descoberta de novos princípios ativos e novos medicamentos
à base de plantas medicinais.
O material vegetal deste estudo é constituído pelas partes aéreas da Hyptis
pectinata (L.) Poit. pertencente à família Lamiaceae, comumente encontrada na região da
caatinga sendo popularmente conhecida por sambacaitá, de uso difundido por via oral e/ou
uso como anti-séptico tópico, em bochechos, banhos aromáticos, contra febre, diaforético
estomacal, infecções bacterianas, dor e até mesmo câncer; apresentando comprovadas
atividades antimicrobianas, analgésicas e antiinflamatórias (PEREDA-MIRANDA et al.,
1993; BISPO et al., 2001; FRAGOSO-SERRANO; GIBBONS; PEREDA-MIRANDA,
2005).
Este trabalho avaliou a atividade antibacteriana do óleo essencial da Hyptis
pectinata frente ao Streptococcus mutans. Trata-se de um estudo pioneiro e vem se somar a
outros estudos microbiológicos e farmacológicos já realizados na Universidade Federal de
Sergipe. Além disso, à luz da importância da ciência, poderá contribuir para enriquecer outras
pesquisas. Espera-se que a partir dele haja um maior aprofundamento na compreensão e
interpretação dos procedimentos da medicina popular, de forma a promover avanços na área
da etnobotânica, antropologia, química, farmacologia, sociologia, microbiologia, fitoterapia,
odontologia e medicina. No contexto operacional, os resultados desta pesquisa poderão ser de
grande valor para melhoria da qualidade de saúde da população.
A dissertação está estruturada por capítulos, sendo o primeiro representado pela
parte introdutória, e, a seguir, cada objetivo específico gerou os capítulos seguintes.
REVISÃO DA LITERATURA
18
2. REVISÃO DA LITERATURA
2.1 CENÁRIO DA DOENÇA CÁRIE: DOMÍNIO MICROBIOLÓGICO.
A preocupação do homem na busca de meios eficientes para prevenção e cura de
suas enfermidades vem desde as remotas épocas em que curandeiros utilizavam ervas
medicinais e rituais místicos para tratamento dos diversos males que acometiam sua cavidade
bucal. Esse interesse pela prevenção evoluiu consideravelmente a partir da real percepção de
que ao mastigar alimentos, resíduos ficavam em várias regiões da cavidade bucal,
principalmente entre os dentes. Várias civilizações contribuíram para o desenvolvimento das
técnicas de remoção desses resíduos alimentares, com a conseqüente redução da formação do
biofilme bacteriano.
Council on Dental Therapeutics (1986) conceituou biofilme bacteriano como uma
entidade altamente variável que resulta da colonização e do crescimento de microrganismos
nas superfícies dos dentes e nos tecidos orais moles, consistindo de um número de espécies e
cepas microbianas embutidas em uma matriz extracelular. Clinicamente, o biofilme é
encontrado como supragengival e subgengival, assim como nas superfícies orais que incluem
as restaurações e dispositivos orais.
Uma variedade de superfícies, incluindo o corpo humano, é colonizada por
microrganismos que ocorrem na forma de película chamada biofilme. Esse biofilme é
formado como uma resultante da interação interbacteriana e co-agregação de uma variedade
de microrganismos. A placa dental é um filme bacteriano aderente. Na formação da placa são
Revisão da Literatura
19
aderidos microrganismos pioneiros que proliferam e formam colônias. No estágio final
envolve a agregação de organismos filamentosos e espiroquetas em um biofilme coesivo. A
placa dental é, talvez, o biofilme melhor estudado e serve como um modelo para estudo de
outro biofilme (BERNIMOULIN, 2003).
Foi descrito no processo de colonização do biofilme que os primeiros
microrganismos a se agregarem são os cocos Gram-positivos, especialmente os Streptococcus
mutans e sanguis, fusobactérias, espirilos e espiroquetas. A colonização ocorre nas primeiras
oito horas de forma rápida e seletiva à película adquirida (NEWBRUM, 1988). A composição
do biofilme varia de acordo com a idade e a dieta, mas geralmente é composta por cerca de
80% de água e 20% de sólidos, dentre estas, bactérias e polímeros extracelulares secretados
pelos organismos e aqueles derivados do meio ambiente (GENCO, 1996; SREENIVASAN;
GAFFAR, 2002).
As doenças cárie e periodontal são as afecções bucais de maior prevalência e
incidência na população mundial, constituindo os dois maiores problemas de saúde pública na
odontologia. Na verdade não constitui uma afecção apenas, mas um grupo de problemas ou
doenças que ganham importância cada vez maior. Sendo assim, responsáveis pela maioria das
dores e perdas dentais, que têm por principal causa o biofilme bacteriano devido às más
condições de higienização (MOREIRA; HAHN, 1994; QUELUZ, 1995; BERNIMOULIN,
2003).
Thylstrup e Fejerskov (2001) afirmaram que as superfícies da cavidade oral são
constantemente colonizadas por microrganismos, os quais constituem uma microbiota muito
complexa que, por si só, não resulta em doença, pois eles existem em equilíbrio com o
Revisão da Literatura
20
hospedeiro. Em seguida a uma limpeza completa dos dentes, o biofilme supragengival se
acumula ao longo da margem gengival dos dentes em dois dias e nesse ponto ele começa a
aumentar em espessura até um máximo de sete dias. Levantamentos epidemiológicos,
associados ao papel etiológico estabelecido a partir de investigação clínica, resultaram na
suposição de que o controle mecânico do biofilme poderia prevenir a cárie, a gengivite e,
portanto, a doença periodontal.
A associação de Streptococcus mutans com lesões de cárie dental foi
primeiramente reportada por Clarke (1924 apud GOLD; JORDAN; van HOUTE, 1973) que
isolou o microrganismo, geralmente de culturas puras, do fundo de lesões cariosas. Este
microrganismo tem sido foco de vários estudos desde que foi descoberto o seu potencial de
indução de cárie, demonstrada em modelos animais.
Sabe-se que a cárie é uma doença dentária infecciosa crônica, dependente da
virulência e do tempo de permanência do biofilme, bem como da resistência, dos hábitos
alimentares e de higiene do hospedeiro. O principal microrganismo envolvido no processo é o
Streptococcus mutans pela sua capacidade de metabolizar carboidratos e produzir ácidos,
além de polímeros intracelulares (que são utilizados como reserva de carboidratos) e
extracelulares (fazendo com que as bactérias fiquem aderidas umas às outras e ao dente). A
dieta alimentar rica em carboidratos (oligossacarídeos, em especial a sacarose) é fator
fundamental para a manutenção do Streptococcus mutans em grandes proporções na boca,
sendo importante também, a freqüência com que estes carboidratos são ingeridos. No entanto,
a capacidade tampão da saliva do indivíduo reduz o risco à cárie, promovendo a neutralização
dos ácidos e inibindo a formação e cavitação dentária da doença (NEWBRUN, 1988).
Revisão da Literatura
21
Maltz (1996) e Hofling et al. (1999) estabeleceram que os Streptococcus mutans
constituem um grupo heterogêneo de bactérias altamente cariogênicas pelas seguintes
características: capacidade de colonizar o dente, produzir polissacarídeo extracelular a partir
da sacarose, ser altamente acidogênico e acidúrico e metabolizar glicoproteínas salivares. O
efeito local do alimento na cavidade bucal é o fator mais importante na etiologia e
patogenicidade da doença cárie. Takahashi; Yamada (1999) relataram que a dieta influencia o
tipo e a quantidade de biofilme bacteriano, a composição de microrganismos, a qualidade e
quantidade de secreção salivar e a produção de ácidos. A cárie se inicia pela desmineralização
da superfície dentária devido à produção de ácido pelas bactérias do biofilme dental.
Muitos estudos têm sido efetuados com a intenção de descobrir a maneira mais
eficiente para controlar o biofilme bacteriano, fator primordial na prevenção, e deve ser
considerada a base da promoção da saúde bucal. No entanto, apesar dos esforços dos
pesquisadores nessa busca, a limpeza mecânica através da escovação dentária, continua sendo
o método mais eficiente e universalmente aceito (LINDHE, 1983).
Weyne (1996) descreveu a cárie como uma doença infecto-contagiosa,
multifatorial, sacarose dependente de fundo comportamental que exige tratamento específico
sobre fatores etiológicos para sua prevenção e cura. Métodos convencionais de combate à
cárie baseados apenas nos procedimentos curativos mostram-se ao mesmo tempo ineficientes
e clinicamente irrealistas.
Vários fatores podem interferir na acidogenicidade e cariogenicidade do biofilme,
como a dieta, capacidade de higienização do paciente, o uso da água, dentifrícios e outros
produtos que possuem flúor. A cárie trata-se de condição patológica na qual o hospedeiro
Revisão da Literatura
22
susceptível, em um ambiente de desequilíbrio da microbiota, é agredido pela ação de ácidos
orgânicos, particularmente o ácido lático, produzido principalmente por Streptococcus
mutans, segundo Jardim P. e Jardim Junior (1998).
Barbosa; Medeiros (1999) e Pilloni; Paoletti; Perdona (1999) concluíram que o
índice de cárie aumenta paralelamente com a concentração, na saliva, de microrganismos
cariogênicos e que, a sua contagem é importante para o diagnóstico de risco desta doença. O
teste de saliva, para diagnóstico do risco de cárie, tem como objetivo identificar os indivíduos
que precisam de medidas específicas para reduzir a velocidade de progressão da cárie, bem
como verificar se o ambiente bucal é propício à formação de lesões de cárie, determinando o
real risco da doença de um paciente. Complementando, para Toi; Cleaton-Jones; Daya, (1999)
enquanto os Streptococcus mutans estiverem associados fortemente com cárie dental, seus
níveis salivares são uma ótima indicação do risco de cárie.
Bratthall (1980) definiu pacientes de risco à cárie como sendo os expostos a uma
maior oportunidade e/ou possibilidade de injúrias. Representados pelos que tenham alta
freqüência de ingestão de sacarose, que apresentam um reduzido fluxo salivar e também baixa
capacidade tampão da saliva e/ou aqueles com altas contagens de Streptoccocus mutans.
A presença de altos números de Streptococcus mutans no biofilme e na saliva (>
106 UFC/mL) é um índice confiável para apontar pessoas de alto risco de cárie. A
possibilidade de aparecimento de lesões cariosas aumenta em proporção direta com o grau de
presença dessas bactérias no ambiente bucal, constatado por métodos de contagem
(LORENZO J.; LORENZO A., 2002; YANO et al., 2002).
Revisão da Literatura
23
Nos pacientes de alto risco, a escovação com dentifrícios fluoretados deve estar
associada à utilização de substâncias antimicrobianas capazes de atuar no meio bucal, no
processo de desmineralização – remineralização, como um meio preventivo seguro e de baixo
custo. A eficácia da escovação depende do risco à cárie do paciente e não age isoladamente
como um método eficaz na prevenção de cáries, e doenças periodontais (TINOCO E.,
TINOCO N., 2000).
A colonização da cavidade bucal pelos Streptococcus mutans geralmente ocorre
durante a infância, sendo transmitida de acordo com o nível de infecção da mãe, detectados na
cavidade bucal a partir da erupção dos dentes decíduos, fato relatado por Torres et al. (1999);
Castro et al. (2000).
Mattos-Granner et al. (1998) relacionaram em sua pesquisa a presença de cárie
dental e o quantitativo de Streptococcus mutans na saliva, encontrando uma alta prevalência
de Streptococcus mutans em crianças de 12 a 31 meses de idade na amostra estudada.
Sugeriram que os níveis salivares desses microrganismos são dependentes do número de
dentes irrompidos na cavidade bucal, além de estarem positivamente associados à freqüência
e severidade da cárie dental.
Entretanto, estudos sobre a etiologia dos Streptococcus mutans em cáries dentais
são difíceis de serem realizados devido à falta de técnicas convincentes e confiáveis para o
reconhecimento e contagem dos microrganismos do biofilme dental humano. Um método
largamente utilizado envolve a cultura de amostras de biofilme dental em ágar Mitissalivarius que é seletivo para o gênero Streptococcus. Neste meio é possível diferenciar o
Streptococcus mutans de outras espécies baseado na sua morfologia colonial, este
Revisão da Literatura
24
procedimento, no entanto, pode ser tedioso quando um grande número de amostras está
envolvido. Com objetivo de desenvolver um meio seletivo para isolamento de Streptococcus
mutans do biofilme de humanos, foi utilizado o ágar Mitis-salivarius modificado pela adição
de 0.2 unidades/mL de bacitracina e 20% de sacarose. Nestas concentrações, os agentes
seletivos permitem o crescimento do Streptococcus mutans com inibição máxima da flora
estreptocócica normal encontrada neste meio (GOLD; JORDAN; van HOUTE, 1973).
Whiley e Beighton (1998) desenvolveram uma classificação atualizada para
estreptococos orais. As mudanças que surgiram na classificação, identificação e nomenclatura
dos membros das espécies foram revisadas frente a um plano histórico de gradual melhora das
técnicas, levando a uma classificação natural baseada na evidência genotípica. O esquema de
identificação corrente, empregando testes bioquímicos foi também revisado, juntamente com
alternativa aproximação molecular. Dentro do gênero Streptococcus, os estreptococos orais
são as espécies que predominam na cavidade oral e nas vias respiratórias superiores de
humanos, podendo causar infecções oportunistas em pacientes imunocomprometidos. Os
Streptococcus do grupo mutans são cocos Gram-positivos, imóveis, catalase-negativos, que
formam cadeias curtas ou médias. Em ágar Mitis-salivarius crescem como colônias convexas,
opacas, com aparência de vidro esmerilhado. No ágar-sangue produzem hemólise tipo alfa
(viridante) ou ausência de hemólise. Quando cultivados em presença de sacarose, apresentam
cápsula de glicano e levano e produzem polissacarídeos extracelulares insolúveis. Fermentam
o manitol e o sorbitol e não são exigentes para seu crescimento como os demais
Streptococcus. Desenvolvem bem em pH ácido, em torno de 4,3.
Os Streptococcus do grupo mutans são pandêmicos, sendo isolados de populações
de diversas origens étnicas e sócio-econômicas. São encontrados em grande número no
Revisão da Literatura
25
biofilme isolado de populações cárie-ativas e mais freqüentemente de biofilme de lesões
cariosas do que de biofilme que recobrem superfícies dentárias sadias. Existe uma relação
entre o nível de infecção por Streptococcus do grupo mutans e o risco de cárie em fissuras e
nas superfícies interdentais. Na cavidade bucal humana, predominam as espécies
Streptococcus mutans (presentes em 90% das bocas) e Streptococcus. sobrinus (7 a 35% das
bocas). A concentração do grupo Streptococcus mutans na saliva humana tem uma variação
que vai desde não detectável até 107 UFC/mL, com concentração média de 105 UFC/mL de
saliva (BERNIMOULIN, 2003).
2.2 COLUTÓRIOS DE USO ODONTOLÓGICO.
Os colutórios bucais são definidos como produtos para uso tópico na cavidade
bucal, destinados a funcionar como cosméticos e terapêuticos. Eles podem ser classificados
em dois grandes grupos: com fluoretos e com antimicrobianos. Os antimicrobianos à base de
clorexidina, óleos essenciais e cloreto de cetilpiridínio são facilmente encontrados no mercado
nacional e internacional, sendo considerados coadjuvantes importantes no tratamento dentário
(WU; SAVITT, 2002).
Os bochechos antimicrobianos reduzem o biofilme visível na superfície dos
dentes. A aplicação clínica dos bochechos pode ser dividida em duas categorias: preventiva e
terapêutica (FISCHMAN, 1994).
A relevância da eficácia dos produtos antibiofilme para a manutenção da saúde
bucal justifica a necessidade de realização de novos experimentos. Pitten e Kramer (1999)
Revisão da Literatura
26
avaliaram diversas soluções de bochechos contra as bactérias da cavidade oral de dez
indivíduos através de um modelo uniforme que permitiu uma comparação direta de diferentes
produtos. Os resultados obtidos classificaram as soluções de acordo com suas propriedades:
eficácia contra os patógenos do biofilme; substantividade, ou seja, que possua um efeito
residual; ação preventiva ou curativa de doenças; forma de uso segura; não provocar efeitos
colaterais locais ou sistêmicos importantes e sabor agradável.
Segundo Bernimoulin (2003), muitos produtos do biofilme bacteriano reagem com
o tecido subepitelial, causando a inflamação responsável por um aumento da vascularidade e
diapedese dos leucócitos. Um anti-séptico oral efetivo deve atuar contra uma larga variedade
de bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, incluindo Streptococci e Fusobacteria. Um
agente efetivo ideal deveria também penetrar no biofilme. Dados mostram que bochechos
com óleos essenciais e clorexidina têm o mais amplo efeito antimicrobiano contra as bactérias
da cavidade oral.
2.2.1 Clorexidina
Dentre os antimicrobianos mais utilizados, destaca-se um detergente catiônico, do
tipo bisguanidina, disponível na forma de sais de gluconato ou acetato de clorexidina. Devido
a seu grande potencial antibiofilme, a clorexidina é a substância de eleição em procedimentos
de descontaminação bucal, sendo muito utilizada sob a forma de gel ou solução,
principalmente para pacientes que necessitam de uma forma adicional de controle de biofilme
microbiano, tais como pacientes de alto risco à cárie, com deficiências físicas e/ou mentais
Revisão da Literatura
27
impossibilitados de realização da escovação eficiente, com cárie rampante, com fluxo salivar
reduzido, nas doenças periodontais e após cirurgias orais (NAVARRO; CÔRTES, 1995).
O potencial da clorexidina como um agente útil em influir na atividade cariogênica
foi mencionado há quase 20 anos atrás por Emilson (1977 apud BOWDEN, 1996). Usada ao
longo da história por ser segura, possui utilidade em diversas áreas e uma variada aplicação. A
clorexidina também pode ser usada como irrigante subgengival, como enxaguatório para
controle de aerossóis, como anti-séptico e desinfetante de hospitais, em saúde pública na
purificação de água, como produtos de tratamento - incluindo formulações de tratamento,
funcionando como chave no controle e prevenção de infecções (SREENIVASAN; GAFFAR,
2002).
O advento das soluções para bochechos à base de clorexidina, que é considerado o
“padrão ouro” dos agentes antibiofilme, proporcionou um novo impulso nas pesquisas sobre a
prevenção de doenças. Além disso, um produto com clorexidina a 0,12%, Peridex – Procter
and Gamble Co., Cincinnati, OH., recebeu o Selo de Aceitação do Council on Dental
Therapeutics (CDT), sendo aceito como controle positivo, usando as Diretrizes American
Dental Association – ADA (ADAMS; ADDY, 1994).
De acordo com Reis e Novaes Júnior (1984), duas aplicações diárias de
clorexidina tópica a 2% ou sob a forma de bochecho a 0,2% são eficientes para controlar o
biofilme supragengival. A superfície dental condicionada com clorexidina rejeita a retenção e
crescimento bacteriano. Devido às suas propriedades catiônicas, a clorexidina liga-se a
hidroxiapatita do esmalte dentário, à película orgânica e às proteínas salivares, podendo ser
liberada quando a sua concentração no meio bucal diminui.
Revisão da Literatura
28
Quagliato (1991) concluiu que a clorexidina é uma das substâncias mais estudadas
na odontologia há três décadas e, por isso, uma das mais utilizadas entre os antimicrobianos.
Na cavidade oral ela age inibindo a formação e na retenção do biofilme com subseqüente
lenta liberação, atuando de forma bactericida e bacteriostática. Seu uso mais comum é na
forma de bochechos diários.
Silva (1994), afirmou que os efeitos colaterais, relativos ao manchamento dos
dentes e alterações da mucosa, não foram observados. Entretanto, perda do paladar, e gosto
metálico, foram observados por alguns minutos após a realização do bochecho com
clorexidina.
Bowden (1996) relacionou o Streptococcus mutans com a cárie, o valor dos testes
de quantificação para S. mutans no diagnóstico da atividade de cárie e o uso da clorexidina na
redução ou eliminação destes microrganismos. Uma avaliação do número de S. mutans no
biofilme e na saliva pode ajudar no diagnóstico da atividade de cárie. Em conjunto com este
conceito, o controle e prevenção de cárie têm sido buscados com intuito de reduzir o número
de colonização bacteriana no indivíduo. É possível conduzir análises clínicas e laboratoriais
de amostra de saliva e do biofilme para determinar a presença e número de S. mutans,
possibilitando um meio de controle e prevenção da doença. Testes para diagnóstico de cárie
que são baseados apenas na microbiologia são confundidos pela natureza multifatorial da
cárie. A contagem de microrganismos pode ser útil para estabelecer o padrão microbiológico
para dado paciente e ela é essencial para a monitoração no tratamento preventivo com uso de
antimicrobianos. Assim, também pode ser usada para estabelecer um padrão normal de
colonização para um paciente, e uma divergência desse padrão indicará mudança no status
oral, que pode ser incluído como um parâmetro no diagnóstico. A decisão de usar testes
Revisão da Literatura
29
microbiológicos para auxiliar o diagnóstico e o uso de clorexidina para reduzir ou eliminar
Sreptococcus mutans repousa sobre o profissional.
Jones (1997), revisando o uso da clorexidina na prática odontológica, a considerou
um dos agentes mais conhecidos e estudados. Sendo do grupo das bisguanidas, com amplo
espectro antibacteriano, atinge bactérias Gram-positivas, Gram-negativas, fungos e alguns
vírus. É muito bem aceita pelos odontólogos e freqüentemente usada como controle positivo
em estudos que testam produtos alternativos para o controle do biofilme supragengival.
Uma das principais indicações da clorexidina é o controle químico do biofilme
dental, sendo utilizada nos pós-operatórios nos pacientes com dificuldades motoras e mentais,
com problemas sistêmicos que predisponham a infecções orais, pacientes com alto risco à
cárie, em uso de terapia ortodôntica, implantodontia e pacientes hospitalizados por um longo
período (ADDY; RENTON-HARPER, 1997).
Villalpando e Toledo (1997) observaram que a capacidade antibiofilme bacteriano
da clorexidina está relacionada com sua substantividade na cavidade bucal, formando
complexos reversíveis com macromoléculas presentes no epitélio da mucosa oral e nos
dentes. É ratificada por Vasconcelos (2001), que relatou acentuada capacidade de adsorção da
clorexidina aos dentes e às superfícies da mucosa oral, com posterior liberação na cavidade
oral em níveis terapêuticos no período de 24 horas.
Pesquisas epidemiológicas indicam um aumento no isolamento de linhagens
clínicas de bactérias resistentes aos antibióticos. Monitoramentos microbiológicos
examinaram a flora oral com relação à resistência segundo o uso prolongado de biocidas em
Revisão da Literatura
30
adição a susceptibilidade antibiótica de um grande número de linhagens clínicas de bactérias
orais comuns obtidas de indivíduos acompanhando o uso de formulações de clorexidina.
Demonstraram fornecer benefícios adicionais na redução da gengivite e do biofilme, sem
resultar em resistência microbiana ou alterar a flora oral levando a colonização por
microrganismos patogênicos ou oportunistas (SREENIVASAN; GAFFAR, 2002).
2.2.2 Listerine
O Listerine, anti-séptico bucal que segundo o fabricante Warner Lambert , ajuda
a combater os germes que causam o mau hálito e previne a formação do biofilme dental, deve
ser usado como bochecho duas vezes ao dia, com 20 mL cada, após escovação ou quando
desejado. O Listerine é composto por timol (0.064%), eucaliptol (0.092%), salicilato de metila
(0.060%) e mentol (0.042%) em veículo de solução hidroalcoólica a 26.9%.
Análises clínicas de curto prazo, com durações entre sete e sessenta dias,
demonstraram que Listerine retarda a acumulação do biofilme dentário e reduz a gravidade da
gengivite quando usado como suplemento ou na ausência dos procedimentos normais de
higiene oral (KENNEDY; KRAVETS, 1970; GOMER et al., 1972; LUSK et al., 1974;
FORNELL; SUNDIN; LINDHE, 1975; MENAKER et al., 1979).
Estudos realizados sobre os efeitos do enxágüe bucal com Listerine contra mau
hálito (halitose) e sua ação anti-séptica frente às bactérias produtoras de compostos
responsáveis por esse odor, provaram sua eficácia na redução do nível desses microrganismos
Revisão da Literatura
31
e, conseqüentemente, no mau hálito (PITTS et al., 1983). Testes feitos por Lamster et al.
(1983) verificaram o efeito de Listerine na redução da extensão e gravidade do biofilme
supragengival e gengivite, quando usado como um adjunto a práticas orais usuais. Gordon,
Lamster e Seiger (1985) notaram também, que o uso do Listerine como complemento aos
procedimentos de higiene bucal ocasionava uma redução global na atividade tóxica do
biofilme, bem como, redução na massa do mesmo sem que houvesse a ocorrência de efeitos
adversos no tecido mole ou coloração extrínseca do dente. Através de ensaios comparativos
desenvolvidos por Axelsson e Lindhe (1987), a respeito de bochechos realizados com os antisépticos Listerine e clorexidina, verificaram a eficiência dos mesmos na redução do biofilme
dental e gengivite, no entanto, somente os pacientes que fizeram uso da clorexidina
apresentaram ulcerações.
O uso de enxaguatórios com Listerine duas vezes ao dia por nove meses induziu
uma inibição de biofilme em 13,8%, quando comparado ao veículo controle, e de 19,5%
quando comparados com o controle água. O grupo que fez bochechos com Listerine, não
desenvolveu mais pigmentação dentária do que o grupo que fez bochechos com água. Por
último, o veículo contendo 26,9% de álcool não mostrou uma diferença significativa com a
água, confirmando que o álcool não é ativo na inibição de biofilme. A efetividade de Listerine
não é devida somente ao teor de álcool, e sim, aos seus ingredientes ativos (GORDON;
LAMSTER; SEIGER, 1985).
Alguns bochechos podem ter seus efeitos anti-sépticos reduzidos quando em
contato com proteínas, e sendo a saliva uma fonte rica em proteínas, acredita-se que esta pode
interferir na atividade dos colutórios. Nesse sentido, Ross, Charles e Dills (1989) estudaram a
ação das proteínas sobre o Listerine e determinaram a capacidade do mesmo em matar uma
Revisão da Literatura
32
ampla faixa de bactérias e a não inibição dele pela presença de proteínas. Nenhum
microrganismo resistente, oportunista ou patógenos orais prováveis emergem como resultado
do uso diário de longa duração de Listerine, sendo o primeiro enxaguatório sem prescrição a
receber o Selo de Aceitação do “Council on Dental Therapeutics” como seguro e efetivo no
auxílio da prevenção e redução de acúmulo de biofilme supragengival e gengivite quando
usado em um programa de higiene oral e tratamento profissional regular aplicado de forma
consciente.
A prevenção e/ou a redução do biofilme, determinada pelo Listerine, se deve a
uma potente atividade antimicrobiana que essa substância possui, uma vez que a mesma
promove alterações na superfície celular da bactéria e, assim, interfere na colonização inicial
da microbiota inativando o crescimento do biofilme (OVERHOLSER et al, 1990; KUBERT
et al, 1993; OLIVEIRA et al, 1998).
Sperança e Barbosa (1993) afirmaram que o Listerine é capaz de exercer atividade
inibitória sobre o Streptococcus mutans, sendo bacteriostático nos períodos de trinta segundos
a três minutos e bactericida após esse período.
Whitaker et al. (2000) sugeriram que há uma associação entre doença periodontal
avançada e condições sistêmicas, tais como doença da coronária. Investigaram se a exposição
dos patógenos orais ao Listerine afeta a agregação de plaquetas do indivíduo. Demonstraram
que o uso de colutórios contendo óleos essenciais tem uma variedade de efeitos, além e acima
de eliminação direta da bactéria, que podem ter relevância clínica.
Revisão da Literatura
33
O Listerine é o mais antigo produto de higiene oral do mercado. Seus ingredientes
ativos consistem numa combinação de óleos essenciais de plantas. Evidências clínicas da
segurança desse produto foram baseadas em mais de cem anos de uso e na baixa incidência de
queixas. Todos os óleos foram estudados individualmente e considerados seguros para o uso
tópico em mucosas da boca e garganta na forma de bochechos, gargarejos e sprays nas
concentrações de: 0.04 a 2.0% de mentol, 0.025 a 0.1% de eucalipitol, e acima de 0.4% de
metil salicilato. Estudos toxicológicos mostraram que quando os componentes que formam o
Listerine são combinados, produzem um composto seguro e sem efeito adverso de nenhum
componente em particular. Apesar de alguns relatos sobre uma sensação inicial de queimor e
gosto amargo, esses efeitos cessaram após alguns minutos do uso. Não houve lesão de mucosa
oral com o uso do produto. Não se detectou surgimento de microrganismos oportunistas ou
patógenos potenciais na flora de usuários de Listerine (WU; SAVITT, 2002).
Revisão da Literatura
34
2.3 ASPECTO SÓCIO–ECONÔMICO DOS FITOTERÁPICOS.
A Organização Mundial de Saúde – OMS estima que 80% das pessoas nos países
em desenvolvimento confiam na medicina tradicional para os cuidados primários de saúde e
que 85% desta medicina tradicional envolve o uso de extratos de plantas (FARNSWORTH;
SOEJARTO, 1985).
Definição sobre a fitoterapia, dada por Ferreira (1998), significa a expressão
genérica ao tratamento de doenças por meio de medicamentos originados exclusivamente de
material botânico integral ou de extratos. A Organização Mundial da Saúde define fitoterápico
como “qualquer produto medicinal acabado e rotulado que contenha como ingredientes
ativos, partes aéreas ou subterrâneas de plantas, ou outro material derivado de plantas, ou
combinações destes, quer em estado natural, quer como preparado de plantas” (OMS, 1991
apud ELDIM; DUNFORD, 2001).
Desde o início da civilização, o homem faz uso das plantas pela necessidade de
sobrevivência, levando-o à descoberta de possíveis aplicações terapêuticas de determinadas
espécies (MATOS, 1999). Entende-se por planta medicinal qualquer vegetal produtor de
drogas ou de substâncias bio-ativas utilizadas, direta ou indiretamente, como medicamento
(BRAGANÇA, 1996). Segundo Matos (1999), uma planta é considerada medicinal quando,
através da experimentação científica, tiver validado suas ações farmacológicas e, portanto,
possa ser usada na terapêutica ou como matéria-prima para a fabricação de medicamento
fitoterápico.
Revisão da Literatura
35
O Brasil possui a maior biodiversidade vegetal do mundo, em torno de 55.000
espécies de um total mundial estimado de 350.000 a 550.000, estando o nordeste entre as
regiões que apresentam uma grande diversidade de plantas, característica que quando somada
às particularidades sócio-econômicas da região se constituem em fatores responsáveis pela
tradição do uso de plantas medicinais. Apesar da riqueza da flora brasileira, com cerca de 55
mil espécies vegetais catalogadas, dentre as espécies, 10 mil podem ser medicinais,
aromáticas ou úteis (FERREIRA, 1998). Tem crescido gradualmente e de forma significativa
no Brasil nos últimos anos, o uso das plantas no meio urbano como alternativa e complemento
aos medicamentos no tratamento de algumas doenças, isso se deve, principalmente, às
terapias naturais, através do uso de compostos de plantas com finalidades farmacêuticas.
Além disso, a crise econômica, o alto custo dos medicamentos industrializados, o difícil
acesso da população à assistência médica e farmacêutica e os efeitos colaterais causados pelos
fármacos sintéticos, são alguns dos fatores que têm contribuído para a utilização de tal recurso
através da medicina popular, mesmo em camadas sociais que até então não a empregavam
(SIMÕES, 2000).
Estima-se que 60% dos brasileiros recorrem às plantas medicinais, principalmente
por falta de recursos. O Brasil está em sétimo lugar no mercado mundial de produtos
farmacêuticos, entretanto, 60% dos remédios são consumidos por apenas 23% da população
(VAITSMAN, 1995). Nos países subdesenvolvidos e em desenvolvimento, onde persistem os
grandes bolsões de pobreza, os fitoterápicos representam uma opção terapêutica ou
complementar ao tratamento convencional. Além disso, ampliam o número de benefícios de
programas de saúde, bem como diminuem os custos operacionais dos medicamentos
alopáticos. As análises experimentais são fundamentais, principalmente, porque muitas
plantas, embora venham sendo utilizadas comumente, podem provocar reações tóxicas ao
Revisão da Literatura
36
organismo, seja pelo seu uso incorreto quanto à denominação da planta ou pela dosagem
inadequada (BONFIM, 2001).
A relevância social das plantas medicinais foi abordada pela Organização Mundial
de Saúde – OMS, quando publicou uma resolução determinando a criação de um programa
mundial para avaliar as espécies vegetais utilizadas na medicina popular com a finalidade de
estimular sua utilização, conforme Bragança em 1996.
À luz da importância cultural e sócio-econômica das plantas utilizadas como
medicinais pelo povo e diante da necessidade do reconhecimento destas plantas pela ciência
ortodoxa, através da caracterização farmacológica e toxicológica, Bomfim em 2001, elucidou
o exposto através de pesquisa etnofarmacológica realizada na Universidade Federal de
Sergipe. A interação entre o conhecimento popular e o saber científico é altamente vantajosa,
pois contribui, preliminarmente, para: o resgate das informações populares a respeito do uso
das plantas; o cultivo das espécies estudadas e validadas cientificamente, implementação de
hortas comunitárias e de farmácias vivas locais colaborando para a preservação das espécies
nativas.
Numa esfera maior, a descoberta de plantas medicinais e o saber a elas associado
incluem diversos benefícios sociais, tais como: atividades econômicas ligadas ao plantio
(processamento e comercialização), melhores condições de assistência à saúde, benefícios
ambientais com a preservação dos ecossistemas, possibilidade da substituição de fármacos
importados, surgimento de novos modelos para a síntese de fármacos e de ferramentas
farmacológicas, conservação dos recursos genéticos como fonte potencial de fármacos para
Revisão da Literatura
37
doenças ainda desconhecidas e possibilidade de descoberta de novos compostos ativos contra
microrganismos resistentes (ELISABETSKY, 1997).
Serrano (1985) afirmou que vários medicamentos da medicina oficial tiveram suas
bases nas plantas popularmente conhecidas, corroborando com Farnsworth e Soejarto (1985)
relataram que 74% das 119 drogas desenvolvidas a partir de plantas tiveram como guia o uso
destas pela medicina popular.
A coleta dos espécimes vegetais deve levar em conta qual órgão ou parte da planta
adequada: raiz, caule, folha, casca, entrecasca ou a planta inteira. Deve-se considerar o estágio
de desenvolvimento, a época do ano e até mesmo a hora do dia ideal para a coleta. Alguns
cuidados devem ser tomados no sentido de se evitar coletar em plantações situadas próximas
de estradas, rodovias, lavouras que utilizam agrotóxicos e à margem de cursos d’água
contaminados com produtos químicos (MARTINS, 1998).
As propriedades farmacológicas que as ervas medicinais podem oferecer variam
de acordo com a natureza dos compostos químicos – princípios ativos – que as mesmas
apresentam, sendo assim, alguns aspectos devem ser respeitados durante a avaliação das
potencialidades terapêuticas das plantas consideradas como medicinais, partindo, por
exemplo, da seleção adequada do método de extração dos constituintes químicos (CRUZ,
2002). Esses compostos são classificados nos seguintes grupos: óleos essenciais, ácidos
orgânicos, alcalóides, flavonóides, glicosídeos cardioativos, glicosídeos cianogênicos, taninos,
mucilagens e pectinas, compostos fenólicos, antraquinonas, cumarinas, “bitters” ou
medicamentos amargos e saponinas (MARTINS, 1998; ELDIM; DUNFORD, 2001).
Revisão da Literatura
38
A combinação entre as informações populares sobre o uso das plantas medicinais e
os estudos farmacológicos e químicos, permitiu a descoberta de inúmeros fármacos usados
atualmente na clínica odontológica (BARREIRO, 1990). A eficiência de ervas medicinais,
tanto nos cremes como nos colutórios bucais para o tratamento do biofilme dentário, foi
investigada por Willershausen (1994), cujos resultados sugeriram que os ingredientes
herbáceos podem ser empregados como apoio à terapia das doenças periodontais e como
profilaxia de rotina. Desse modo, várias plantas de uso medicinal tiveram suas propriedades
antimicrobianas testadas e atualmente são empregadas como preventivo a algumas infecções,
a exemplo da amina, da camomila, da hortelã, da sálvia, do cravo-da-índia e do juá que se
constituem em alguns fitoterápicos de grande interesse no uso odontológico.
Silva (2001) relatou que na odontologia o uso de plantas medicinais não é tão
restrito e que plantas como romã, pitanga e girassol são utilizadas no serviço público e na
clínica privada há mais de dez anos. Esclareceu que a fitoterapia não é uma terapia
especificamente conduzida para as populações pobres, não sendo uma alternativa, mas uma
conduta clínica criteriosa pela qual o profissional opta por ser eficaz, por provocar efeitos
colaterais mínimos e por estar ao alcance de todos.
Swerts et al. (2002) expõem a atividade da própolis contra patógenos bucais,
principalmente sua ação antibacteriana in vitro contra as bactérias cariogênicas entre elas os
Streptococcus mutans. O potencial terapêutico da própolis varia de acordo com a ecoflora da
coleta, com gênero da abelha coletora e com a forma de preparo. A própolis nos estudos in
vitro foi eficaz na inibição de bactérias cariogênicas e patógenos periodontais.
Revisão da Literatura
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Sato et al. (1998) e Takahashi et al. (2003) afirmaram que o uso da mastigação
lenta de goma de mascar com extrato de eucalipto mostrou reduzir o número de bactérias da
saliva, índice de biofilme e índice gengival. Sugeriram que a eficiência dos métodos de
higiene oral tradicional pode ser devida, em parte, aos componentes antimicrobianos extraídos
de plantas presentes nos produtos.
Carvalho (1999) e Cruz (2002) num levantamento etnofarmacológico no semiárido de Sergipe, citaram uma variedade de plantas utilizadas para diversos fins. Dentre as
quais, Cruz (2002) mencionou o potencial antimicrobiano de algumas delas, a exemplo da
cabaceira (Lagenaria vulgaris Ser.); da sacatinga (Croton argirophyloides Mull.), do juazeiro
(Ziziphus joazeiro Mart.), da quixabeira (Bumelia sartorum Mart.), do jatobá (Hymneaea
courbaril L.), da catingueira (Caesalpínia pyramidalis Tull.) e do sambacaitá (Hyptis
pectinata (L.) Poit.).
O estudo conduzido por Carvalho (1999), no povoado de Curituba (SE), a respeito
das plantas medicinais da caatinga, correlaciona aspectos sociais, culturais e farmacológicos
sobre a fitoterapia na região. Identificou 44 espécies como fitoterápicos classificados de
acordo com os critérios de atividade biológica. Uma das mais freqüentes utilizações
encontrada na comunidade foi o uso dermatológico como anti-séptico e cicatrizante, que
justifica pela própria característica da flora da caatinga, que apresenta adaptações, entre as
quais, a presença de espinhos. Quanto às formas de preparo, registraram-se dez técnicas:
infusão, decocção, alcoolaturas, xarope ou lambedor, garrafadas, compressas, banhos,
cataplasmas, tintura e ungüento, além do uso na dieta e bochechos. O sambacaitá foi uma das
plantas mais conhecidas e utilizadas, tendo indicação popular para os diversos tipos de
inflamação, sob a forma de chás e bochechos.
Revisão da Literatura
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2.3.1-Hyptis pectinata (L.) POIT.: Matéria Prima Vegetal.
O gênero Hyptis pertencente à família Lamiaceae, possui mais de quarenta
espécies espalhadas pela América, oeste africano, oeste indiano, ilhas Fiji (Oceania) e
nordeste brasileiro (PIETSCHMANN et al., 1998). Hyptis pectinata (L). Poit. (Lamiaceae) é
uma espécie aromática, em Sergipe e Alagoas essa planta ocorre naturalmente de forma
selvagem em campos, matas e estradas e em volta de residências, conhecida popularmente
como sambacaitá ou canudinho sendo vastamente utilizada para problemas gastrintestinais. É
um arbusto perene com galhos eretos, e baixa densidade foliar (BISPO et al., 2001).
A utilização dessa planta limita-se ao uso popular, sendo comum sua presença em
hortas e jardins, porém o extrativismo é a forma usual de obtenção, o que na maioria das
vezes, tem acarretado em perdas mesmo antes de serem estudadas. O seu uso mais freqüente é
a ingestão na forma de chás (decocções ou infusões) e bochechos, sendo considerada um
antiinflamatório natural (CARVALHO, 1999).
A medicina popular usa a parte aérea da Hyptis pectinata para tratamento de
infecções no aparelho respiratório, congestão nasal e algumas manchas de pele. As principais
aplicações são como: bactericida, antimicótico e antiviral (MALAN et al., 1988). O extrato
aquoso da planta mostrou efeito antinociceptivo e antiedematogênico, com redução dos
sintomas em até 54% quando aplicado na dosagem de 400mg/kg, validando o uso popular da
espécie (BISPO et al., 2001).
Pereda-Miranda et al. (1993) mensuraram a atividade antimicrobiana da Hyptis
pectinata, a partir do extrato bruto e de seus componentes, através do teste de difusão em
Revisão da Literatura
41
ágar. Observaram que o pectinolide A, um componente encontrado em grande quantidade na
Hyptis pectinata, tinha a maior atividade antimicrobiana entre todos os outros componentes,
além de mostrar uma significante atividade contra bactérias Gram-positivas e uma grande
sensibilidade contra Staphylococcus aureus e Bacillus subtilis.
Melo Júnior et al. (2000) selecionaram plantas, a partir de um estudo etnobotânico
e quimiossistemático, visando encontrar espécies com ação antimicrobiana sobre
microrganismo presente na alveolite. Verificaram que a Hyptis pectinata foi eficaz contra o
Enterococcus Grupo D e o Streptococcus viridans.
Bispo et al. (2001) realizaram o isolamento e identificação dos constituintes fixos
e voláteis da Hyptis pectinata, além da avaliação da atividade dos extratos aquosos e
metanólicos. A espécie estudada foi coletada na farmácia viva do Parque da Sementeira, em
Aracaju-SE, sendo transformada em extrato e óleo essencial. A partir do óleo essencial foi
possível identificar os componentes, num número de 33, tendo como principais o βcariofileno, o ∆-cadineno e o β-selineno. Demonstraram que o extrato aquoso da Hyptis
pectinata teve efeito antinociceptivo e antiedematogênico, com dose de até 5mg/kg não
apresentando ser letal, fato que sugere baixa toxidade do extrato.
A Universidade Federal de Sergipe através do Departamento de Engenharia
Agronômica vem aprofundando estudos na tentativa da domesticação dessa espécie, uma vez
que muito pouco se conhece de suas características agronômicas. O cultivo de plantas
medicinais é considerado uma das etapas que mais pode interferir na produção de um
fitoterápico, tanto do ponto de vista quantitativo como qualitativo. Estudos sobre os
constituintes químicos e atividades farmacológicas do óleo essencial são necessários para a
Revisão da Literatura
42
seleção de genótipos, que agronomicamente demonstrem potencialidades que serão aliadas
aos conhecimentos fitoterápicos. Experimentos realizados por Silva-Mann et al. (2003),
avaliando o teor de óleo essencial, não demonstraram diferença significativa entre os vários
genótipos testados. Verificaram os constituintes químicos do óleo essencial extraído em
diferentes épocas de corte, visando à identificação de princípios ativos que possam sofrer
variações diante das diferentes épocas de colheita. Tais informações contribuíram para
avaliação diante das mudanças sazonais e para definição da melhor época de colheita.
Fragoso-Serrano, Gibbons e Pereda-Miranda (2005) avaliaram a atividade
antibacteriana da Hyptis pectinata contra Staphylococcus aureus comparando essa atividade
com medicamentos clínicos padrões. Correlacionaram poderosa propriedade contra cepas de
linhagens resistentes aos medicamentos tradicionalmente potentes.
2.4 ÓLEOS ESSENCIAIS: ATIVIDADE ANTIMICROBIANA.
Os óleos essenciais são metabólitos orgânicos de origem vegetal, com
características voláteis, refringentes, lipossolúveis, geralmente aromáticos, de odor
característico, composição heterogênea, extraídos de vegetais ou de parte deles por
arrastamento com vapor d’água. Podem estar presentes em um só órgão vegetal ou em toda a
planta, onde atuam atraindo insetos polinizadores, regulando a transpiração e intervindo como
hormônio na polinização (MARTINS, 1998). Tais produtos naturais são responsáveis por
grande movimentação econômica, sendo utilizados em diversos setores industriais: alimentos,
cosméticos e farmacêuticos (MANCINI; HANAI, 1991).
Revisão da Literatura
43
A ISO (International Standard Organization) definiu óleos voláteis como os
produtos obtidos de plantas através de destilação por arraste com vapor d’água, bem como os
obtidos por prensagem - método empregado para extração de óleos vegetais de frutos cítricos
(SIMÕES, 2000).
Óleos e extratos de plantas têm sido usados de uma diversidade de formas e
propósitos há milhões de anos. Esses propósitos variam desde o uso em perfumaria à essência
de bebidas, incluindo a preservação de comida crua e processada, na farmacêutica e terapias
alternativas médicas e naturais (MISHRA; DUBEY, 1994; JONES, 1996; LIS-BALCHIN;
DEANS, 1997).
Historicamente, óleos e extratos de plantas têm sido citados por suas atividades
antimicrobianas e uso como anti-sépticos tópicos. É de grande importância investigar
cientificamente as plantas utilizadas na medicina tradicional como fontes de novos
componentes antimicrobianos (MITSCHER et al., 1987).
Martins (1998) relatou algumas propriedades a cerca dos óleos essenciais,
destacando as seguintes: antiviral, antiespasmódica, analgésica, bactericida, cicatrizante,
expectorante, relaxante, anti-séptica das vias respiratórias, vermífuga e antiinflamatória. No
entanto, Simões (2000) advertiu que altas doses ocasionam efeito abortivo e irritante no trato
gastrintestinal. O que pode desencadear náuseas, vômitos, diarréias e intoxicações graves
levando ao colapso respiratório.
Mudança na composição de um óleo essencial pode influenciar na sua atividade
antimicrobiana, para isso, os seguintes fatores devem ser considerados: a fonte botânica
Revisão da Literatura
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(alguns óleos comerciais são procedentes de diferentes espécies), a proveniência do material
da planta, o tempo de colheita, se o material é fresco ou seco e a técnica de extração
(JANSSEN; SCHEFFER; BAERHEIM SVENDSEN, 1987).
Os óleos essenciais têm uma composição química complexa, apresentando
algumas centenas de constituintes, especialmente, hidrocarbonetos e substâncias terpênicas
oxigenadas (álcoois, aldeídos, cetonas, ácidos, fenóis, óxidos, lactonas, éteres e ésteres).
Assim, é muito importante que a proporção natural das substâncias seja mantida durante a
extração dos óleos essenciais das plantas por algum procedimento. Os métodos mais comuns
para a extração de óleos essenciais são hidrodestilação, arraste a vapor, extração por solvente
e a extração por fluído supercrítico. É importante que o método de extração mantenha as
características naturais do óleo preservando-o da degradação térmica, hidrólise e
contaminação por solvente (LACERDA, 1999).
De acordo com Carson, Hammer e Riley (1995), a eficácia antimicrobiana de um
óleo essencial ou de seus componentes é, geralmente, descrita como concentração inibitória
mínima (CIM), que é a concentração mais baixa capaz de inibir o crescimento de um
microrganismo.
Janssen, Scheffer e Baerheim Svendsen (1987) realizaram uma revisão literária
sobre a atividade antimicrobiana dos óleos essenciais durante a década de 1976 a 1986, com
enfoque nos métodos utilizados para testar os óleos. Classificaram as técnicas de acordo com
a necessidade ou não de dispersão homogênea em água. Uma técnica que não requer a
dispersão homogênea em água é a técnica em ágar, que utiliza: discos, furos ou cilindros
como reservatório, ou ainda, discos como fonte de vapor. As técnicas que requerem uma
Revisão da Literatura
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dispersão homogênea em água são chamadas de técnicas de diluição e são usadas para
determinar: CIM ou CBM (concentração bactericida mínima), curvas de crescimento,
propriedades inibitórias de crescimento, o período anterior ao crescimento fúngico e atividade
anti-séptica. Em estudos recentes sobre a técnica em ágar, a influência do teor de ágar na
solubilidade de alguns constituintes do óleo foi estabelecida. O alto teor de ágar e a baixa
solubilidade geraram uma das menores zonas de inibição. Os valores de CIM podem ser
determinados tanto em meio líquido quanto em meio sólido e a turbidez do meio é tida como
a indicação de densidade bacteriana. O direto envolvimento de um organismo teste é um
importante fator na determinação da atividade antimicrobiana da substância. Os constituintes
do meio podem reagir com os componentes do óleo, ativando ou inativando-os.
Todos os óleos essenciais têm uma solubilidade limitada em meio aquoso. O
Tween 20 ou 80 (0.5 - 20%) ou outros detergentes convenientes foram usados para promover
a distribuição do óleo em meio aquoso sem destruir os efeitos antimicrobianos (CARSON;
RILEY, 1993).
Dada a natureza volátil dos óleos essenciais e solventes, o possível efeito de
transferência da fase de vapor entre os poços nas placas de micro-titulação seladas, deve ser
considerado. Além do mais, é necessário estabelecer se a adição direta do solvente não exerce
nenhum efeito antibacteriano (SHAPIRO; MEIER; GUGGENHEIM, 1994).
Para Carson, Hammer e Riley (1995), os testes de difusão, nos quais o agente é
aplicado a um poço ou no centro de um disco de papel em uma placa com ágar semeada com
os microrganismos testes, são inadequados para testar óleos essenciais, uma vez que seus
componentes não são miscíveis em água. Afirmaram ainda que, quando antimicrobianos não
Revisão da Literatura
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solúveis em água são testados, assim como os óleos essenciais, se faz necessária a aplicação
de um emulsificante ou solvente no meio testado para garantir contato entre o microrganismo
teste e o agente durante o experimento. Os agentes mais utilizados são o Tween 80, Tween 20,
etanol e DMSO (dimetil sulfóxido). Alguns agentes, entretanto, podem causar mudanças nas
propriedades físico-químicas do sistema testado, resultando em aumento ou redução da
atividade antimicrobiana. O agente emulsificante (Tween 80) é usado em experimentos
porque não interfere com as propriedades antimicrobianas do óleo essencial.
Hammer, Carson e Riley (1996) determinaram a susceptibilidade de uma
variedade de microrganismos transientes e comensais da pele ao óleo essencial de Melaleuca
alternifolia. O método de micro-diluição em caldo foi utilizado para determinar o CIM e a
Concentração Bactericida Mínima (CBM) do óleo essencial, e o Tween 80 (na concentração
de 0.001%) foi adicionado ao meio para possibilitar a solubilidade do óleo. Concluíram, com
relação aos microrganismos Gram-negativos, que o valor da CIM geralmente corresponde ao
valor da CBM, e isto pode ser um indicativo de efeito bactericida. Em contra partida,
microrganismos Gram-positivos possuem uma larga diferença entre os valores do CIM e
CBM sugerindo que o óleo essencial de Melaleuca alternifolia pode exercer um efeito
bacteriostático sobre estes microrganismos.
Smith e Navilliat (1997) descreveram um novo protocolo para os testes de
antimicrobianos tópicos de óleos essenciais não comercializados oficialmente, através de
modificações nas regras propostas pela Food and Drug Administration (FDA), para drogas
antimicrobianas tópicas. A FDA propõe que as formulações finais de anti-sépticos solúveis
e/ou miscíveis em água sejam bactericidas e/ou bacteriostáticas. Este novo método, para teste
de óleos essenciais insolúveis em água usando um solvente não tóxico, promoveu um
Revisão da Literatura
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mecanismo com capacidade de reconhecimento geral da eficácia das drogas anti-sépticas com
base em óleos essenciais, estando em acordo com a FDA.
Existe um considerável interesse pelo desenvolvimento de métodos confiáveis para
avaliação e comparação de propriedades antimicrobianas de várias misturas com óleos, bem
como, criação e reprodução de uma formulação que otimize sua reprodutibilidade, sendo
assim exigido, dos métodos atuais, uma maior confiança no uso do Tween na determinação do
CIM dos óleos essenciais (MANN; MARKHAM, 1998).
Souza et al. (1998) investigaram o óleo essencial da flor de Egletes viscosa L. com
relação aos seus efeitos antinociceptivos e anticonvulsivantes em camundongos e a sua
eficácia antibacteriana contra Staphylacoccus aureus, in vitro. Observaram que o óleo
mostrou boa atividade antibactariana contra cepas resistentes de Staphylococcus aureus a um
CIM entre 0,625 e 2,5 mL/mL.
Mann e Markham (1998) desenvolveraram um método de micro-diluição em caldo
conveniente para determinar a atividade antimicrobiana dos óleos essenciais usando um
estabilizador químico e microbiologicamente inerte (corante resazurina), que é um indicador
capaz de demonstrar com segurança o CIM, tanto visualmente como instrumentalmente.
Verificaram numa leitura visual e fotométrica que as placas de micro-titulação apresentavam
resultados que poderiam ser avaliados sem instrumentação. A precisão do método da
resazurina foi confirmada pelos valores da CIM em placas de micro-poços e comparados com
os resultados obtidos pelo método de diluição em ágar. Concluíram que os valores para os
CIM obtidos pelo método da resazurina foram levemente menores que os valores obtidos pelo
método de diluição em ágar, indicando que o primeiro método é mais sensível.
Revisão da Literatura
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As folhas de Hyptis suaveolens são usadas na medicina tradicional como agente
anticancerígeno, como contraceptivo (em mulheres), para o tratamento de cólicas, dores
estomacais e febre. Asekun, Ekundayo e Adeniyi (1999) estudaram as atividades
antibacteriana e antifúngica do óleo essencial das folhas de Hypis suaveolens diluído em
DMSO através do método disco difusão. Os resultados mostraram significante atividade
inibitória contra duas bactérias Gram-positivas, quatro Gram-negativas e também grande
atividade contra Candida albicans.
Hammer, Carson e Riley (1999) testararam um largo número de óleos essenciais e
extratos de plantas contra diversos tipos de microrganismos abrangendo Gram-positivos,
Gram-negativos e um fungo. Utilizaram o método de diluição (v/v) tanto em ágar, como o de
micro-diluição em caldo, para obtenção da CIM. Os resultados foram comparados às CIMs
obtidas em ágar e em caldo onde as diferenças mostraram-se demasiadas, sendo a maior
diferença para a Candida albicans, com óleo essencial de Santalum álbum. Concluíram que
muitos óleos essenciais e extratos de plantas possuem atividade antibacteriana e antifúngica in
vitro, porém, o seu uso na preservação de comidas e em propósitos medicinais requerem mais
estudos.
As substâncias naturais têm atraído a atenção dos consumidores pela sua
segurança, por isso estudos científicos sobre óleos foram realizados com a finalidade de se
conhecer ainda mais sobre as suas utilidades. Uma das teorias sobre os mecanismos de ação
dos óleos é a de que a ação dos terpenos lipofolícos, presentes nos óleos, sobre os
fosfolípidios da membrana celular das bactérias poderia destruir sua estrutura e função (COX;
MANN; MARKHAM, 2000).
Revisão da Literatura
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Em 2000, Christoph, Kaulfers e Stahl-Biskup compararam a atividade
antimicrobiana e antifúngica dos óleos de tea tree, óleo cajuput, óleo niaouli, óleo kanuka e
óleo manuka in vitro. As CIMs encontradas para dezesseis diferentes microrganismos foram
determinadas aplicando o método macro-diluição em caldo. A atividade antimicrobiana e
antifúngica do óleo australiano de tea tree (TTO) avaliada, mostrou-se melhor entre todos os
óleos testados. O melhor efeito inibitório sobre bactérias Gram-positivas e dermatotipos foi
atribuído ao óleo de manuka, devido ao componente β-triketones presente na sua composição
química.
A atividade antibacteriana do óleo essencial de Chrysanthemum viscidehirtum foi
estudada por Khallouki et al. (2000) através do método de diluição em ágar, sendo testada
contra uma linhagem de 21 micróbios, onde o óleo exibiu atividade antimicrobiana contra
todas as cepas, sendo a Salmonella typhi e Proteus mirabilis as bactérias mais sensíveis.
Takaisi-Kikuni, Tshilanda e Babady (2000) através do método de macro-diluição
com caldo de Mueller-Hinton, analisaram a atividade antimicrobiana do óleo essencial de
Cymbopogon densiflorus. Verificaram que o óleo exibia atividade contra a maioria das
bactérias testadas, sendo as Gram-positivas mais sensíveis que as Gram-negativas. A CIM
(concentração inibitória mínima) encontrada ficou entre 250 e 500 ppm para Gram-positivas e
entre 500 e 1000 ppm para bactérias Gram-negativas. Estes resultados podem justificar o uso
da Cymbopogon densiflorus na medicina tradicional, onde são utilizadas no tratamento da
asma, febre, frieira, epilepsia, cãibras abdominais e dor em geral.
Azevedo et al. (2001) estudaram a variabilidade química no óleo essencial de
Hyptis suaveolens. Os óleos essenciais de Hyptis suaveolens coletados de onze localidades do
Revisão da Literatura
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cerrado brasileiro foram investigados pelo método GC-MS. Observaram que os padrões de
variação geográfica, na composição do óleo essencial, indicaram que os componentes foram
produzidos principalmente em amostras que cresceram em baixas latitudes.
Num estudo sobre atividade antibacteriana, através do método de difusão em disco
Haznedaroglu, Karabay e Zeybek (2001) observaram que o óleo essencial de Salvia
tomentosa inibia notavelmente o crescimento de bactérias Gram-positivas e Gram-negativas
com exceção da Pseudomonas aeruginosa. Ressaltaram o uso dos óleos essenciais na
medicina tradicional no tratamento de laringite, faringite, estomatite, gengivite e glossite.
Canillac e Mourey (2001) investigararam o comportamento de várias bactérias
patogênicas isoladas de produtos alimentícios na presença do óleo essencial de Picea excelsa.
A atividade antibacteriana deste óleo foi testada através do método de diluição contra as
seguintes bactérias: Listeria, Staphylococcus aureus e bactérias coliformes. Concluíram que
uma técnica simplificada pode fornecer bons resultados na determinação da atividade
bactericida contra a Listeria.
Lambert et al. (2001) determinaram a CIM do óleo essencial de orégano e de dois
de seus componentes principais, timol e carvacrol, contra Pseudomonas aeruginosa e
Staphylococcus aureus usando uma técnica inovadora. Esta consistia numa análise
matemática específica de observação do perfil de inibição de todos os componentes,
sugerindo que misturas de carvacrol e timol fornecem um efeito aditivo e que toda inibição do
óleo essencial de orégano foi atribuída principalmente a uma ação antimicrobiana desses dois
componentes. Este conhecimento ajudou a entender a eficácia desses óleos com respeito à
variação de composição de cada tipo de planta, localização geográfica e tempo do ano.
Revisão da Literatura
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A composição química do constituinte volátil da flor de Thymus revolutus Celak,
uma planta endêmica da Turquia, foi analisada por Karaman et al. (2001). Vinte e dois
componentes foram identificados, e o carvacrol foi encontrado como o componente
predominante no óleo. Além disso, o óleo essencial foi testado contra onze bactérias e quatro
fungos em diferentes concentrações. Os resultados mostraram que o óleo exibe atividade
antifúngica e antibacteriana significantes.
A investigação da atividade antibacteriana do óleo essencial de folhas de
Cinnamomum osmophloeum e de seus constituintes químicos, utilizou nove linhagens de
bactérias. Os resultados demonstraram que os óleos da folha do Cinnamomum osmophloeum
indígena tinham um excelente efeito inibitório. Estes dados sugerem que o óleo da folha da
Cinnamomum osmophloeum é benéfico à saúde humana, com grande potencial em finalidades
médicas (CHANG, S. -T; CHEN; CHANG, S. -C, 2001).
Em 2002, Rasooli e Mirmostafa testaram a atividade antibacteriana dos óleos
essenciais de Thymus pubescens e Thymus serpyllum através do método de difusão em disco.
Os óleos mostraram-se fortemente bactericidas mesmo em altas diluições contra as bactérias
Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis e Klebsiella pneumoniae com
exceção da bactéria Pseudomonas aeroginosa, que mostrou uma reação estática ao óleo de
Thymus pubescens e uma resistência ao óleo de Thymus serpyllum. Ressaltaram ainda que,
estes óleos possuem propriedades espasmódicas, anti-sépticas e expectorantes. As espécies de
plantas, os quimiotipos e as condições climáticas podem interferir na composição dos óleos
essenciais, concluindo que os óleos essenciais testados podem ser usados no combate a certos
tipos de patógenos.
Revisão da Literatura
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Shafi et al. (2002a) testaram a atividade antimicrobiana dos óleos essenciais de
Syzygium cumini e Syzygium travancoricum pelo método de difusão em disco, onde
perceberam que os óleos mostraram uma considerável atividade antimicrobiana,
especialmente contra Salmonella typhimurium. Relataram que o Syzygium cumini tem sido
usado com sucesso no tratamento da disenteria, inflamação e do diabetes mellitus.
Utilizando o método de difusão em disco, Shafi et al. (2002b) analisaram o óleo
essencial de Aristolochia indica, onde observaram uma atividade antimicrobiana moderada
deste óleo contra os seis microrganismos. Relataram o uso tradicional do óleo essencial de
Aristolochia indica contra verminoses intestinais, inflamações, cólera, diversos tipos de
picadas venenosas e como sedativo suave.
Juteau et al. (2002) estudaram a atividade antibacteriana e antifúngica do óleo
essencial de Artemisia annua, através do método de difusão líquida, e observaram que o óleo
inibia o crescimento de Enterococcus hirae e de fungos. Esta planta é conhecida por suas
atividades antiinflamatórias e anticancerígenas.
Azevedo et al. (2002) pesquisaram quimiotipos de óleos essenciais da Hyptis
suaveolens provenientes do cerrado brasileiro. A composição de nove amostras de óleo
essencial em plantas em estágio frutífero de Hyptis suaveolens foi analisada. Os padrões de
variação geográfica na composição do óleo essencial indicaram que os componentes são
produzidos principalmente em amostras que cresceram em baixas latitudes e longitudes.
Cimanga et al. (2002) selecionaram quinze espécies de plantas aromáticas e
investigaram a composição química dos óleos essenciais e suas supostas atividades
Revisão da Literatura
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antibacterianas in vitro contra onze bactérias, através do método de disco difusão.
Justificaram o uso destas plantas medicinais como remédios tradicionais para o tratamento de
algumas infecções.
Opalchenova e Obreshkova (2003) investigaram a atividade do óleo essencial de
Ocimum basilicum contra as linhagens de bactérias do gênero Staphylococcus, Enterococcus e
Pseudomonas utilizando o método de macro-diluição em caldo para a determinação da CIM.
Compararam os resultados obtidos de concentrações inibitórias com algumas modificações do
método, assim como através da mudança do meio, do tempo de cultivo e do uso de outros
diluentes no lugar do caldo. Os dados obtidos depois da aplicação de diferentes métodos de
investigação e validados com membrana de filtração, mostraram um forte efeito inibitório do
óleo de Ocimum basilicum contra as bactérias testadas. As bactérias tinham um alto nível de
resistência e por isso os resultados foram considerados encorajadores.
Em 2003, Basim E. e Basim H. utilizaram os métodos de disco difusão e efeito
volátil para estudar a atividade antibacteriana do óleo essencial de Rosa damascena, já
conhecida por suas propriedades: analgésica, antidepressiva, antiinflamatória, diurética e
cosmética. O óleo essencial pode ser um potencial agente controle no tratamento da doença
causada por Xanthomonas axonopodis vesicatoria em tomates, uma vez que este óleo inibiu
notavelmente o crescimento desta bactéria.
Malele et al. (2003) estudaram a composição química do óleo de Hyptis
suaveolens oriunda da Tanzânia, bem como testaram sua potencial atividade antifúngica e
concluíram que este óleo é um excelente antifúngico.
Revisão da Literatura
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De acordo com Hood, Wilkinson e Cavanagh (2003), o uso dos óleos essenciais
como agentes terapêuticos tem se tornado comum popularmente. Entretanto, as pesquisas
sobre a atividade antimicrobiana desses produtos têm sido dificultadas pela ausência de
métodos padronizados, fazendo com que a comparação direta entre os estudos seja
praticamente impossível. Foram avaliados os testes antimicrobianos dos óleos essenciais mais
citados na literatura e estimados por sua confiabilidade e habilidade. Os métodos testados
foram: difusão em discos e poços, diluição em ágar e caldo. Os quais se apresentaram
inseguros e produziram resultados inconsistentes, em conseqüência da dificuldade de
obtenção de uma solução estável dos óleos essenciais em meio aquoso, da difusão dos
constituintes lipofílicos neste meio, e da variação de métodos para determinar o número de
bactérias remanescentes viáveis após a adição do óleo. Um método de diluição em caldo
otimizado, usando 0.02% de Tween 80 para emulsificar os óleos, foi desenvolvido e mostrou
ser o método mais seguro para testar a atividade antimicrobiana de óleos essenciais viscosos e
hidrofóbicos. A concentração de Tween 80 usada neste estudo foi a menor relatada na
literatura.
Bassole et al. (2003) estudaram a composição química dos óleos essenciais de
Lippia chevalieri e Lippia multiflora obtidas por hidrodestilação de folhas secas que são
tradicionalmente usados no tratamento da malária, hipertensão, diarréia e como anti-séptico
oral. Os óleos solubilizados em Tween 80 foram testados contra nove linhagens usando o
método de micro-diluição em caldo. Observaram que as bactérias Gram-negativas foram mais
sensíveis e que o óleo de Lippia multiflora foi o mais ativo.
Baydar et al., em 2004, utilizaram uma variedade de patógenos potenciais e outras
bactérias na avaliação da atividade antibacteriana dos óleos extraídos de plantas pertencentes
Revisão da Literatura
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à espécie Lamiaceae, incluindo Origanum minutiflorum, Origanum onites, Thymbra spicata e
Satureja cuneifólia através do teste de difusão em disco de papel e relacionaram com sua
composição química. Confirmaram o uso desses óleos essenciais em alimentos para prevenir
o crescimento de bactérias e aumentar o tempo de armazenamento dos alimentos processados.
Em 2004, Setzer et al. descreveram o uso da folha da Artemisia douglasiana para
o tratamento profilático de infecções crônicas de bexiga em um jovem paraplégico e
apresentaram a análise química, além da atividade antimicrobiana do óleo essencial desta
planta. O óleo essencial mostrou atividade antimicrobiana in vitro limitada, o que torna
incerta a sua atividade in vivo.
Nostro et al. (2004) avaliaram a susceptibilidade de Staphylococcus isolados e
completamente caracterizados como susceptíveis a meticilina (MSS) ou Staphylococcusmeticilina-resistente (MRS), ao óleo de orégano, ao carvacrol e ao thymol. Como a
resistência à meticilina é freqüentemente acompanhada pela resistência a outros agentes
antimicrobianos, o perfil de susceptibilidade de Staphylococcus resistentes a meticilina frente
a vários agentes quimioterápicos foi também avaliado. Indicaram que, em adição a outras
propriedades, o óleo de orégano é um potencial agente antibacteriano tópico contra espécies
Staphylococcus-meticilina-resistentes (MRS).
Benkeblia (2004) estudou o efeito dos óleos essenciais, extraídos de vários tipos de
cebolas e alhos, em dois patógenos bacterianos e três espécies de fungos através do teste de
difusão em disco. Observou que os óleos essenciais de alho e cebola podem ser utilizados
como um antimicrobiano natural pela sua incorporação em vários produtos alimentícios.
Revisão da Literatura
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Sokmen et al. (2004) investigaram a composição química bem como determinaram
a atividade antioxidante e antimicrobiana do óleo essencial e do extrato hidrodestilado de
Thymus spathulifolius. Sugeriram que o óleo essencial e o extrato de Thymus spathulifolius
possuem propriedade antimicrobiana e antioxidante, e também, podem ser usados como um
conservante natural nas indústrias alimentícia e farmacêutica.
Bruni et al. (2004) determinaram a composição química do óleo essencial da flor
Ocotea quixos e proveram o primeiro relato sobre suas propriedades antioxidante,
antibacteriana e antifúngica, in vitro. Concluiram que a atividade do óleo contra o
fitopatógeno testado pode também abrir a possibilidade do seu uso como um constituinte de
fito-complexo para culturas agrobiológicas. Comercialmente, o principal inconveniente destas
especiarias, reside em sua produção escassa e localizada. A sustentabilidade ecológica de sua
colheita, entretanto, sugere sua exploração como um valioso produto de reserva proveniente
do nordeste da Amazônia.
2.5 ÓLEOS ESSENCIAIS NOS REGIMENTOS DE SAÚDE ORAL.
The Lancet, jornal Britânico (1929 apud FINE et al., 2000), publicou um relato
independente a respeito de uma avaliação de bochechos contendo óleos essenciais, os quais
demonstraram ter atividade bactericida significante contra uma variedade de microrganismos
e concluiu que os óleos são tanto seguros quanto efetivos.
Revisão da Literatura
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Óleos essenciais, misturas complexas de componentes orgânicos representados
pelos princípios odoríferos das plantas, são usados há milhares de anos no controle da dor e
odor bucal, e desde o século XIX, na terapia de canais radiculares, restaurações temporárias e
tratamento periodontal (MEEKER; LINKE, 1988).
Apesar de seu largo uso em higiene oral e dentisteria, a quantidade de dados sobre
a atividade dos óleos essenciais ou componentes desses óleos em microrganismos sub e
supragengivais é pequena, e a maioria dos dados disponível é relativa a um microrganismo em
particular, o Streptococcus mutans (SAEKI et al., 1989).
A eficácia de um bochecho antimicrobiano, contendo óleo essencial, no controle
do biofilme supragengival e gengivite foi demonstrada em estudos clínicos de curta e longa
duração (ROSS; CHARLES; DILLS, 1989; OVERHOLSER et al., 1990). O mecanismo
primário da atividade clínica dos bochechos é geralmente o fato dele ser bactericida. Algumas
considerações do mecanismo de ação dos bochechos in vivo, devem ser conduzidas no
contexto do atual entendimento da natureza do biofilme (PAN et al., 2000).
Os efeitos do uso durante seis meses de um bochecho de óleo essencial, não
mostraram alteração na composição bacteriana do biofilme supragengival ou emergência de
patógenos oportunistas. As bactérias permaneceram susceptíveis a este óleo essencial
(OVERHLSER et al., 1990). A capacidade dos enxaguatórios antimicrobianos em reduzir os
níveis de microrganismos cariogênicos fornece uma razão adicional para seu uso no
regimento diário de higiene oral (FINE et al., 2000).
Revisão da Literatura
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Botelho e Soares (1994) utilizaram o óleo essencial do alecrim-pimenta contra
cepas bacterianas do Streptococcus mutans e lactobacilos isolados a partir da saliva e do
biofilme bacteriano de crianças que apresentavam um alto risco à cárie. Concluiram que o
óleo essencial desta planta é detentor de uma considerável atividade contra tais bactérias.
Acrescentaram ainda, o prosseguimento de estudos para elucidar o mecanismo de ação do
princípio ativo do óleo que promoveu a inibição do crescimento das bactérias com evidente
papel acidogênico e acidúrico no biofilme bacteriano.
Shapiro, Meier e Guggenheim (1994) avaliaram a atividade antimicrobiana de
alguns óleos botânicos e sua reprodutibilidade. Determinaram a CIM e a CBM em relação a
bactérias orais anaeróbias facultativas e fastidiosas. Examinaram as propriedades
antimicrobianas do óleo essencial de tea tree, óleo de pimenta (perppermint) e óleo de salva
(sage), usando o método de mensuração de densidade óptica em placas de micro-titulação. Os
três óleos mostraram propriedades inibitórias contra todas as linhagens de anaeróbias
obrigatórias testadas. Já entre os componentes dos óleos essenciais, os mais potentes foram o
timol e o eugenol.
Groppo et al. (2002) compararam a atividade antimicrobiana dos óleos essenciais
de Melaleuca alternifolia, Allium sativum e clorexidina, contra microrganismos orais.
Perceberam que os grupos que utilizaram clorexidina e o Allium sativum mostraram atividade
antimicrobiana contra Streptococcus mutans, mas não contra outros microrganismos orais. Já
o grupo da Melaleuca alternifolia mostrou atividade antimicrobiana contra o Streptococcus
mutans e outros microrganismos orais. A manutenção dos níveis de redução de
microrganismos foi observada somente com o óleo de Melaleuca alternifolia e de Allium
sativum durante duas semanas consecutivas. Alguns efeitos adversos foram relatados, como:
Revisão da Literatura
59
sabor desagradável, sensação de queimor, mau hálito e náusea. Concluíram que estes óleos
essenciais podem ser uma boa alternativa na substituição da clorexidina.
Segundo Shapiro, Meier e Guggenheim (1994) e Groppo et al. (2002), existem
evidências científicas que sugerem que óleos essenciais podem ser usados na manutenção da
higiene oral e na prevenção de doenças dentárias. Já, de acordo com Hammer et al. (2003), a
atividade dos óleos essenciais in vitro contra os microrganismos encontrados na cavidade oral
não foi testada extensivamente.
Segundo Pan et al. (1999), apesar de estudos laboratoriais não serem
necessariamente predictivos de atividade clínica, eles podem ajudar a elucidar o mecanismo
da atividade clínica latente. Em estudo clínico, um bochecho de óleo essencial mostrou ser
significantemente mais efetivo que o bochecho contendo fluoreto estanhoso na inibição do
biofilme supragengival.
As bactérias orais estão associadas a muitas doenças sistêmicas como a pneumonia
e doenças cardiovasculares. Por esse motivo, enfatiza-se a necessidade de cuidado oral no
controle sistêmico da saúde (TAKARADA et al., 2004). O óleo essencial de Melaleuca
alternifolia mostrou-se efetivo como uma alternativa nos protocolos para pacientes aidéticos
com candidíase orofarigeana refratária ao fluconasol (JANDOUREK; VAISHAMPAYAN;
VAZQUEZ, 1998). Para Whitaker et al. (2000), usando tratamento in vitro de células
planctônicas, não ficou claro se efeitos similares seriam vistos in vivo, visto que as bactérias
estariam contidas no biofilme dentro de uma bolsa periodontal. No entanto, este estudo provê
evidência adicional de que o enxaguatório de óleo essencial pode ter efeitos não letais em
células microbianas e amplia as descobertas de um estudo anteriormente mencionado por Fine
Revisão da Literatura
60
et al. (1996), que embora o mecanismo predominante da atividade antibiofilme/antigengivite
deste enxaguatório seja microbicida, sua capacidade para afetar atividades associadas com a
superfície da célula pode ter relevância clínica.
Fine et al. (2000) realizaram um estudo com a saliva de adultos com pelos menos
105 CFU de Streptococcus mutans. Os participantes foram orientados a bochechar duas vezes
ao dia com solução de óleo essencial ou água estéril concomitante à escovação com
dentifrício contendo fluoreto. Perceberam que os bochechos com óleo essencial foram 37,1%
mais ativos contra Streptococcus mutans do que contra Streptococci total. Todavia, o impacto
dos bochechos de óleos essenciais no desenvolvimento e prevalência da cárie dentária não foi
avaliado. Portanto, as implicações clínicas são desconhecidas. Concluíram que os bochechos
com antimicrobianos são mais freqüentemente recomendados no controle do biofilme
supragengival e gengivite para pacientes cujos procedimentos mecânicos de higiene oral são
inadequados. Além disso, promoveram uma inclusão racional dos bochechos com óleos
essenciais como um adjunto aos procedimentos de higiene oral.
Pan et al. (2000) indicaram que bactérias do biolfime podem sofrer mudanças na
susceptibilidade a agentes antimicrobianos quando comparadas com as suas formas
planctônicas. Determinaram o efeito bactericida de um bochecho contendo óleo essencial nas
bactérias do biofilme dental in situ, por meio de análise computadorizada. Suportaram a
primazia de um mecanismo bactericida na produção do biofilme e redução da gengivite
observada com bochechos contendo óleos essenciais.
Em um estudo piloto sobre o efeito clínico e antibacteriano do óleo de tea tree
(TTO), Arweiler et al. (2000) compararam o efeito deste óleo com o da água e da clorexidina
Revisão da Literatura
61
na formação e vitalidade do biofilme supragengival. Os resultados obtidos não puderam ser
comparados com outros estudos por não haver na literatura relatos sobre a eficácia
antibacteriana do óleo de TTO no biofilme dental in vivo. Comparando os resultados com um
controle positivo e negativo, entretanto, classificaram o efeito do óleo de TTO, que quando
usado como uma simples solução de bochecho, não influencia efetivamente na quantidade e
qualidade do biofilme supragengival.
Estudos do tempo de morte demonstraram um decréscimo rápido de Streptococcus
mutans e Lactobacillus rhamnosus depois de 30 segundos de tratamento com 0,5% de óleo de
tea tree. Os autores concluíram que as bactérias encontradas na cavidade oral são susceptíveis
e morrem rapidamente quando em contato com o óleo de Melaleuca alternifólia (HAMMER
et al, 2003). Dessa forma, o uso deste óleo é adequado à cavidade oral funcionando como um
eficiente anti-séptico que pode ser utilizado incorporado a produtos de higiene oral como
bochechos, dentifrícios e géis dentais ou irrigatórios.
Claffey (2003) esclareceu os benefícios dos bochechos com óleos essenciais como
um componente seguro nos cuidados diários de higiene oral. Ressaltou que bochechos
contento álcool desnaturado como veículo têm aumentado as suspeitas sobre a associação do
álcool com o câncer oral.
Segundo Seymour (2003), muitas evidências dão suporte ao uso dos bochechos
com óleos essenciais em inúmeras áreas da saúde oral, incluindo atividade antimicrobiana,
irrigação caseira, manutenção da saúde dos implantes, uso pós-cirúrgico, redução de bactérias
do aerossol dental e redução de bacteremia.
Revisão da Literatura
62
Saeed e Sabir (2004) testaram a atividade antimicrobiana do óleo essencial
extraído do látex resinoso de Commiphora mukul através do método de difusão em disco por
zona de inibição e determinaram a CIM. O óleo essencial exibiu uma potente e persistente
atividade de inibição contra bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, enfatizando seu uso
na medicina tradicional como bochechos, dentifrícios, em úlceras bucais e faringite.
Takarada et al. (2004) investigaram o efeito antimicrobiano dos óleos essenciais
contra as principais bactérias da cavidade oral. Determinaram as CIMs e CBMs dos óleos
essenciais de manuka, tea tree, eucalyptus, lavandula e romarinus. Todos os óleos inibiram o
crescimento das bactérias testadas e a adesão do Streptococcus mutans, sendo o óleo de
manuka e o tea tree os que apresentaram maior atividade antimicrobiana contra bactérias
periodontopáticas e cariogênicas. Do ponto de vista da segurança, examinaram o efeito desses
óleos em células endoteliais do umbigo de humanos e observaram que na concentração de
0.2%, eles exerciam pequeno efeito sobre as células humanas cultivadas. As substâncias
antimicrobianas ideais devem ser efetivas contra a maioria dos microrganismos, agir
rapidamente, manter boa atividade em baixas concentrações, não possuir efeitos colaterais e
não causarem desconforto.
63
OBJETIVOS
64
3. OBJETIVOS
3.1 OBJETIVO GERAL
•
Determinar a atividade antimicrobiana do óleo essencial de Hyptis pectinata L. Poit
(Lamiaceae) frente aos isolados clínicos e cepas padrão de Streptococcus mutans.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
•
Avaliar a atividade antibacteriana de um colutório comercializado contendo
clorexidina comparando-o com o Listerine, a base de óleos essenciais, também
industrializado e com o óleo essencial de Hyptis pectinata.
•
Verificar a eficiência de alguns solventes nos testes de difusão em discos na
atividade antimicrobiana do óleo essencial de Hyptis pectinata.
•
Copilar os dados disponíveis na literatura acerca da atividade antibacteriana de óleos
essenciais.
65
REFERÊNCIAS
66
4. REFERÊNCIAS
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.
77
CAPÍTULO II
ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DO ÓLEO ESSENCIAL DE
Hyptis pectinata (L.) Poit. FRENTE AO Streptococcus mutans.
Atividade Antimicrobiana do Óleo Essencial de Hyptis pectinata Frente ao S. mutans
78
ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DO ÓLEO ESSENCIAL DE
Hyptis pectinata (L.) Poit. FRENTE AO Streptococcus mutans.
RESUMO
A odontologia preventiva tem como meta principal o controle do biofilme bacteriano,
objetivando assim um melhor nível de saúde bucal. Com a finalidade de auxiliar os métodos
convencionais de controle das doenças cárie e periodontal, substâncias químicas vêm sendo
bastante utilizadas na terapêutica odontológica. Apesar da maioria absoluta desses produtos
ser industrializada, com o desenvolvimento da fitoterapia uma nova fonte de possíveis
medicamentos vem sendo testada. O presente trabalho analisou, in vitro, a eficácia do óleo
essencial Hyptis pectinata, em comparação com as soluções comerciais, com relação à
atividade antimicrobiana sobre os Streptococcus mutans presentes na saliva e cepas padrão,
através dos métodos de difusão em disco. Realizou isolamento das bactérias para posterior
teste antimicrobiano com as referidas soluções. Em concentração definida, o óleo essencial de
Hyptis pectinata, apresenta atividade anti Streptococcus mutans bem semelhante à
clorexidina, podendo ser considerada alternativa promissora no controle do biofilme.
PALAVRAS-CHAVE: óleo essencial; atividade antimicrobiana; biofilme dental; bochecho.
ABSTRACT
The preventive dentistry has as main goal the control of the bacterial biofilm, aiming a better
level of buccal health. With the purpose of aiding the conventional methods of control of the
caries and periodontal diseases, chemical substances are being quite used in the therapeutics
odontology. In spite of most absolute of those products to be industrialized, with the
development of the fitoterapia a new source of possible medicines has been tested. The
present work analyzed in vitro the effectiveness of the Hyptis pectinata essential oil in
comparison with the commercial solutions regarding the antimicrobial activity on
Streptococcus mutans present in the saliva and pure cultures of ATCC strains through the
diffusion methods in disk. It accomplished isolation of the bacteria for subsequent
antimicrobial tests with referred solutions. In defined concentration, Hyptis pectinata essential
oil presents anti Streptococcus mutans activity very similar to the chlorhexidine, and can be
considered a promising alternative in the control of the biofilm
KEY WORDS: essential oil; antimicrobial activity; dental biofilm; mouthwash.
Atividade Antimicrobiana do Óleo Essencial de Hyptis pectinata Frente ao S. mutans
79
1. INTRODUÇÃO
Os dois tipos mais comuns de doenças bucais, cárie dental e doença periodontal,
são infecções relacionadas ao biofilme bacteriano. A cárie dental envolve desmineralização,
cavitação e quebra do tecido dental mineralizado e é causada por microrganismos que
fermentam carboidratos da dieta, especialmente sacarose, para produzirem ácidos que iniciam
a dissolução do esmalte dental. Dentre os microrganismos envolvidos no processo de
formação do biofilme, o Streptococcus mutans salivar tem sido apontado como agente
principal de cariogenicidade, estando sua quantidade diretamente relacionada com o
acréscimo do número de colônias totais, permitindo assim o avanço da doença periodontal e
da cárie. Um declive no número desse microrganismo é considerado o equivalente ao
decréscimo do biofilme, por isso a prevenção de doenças dentais está baseada na
administração de produtos que reduzam ao máximo a incidência de Streptococcus mutans
(AXELSSON; LINDHE, 1987; HARDIE, 1992).
Dessa forma, os bochechos realizados, antes e depois da escovação, têm sido
considerados, ao longo dos anos, um adjunto poderoso para os cuidados orais dos pacientes,
através da utilização de uma variedade de agentes antimicrobianos como a clorexidina,
triclosan, sais metálicos, óleos essenciais e extratos de plantas, os últimos, estão sendo
formulados e estudados para examinar sua eficácia clínica na tentativa de inibir o biofilme
dental (OWENS; ADDY; FAULKNER, 1997; SREENIVASAN; GAFFAR, 2002).
Os colutórios utilizados durante os bochechos contêm surfactantes, álcool, flúor e
agentes antimicrobianos. Estes últimos devem ter as seguintes propriedades: largo espectro
antimicrobiano, ser eficaz em baixas concentrações, ação rápida, não ser tóxico, não ser
irritante, ter sabor e odor neutro, boas propriedades de retenção oral, não interferir na flora
oral microbiana, ter regulamentação globalmente aprovada, ser fisicamente estável
quimicamente definido e invariável, e ter custo acessível (MORGAN et al., 2001).
Atividade Antimicrobiana do Óleo Essencial de Hyptis pectinata Frente ao S. mutans
80
Dentre os enxaguatórios frequentemente prescritos, ressaltam-se a clorexidina e o
Listerine, sendo o primeiro considerado um dos mais seguros e eficientes agentes
antimicrobianos, porém, possui efeitos adversos importantes como: manchamento dental,
sabor desagradável, alteração de paladar, erosão de mucosa e outros (OWENS; ADDY;
FAULKNER, 1997). Já o segundo anti-séptico, o Listerine, quando comparado ao primeiro,
apresenta menos efeitos colaterais, comprovado em ensaios desenvolvidos por Axelsson e
Lindhe (1987), nos quais verificaram a presença de ulcerações apenas em pacientes que
fizeram uso da clorexidina.
Evidências clínicas da segurança da utilização do Listerine têm sido baseadas em
mais de 100 anos de uso e na baixa ocorrência de queixas por parte dos consumidores. Seus
ingredientes ativos consistem numa combinação de óleos essenciais (timol, eucaliptol,
salicilato de metila e mentol) extraídos de plantas (WU; SAVITT, 2002); um dos motivos
pelos quais os produtos naturais têm sido apontados como alternativa na busca de novos
fármacos com propriedades antimicrobianas. Além disso, os fitoquímicos têm demonstrado
um grande potencial na substituição de produtos químicos sintéticos para prevenção da cárie
(HAMMER; CARSON; RILEY, 1999).
Estudos etnofarmacológicos realizados por Carvalho (1999) e Cruz (2002), no
município de Curituba, Canidé do São Francisco-SE, demonstraram a utilização de plantas na
medicina popular na forma de bochechos como indicação para infecções bucais, a exemplo da
cabaceira (Lagenaria vulgaris Ser.); da sacatinga (Croton argirophyloides Mull.), do juazeiro
(Ziziphus joazeiro Mart.), da quixabeira (Bumelia sartorum Mart.), do jatobá (Hymneaea
courbaril L.), da catingueira (Caesalpínia pyramidalis Tull.) e do sambacaitá (Hyptis
pectinata L. Poit.).
Dentre as espécies supracitadas a Hyptis pectinata (L.) Poit. Lamiaceae é uma das
que vem sendo estudada devido a sua ampla utilização na medicina popular, tendo seus
Atividade Antimicrobiana do Óleo Essencial de Hyptis pectinata Frente ao S. mutans
81
efeitos antiflamatório, antinociceptivo e antimicrobiano confirmados (PEREDA-MIRANDA
et al., 1993; BISPO et al., 2001; FRAGOSO-SERRANO; GIBBONS; PEREDA-MIRANDA,
2005).
No Nordeste brasileiro, principalmente em Sergipe e Alagoas, essa planta ocorre
naturalmente de forma selvagem em campos, matas e estradas e em volta de residências,
conhecida popularmente como sambacaitá ou canudinho. Destaca-se pela sua freqüente
utilização, em chás, decocções, infusões e bochechos como antiinflamatório natural (BISPO
et al., 2001).
Devido ao exposto, o presente trabalho avaliou a atividade antimicrobiana do óleo
essencial e do hidrolato puro de Hyptis pectinata (L.) Poit. Lamiaceae frente a amostras
clínicas e amostra padrão de Streptococcus mutans.
2. CASUÍSTICA E MÉTODOS
2.1. PRODUÇÃO DA AMOSTRA.
Foram selecionados, para coleta de saliva, 10 pacientes voluntários adultos de
ambos os gêneros, atendidos no Ambulatório de Odontologia do Hospital Universitário/UFS,
seguindo os critérios citados no Quadro 1.
Atividade Antimicrobiana do Óleo Essencial de Hyptis pectinata Frente ao S. mutans
82
Quadro 1 – Critérios para participação de voluntários
•
Indivíduos adultos (18 a 50 anos de idade);
•
Serem mutans-milionários (> 106 UFC/mL), após o processamento da saliva;
•
Sem evidências clínicas de gengivite e periodontite;
•
Presença de no mínimo 70% de dentes na arcada dentária, (20 dentes presentes);
•
Não serem portadores de rinite e sinusite;
•
Maior homogeneidade possível quanto à dieta;
•
Cooperação e habilidade durante a coleta da saliva;
•
Assinatura do termo de Consentimento Livre Esclarecido do Comitê de Ética;
•
Não serem fumantes, alcoólatras, imunodeprimidos e desnutridos;
•
Não serem portadores de dentaduras parciais e aparelhos removíveis;
•
Foram excluídas as gestantes e as mulheres que fazem uso de medicação
contraceptiva;
•
Excluídos os indivíduos sob terapia com antibióticos, antiinflamatórios e
antifúngicos locais (na cavidade bucal) ou sistêmicos.
Fonte: (PITTEN; KRAMER, 1999; adaptado).
As amostras de saliva foram coletadas no período entre sete e nove horas da
manhã, em jejum e sem escovação. De cada voluntário, um volume de cerca de 2 mL de
saliva foi depositado em tubos de ensaios estéreis e transportado em gelo até o Laboratório de
Microbiologia Aplicada da Universidade Federal de Sergipe, onde foi imediatamente
processado.
Atividade Antimicrobiana do Óleo Essencial de Hyptis pectinata Frente ao S. mutans
83
2.2 ISOLAMENTO DO Streptococcus mutans.
As amostras foram homogeinizadas e diluídas em solução salina na escala de 10-1 a
10-3. Com auxílio de “swabs” estéreis, os inóculos foram semeados em placa de Petri
contendo ágar Mitis salivarius, suplementado com 20% de sacarose e 0,2 UI/mL de
bacitracina (GOLD; JORDAN; van HOUTE, 1973). Em seguida, foram incubados a 37°C,
por 72 horas em condições de microaerofilia. Realizaram-se leituras de 24, 48 e 72 horas. As
colônias que apresentaram as características morfológicas típicas das colônias de
Streptococcus mutans (convexas, opacas, com aparência de vidro esmerilhado) foram
repicadas para tubos contendo meio de cultura ágar triptona soja enriquecido com sangue, e
estocadas em freezer a –80°C.
Foram testadas sete cepas clínicas de Streptococcus mutans e duas cepas padrão
ATCC N° 10449 e 25175.
Todo o experimento foi realizado em duplicata e em capela de fluxo laminar.
2.3. ÓLEO ESSENCIAL - Hyptis pectinata (L.) Poit.Lamiaceae.
Registro no Herbário da UFS: 7454
Data de colheita: Março/2004
Teor: Os teores foram estimados com base no peso da matéria seca (0,5mL/100 g1) e
obtidos utilizando-se três amostras de 75g de folhas secas.
2.3.1. Colheita da planta.
As plantas foram obtidas no Campus Rural da UFS localizado no município de
São Cristóvão-SE. A colheita foi realizada três meses após o plantio, em março de 2004. As
folhas foram secas em estufa a 40°C, até peso constante.
Atividade Antimicrobiana do Óleo Essencial de Hyptis pectinata Frente ao S. mutans
84
2.3.2. Extração, análise e identificação do óleo essencial:
A extração do óleo essencial foi realizada no Laboratório de Fitotecnia do
Departamento de Engenharia Agronômica da Universidade Federal de Sergipe (UFS), pela
técnica de hidrodestilação em aparelho do tipo Clevenger onde foi obtido além do óleo o
hidrolato (GUENTHER, 1972). Amostras dos óleos foram analisadas utilizando-se
cromatografia gasosa em equipamento Shimadzu QP5050A interfaceada com espectrômetro
de massa (CG/EM) dotada de: coluna capilar DB-5 (30m x 0,25mm x 0,25µm) conectado em
um detector operando em impacto eletrônico a 70V; gás de arraste Hélio (fluxo 1 mL/min) e
programação: 80oC (1 min), 3oC/min, 180oC (0 min), 10oC/min, 300oC (3 min), tipo de
injeção split 1:100. Os cálculos dos índices de retenção foram feitos através da co-injeção de
n-alcanos. A identificação dos constituintes do óleo essencial foi efetuada baseada nos
índices de retenção (ADAMS, 1995) e pela comparação do espectro de massa com o banco
de dados da biblioteca NIST21 e NIST107. A concentração dos constituintes foi calculada a
partir da área de pico do CG e arranjado em ordem de eluição (Tabela 1).
Durante e após as análises, o óleo foi estocado em frascos âmbar estéreis a -4°C.
Atividade Antimicrobiana do Óleo Essencial de Hyptis pectinata Frente ao S. mutans
85
Tabela 1 - Constituintes químicos do óleo essencial de Hyptis pectinata.
Pico No
TR
Composto
(%)
IRR exp.*
IRR lit.**
(min)
1
4.050
-Pineno
1.39
937
939
2
4.700 1-Octen-3-ol
2.23
975
978
3
4.817
-Pineno
6.95
982
980
4
5.867 Limoneno
2.06
1030
1031
5
7.550 Linalol
1.54
1099
1098
6
16.375
-Copaeno
2.40
1381
1376
7
16.867
-Elemeno
2.15
1396
1391
8
17.800 Cariofileno
18.34
1425
1418
9
18.900
-Cariofileno
1.50
1459
1454
10
19.758 Germacreno-D
3.07
1486
1480
11
20.050 Guaieno
3.76
1495
1490
12
20.258 Biciclogermacreno
1.49
1502
1494
13
20.525
-Bisaboleno
1.17
1510
1509
14
20.758
-Cadineno
1.75
1518
1513
15
21.025 Trans-Calameno
2.40
1527
1532
16
21.958 Epi-Longipanol
1.07
1558
1561
17
22.708 Globulol
1.24
1583
1583
18
22.892 Òxido de Cariofileno
18.00
1589
1581
19
23.683 Não identificado
1.17
1618
20
23.833 Cubenol
1.66
1621
1614
21
25.767 Não identificado
24.68
1687
* IRR exp. = Indice de retenção relativo aplicando a equação de Van den Dool, H. e Kratz,
P.D., J. Chrom., 1963, 11, 463.
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2.4. TESTE DE SUSCEPTIBILIDADE in vitro.
2.4.1. Padronização do inóculo.
Foram preparadas suspensões celulares, transferindo-se as células com 24h de
cultivo do meio de ágar Mitis salivarius para tubos contendo salina estéril. Utilizando a escala
de MacFarland ajustou-se a suspensão celular para a turvação padrão 0,5, que equivale 1,5 x
108 UFC/mL (BIER,1981).
Atividade Antimicrobiana do Óleo Essencial de Hyptis pectinata Frente ao S. mutans
86
2.4.2. Teste de difusão em disco.
A atividade antimicrobiana foi verificada adaptando o método do NCCLS (M44-P,
2003) utilizando discos de papel de filtro estéreis. Os discos foram dispostos individualmente
em fileiras sobre tela de nylon estéril, de forma que não houvesse contato entre eles, sendo
adicionados em discos diferentes (ao centro de cada um) 20 µL de cada solução a ser testada
(Quadro 2) esperando sua secagem para o uso (JÚNIOR; MARTINS, 2004).
A suspensão celular foi inoculada por espalhamento em placa contendo meio ágar
Mitis salivarius. Após a secagem da suspensão no meio, foram adicionados os discos (5mm)
contendo as soluções conforme Quadro 2. As placas foram incubadas por 72h em
microaerofilia, sendo realizadas leituras após 24, 48 e 72h.
Quadro 2 – Soluções-controle e Soluções-teste utilizadas no ensaio.
•
Periogard-solução bucal de clorexidina a 0,12%, fabricada pela ColgatePalmolive (controle positivo).
•
Listerine-antisséptico bucal fabricado pela Warner Lambert
•
Solução de óleo de canola em Tween 80 a 1% (controle negativo).
•
Solução de óleo essencial de Hyptis pectinata nas concentrações de 200mg/mL,
300mg/mL, 400mg/mL, 500mg/mL e 600mg/mL em Tween 80 a 1% (soluçãoteste).
•
Óleo essencial de Hyptis pectinata (substância-teste).
•
Hidrolato da Hyptis pectinata (solução-teste).
(controle positivo).
Atividade Antimicrobiana do Óleo Essencial de Hyptis pectinata Frente ao S. mutans
87
2.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA.
O delineamento experimental utilizado foi o inteiramente casualizado montado em
sete tratamentos (concentrações) com nove repetições para cada tratamento. Os dados foram
expressos como médias. Foi aplicado o teste de Tukey para detecção de diferenças de médias
entre os tratamentos, adotando-se o nível de 5% de probabilidade. Foi utilizado o programa
ASSISTAT versão 7.2 beta 2004.
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Em todas concentrações testadas de óleo essencial de Hyptis pectinata foi
observada a formação do halo de inibição das cepas de Streptococcus mutans analisadas
(Tabela 2), corroborando com o estudo realizado por Pereda-Miranda et al. (1993) e FragosoSerrano, Gibbons e Pereda-Miranda (2005) sobre a propriedade atimicrobiana da Hyptis
pectinata frente a bactérias Gram-positivas.
Na concentração de 200mg/mL foram observados os menores halos de inibição
quando comparados aos produzidos pela clorexidina (controle positivo). Nas concentrações de
300 a 500mg/mL houve um aumento crescente nos halos de inibição, no entanto, esse
resultado não foi observado nas cepas S-53.2, ATCC 25175 e ATCC 10449.
Entre as cepas clínicas e padrão não foi notada diferença de sensibilidade.
88
Atividade Antimicrobiana do Óleo Essencial de Hyptis pectinata Frente ao S. mutans
Tabela 2 – Diâmetro (mm) do halo de inibição de S. mutans produzido pelo hidrolato e o óleo
essencial de Hyptis pectinata em variadas concentrações, utilizando-se o método de difusão
em disco.
Concentração de
óleo essencial
Cepas testadas Halo (mm)*
S-50 S-53. 2 S-54 S-55
S-56 S-57 S-64
200mg/mL
9
6
7
5
13,5 10
11
300mg/mL
12
6
10
9
13
12
11
400mg/mL
13
12
12 10,5
14 14,5 11
500mg/mL
13,5
9
13
14
14
15 11,5
600mg/mL
14
14
14
12
15
15
10
Óleo puro
14,5
10
14,5 12,5
15
14 11,5
Hidrolato puro
Controles
Clorexidina
14,5
13
14
13
15,5 15,5 15
Listerine
Óleo de canola
*Os halos foram calculados a partir de uma média de duas placas.
(-) não houve halo de inibição.
25175
ATCC
10449
ATCC
7
11
13,5
11
14
12
-
10
10
12
11
14
13
-
13
-
13,5
-
Como mostra a Tabela 3, as zonas de inibição apresentadas pelo óleo puro e nas
concentrações acima de 400mg/mL, foram estatísticamente iguais entre si e ao controle
positivo (clorexidina) nas diferentes cepas. Uma vez que entre 200 e 400mg/mL, a diferença
foi considerada significante, pode-se inferir que esse fato está relacionado ao aumento da
concentração do princípio ativo responsável pela ação antimicrobiana presente no óleo
essencial proporcionalmente ao aumento de sua concentração, o que foi mais observado a
partir de 400mg/mL. A ação do Tween 80 como emulsificante, por sua vez, pode ter facilitado
o envolvimento direto do microrganismo teste com a solução resultando numa melhor
determinação da atividade antibacteriana do óleo. A concentração de 400mg/mL é proposta
aqui como a ideal, pois, foi a menor concentração utilizada que apresentou desempenho
estatísticamente igual ao da clorexidina. Tal proposta significa uma economia do óleo, e seu
uso nessa concentração, economicamente mais viável.
Atividade Antimicrobiana do Óleo Essencial de Hyptis pectinata Frente ao S. mutans
89
O hidrolato de Hyptis pectinata, bem como, o Listerine não apresentaram ação
antibacteriana diante das cepas testadas.
Tabela 3 – Médias dos diâmetros (mm) dos halos de inibição de S. mutans produzidos em
diferentes concentrações do óleo essencial de Hyptis pectinata e a clorexidina (controle
positivo) pelo método de difusão em disco.
Concentração do óleo essencial de Hyptis
Halo de inibição (mm)
pectinata
200mg/mL
8.94
c
300mg/mL
10.61
b c
400mg/mL
13.27 a
500mg/mL
12.27 a b
600mg/mL
14.27 a
Óleo essencial puro
12.94 a
Controle positivo
Clorexidina
14.11 a
As médias seguidas pelas mesmas letras não diferem estatisticamente entre si no testes de
Tukey ao nível de 5% de probabilidade.
4. CONCLUSÃO
O óleo essencial de Hyptis pectinata apresenta atividade anti Streptococcus
mutans.
As concentrações de 400mg/mL, 500mg/mL, 600mg/mL bem como o óleo puro
apresentam atividade anti Streptococcus mutans iguais à clorexidina.
A concentração de 400mg/mL se apresenta economicamente mais viável.
O hidrolato puro de Hyptis pectinata não apresenta ação antibacteriana diante das
cepas analisadas.
Nas condições deste estudo, o Listerine não apresentou atividade anti
Streptococcus mutans.
Atividade Antimicrobiana do Óleo Essencial de Hyptis pectinata Frente ao S. mutans
90
5. REFERÊNCIAS
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92
CAPÍTULO III
AVALIAÇÃO DE DILUENTES USADOS PARA ÓLEO ESSENCIAL EM
TESTES DE DIFUSÃO EM DISCO.
Avaliação de Diluentes Usados para Óleo Essencial em Testes de Difusão em Disco
93
AVALIAÇÃO DE DILUENTES USADOS PARA ÓLEO ESSENCIAL EM
TESTES DE DIFUSÃO EM DISCO.
RESUMO
A utilização de produtos de origem natural, como os óleos essenciais e extratos brutos de
plantas com atividade terapêutica específica, tem crescido na área de cosméticos e produtos
farmacêuticos. Em virtude de suas características, os óleos têm apresentado potencial para a
elaboração de fármacos com propriedade antibacteriana, por isso, levando-se em consideração
a atividade antimicrobiana e conhecendo a flora microbiana sensível a ele é possível prever
sua utilização. Para a avaliação desse potencial alguns métodos têm sido propostos, embora
não haja nenhuma padronização, o que dificulta a reprodutibilidade dos experimentos. Essa
dificuldade está relacionada às características que os óleos essenciais apresentam, tais como,
volatilidade, complexidade e hidrofobicidade. Nesse sentido, visando à otimização da técnica
de difusão em disco, este estudo comparou a eficiência de emulsificação dos agentes Tween
20, Tween 80, DMSO (dimetil sulfóxido) e Propileno glicol no óleo essencial de Hyptis
pectinata frente ao Streptococcus mutans. Os dados obtidos confirmam o efeito inibitório do
óleo. Dos diluentes testados, o Tween 20 e o Tween 80 são os mais indicados para a
emulsificação do óleo essencial de Hyptis pectinata.
PALAVRAS-CHAVE: óleo essencial; atividade antimicrobiana; métodos.
ABSTRACT
The use of natural origin products, as the essential oils and rude extracts of plants with
specific therapeutic activity, it has been growing in the area of cosmetics and pharmaceutical
products. Because of their characteristics the oils have been presenting potential for the
pharmaceutical products elaboration with antibacterial property for that, being taken into
account the activity antimicrobial and knowing the sensitive microbial flora to him is possible
to foresee his/her use. For the evaluation of that potential some methods have been proposed,
although there is not any standardization, what hinders the reproduction of the experiments.
That difficulty is related to the characteristics that the essential oils present such as, volatility
complexity and water insolubility. In that sense seeking to the optimization of the diffusion
technique in disk, this study compared the efficiency of the agents' emulsify Tween 20,
Tween 80, DMSO (dimethylsulphoxide) and Propylene glycol in the Hyptis pectinata
essential oil front to the Streptococcus mutans. The obtained data confirm the inhibitory effect
of the oil. Of the tested diluents, Tween 20 and Tween 80 are the most suitable for the
emulsification of the Hyptis pectinata essential oil.
KEY WORDS: essential oil; antimicrobial activity, methods.
Avaliação de Diluentes Usados para Óleo Essencial em Testes de Difusão em Disco
94
1. INTRODUÇÃO
Relatos a respeito da utilização de plantas com aplicações terapêuticas datam
desde o início da civilização. No entanto, somente nos últimos anos, o consumo de ervas
medicinais como alternativa no tratamento de algumas doenças tem crescido gradualmente e
de forma considerável, isso decorre, principalmente, das terapias naturais, através do uso de
compostos de plantas com finalidades farmacêuticas (RIBEIRO, 1996; PEREIRA, 2004).
Vários estudos têm sido propostos para investigar as propriedades farmacológicas
dos diversos produtos de origem vegetal, a exemplo dos extratos e dos óleos essenciais. Em
particular, os óleos têm se apresentado como base de muitas aplicações farmacêuticas e
terapias alternativas médicas (MISHRA; DUBEY, 1994; JONES, 1996; LIS-BALCHIN;
DEANS, 1997).
Os óleos essenciais são metabólitos orgânicos, de origem vegetal, com
características voláteis, refringentes, lipossolúveis, geralmente aromáticos de odor
característico e de composição heterogênea. Algumas de suas propriedades têm sido descritas,
destacando as seguintes: antiviral, antiespasmódica, analgésica, antimicrobiana, cicatrizante,
expectorante, relaxante, anti-séptica das vias respiratórias, vermífuga e antiinflamatória
(MARTINS, 1998).
Existe um considerável interesse pelo desenvolvimento de métodos confiáveis para
avaliação e comparação das diversas propriedades dos óleos essenciais, dentre elas destaca-se
a ação antimicrobiana (MANN; MARKHAM, 1998).
As técnicas mais utilizadas para a determinação da atividade bactericida ou
fungicida dos óleos essenciais se fundamentam de acordo com a necessidade ou não de
dispersão homogênea em água. Uma técnica que não requer a dispersão homogênea em água
é a técnica em ágar, que utiliza discos, furos ou cilindros como reservatório, ou ainda, discos
como fonte de vapor. As técnicas que requerem uma dispersão homogênea em água são
Avaliação de Diluentes Usados para Óleo Essencial em Testes de Difusão em Disco
95
chamadas de técnicas de diluição e são usadas para determinar a CIM (concentração inibitória
mínima) ou a CBM (concentração bactericida mínima). Os estudos sobre a técnica em ágar, a
baixa solubilidade dos óleos essenciais geraram uma das menores zonas de inibição, o que
aumenta, significativamente, as chances de resultados falso-negativos (JANSSEN;
SCHEFFER; BAERHEIM SVENDSEN, 1987).
Os testes de difusão, nos quais o agente é aplicado em furos feitos no ágar ou no
centro de um disco de papel em uma placa com ágar semeada com os microrganismos testes,
são inadequados para testar óleos essenciais, uma vez que seus componentes não são
miscíveis em água. Quando antimicrobianos não solúveis em água são testados, se faz
necessária adição ao meio testado de um emulsificante ou solvente, que garanta o contato
entre o microrganismo teste e o agente durante o experimento. O mesmo princípio deve ser
obedecido quando da utilização de óleos essenciais, uma vez que, o direto envolvimento de
um organismo teste é um importante fator na determinação da atividade antibacteriana e
antifúngica da substância. Para a realização de testes antimicrobianos, os agentes
emulsificantes mais utilizados são o Tween 80, Tween 20 e DMSO (dimetil sulfóxido).
Alguns agentes, entretanto, podem causar mudanças nas propriedades físico-químicas do
sistema testado, resultando em aumento ou redução da atividade antimicrobiana (CARSON;
HAMMER; RILEY, 1995).
Com vista na otimização dos resultados experimentais durante a avaliação da
atividade antimicrobiana de óleos essenciais, o objetivo deste estudo foi comparar a eficiência
de emulsificação dos agentes Tween 20, Tween 80, DMSO (dimetil sulfóxido) e Propileno
glicol no óleo essencial de Hyptis pectinata em teste de difusão em disco frente ao
Streptococcus mutans.
Avaliação de Diluentes Usados para Óleo Essencial em Testes de Difusão em Disco
96
2. CASUÍSTICA E MÉTODOS
2.1 PRODUÇÃO DA AMOSTRA.
Foram selecionados, para coleta de saliva, 10 pacientes voluntários adultos de
ambos os gêneros, atendidos no Ambulatório de Odontologia do Hospital Universitário/UFS,
seguindo os critérios citados no Quadro 1.
Quadro 1 – Critérios para participação de voluntários
•
Indivíduos adultos (18 a 50 anos de idade);
•
Serem mutans-milionários (> 106 UFC/mL), após o processamento da saliva;
•
Sem evidências clínicas de gengivite e periodontite;
•
Presença de no mínimo 70% de dentes na arcada dentária, (20 dentes presentes);
•
Não serem portadores de rinite e sinusite;
•
Maior homogeneidade possível quanto à dieta;
•
Cooperação e habilidade durante a coleta da saliva;
•
Assinatura do termo de Consentimento Livre Esclarecido do Comitê de Ética;
•
Não serem fumantes, alcoólatras, imunodeprimidos e desnutridos;
•
Não serem portadores de dentaduras parciais e aparelhos removíveis;
•
Foram excluídas as gestantes e as mulheres que fazem uso de medicação
contraceptiva;
•
Excluídos os indivíduos sob terapia com antibióticos, antiinflamatórios e
antifúngicos locais (na cavidade bucal) ou sistêmicos.
Fonte: (PITTEN; KRAMER, 1999; adaptado).
As amostras de saliva foram coletadas no período entre sete e nove horas da
manhã, em jejum e sem escovação. De cada voluntário, um volume de cerca de 2 mL de
saliva foi depositado em tubos de ensaios estéreis e transportado em gelo até o Laboratório de
Avaliação de Diluentes Usados para Óleo Essencial em Testes de Difusão em Disco
97
Microbiologia Aplicada da Universidade Federal de Sergipe, onde foi imediatamente
processado.
2.2. ISOLAMENTO DO Streptococcus mutans.
As amostras foram homogeinizadas e diluídas em solução salina na escala de 10-1 a
10-3. Com auxílio de “swabs” estéreis, os inóculos foram semeados em placa de Petri
contendo ágar Mitis salivarius, suplementado com 20% de sacarose e 0,2 UI/mL de
bacitracina (GOLD; JORDAN; van HOUTE, 1973). Em seguida, foram incubados a 37°C,
por 72 horas em condições de microaerofilia. Realizaram-se leituras de 24, 48 e 72 horas. As
colônias que apresentaram as características morfológicas típicas das colônias de
Streptococcus mutans (convexas, opacas, com aparência de vidro esmerilhado) foram
repicadas para tubos contendo meio de cultura ágar triptona soja enriquecido com sangue, e
estocadas em freezer a –80°C.
Foram testadas nove cepas clínicas de Streptococcus mutans e duas cepas padrão
ATCC N° 10449 e 25175.
Todo o experimento foi realizado em duplicata e em capela de fluxo laminar.
2.3. ÓLEO ESSENCIAL - Hyptis pectinata (L.) Poit.Lamiaceae.
Registro no Herbário da UFS: 7454
Data de colheita: Março/2004
Teor: Os teores foram estimados com base no peso da matéria seca (0,5mL/100g1) e
obtidos utilizando-se três amostras de 75g de folhas secas.
Avaliação de Diluentes Usados para Óleo Essencial em Testes de Difusão em Disco
98
2.3.1. Colheita da planta.
As plantas foram obtidas no Campus Rural da UFS localizado no município de
São Cristóvão-SE. A colheita foi realizada três meses após o plantio, em março de 2004. As
folhas foram secas em estufa a 40°C, até peso constante.
2.3.2. Extração, análise e identificação do óleo essencial:
A extração do óleo essencial foi realizada no Laboratório de Fitotecnia do
Departamento de Engenharia Agronômica da Universidade Federal de Sergipe (UFS) pela
técnica de hidrodestilação em aparelho do tipo Clevenger onde foi obtido além do óleo o
hidrolato (GUENTHER, 1972). Amostras dos óleos foram analisadas utilizando-se
cromatografia gasosa em equipamento Shimadzu QP5050A interfaceada com espectrômetro
de massa (CG/EM) dotada de: coluna capilar DB-5 (30m x 0,25mm x 0,25µm) conectado em
um detector operando em impacto eletrônico a 70V; gás de arraste Hélio (fluxo 1 mL/min) e
programação: 80oC (1 min), 3oC/min, 180oC (0 min), 10oC/min, 300oC (3 min), tipo de
injeção split 1:100. Os cálculos dos índices de retenção foram feitos através da co-injeção de
n-alcanos. A identificação dos constituintes do óleo essencial foi efetuada baseada nos
índices de retenção (ADAMS, 1995) e pela comparação do espectro de massa com o banco
de dados da biblioteca NIST21 e NIST107. A concentração dos constituintes foi calculada a
partir da área de pico do CG e arranjado em ordem de eluição (Tabela 1).
Durante e após as análises o óleo foi estocado em frascos âmbar estéreis a
temperatura de -4°C.
Avaliação de Diluentes Usados para Óleo Essencial em Testes de Difusão em Disco
99
Tabela 1 - Constituintes químicos do óleo essencial de Hyptis pectinata
Pico No
TR
Composto
(%)
IRR exp.*
IRR lit.**
(min)
1
4.050
-Pineno
1.39
937
939
2
4.700 1-Octen-3-ol
2.23
975
978
3
4.817
-Pineno
6.95
982
980
4
5.867 Limoneno
2.06
1030
1031
5
7.550 Linalol
1.54
1099
1098
6
16.375
-Copaeno
2.40
1381
1376
7
16.867
-Elemeno
2.15
1396
1391
8
17.800 Cariofileno
18.34
1425
1418
9
18.900
-Cariofileno
1.50
1459
1454
10
19.758 Germacreno-D
3.07
1486
1480
11
20.050 Guaieno
3.76
1495
1490
12
20.258 Biciclogermacreno
1.49
1502
1494
13
20.525
-Bisaboleno
1.17
1510
1509
14
20.758
-Cadineno
1.75
1518
1513
15
21.025 Trans-Calameno
2.40
1527
1532
16
21.958 Epi-Longipanol
1.07
1558
1561
17
22.708 Globulol
1.24
1583
1583
18
22.892 Òxido de Cariofileno
18.00
1589
1581
19
23.683 Não identificado
1.17
1618
20
23.833 Cubenol
1.66
1621
1614
21
25.767 Não identificado
24.68
1687
* IRR exp. = Indice de retenção relativo aplicando a equação de Van den Dool, H. e Kratz,
P.D., J. Chrom., 1963, 11, 463.
** Adams, R.P. Identification of essential oil components by gas chromatograpy/mass
spectroscopy. Illinois USA: Allured Publishing Corporation, Carol Stream, 1995.
2.4 TESTE DE SUSCEPTIBILIDADE in vitro.
2.4.1 Padronização do inóculo.
Foram preparadas suspensões celulares, transferindo-se as células com 24h de
cultivo do meio de ágar Mitis salivarius para tubos contendo salina estéril. Utilizando a escala
de MacFarland ajustou-se a suspensão celular para a turvação padrão 0,5, que equivale 1,5 x
108 UFC/mL (BIER,1981).
Avaliação de Diluentes Usados para Óleo Essencial em Testes de Difusão em Disco
100
2.4.2. Teste de difusão em disco.
A atividade antimicrobiana foi verificada adaptando o método do NCCLS (M44-P,
2003) utilizando discos de papel de filtro estéreis. Os discos foram dispostos individualmente
em fileiras sobre tela de nylon estéril, de forma que não houvesse contato entre eles, sendo
adicionados em discos diferentes (ao centro de cada um) 20 µL de cada solução a ser testada
(Quadro 2) esperando sua secagem para o uso (JÚNIOR; MARTINS, 2004).
A suspensão celular foi inoculada por espalhamento em placa contendo meio ágar
Mitis salivarius. Após a secagem da suspensão no meio, foram adicionados os discos (5mm)
contendo as soluções conforme Quadro 2. As placas foram incubadas por 72h em
microaerofilia, sendo realizadas leituras após 24, 48 e 72h.
Quadro 2 – Soluções-controle e Soluções-teste utilizadas no ensaio.
•
Periogard-solução bucal de clorexidina a 0,12%, fabricada pela ColgatePalmolive (controle positivo).
•
Listerine-antisséptico bucal fabricado pela Warner Lambert
positivo).
•
Óleo de canola solução em Tween 80 a 1%, Tween 20 a 1%, DMSO a 1% e
Propileno glicol a 1% (controle negativo).
•
Óleo essencial de Hyptis pectinata nas concentrações de 400mg/mL e
600mg/mL de solução em Tween 80 a 1%, Tween 20 a 1%, DMSO a 1% e
Propileno glicol a 1%(solução-teste).
(controle
Avaliação de Diluentes Usados para Óleo Essencial em Testes de Difusão em Disco
101
2.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA.
O delineamento experimental utilizado foi o inteiramente casualizado montado em
esquema fatorial cinco (diluentes) x dois (concentrações), com duas repetições para cada
tratamento. Os dados foram expressos como médias. Foi aplicado o teste t para detecção de
diferenças de médias entre os tratamentos, adotando-se o nível de 5% de probabilidade. Foi
utilizado o programa ASSISTAT versão 7.2 beta 2004.
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Para a verificação da atividade antimicrobiana de óleos essenciais através do método
de difusão em disco tem sido sugerida a utilização de diluentes que possibilitem uma melhor
interação entre o óleo e o microrganismo teste, podendo essa interação ser avaliada pelo
tamanho do halo de inibição. Dentro dessa proposta, os diluentes Tween 80, Tween 20 e o
DMSO são os mais utilizados (REMMAL et al., 1993; CARSON; RILEY, 1993; HOOD;
WILKINSON; CAVANAGH, 2003).
No teste antimicrobiano de difusão em disco, realizado com óleo essencial de Hyptis
pectinata nas concentrações de 400mg/mL e 600mg/mL em solução de Tween 80 a 1%,
Tween 20 a 1%, DMSO a 1% e Propileno glicol a 1% (solução-teste), foi verificada a
presença de halos de tamanho semelhantes entre si e ao controle positivo em todas as
soluções-teste analisadas frente ao S. mutans (Tabela 2). Quando os mesmos diluentes foram
testados em associação com o óleo de canola (selecionado por apresentar propriedades físicas
similares à maioria dos óleos), reconhecidamente inerte microbiologicamente, (HOOD;
WILKINSON; CAVANAGH, 2003). As culturas de S. mutans cresceram sem qualquer
inibição, indicando que nenhum dos diluentes aqui testados apresentou atividade
antimicrobina per si, não potencializando, portanto, a ação antimicrobiana do óleo. A
possibilidade da ação sinérgica entre o óleo essencial e o diluente utilizado foi relatada por
Avaliação de Diluentes Usados para Óleo Essencial em Testes de Difusão em Disco
102
vários autores (JANSSEN; SCHEFFER; BAERHEIM SVENDSEN, 1987; CARSON;
HAMMER;
RILEY,
1995;
MANN;
MARKHAM,
1998;
HOOD;
WILKINSON;
CAVANAGH, 2003).
Tabela 2 – Diâmetro (mm) do halo de inibição de S. mutans produzido pelo óleo essencial de Hyptis
pectinata suspenso em diluentes diversos (DMSO, Tween 20 e 80 e Propileno glicol) através do
método de difusão em disco.
Diluente Concentração
de Óleo
DMSO
Tween 20
Tween 80
Propileno
glicol
Controles
Clorexidi
na
Listerine
Óleo de
canola**
400mg/mL
600mg/mL
400mg/mL
600mg/mL
400mg/mL
600mg/mL
400mg/mL
600mg/mL
CEPAS TESTADAS - HALO (mm)*
S-53.2
S-60
S-57
S-54
S-55
S-56
S-58
10449A 25175
TCC ATCC
15
17,5
11,5
15,5
15,5
16
16
15
14
13
16
14
12
13
12
14
9
11
11
12
11,5
12
13
13,5
15,5
14,5
14
14,5
16
17
12
10,5
11
14,5
15,5
16
14,5
16
12,5
11
13,5
15
17
17
12
14
13
14
14
14
14
14
10,5
12
15
14
13,5
15,5
14,5
15,5
18
18
18,5
18,5
11,5
12,5
12,5
11,5
17
18,5
10,5
11
13,5
15
13,6
14
13
15,5
16
13,5
-
-
-
-
-
-
-
-
S-64
S-54.2
12,5
14,5
11,5
16,5
11
10
11,5
12,5
13,5
15
14,5
15,5
15
20
12
11,5
15
15
16,5
-
-
-
*Os halos foram calculados a partir de uma média de duas placas.
** Óleo de canola suspenso nos diluentes supracitados.
(-) não houve halo de inibição.
Com o tratamento estatístico (Tabela 3), observou-se que as médias dos halos de
inibição obtidos a partir das soluções-teste utilizando os diluentes Tween 80 e Tween 20, não
diferem estatisticamente entre si e ao controle positivo. Com efeito, estes diluentes se
apresentaram como os melhores emulsificantes para o óleo essencial de Hyptis pectinata. O
DMSO mostrou diferença estatisticamente significante, embora os halos produzidos sejam
insignificantes quando comparados ao Tween 20, ao Tween 80 e à clorexidina (controle
positivo). Já o propileno glicol, foi estatisticamente considerado, o diluente de menor
qualidade.
A variação nas concentrações (400mg/mL e 600mg/mL) do óleo não apresentou
diferença estatística, demonstrando que a capacidade de emulsificação do diluente não foi
Avaliação de Diluentes Usados para Óleo Essencial em Testes de Difusão em Disco
103
reduzida com o aumento da concentração do óleo. Concomitantemente, a atividade
antimicrobiana do óleo essencial não foi potencializada com a diminuição da concentração do
óleo, o que seria uma possibilidade, uma vez que, com a diminuição da concentração
(400mg/mL) do óleo o diluente poderia emulsificá-lo de forma mais eficiente.
Tabela 3 – Médias dos diâmetros (mm) dos halos de inibição de S. mutans produzidos pelo
óleo essencial Hyptis pectinata suspenso em diversos diluentes (Tween 80, Tween 20, DMSO
e Propileno glicol) através do método em disco.
Diluentes
Halo de inibição (mm)
Tween 80
14.55 a
Tween 20
14.50 a
DMSO (dimetil sufóxido)
13.64 a b
Propileno glicol
12.98
b
Controle positivo
Clorexidina
14.60 a
As médias seguidas pelas mesmas letras não diferem estatisticamente entre si no teste de t ao
nível de 5% de probabilidade.
4. CONCLUSÃO
O óleo essencial de Hyptis pectinata apresenta atividade anti Streptococcus
mutans semelhante à clorexidina.
Dos diluentes testados, o Tween 20 e o Tween 80 são os mais indicados
para a emulsificação do óleo essencial de Hyptis pectinata.
Dentre os diluentes testados, o propileno glicol apresenta capacidade de
solubilização inferior.
Nas condições teste, nenhum dos diluentes testados pontencializa a ação
antimicrobiana do óleo essencial de Hyptis pectinata.
Avaliação de Diluentes Usados para Óleo Essencial em Testes de Difusão em Disco
104
5. REFERÊNCIAS
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Avaliação de Diluentes Usados para Óleo Essencial em Testes de Difusão em Disco
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1996. 152 f. Dissertação de Mestrado. Universidade Federal do Rio de Janeiro/ Museu
Nacional, Rio de Janeiro, 1996.
106
CAPÍTULO IV
ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DOS ÓLEOS ESSENCIAIS:
Uma abordagem multifatorial dos métodos
Atividade Antimicrobiana dos Óleos Essenciais
107
ATIVIDADE ANTIMICROBIANA DOS ÓLEOS ESSENCIAIS:
Uma abordagem multifatorial dos métodos
RESUMO
Os dados colhidos da literatura sobre a atividade antimicrobiana dos óleos essenciais são
tratados de um ponto de vista experimental e consideram uma possível aplicação clínica dos
óleos. Com intuito de verificar a variação entre os experimentos sobre eficácia antimicrobiana
dos óleos essenciais, realizou-se um levantamento bibliográfico. Os testes e avaliações da
atividade antimicrobiana dos óleos essenciais são dificultados pela volatilidade do óleo, sua
insolubilidade em água e sua complexidade. Uma maior atenção deve ser dada a quatro
fatores quando se trabalha com óleos essenciais: a técnica usada, o meio de crescimento, o
microrganismo teste e o óleo essencial testado. Os resultados obtidos na literatura com relação
aos testes de óleos essenciais para atividade antimicrobiana são difíceis de se comparar. Os
métodos usados diferem largamente e fatores importantes que influenciam os resultados são
freqüentemente negligenciados. Assim, diante deste levantamento, concluiu-se a
irreprodutibilidade dos experimentos.
PALAVRAS-CHAVE: óleo essencial; atividade antimicrobiana.
ABSTRACT
The given data of the literature on the antimicrobial activity of the essentials oils are treated of
an experimental point of view and they consider a possible clinical application of the oils.
With intention of verifying the variation among the experiments on antimicrobial
effectiveness of the essential oils, a bibliographical rising was made. The tests and evaluations
of the antimicrobial activity of the essentials oils are hindered by the volatility of the oil, its
insolubility in water and its complexity. A larger attention should be given to four factors
when we work with essential oils: the technique used, the growth medium, the tested
microorganism and the essential oil tested. The results obtained in the literature regarding the
tests of essential oils for activity antimicrobial are difficult to compare. The used methods
differ broadly and important factors that influence the results are frequently neglectful. Like
this, before this rising, the irreproductibility of the experiments was ended.
KEY WORDS: essential oil; antimicrobial activity.
Atividade Antimicrobiana dos Óleos Essenciais
108
INTRODUÇÃO
Óleos e extratos de plantas há muito tempo têm sido base para diversas aplicações
na medicina popular, entre elas, como antimicrobianos e anti-sépticos tópicos. A luz desta
importância levou a diversas investigações científicas, com intuito de se confirmar a atividade
antimicrobiana dos óleos essenciais (JANDOUREK; VAISHAMPAYAN; VAZQUEZ, 1998;
ARWEILER et al., 2000; FINE et al., 2000; PAN et al., 2000; CLAFFEY, 2003;
SEYMOUR, 2003; BENKEBLIA, 2004; REHDER et al., 2004).
Para tanto, têm-se buscado métodos in vitro confiáveis capazes de serem
reproduzidos e validados. Contudo, isso tem sido dificultado devido às peculiaridades que os
óleos apresentam, tais como: volatilidade, insolubilidade em água e complexidade,
características que interferem significativamente nos resultados, por isso, em testes de
susceptibilidade antimicrobiana, deve-se levar em consideração a técnica usada, o meio de
crescimento, o microrganismo teste e o óleo essencial testado. Nesse contexto, o presente
estudo realizou um levantamento bibliográfico a respeito dos métodos utilizados para testes
de avaliação antimicrobiana de óleos essenciais.
Testes de susceptibilidade in vitro.
O ressurgimento do interesse nas terapias naturais e o crescimento da demanda de
consumo por produtos naturais efetivos e seguros requerem mais dados sobre os óleos e
extratos de plantas (MANCINI; HANAI, 1991; MISHRA; DUBEY, 1994; JONES, 1996;
LIS-BALCHIN; DEANS, 1997). Vários estudos têm apontado algumas propriedades dos
óleos, destacando as seguintes: antiviral, antiespasmódica, analgésica, antimicrobiana,
cicatrizante, expectorante, relaxante, anti-séptica das vias respiratórias, vermífuga e
antiinflamatória. (MARTINS, 1998).
Atividade Antimicrobiana dos Óleos Essenciais
109
Nos ensaios sobre a atividade antimicrobiana dos óleos essenciais in vitro é
possível verificar uma variedade de metodologias propostas, o que torna a comparação entre
esses estudos problemática (MITSCHER et al., 1987; HAMMER; CARSON; RILEY, 1999).
Os métodos comumente usados são o de difusão em disco, difusão utilizando
pocinhos feitos no ágar, diluição em ágar e diluição em caldo para determinação da
concentração inibitória mínima - CIM (MANN; MARKHAM, 1998; SOUZA et al., 1998;
ASEKUN; EKUNDAYO; ADENIYI, 1999; TAKAISI-KIKUNI; TSHILANDA; BABADY,
2000; CANILLAC; MOUREY, 2001; HAZNEDAROGLU; KARABAY; ZEYBEK, 2001;
CIMANGA et al., 2002; JUTEAU et al., 2002; SHAFI et al., 2002; NOSTRO et al., 2004).
Os resultados obtidos por cada um desses métodos podem diferir devido a fatores como as
variações entre os testes, a exemplo do crescimento microbiano, exposição de microrganismos
ao óleo, a solubilidade do óleo ou de seus componentes e o uso e quantidade de emulsificante
(HAMMER; CARSON; RILEY, 1999; LAMBERT et al., 2001; OPALCHENOVA;
OBRESHKOVA, 2003; HOOD; WILKINSON; CAVANAGH, 2003).
Os testes de avaliação antimicrobiana são padronizados pela NCCLS (National
Committee for Clinical Laboratory Standards) e desenvolvidos para analisar agentes
antimicrobianos convencionais como os antibióticos. Nos testes de atividade antimicrobiana
de óleos essenciais a metodologia proposta pelo NCCLS não pode ser seguida à risca, devido
às propriedades químicas que estes apresentam. Dessa forma, feitas modificações esses
métodos podem ser usados em algumas situações. Na maioria dos estudos, as zonas de
inibição formadas pelos óleos são comparadas com aquelas obtidas pelos antibióticos, no
entanto, é importante destacar que esses resultados não devem ser simplesmente comparados,
pois as particularidades apresentadas pelos óleos, bem como, outras variáveis (técnica usada,
o meio de crescimento, o microrganismo teste) devem ser levadas em consideração
Atividade Antimicrobiana dos Óleos Essenciais
110
(CARSON; HAMMER; RILEY, 1995; CHRISTOPH; KAULFERS; STAHL-BISKUP, 2000;
JÚNIOR; MARTINS, 2004; NOSTRO et al., 2004; SAEED; SABIR, 2004).
As substâncias normalmente testadas pelos métodos propostos pelo NCCLS têm
natureza hidrofílica e os testes são otimizados para esta condição. Nos ensaios com óleos
essenciais essa característica é inadequada para verificar a atividade antimicrobiana, uma vez
que os óleos são voláteis, insolúveis em água, viscosos e complexos, além disso, formam uma
suspensão túrbida que impede a determinação visual da eficácia antimicrobiana do óleo,
devido à interferência da dissolução insuficiente dos componentes testados, sendo assim, a
falta de padronização dos testes de susceptibilidade antimicrobiana tem sido um dos
empecilhos encontrados para a realização desse tipo de estudo (HAMMER; CARSON;
RILEY, 1996; SMITH; NAVILLIAT, 1997; HOOD; WILKINSON; CAVANAGH, 2003).
Outro problema observado é a difusão dos componentes lipofilícos dos óleos,
quando se utiliza a técnica de difusão em ágar, pois resulta em concentrações desiguais do
óleo no ágar causando a formação de regiões variáveis de atividade antibacteriana e,
finalmente, a determinação de um número de bactérias viáveis remanescentes após a adição
do óleo. Desta forma, acredita-se que os métodos não permitem a reprodução de resultados
que expressem a realidade e, por isso, são incapazes de comparar diretamente a verdadeira
atividade dos óleos (HOOD; WILKINSON; CAVANAGH, 2003; SETZER et al., 2004;
SOKMEN et al., 2004).
Visando a otimização dos procedimentos com óleos essenciais, tornou-se comum
à dispersão dos mesmos através do meio de crescimento, usando um solvente, detergente, ou
agente emulsificante, os mais utilizados são: Tween 20, Tween 80, DMSO (dimetil sulfóxido)
e etanol (GROPPO et al., 2002; BAYDAR et al., 2004; BRUNI et al., 2004). As propriedades
físicas e químicas das dispersões usadas são importantes para observar a atividade
antimicrobiana dos óleos, no entanto, deve-se levar em consideração que ao se introduzir um
Atividade Antimicrobiana dos Óleos Essenciais
111
agente emulsificante, este está sujeito a possíveis interações com a substância em teste, bem
como, possuir atividade antimicrobiana. Esses efeitos podem ser acentuados ou minimizados
a depender do modo de preparo da solução óleo-agente emulsificante. Por isso, preconiza-se
uma relação adequada entre óleo e dispersante. (JANSSEN; SCHEFFER; BAERHEIM
SVENDSEN, 1987; REMMAL et al., 1993; SHAPIRO; MEIER; GUGGENHEIM, 1994;
HAMMER; CARSON; RILEY, 1999).
A interferência do agente dispersante na susceptibilidade da bactéria ao óleo
essencial pode ser explicada devido a possível influência que este exerce sobre o crescimento
bacteriano e/ou a alteração da permeabilidade da membrana celular. Os emulsificantes podem
agir antagonicamente ou sinergeticamente aos componentes ativos do óleo. Altas
concentrações de Tween, por exemplo, podem aumentar a atividade antibacteriana
determinando resultados falso-positivos ou reduzindo a bio-atividade do óleo, esse último
efeito é, possivelmente, causado pela formação de micelas que dificultaria o contato direto do
óleo com os microrganismos (REMMAL et al., 1993; COX; MANN; MARKHAM, 2000;
TAKARADA et al., 2004). Para minimizar esses efeitos, alguns autores propuseram que os
dispersantes Tween 20, 80 e outros detergentes sejam utilizados em concentrações que variem
entre 0.5 a 20% em solução com óleo. Ou ainda, para o Tween 80, preconiza-se uma
concentração de 0.02% a fim de se otimizar o método de diluição em caldo na determinação
da concentração inibitória mínima - CIM, estando os valores desta relacionados ao agente
dispersante usado (REMMAL et al., 1993; CARSON; RILEY, 1993; HOOD; WILKINSON;
CAVANAGH, 2003).
Outros elementos podem interferir nos valores apresentados pelo CIM obtido em
métodos de difusão e diluição, como: no tempo de incubação, nas formulações de ágar, nos
volumes das substâncias testadas e na interferência da emulsão óleo-água (CARSON;
Atividade Antimicrobiana dos Óleos Essenciais
112
HAMMER; RILEY, 1995; CARSON et al., 1995; MANN; MARKHAM,1998; HAMMER;
CARSON; RILEY, 1999).
Existe um crescimento da demanda para aumentar o conhecimento sobre os CIMs
dos óleos essenciais gerando um equilíbrio sensível entre aceitabilidade e a eficácia
antimicrobiana. Isto pode ser testado com estudos in vitro e in vivo. Os métodos podem ser
divididos em grupos como difusão, diluição, impedância e densidade ótica (TASSOU;
KOUTSOUMANIS; NYCHAS, 2000). Entre esses, a diluição provou ser o método de
maiores resultados quantitativos, enquanto dados obtidos a partir da difusão em placa de petri,
constitui em um método qualitativo, por isso, esses métodos (diluição e difusão) não são
necessariamente comparáveis. Os resultados obtidos por cada um desses métodos podem
diferir devido a fatores como as variações entre os testes. Na técnica de difusão em disco e em
ágar a vantagem é limitada na geração de dados preliminares, somente dados qualitativos,
como a natureza hidrofóbica da maioria dos óleos essenciais e extrato de plantas, impedem a
difusão uniforme destas substâncias através do meio contendo ágar. Algumas das condições
propostas neste modelo foram checadas para sua validação, concluindo que os testes são
muitas vezes impraticáveis (SKANDAMIS; TSIGARIDA; NYCHAS, 2000).
Variação dos microrganismos e óleos essenciais testados.
Estudos da atividade antimicrobiana dos óleos essenciais, em sua maioria, não
fornecem detalhes sobre a quantidade, o tipo de microrganismo utilizado e o espectro desta
atividade, dificultando sua reprodutibilidade e a comparação dos dados. Dessa forma,
sugerem que a avaliação do efeito antibacteriano e antifúngico dos óleos essenciais seja
realizada com isolados múltiplos para cada espécie testada (HAMMER; CARSON; RILEY,
1999; KHALLOUKI et al., 2000; CHANG, S. -T; CHEN; CHANG, S. -C, 2001;
KARAMAN et al., 2001; HAMMER et al., 2003).
Atividade Antimicrobiana dos Óleos Essenciais
113
Outro fator importante a ser considerado para validar o efeito antimicrobiano do
óleo é o conhecimento das particularidades de cada microrganismo, bem como do óleo a ser
analisado. Em experimentos com fungos, por exemplo, deve-se levar em conta o tempo de
incubação, uma vez que este acontece em torno de dois a quinze dias, podendo interferir no
diâmetro de inibição para alguns óleos, esse fato pode ser atribuído à decomposição ou
evaporação pela volatilidade dos óleos durante o período de teste (JANSSEN; SCHEFFER;
BAERHEIM SVENDSEN, 1987; BASIM E.; BASIM H., 2003; MALELE et al., 2003).
Em relação às particularidades do óleo, algumas pesquisas a respeito de sua
composição mostram que mesmo variações genéticas dentro de uma espécie podem alterar o
teor do princípio ativo. Ademais, outros fatores, como clima, solo, época e forma de plantio,
adubação, uso de agrotóxicos, irrigação, tempo e condições ambientais, proveniência do
material da planta (fresco ou seco), técnica de extração, fonte botânica, tratos culturais e
colheita e padrões de variação geográfica (latitudes e longitudes) afetam na variabilidade
química dos óleos, levando, por exemplo, a alterações na atividade bacteriana (LACERDA,
1999; LAMBERT et al., 2001; AZEVEDO et al., 2002; RASOOLI; MIRMOSTAFA, 2002;
BASSOLE et al. 2003; OPALCHENOVA; OBRESHKOVA, 2003).
A atividade antimicrobiana de um mesmo óleo pode ser às vezes bem diferente.
Para uma espécie em particular, por exemplo, os valores de CIM determinados para óleos
essenciais de quimiotipos de Thymus vulgaris diferem quando se usam outras linhagens de um
mesmo microrganismo (JANSSEN; SCHEFFER; BAERHEIM SVENDSEN, 1987).
O volume e a concentração dos óleos são parâmetros que também devem ser
observados na avaliação do efeito antimicrobiano, pois podem afetar os resultados do sistemateste. Nos experimentos com óleos essenciais utilizando-se pocinhos, um certo volume
mínimo de óleo é necessário para se observar alguma inibição. Existe ainda um volume
ótimo, além do qual nenhum crescimento maior dentro do diâmetro de inibição pode ocorrer.
Atividade Antimicrobiana dos Óleos Essenciais
114
Entretanto, a significância destes volumes na descrição da atividade antimicrobiana de um
óleo essencial não é conhecida. Quando cilindros e discos de diâmetros similares são usados
para o mesmo óleo, diâmetros de inibição iguais são encontrados. Isto é imprescindível
porque a aplicação de volumes difere largamente (JANSSEN; SCHEFFER; BAERHEIM
SVENDSEN, 1987).
CONCLUSÃO
Existem vários métodos descritos na literatura para mensurar a atividade
bactericida e bacteriostática dos óleos essenciais. Entretanto, as pesquisas sobre a atividade
antimicrobiana desses produtos têm sido dificultadas pela ausência de métodos padronizados,
fazendo com que a comparação entre os estudos seja praticamente impossível, além de
incapacitar sua reprodutibilidade. Os métodos usados diferem largamente e fatores
importantes que influenciam os resultados são freqüentemente negligenciados. Em estudos
futuros, deve-se, por exemplo, mencionar o número da linhagem do microrganismo testado, o
tempo de exposição do microrganismo ao óleo essencial, uso e quantidade de emulsificante,
revelar a composição do óleo essencial ou descrever precisamente as condições em que ele foi
obtido. Sem um método padrão confiável é praticamente impossível elucidar a verdadeira bioatividade, o potencial terapêutico e a utilidade clínica dos óleos essenciais, bem como fazer
uma comparação direta entre eles.
Atividade Antimicrobiana dos Óleos Essenciais
115
REFERÊNCIAS
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120
CONSIDERAÇÕES FINAIS
121
5. CONSIDERAÇÕES FINAIS
O papel do biofilme bacteriano como fator para o desenvolvimento das doenças
bucais como a cárie dentária e a gengivite é reconhecido pela comunidade de dentistas. Maior
ênfase é dada à prevenção da forma precoce dessas doenças, e na prevenção da progressão
destas para formas mais destrutivas de periodontite. As abordagens sobre a prevenção foram
centradas na conscientização crescente das pessoas sobre a necessidade da manutenção dos
níveis adequados de higiene oral e na pesquisa dirigida para a avaliação de métodos químicos
de redução e inibição do biofilme. A utilização de agentes seguros, efetivos e
antimicrobianos, oferece uma abordagem para redução da incidência mundial das doenças
bucais.
A pesquisa farmacológica de plantas medicinais é necessária diante das suas
capacidades terapêuticas e da sua larga utilização. Dessa maneira, é primordial o estudo
científico das plantas para distinguir e selecionar aquelas que apresentam propriedades ativas
e dotadas de razoável grau de segurança, aumentando o arsenal terapêutico disponível no
atendimento médico/farmacêutico em saúde pública.
A relevância da eficácia dos produtos antibiofilme para a manutenção da saúde bucal
juntamente com o potencial terapêutico das plantas justifica a necessidade de realização de
experimentos.
Dentro do contexto, esta Dissertação de mestrado conseguiu alcançar o objetivo
proposto ao demonstrar, in vitro, que o tratamento com óleo essencial de Hyptis pectinata
frente a odontopatógenos é viável. Contribuiu, ainda, com um levantamento consistente
acerca das técnicas utilizadas, buscando definir as mais confiáveis para avaliação e
comparação das propriedades antimicrobianas dos óleos essenciais. Proveu evidências
Considerações Finais
122
adicionais de que a definição adequada do diluente pode favorecer a emulsificação do óleo
contribuindo para uma melhora na atividade antimicrobiana.
Considerando que as plantas medicinais levam em seu bojo a possibilidade de
aproveitamento da planta “in natura” e/ou preparados simples obtidos a partir dela, tais
abordagens surgem como um caminho viável para a produção de medicamentos a baixo custo
e acessíveis à maior parte da população mundial.
A Hyptis pectinata, pode representar uma opção para a manutenção da higiene oral
como uma alternativa promissora no controle do biofilme, além e acima de eliminação direta
da bactéria, que pode ter relevância clínica.
Esse é um dos aspectos que merece atenção especial, principalmente no contexto
da implementação de Programas de Plantas Medicinais com a finalidade de viabilizar não só
as pesquisas e divulgação, mas também, a produção de medicamentos.
É clara a necessidade do estudo de plantas que são utilizadas pela medicina
popular, e podem ser empregadas no arsenal terapêutico, isso somado ao fato de que o uso de
plantas medicinais é recomendado pela Organização Mundial de Saúde (OMS) como forma
de ampliar: os programas de saúde pública, o número de beneficiários, a capacidade de
atendimento farmacêutico e a formação de multiplicadores.
Estamos no início de um novo século e já é chegado o momento de refletir sobre o
caminho da odontologia em relação ao seu importante papel na promoção saúde bucal da
população, permitindo uma mudança no paradigma da profissão odontológica. A odontologia
moderna está praticamente voltada para a prevenção, pois, sem dúvida, esse é o único
caminho para a saúde em latu sensu.
123
APÊNDICES
124
APÊNDICE 1
CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Eu, _____________________________________________________, portador(a) da Carteira
de Identidade de número: ____________________, autorizo a odontológa Paula Frassinetti
Coelho Nascimento, a examinar minha cavidade bucal , bem como a coleta da saliva e
execução de exames microbiológicos. Além disso, autorizo a realização de fotografias e
utilização dos dados coletados para a elaboração de trabalhos científicos, apresentações em
seminários, reuniões científicas, jornadas, congressos e a publicação em revistas e periódicos
odontológicos.
Aracaju, ____/____/______
____________________________________________
Paciente
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