ANÁLISE DA EXPRESSÃO DOS GENES DAS - PPGBAIP

UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA DE AGENTES INFECCIOSOS E
PARASITÁRIOS
ANÁLISE DA EXPRESSÃO DOS GENES DAS CITOCINAS IL-2 E
TNF-α EM MODELO EXPERIMENTAL ANIMAL INFECTADO COM O
VÍRUS MAYARO (TOGAVIRIDAE: ALPHAVIRUS)
ALESSANDRA DA CONCEIÇÃO MIRANDA SANTOS
Belém-Pará
2013
ALESSANDRA DA CONCEIÇÃO MIRANDA SANTOS
ANÁLISE DA EXPRESSÃO DOS GENES DAS CITOCINAS IL-2 E
TNF-α EM MODELO EXPERIMENTAL ANIMAL INFECTADO COM O
VÍRUS MAYARO (TOGAVIRIDAE: ALPHAVIRUS)
Dissertação apresentada ao Programa de PósGraduação em Biologia de Agentes Infecciosos e
Parasitários do Instituto de Ciências Biológicas da
Universidade Federal do Pará como requisito para
obtenção do grau de Mestre em Biologia de Agentes
Infecciosos e Parasitários.
Orientadora: Prof.ª Dr.ª Ana Cecília Ribeiro Cruz.
Belém-Pará
2013
ALESSANDRA DA CONCEIÇÃO MIRANDA SANTOS
ANÁLISE DA EXPRESSÃO DO GENE DA IL-2 E TNF-α EM MODELO
EXPERIMENTAL ANIMAL INFECTADO COM O VÍRUS MAYARO
(TOGAVIRIDAE: ALPHAVIRUS).
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia de Agentes Infecciosos
e Parasitários do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Pará como
requisito para obtenção do grau de Mestre em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários.
Orientadora:
Prof.ª Dr.ª Ana Cecília Ribeiro Cruz
Instituto Evandro Chagas
Banca Examinadora:
Prof.ª Dr.ª Edna Cristina Santos Franco
Instituto Evandro Chagas
Prof. Dr. José Antônio Picanço Diniz Júnior
Instituto Evandro Chagas
Prof. Dr. Luiz Fernando Almeida Machado
Instituto de Ciências Biológicas – ICB/UFPA
Prof.ª Dr.ª Daniele Barbosa de Almeida Medeiros
(Suplente)
Instituto Evandro Chagas
Aprovada em:___/___/___
Conceito:_____
Belém, 30 de Abril de 2013.
EPÍGRAFE
“Um homem nunca sabe aquilo de que é capaz até que o tenta fazer.”
(Charles Dickens).
DEDICATÓRIA
“Ao meu pai, tias-mães e irmã que fizeram dos meus sonhos sua luta;
ao meu marido e filho por todo amor, compreensão e incentivo; aos meus
amigos e familiares, pelo carinho e apoio constantes e a Deus porque sem
Ele nada seria possível".
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus pelo dom da vida, por seu infinito amor que me guia
em todos os momentos da minha vida e pela realização de mais sonho.
Ao meu Pai, Edilson da Silva Miranda, minha tia, Oscarina da Silva Miranda e a
minha irmã, Renata da Conceição Miranda, pelo apoio, confiança e paciência, elementos
fundamentais que me permitiram hoje está a onde estou. Obrigado por todo amor, carinho e
proteção que vocês me proporcionam.
Aos meus Tios e Tias, Primos e Primas, por todo apoio, palavra de incentivo e gestos
de compreensão que me deram. Obrigada pela família maravilhosa que vocês são.
Ao meu marido, José Alberto Baptista Santos Junior (Jota), pelo companheirismo,
paciência, compreensão, amor e carinho que me dedica. Obrigada por fazer parte da minha
vida e me permitir fazer parte da sua.
Ao meu filho Lucas, hoje com apenas sete meses, e dono de um amor que não cabe em
mim. Obrigada por existir em minha vida e dar a ela o sentido que só você pôde dar. Te amo
mais que tudo e para sempre, você foi sem dúvida a melhor coisa que me aconteceu durante
este curso!
À Professora Dr.ª Ana Cecília Ribeiro Cruz, pela orientação ao longo desses anos, que
me permitiram crescimento pessoal e profissional. Obrigada pela atenção, confiança,
paciência e dedicação para a realização desse trabalho.
À equipe do Laboratório de Biologia Molecular da Secção de Arbovirologia e Febres
hemorrágicas do Instituto Evandro Chagas: Cleiton e Maira, pela amizade e paciência com
que me ensinaram as técnicas de biologia molecular; José Wilson Jr, pelo apoio e trabalho na
inoculação dos isolados em camundongos e dissecação para extração dos órgãos dos animais;
Antônio Gregório Dias Jr; pela colaboração e sugestões no trabalho e execução das técnicas
de RT-qPCR; Samir Casseb, pelo companheirismo, incentivo e execução das técnicas de
biologia molecular; e Natália do Vale e Maria Natividade pela amizade e incentivo durante a
realização desse trabalho.
À Pesquisadora Eliana Pinto da Silva pela colaboração nos experimentos de titulação
em células Vero; A pesquisadora Milene Ferreira e ao pesquisador Basílio pelas inoculações
dos isolados em camundongos.
A todos os funcionários do biotério da Seção de Arbovirologia e Febres Hemorrágicas
(SAARB) do Instituto Evandro Chagas, pelo apoio no fornecimento e manutenção dos
animais de laboratório.
A todos os funcionários, contratados e estagiários da SAARB do Instituto Evandro
Chagas, pela amizade apoio e incentivo na realização deste trabalho.
Ao Instituto Evandro Chagas por permitir que este trabalho fosse desenvolvido em
seus laboratórios.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnológico (CNPq), pela
concessão da bolsa de estudos.
A Universidade Federal do Pará, em especial ao Programa de Biologia de Agentes
Infecciosos e Parasitários, pela oportunidade de cursar o mestrado em Biologia de Agentes
Infecciosos e Parasitários.
Aos professores do curso de mestrado do programa de Biologia de Agentes
Infecciosos e Parasitários, pelos conhecimentos transmitidos.
À minha turma de mestrado, pela amizade ao longo dos vários meses de disciplinas.
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS
8
RESUMO
9
ABSTRACT
10
1.
INTRODUÇÃO
11
1.1.
CONSIDERAÇÕES GERAIS SOBRE O ARBOVÍRUS
11
1.2.
FAMÍLIA TOGAVIRIDAE
15
1.3.
GÊNERO ALPHAVIRUS
16
1.4.
CONSIDERAÇÕES GERAIS SOBRE O VÍRUS MAYARO
19
1.4.1. Modo de Transmissão
20
1.5.
Breve Histórico e Epidemiologia
20
1.6.
Manifestação Clinica
22
1.7.
Patogenia e Resposta Imunológica
23
1.8.
Diagnóstico, Tratamento e Prevenção
25
1.5.
RELEVÂNCIA DO TRABALHO
27
1.6.
OBJETIVOS
28
1.6.1. Objetivo Geral
28
1.6.2. Objetivos Específicos
28
2.
MATERIAL E METODOS
29
2.1.
AMOSTRAS VIRAIS
29
2.2.
PREPARAÇÃO DO ESTOQUE VIRAL I
30
2.3.
TITULAÇÃO VIRAL EM CELULA VERO
31
2.4.
PREPARAÇÃO DO ESTOQUE VIRAL II
32
2.5.
TITULAÇÃO VIRAL EM CAMUNDONGO
32
2.6.
EXPERIMENTO
33
2.6.1. Critérios de Inclusão e Exclusão de Animais no Experimento
33
2.6.2. Dose Infectante
33
2.6.3. Colheita e Preparação do Material para Análise
33
2.7.
TESTES VIROLÓGICOS
33
2.8.
EXPRESSÃO DE RNA MENSAGEIRO PARA DETECÇÃO DE
CITOCINAS POR TRANSCRIÇÃO REVERSA E REAÇÃO EM CADEIA
MEDIADA PELA POLIMERASE EM TEMPO REAL (RT-qPCR)
USANDO SISTEMA SYBR GREEN
35
2.8.1. Análise da Expressão de mRNA de IL-2, TNF-α e GAPDH
35
2.9.
ANÁLISE ESTATÍSTICA
36
3.
RESULTADOS
37
3.1.
CONFIRMAÇÃO DA INFECÇÃO POR MAYV
37
3.2.
ANÁLISE DA EXPRESSÃO DE mRNA DE IL-2, TNF-α E GAPDH
39
4.
DISCUSSÃO
48
5.
CONCLUSÕES
52
8.
REFERENCIAS BIBLIOGÁFICAS
53
ANEXO 1
59
ANEXO 2
60
ANEXO 3
61
LISTA DE FIGURAS
Figura 1- Ciclo de manutenção dos Arbovírus em natureza --------------------------------
11
Figura 2 - Esquema do genoma dos integrantes da família Togaviridae (Alphavirus) --
16
Figura 3 - Esquema do genoma de RNA dos Alphavirus -----------------------------------
18
Figura 4 – Localização do município de Santa Bárbara no Estado do Pará --------------
29
Figura 5 - Produto de RT-PCR, em gel de agarose a 1,5% corado por SYBR® Safe,
de amostras de camundongos infectados via subcutânea com o MAYV, após 24 horas
de infecção -------------------------------------------------------------------------------------
37
Figura 6 - Produto de RT-PCR, em gel de agarose a 1,5% corado por SYBR® Safe,
de amostras de camundongos infectados via subcutânea com o MAYV, após 48 horas
de infecção -----------------------------------------------------------------------------------------
37
Figura 7 - Produto de RT-PCR, em gel de agarose a 1,5% corado por SYBR® Safe,
de amostras de camundongos infectados via subcutânea com o MAYV, após 72 horas
de infecção ----------------------------------------------------------------------------------------
38
Figura 8 – Curva de amplificação do experimento de RT-qPCR para determinação da
expressão de mRNA das citocinas IL-2, TNF-α e GAPDG (gene endógeno) em
camundongos infectados após 24horas com o MAYV pela via subcutânea nos
fragmentos de cérebro, fígado, rim e músculo esquelético ---------------------------------
40
Figura 9 - Curva padrão da RT-qPCR demonstrando a eficiencia da reação para o
gene GAPDH - ------------------------------------------------------------------------------------
41
Figura 10 - Curva padrão da RT-qPCR demonstrando a eficiencia da reação para o
gene IL-2 -- ----------------------------------------------------------------------------------------
41
Figura 11 - Curva padrão da RT-qPCR demonstrando a eficiencia da reação para o
gene TNF-α ----------------------------------------------------------------------------------------
42
Figura 12 – Curva de dissociação com amplificação do gene endógeno (GAPDH) em
camundongos infectados após 24horas com o MAYV pela via subcutânea nos
fragmentos de cérebro, fígado, rim e músculo esquelético --------------------------------
43
Figura 13 – Curva de dissociação com amplificação do gene da citocina IL-2 em
camundongos infectados após 24horas com o MAYV pela via subcutânea nos
fragmentos de cérebro, fígado, rim e músculo esquelético ---------------------------------
43
Figura 14 – Curva de dissociação com amplificação do gene da citocina TNF-α em
camundongos infectados após 24horas com o MAYV pela via subcutânea nos
fragmentos de cérebro, fígado, rim e músculo esquelético ---------------------------------
44
Figura 15 – Diferença em porcentagem da expressão de gene da IL-2 nos órgãos e
tecido muscular infectados com o MAYV com 48 e 72 horas após infecção ------------
45
Figura 16 – Diferença em porcentagem da expressão de gene da IL-2 nos órgãos e
tecido muscular infectados com o MAYV com 48 e 72 horas após infecção ------------
46
RESUMO
O Mayaro vírus (MAYV) é um vírus considerado endêmico na Amazônia brasileira e
enzoótico na América do Sul onde é amplamente distribuído. Diversos surtos têm sido
descritos ao norte do Brasil e diagnosticado de forma endêmica no Estado do Para. O objetivo
deste trabalho foi analisar a expressão de RNA mensageiro das citocinas IL-2 e TNF-α em
camundongos (Mus musculus) recém-nascidos infectados experimentalmente via subcutânea
com o MAYV. A cepa selecionada foi proveniente de um caso humano de Febre do Mayaro
oriundo do surto ocorrido em fevereiro de 2008, no município de Santa Bárbara, no Estado do
Pará. O vírus foi inoculado na região dorsal dos camundongos com 0,02 mL de suspensão
viral a 10% contendo 10-9,5 DL50/0,02 mL da cepa. Após a infecção experimental, em
intervalos de 24, 48 e 72 horas, três camundongos infectados com a cepa e três camundongos
não infectados (controle negativo) foram anestesiados, eutanasiados e necropsiados, sendo os
fragmentos do cérebro, fígado, rim e músculos esqueléticos extraídos para a análise da
expressão de citocinas por RT-qPCR. Nas análises dos três primeiros dias após infecção,
todos os fragmentos em estudo (cérebro, fígado, rim e músculo esquelético) e em todos os
intervalos de tempo (24, 48 e 72 horas) foram confirmados por RT- PCR com infecção pelo
MAYV. A expressão de mRNA das citocinas IL-2 e TNF-α utilizando a técnica de RT-qPCR
não apresentou variação estatisticamente significativa nos órgãos e tecido muscular
selecionados no intervalo de tempo de 24 horas, no cérebro foi observada redução
significativa de expressão dos genes da IL-2 e TNF-α após 48 horas de infecção; no rim um
aumento de expressão do gene IL-2 após 48 e 72 horas de infecção, porém redução de
expressão do gene TNF-α no mesmo período; o fígado não apresentou variação de expressão
gênica em nenhum dos genes alvo em todos os intervalos de tempo, já o músculo esquelético,
teve aumento significativo de expressão dos genes da IL-2 e TNF-α, após 48 e 72 horas de
infecção, sugerindo que tais citocinas pró-inflamatórias podem ter um papel fundamental na
patogêneses das doença artralgênicas.
Palavra-Chave: Arbovírus; Expressão Gênica; Camundongo como animal de laboratório.
ABSTRACT
Mayaro virus (MAYV) is widely distributed and considered to be endemic in
Brazilian Amazon and enzootic in South America. On this regard, several outbreaks have
been reported in northern Brazil and diagnosed in the state of Pará. The aim of this study was
to analyze the expression of mRNA of IL-2 and TNF-α in newborn mice (Mus musculus) that
were via subcutaneous experimentally infected with MAYV. The strain was selected from a
human case of MAYV fever outbreak in Santa Barbara municipality, State of Pará, Brazil, in
February 2008. The virus was inoculated in the dorsal region of the mice with 0.02 ml of 10%
viral suspension containing 10 to 9.5 LD50/0.02 ml. After experimental inoculation, at
intervals of 24, 48 and 72 hours, three infected and three uninfected mice (negative control)
were anesthetized, sacrificed and necropsied and fragments from brain, liver, kidney, skeletal
muscles were extracted for analysis of cytokine expression by RT-qPCR. In the analyzes of
the first three days after infection, all fragments under study (brain, liver, kidney and skeletal
muscle) and at all time intervals were confirmed to be infected by RT-PCR. The mRNA
expression of IL-2 and TNF-α, using the technique of RT-qPCR, showed no statistically
significant change in those investigated organs within 24 hours post-infection. By the other
hand, it was observed a significant reduction of genes IL-2 and TNF-α at 48 hours after
infection in brain. In kidney extracts, there was an increase in expression of IL-2 after 48 and
72 hours post-infection, but reduced expression of TNF-α at the same period. Regarding liver,
it could not be observed any change in gene expression in any of the target genes at all time
intervals. And finally, skeletal muscle had a significant increase in gene expression of IL-2
and TNF-α after 48 and 72 hours post infection, suggesting that these pro-inflammatory
cytokines may play a key role in the pathogenesis arthrogenic of disease.
Keyword: Arboviruses; Gene Expression; Mouse as a laboratory animal.
11
1. INTRODUÇÃO
1.1. CONSIDERAÇÕES GERAIS SOBRE OS ARBOVÍRUS
O termo arbovírus refere-se a vírus transmitidos por artrópodes e deriva da expressão
inglesa “arthropod borne”, formado pela primeira sílaba de cada palavra acrescida da palavra
vírus. Constituem um grupo heterogêneo de vírus de acordo com suas propriedades físicoquímicas, porém com características epidemiológicas em comum. São considerados arbovírus
os vírus mantidos em natureza através da transmissão biológica entre hospedeiros vertebrados
suscetíveis por artrópodes hematófagos, principalmente mosquitos e carrapatos, ou por
transmissão transovariana e possivelmente venérea em artrópodes (Figura 1) (Levinson &
Jawetz, 2005; Azevedo et al., 2007; Vasconcelos et al., 2009).
Figura 1- Ciclo de manutenção dos Arbovírus em natureza.
Fonte: Adaptado de Azevedo et al., 2007.
A transmissão envolve uma complexa interação entre o vírus, o vetor artrópode e o
hospedeiro vertebrado, determinada por diversos fatores, como a habilidade do vetor de se
tornar infectado e de transmitir o vírus a um hospedeiro vertebrado, dependendo de fatores
genéticos, concentração viral no hospedeiro infectado, ambiente, temperatura e barreiras do
intestino, servindo como vetores de manutenção ou de disseminação, amplificando o vírus
com suas altas taxas de infecções e baixas taxas de transmissão, compensada por sua eclética
variedade alimentar de espécies de hospedeiros vertebrados. Já nos hospedeiros vertebrados, a
12
replicação deve ser suficiente para que os mesmos sirvam de fonte de infecção para os
hospedeiros invertebrados no momento do repasto sanguíneo, garantindo deste modo a
infecção dos vetores artrópodes. Além disso, o tamanho populacional dos vertebrados
suscetíveis é grande o suficiente para promover o contato com outros artrópodes, assim um
único hospedeiro serve como fonte de infecção para muitos artrópodes, tornando-os uma fonte
de amplificação viral em situações epidêmicas (Calisher, 1998; Vasconcelos et al., 2009).
Os vertebrados susceptíveis são infectados ao serem picados por insetos portadores de
arbovírus, os quais são capazes de se multiplicar e produzir viremia nos vertebrados, fase na
qual, novos vetores se infectam ao realizarem o repasto sanguíneo, tornando-se aptos a
infectarem novos hospedeiros vertebrados suscetíveis após um período de incubação
extrínseco, que representa o intervalo decorrido entre a ingestão do sangue e o momento em
que o mosquito é capaz de transmitir o vírus. Este período caracteriza-se pela replicação do
vírus nos tecidos do inseto, inclusive nas glândulas salivares, permanecendo o inseto
infectado por toda a sua existência (Azevedo et al., 2007; Vasconcelos et al., 2009).
Os arbovírus possuem ampla distribuição geográfica, abrangendo todos os continentes,
tanto em regiões tropicais quanto temperadas, com exceção da Antártida, porém com nítida
predominância nas regiões tropicais devido às condições climáticas e ecológicas favoráveis a
manutenção do ciclo viral, que comportam uma maior biodiversidade que favorece a
coexistência de grandes diversidades de vetores e hospedeiros vertebrados em toda época do
ano, diferentemente dos países de clima temperado, no qual o ciclo é interrompido durante a
estação do inverno reiniciando-se durante a primavera ou verão (Dégallier et al., 1990;
Figueiredo, 2007; Vasconcelos et al., 2009).
Atualmente, os arbovírus constituem o maior grupo conhecido de vírus, sendo
registrados 537 tipos diferentes de arbovírus segundo o “International Catalogue of
Arboviruses, Including Certain Other Viruses of Vertebrates”. No Brasil já foram
reconhecidos 210 tipos diferentes de arbovírus, dos quais, 197 foram isolados na Amazônia e
pelo menos 34 deles causam doenças em humanos de forma esporádica, endêmica e/ou
epidêmica, sendo freqüentemente associadas a surtos em seres humanos. As arboviroses
podem constituir importantes problemas de saúde pública e econômico-financeiro em todos os
continentes com exceção da Antártida. São conhecidas mais de 100 espécies de arbovírus por
causarem doenças no homem, 40 deles infectam animais domésticos e, pelo menos, vinte
causam epidemias. Entre os arbovírus conhecidos no Brasil, 37 têm sido incriminados como
causadores de doença humana, dentre estes, cinco destacam-se por estarem associados a
epidemias: Dengue virus, Febre amarela virus, Mayaro virus, Oropouche virus e Rocio.
13
Vírus. Apesar de ser baixo o número de arbovirus com potencial epidêmico, os impactos
sociais e econômicos dos surtos são importantes, os quais têm sido responsáveis por mais de
95% dos casos de arboviroses humanas no Brasil (Karabatson, 1985; Vasconcelos et al.,
1992; Travassos da Rosa et al., 1997; Gubler, 2004; Vasconcelos et al., 2009).
A classificação dos arbovírus pode ser feita de acordo com suas propriedades
antigênicas ou segundo suas características físico-químicas. De acordo com as propriedades
antigênicas, são classificados em grupos antigênicos segundo testes sorológicos como fixação
do complemento (FC), inibição de hemaglutinação (IH) e teste de neutralização (TN), assim
quando dois ou mais vírus apresentam cruzamento sorológico, passam a constituir um grupo
antigênico. Os três primeiros grupos caracterizados foram designados pelas letras: A, B e C, e
os demais receberam nomes do primeiro vírus isolado no respectivo grupo. Com base em suas
propriedades físico-químicas, os arbovírus estão distribuídos em cinco famílias: Bunyaviridae
(gênero Orthobunyavirus e Phebovirus), Flaviviridae (gênero Flavivirus), Reoviridae (gênero
Orbivirus), Rhabdoviridae (gênero Vesiculovirus e Lyssavirus) e Togaviridae (gênero
Alphavirus), ressaltando-se que nem todos os gêneros das citadas famílias são
necessariamente arbovírus. Em geral, recebem o nome conforme a doença que causam (ex.:
Febre amarela virus - FAV) ou de acordo com o lugar onde foram primeiramente isolados
(ex.: Encefalite St. Louis vírus - ESLV) (Casals, 1967; Karabatson, 1985; Vasconcelos et al.,
2009).
Todos arbovírus possuem genoma constituído por ácido ribonucléico (RNA), exceto o
vírus da peste suína africana que possui genoma de ácido dexoribonucléico (DNA). O RNA
dos arbovírus pode ser segmentado ou não e, apresentar-se com uma ou duas fitas
nucleotídicas. Os arbovírus com genomas não segmentados estão incluídos nas famílias
Flaviviridae, Rhabdoviridae e Togaviridae enquanto aqueles com genomas segmentados
incluem-se nas famílias Bunyaviridae e Reoviridae (Quadro 1) (Travassos da Rosa et al.,
1997; Vasconcelos et al., 2009).
A presença do envoltório lipoprotéico (envelope) nos vírus pertencentes às famílias
Rhabdoviridae, Bunyaviridae, Flaviviridae, e Togaviridadae determina a acentuada
sensibilidade aos solventes lipídicos (éter e clorofórmio), e a detergentes (desoxicolato de
sódio) dos membros destes grupos, enquanto que representantes da família Reoviridae, que
não apresentam este envoltório, são pouco sensíveis (ou resistentes) aos mesmos. Em geral, os
arbovírus são lábeis em pH ácido e estáveis em pH alcalino, podendo serem rapidamente
inativados à 56 ºC ou em temperaturas mais elevadas, porém são bem preservados quando
14
mantidos à temperatura de –70 ºC ou, se liofilizados e mantidos à temperatura de – 20 ºC
(Pinheiro et al., 1997; Vasconcelos et al., 2009).
Quadro 1 - Características gerais das famílias com arbovírus segundo algumas características
físíco-químicas.
Fonte: Adaptado de Levinson & Jawetz, 2005.
O quadro clinico das doenças causadas por arbovírus varia de branda até fatal em um
breve período de tempo, sendo a diversidade das manifestações clínicas uma peculiaridade
das arboviroses. Diferentes tipos de arbovírus podem determinar a mesma sintomatologia, ou
determinado tipo de arbovírus pode ocasionar respostas clinicas diferentes. Usualmente são
consideradas quatro formas clínicas principais de arboviroses: doença febril indiferenciada,
doença febril exantemática, febre hemorrágica e encefalites (Azevedo et al., 2007).
Apresentada praticamente por todos os arbovírus patogênicos ao humano, a doença
febril indiferenciada possui período de incubação variando de três a oito dias, entre sinais e
sintomas mais comuns temos febre, calafrios, cefaleia, mialgias, artralgia, tonturas, fotofobia,
dor epigástrica, dor retrorbitária, náuseas, vômitos, astenia, inapetência e congestão
conjuntival. Na doença febril exantemática, além de febre e das manifestações sistêmicas,
observa-se em 80% dos pacientes exantema maculopapular no tronco e membros inferiores e
superiores. A virose se apresenta em curso bifásico, primeiramente com um período febril que
perdura de um a três dias, e a segunda fase com reaparecimento da febre e surgimento do
exantema e artralgias que aparecem com grande intensidade podendo persistir por até quatro
meses. Tais características clinicas são reportadas nas infecções ocasionadas pelos Virus
Chikungunya (CHIKV), Mayaro (MAYV), Oropouche (OROV) e Dengue(DENV). A febre
hemorrágica, os arbovírus responsáveis por tais fenômenos em seres humanos pertencem as
famílias Togaviridae, Flaviviridae e Bunyaviridae, porém no Brasil o vírus da febre amarela e
15
da dengue são os únicos já registrados. As encefalites, a forma mais grave de apresentação
clínica das arboviroses em humanos, podendo levar à morte ou deixar sequelas graves nos
pacientes, são eles arbovírus das famílias Togaviridae, Flaviviridae e Bunyaviridae (Pinheiro
et al., 1997; Travassos da Rosa et al., 1997; Vasconcelos et al., 2009).
Praticamente todos os arbovírus são patogênicos para camundongos neonatos, adultos,
hamsters e cobaias. Porém, animais recém-nascidos são os mais vulneráveis, enquanto que os
animais jovens e adultos, de modo espontâneo ou dependendo do título do inóculo se
sobrepõe a natural resistência do adulto. Porém, quadros lesionais também se instalam de
modo semelhante aos vistos em animais imaturos. Dentre os achados histopatológicos,
destacam-se: lesões de células conjuntivas jovens ou pouco diferenciadas dos interstícios e de
membranas conjuntivas as quais são encontradas em vários órgãos e tecidos, como pulmão,
rim, cório de mucosas, derme, polpa dentária, miocárdio, músculos esqueléticos, pericôndrio e
periósteo; lesões no tecido muscular estriado, com alterações ocorrendo no interstício, onde
há dissociação das fibras musculares por edema intersticial, observam-se ainda detritos
celulares de células conjuntivas necrosadas; pode haver ainda envolvimento simultâneo de
músculo cardíaco e esquelético ou apenas miocardite ou miosite; além de tendinites (Dias,
1986).
1.2. FAMÍLIA TOGAVIRIDAE
A família Togaviridae compreende dois gêneros: os Alphavirus, que possuem 30
espécies de arbovírus do grupo A de acordo com a classificação sorológica (Tabela 1), e os
gêneros Rubivirus, cujo membro não pertencem aos arbovírus (Vasconcelos et al., 2009;
ICTV, 2012).
Estruturalmente, possui diâmetro de aproximadamente 65 a 70 nm e nucleocapsídeo
variando de 35 a 40 nm de diâmetro com simetria icosaédrica (T = 4), composto de doze
capsômeros pentaméricos e 30 hexaméricos para um total de 240 proteínas do capsídeo. Sua
superfície é circundada por envoltório lipoprotéico com dupla camada, onde se observa 80
trímeros de espículas, projeções que variam de 6,5 a 10 nm de comprimento e possuem os
heterodímeros E1 e E2 (Figura 2). Seu genoma é constituído de RNA de fita única, linear, de
polaridade positiva com aproximadamente 11700 nucleotídeos distribuídos por oito genes, os
quais codificam proteínas não estruturais (nsP1 à nsP4) que estão envolvidas na replicação
viral; proteínas estruturais do envoltório (glicoproteinas E1 e E2) e do capsídeo, além de
16
pequenos polipeptídios E3 e 6Ks (Casals & Whitman 1957; Azevedo et al., 2007;
Vasconcelos et al., 2009; Viral Zone, 2010; ICTV, 2012).
Figura 2 - Esquema do genoma dos integrantes da família Togaviridae
(Alphavirus). Fonte: Adaptado de Viralzone, 2010.
1.3. GÊNERO ALPHAVIRUS
Os membros do gênero Alphavirus podem causar uma grande variedade de doenças
em humanos e animais. São causas importantes de doenças encefálicas e artrogênica em seres
humanos , sendo considerados como umas das principais causas de doença debilitante por
artrite no mundo. A capacidade desse grupo de vírus de causar epidemias extensas de
poliartritre e artralgia, associada a sintomas crônicos, tornam a infecção por estes vírus, uma
doença de grande significado socioeconômico. Muitos vírus do Velho Mundo, incluindo o
Ross River (RRV), Barmah Forest, Mayaro, o'nyongnyong, Chikungunya e Sindbis virus
(SINV), apresentam como manifestação clinica a artralgia, enquanto que as encefalites são
causadas pelos vírus do Novo Mundo como Encefalite Eqüina do Oeste virus (WEEV),
Encefalite Eqüina do Leste virus (EEEV) e Encefalite Eqüina Venezuelana virus (VEEV)
(Powers et al., 2001; Herreroa et al., 2011).
Como um gênero, os Alphavirus são amplamente distribuídos por todo o mundo,
habitando todos os continentes, exceto na Antártida, sendo mantidos em ciclos naturais que
envolvem transmissão por um vector artrópode para hospedeiros vertebrados suscetíveis.
Porém, as distribuições geográficas de espécies individuais são prejudicadas devido as
condições ecológicas específicas e restrições de vetor e hospedeiro reservatório, já que as
interações vírus-hospedeiro podem ser altamente específicas, e, por vezes, apenas uma única
espécie de mosquito é utilizada como vector principal, como tem sido relatado para muitos
17
vírus complexos como o Encefalite Equina Venezuelana virus (EEV), limitando assim a
distribuição de muitos Alphavirus (Powers et al., 2001).
Tabela 1: Taxonomia dos vírus da família Togaviridae, gênero Alphavirus, segundo o
Comitê Internacional de Taxonomia Viral (ICTV, 2012).
Família
Gênero
Espécie
Aura vírus
Barmah Forest virus
Bebaru virus
Cabassou virus
Chikungunya virus
Eastern equine encephalitis virus
Everglades virus
Fort Morgan virus
Getah vírus
Highlands J virus
Madariaga virus
Mayaro virus
Middelburg virus
Mosso das Pedras virus (78V3531)
Togaviridae
Alphavirus
Mucambo virus
Ndumu virus
O'nyong-nyong virus
Pixuna virus
Rio Negro virus
Ross River virus
Salmon pancreas disease virus
Semliki Forest virus
Sindbis vírus
Southern elephant seal virus
Tonate virus
Trocara virus
Una virus
Venezuelan equine encephalitis virus
Western equine encephalitis virus
Whataroa virus
18
Seu genoma é constituído de uma monopartícula linear de fita simples com 9,7 a 11,8
kb. Possuem polaridade positiva, sendo, portanto traduzidos a partir do RNA genômico que
serve tanto como genoma como RNA mensageiro. O genoma completo é traduzido em uma
poliproteína não estrutural, que é processada pelas proteases virais e do hospedeiro, e uma
poliproteína estrutural, expressa através de um mRNA subgenômico (Figura 3). Nos
Alphavirus, a poliproteína estrutural possui quatro proteínas: E3, que serve como sequencia de
sinais; E2, proteína transmembrana que transporta epítopos neutralizantes importantes para
neutralização dos anticorpos, além de responsável pela ligação ao receptor; 6K, importante na
montagem da partícula viral e no brotamento, aumentado a infectividade da partícula,
servindo também como peptídeo sinal para proteína E1, que tem a função de peptídeo de
fusão para entrada do vírus na célula hospedeira (Casals & Whitman, 1957; Griffin, 2007;
PiaLoux et al., 2007; Vasconcelos et al., 2009; ViralZone, 2010; ICTV, 2012).
Genoma dos Alphavirus
Não Estrutural
Estrutural
5’ M7G
Mtr
nsP1
Hel
Pro
nsP2
X
nsP3
An 3’
Rep
nsP4
CP E3 E2 6K E1
sgRNA 5’
An 3’
Legenda: Mtr: Metiltransferase; Pro:Protease; HEL: Helicase; X: Função desconhecida; Rep: Replicase.
Figura 3 - Esquema do genoma de RNA dos Alphavirus.
Fonte: Adaptado de ICTV, 2012.
Sorologicamente, os Alphavirus são classificados em 9 complexos antigênicos
(incluindo Alphavirus de peixe) baseados em suas propriedades antigênicas e relacionados
antigenicamente entre si, segundo testes sorológicos, tais como neutralização, fixação do
complemento e inibição da hemaglutinação. Dados de soroprevalência de alphavirus indicam
que eles infectam as pessoas e /ou animais domésticos, porém com manifestações clínicas
desconhecidas ou causam apenas uma doença febril leve. Curiosamente, tal gênero causa
sintomatologias semelhantes sendo mantidos sob diversas condições ecológicas e podendo ter
uma distribuição generalizada. Por exemplo, a infecção Mayaro virus está limitada
geograficamente para a América Latina, enquanto o'nyong-nyong vírus nunca foram
identificados fora da África, no entanto, esses dois vírus causam sinais e sintomas clinicos
19
quase que idênticos Tal padrão epidemiológico incomum visto em vários Alphavirus levanta
questões intrigantes a respeito da relação de evolução de seus membros, a origenm geográfica
do gênero e posterior expansão do gênero e espécie (Casals & Whitman, 1957; Powers et al.,
2001; Lavergne et al., 2005; Griffin, 2007; PiaLoux et al., 2007; ICTV, 2012).
Diversos vírus evoluiram em numerosos mecanismos para inibir a reposta celular
antiviral, e embora a grande maioria interfira em vias de sinalizações celular, os Alphavirus
do Velho Mundo, altamente citopáticos e conhecido por evadir a resposta celular antiviral
induzem a inibição global da transcrição em células vertebradas, mediada pela proteina não
estrutural nsP2. Estes estudos com a proteina nsP2 dos vírus Sindbis, Semliki Forest e
Chikungunya mostram que ela inibir a transcrição celular, independente da atividade de
protease nsP2-associada, através da indução de uma rápida degradação de Rpb1, uma
subunidade catalitica da polimerase II, desempenhando um papel indispensável no bloqueio
da ativação de genes celulares e baixa regulação da resposta celular antiviral (Akhrymuk et
al., 2012).
1.4. CONSIDERAÇÕES GERAIS SOBRE O MAYARO VIRUS
O Mayaro virus (MAYV) é um arbovírus pertencente à família Togaviridae, gênero
Alphavirus, destas, seis espécies podem causar distúrbios nas articulações humanas, são eles:
Chikungunya vírus, O’nyong-nyong virus (África central), Ross River virus e Barmah Forest
virus (Austrália e no Pacífico), Sindbis virus (cosmopolita), e o Mayaro virus (America do Sul
e Guiana Francesa). De acordo com a sorologia, é integrante do grupo A, o complexo
antigênico Semliki Forest, sendo primeiramente relacionado ao Semliki Forest virus (SFV),
porém semelhanças antigênicas com o Chikungunya virus também já foram relatadas (Casals
& Whitman, 1957; Vasconcelos et al., 1992; Lavergne et al., 2005; Griffin, 2007; PiaLoux et
al., 2007; ICTV, 2012).
Análises filogenéticas com diversas cepas desse vírus demonstraram a existência de
dois genótipos altamente conservados: o genótipo D, que contêm vírus com divergência de
nucleotídeos menor do que 6%, representados pelos vírus isolados originalmente em Trinidad
e na América do Sul (Peru, Guiana Francesa, Suriname, Brasil e Bolívia), e o genótipo L, com
vírus isolados originalmente apenas no Brasil, com divergência de nucleotídeos menor que
4%, porém bastante distintos dos vírus do genótipo D, com cerca de 15-19% de divergência
(Powers et al., 2006).
20
1.4.1. Modo de transmissão
Assim como os demais arbovírus, o MAYV é transmitido por artrópodes hematófagos
a hospedeiros vertebrados silvestres, incluindo primatas não humanos, roedores e aves, sendo
os dois últimos considerados como hospedeiros secundários, porém importantes para a
disseminação do vírus. Semelhante ao ciclo da febre amarela silvestre, o ciclo do MAYV
apresenta macacos como hospedeiros primários, considerado também amplificador em
epidemias, devido apresentarem elevada viremia e servirem de fonte de infecção para muitos
mosquitos vetores do gênero Haemagogus, especialmente a espécie Haemagogus
janthinomys, encontrada principalmente nas copas das árvores na floresta e considerada como
reservatório natural do MAYV (Vasconcelos et al., 1992; Gubler, 2002; Coimbra et al., 2007;
Figueiredo, 2007; Vasconcelos et al., 2009).
Alguns autores, sugerem a possibilidade de o MAYV ser transmitido por mosquitos do
gênero Aedes, principalmente as espécies Aedes aegypti e Aedes albopictus, o que
possibilitaria o deslocamento deste vírus para cidades em aves ou viajantes humanos
virêmicos, podendo assim se adaptar a um novo ciclo de transmissão natural que envolveria o
homem como principal hospedeiro. Apesar da quantidade de vírus necessária para infectar o
vetor não ter sido estabelecida, o homem é tido como amplificador na transmissão do MAYV
durante epidemias rurais, por circular com o vírus em quantidade suficiente para
eventualmente infectar os vetores potenciais (Tesh et al., 1999; Coimbra et al., 2007).
A maioria das infecções humanas é esporádica e os ciclos enzoóticos ocorrem em
ambientes silvestres, de modo que as pessoas se infectam ao penetrarem nestas áreas para
executarem atividades dentro ou próximo a florestas. Vários surtos de febre do Mayaro têm
sido notificados na Região Amazônica, geralmente limitados ao interior das florestas ou áreas
rurais próximas a elas (Vasconcelos et al., 1992; Tesh et al., 1999; Torres, 2004; Coimbra et
al., 2007).
1.4.2. Breve histórico e epidemiologia
Os primeiros isolamentos originais do MAYV ocorreram a partir do sangue de cinco
trabalhadores febris, que haviam adentrado áreas florestais em Trinidad & Tobago em 1954.
Após este período, o vírus tem sido identificado como responsável por surtos de doença febril
aguda na região da Amazônia e do Planalto Central do Brasil, bem como na região amazônica
e outros países sul-americanos, sendo recuperado a partir de seres humanos, vertebrados
silvestres e mosquitos no Brasil, Bolívia, Colômbia, Guiana Francesa, Guiana, Peru,
21
Suriname e Venezuela (Anderson et al., 1957; Pinheiro et al., 1981; Talarmin et al., 1988;
Coimbra et al., 2007).
Casos de MAYV também foram descrito em membros da mesma família, após
exposição de um único dia em áreas de floresta semi rural na Venezuela. Além disso,
prevalência de anticorpos para MAYV tem sido encontrada em Costa Rica, Guatemala,
Panamá e América central (Torres, 2004; Figueiredo, 2007).
Considerado enzoótico para a América do Sul e endêmico em áreas rurais, o MAYV, é
considerado um dos arbovírus mais importantes pelo seu poder patogênico aos humanos. No
Brasil, o vírus é endêmico na Região Amazônica, onde pelo menos cinco epidemias já foram
notificadas no Estado do Pará: no rio Guamá (1955); Belterra (1978); Conceição do Araguaia
(1981); Benevides (1994) e em Santa Bárbara (2008) (Causey et al., 1958; Coimbra et al.,
2007; Figueiredo, 2007; Azevedo et al., 2009).
O surto ocorrido em Belterra no ano de 1978, em uma vila rural de plantações de
borracha, foi extensivamente estudado e contribuiu para a primeira descrição detalhada da
epidemiologia do MAYV, onde foi possível isolar o vírus e recuperá-lo de mosquitos da
espécie Haemagogus janthinomys. Durante este estudo, os investigadores encontraram
anticorpos contra MAYV em 1% das aves capturadas e em 27% no soro de sagüis
(Callithrix), indicando que os primatas que vivem em árvores seriam os hospedeiros
vertebrados primários do vírus. Em Benevides (1994), foram registrados dois casos humanos
pelo isolamento viral e nove sorologias positivas por MAC ELISA, indicativas de infecção
recente pelo vírus, além de 16 isolamentos a partir de lotes do mosquito Hg. (Hag.)
janthinomys, que corrobora o papel desse artrópode como principal vetor do MAYV. No
município de Santa Bárbara (2008), 36 pessoas foram confirmadas com IgM para o MAYV
pelo ELISA, das quais 23 (64%) eram moradores de áreas de invasão, 13 (36%) moradores do
município de Belém e Ananindeua, e que haviam visitado a área de invasão por apenas uma
semana. (Pinheiro et al., 1981; Travassos da Rosa et al., 2000; Powers et al., 2006; Azevedo
et al., 2009).
Dois outros surtos foram registrados: em Itarumã/GO, em 1987 e em Peixe/TO, em
1991, com três isolamentos virais e 14 sorologias indicativas de infecção recente pela
presença de anticorpos IgM específicos por MAC ELISA. Anticorpos específicos contra
MAYV também foram encontrados em índios Xavante no Mato Grosso, em três homens que
pescavam em Camapuã/MS e em habitantes das áreas rurais do Estado de Goiás (Travassos
da Rosa et al., 2000; Coimbra et al., 2007).
22
1.4.3. Manifestações Clínicas
As infecções por MAYV nos animais silvestres aparentemente se apresentam como
assintomáticas, devido à ausência de manifestações clínicas perceptíveis. Já em humanos
produzem sintomatologia clínica não específica, cujos quadros febris são similares àqueles
causados por outros arbovírus como Oropouche e Dengue (Vasconcelos et al., 2009).
O MAYV se caracteriza por produzir uma doença febril aguda, não fatal, com
exantema maculopapular, cefaléia frontal, dor epigástrica, mialgias incapacitantes, artralgias
que se manifestam com grande intensidade, afetando punhos, dedos, tornozelos, artelhos e
articulações maiores, obrigando os doentes a permanecer recurvados e imóveis, sintoma este
semelhante ao observado em pacientes infectados com o CHIKV, característica clínica que
originou o nome do vírus, que significa “andar recurvado” no dialeto africano onde é
endêmico (Travasso-da-Rosa et al., 1998; PiaLoux et al., 2007).
Outros sintomas frequentemente observados incluem os calafrios, náuseas, fotofobia,
vertigem e linfonodos aumentados. Tais manifestações clínicas persistem em média de 2 a 7
dias, com exceção da artralgia que pode permanecer por vários meses. Não são observados
sinais hemorrágicos, porém leucopenia com contagem de 2.500 glóbulos brancos/mm3 é
constante, acompanhada de linfocitose moderada. Observam-se ainda níveis séricos de
bilirrubina e da alanina amino trasaminase (ALT) nos limites da normalidade (Torres, 2004;
Levinson & Jawetz, 2005; Vasconcelos et al., 2009).
No Brasil, até o momento, o MAYV, Oropouche e Dengue, são os únicos arbovírus
conhecidos capazes de induzir resposta clínica com quadro febril exantemático. Esse tipo de
manifestação cutânea em casos de febre por MAYV não era relatado na Amazônia brasileira
antes de 1978, quando ocorreu a epidemia em Belterra/PA (1978), o exantema foi observado
em 2/3 dos infectados, sendo mais freqüente no tórax, dorso, braços, pernas e mãos, sendo o
rosto o menos atingido. As lesões surgem em torno do quinto dia e persistem em média por
três dias (Pinheiro et al., 1981; Vasconcelos et al., 2009).
De fato, até o momento, em todos os casos de infecção pelo MAYV, os pacientes se
recuperaram sem sequelas aparentes e nenhum óbito devido a esta doença foi relatado
(Vasconcelos et al., 2009).
23
1.4.4. Patogenia e Resposta Imunológica
Como os demais arbovírus, o MAYV, é intracelular obrigatório, passando por uma
fase extracelular no período inicial da infecção e na ocasião em que são liberados após lise
das células infectadas, sendo a resposta imunológica eficiente contra este agente viral,
composta da integração dos mecanismos da imunidade inata (natural) e da imunidade
adquirida (específica). Os primeiros a realizarem o controle da infecção são os componentes
da imunidade inata, os interferons do tipo I: interferon alfa (IFN-α) e interferon beta (IFN-β),
citocinas produzidas por fagócitos mononucleares e fibroblastos respectivamente, que
estimulam a sua produção para que eles possam agir em células não infectadas, protegendo-as
da infecção viral, inibindo assim a disseminação da partícula viral as células do hospedeiro.
Após os estágios iniciais da infecção, estabelece-se a resposta imune adquirida, iniciada após
o intervalo de tempo necessário para a ativação, proliferação e diferenciação dos linfócitos
reconhecedores dos epítopos virais, das células apresentadoras de antígenos (APC), dos
anticorpos específicos, das citocinas e das moléculas de classe I e II do complexo de
histocompatibilidade principal (MHC). Considerada como uma resposta imunológica
específica pode ser de dois tipos: celular e humoral (Levinson & Jawetz, 2005; Azevedo et
al., 2007).
O sistema imune inato e adaptativo é importante na patogênese da artrite reumatóide
(RA). A presença de células T ativadas e células B, os rearranjo dos seus respectivos
receptores e suas especificidades para os antígenos suporta o papel da resposta adaptativa na
patogênese da artrite reumatóide. No entanto, estudos do papel do sistema imune inato em
modelos experimentais mostram receptores Toll-like (TLR) como sendo crítico para a geração
tanto da imunidade inata como adaptativa. Em resposta aos patógenos, a ativação do sistema
imune inato através de TLRs em macrófagos e células dendríticas (DC) resulta na produção
de citocinas pró-inflamatórias, incluindo o factor de necrose tumoral (TNF-α) e interleucina-1
(IL-2). Essa ativação promove o desenvolvimento da resposta imune adaptativa, envolvendo
Linfócitos T e B, o que contribui para a remoção do estímulo patogênico e resolução da
resposta inflamatória. Apesar do desenvolvimento de uma resposta imune adaptativa, a
expressão de TNF-α e IL-2 persiste e pode diretamente contribuir para a patogênese da artrite
reumatóide (Huang et al., 2007).
O mecanismo que desencadeia as manifestações clínicas e as alterações
imunopatológicas em pacientes com MAYV, ainda não é suficientemente conhecido. Estudos
experimentais demonstram que esse vírus se multiplica inicialmente nos linfonodos regionais
da área do tegumento onde o artrópode infectado fez o repasto sanguíneo. Alcança a corrente
24
sanguínea através dos vasos linfáticos, disseminando-se pelos órgãos e tecidos do hospedeiro.
O MAYV se multiplica nesses locais, sendo lançado novamente na corrente sangüínea,
determinando a viremia que coincide com o período febril. O titulo viral no sangue é elevado
nas primeiras 24 horas após a infecção, porém decrescem rapidamente, sendo rara a detecção
do vírus após as 72 horas de infecção, uma vez que após o período virêmico, o paciente
apresenta elevados títulos de anticorpos neutralizantes que depuram o vírus do organismo
(Pinheiro et al., 1981; Levinson & Jawetz, 2005; Azevedo et al., 2007; Vasconcelos et al.,
2009).
Em alguns casos a infecção pelo MAYV não passa de um quadro febril, onde o
paciente se recupera totalmente, sem sequelas. Outras vezes a infecção progride, com uma
tríade de sintomas: febre, exantema e artralgia, sendo considerada autolimitante, porém uma
doença reumática debilitante. Pesquisas sobre a patogênese da artrite relacionada com
infecções por Alphavirus foram desenvolvidas utilizando ratos como modelo experimental e
Ross River virus (RRV) como indutor da doença, e mostraram o papel dos macrófagos como a
principal causa imunopatológica para o desenvolvimento da doença, sendo encontrado
principalmente nos músculos e articulações. Estudos com primatas não humanos suscetíveis a
infecção pelo vírus Chikungunya também obtiveram os macrófagos como atores centrais
durante as infecções e persistência da doença sendo encontrado principalmente nos órgãos
linfóides, fígado e músculo (Azevedo et al., 2007; Lidbury et al., 2008; Labadie et al., 2010;
Herrero et al., 2011).
Os macrófagos em si não são uma importante fonte de replicação do vírus, mas são a
fonte principal de mediadores da inflamação responsáveis pela produção de uma série de
citocinas pró-inflamatórias importantes na patogênese da artrite reumatóide. Dentre essas
citocinas, destaca-se o TNF-α (fator de necrose tumoral), um mediador inflamatório que em
baixas concentrações aumenta a síntese de linfocinas pelas células T e estimula a produção de
células B, e em altas concentrações é um importante mediador do choque tóxico induzido por
endotoxinas contribuindo para doença inflamatória, encontrado em níveis elevados em ambos
os trabalhos mencionados (Levinson & Jawetz, 2005; Azevedo et al., 2007; Lidbury et al.,
2008; Herrero et al., 2011).
Estudos apontam que a prevalência da imunidade contra o MAYV aumenta com a
idade, e as taxas em comunidades rurais na região Amazônica aumentam de 10% para 60%.
Estudos têm mostrado que em diversas tribos indígenas na Amazônia, cerca de 20% a 47% da
população, apresentaram imunidade ao MAYV. Porém, apesar das taxas elevadas de
anticorpos na população, é extremamente difícil isolar o vírus, uma vez que o período de
25
viremia é muito curto (2-3 dias), durante o qual é normalmente improvável a suspeita do
MAYV como agente causador da doença (Pinheiro et al., 1981; Vasconcelos et al., 1992).
1.4.5. Diagnóstico, tratamento e prevenção.
O diagnóstico clínico da infecção pelo MAYV é difícil devido à natureza não
específica da doença e a presença de outros vírus, como o Dengue virus, que comumente
produz manifestação clínica similar, especialmente nos trópicos (Vasconcelos et al., 2009).
Aliado a este fator, a ausência de um método diagnóstico simples para a detecção
rápida das infecções agudas ainda durante os estágios iniciais da doença, dificulta a avaliação
do potencial de uma epidemia e a implementação de medidas de controle adequadas, como o
controle do mosquito. Neste sentido, o diagnóstico virológico moderno tem como
característica importante o uso de vários métodos para detecção da infecção viral, sendo de
grande importância para a saúde pública, pois auxiliam no diagnóstico de pacientes e no
monitoramento da virose nas diferentes regiões do país (Vasconcelos et al., 2009).
Ensaios convencionais para detecção da infecção incluem o isolamento do vírus pela
inoculação viral em culturas celulares ou camundongos recém-nascidos, considerado como
padrão ouro, testes sorológicos para detecção de anticorpos específicos IgM ou soro
conversão de IgG, e amplificação do RNA viral (Azevedo et al., 2007).
No método de isolamento em cultura celular, uma grande variedade de cultivos
celulares tem sido utilizada, onde se observa a multiplicação viral mediante a evidência de
efeito citopático ou de formação de placas sob camada de ágar, pela inoculação de material
infectado com o vírus (sangue total ou soro) de pacientes com até 3 dias de doença em
culturas celulares. Dentre as linhagens celulares continuas que apresentam sensibilidade a um
grande número de arbovírus estão às células Vero (obtidas a partir de rim de macaco verde
africano, Cercopithecus aethiops), BHK-21 (obtidas a partir rim de hamster neonato), LLCMK2 (obtidas a partir rim de macaco do gênero Rhesus) e as células de artrópodes Aedes
pseudoscutellaris (AP61) e Aedes albopictus (clone C6/36). A confirmação do isolamento
viral em culturas celulares é feita por teste de imunofluorescência indireta (Azevedo et al.,
2007; Vasconcelos et al., 2009)
Quanto aos métodos sorológicos, os testes de Inibição da Hemaglutinina (IH) e ELISA
são os mais empregados. A IH por ser uma técnica sensível, rápida e de fácil execução é
recomendada na rotina laboratorial, principalmente nos estudos soro-epidemiológicos, devido
à longa persistência dos anticorpos inibidores da hemaglutinação após a infecção, permitindo
26
diferenciar entre infecções primária e secundária. Entretanto, a confirmação do diagnóstico
exige amostras de soros pareadas, colhidas na fase aguda e de convalescença da doença, as
quais, nem sempre são de fácil obtenção. O teste de ELISA, utilizado para detecção de IgM
específica, tem a vantagem de identificar infecção atual ou recente; ou a detecção de
antígenos, técnica que apresenta alta sensibilidade, rápida e de fácil execução, porém deve ser
utilizada apenas em amostras de soro obtidas a partir do 5º dia de doença (Wang et al., 2006;
Vasconcelos et al., 2009).
O desenvolvimento de técnicas moleculares permitiu a detecção de seqüências
específicas do genoma viral, eliminando assim alguns dos problemas encontrados na
utilização de métodos sorológicos como, sensibilidade, especificidade e tempo, sendo este de
grande importância em situações epidêmicas. Os métodos são baseados na RT-PCR,
transcrição reversa do RNA em DNA, seguida de um ensaio de amplificação da seqüência do
DNA viral, um método mais rápido e sensível para detecção do MAYV, além do que a
sequencia nucleotídica amplificada poderá ser utilizada em estudo filogenéticos,
possibilitando a diferenciação entre os genótipos existentes, a determinação da origem
evolutiva desse vírus e sua relação geográfica com o país e com o mundo (Wang et al., 2006;
Azevedo et al., 2007; Vasconcelos et al., 2009).
O tratamento para infecções pelo MAYV, assim como nas demais arboviroses, se
limita a manutenção do estado geral do doente; as medidas irão dar suporte para a manutenção
das funções vitais do paciente, que deve, sobretudo, observar repouso e fazer uso de
terapêutica sintomática quando necessário (Wang et al., 2006; Azevedo et al., 2007).
Com relação às medidas de controle da doença, a febre do Mayaro não dispõe de
medidas profiláticas coletivas que possam ser aplicadas, pois o vírus apresenta dispersão
apenas em áreas rurais ou de floresta, sendo as medidas de controle individuais as que podem
impedir a picada do vetor infectado, dentre as quais, uso de mosqueteiros, roupas longas e
grossas e repelentes, principalmente nos membros inferiores, durante o trabalho em áreas de
floresta, haja vista que o vetor principal Hg janthinomys tem hábitos silvestre e preferências
por essas partes do corpo (Wang et al., 2006; Azevedo et al., 2007; Vasconcelos et al., 2009).
27
1.5. RELEVÂNCIA DO TRABALHO
O Mayaro virus é um vírus considerado endêmico na Amazônia brasileira e enzoótico
para América do Sul onde é amplamente distribuído. No Brasil, o MAYV possui um alto
potencial para tornar-se um importante problema de saúde pública nos próximos anos,
considerando as recentes mudanças demográficas e o uso desordenado da terra com mais
pessoas entrando em contato com áreas de floresta para o trabalho e recreação, possibilitando
a alteração e o aumento assim da frequência desta doença na população. A maioria das
infecções humanas é esporádica e os ciclos enzoóticos ocorrem em ambientes silvestres,
sendo o principal vetor, mosquitos do gênero Haemagogus, especialmente a espécie
Haemagogus janthinomys, reportada como reservatório natural do vírus. Em animais
silvestres, as infecções apresentam-se como assintomáticas, devido à ausência de
manifestações clinicas perceptíveis, já em humanos produzem sintomatologia clínica não
especifica, cujos quadros são similares aqueles causados por outros arbovírus, geralmente
com quadro clínico febril não fatal, sendo consideradas auto limitantes, porém uma doença
reumática debilitante caracterizada por mialgias incapacitante e artralgias, que se manifestam
com grande intensidade obrigando os doentes a permanecerem recurvados e imóveis. Tais
manifestações clínicas persistem em média de 2 a 7 dias, com exceção da artralgia que pode
permanecer por vários meses (Tesh et al., 1999; Vasconcelos et al., 2009).
Considerando a importância desse vírus devido a sua ampla distribuição na região,
onde nos últimos anos alguns surtos já foram diagnosticados no Estado do Pará de forma
endêmica e por sua capacidade de incapacitar temporariamente muitos doentes, o MAYV
levanta a necessidade de uma vigilância como parte de programas efetivos de controle, capaz
de detectar os primeiros casos dessa arbovirose emergente e diagnóstico laboratorial rápido de
casos suspeitos, seguido de medidas de controle e estudos detalhados acerca da
imunopatogenicidade desse agente viral causada pela infecção, correlacionando-as com a
severidade da doença. Portanto, o estudo se justifica pela importância de se conhecer melhor a
patogenia da doença, com ênfase na resposta imunológica do doente por meio da expressão de
RNA mensageiro IL-2 e TNF-α, citocinas pro-inflamatórias importantes na patogênese da
artrite reumatóide, utilizando-se para isso, um modelo experimental animal (Dias, 1986; Tesh
et al., 1999; Gubler, 2002; Huang et al., 2007; Azevedo et al., 2009; Vasconcelos et al.,
2009).
28
1.6. OBJETIVOS
1.6.1. Objetivo geral
 Analisar a expressão de RNA mensageiro das citocinas IL-2 e TNF-α em
camundongos (Mus musculus) recém-nascidos infectados experimentalmente via
subcutânea com o MAYV.
1.6.2. Objetivos específicos:
 Determinar a expressão de genes de IL-2 e TNF-α no cérebro, fígado, rim e
músculo
esquelético
de
camundongos
recém-nascidos
infectados
experimentalmente com MAYV;
 Verificar a presença do VMAY no cérebro, fígado, rim e músculo esquelético de
camundongos recém-nascidos infectados experimentalmente com MAYV;
 Correlacionar a expressão dos genes das citocinas com a presença do vírus no
cérebro, fígado, rim e músculo esquelético de camundongos recém-nascidos
infectados experimentalmente com MAYV.
29
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1. AMOSTRA VIRAIL
O espécime viral foi cedido do acervo de isolamentos virais da Seção de
Arbovirologia e Febres Hemorrágicas (SEARB) do Instituto Evandro Chagas (IEC). A cepa
selecionada é proveniente de um caso humano de Febre do Mayaro oriundo do surto ocorrido
em fevereiro de 2008, no município de Santa Bárbara, no Estado do Pará (Fig. 4). Para que
fosse utilizado este isolado no presente estudo foi realizada a solicitação de autorização para
utilização da cepa viral à direção do IEC, bem como anuência do chefe da seção SEARB
conforme orientação do Comitê de Ética em Pesquisa dessa instituição (Anexo 1 e 2). Sendo
posteriormente submetido e aprovado no Comitê de Ética em pesquisa com animais (CEPAN)
do IEC (Anexo 3).
A
B
C
Figura 4: Localização do município de Santa Bárbara no Estado do Pará.
A) localização do Estado do Pará, Norte do Brasil. B) Localização de
Belém, capital do Estado do Pará. C) localização do município de Santa
Bárbara/PA e municípios vizinhos na região metropolitana de Belém e ao
longo da PA-391, rodovia de acesso ao município. (Fonte: adaptado de
Azevedo et al., 2009).
30
O isolado selecionado (SBA91 H743921) foi coletado de um caso de febre do Mayaro
com complicação diagnosticado pelo IEC e oriundo de um paciente do gênero feminino, com
52 anos, agricultora e residente em um assentamento no município de Santa Barbara (PA). A
paciente desenvolveu um quadro clinico de febre alta, cefaléia, artralgia, calafrios, dor ocular,
mialgia e edema nas mãos, joelhos e pés.
2.2. PREPARAÇÃO DO ESTOQUE VIRAL I
O vírus SBA91 H743921 usado neste estudo foi inoculado pela via intracerebral em
camundongos albinos suíços recém-nascidos para tentativas de um novo isolamento e
preparação de estoque viral. Os camundongos foram cedidos pela Seção de Criação e
Produção de Animais (SACPA/IEC/SVS/MS), sendo distribuídos em número de seis animais
em cada microisolador (gaiolas) de acrílico com tampa de aço cromado, em racks de
exaustão, com fornecimento de ração balanceada e água à vontade. Os animais foram
mantidos no infectório NBA-3 em ambiente refrigerado, temperatura aproximada de 25ºC (±
3ºC) acompanhados de uma fêmea recentemente parida. Todos os procedimentos com os
animais foram realizados por ou sob orientação de veterinário.
Para compor o estoque viral da amostra, foi preparada uma suspensão a 10%, na
proporção de 1:10 em solução salina tamponada com fosfato (PBS) pH 7.2 contendo
albumina bovina a 0,75%, estreptomicina (100 g/mL) e penicilina (100 UI/mL), a partir da
alíquota do sangue do indivíduo com a cepa selecionada para o estudo e inoculados via
intracerebral (i.c.) em camundongos suíços albinos recém-nascidos (1 a 2 dia de idade). Esses
animais foram inoculados com 0,02 mL das respectivas suspensões utilizando agulhas 13 x
4,5 mm e seringas hipodérmica de 1 mL. Para inoculação foi usada contenção física, sendo
neste momento os animais foram seguros pela cabeça com o dedo indicador e polegar, tendo o
resto do corpo apoiado nos outros dedos.
Para esta etapa foram utilizadas três gaiolas contendo cada uma seis recém-nascidos.
Os animais infectados foram observados diariamente em intervalos de, aproximadamente, 12
horas e quando apresentaram sinais de doença (dificuldade de alimentação, falta de
coordenação motora, tremores, hipodesenvolvimento e hipoatividade) foram retirados das
respectivas gaiolas, eutanasiados a partir do método físico “deslocamento cervical” conforme
recomendação do Manual Para Técnicos em Bioterismo do COBEA (De Luca at al., 1996;
Mezadri et al., 2004), o qual refere que esse “é o método mais simples e humanitário adotado
31
para eutanásia de camundongos e cobaias”. Em seguida foram identificados e congelados à 70ºC para compor o estoque viral que seriam utilizados nos experimentos.
2.3. TITULAÇÃO VIRAL EM CÉLULA VERO
Neste trabalho foi utilizada uma linhagem celular de células Vero, provenientes do rim
do macaco verde africano Cercopithecus aethiops. A linhagem celular foi mantida em estufa
(NAPCO) à 37ºC com 5% CO2, em microplacas de 6 poços de cultura com meio de
manutenção 199 suplementado com 2% de soro bovino fetal e antibiótico (100 UI/mL de
penicilina e 100 µl/mL de streptomicina). Quando as células formavam uma monocamada
eram consideradas prontas para serem utilizadas nos experimentos ou para a sua manutenção,
realizada primeiramente com a assepsia rigorosa da sala de cultura, passando-se álcool a 70 %
em todos os materiais a serem utilizados no fluxo laminar. A técnica utilizada na preparação
das microplacas para o experimento foi a da tripsinização. Após a observação da
monocamada celular em microscópio invertido (Zeiss modelo Axiovert S100) com objetiva
de 20 X, retirou-se o meio de cultura da mesma, e a camada celular foi então lavada
rapidamente com tripsina (2 mL), para retirar o excesso de soro. Em seguida, foi adicionado
0,5 mL de tripsina à 0,25 % sobre as células, para desprendê-las da garrafa, e 5 mL meio 199
de manutenção. Após homogeneização mecânica utilizando pipeta automática, a suspensão
obtida foi distribuída em outras microplacas na proporção de 1:3 para manutenção, sendo
complementadas com meio de manutenção 199, incubadas em estufa a 37ºC até o momento
de serem utilizadas ou passadas novamente.
A titulação viral foi realizada partindo-se de uma suspensão de cérebro de
camundongo estoque infectado com o vírus do estudo. Os camundongos tiveram seus
cérebros retirados e macerados em gral e pestilo, e acrescido de PBS (1,8 mL por cérebro)
contendo albumina bovina a 0,75 % e os antibióticos penicilina (100 UI/mL) e estreptomicina
-1
-6
(100 μg/mL), nas diluições de 10 a 10 , respectivamente, em meio de manutenção 199.
Foram utilizadas microplacas com seis poços com culturas subconfluentes de células Vero.
Desprezou-se o meio de cultura das placas e em seguida foi inoculado em cada poço 0,1 ml de
suspensão viral, em duplicata, para cada diluição, para o controle do teste alguns poços
ficaram apenas com o meio de cultura de manutenção para o testemunho de células não
infectadas. As placas foram então incubadas em estufa de CO 2 (5%) durante 60 minutos a 37
°C (período de adsorção viral). Após esse período, foi desprezado o meio e adicionado em
cada poço 3 ml de Carboximetilcelulose (CMC) à 3% e incubado na estufa de CO2 por 7 dias,
32
sendo então fixadas com adição de 3 ml de formol à 10% em cada poço por 60 minutos . As
placas foram lavadas em água corrente e coradas com 3 ml de cristal violeta durante a noite e
posteriormente lavadas em água corrente. Com base no número de placas formadas pelo vírus,
considerado como positivo o efeito citopatológico (ECP) característico em células Vero, o
titulo viral foi calculado pelo método de Reed & Muench (1938), onde é expresso em
unidades formadoras de placas por mililitro (pfu/ml), conforme fórmula abaixo.
T=nxf/i
- n é a soma dos números de placas virais contadas nos poços em que se inocularam
diluições que resultaram num número contável de placas.
- f é o factor relativo à menor diluição que contribuiu para o valor n
- i é a soma dos volumes (em ml) dos inóculos virais aplicados nos poços em que se
contaram placas.
2.4. PREPARAÇÃO DO ESTOQUE VIRAL II
Com a informação do título do vírus em estudo de 3,7 x 107 pfu/mL, obtido a partir da
titulação do estoque viral I, realizou-se um novo estoque viral a partir do estoque viral I,
através da inoculação via intracerebral (i.c) de 0,02mL de suspensão de cérebro de
camundongo a 10% infectados com o vírus do estudo, em camundongos albinos suíços
recém-nascidos. Foram utilizadas três gaiolas contendo cada uma seis recém-nascidos, sendo
os mesmos eutanasiados após serem observados sinais de doença e identificados e congelados
à -70ºC. Também foram utilizadas três gaiolas contendo cada uma seis recém-nascidos não
infectados, os quais foram eutanasiados, identificados e congelados à -70ºC, com o mesmo
tempo de vida dos animais infectados para servirem de controle negativo no presente estudo.
2.5. TITULAÇÃO VIRAL EM CAMUNDONGO
A titulação viral foi realizada partindo-se de uma suspensão de cérebro de
camundongo estoque viral II, nas diluições seriadas de 10-1 a 10-8. Cada diluição no volume
de 0,02 ml foi inoculada por via i.c., em camundongos albinos suínos recém-nascidos (2 dia
de vida) sendo as informações com relação a doença, morte e coleta armazenadas e um cartão
de inoculação. O título foi calculado pelo método de Reed e Muench (1938) e expresso em
DL50/0,02 mL, que representa a dose letal mediana (dose capaz de matar 50 % dos
camundongos infectados).
33
2.6. EXPERIMENTO
2.6.1. Critérios de Inclusão e Exclusão de Animais no Experimento
Foram incluídos no experimento todos os camundongos suíços albinos recém-nascidos
com 1 a 2 dias de vida sadios (controle negativo) e susceptíveis a infecção (grupo infectado).
Foram excluídos do experimento todos os camundongos suíços albinos que não
estavam entre a faixa-etária pré-estabelecida para o grupo recém-nascidos. Após a infecção
foram excluídos todos os animais que não foram susceptíveis a infecção e ou foram a óbito
antes de eutanasiados.
2.6.2. Dose Infectante
O vírus foi inoculado na região dorsal de camundongos recém-nascidos, via
subcutânea (s.c.) com 0,02mL de suspensão viral a 10% contendo 10-9,5 DL50/0,02 mL da
cepa SBA91 H743921. Para comparar a infecção com a cepa do vírus SBA91, foi inoculado
na região dorsal de camundongos recém-nascidos, via subcutânea (s.c.) com 0,02mL de
suspensão viral da cepa protótipo (AR20290) a 10% contendo 10-9,4 DL50/0,02 mL. Os
animais foram observados diariamente e examinados para presença de sinais e/ou sintomas
característicos de infecção (dificuldade de alimentação, falta de coordenação motora,
tremores, hipodesenvolvimento e hipoatividade), anotados nos cartões de inoculação.
2.6.3. Colheita e Preparação do Material para Análise
Após a infecção experimental, diariamente, em intervalos de 24, 48 e 72 horas, três
camundongos recém-nascidos infectados com a cepa em estudo, três camundongos infectados
com a cepa do protótipo do MAYV (controle positivo) e três camundongos não infectados
(controle negativo) foram anestesiados e eutanasiados. Constatada a morte, todos os animais
foram necropsiados, sendo os fragmentos dos órgãos (cérebro, coração, fígado, rim, baço e
músculos esqueléticos) extraídos e preservados à -70 °C, até o momento de uso.
2.7. TESTES VIROLÓGICOS
Os fragmentos do cérebro, coração, fígado, rim, baço e músculo esquelético de todos os
camundongos recém-nascidos infectados e controle negativo foram submetidos à técnica de RTPCR (Transcrição Reversa seguida da Reação em cadeia mediada pela polimerase) para
confirmação da infecção pelo MAYV. Primeiramente foi utilizado o Kit Viral Pure LinkTM
34
(Invitrogen) para a extração do RNA viral, seguindo as orientações do fabricante como a seguir:
Em um tubo de microcentrífuga (1,5 ml), adicionou-se 25 µl de proteinase K, 200 µl de tampão
de lise e 200 µl da amostra previamente macerada, sendo então incubado à 56ºC por 15 minutos
e adicionado 250 µl de etanol (96-100%). O lisado foi incubado novamente por 5 minutos à
temperatura ambiente e transferido para coluna e centrifugado a 8.000 rpm por 1 minuto. Após
essa etapa o tubo coletor foi descartado e adicionado 500 µl de tampão de lavagem (Wash
Buffer) e centrifugado a 8.000 rpm por 1 minuto, sendo esta etapa de lavagem repetida duas
vezes. Finalmente a coluna foi centrifugada a velocidade máxima (14.000 rpm) por 1 minuto e
transferida para um tubo de microcentrífuga (1,5 ml) onde foi adicionado 50 µl de água livre de
nuclease, posteriormente incubada por 1 minuto em temperatura ambiente e centrifugada a
velocidade máxima por 1 minuto.O RNA extraído foi identificado e estocado à –70 °C até o
momento do uso.
Após a extração do RNA, foi gerado pela reação de transcrição reversa do RNA a
síntese de DNA complementar (cDNA) em duas etapas, utilizando-se para isso,
oligonucleotídeos iniciadores específicos e iScript ™ cDNASíntese kit (Promega), seguindo
as instrunções do fabricante. Primeiramente, 1 µl de RNA total, 1 µl de primer reverso e 5 µl
de água livre de DNAse, foi desnaturado à 65 °C por 5 min. O RNA foi homogenizado a uma
mistura previamente preparada, contendo 4 µl buffer RT (5x), 2 µl DTT, 1 µl RNAseout e 1
µl Superscrit II, obtendo-se assim um volume final de 20 µL para a sintese do cDNA.
O cDNA obtido na reação de transcrição reversa do RNA foi utilizado na reação da
PCR segundo informações do fabricante seguindo os seguintes parâmetros: desnaturação
inicial à 95 ºC por 5 min, 45 ciclos com desnaturação à 95 ºC por 30 segundos, hibridização à
55 ºC por 30 segundos e extensão à 68 ºC por 1 minuto. A etapa de extensão final foi
realizada à 68 ºC por 5 minutos. O volume final da reação foi de 50 µl contendo 5 µl tampão
buffer (10x); 1,5 µl MgCl2; 1 µl dNTP; 1 µl Taq. Platinum; 32,5 µl água livre de nuclease; 1
µl de iniciadores senso e complementar e 5 µl de cDNA. Os oligonucleotídeos iniciadores
específicos utilizados tanto para a obtenção do cDNA como do PCR estão descritos no quadro
abaixo (Pfeffer et al., 1997; Bronzoni et al., 2004).
Quadro 2- Oligonucleotídeos iniciadores usados na reação de RT-PCR.
Oligonucleotídeos
M2W
M3W
Seqüência
5’-YAGAGCDTTTTCGCAYSTRGCHW-3’
5’-ACATRAANKGNGTNGTRTCRAANCCDAYCC -3’
Tamanho (pb)
434
35
Os produtos da RT-PCR foram então submetidos à eletroforese horizontal em gel de
agarose à 1,5% usando SYBR SAFE (Invitrogen), sendo visualizados e analisados em um
transiluminador com luz UV (Vilber Lourmat, EUA).
2.8. EXPRESSÃO DE RNA MENSAGEIRO PARA DETECÇÃO DE CITOCINAS POR
TRANSCRIÇÃO REVERSA E REAÇÃO EM CADEIA MEDIADA PELA
POLIMERASE EM TEMPO REAL (RT-qPCR) USANDO SISTEMA SYBR
GREEN.
2.8.1. Análise da Expressão de mRNA de IL-2, TNF-α e GAPDH.
A expressão de RNA mensageiro que codifica as IL-2 e TNF-α foi realizada pela
técnica de Transcrição Reversa e Reação em Cadeia mediada pela Polimerase em Tempo Real
(RT-qPCR) pelo método de SYBR Green. Tal técnica é capaz de monitorar o progresso da
PCR e coletar seus dados enquanto ela progride. Para isso, utiliza o momento do ciclo da
reação no qual a amplificação do alvo é detectada pela primeira vez, assim quanto mais alto o
número de cópias iniciais do ácido nucléico alvo, mais rápido será observado o aumento
significativo na fluorescência, que será detectada pelo sistema do corante SYBR Green que
possui ligação altamente específica ao DNA dupla-fita formado durante a reação, tendo como
resultado, o aumento na intensidade da fluorescência proporcional à quantidade de produto
gerado pela PCR (Peirson et al., 2003).
A quantificação relativa das citocinas por RT-qPCR foi realizada pelo Sistema de
Detecção de ViiA™ 7 system Real-Time PCR (Applied Biosystem). Utilizando-se o
EXPRESS SYBR® GreenER™ qPCR SuperMix Kits (Applied Biosystem). Foram
selecionados quatro fragmentos dos seis extraídos dos camundongos recém-nascidos
infectados pela via subcutânea com a cepa SBA91 H743921 e do grupo controle não
infectado, dentre os quais estão o cérebro, fígado, rim e músculo esquelético. A exclusão dos
fragmentos do coração e baço ocorreu devido a pouca quantidade de RNA obtido na extração
e confirmado pelo método de quantificação de RNA fluorométrica, usando o equipamento
Qubit® (Invitrogen).
A PCR foi realizada em um volume de 10 μl contendo 2 µl do DNA (100 ng); 5 μl
Super Mix with premixed Rox; 1μl de iniciadores de cada primer gene-específico senso e
complementa; 0,25 μl One-step SybrGreenER e 0,75 μl de água livre de nuclease, seguindo os
seguintes parâmetros: desnaturação inicial à 50 °C por 5 minutos, 95 °C por 10 minutos
36
seguidos de 40 ciclos de desnaturação à 95 °C por 15 segundos, hibridização à 60 °C por 1
minuto. A etapa final foi a de obtenção de uma curva melt para os produtos de PCR para
determinar a especificidade da amplificação. A quantificação da expressão gênica de citocinas
por PCR em tempo real foi realizada, conforme detalhado por Peirson et al. (2003). Os pares
de primers utilizados seguem abaixo.
Quadro 3 - Primer usados na reação de RT-PCR em Tempo Real para a determinação
da expressão de citocinas.
Gene Alvo
GAPDH*
IL-2p40**
TNF-α***
Primer
F - 5’ CGA CTT CAA CAGCAA CTC CAC TC 3’
R – 5’ CAC CCT GTT GCT GTA GCC CGT ATT C 3’
F - 5’ CCC AAG CAG GCC ACA GAA TTG AAA 3’
R - 5’ AGT CAA ATC CAG AAC ATG CCG CAG 3’
F - 5’ ATC TTC TCA AAA TTC GAG TGA CAA 3’
R - 5’ TGG GAG TAG ACA AGG TAC AAC CC 3’
Tamanho do
amplicon (pb)
278pb
81 pb
174 pb
*Sequencia de primer descrita por Bordignon et al., 2008.
** Sequencia de primer descrita por Cezario et al., 2011.
***Sequencia de primer descrita por Yamaguchi et al., 2007.
Esta expressão foi determinada em amostras de cérebro, fígado, rim e músculo
esquelético de camundongos recém-nascidos infectados experimentalmente com MAYV e
não infectados (controle negativo), com o objetivo de determinar a expressão das citocinas de
interesse, nos diferentes órgãos e tecido desses animais. Para isso, um ensaio de quantificação
relativa foi utilizado para analisar alterações na expressão gênica destes alvos. O método de
cálculo utilizado para a quantificação foi o método de CT comparativo, também referido
como ∆∆Ct e determinado pela fórmula: ∆Ct = Ct (gene alvo) – Ct (gene endógeno). O gene
da GAPDH foi utilizado como controle endógeno para verificar a integridade dos cDNAs e
padronizar as concentrações iniciais de cDNA de todas as amostras, uma vez que, é expresso
de forma constitutiva em todas as células.
2.9. ANÁLISE ESTATÍSTICA
Para as análises estatísticas foi utilizado o programa GraphPad Prism versão 5.0
(GraphPad Software, San Diego, Califórnia, USA). As diferenças estatíst k bicas entre os
grupos experimentais foram determinadas através da Análise de Variância (ANOVA), seguida
pelo método pós-teste (Bonferroni, ou Student t Test). Foram consideradas diferenças
estatisticamente significante quando p<0,05.
37
3. RESULTADOS
3.1. CONFIRMAÇÃO DA INFECÇÃO POR MAYV
No presente estudo, camundongos recém-nascidos (Mus musculus) foram inoculados
via subcutânea com a cepa SBA91 H774173 juntamente com o controle positivo (Protótipo
AR20290) e negativo, onde foram observados diariamente, por um período de três dias, em
intervalos de 24, 48 e 72 horas, sendo utilizado o método de RT-PCR para a confirmação da
infecção pelo MAYV. Nas imagens obtidas com a eletroforese, foi possível observar a
presença de amostras positivas em todos os fragmentos em estudo e em todos os intervalos de
tempo, mostrando que o MAYV circula por uma grande variedade de órgão e tecidos em um
curto período de tempo (Figura 5, 6 e 7).
1 2 3 4 5
1
2
3 4
6 7 8 9 10
5 6 7
8 9 10
Figura 5- Produto de RT-PCR, em gel
de agarose a 1,5% corado por SYBR®
Safe, de amostras de camundongos
infectados via s.c. com MAYV, após 24
horas de infecção: Faixa 1: Cérebro;
Faixa 2: Coração; Faixa 3: Fígado;
Faixa 4: Rim; Faixa 5: Baço; Faixa
6:Músculo esquelético; Faixa 7:
Controle positivo (Cérebro do Protótipo
do MAYV); Faixa 8: Controle Negativo
(Cérebro camundongo não infectado
24h); Faixa 9: Controle Negativo
(água); Faixa 10: Peso Molecular (100
pb DNA Ladder).
Figura 6 - Produto de RT-PCR, em gel
de agarose a 1,5% corado por SYBR®
Safe, de amostras de camundongos
infectados via s.c. com MAYV, após 48
horas de infecção: Faixa 1: Cérebro;
Faixa 2: Coração; Faixa 3: Fígado;
Faixa 4: Rim; Faixa 5: Baço; Faixa
6:Músculo esquelético; Faixa 7:
Controle positivo (Cérebro do Protótipo
do MAYV); Faixa 8: Controle Negativo
(Cérebro camundongo não infectado
48h); Faixa 9: Controle Negativo : água;
Faixa 10: Peso Molecular (100 pb DNA
Ladder).
38
1
2
3
4 5
6
7 8
9 10
Figura 7 - Produto de RT-PCR, em gel
de agarose a 1,5% corado por SYBR®
Safe, de amostras de camundongos
infectados via s.c. com MAYV, após 72
horas de infecção: Faixa 1: Cérebro;
Faixa 2: Coração; Faixa 3: Fígado;
Faixa 4: Rim; Faixa 5: Baço; Faixa
6:Músculo esquelético; Faixa 7:
Controle positivo (Cérebro do Protótipo
do MAYV); Faixa 8: Controle Negativo
(Cérebro camundongo não infectado
72h); Faixa 9: Controle Negativo :
água; Faixa 10: Peso Molecular (100 pb
DNA Ladder).
O quadro 4 apresenta a síntese da análise das amostras biológicas dos camundongos
inoculados com os isolados do MAYV para a amostra em estudo (SBA91), o controle
positivo (AR 20290) e controle negativo (camundongos não infectados). Os animais foram
diariamente observados e examinados para presença de sinais e sintomas característicos da
infecção pelo MAYV, classificados como presença ou ausência de sinais de distúrbios
neuromotores
como
dificuldade
de
alimentação,
tremores,
hipodesenvolvimento,
hipoatividade e dificuldade de locomoção principalmente com as patas traseiras, sendo
observados 24 horas após infecção nos animais do controle positivo e 48 horas após infecção
nos animais infectados com a amostra em estudo. Apesar das variações de tempo no
aparecimento dos sinais clínicos, a confirmação da presença do vírus nos órgãos e tecido
estudados pelo método de RT-PCR, foi positiva desde o primeiro dia de infecção.
39
Quadro 4 - Análises de amostras biológicas de camundongos inoculados com isolados de
MAYV.
AMOSTRAS ANALISADAS
AR 20290
SBA 91
Controle Negativo
Dia
Sinais
Clínicos
RT-PCR
Sinais
Clínicos
RT-PCR
Sinais
Clínicos
RT-PCR
1º
+
Positivo
0
Positivo
0
Negativo
2º
+
Positivo
+
Positivo
0
Negativo
3º
+
Positivo
+
Positivo
0
Negativo
4º
+
Positivo
+
Positivo
0
Negativo
5º
+
Positivo
+
Positivo
0
Negativo
Legenda: 0= sem sinal de doença; += sinais de distúrbios neuromotores; Positivo= com amplifacação de
genoma; Negativo= sem amplificação de genoma.
3.2. ANÁLISE DA EXPRESSÃO DE mRNA DE IL-2, TNF-α E GAPDH
A quantificação da expressão de mRNA das citocinas IL-2, TNF-α e o controle
endógeno GAPDH, foi analisado utilizado a técnica de Transcrição Reversa e Reação em
Cadeia mediada pela Polimerase em Tempo Real (RT-qPCR) usando sistema SYBR Green.
Para cada intervalo de tempo, 24, 48 e 72 horas, foi realizado um experimento de RTqPCR, onde cada citocina foi analisada em triplicata para cada um dos órgãos e tecido
selecionados para o estudo. A figura 8 mostra a curva de amplificação do experimento de RTqPCR.
40
Figura 8 – Curva de amplificação do experimento de RT-qPCR para determinação da
expressão de mRNA das citocinas IL-2, TNF-α e GAPDG (gene endógeno) em
camundongos infectados após 24horas com o MAYV pela via subcutânea e camundongos
não infectados (controle negativo) nos fragmentos de cérebro, fígado, rim e músculo
esquelético.
Os valores de CT obtidos pela análise das curvas de amplificação foram utilizados na
avaliação da variação de expressão (fold-change) de cada gene de interesse por meio do
método de comparação do CT, utilizando o gene GAPDH para normalização, conforme
descrito na metodologia. Tal método requer uma validação, realizada para mostrar a eficiência
das amplificações do alvo e a eficiência da amplificação do controle endógeno são
aproximadamente iguais (Figura 9, 10 e 11).
41
Figura 5 - Curva padrão da RT-qPCR demonstrando a eficiência
da reação para o gene GAPDH.
Figura 6 - Curva padrão da RT-qPCR demonstrando a eficiência
da reação para o gene IL-2.
42
Figura 7 - Curva padrão da RT-qPCR demonstrando a eficiência
da reação para o gene TNF-α.
Após o término de cada reação, uma etapa de dissociação foi realizada para
visualização da cinética de dissociação dos produtos amplificados. Para isso, a temperatura da
reação foi aumentada de forma linear e a fluorescência de cada amostra foi representada
graficamente, com o eixo da ordenada mostrando a derivada da intensidade da fluorescência e
o da abscissa, a temperatura. O gene endógeno (GAPDH) e o gene da citocina IL-2 tiveram
seus produtos amplificados com uma Temperatura (Tm) 81,32 ºC e Tm 78,49 ºC
respectivamente, sem qualquer formação de dímeros dos iniciadores, amplificação de produto
inespecífico ou contaminação das amostras (Figura 12 e 13). Já o gene da citocina TNF-α teve
seu produto amplificado com uma temperatura mais elevada, de 87,24 ºC, e com uma pequena
formação de dímero, demonstrado pela seta (Figura 14).
43
Figura 12 – Curva de dissociação com amplificação do gene
endógeno (GAPDH) em camundongos infectados após 24horas com o
MAYV pela via subcutânea nos fragmentos de cérebro, fígado, rim e
músculo esquelético.
Figura 13 – Curva de dissociação com amplificação do gene da
citocina IL-2 em camundongos infectados após 24horas com o
MAYV pela via subcutânea nos fragmentos de cérebro, fígado, rim e
músculo esquelético.
44
Figura 14 – Curva de dissociação com amplificação do gene da
citocina TNF-α em camundongos infectados após 24horas com o
MAYV pela via subcutânea nos fragmentos de cérebro, fígado, rim e
músculo esquelético.
A variação de expressão de genes das citocinas IL-2 e TNF-α nas amostras coletadas
de cérebro, fígado, rim e músculo esquelético de camundongos recém-nascidos infectados
com MAYV nos intervalos de tempo 24, 48 e 72 horas foram analisada pela quantificação
relativa utilizando os valores de CT obtidos pela análise das curvas de amplificação e
normalizados com o gene GAPDH, utilizando a fórmula: ∆Ct = Ct (gene alvo) – Ct (gene
GAPDH). Com a eficiência das amplificações dos genes alvo (IL-2 e TNF-α) e controle
endógeno aproximadamente igual, os resultados obtidos permitiram usar a expressão 2 -∆∆ct
(∆∆ct = ∆Ctinfectados – ∆Ctnão infectados) para a quantificação dos transcritos.
Os níveis de expressão de mRNA das citocinas pró-inflamatórias IL-2 e TNF-α nos
diferentes intervalos de tempo e órgãos selecionados, foram comparados com o controle
negativo (não infectados) e apresentaram expressão significativa estatisticamente com p<0,05.
No cérebro, tanto a expressão de genes de IL-2 quanto de TNF-α tiveram sua expressão
reduzida significativamente após 48 horas de infecção, nos demais intervalos, não houve
mudança de expressão significativa. Já no músculo esquelético, observou-se um aumento
significativo de expressão de ambos os genes, após 48 e 72 horas de infecção. O rim
apresentou um aumento de expressão do gene IL-2 após 48 e 72 horas de infecção e redução
de expressão do gene TNF-α no mesmo período. O fígado por sua vez, não apresentou
45
variação de expressão gênica em nenhum dos genes alvo em todos os intervalos de tempo
(Tabela 2).
Tabela 2 - Valores de expressão de mRNA de IL-2 e TNF-α nos diferentes intervalos de
tempo e órgãos selecionados comparados *.
Cérebro
Fígado
M.E
RIM
Citocinas
24h
48h
72h
IL-2
-0,071
-0,864
0,106
TNF-α
-0,073
-1,063
0,09
IL-2
-0,058
0,277
0,07
TNF- α
0,078
0,297
0,247
IL-2
-0,063
1,683
0,528
TNF- α
0,019
0,409
0,510
IL-2
-0,008
0,559
1,345
TNF- α
-0,135
-2,085
-2,094
*Os valores em preto, não houve alteração estatística significativa na expressão da citocina quando
comparado com o controle negativo; valores em azul, aumento significativo de expressão de citocinas
quando comparado com o controle negativo e valores em vermelho, redução significativa de expressão de
citocinas quando comparado com o controle negativo, segundo teste estatístico Student t, sendo
consideradas diferenças estatisticamente significante quando p<0,05.
No intervalo de tempo de 24 horas, não foi possível observar nenhuma mudança
estatisticamente significativa nos órgãos e tecido muscular selecionado, em ambos os genes.
Assim as figuras 15 e 16 mostram em porcentagem apenas os intervalos de tempo em que
houve variação gênica estatisticamente significativa, seja ela tanto positiva como negativa.
Figura 15 – Diferença em porcentagem da expressão de gene
da IL-2 nos órgãos e tecido muscular infectados com o MAYV
com 48 e 72 horas após infecção comparados com o controle
negativo.
46
Figura 16 – Diferença em porcentagem da expressão de gene da
IL-2 nos órgãos e tecido muscular infectados com o MAYV com
48 e 72 horas após infecção comparados com o controle
negativo.
No quadro 5 observamos a síntese das análises das expressões dos genes de IL-2 e
TNF- α nos diferentes intervalos de tempo (24, 48 e 72 horas) e órgãos estudados (cérebro,
fígado, rim e músculo esquelético) tanto no grupo de camundongos infectados com isolado do
MAYV em estudo (SBA91) quanto o grupo de camundongos não infectados (controle
negativo), onde nota-se a permanência da expressão de citocinas sem qualquer alteração em
todos os intervalos de tempo e em todos os órgãos e tecidos em estudo no grupo de
camundongos não infectados, enquanto que nos camundongos infectados com a cepa SBA 91
observa-se um aumento significativo de expressão de citocinas no músculo esquelético no
intervalo de tempo de 48 e 72 horas de ambas as citocinas e no rim no intervalo de tempo de
48 e 72 horas da IL-2; redução significativa de expressão de citocina no cérebro no intervalo
de tempo de 48 horas em ambas as citocinas e no rim do TNF- α no intervalo de tempo de 48
e 72 horas, nos demais períodos e órgãos não houve alteração significativa.
47
Quadro 5 - Análises de expressão de mRNA de IL-2 e TNF-α nos diferentes intervalos
de tempo e órgãos de camundongos inoculados com isolados de MAYV.
AMOSTRAS ANALISADAS
SBA 91
Controle Negativo
IL 2
TNF-alfa
IL 2
TNF-alfa
ÓRGÃO
24h 48h 72h 24h 48h 72h 24h 48h 72h 24h 48h 72h
Cérebro
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
Fígado
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
Rim
0
+
+
0
0
0
0
0
0
0
Músculo
0
+
+
0
+
+
0
0
0
0
0
0
esquelético
Legenda: 0 = sem alteração estatística significativa na expressão da citocina; + = aumento significativo de
expressão de citocinas; - = redução significativa de expressão de citocinas.
48
4. DISCUSSÃO
Os Alphavirus, como MAYV, CHIKV e RRV, são frequentemente associados a surtos
de doenças reumáticas infecciosas pelo mundo, onde artralgia e artrite grave são os sintomas
mais comuns, sendo considerada uma doença autolimitada, porém debilitante devido
apresentar dor muscular e articular persistente por semanas e até meses, caracterizada por
infiltrados inflamátórios compostos em sua maioria de células mononucleares, sugerindo os
monócitos e macrófagos como um dos principais constituintes desses infiltrados. A maioria
dos estudos da patogênese dos alphavírus tem sido feito àqueles causadores de encefalite,
contudo o mecanismo pelo qual alphavírus artralgênicos causam doença são em grande parte
desconhecido (Morrison et al., 2006; 2007; Huang et al., 2007; Lidbury et al, 2008).
Praticamente todos os arbovírus são patogênicos para camundongos recém-nascidos,
adultos, hamsters e cobaias, porém, animais recém-nascidos são os mais vulneráveis,
enquanto que os animais jovens e adultos, de modo espontâneo ou dependendo do título do
inóculo se sobrepõe a natural resistência do adulto. Diversos estudos com Alphavirus têm
utilizado camundongos como animal experimental, sendo utilizados como modelos na
suscetibilidade e resistência ao vírus para analise imunopatologica das doenças causados pelos
integrantes desse gênero. Desta forma iniciamos nossos estudos utilizado camundongos (Mus
musculus) recém-nascidos como modelo experimental animal a fim de analisar a expressão de
citocinas pro-inflamatórias (IL-2 e TNF-α) nos diferentes órgãos e tecidos e intervalo de
tempo(Dias, 1986; Morrison et al., 2006).
Neste estudo, camundongos recém-nascidos infectados com MAYV pela via
subcutânea com o titulo viral de 10 -9,5 DL50/0,02 mL, foram a óbito cinco dias após infecção.
Quando comparamos com estudos experimentais em hamster de 9 a 10 dias de vida por Li et
al. (2008) para análise de expressão de citocinas para o vírus da febre amarela, tiveram óbitos
entre o sexto e décimo dia após infecção pela via intraperitoneal, período este em que o nível
de viremia era baixo ou indetectável no sangue, sugerindo que a morte dos animais pode estar
correlacionado com a reposta imune do hospedeiro. Em nossos estudos, a morte após cinco
dias da infecção, pode estar relacionada ao nível de viremia e por se tratar de camundongos
recém-nascidos com sistema imune ainda prematuro em relação a camundongos jovens.
Na análise dos três primeiros dias após infecção (s.c.), observou-se a presença do vírus
em todos os fragmentos em estudo (cérebro, fígado, rim e músculo esquelético) e em todos os
intervalos de tempo (24, 48 e 72 horas) evidenciando a rápida replicação do vírus em uma
grande variedade de órgãos e tecidos em um curto período de tempo (quadro 4). Semelhante
ao obervado por Morrison et al. (2006), que detectaram picos de títulos virais no tecido dos
49
músculos quadriceps e tornozelo de camundongos infectatos pela via subcutânea com o RRV
após 24 e 48 horas pós infecção e em contraste, picos de títulos virais no cérebro e baço foram
marcadamente mais baixos do que os observados nos tecido muscular do quadriceps e
tornozelo.
Segundo Akhrymuk et al. (2012) descreve que o ciclo de replicação dos Alphavirus
ocorre no citoplasma e é concluido dentro de 24 a 48 horas pós-infecção (p.i.). A nível
citoplasmático ocorre a inibição global da transcrição celular pela nsP2, que é um eficiente
meio de resposta a inibição antiviral, sem afetar a replicação e saida do vírus. Como resultado
temos, a incapacidade das células infectadas para ativar expressão de citocinas e quimiocinas,
fato este que corrobora com os achados deste estudo, onde não foi possível observar nenhuma
mudança estatisticamente significativa nos órgãos e tecido muscular selecionados em um
intervalo de tempo de 24 horas após a infecção pelo MAYV, sugerindo que neste intervalo de
tempo possivelmente houve uma evasão a resposta celular antiviral do hospedeiro. Porém,
estudo sobre a imunopatogenicidade dos Alphavirus torna cada vez mais claro que a
imunogenicidade é devido a ativação de resposta imune inata em vez de aumento na produção
de antígenos, segundo Naslund et al. (2011). Morrinson et al. (2007) analisando o papel do
sistema complemento, componente importante de imunidade inata, descobriram que
camundongos deficientes em C3 desenvolvem inflamação nos ossos, tecido muscular
esquelético e articular, com sinais de doença e danos nos tecidos menos graves após infecção
por RRV, sugerindo que a ativação do complemento, independente do recrutamento de
células inflamatórias para os tecidos, contribui para a lesão tecidual, desempenhando um
papel central e imunorregulador na patogênese dos alphavirus que provocam doença
inflamatória, podendo também estar associada com formas mais graves de outras doenças
virais, incluindo a dengue.
Neste estudo foi encontrado no músculo esquelético, aumento significativo da
expressão dos genes da IL-2 e TNF-α, após 48 e 72 horas de infecção, sugerindo que tais
citocinas pró-inflamatórias podem ter um papel fundamental na patogênese das doenças
reumáticas. Lidbury et al. (2008) utilizando ratos como modelo, infectados com RRV pela via
subcutânea, demonstrou o papel dos macrófagos na patogênese da doença, comprovando que
mediadores pró-inflamatórios derivados de macrófagos, como IL-2 e TNF-α são a causa
principal de processos imunopatológicos que levam a doença reumática. Estudos com
primatas não humanos suscetíveis a infecção pelo CHIKV realizados por Labadie et al.
(2010), observaram principalmente nos órgãos linfóides, fígado e músculo, os macrófagos
como atores centrais durante as infecções e persistência da doença.
50
Análises realizadas a partir de articulações de pacientes com artrite reumatoide, Huang
et al. (2007), observaram receptores Toll-like (TLRs) como sendo crítico para a geração da
reposta imune, devido ativarem o sistema imune inato em macrofágos e células dendríticas,
resultando na produção de citocinas pró-inflamatórias, incluindo o TNF-α e a IL-2, que
tiveram expressão persistente, apesar do desenvolvimento de uma resposta imune adaptativa,
o que contribuiu para a patogênese da doença. Tal estudo corrobora com os achados em
nossos experimentos, onde também observamos uma maior expressão dessas citocinas próinflamátorias no músculo esquelético dos animais infectados por MAYV.
Li et al. (2008), relataram que desde o terceiro dia após a infecção, foi evidente o
aumento das citocina Th1 nos órgão dos animais como o fígado e o rim, sugerindo o papel
protetor dessas citocinas contra a infecção, sendo importantes efetores na resposta mediada
por célula, uma tentativa do hospedeiro para controlar a infecção. No presente estudo, o rim
apresentou um aumento de expressão do gene IL-2 após 48 e 72 horas de infecção, porém a
expressão do gene TNF-α teve redução no mesmo período. O fígado por sua vez, não
apresentou variação de expressão gênica em nenhum dos genes alvo em todos os intervalos de
tempo. A causa dessa redução ou mesmo a sua não variação é desconhecida, sendo
necessários estudos futuros para determinar a sua causa, seja pelo depuramento passivo da
resposta inflamatória inicial pelo vírus, seja pela supressão da resposta de citocinas pelo vírus,
regulação de citocinas ou pela combinação desses mecanismos.
Nos estudos de Carmen et al. (2009) com NSV (Neuroadapted Sindbis virus) em
cultura de medula espinhal, demonstraram que o TNF-α é secretado em níveis elevados a
partir de 12 e 24 horas após infecção e está correlacionado com os efeitos deletérios no
sistema nervoso central, implicando-o como um mediador importante na morte de neurónios
em encefalomielite viral. Já outras citocinas inflamátorias como IL-2, IL-4, IL-17 e IFN-γ
não tiveram níveis elevados secretados nas culturas de medula espinhal infectadas.
Em
nossos estudos, no cérebro, tanto a expressão de genes de IL-2 quanto de TNF-α tiveram sua
expressão reduzida significativamente após 48 horas de infecção, e nos demais intervalos, não
houve mudança significativa de expressão. Segundo Dias (1986), lesões no sistema nervoso
central são frequentes, determinando inclusive quadros de encefalite em animais recémnascidos. Porém há uma variação desse comportamento, nem sempre se comprovando uma
agressão ao sistema nervoso central, dependendo assim do tipo viral, a via de inoculação ou o
titulo do vírus. Na maioria das vezes não se percebe uma resposta inflamatória, quer seja
discreta ou ampla a injúria celular neuronal e glial, principalmente nos animais que morrem
em 24 ou 48 horas após a infecção. Sugerindo assim, que a redução na expressão dos genes de
51
citocinas pro inflamatórias e até mesmo a sua não variação, pode ser devido a uma
inexpressível resposta inflamatória a infecção pelo MAYV ou por se tratar de um vírus não
neurotrópico, estando presente, porém sem causar danos inflamatórios graves.
De acordo com Morrison et al. (2006) as análises histológicas de ossos dos membros
posteriores, juntas, tecido do músculo esquelético e tecidos do sistema nervoso central,
resultaram em pouca ou nenhuma inflamação cinco dias após a infecção, diferente do
encontrado nos ossos e articulações dos membros inferiores, com presença abundante de
células inflamatórias após cinco dias de infecção atingindo o seu pico de gravidade entre sete
e dez dias de pós-infecção, ocorrendo bem depois do pico do título viral, sendo pouco
expressiva ou ausente no terceiro dia pós infecção, o que nos leva a pensar em futuros
experimentos analisando o quarto e quinto dia após infecção no intuito de observar expressão
signficativamente elevada das citocinas em estudo, bem como avaliar outras possíveis
citocinas como INF- γ e TGF-β, envolvidas na patogênese da doença.
Nosso estudos mostraram o aumento significativo de citocinas pró-inflamatórias (IL-2
e TNF-α) em tecido muscular esquelético e no rim após 48 horas de infecção pelo MAYV,
semelhante ao observado em outros estudos com Alphavirus artralgênicos. Porém a
diminuicão ou ausência de variação nos demais órgãos, levanta a necessidade de estudos mais
detalhados acerca dos mecanismos de evasão do vírus à resposta imunológica do hospedeiro,
bem como a análise por um período mais prolongado pós-infecção, a fim de se observar um
aumento de expressão das citocinas.
52
5. CONCLUSÕES
 No presente estudo camundongos infectados com MAYV pela via subcutânea com o título
viral de 10-9,5 DL50/0,02 mL, foram a óbito cinco dias após infecção.
 Nas análises dos três primeiros dias após infecção, todos os fragmentos em estudo
(cérebro, fígado, rim e músculo esquelético) e em todos os intervalos de tempo (24, 48 e 72
horas) foram confirmados por RT- PCR com infecção pelo MAYV;
 Apesar das variações de tempo no aparecimento dos camundongos infectados com isolado
do MAYV, a confirmação da presença do vírus nos órgãos e tecido estudados pelo método de
RT-PCR, foi positiva desde o primeiro dia de infecção;
 A quantificação de expressão de mRNA das citocinas IL-2 e TNF-α apresentou no cérebro
redução significativa de expressão de ambos os genes após 48 horas de infecção; no rim um
aumento de expressão do gene IL-2 após 48 e 72 horas de infecção, porém redução de
expressão do gene TNF-α no mesmo período; o fígado não apresentou variação de expressão
gênica em nenhum dos genes alvo em todos os intervalos de tempo, já o músculo esquelético,
teve aumento significativo de expressão dos genes da IL-2 e TNF-α, após 48 e 72 horas de
infecção.
 No intervalo de tempo de 24 horas após infecção pelo MAYV, não foi possível observar
nenhuma mudança estatisticamente significativa nos órgãos e tecido muscular selecionados,
sugerindo que neste intervalo de tempo possivelmente houve uma evasão a resposta celular
antiviral do hospedeiro.
53
6. REFERÊNCIAS
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ANEXO 2
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ANEXO 3