Document

UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOMÉDICAS
MESTRADO ACADÊMICO DE CIÊNCIAS FISIOLÓGICAS
VICTOR MARTINS GOMES
INOTROPISMO CARDÍACO POSITIVO INDUZIDO POR F9; PAPEL DA
PROTEÍNA QUINASE A E RECEPTOR 2 DE RIANODINA.
FORTALEZA-CEARÁ
2012
VICTOR MARTINS GOMES
INOTROPISMO CARDÍACO POSITIVO INDUZIDO POR F9; PAPEL DA
PROTEÍNA QUINASE A E RECEPTOR 2 DE RIANODINA.
Dissertação submetida à Banca do Mestrado acadêmico de
Ciências Fisiológicas do Centro de Ciências da Saúde, da
Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial
para obtenção do grau de Mestre em Ciências Fisiológicas.
Orientador: Prof.Dr.Nilberto Robson Falcão do Nascimento
FORTALEZA-CEARÁ
2012
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação
Universidade Estadual do Ceará
Biblioteca Central Prof. Antônio Martins Filho
G633i
Gomes, Victor Martins.
Inotropismo cardíaco positivo induzido por F9: papel da
proteína Quinase A e Receptor 2 de Rianodina / Victor Martins
Gomes. – 2012.
114 f. : il. color., enc. ; 30 cm.
Dissertação (Mestrado) – Universidade Estadual do Ceará,
Centro de Ciências da Saúde, Curso de Mestrado Acadêmico em
Ciências Fisiológicas, Fortaleza, 2012.
Área de Concentração: Fisiologia.
Orientação: Prof. Phd. Nilberto Robson Falcão do Nascimento.
1. Fisiologia. 2. Proteína Quinase A. 3. Receptor de Rianodina.
I. Título.
CDD: 574.1
VICTOR MARTINS GOMES
INOTROPISMO CARDÍACO POSITIVO INDUZIDO POR F9; PAPEL DA
PROTEÍNA QUINASE A E RECEPTOR 2 DE RIANODINA.
Dissertação submetida à Banca do Mestrado acadêmico de
Ciências Fisiológicas do Centro de Ciências da Saúde, da
Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial
para obtenção do grau de Mestre em Ciências Fisiológicas
Aprovada em ___/___/___
Conceito:
Nota:
BANCA EXAMINADORA
__________________________________________
Prof. Dr. Nilberto Robson Falcão do Nascimento (Orientador)
Universidade Estadual do Ceará
__________________________________________
Prof.Dr.Manassés Claudino Fonteles
Universidade Estadual do Ceará
__________________________________________
Profa.Dra.Cláudia Ferreira Santos (Suplente)
Universidade Estadual do Ceará
What a Wonderful World
I see trees of green, red roses too
I see them bloom for me and you
And I think to myself, what a wonderful
world
I see skies so blue and clouds of white
The bright blessed days, the dark sacred night
And I think to myself, what a wonderful world
The colors of the rainbow, so pretty in the sky
Are also on the faces of people going by
I see friends shaking hands, saying, "how do you do?"
They're really saying, "I love you"
I hear babies cry, I watch them grow
They'll learn much more, than I'll never know
And I think to myself, what a wonderful world
Yes, I think to myself, what a wonderful world
Louis Armstrong
AGRADECIMENTOS
Primeiramente agradeço a Deus por todo apoio que tem me dado em todas as horas
durante esses anos de pesquisa.
Segundo lugar, eu gostaria de agradecer a minha mãe, Maria de Fátima V.Martins
Gomes, e meu pai, José Orestes Ponciano Gomes, por todo o apoio familiar nos
congressos, nos experimentos até tarde, e na minha faculdade como um todo. Incluo nesse
parágrafo o grande amor da minha vida que já faz parte também da minha família, minha
namorada Gabriela Messias de Araújo, um arcanjo cujas qualidades não caberiam nesse
manuscrito.
Agradeço profundamente ao meu orientador Nilberto Robson Falcão do Nascimento
e sua Esposa Cláudia Ferreira Santos, cujo brilhantismo do saber nos inspira a crescer na
carreira científica e acadêmica. Aqui incluo também Dr. Manassés Claudino Fonteles que
com sua força e determinação, fomentou a pesquisa no Ceará, formando núcleos de
excelência tanto na UFC quanto na UECE. E também devo minha parte de gratidão a
Profa.Lucília nos conselhos , dúvidas e ideias que compartilhamos.Agradeço também ao
Prof.Dr.Roberto Takashi Sudo por ter aceitado o convite à banca de mestrado.
Todos os meus amigos do laboratório sempre irão ter um lugar especial para mim,
com destaque para; Hilana Cahína, Paula Priscila, Luciana Amorim e Rafael Campos.
RESUMO
A terapêutica para Insuficiência cardíaca ainda não possui uma terapêutica inotrópica para a
melhora da qualidade e expectativa de vida. Uma mistura esteroidal assim com seus
compostos isolados de Physalin angulata (Família Solanacea), F9 e F13 foram testados in
vivo, e in vitro, em tecidos cardíacos de cobaios. Curvas de concentração-resposta (0.2 to
200 μM) foram feitas tanto em batimentos espontâneos de átrio direito isolado quanto em
átrio esquerdo estimulado eletricamente (supramáxima, 10 ms e 0,1Hz).Os parâmetros
avaliados foram amplitude máxima, tempo para atingir a resposta máxima e tempo para
atingir 80% do relaxamento.Os efeitos de F9 no átrio foram avaliados na presença ou
ausência de propranolol (1 μM), verapamil (0.1 μM), estaurosporina (0.1 μM) , H89 (10 μM) e
em condições de acidose ou acidose+ Verapamil (0.1 μM).Experimentos em fibra cardíaca
permeabilizada foram feitos para o estudo do mecanismo de ação de F9 sobre Src-NKA,
IP3R, RYR e tirosinas quinases.Para avaliar a ação de F9 sobre a mobilização de cálcio
celular foram feitos protocolos para carregamento de Ca2+, liberação de Ca2+ e sensibilidade
das proteínas contráteis ao Ca2+(pCa 7.0– 4.8). Os efeitos hemodinâmicos da infusão F9(25
µg/Kg/min) foram comparados ao isoproterenol (1 µg bólus), sendo avaliados parâmetros
como pressão intraventricular máxima, dP/dt máxima, dP/dT mínima, débito cardíaco, fração
de ejeção , tau, tempo de duração da diástole e frequência cardíaca. F9 e F13 aumentaram
a tensão em átrio esquerdo (346.97 ± 33.82% e 312.72 ± 98.63 %, respectivamente, sem
eventos arritmogênicos, efeitos cronotrópicos ou tonotrópicos positivos para F9. Este
fenômeno não foi afetado em tecidos pré-tratados com propranolol, estaurosporina ou
verapamil. Porém, houve 91.8% de inibição do efeito inotrópico positivo em átrios
previamente incubados com H89 (n=5), um inibidor de PKA. F9 (10 μM) evocou uma
contração máxima de 53% em relação pCa 4.8( 0.25 μM Ca2+) em fibra permeabilizada.O
composto não afetou o deslocamento da curva de carregamento e cálcio nem a
sensibilidade dos miofilamentos ao Ca2+.O aumento de tensão promovido por F9 não foi
bloqueado por xestospogina C (3μM) ou herbimicina A (1μM), ao passo que foi bloqueado
por rutênio vermelho (30μM). F9 promoveu o aumento de parâmetros in vivo como Pressão
Intraventricular Máxima, dP/dt máxima, dP/dT mínima, débito cardíaco, fração de ejeção ,
duração diastólica enquanto diminuiu a frequência cardíaca e o tau .O efeito de F9 parece
ser depende de um aumento de fosforilação em RYR2 através da ativação de PKA
independentemente de AMPc. Este projeto foi aprovado pelo comitê de ética com o número
de protocolo: 08627944-0
Palavras Chave:F9, Proteína Quinase A, Receptor de Rianodina.
ABSTRACT
Long-term positive cardiac inotropic therapy to heart failure that increases both life quality
and expectancy is still lacking. Phytosteroids mixture, isolated from Physalis angulata
(Solonacea), as there isolated compounds, F9 and F13 were probed in guinea-pig cardiac
tissues in vitro and in vivo. Concentration response curves (0.2 to 200 μM) were performed in
both spontaneous beating right atria and electrically driven left atria (supramaximum, 10 ms
e 0,1 Hz). The parameters evaluated were: time to reach peak tension, 80% relaxation time
and maximum amplitude in atrial tissues. The effects of F9 in the atria were evaluated either
in the absence or presence of propranolol (1 μM), verapamil (0.1 μM), staurosporine (0.1 μM)
and H89 (10 μM). Saponin-skinned fibers were studied in order to further study its
mechanism of action under Src-NKA, IP3R, RYR and Tyrosine Kinases inhibition. Protocols
to Ca2+ loading, Ca2+ release and Ca2+ sensitivity (pCa 7.0 – 4.8) were performed to
investigate if F9 could be acting on cell Ca2+ mobilization. F9 hemodynamic effects were
investigated through Millar Hemodynamic system by infusion (25 µg/Kg/min) compared to
isoproterenol 1 µg bolus. Ventricular Max Pressure, Max dP/dt, Min dP/dt, Cardiac Output,
Ejection Fraction, tau, diastolic duration and Heart Rate were evaluated. F9 and F13
increased left atria tension to 346.97± 33.82% and 312.72 ± 98.63 %, respectively, without
any remarkable arrhythmogenic, chronotropic or tonotropic effect. This positive inotropic
effect was not affected by pretreating tissues with propranolol, staurosporine or verapamil.
Nevertheless, this effect was blunted by 91.8% by H89 (n=5) a PKA inhibitor. F9 (10μM)
evoked a contraction of trabecular skinned fiber that attained 53% of the maximal contraction
achieved with 0.25 μM Ca2+. This compound did neither affect Ca2+ loading nor shifted
significantly the sensitivity of contractile proteins to Ca2+. The increase in tension promoted
by F9 in skinned fibers was not blocked by xestospongin C (3μM) or herbymicin A (1μM) but
was blunted by either ruthenium red (30μM). F9 does neither affect cAMP levels. F9
increased in vivo parameters as ventricular max pressure, max dP/dT, min dP/dt, cardiac
output and ejection fraction, while decrease heart rate. The positive cardiac inotropic effect of
F9 seems to be dependent of activation of PKA and RYR2 phosphorylation cAMP
independent. CEUA protocol number: 08627944-0.
Keywords:F9, Protein Kinase A, Ryanodine Receptor
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Dedaleira roxa (Digitalis purpurea L.)
Figura 2: Estrutura química da digoxina .
Figura 3. Representação do processo de acoplamento excitação contração cardíaco.
Figura 4: Estrutura de miócitos cardíacos ventriculares e atriais de rato.
Figura 5: Sinalização de Ca2+ durante um acoplamento excitação contração atrial.
Figura 6:Dependência de cálcio de receptores de rianodina de músculo esquelético
e cardíaco .
Figura 7: Physalis angulata em seu habitat natural.
Figura 8: Estruturas químicas de compostos originados por plantas do gênero
Physalis.
Figura 9: Protocolo para liberação de cálcio na Fibra permeabilizada.
Figura 10: Protocolo para sensibilidade das fibras contrateis ao cálcio na Fibra
permeabilizada.
Figura 11: Protocolo para captação ao cálcio na Fibra permeabilizada.
Figura 12: Efeito da infusão de F9 e injeção de Isoproterenol sobre pressão
ventricular máxima desenvolvida no ventrículo esquerdo de cobaio.
Figura 13: Efeito da infusão de F9 e injeção de Isoproterenol sobre o incremento
máximo na pressão ventricular (dP/dT máxima) e decremento máximo da pressão
ventricular máxima (dP/dT mínima) desenvolvida no ventrículo esquerdo de cobaio.
Figura 14: Efeito da infusão de F9 e injeção de Isoproterenol sobre a fração de
ejeção, Frequência cardíaca, Débito cardíaco, Tempo para diástole e tau em cobaio.
Figura 15: Efeito F9 sobre a relação força-frequência em batimentos espontâneos de
átrio direito de cobaio.
Figura 16: Efeito de PHY, F9, F13, Ouabaína, Digoxina e veículo sobre o tempo para
atingir o pico máximo no átrio esquerdo de cobaio estimulado eletricamente.
Figura 17: Efeito de PHY, F9, F13, Ouabaína, Digoxina e veículo sobre o tempo para
atingir 80% do relaxamento átrio esquerdo de cobaio estimulado eletricamente.
Figura 18: Registro das contrações em átrio esquerdo em átrio esquerdo isolado de
cobaio estimulado eletricamente na curva cumulativa dose- resposta de DMSO.
Figura 19: Registro das contrações em átrio esquerdo em átrio esquerdo isolado de
cobaio estimulado eletricamente na curva cumulativa dose- resposta de PHY .
Figura 20: Registro das contrações em átrio esquerdo em átrio esquerdo isolado de
cobaio estimulado eletricamente na curva cumulativa dose- resposta de F9
Figura 21: Registro das contrações em átrio esquerdo em átrio esquerdo isolado de
cobaio estimulado eletricamente na curva cumulativa dose- resposta de F13.
Figura 22: Registro das contrações em átrio esquerdo isolado de cobaio estimulado
eletricamente na curva cumulativa dose- resposta de Ouabaína .
Figura 23: Registro das contrações em átrio esquerdo isolado de cobaio estimulado
eletricamente .
Figura 24: Efeito de PHY, F9, F13, Ouabaína, Digoxina e Veículo sobre a força de
contração de átrio esquerdo de cobaio estimulado eletricamente .
Figura 25: Registro das contrações em átrio direito isolado de cobaio na curva
cumulativa dose- resposta de F9 sob ação de propranolol (10 -6 M).
Figura 26: Registro das contrações em átrio direito isolado de cobaio na curva
cumulativa dose- resposta de F9 sob ação de verapamil (10 -7 M).
Figura 27: Efeito de F9, F9 + Propranolol (1 µM) e F9 + Verapamil ( 100 nM ) sobre a
força de contração de átrio direito de cobaio .
Figura 28: Registro das contrações em átrio esquerdo isolado de cobaio estimulado
eletricamente na curva cumulativa dose- resposta de F9 em condição de acidose
(pH 6.5).
Figura 29: Registro das contrações em átrio esquerdo isolado de cobaio estimulado
eletricamente na curva cumulativa dose- resposta de F9 em condição de acidose
(pH 6.5) incubado com verapamil( 10 -7 M).
Figura 30: Registro das contrações em átrio esquerdo isolado de cobaio estimulado
eletricamente na curva cumulativa dose- resposta de F9 sob ação de H89 ( 10 μM).
Figura 31: Registro das contrações em átrio esquerdo isolado de cobaio estimulado
eletricamente na curva cumulativa dose- resposta de F9 sob ação de estaurosporina
(100 nM).
Figura 32: Efeito de F9, F9 + H89 (10 µM) e F9 + estaurosporina (100 nM ) sobre a
força de contração de átrio esquerdo de cobaio .
Figura 33: A. Incremento inotrópico em átrio esquerdo de cobaio sob ação de, F9,
Veículo e Forscolina .
Figura 34: Registro original de experimento feito com fibra permeabilizada de cobaio
para protocolo de liberação de cálcio mediante administração de F9.
Figura 35: Efeito de F9 na liberação de cálcio em fibras permeabilizadas de cobaio.
Figura 36: Registro original de experimento feito com fibra permeabilizada de cobaio
para protocolo de liberação de cálcio mediante administração de F9.
Figura 37: Efeito de F9 na sensibilização das proteínas contráteis ao cálcio em fibras
permeabilizadas de cobaio.
Figura 38: Efeito de F9 na captação de cálcio em fibras permeabilizadas de cobaio.
Figura 39: Efeito de F9 na liberação de cálcio em fibras permeabilizadas de cobaio
na presença ou ausência de Xestonpongina C (3 µM).
Figura 40: Efeito de F9 na liberação de cálcio em fibras permeabilizadas de cobaio
na presença ou ausência de Herbimicina A (100 µM).
Figura 41: Efeito de F9 na liberação de cálcio em fibras permeabilizadas de cobaio
na presença ou ausência de Rutênio Vermelho (30 µM).
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Efeito na frequência de contração em átrio direito isolado de cobaio promovido por
PHY, F9, F13 e Ouabaína e Veículo.
Tabela 2: Efeito de F9, Digoxina e Ouabaína sobre força basal no átrio esquerdo de cobaio
estimulado eletricamente .
LISTA DE ABREVIATURAS
SUS-MS
Sistema Único de Saúde e Ministério da Saúde
ICS
Insuficiência Cardíaca Sistólica
NKA
Na+,K+-ATPase
AMPc
Monofosfato cíclico de adenosina
PDE
Fosfodiesterase
SERCA2a
Ca2+ ATPase do Retículo Sarcoplasmático tipo 2a
AVV
Vírus Adeno-Associados
DHPR
receptor de Diidropiridina
RYR1
receptor de rianodina tipo 1
RYR2
receptor de rianodina tipo 2
RYR3
receptor de rianodina tipo 3
FRET
Ressonância de fluorescência por transferência de energia
ATP
trifosfato de adenosina
CIRC
Liberação de cálcio mediada por cálcio
ms
millisegundo
µM
micromolar
IP3R
Receptor de inositol-1,4,5-trifosfato
IP3
inositol-1,4,5-trifosfato
IP3R1
Receptor de inositol-1,4,5-trifosfato tipo 1
IP3R2
Receptor de inositol-1,4,5-trifosfato tipo 2
IP3R3
Receptor de inositol-1,4,5-trifosfato tipo 3
MDa
Megadaltons
kDa
quilodaltons
CaM
Cálcio- calmodulina
CaMK
Cálcio- calmodulina quinase
PKA
Proteína quinase dependente de AMPc
AKAP
Proteína ancoradoura de PKA
IL-2
Interleucina tipo 2
TNF-α
Fator de necrose tumoral tipo α
PHY
Mistura de frações
dP/dt
derivada da pressão ventricular pela derivada do tempo
UFC
Universidade Federal do Ceará
CEUA
Comitê de Ética para Uso de Animais
UECE
Universidade Estadual do Ceará
LASSBio
Laboratório de Avaliação de Substâncias Bioativas
BPM
Batidas por minuto
EGTA
ácido tetracético etilenoglicol
DMSO
Dimetil Sulfóxido
TCA
Ácido tricloroacético
RPM
Rotações por minuto
pCa
-Log[Ca2+]
p0
Padrão controle para fibra permabilizada referente a um pCa de 4.8
ECG
Eletrocardiograma
DII
Derivação II
FC
Frequência cardíaca
ANOVA
Análise de Variância
TR80
Tempo para atingir 80% do relaxamento
Tmáx
Tempo para atingir o pico da contração
PK
Proteína dependente de Cálcio
PKA
Proteína dependente de AMPc
IBMX
3-isobutil-1-metil-xantina
mL
Mililitro
RPM
Rotações por minuto
ANOVA
Análise de Variância
e.p.m
Erro padrão da média
mmHg
Milímetros de mercúrio
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO
20
2 REVISÃO DE LITERATURA
22
2.1 Fisiopatologia da Insuficiência Cardíaca Sistólica
22
2.2 Epidemiologia da Insuficiência cardíaca
23
2.3 Terapêutica atual
24
2.3.1 Digitálicos
25
2.3.2 Agonistas β1 adrenérgico
27
2.3.3 Inibidores de fosfodiesterase
27
2.3.4 Sensibilizadores ao cálcio
29
2.4 Inotrópicos sob investigação
30
2.4.1 Novos Inibidores de Na+,K+-ATPase
30
2.4.2 Ativadores da Miosina Cardíaca
30
2.4.3 Ativadoras da SERCA2a
31
2.5 Fatia de Mercado
31
2.6 Perfil do paciente cardiopata
32
2.7 Acoplamento excitação contração
34
2.7.1 Histórico
34
2.7.2 Fisiologia do Processo de Acoplamento Excitação contração
35
2.8 Liberação de cálcio induzida por cálcio (CIRC)
39
2.9 A liberação de cálcio via IP3R
41
2.10 Liberação de cálcio via RYR
42
2.10.1 Estrutura e modulação do receptor
44
2.11 Modulação por Acidose
45
2.12 Modulação Por Proteína Quinase A
46
3 Gênero Physalis
47
3.1 Atividades Biológicas
50
3.1.1 Atividade antimicrobiana
50
3.1.2 Imunomoduladora
50
3.1.3 Moluscicida
50
3.1.4 Anti-inflamatória
51
3.1.5 Antitumoral
51
4 JUSTIFICATIVA
52
5 HIPÓTESE
53
6 OBJETIVOS
54
6.1 Objetivo Geral
54
6.2 Objetivos Específico
54
7 MATERIAL E MÉTODOS
55
7.1 Animais
55
7.2 Material cirúrgico
55
7.3 Soluções e Reagentes
55
7.4 Cirurgia
56
7.5 Protocolo
57
7.5.1 Átrio Isolado
57
7.5.2 Medição dos níveis intracelulares de AMPc
58
7.5.3 Fibra Permeabilizada
58
7.5.4 Hemodinâmica Sistêmica
64
7.6 Análise estatística
64
8 RESULTADOS
66
8.1 Avaliação do efeito de F9 na Hemodinâmica Sistêmica de cobaio
66
8.1.1 Pressão Ventricular
66
8.1.2 dP/dT
66
8.1.3 Fração de Ejeção, Débito Cardíaco, Frequência Cardíaca , tempo de duração da
diástole, tau.
67
8.2 Avaliação do efeito de PHY, F9, F13, Veículo e Ouabaína na frequência cardíaca em
átrio direito de cobaio.
69
8.3 Avaliação do efeito de F9 na relação força- frequência cardíaca em átrio direito de
cobaio.
71
8.4 Avaliação do efeito de PHY, F9, F13, Veículo, Ouabaína e Digoxina no tempo para
atingir pico máximo (Tmáx) e para relaxar 80% da contração (TR80) em átrio esquerdo.
72
8.5 Avaliação do efeito de PHY, F9, F13, Veículo e Ouabaína na força máxima desenvolvida
em átrio esquerdo de cobaio.
74
8.6 Avaliação do Efeito de F9 quanto na força máxima desenvolvida em átrio esquerdo de
cobaio sob ação de inibidor de Proteína Quinase dependente de AMPc (PKC) e Proteína
Quinase dependente de Ca2+.
81
8.7 Avaliação do efeito de F9 e Ouabaína sobre o tonotropismo em átrio esquerdo de
cobaio.
84
8.8 Avaliação do efeito de F9, PHY, Forscolina e Veículo sobre os níveis intracelulares de
AMPc.
85
8.9 Avaliação da mobilização de cálcio em cardiomiócito de cobaio sob ação
de F9
86
8.9.1 Protocolo de Liberação de Cálcio
86
8.9.2 Protocolo de Sensibilização ao cálcio
88
8.9.3 Protocolo de Captação de cálcio
90
8.10 Bloqueio Farmacológico
90
8.10.1 Xestonpongina
90
8.10.2 Herbimicina A
91
8.10.3 Rutênio Vermelho
92
9 DISCUSSÃO
93
10 REFERÊNCIAS
101
11 ANEXOS
118
1.INTRODUÇÃO
Alterações do estado fisiológico do sistema cardiovascular tornando-o um dos
principais alvos em todo o mundo na terapêutica de patologias relacionadas a este
órgão.
Atualmente, patologias relacionadas ao sistema cardiovascular estão entre as
principais causas de morte, superando doenças como malária, HIV/AIDS e
tuberculose, tornando-se assim, fator de risco tanto em nações industrializadas
quanto em desenvolvimento no ocidente (FUSTER & VOUTE, 2005; REDDY &
YUSUF, 1998). Além do alto custo demandado, o mercado farmacêutico para drogas
cardiovasculares não dispõem de medicamentos seguros farmacologicamente em
uma terapia a longo prazo para o incremento e manutenção de um debito cardíaco
satisfatório.
Agentes
inotrópicos
como
agentes
beta-agonistas,
inibidores
de
fosfodiesterase, sensibilizadores ao cálcio e digitálicos (OVERGAARD & DZAVÍK,
2008; FRAGA & ELIEZER 1996) atuam diretamente nos componentes envolvidos no
processo de acoplamento excitação - contração. A prospecção de novos alvos
moleculares no âmbito do acoplamento excitação contração possibilita o surgimento
de novas formas de abordagem farmacológica para o desenvolvimento de fármacos
mais específicos.
A caracterização farmacodinâmica de compostos no sistema cardiovascular
envolve vários conceitos. O aumento da força de contração (Inotropismo) se faz
necessária para a manutenção do débito cardíaco no paciente cardiopata. A
manutenção da velocidade de relaxamento dessa contração (Lusitropismo) é
importante
para
a
conservação
da
tensão
diastólica
desse
paciente,
e
consequentemente, da fração de ejeção. A manutenção da ritmicidade das
contrações (Cronotropismo) indica uma estabilização no consumo de oxigênio pelo
miocárdio.
Os vitaesteróides constituem uma classe de substâncias com estrutura
química semelhante aos derivados do ergostano (RAY & GUPTA, 1994), na qual
estão incluídas as fisalinas. As Fisalinas B e F possuem uma gama de atividades
biológicas já descritas, como imunomoduladora em cultura de macrófagos (SOARES
et al, 2003), antiinflamtória em modelo de isquemia intestinal e injúria por reperfusão
(VIEIRA et al, 2005), atividade imunosupressiva (SOARES et al, 2006), porém não
existem estudos até o presente momento da ação dessas substâncias no sistema
cardiovascular.
Assim, faz necessário a caracterização a nível de efeito farmacodinâmico de
Fisalina F e Fisalina B no processo do acoplamento excitação-contração cardíaco,
bem como seu mecanismo de sinalização molecular , podendo, então, iniciar um
passo para o planejamento de novos fármacos a partir de uma molécula base,
constituindo uma alternativa terapêutica no tratamento de diversas patologias
cardíacas.
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Histórico da Insuficiência Cardíaca Sistólica
Manuscritos e relatos antigos já descreviam eventos de falecimento devido a
sintomas semelhantes à insuficiência cardíaca em várias civilizações como egípcia,
grega e indiana, e era sabido que os romanos faziam uso de uma planta chamada
“dedaleira” (Digitalis purpurea) (Figura 1) como medicamento. Após a descrição da
circulação sanguínea em 1628 por William Harvey, a natureza da insuficiência
cardíaca pôde ser mais bem compreendida. O avanço tecnológico com a descoberta
dos raios-x por Röntgen, o desenvolvimento da eletrocardiografia por Einthöven por
volta de 1890, e os adventos da tecnologia moderna como ecocardiografia,
cateterismo cardíaco e a medicina nuclear têm, desde então, melhorado o
diagnóstico e a investigação dos pacientes portadores de insuficiência cardíaca
(DAVIS et al, 2000).
A sangria e a utilização de sanguessuga com caráter medicinal para o
tratamento dessa patologia foram empregadas largamente por séculos, tendo
médico e botânico William Withering publicado seu relatório sobre os benefícios da
digitalis em 1785 no tratamento da hidropsia e outras doenças. Verificava-se que
após a administração de extratos da dedaleira, seguia-se um potente efeito diurético,
benéfico sobre a retenção de líquidos, sintoma presente nos pacientes tratados
(WITHERING, 1975).
Figura 1: Dedaleira roxa (Digitalis purpurea L.)
Fonte: http://www.henriettesherbal.com
2.2 Epidemiologia da Insuficiência cardíaca
O cenário atual frente à propagação de doenças cardiovasculares em todo o
mundo nos mostra que as mesmas permanecem como causa líder de morte, a frente
de doenças como malária, HIV/AIDS e tuberculose (GERSH et al, 2010)
A prevenção da insuficiência cardíaca é uma questão urgente de saúde
pública com importância nacional e internacional.
Estudos epidemiológicos mostram que a insuficiência cardíaca é um
importante problema de saúde pública nos Estados Unidos. De acordo com a
Sociedade Americana do Coração, é estimado que 550.000 novos casos apareçam
a cada ano. Mais de 5 milhões de americanos tem insuficiência cardíaca , sendo
causa líder de hospitalizações. Estima-se que em 2007, segundo a Sociedade
Americana de Cardiologia, mais de U$ 33 bilhões tenham sido gastos com o
tratamento de pacientes com insuficiência cardíaca (SHOCKEN et al, 2008).
No Brasil, em 2007 a IC foi responsável por 2,6% das hospitalizações e por
6% dos óbitos registrados pelo SUS-MS no Brasil. Entre grupos de idades, a
insuficiência cardíaca se mostra como principal causa de morte em idosos, em
segmento de 60-80 anos, sendo seguida por outras doenças como Diabetes mellitus
e pneumonia (INDICADORES SOCIODEMOGRÁFICOS E DE SAÚDE NO BRASIL,
2009).
No Brasil, a mortalidade intra-hospitalar por insuficiência cardíaca em
hospitais do SUS variou de 5,6% a 6,0% do ano 2000 a 2002 (I DIRETRIZ LATINO-
AMERICANA PARA AVALIAÇÃO E CONDUTA NA INSUFICIÊNCIA CARDÍACA
DESCOMPENSADA, 2005).
Apesar dos enormes avanços no entendimento e tratamento da insuficiência
cardíaca nos últimos anos, esta ainda permanece como uma das doenças mais
prevalentes no Brasil e no Nordeste em relação à população idosa.
O Nordeste foi a segunda região com maior número de internações realizadas
por Insuficiência cardíaca nos anos de 2000 a 2007 (III DIRETRIZ BRASILEIRA DE
INSUFICIÊNCIA CARDÍACA CRÔNICA, 2009)
2.3 Terapêutica atual
O tratamento da insuficiência Cardíaca Sistólica atualmente objetiva prolongar
a vida do paciente e melhorar a qualidade de vida do mesmo. As modalidades do
tratamento para insuficiência cardíaca sistólica podem ser subdivididas em
tratamentos não farmacológicos, os tratamentos farmacológicos e procedimentos
mecânicos-cirúrgicos.
Os tratamentos não farmacológicos incluem a otimização do nível de
atividade física de acordo com a situação clínica do paciente, regulação do consumo
de sal e de líquidos, restringida de acordo com a superfície corporal, na busca de um
estado normovolêmico, e medidas nutricionais com uma dieta protéico-calórica
adequada as comorbidades do paciente (GHEORGHIADE, 2004).
Os tratamentos farmacológicos da insuficiência cardíaca são realizados
através do uso combinado de várias classes de medicamentos tais como digitálicos,
beta-bloqueadores adrenérgicos, antagonista da aldosterona, antagonistas dos
receptores de angiotensina II, inibidores da enzima conversora de angiotensina
inibidores de fosfodiesterase(GHEORGHIADE et al, 2004; FIGUEIREDO &
MACHADO, 2010).
Várias
intervenções
cirúrgicas
como
revascularização
do
miocárdio,
restauração ventricular, ressincronização ventricular, cirurgia da valva mitral,
transplante cardíaco e terapia celular são consideradas na correção de
complicações derivadas da condição de Insuficiência Cardíaca Sistólica, como por
exemplo, infarto agudo do miocárdio, cardiomiopatia isquêmica, valvulopatias,
arritmias e bloqueios (I DIRETRIZ LATINO-AMERICANA PARA AVALIAÇÃO E
CONDUTA
NA
INSUFICIÊNCIA
CARDÍACA
DESCOMPENSADA,
2005;
EXECUTIVE SUMMARY: HFSA 2010 COMPREHENSIVE HEART FAILURE
PRACTICE GUIDELINE, 2010).
Atualmente, a terapia medicamentosa para o tratamento da ICS faz uso de
várias classes de medicamentos:
2.3.1 Digitálicos
Aproximadamente 1,7 milhões de pacientes nos Estados Unidos com
insuficiência cardíaca ou fibrilação atrial recebem digoxina, permanecendo como um
dos medicamentos mais prescritos para pacientes com insuficiência cardíaca. A
digoxina , considerada uma glicosídeo digitálico, pode ser dividida em duas regiões
distintas quimicamente; uma parte esteróide, chamada aglicona ou genina e uma
parte glicosídica, ligada à genina pela hidroxila ß do carbono 3 (Figura 2) (BAGROV
& SHAPIRO, 2008).Existem similitudes na base estrutural entre compostos da classe
das fisalinas e digoxina, possuindo o grupamento como grupamento em comum,
porém sem correspondência farmacológica.
Figura 2: Estrutura química da digoxina (adaptado de HIRABAYASHI, 2011) e Fisalina B.
Inicialmente descoberta por Jens Christian Skou em 1965, a bomba Na+,K+ ATPase (NKA) está presente nas membranas plasmática de todas as células
(SKOU,1965) configurando-se dois estados estacionários, E1 e E2, em um ciclo que
recebe energia da hidrólise de uma molécula de ATP para a mudança de
conformação.
Os esteróides digitálicos se ligam a NKA quando está permanece no estado
estacionário E2, onde NKA está voltada para o meio extracelular, liberando Na + para
o meio extracelular e expondo os sítios de alta afinidade por K+. Assim, a ligação ao
estado E2 impede a mudança conformacional para E1 e assim, a manutenção do
gradiente eletroquímico.
A inibição de NKA aumenta a concentração intracelular de Na+, causando a
inversão do trocador Na+- Ca2+, o que leva ao aumento do influxo de Ca2+ e o efluxo
de Na+, resultando no aumento da concentração intracelular de Ca2+, uma
disponibilidade maior de Ca2+ para a célula, e um aumento na força de contração
miocárdica (SCHONER & SCHEINER-BOBIS, 2007).
Além do efeito inotrópico causado pela digoxina, seu principal uso na
insuficiência cardíaca se deve aos efeitos benéficos que exerce na modulação das
alterações neuro hormonais presentes na insuficiência cardíaca (GHEORGHIADE et
al, 2004)
Digoxina exerce diversos efeitos na modulação neuro hormonal.
•
Função Barorreceptora; em modelos de insuficiência cardíaca de baixo
debito, existe uma atenuação da sensitividade de descarga do seio carotídeo.Uma
atenuação dos barorreceptores para modular a ativação excessiva do sistema
sismpático pode resultar no aumento dos níveis séricos de norepinefrina,
vasopressina e ativação do sistema renina-angiotensina-aldosterona (HOLTZ,1987).
A administração de digoxina produz uma melhora na função dos
barorreceptores que resulta na diminuição da ativação do sistema nervoso
simpático, além de provocar uma diminuição na síntese e secreção de renina,
consequentemente,
diminuindo
a
ativação
do
sistema
renina-angiotensina-
aldosterona. Essa ação pode ser relacionada a um efeito direto no rim (CHURCHILL,
1985), inibição da atividade simpática (THAMES, 1979) ou ativação do peptídeo
natriurético atrial (LARAGH, 1985).
•
Efeito Simpático Inibitório; a digoxina tem um efeito simpático inibitório direto
que não parece ser relacionado a um aumento do débito cardíaco produzido pelo
fármaco. Por exemplo, dobutamina e digoxina causam um aumento similar no débito
cardíaco na insuficiência cardíaca, mas somente o último diminui a descarga
simpática. Ferguson em 1987 propõe 4 mecanismos em potenciais para a ação
inibitória da digitais em pacientes com insuficiência cardíaca; uma ativação direta
dos barorreceptores aórticos através do aumento da pressão arterial, ativação direta
dos barorreceptores cardiopulmonares , uma ação inibitória mediada centralmente e
uma sensibilização de mecanismos devido a uma ação de digitalis (FERGUSON,
1989).
•
Efeito Vagomimético;
Digitalis tem mostrado em estudos efeito vagomimético relacionado a
estimulação do núcleo central vagal e sensibilização de tecido cardíaco a acetilcolina
exógena enquanto digoxina em doses terapêuticas aumenta o tônus vagal,
diminuindo a condução sinoatrial e atrioventricular (SMITH, 1984).
2.3.2 Agonistas β1 adrenérgicos
Os agonistas ß1 adrenérgicos tem sido vastamente usados para o tratamento
da insuficiência cardíaca, sendo atribuída a sua ação à interação com receptores ß1
adrenérgicos presentes na musculatura cardíaca, responsáveis pelo efeito inotrópico
positivo.
Fármacos como a dobutamina e dopamina promovem a ativação dos
receptores ß1 adrenérgicos, acoplados a enzima adenilil ciclase, aumentando os
níveis de AMPc, e consequentemente , ativando a proteína quinase dependente de
AMPc (PKA), que fosforila canais de Ca2+ presentes na membrana, causando o
influxo de íons Ca2+ e também liberando grandes quantidades de Ca 2+ do retículo
sarcoplasmático , por fosforilação de receptores de rianodina , promovendo um
efeito inotrópico (OVERGAARD & DZAVÍK, 2008).
Os principais fármacos usados na terapia ß1 adrenérgica são a dopamina e
dobutamina, sendo vários os efeitos adversos relacionados ao aumento do influxo
intracelular de cálcio promovido pela estimulação ß1 adrenérgica: aumento da
demanda de O2 pelo miocárdio, isquemia miocárdica, arritmias cardíacas, ativação
de proteases, endonucleases e fosfolipases intracelulares, componentes do
processo de morte e necrose celular (CODY, 1988; BRISTOW et al ,1990).
2.3.3 Inibidores de fosfodiesterase
Fosfosdiesterases (PDE) são uma classe de enzimas capazes de clivar a
ligação fosfodiéster tanto no monofosfato de adenosina cíclico (AMPc) quanto no
monofosfato de guanosina cíclico (GMPc).Elas são responsáveis por controlar a
concentração intracelular de AMPc e GMPc hidrolizando-os a 5´-AMPc e 5´-GMPc
(OMORI & KOTERA, 2007; BENDER & BEAVO, 2006).
O genoma humano possui 21 genes que expressam PDE, categorizados em
11 famílias (OMORI & KOTERA, 2007) nas quais são baseadas pela sequência
protéica, especificidade de substrato, propriedades enzimáticas, sensibilidade a
inibidores seletivos e distribuição tecidual (KOTERA, 2005; BEAVO et al, 1994;
UCKERT et al, 1994; DOUSA, 1999).
Algumas PDEs são altamente especificas para AMPc (PDE4, PDE7, PDE8)
ou GMPc (PDE5, PDE6, PDE9) e uma grande parte possuem uma atividade não
específica (PDE1, PDE2, PDE3, PDE10, PDE11) (PUZZO et al, 2008; FRANCIS et
al, 2001). PDE3 e PDE4 estão expressas no coração e participam do processo de
acoplamento excitação contração , atuando na regulação do AMPc, homeostase do
Ca2+ e contratilidade do coração (BECA et al, 2011).
Os inibidores de fosfodiesterase possuem também um efeito vasodilatador
periférico, através da elevação dos níveis intracelulares de GMPc e produção de
óxido nítrico. Os principais representantes dessa classe incluem a amrinona e a
milrinona, que são muito semelhantes do ponto de vista químico e farmacológico.
Ambas melhoram os índices hemodinâmicos em pacientes com insuficiência
cardíaca, porém agravam paradoxalmente a sobrevida, em virtude de seu efeito pro
- arrítmico (ROHDE & RIBEIRO, 1994).
Fármacos com atividade inibidora de fosfodiesterases promovem a inibição da
degradação de AMPc, aumentando a disponibilidade e a concentração de cálcio na
célula e o inotropismo cardíaco (BERS, 2001)
2.3.4 Sensibilizadores ao cálcio
Os sensibilizadores ao cálcio representam uma nova classe de fármacos
inotrópicos que são caracterizados pelo aumento da contratilidade cardíaca sem um
aumento correspondente no consumo de oxigênio pelo miocárdio ou uma prédisposição aumentada para arritmias (LEVIJOKI et al, 2000).
Seu mecanismo de ação se baseia no aumento da contratilidade associada à
sensibilidade dos miofilamentos cardíacos sem influência do Ca2+ externo. Este
efeito aumenta o inotropismo cardíaco usando a concentração de cálcio disponível
no retículo sarcoplasmático e sem risco associados pela sobrecarga de cálcio, como
vemos em agonistas β-adrenérgicos e inibidores de fosfodiesterases (PERRONE &
KAPLINSKY, 2005).
Os principais representantes desta classe são pimobendan e levosimedan. A
contratilidade miocárdica e a hemodinâmica são melhoradas pelo levosimedan
comparativamente à ß agonistas e inibidores de fosfodiesterase, possuindo estes
medicamentos também ação vasodilatadora como resultado da ativação de canais
de potássio (HAIKALA & LINDEN, 1995)
Todas
as
terapias
inotrópicas
citadas
acima
com
exceção
dos
sensibilizadores ao cálcio aumentam a contratilidade miocárdica pelo aumento de
AMPc , atividade de proteína quinase A ou inibição de NKA para estimular o influxo
de Ca2+.
Sendo assim, o risco de sobrecarga de Ca2+ e arritmias são intrínsecos ao
seu mecanismo de ação, tendo seu valor clínico limitado pela estreita margem
terapêutica desses agentes. (MESQUITA & MADY, 1994; I CONSENSO SOBRE
MANUSEIO TERAPÊUTICO DA INSUFICIÊNCIA CARDÍACA, 1998; COELHO et al,
1998; II DIRETRIZES DA SOCIEDADE BRASILEIRA DE CARDIOLOGIA PARA O
DIAGNÓSTICO E TRATAMENTO DA INSUFICIÊNCIA CARDÍACA, 1999).
Vários agentes inotrópicos, incluindo inibidores de fosfodiesterases, que
aumentam a concentração de cálcio intracelular têm demonstrado exercer um efeito
pró-arrítmico e aumentar o risco de morte súbita, hipocalemia (em alguns casos
provocados
pela
associação
a
diuréticos),
hipomagnesemia,
e
uma
alta
concentração intracelular de cálcio podem ser importantes como fatores primários ou
gatilhos para desencadear a morte súbita (ZIPES & WELLENS 1998).
2.4. Inotrópicos sob investigação.
2.4.1 Novos Inibidores de Na+,K+-ATPase
Uma nova droga, Istaroxima, surge como um protótipo para um fármaco com
capacidade de inibição da bomba Na+, K+-ATPase, promovendo inotropismo
positivo, e lusitropismo negativo, devido a ativação da SERCA2a , aumentando a
recaptação de cálcio, melhorando simultaneamente parâmetros de contratilidade e
relaxamento (METRA et al, 2011).
Trabalhos relatam a atuação de istaroxima em modelos animais, cobaio e
cão, no aumento do inotropismo (MICHELETTI et al, 2007), diminuição do volume
final sistólico e diastólico final e aumento da fração de ejeção (SABBAH et al , 2007).
Estudos em pacientes insuficientes cardíacos crônicos com disfunção sistólica do
ventrículo esquerdo mostraram melhoras na redução da pressão de capilar
pulmonar e o volume diastólico final (SHAH et al, 2009).
2.4.2 Ativadores da Miosina Cardíaca
Outra nova classe de fármacos em desenvolvimento são ativadores de
miosina que atuam na transição de uma configuração fraca do complexo actinamiosina para uma configuração fortemente ligada. Isto promove o prolongamento do
estado de sístole, e aumento do volume de ejeção, sem efeitos colaterais como
aumento de AMPc e cálcio interno.
Esses
agentes
ativam
diretamente
a
miosina
ATPase
miocárdica,
aumentando a taxa da formação de ciclo de pontes cruzadas, então, aumentando a
duração e quantidade da força de contração no miócito, sem efeito no influxo de
cálcio ou aumento do AMPc.
Teerlink e colaboradores demonstraram que um ativador seletivo de miosina
cardíaca, CK-1827452, conhecido como omecamtiv mecarbil, foi capaz de aumentar
de forma concentração dependente tanto a atividade miosina ATPase quanto a
fração
de
encurtamento em
ratos induzidos a
insuficiência
cardíaca
ou
sham(TEERLINK, 2009a ;TEERLINK et al, 2009b).
2.4.3 Ativadoras da SERCA2a
Vírus adeno-associados (AVV) são pequenos vírus de DNA pertencente à
família Parvoviridae não envelopado, não patogênico utilizados hoje como
componentes no desenvolvimento de uma estratégia para o tratamento da
Insuficiência cardíaca em estado avançado. Isto inclui pacientes de classe III/IV e
com fração de ejeção ventricular esquerda menor do que 30%. AVVs portadores de
um gene para a SERCA2a são injetados de forma intra coronária em pacientes
portadores de Insuficiência cardíaca, obtendo-se a longo prazo (6 - 12 meses)
melhoras significativas em aspectos sintomáticos, estruturais e funcionais (JASKI et
al , 2009)
2.5 Participação do segmento no mercado de medicamentos
Pesquisas mostram que o mercado global de drogas cardiovasculares está
previsto exceder US$ 111.8 bilhões até 2015. O crescimento se deve ao
envelhecimento da população, grande número de pacientes e o aumento da
incidência de doenças cardiovasculares. Hoje temos fatores de risco líderes como o
tabaco, alto colesterol, hipertensão, diabetes, obesidade e sedentarismo (GLOBAL
INDUSTRY ANALYSTS, 2010).
No último século, as condições de vida e saúde têm melhorado de forma
contínua e sustentada na maioria dos países, devido principalmente aos progressos
políticos, econômicos, sociais e ambientais, assim como aos avanços da tecnologia
médica (BUSS, 2000).
No Brasil, o envelhecimento da população é um fenômeno relativamente
recente, existindo muitos estudos que apontam, de forma recorrente, a
irreversibilidade do processo, diante do comportamento da fecundidade e da
mortalidade registrado nas últimas décadas e do esperado para as próximas
(CALDAS, 2003).
A elevação da qualidade de vida, tais como melhorias nutricionais, elevação
do nível de higiene pessoal, melhores condições ambientais no trabalho e nas
residências, levaram a uma acentuada redução nas taxas de mortalidade,
particularmente nos primeiros anos de vida.
A modificação do modus vivendi de grandes centros urbanos, caracterizando
uma estrutura familiar de pequeno porte, com baixo número de indivíduos, atua de
forma decisiva em uma modificação do padrão reprodutivo das populações,
reduzindo a taxa de fecundidade (VERAS, 1988).
Então, aliado a redução da mortalidade, o crescimento da população com
mais de sessenta anos pode ser explicado pela redução nas taxas de fecundidade,
principalmente nos centros urbanos.
Todas essas modificações na estrutura da sociedade levam a um
estreitamento da pirâmide populacional, aumentando o número de idosos na
população total em detrimento ao número de jovens, consequentemente, mudando a
expressão de doenças associadas aos segmentos etários. O Brasil, desde a década
de 40, vem passando por um processo de inversão das curvas de mortalidade em
que se observa um declínio na mortalidade por doenças infecciosas e um
concomitante aumento na mortalidade por doenças crônicas não transmissíveis e
causas externas.
Em virtude da nítida tendência no crescimento da população idosa, devido a
uma melhora no desenvolvimento de tecnologias médicas e ao crescimento da
abrangência da medicina preventiva, temos o aumento da expectativa de vida da
população.
Diante desse fato, há um provável aumento na prevalência de doenças
cardíacas, portanto, havendo uma maior procura por remédios relacionados a
doenças cardiovasculares.
2.7 Acoplamento excitação contração.
2.7.1 Histórico:
Desde meados dos anos 60 até os dias atuais, vêm se descobrindo novos
aspectos
sobre
o
processo
de
acoplamento
excitação-contração
e
seus
componentes.
Em 1960, foram realizadas várias descobertas no campo da morfologia
celular, relacionadas ao processo de acoplamento excitação-contração, como a
existência de pontos específicos de membrana com um menor limiar para a
contração, denominados “hot spots” (HUXLEY & STRAUB 1958a; HUXLEY &
TAYLOR, 1958b) e a conexão estrutural entre os túbulos t e o retículo
sarcoplasmático, descobertos através de microscopia eletrônica (FRANZINIARMSTRONG,1970).
Os anos 70 trouxeram o debate sobre a natureza da transmissão do impulso
da membrana plasmática para as tríades em músculo esquelético. Sobressaiu-se
um modelo para o acoplamento mecânico entre um sensor de voltagem, mais tarde
conhecido como receptor de diidropiridina (DHPR), e uma via de liberação de cálcio
na membrana do retículo sarcoplasmático.
Houve um avanço nos anos 80, no que concerne sobre a natureza do
receptor responsável pela liberação de cálcio, reconhecido como uma proteína de
alto peso molecular e uma alta afinidade pelo alcalóide chamado rianodina, que deu
nome a este mesmo receptor (MEISSNER, 1986; SMITH et al, 1985; FLEISCHER et
al, 1985; INUI et al, 1987). Nos anos seguintes, foram descobertas as isoformas do
receptor em vários tecidos, sendo RYR1 presente em músculo esquelético, RYR2
em músculo cardíaco e RYR3 inicialmente identificado no cérebro, mas não
exclusivamente nesse tecido.
Atualmente, estudos eletrofisiológicos em modelo de whole cell têm
possibilitado localizar sítios de interações moleculares entre DHPR e RYR, usando
técnicas como Ressonância de fluorescência por transferência de energia (FRET) e
biotinilação metabólica (PAPADOPOULOS, 2004; LORENZON et al, 2004).
2.7.2 Fisiologia do Processo de Acoplamento Excitação contração
O trabalho de Sidney Ringer, em 1883, demonstrou em preparação de
coração isolado de sapo, o papel crucial do cálcio na natureza da contração
muscular cardíaca (BEERS, 2001).
Em 1952, baseado nos trabalhos de Katz (KATZ, 1950), Alexander Sandow
teorizava sobre como a excitação da membrana plasmática resultava em contração
e qual o processo existente na transmissão de um sinal a partir da superfície da
membrana até os elementos contráteis. Essa série de reações – excitaçãotransmissão de sinal - contração- foi designada, então com o termo de Acoplamento
Excitação-Contração.
Várias estruturas celulares estão envolvidas nesse processo (Figura 3). Um
sistema tubular longitudinal (HUXLEY, 1964) é capaz de conduzir de modo
regenerativo (BEZANILLA et al, 1972; GONZALEZ-SERRATOS, 1971; PEACHEY &
ADRIAN, 1973) o impulso elétrico gerado a partir da superfície de membrana. O
sinal é então conduzindo até estruturas conhecidas como cisternas terminais
(FRANZINI-ARMSTRONG; 1970; 1973), na fibra muscular, quando é atingido o
limiar de excitação, favorecendo o estado aberto de canais de cálcio dependentes
de voltagem.
Figura 3. Representação do processo de acoplamento excitação contração cardíaco. (Adaptado de
DONALD M. BERS, 2002)
Diferentemente do estado de repouso, em que a concentração interna de
cálcio não ultrapassa 0,1 µM. Após a abertura dos DHPR, o nível interno de cálcio
intracelular cresce, atingindo a concentração de 1 µM como limiar para a ativação
do ciclo de pontes cruzadas e , posteriormente chegando ao máximo de 100 µM, na
ativação máxima do aparelho contrátil.
O aumento citosólico local de cálcio na cisterna terminal, decorrente da
abertura dos DHPR, favorece a ativação dos receptores de rianodina, posicionados
diametralmente opostos. O crescimento da concentração de cálcio ao redor dos
receptores de rianodina promove sua abertura, com liberação do cálcio sequestrado
pelo retículo sarcoplasmático. Há, portanto, amplificação do sinal e a ocorrência de
um fenômeno chamado de liberação de cálcio induzida por cálcio (MEISSNER,
2004).
O cálcio então se liga à troponina C, resultando uma diminuição da
capacidade inibitória da troponina I sobre troponina C, no filamento de actina. A
desestabilização
da
molécula
de
troponina
I
resulta
em
uma
mudança
conformacional do complexo tropomiosina-troponina, a partir do qual, através do sitio
de ligação para miosina, haverá a formação das pontes cruzadas.
A formação de pontes cruzadas resulta a hidrólise do ATP, e a mudança
conformacional da cabeça pesada de miosina possibilita a ligação de uma nova
molécula de ATP. Assim, há a liberação da ponte cruzada existente e a formação de
uma nova.
O ciclo de pontes cruzadas irá continuar até que todo o cálcio seja ativamente
removido do citoplasma através de bombas eletrogênicas como o trocador Na +/Ca2+
e Ca2+-ATPases, presentes na membrana, tanto do retículo sarcoplasmático quanto
da fibra muscular.
A variação entre ultra-estruturas celulares de átrio e ventrículo faz com que o
aumento da concentração intracelular de cálcio ocorra com propriedades espaciais e
temporais distintas.
É intrínseco à ultra-estrutura do acoplamento excitação-contração do miócito
ventricular a presença de um sistema de túbulos transversos (SONG et al, 2005)
orientados de forma axial e perpendicular (AYETTEY & NAVARATNAM, 1978),
constituindo uma rede tubular profunda que aproxima DHPR e canais de rianodina,
formando um sinalossoma, região especializada e espacialmente relacionada
(CHEN-IZU et al , 2006).
Diferentemente do miócito ventricular, o processo de acoplamento excitaçãocontração do miócito atrial difere estruturalmente no que concerne a presença de
uma rede de túbulos t cuja origem reside na membrana do retículo sarcoplasmático
e estão orientados, não de forma axial e perpendicular (BRETTE & ORCHARD,
2003), mas transversa, sendo uma forma rudimentar de compartimentalização
(Figura 4)
Figura 4: Estrutura de miócitos cardíacos ventriculares e atriais de rato. Painéis A e B mostram
porções de um miócito ventricular e atrial,respectivamente.Eles ilustram o posicionamento relativo de
alguns elementos chave envolvidos no acoplamento excitação contração.A rede dos elementos do
reticulo sarcoplasmático circunda tanto as miofibrilas quanto mitocôndrias.Painel C mostra a topologia
de uma miofibrila relativa a secção de miócito mostrada em A.(Adaptado de MARTIN D. BOOTMAN,
2006)
Dado a formação dessa rede, a origem do aumento no transiente de cálcio
em miócitos atriais (Figura 5) está presente em uma região periférica na fibra
(MACKENZIE et al, 2001; MACKENZIE et al, 2004), onde estão co-localizados os
DHPR e receptores de rianodina.
Figura 5: Sinalização espacialmente heterogênea de Ca
2+
durante um acoplamento excitação
contração atrial. Painel A mostra o desenvolvimento de um transiente de Ca
2+
logo após uma
despolarização, em um único miócito atrial. Painel B mostra o desenvolvimento temporal e espacial
de um sinal de Ca
2+
em uma célula atrial. A concentração de Ca
2+
é indicada por altura e coloração
2+
2+
dos picos (azul/verde indicam baixas [Ca ] e amarelo/vermelho, altas [Ca ]). Um anel periférico de
2+
Ca
2+
é evidente, junto com um acentuado “vale” de baixa [Ca ] no centro da célula (Adaptado de
MARTIN D. BOOTMAN, 2006).
A densidade e a morfologia dos túbulos t não diferem somente entre miócitos
atriais e ventriculares, mas também podem variar intensamente entre células do átrio
esquerdo e direito. Além disso, dentro de deferentes câmaras atriais, o padrão de
túbulos t varia de célula para célula (KIRK et al, 2003; TIDBALL et al, 1991; WOO et
al, 2005). A inconsistência na expressão, densidade e morfologia dos túbulos t nas
células atriais faz com que a contração atrial seja um fenômeno complexo, por ter
uma variabilidade substancial em resposta a células adjacentes no átrio.
2.8 Liberação de cálcio induzida por cálcio (CIRC)
O mecanismo de liberação de cálcio induzida por cálcio é uma das formas
mais primitivas, do ponto de vista filogenético, no que se refere a acoplamento
excitação contração. Músculos esqueléticos presentes em invertebrados já
possuíam similaridades neste mecanismo comparado aos mamíferos (GYÖRKE &
PALADE, 1993, 1994).
Primeiramente caracterizado em fibras esqueléticas permeabilizadas (ENDO
et al, 1970), Alexandre Fabiato e Françoise Fabiato, de 1973 até 1985, realizaram
grandes contribuições para o entendimento do fenômeno celular de liberação de
cálcio induzida por cálcio (FABIATO & FABIATO, 1973, 1975a, b, 1978a, b, 1979;
FABIATO 1981, 1983, 1985a-c). O ápice se deu em 1985 quando utilizaram fibras
de purkinje caninas, mecanicamente permeabilizadas, na qual a ausência de túbulos
t as tornava mais adequadas para o estudo do fenômeno.
A CIRC só é possível com a formação de um microdomínio conhecido como
díade, onde a porção juncional do retículo sarcoplasmático e o túbulo t se
encontram, separados por uma fissura juncional (12 a 15 nm) (FRANZINIARMSTRONG et al, 1999). Estudos em microscopia eletrônica por criofratura
mostram a localização dos canais de Ca2+ tipo L preferencialmente na região dos
túbulos t, em oposição espacial aos canais de rianodina (FRANZINI-ARMSTRONG &
PROTASI, 1997).
No âmbito do acoplamento excitação-contração, a corrente de Ca2+
durante a fase de platô do potencial de ação cardíaco não é suficiente para
promover a ativação dos miofilamentos per si (BASSINGTHWAIGHTE & REUTER,
1972). A interação entre as redes formadas pelo retículo sarcoplasmático e túbulos t
permite a formação de um mecanismo de liberação de Ca 2+ dos estoques
intracelulares do miócito.
Durante o estágio de despolarização inicial, os canais de Ca 2+ tipo L abrem,
permitindo a entrada de Ca2+, então a concentração de Ca2+ na díade cresce (10 a
20 µM) em menos de 1 ms, e o Ca2+ liga ao canais de rianodina, aumentando a sua
probabilidade de abertura. A abertura leva a uma maior liberação de Ca 2+ a partir de
uma região especializada do retículo sarcoplasmático, a porção juncional do retículo
sarcoplasmático (GREENSTEIN & WINSLOW, 2011).
A quantidade de Ca2+ liberada é significantemente maior do que a quantidade
de Ca2+ que entre via canais de Ca2+ tipo L. O fluxo de liberação de Ca2+ é uma
função contínua do influxo de Ca2+, um fenômeno inicialmente observado por
Fabiato, a liberação gradual de Ca2+. Quando se relaciona a frequência com que
ocorre a entrada de Ca2+ via canais de Ca2+ tipo L com a ativação de receptores e
consequente liberação de Ca2+, temos o ganho desse tipo de sistema, ou seja, a
frequência de entrada de Ca2+ necessária para dispara o fluxo de Ca2+ via canais de
rianodina (GREENSTEIN & WINSLOW, 2011).
O aumento rápido e largo na díade da concentração de Ca 2+ leva a difusão do
Ca2+ da díade para o citosol.Como a concentração de Ca 2+ citosólico aumenta, Ca2+
liga a troponina C nos miofilamentos e inicia a contração no miócito.
2.9 A liberação de cálcio via IP3R
Desde sua descoberta, em 1983, como D-mio-inositol-1,4,5-trifosfato (IP3)
(STREB, 1983) , este tem adquirido suma importância como segundo mensageiro
celular, não somente na dinâmica da contração muscular cardíaca (KOCKSKÄMPER
et al, 2008) , mas também na contração em músculo liso vascular, com influência na
resistência periférica e consequentemente no sistema cardiovascular em geral.
A liberação de cálcio mediada por IP3 se relaciona diretamente com a
ativação do seu maior alvo, o receptor de IP 3(IP3R), descoberto por Hirata e
colaboradores em 1984 em vesículas de retículo sarcoplasmático no coração
(HIRATA et al, 1984). Filogeneticamente existem três subtipos de receptores; IP 3R1,
IP3R2 e IP3R3. Eles diferem em suas afinidades por IP3, expressão celular,
distribuição subcelular e associação com proteínas acessórias (TAYLOR &
STEPHEN 2010). Receptores de IP3 são bem menos expresso no coração em
comparação a RYR´s em uma taxa de 100:1. Há diferenças também entre câmaras
cardíacas, verificando-se que IP3R são encontrados 5 vezes menos em miócitos
ventriculares do que em células atriais( LI et al, 2005; DOMEIER et al, 2008; LIPP et
al, 2000)
Estruturalmente, a configuração tetramérica do IP3R possui intrinsecamente
um caráter de cooperatividade positiva na interação de IP 3 aos seus sítios de ligação
(BOEHNING & JOSEPH, 2000a).Foskett em 2007 por meio de expressão de IP3R
com uma das subunidades mutantes, verificou que duas moléculas de IP3 já
promoviam a abertura do canal.
Vites e Pappano, em 1990, demonstraram o poder de indução de contrações,
via IP3, em preparações cardíacas permeabilizadas de aves. Em 1986, Fabiato,
observou o mesmo efeito de liberação de cálcio em mamíferos, utilizando
preparações permeabilizadas de miócito de rato, porém, ressaltando que seu efeito
era inferior ao fenômeno de liberação de cálcio induzida por cálcio (FABIATO a,b,
1986, 1990).
Quantitativamente, temos uma maior expressão dos receptores de rianodina
no miócito ventricular cardíaco, perfazendo a quantidade de 500-1000 fmol/mg de
proteína total , em várias espécies e mamíferos (BERS, 1993), justificando uma
maior participação no fenômeno de liberação de cálcio a partir do retículo em
relação aos IP3R.
2.10 Liberação de cálcio via RYR
Em 1878, quando John Newport Langley estudava os efeitos do antagonismo
entre a atropina e pilocarpina, extraída dos galhos e folhas de Pilocarpus jaborandi
(GERRARD, 1875, apud HOLMESTED, 1979), na salivação de glândulas maxilares
de cão, nascia o conceito de interação droga-receptor (MAEHLE, 2004). Teria dito
ele:
“Existem alguma substância ou substâncias na terminação nervosa ou célula de
glândulas, na qual ambos, atropina e pilocarpina, são capazes de formar
compostos.” (LANGLEY, 1878, p.364)
Somente em 1909, com os trabalhos de Paul Ehrlich teríamos então o termo
“receptor” (STREBHARDT & ULLRICH 2008).
Primeiramente, isolado das raízes e caule de Ryania speciosa para uso como
potencial inseticida (ELISON & JENDEN 1967; JENDEN & FAIRHURST, 1969), o
alcalóide rianodina foi usado para posterior identificação de um canal para liberação
de cálcio presente no retículo sarcoplasmático (ELISON & JENDEN 1967;
FAIRHURST, 1973; FRANK, 1975, NAYLER et al, 1970; SUTKO & WILLERSON,
1980; SUTKO et al, 1983), caracterizando uma potente ação paralisante tanto em
músculo esquelético quanto cardíaco, e sendo mais tarde conhecido como canal ou
receptor de rianodina.
A capacidade inibitória do alcalóide rianodina no canal de cálcio presente no
retículo sarcoplasmático se faz através de uma ligação de alta afinidade em uma
proteína presente em sua membrana (CANNELL et al, 1985; FABIATO, 1981;
FRANK & SLEATON, 1985).
A caracterização do canal através de purificação (FLEISCHER, 1945;
HYMEL, 1988; LAI, 1988; PESSAH, 1986), microscopia eletrônica (INUI, 1987)
revelou a sua estrutura tetramérica e similaridade entre canais de liberação de cálcio
localizados em diferentes regiões do miócito (FERGUSON, 1984; FRANZINIARMSTRONG, 1970).
A ativação dos receptores de rianodina presentes no músculo cardíaco por
cálcio começa em concentrações sub molares, e alcança um máximo (em uma p0
máxima) próximo a 100 μM, decrescendo em altas concentrações de cálcio (5-10
mM) (ROUSSEAU & MEISSNER, 1989; XU et al, 1998).
Os trabalhos de Xu e colaboradores em 1988 demonstravam que os canais
de rianodina presente no músculo cardíaco possuíam diferenças quanto ao modo
como eram ativados por cálcio comparados ao músculo esquelético. Tipicamente, os
canais de rianodina do músculo cardíaco são ativados em uma maior medida do que
os canais do músculo esquelético, quando só existe o cálcio como ligante, e
requerem uma maior concentração de cálcio para sua própria inibição do que o
músculo esquelético.
A dependência, de forma bimodal, da atividade do canal por cálcio sugeria na
época a existência de sítios de ligação ao cálcio de alta-afinidade e baixa afinidade,
acessíveis a partir do lado citosólico em relação ao retículo sarcoplasmático. O
gráfico original abaixo (Figura 6) demonstra claramente uma maior dependência de
cálcio para um aumento na probabilidade de abertura (P0), representada como uma
função do cálcio citosólico livre, dos canais de rianodina presentes no músculo
cardíaco (XU et al., 1998).
Figura 6:Dependência de cálcio de receptores de rianodina de músculo esquelético (RYR1) e
cardíaco (RYR2) (Adaptado de XU ,1998).
Receptores de rianodina podem intrinsecamente (YIN & LAI 2000; YIN et al,
2005) se organizar em um arranjo regular semelhante a um padrão de um tabuleiro
de damas, sendo cada receptor representado por um quadrado. Cada canto do
quadrado estaria em contato com outro receptor vizinho, assim criando um padrão
para um arranjo do aglomerado de receptores de rianodina (YIN, 2008).
Experimentos em membranas in vitro (MARX et al, 1998) demonstraram a
ativação sincronizada desse tipo de receptor, sendo consistente com uma
modulação alostérica intermolecular correndo pro meio da interação física entre
receptores. Marx e colaboradores demonstraram através de experimentos em patch
clamp o desacoplamento funcional em virtude da adição de rapamicina, um inibidor
do fragmento FKBP12.6, responsável pela interação intermolecular desses
receptores (MARX et al, 2001)
Os receptores de rianodina se interligam através do subdomínio seis, um
subdomínio de oligomerização, promovendo uma interação física entre os quatro
cantos do receptor e estabelecendo um padrão como tabuleiro de damas, lado a
lado, e em uma maior magnitude, formando arranjos bidimensionais cristalinos.
A partir de uma técnica de microscopia de localização imunocitoquímica de
alta resolução, David Baddeley em 2009 mostrou que aglomerados de receptores de
rianodina podem variar em tamanho, morfologia, distribuição e distância centro a
centro (BADDELEY, 2009)
Receptores de rianodina tipo 2 não possuem somente um acoplamento físico
através de uma interação proteína-proteína, mas também um acoplamento funcional
através de um grupamento protéico do receptor FKBP12.6.Experimentos por
técnicas de patch clamp realizados em receptores de rianodina tipo 2 de
cardiomiócitos isolados de cães, demonstraram que após incubados com
rapamicina, um bloqueador que destrói o grupamento FKBP12.6, os receptores
mostrarem um perfil de desacoplamento funcional, ocorrendo a reversão para o
estado de acoplamento mediante inserção de FKBP12.6 novamente.É portanto
plausível pensar em uma abertura e fechamento dos canais de forma ordenada e
conjunta (MARX et al, 2001a).
2.10.1 Estrutura e modulação do receptor
Receptores de rianodina possuem uma estrutura molecular homotetramérica,
com massa total > 2MDa, possuindo cada subunidade
massa molecular
>550
kDa.Estão localizados de forma residente na membrana do retículo sarcoplasmático,
controlando a concentração luminal de cálcio desta organela (HAMILTON &
SERYSHEVA, 2009).
Estruturalmente, o receptor de rianodina é divido em uma região
citoplasmática (280 x 280 x 120 ºA) conectada por um segmento a uma região
transmembrana.
O receptor de rianodina possui em sua estrutura terciária, vários sítios de
modulação de atividade, localizados principalmente em sua porção citoplasmática Nterminal, que serve de ancoradouro para interações proteína-proteína, favorecendo
assim, uma modulação funcional do receptor (ZALK et al, 2007).
Canais iônicos, como canais de cálcio regulados por voltagem (Cav1.1 e
Cav1.2), proteínas quinase, como proteína quinase dependente de AMPc ,FKBP12 e
12.6, cálcio calmodulina (CaM), cálcio calmodulina quinase II(CaMKII), proteínas
estruturais como triadina , juntina e calsequestrina formam o núcleo de um complexo
macromolecular que regula a liberação de cálcio através do receptor de rianodina (
LANNER et al, 2010)
Então, existe uma rede de interações nas quais características como
estrutura, função e regulação exercem um efeito definitivo na função fisiológica do
receptor de rianodina. E apesar das isoformas possuírem 65% de homologia na
sequência protéica, elas respondem diferentemente aos moduladores.
2.11 Modulação por Acidose
Fisiologicamente, o pH se mostra como um fator crucial na manutenção da
regulação do cálcio e desenvolvimento de força.Um dos fatores mais conhecidos por
alterar a contratilidade cardíaca é a acidose (GASKELL, 1880), sendo uma das
alterações conhecidas em condições patológicas como isquemia miocárdica ou
hipóxia.
No nível de miofilamentos, a condição de acidose, durante eventos de hipóxia
ou isquemia (JACOBUS et al, 1982), na qual o pH intracelular está diminuído,
promove a redução da sensibilidade dos miofilamentos ao cálcio e a geração de
força máxima (FABIATO, 1978a; BLANCHARD & SOLARO, 1984).
Os receptores de rianodina também atuam como elementos sensíveis a uma
diminuição de pH, onde uma redução ( pH 7.3 para pH 6.5) causa uma redução
maior que 50% na probabilidade de abertura do canal (XU et al , 1996).
Os trabalhos de Orchard de 1983 a 1998 mostram a existência de um
aumento no transiente de cálcio e, concomitantemente, uma diminuição da força
contrátil, sendo demonstrado posteriormente que o efeito inotrópico negativo da
acidose é devido a uma diminuição na responsividade do miofilamento ao cálcio
(BLANCHARD & SOLARO, 1984). A mudança de sensibilidade é atribuída a um
decréscimo tanto na afinidade de ligação de
45
Ca2+ a proteína Troponina C quanto
na afinidade de Troponina C por Troponina I (EL-SALEH & SOLARO, 1988;
SOLARO et al , 1993).
Paradoxalmente, aumentos na concentração de cálcio citosólico podem
ocorrer devido a vários fatores como competição por prótons em sítios de
tamponamento de cálcio, como Troponina C (BERS & ELLIS, 1982; VAUGHANJONES et al, 1983) e estimulação do trocador Na+/H+ por baixo pH intracelular ,
acarretando um aumento na concentração de sódio intracelular e diminuição da
atividade do trocador Na+/Ca2+ (PHILIPSON & NISHIMOTO, 1982).
Todos esses fatores contribuem para um comprometimento da capacidade
celular de extrusão de cálcio via Na+/Ca2+. Esses eventos podem contribuir para um
aumento no carregamento do reticulo sarcoplasmático e no transiente de cálcio visto
durante a acidose, porém, isto também pode levar a sobrecarga de cálcio e
consequentemente arritmias (CORABOEUF et al, 1976; KURACHI, 1982).
2.12 Modulação Por Proteína Quinase A
Kapiloff e colaboradores em 2001 mostraram que existe uma associação
estrutural e funcional entre o complexo de receptor de rianodina e proteína quinase
A, realizada através das proteínas ancoradouras de proteína quinase A (AKAP)
(KAPILOOFF et al, 2001).
A associação entre PKA e RYR2 é mediada por um grupamento isoleucinaleucina, que funciona como sítios funcionais de ancoragem, portanto, permitindo
uma regulação de RYR2 dependente de AMPc compartimentalizada ( MARX et al,
2000; 2001a, 2001b; LEHNART et al, 2005) e PKA, através de uma subunidade
regulatória ligada a AKAP.
O estado de fosforilação de PKA tem notável influência sobre a probabilidade
de abertura do canal de rianodina, no qual a fosforilação de PKA aumenta a
atividade do canal e a desfosforilação a diminui (WANG et al, 2001)
Já foi mostrado em estudos utilizando-se técnicas de patch clamp, em modo
whole cell, e cardiomiócito, elevações da concentração de AMPc locais, sugerindo
que as ações do AMPc podem ser tanto espacialmente quanto temporalmente
restritas (JUREVICIUS & FISCHMEISTER, 1996; ZACCOLO et al, 2002).
Muitos fatores impedem uma interpretação clara de estudos com fosforilações
de receptores de rianodina. Primeiramente, RYRs contêm múltiplos sítios de
fosforilação que, dependendo do seu estado de fosforilação, podem ter efeito
atenuante ou sinérgico em outros sítios, ou podem requerer fosforilação de um único
sítio para ativar completamente a enzima.
Não existe um consenso formado quanto aos sítios de fosforilação de RYR2
para PKA. Marks e colaboradores (2000) apresentaram resultados sugerindo que
PKA fosforila RYR2 somente em Ser-2809 (ou Ser-2808, dependendo da espécie)
enquanto Xiao e colaboradores (2005) identificaram Ser-2830 como um sítio de
fosforilação em camundongo, rato, coelho e humanos, e posteriormente como um
sitio exclusivo para fosforilação (XIAO et al, 2006). Já Wehrens (2006) e
colaboradores concluíram que Ser-2808 é o único sitio para PKA em RYR2, apesar
de RYR2 de camundongo com um silenciamento genético para este sitio ainda
poder ser fosforilado por PKA (BENKUSKY et al, 2007)
3 Gênero Physalis
O gênero Physalis (Figura 7) inclui cerca de 120 espécies com caracteres
herbáceos e hábitos perenes, que se distribuem pelas zonas tropicais e subtropicais
do mundo principalmente nas Américas Central e Sul (VASINA et al, 1986). Em
países como Peru, México e Estados Unidos, plantas do gênero Physalis são
consumidas como hortaliças, com destaque para P. peruviana, P. ixocarpa, P.
viscosa e P. philadelphica entre outras (SILVA, 2006).
Figura 7: Physalis angulata em seu habitat natural. Fonte: professora Otília Deusdênia Loiola
Pessoa.
Extratos ou infusões de plantas do gênero Physalis tem sido usados em
vários países na medicina popular para várias doenças como malária, asma,
hepatite, dermatite e reumatismo (LIN et al, 1992). Ainda não foi documentado, no
entanto, o uso de extratos de plantas do gênero Physalis para doenças
cardiovasculares.
Todas as partes de Physalis angulata têm sido usadas com caráter medicinal
nos sistemas fitoterápicos. As propriedades que são atribuídas por praticantes de
tratamentos naturais são as seguintes; antiasmática, antibacteriano, antigonorréica,
hipoglicemiante, antiinflamatória, antimicrobiana, anti-séptica, antiviral, diurética,
expectorante e antipirética.
O gênero Physalis é o mais evoluído na família Solanaceae, considerando o
nível de oxidação biogenética, devido à existência de metabólicos polioxigenados,
os derivados do ergostano, com funções lactonas, epóxido e enona. O sistema
enzimático nas plantas do gênero Physalis possui habilidade de oxidar o átomo de
carbono do núcleo esteroidal e da cadeia lateral, originando ampla variedade de
estruturas: fisalinas, vitafisalinas, ixocarpalactonas, acnistinas, dentre as demais
(Figura 8) (TOMASSINI et al, 2000).
Figura 8: Estruturas químicas de compostos originados por plantas do gênero Physalis.
Um grupo de substâncias, conhecidas como fisalinas, derivados esteroidais
do tipo 13,14-seco-16,24 ciclo ergostano, carbonilados em C-15, são encontradas
em muitas espécies do gênero Physalis, principalmente em folhas e raízes de
Physalis angulata (MATSUURA et al, 1970).
As fisalinas ocorrem em muitas espécies do gênero Physalis como; P.
alkekengi, P. alkekengi var francheti, P. angulata, P. ixocarpa, P. lanifolia, P. minima,
P. peruviana, P. phyladelphia, P. pubescens e P. viscosa. Já foram extraídas das
espécies citadas em torno de dezenove tipos de fisalinas, compreendendo uma
grande diversificação estrutural na produção dessas substâncias.
O grupo da Profa.Dra.Otilia Deusdênia Loiola Pessoa do Departamento de
Química Orgânica e Inorgânica da Universidade Federal do Ceará, realizou uma
colaboração com nosso grupo do Laboratório de Fisiofarmacologia Cardiorenal no
sentido de nos fornecer a partir do extrato etanólico de Physalis angulata ,
primeiramente, uma mistura esteroidal para os ensaios farmacológicos pré-clínicos,
e posteriormente, dois compostos isolados dessa mistura esteroidal, F9 e F13, afim
de investigar a ação dessa substância sobre o sistema cardiovascular.
3.1 Atividades Biológicas
Compostos desse gênero apresentam diversidades de funções biológicas
como:
3.1.1 Atividade antimicrobiana
Em recente trabalho Tomassini et al ( 2006), demonstraram a atividade do
extrato etanólico dos frutos de Physalis angulata, utilizando o método de difusão em
ágar e comparando os halos de inibição frente a cepas de Staphylococcus aureus.
Quando comparado ao controle positivo, ampicilina, o extrato etanólico dos frutos de
Physalis angulata demonstrou inibir as cepas de modo significante (LOPES et al,
2006).
3.1.2 Imunomoduladora
Soares et al(2006), obtiveram uma supressão causada pelas fisalinas,
evidenciada in vitro pela adição de 2 μg/ml de Fisalina B à reação linfocitária mista
(MLR),causando 100% de inibição da proliferação de linfócitos e inibição da
produção de um mediador de crescimento, IL-2, em camundongos de linhagem
BALB/c.Outro importante dado encontrado foi o fato das Fisalinas B e F terem
efeitos inibitórios no crescimento de muitas linhagens de células leucêmicas,
incluindo linhagens de células linfóides agudas T e B, sugerindo que essas
moléculas interferem diretamente com a proliferação linfocitária (SOARES et al,
2006)
3.1.3 Moluscicida
Experiências realizadas nos laboratórios de Farmacologia Aplicada de Far
Manguinhos/FIOCRUZ comprovam a atividade moluscicicda de P. angulata L., uma
vez que nos ensaios in vitro com espécies de caracóis Biomphalaria tenagophila,
verificou-se a mortalidade de 100% das espécies sob ação do extrato etanólico de P.
angulata (a planta inteira) na dosagem de 400 mg/L. (TOMASSINI et al, 2003)
3.1.4 Anti-inflamatória
Fisalinas B e F mostraram-se atuantes nos modelos de injúria por reperfusão,
demonstrando uma prevenção do influxo de neutrófilos e do aumento da
permeabilidade vascular no intestino e nos pulmões.
A inibição máxima ocorreu na dose de 20 mg Kg
-1
. Além disso, houve
prevenção de hemorragia no intestino dos animais reperfundidos. Utilizando como
controle positivo a dexametasona, as fisalinas também suprimiram efetivamente o
aumento do influxo nos tecidos (intestino e pulmão) e as concentrações séricas de
TNF-α. Demonstrou-se uma similaridade qualitativa e quantitativa entre Fisalinas B e
F e dexametasona quanto aos efeitos protetores no modelo de isquemia intestinal
por injúria e reperfusão (VIEIRA et al, 2005). Estudos recentes têm demonstrado que
as fisalinas também podem possuir atividade anti- inflamatória em macrófagos por
uma ação inibitória na produção de óxido nítrico e prevenção da letalidade
associada com injeção de lipopolissacárides em camundongos (SOARES et al
2003).
3.1.5 Antitumoral
Algumas Fisalinas têm sido descritas como possuidoras de efeitos
antimicobacterianos, antitumorais e por possuírem uma potente atividade citotóxica
contra células cancerosas (CHIANG et al, 1992a ; CHIANG et al 1992b; LIN et al
1992; JANUÁRIO et al, 2002; KUO et al, 2006; DAMU et al, 2007). Esse amplo
espectro de atividade é sem dúvida justificável pela grande diversidade de estruturas
e funcionalização apresentadas pelos grupamentos químicos como lactonas,
epóxido e enona presentes nesses tipos de compostos.
4 JUSTIFICATIVA
Atualmente, a insuficiência cardíaca é uma das desordens do sistema
cardiovascular que mais tem afetado pessoas em todo o mundo, se tornando um
problema global de saúde pública. No Brasil, em 2007, a Insuficiência cardíaca foi
responsável por 2,6% das hospitalizações e por 6% dos óbitos registrados pelo SUS
no Brasil.
A terapêutica inotrópica atual se faz no sentido de melhorar tanto a
sintomatologia do paciente quanto a sobrevida, com o uso de beta agonistas,
inibidores de fosfodiesterase e digitálicos. Entretanto, ainda existem poucos
fármacos que realmente exerçam esse benefício sem trazer efeitos colaterais a
longo prazo para esses mesmos pacientes, como diminuição do tempo de
relaxamento e o aparecimento de arritmias , aumentando os casos de reinternações
hospitalares (I DIRETRIZ LATINO-AMERICANA PARA AVALIAÇÃO E CONDUTA
NA INSUFICIÊNCIA CARDÍACA DESCOMPENSADA, 2004).
O desenvolvimento de novos compostos que atuem na manutenção da
qualidade de vida desses pacientes sem haver um prejuízo da sobrevida ou
sintomatologia, representa uma necessidade médica importante.
A ação de vitaesteróides da classe das Fisalinas, representados por Fisalina
B e Fisalina F, no sistema cardiovascular pode ser tanto farmacologicamente mais
segura do que os inotrópicos atuais e ter como alvos elementos moleculares da
cascata de sinalização para contração do miócito.
Esse projeto, então, se limitou a um estudo pré-clinico em cobaios, para
caracterização farmacológica no sistema cardiovascular dos compostos isoladas de
uma fração etanólica de P.angulata (PHY), possuindo um destaque F9. Buscamos
nos compostos estudados, características superiores aos inotrópicos existentes no
mercado, com mecanismos de ação novos.
Este estudo pode ser a base para o desenvolvimento de um fármaco
inotrópico com utilidade terapêutica ao suporte inotrópico cardíaco em pacientes
com insuficiência miocárdica.
HIPÓTESE
A mistura esteroidal (PHY) , assim como F9 e F13, possuem efeito inotrópico
positivo destituído de efeito tonotrópico, cronotrópico e lusitrópico positivo, sendo
farmacologicamente mais seguro do que os esteróides digitálicos atuais.
6
OBJETIVOS
6.1 Objetivo Geral
Caracterizar farmacodinamicamente e hemodinamicamente o potencial
cardiotônico da F9 comparando à esteróides digitálicos.
6.2 Objetivos Específicos
1.
Avaliar o efeito inotrópico da mistura esteroidal PHY, F9 e F13 em preparação
de átrio isolado de cobaio.
2.
Avaliar o efeito cronotrópico da mistura esteroidal PHY, F9 e F13 em átrio
direito isolado de cobaio.
3.
Avaliar o efeito lusitrópico da mistura esteroidal PHY, F9 e F13 em átrio
esquerdo isolado de cobaio.
4.
Avaliar o efeito da mistura esteroidal PHY, F9 quanto ao nível de nucleotídeos
cíclicos em preparações de átrio esquerdo isolado de cobaio.
5.
Avaliar o efeito direto de F9 em preparação de fibra cardíaca permeabilizada.
6.
Verificar o efeito da F9 tanto na via de sinalização adrenérgica, com o uso de
inibidores de receptores β1 , proteína quinase dependente de AMPc (PKA) e
proteína quinase dependente de cálcio (PKC) , e sinalização de canais de cálcio
regulados por voltagem, na presença ou ausência de acidose.
7.
Verificar o efeito direto F9 na hemodinâmica cardiovascular, por avaliação da
velocidade de incremento da pressão no ventrículo esquerdo (dP/dt), eletrograma
cardíaco e frequência cardíaca em cobaios em sistema Millar.
7 MATERIAL E MÉTODOS
7.1 Animais
O modelo experimental animal usado foi a espécie Cavia porcellus,
normalmente chamado de cobaio ou porquinho da índia. Os animais são machos em
idade adulta, pesando entre 400 e 500 g, obtidos do biotério central da Universidade
Federal do Ceará (UFC) e aclimatados no Biotério de Experimentação do Instituto
Superior de Ciências Biomédicas. Todos os animais receberam ração padronizada e
ficaram sob ciclo claro escuro de 12 horas.
Todos os protocolos experimentais seguiram estritamente as normas
internacionais de cuidados com animais de laboratório e estão de acordo com as
normas preconizadas pelo CEUA (Comitê de Ética para Uso de Animais).
Este projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética para Uso de Animais da
Universidade Estadual do Ceará (UECE), atendendo as normas de cuidados com
animais, com número; 08627944-0
7.2 Material cirúrgico
Todo material cirúrgico foi esterilizado por meios físicos (autoclavados) e o
material de procedimento (luvas, seringas, agulhas, etc) são descartáveis. As
carcaças foram acomodadas em freezer horizontal e recolhidas pelo sistema de
coleta de lixo hospitalar.
7.3 Soluções e Reagentes
Soluções estoques de Krebs-Henseleit (em mM): NaCl 124; KCl 4,75; MgCl2
1,3; CaCl2 2,25; NaHCO3 25; NaH2PO4 0,6; Dextrose 10 . Todos os sais e regentes
utilizados são de pureza analítica e foram obtidos da VETEC, DINAMICA e
LABSYNTH.
Para a realização de experimento na técnica de fibra descascada serão
usados quatro tipos de soluções.
Inicialmente é usada uma solução de Tyrode livre de cálcio para a dissecação
do coração e retirada das fibras para montagem no sistema. Sua composição é
(mM): NaCl 130 ,KCl 3 , MgCl26H2O 1 , HEPES 4 e Glicose 10 ( pH 7.4).
Uma solução de lavagem (W), na qual nos permite excluir contaminantes de
cálcio dentro da cuba durante a realização do protocolo. Sua composição é (mM):
propionato de potássio 185, acetato de magnésio 2,5, propionato de imidazol 10 mM
e K2Na2ATP 5 (pH 7). A solução de relaxamento (R), que possui a mesma
composição de W, é usada para promover o relaxamento da fibra e, portanto,
término da contração muscular, possuindo um quelante de cálcio, ácido tetracético
etilenoglicol (EGTA) 5
composição
mM. A solução de permeabilização (S) possui a mesma
de W, excerto,
pela
adição
de
Saponina
(0,05%), para
a
permeabilização da fibra ou Triton x-100 (2%) para protocolos de sensibilização das
fibras contráteis ao cálcio.
Soluções com valores diferentes de pCas serão preparadas substituindo
K2EGTA por CaK2EGTA, assim, mantendo a concentração total de EGTA constante.
Cafeína foi comprada da empresa SIGMA (St.Louis, MO e EUA) e adicionada
na solução de trabalho imediatamente antes do uso.Bloqueadores farmacológicos
foram comprados para investigação sobre o mecanismo de ação sobre fibra
permeabilizada.Genisteína, Herbimicina A e Xestonpongina C foram comprados da
empresa TOCRIS( Ellisville, MO e EUA). Saponina foram comprada da Merck
(Darmstadt, Alemanha) e triton x-100, H89 e Estaurosporina foram comprados da
SIGMA(St.Louis, MO e EUA).
7.4 Cirurgia
Para os estudos in-vitro, e caracterização do efeito da mistura esteroidal , F9
e F13 em tecido atrial, usamos a metodologia de átrio isolado (BURN, 1952), pois o
uso do átrio direito, por possuir atividade contrátil espontânea, nos permite estudar a
ação de compostos na frequência cardíaca, enquanto o uso do átrio esquerdo
estimulado eletricamente nos permite estudar a ação de compostos sobre a força e
velocidade de contração do coração. Para estudos in vivo, foi utilizada a metodologia
de hemodinâmica cardíaca em sistema Millar.
Os animais foram anestesiados com Uretana (800 mg/kg,i.p) e Pentobarbital
(50 mg/kg, i.p). Para estudos in vitro, após sacrifício por deslocamento cervical, foi
feita a secção da aorta abdominal, seguida de toracotomia para exposição das
câmaras cardíacas e remoção do átrio direito e átrio esquerdo para imersão em
solução nutritiva de Krebs-Henseleit modificado, a 37°C, pH = 7,4 e aerados com
mistura carbogênica (5% de CO2 e 95% de O2). Os tecidos foram montados em
banhos de órgãos acoplados a transdutores (Myograph F-60) para registro
isométrico acoplado a polígrafo de quatro canais (Narco Biosystems, Houston, EUA)
7.5 Protocolo
7.5.1 Átrio Isolado
Após a remoção do tecido atrial, realizou-se a montagem do tecido cardíaco
com clipes de aço presos nas extremidades do tecido, e fixado ao eletrodo de platina
inserido na câmara de banho. Após um período de 1 hora de estabilização do tecido
com lavagens a cada 15 minutos, um traçado controle foi feito captando as
contrações de átrio direito ou esquerdo. Seguiu-se então a avaliação dos parâmetros
como a frequência das contrações espontâneas de átrio direito, tempo para atingir
pico máximo e tempo para alcançar 80% do relaxamento no átrio esquerdo
estimulado eletricamente (supramáxima, 10 ms e 0,1Hz).
Curvas dose-resposta cumulativas de PHY (0,1 – 100 µg/mL), F9 (0,2 a 200
µM), F13 (0,2 a 200 µM),DMSO(adicionado isovolumetricamente) e Ouabaína (1.5106 µM)
foram realizadas nas preparações atriais espontâneas de átrio direito .
Curvas dose-resposta cumulativas de PHY (0,1 – 100 µg/mL), F9 (0,2 a 200 µM),
F13 (0,2 a 200 µM), DMSO (adicionado isovolumetricamente) e Digoxina (0,2 a 200
µM) foram realizadas nas preparações atriais eletricamente estimuladas de átrio
esquerdo (n= 5). As respostas foram medidas 5 minutos após adição de cada
concentração. Sendo PHY um mistura de substâncias, a mesma será expressa em
µg/mL, possuindo equivalência em comparação à faixa de concentração (0.2 -200
µM) na qual as demais substâncias são expressas.
7.5.2 Medição dos níveis intracelulares de AMPc
A utilização da metodologia de medição dos níveis intracelulares de AMPc
nos permite inferir mais precisamente se a farmacodinâmica das frações testadas no
átrio esquerdo de cobaio é dependente do aumento dos níveis intracelulares de
AMPc.
Amostras experimentais
Os tecidos atriais de cobaio foram montados em banhos para registro
isométrico contendo solução de Krebs Henseleit. Após período de estabilização,
com intervalos de lavagens de 15 minutos, os tecidos foram expostos à
concentrações de F9 ( 6, 60 e 200 µM), PHY ( 1, 10 e 100 µg/ml), Veículo (100%) e
Forscolina ( 1 e 10 µM) até que se observasse o efeito máximo. Após o efeito
máximo, os tecidos foram imediatamente retirados do banho, congelados em tubos
criogênicos em nitrogênio líquido e armazenados a –20ºC até o dia do experimento.
Método de dosagem de nucleotídeos cíclicos
Todas as amostras foram descongeladas, sendo o tecido homogeneizado em
tubos contendo solução de Krebs gelado (100 µL/ 10 mg de amostra) com adição de
3-isobutil-1-metil-xantina (IBMX), um inibidor inespecífico de fosfodiesterase, a fim
de evitar a degradação do AMPc intracelular.
Após completa maceração do tecido, alíquotas de todas as amostras foram
separadas para dosagem de proteínas (100 µL) pelo método de Bradford
(BRADFORD, 1976) e o restante foi processado para dosagem de nucleotídeos
cíclicos.
Do homogenato dos tecidos foi adicionado ácido tricloroacético (TCA-10%),
para
precipitação
protéica.
Em
seguida,
as
amostras
foram
agitadas
e
posteriormente centrifugadas a 2000 rpm por 15 minutos, destacando-se duas
fases.O sobrenadante foi removido e o precipitado descartado.O sobrenadante foi
lavado com éter dietílico saturado de água (em um volume quatro vezes maior que o
volume da amostra) e a fração etílica descartada.Após a repetição do processo de
lavagens 5 vezes, a fase aquosa resultante das lavagens foram secas em banho
Maria a 60ºC em atmosfera de nitrogênio e ressuspensas no tampão de ensaio do
“Kit imunoenzimático para dosagem de AMPc” .Os níveis de AMPc foram expressos
em pmol de AMPc/mg de proteína
.
7.5.3 Fibra Permeabilizada
•
Histórico
A técnica de fibra permeabilizada foi criada por Reiji Natori em 1954
(NATORI, 1954), na qual, originalmente, sua intenção era examinar se a propriedade
elástica das fibras musculares era devido à superfície da membrana ou aos
componentes intracelulares, as miofibrilas.
Fazia-se necessário a retirada da membrana, e após várias tentativas, usouse um óleo mineral para separar o ambiente intracelular da solução aquosa e excluir
qualquer contaminante de cálcio que pudesse haver na solução.
Endo e colaboradores introduziram o uso do detergente saponina para
permeabilizar quimicamente fibras de músculo esquelético, destruindo a superfície
de membrana de preparações multicelulares e preservando a integridade do retículo
sarcoplamástico. É utilizada atualmente para realizar a permeabilização da
membrana, assim como triton X-100 para permeabilizar o retículo sarcoplasmático
(POSTERINO, 2001). Então podemos dizer que fibras permeabilizadas não são
nada mais são do que células musculares sem uma superfície de membrana integral
(ENDO, 2010), usadas para o estudo do processo de acoplamento excitação
contração.
•
Elementos da técnica
Cobaios machos adultos (400- 500 g) foram sacrificados com Uretana (800
mg/kg) e Pentobarbital (40 mg/kg),
no qual seus corações foram rapidamente
removidos.Pequenos fascículos, com o tamanho de aproximadamente 250 -350 µm
de diâmetro e 10 mm de comprimento foram dissecados da parede subendocárdica
do ventrículo esquerdo à temperatura ambiente, em uma solução Tyrode livre de
cálcio.
As extremidades dos fascículos são conectadas a um micromanipulador e, a
outra a um transdutor de força (Grass, modelo FT-03). Seguiu-se a montagem em
uma câmara de acrílico horizontal usando um microscópio estéreo binocular. Para a
destruição do sarcolema e obtenção das fibras permeabilizadas, os fascículos foram
imersos por 5 minutos em Saponina 0,05 % (BANGHAM & HORNE, 1962; MILLER &
SMITH, 1985) diluída em solução de R, contendo 5 mM de EGTA.
A tensão isométrica foi registrada em um polígrafo acoplado a 4 canais
(GRASS, modelo 7400).Quanto aos protocolos para investigação do efeito direto de
F9 na sensibilidade ao cálcio, a membrana do reticulo sarcoplasmático foi destruída
com através da exposição por 60 minutos à Triton X-100, 2% ( MILLER , 1985). A
temperatura do sistema foi mantida em torno de 22 ± 08 ºC.
•
Protocolos Experimentais
A determinação da resposta máxima nas fibras cardíacas permeabilizadas
(p0) foi alcançada pela exposição da fibra a uma solução de pCa 4.8( 15.84 mM
Ca2+) adicionado a solução de lavagem.No platô da contração induzida por cálcio, as
fibras foram relaxadas pela troca da solução de lavagem por solução de
relaxamento.O p0 foi mensurado no começo e fim dos experimentos .Nosso critério
foi de 30 % para o decréscimo do p0 do inicio ao fim dos experimentos.Depois da
medida do p0 inicial, foi realizada uma depleção dos estoques intracelulares de
cálcio com exposição da fibra a uma solução de R por 1 minuto, contendo cafeína
(20 mM).A presença de EGTA 5 mM na solução R previne a recaptação do cálcio
para o retículo sarcoplasmático durante o tempo de exposição.
O procedimento de esvaziamento de depleção do retículo sarcoplasmático
induzido por cafeína precedeu cada passo de carregamento de cálcio, realizado por
uma exposição da fibra a um pCa 6.6 (2.57 x 10
-7
M Ca2+).Foi adicionado a solução
de pCa 6.6 um bloqueador de canais de rianodina , procaína (10 mM) para evitar
vazamento de cálcio do retículo durante a fase de carregamento e indução do
fenômeno de liberação de cálcio ativada por cálcio.O carregamento de cálcio foi
avaliado pela contração induzida pela exposição da fibra à solução de W contendo
cafeína a 20 mM (SU & HASSELBACH, 1984).
O processo descrito acima para indução de contração mediada por cafeína é
utilizado como passo inicial em todos os protocolos a fim de avaliar a integridade do
retículo sarcoplasmático na preparação. Para critério quanto à resposta mínima da
cafeína para comparação ao controle (p0), se estabelece um percentual de reposta
superior a 50 % de p0. O tempo entre as trocas de soluções foi fixado em 30 s, com
exceção para a fase de esvaziamento (1 min) e carregamento (3 min) do retículo.
Foram realizados 3 diferentes protocolos para avaliar a mobilização interna de
cálcio sob ação de F9. Primeiramente foi feito um protocolo de liberação de cálcio
para avaliar se F9 possui a capacidade de liberação de cálcio .
Segundo, um protocolo de sensibilidade das fibras contráteis ao cálcio em
preparações com o reticulo sarcoplasmático permeabilizado, sendo realizada uma
curva de tensão versus pCa ( 7.0 - 4.8) na ausência e presença de F9 .
Terceiro, foi feito o protocolo de captação de cálcio para avaliar se F9 tem
efeito no processo de armazenamento de cálcio no retículo sarcoplasmático.
•
Desenhos experimentais
Protocolo para liberação de cálcio
Figura 9:Fibra permeabilizada, protocolo para liberação de cálcio.
Protocolo para Sensibilidade ao cálcio
Figura 10:Fibra permeabilizada, protocolo para sensibilidade das fibras contrateis ao cálcio.
Protocolo para Captação de cálcio
Figura 11:Fibra permeabilizada, protocolo para captação ao cálcio.
Bloqueio Farmacológico
•
Xestopongina C
Xestonpongina C, isolada a partir da esponja Xestospongia sp , tem mostrado
em trabalhos recentes ser um bloqueador da liberação de cálcio mediado por IP 3
permeável a membrana (GAFNI et al, 1997; WILCOX et al, 1998).Este composto é
sugerido ser um inibidor altamente potente e sensível do receptor de IP 3 com IC50 de
350 nM, valor 30 vezes menor do que a IC50 para o receptor de rianodina (GAFNI et
al, 1997).
O bloqueador xestonpongina C (3µM) foi utilizado na preparação de fibra
permeabilizada na presença de F9 (10 µM, n=5) para investigação de possível ação
sobre o receptor de IP3.
•
Herbimicina A
A família das P-ATPases controla o fluxo de íons através da membrana
celular, enquanto que receptores de membrana convertem sinais extracelulares na
ativação de cascatas de proteínas quinases e a geração de segundos mensageiros
(LI & XIE, 2009).
Vários trabalhos científicos suportam a visão de que a bomba de sódio,
potássio ATPase forma um complexo receptor com a proteína tirosina quinase não
receptora de membrana Src, funcionando como um transdutor de sinal intracelular,
convertendo e amplificando o sinal de um ligante externo para aumentar a taxa de
fosforilação de proteínas tirosina (LI & XIE, 2009).
Exemplos de interações de Src com proteínas intracelulares incluem
anquirina, receptores de inositol 1,4,5-trifosfato (IP3R), Fosfoinositidio 3 quinase
(PI3K) e fosfolipase C- γ.(BARWE et al, 2005; YUAN et al , 2005; YUDOWSKI et al,
2000)
Foram feitos experimentos, na preparação de fibra permeabilizada na
presença de F9 (10 µM) e também o bloqueador herbimicina A (1 µM , n=5), um
inibidor especifico da família de quinases Src.
O uso de herbimicina A nesse tipo de preparação objetivou a investigação da
ação de F9 sobre a cascata de sinalização promovida pelo acoplamento da bomba
de sódio, potássio ATPase e a proteína tirosina quinase associada a membrana Src,
tendo como alvos de interações proteínas ligada ao processo de liberação de cálcio.
•
Rutênio Vermelho
Rutênio vermelho é uma substancia policatiônica com uma estrutura linear
que inclui 14 grupos de aminoácidos. Rutênio vermelho tem mostrado atividade
inibitória sobre a liberação de cálcio via reticulo sarcoplasmático, tanto em músculo
cardíaco quanto esquelético.
Foram feitos experimentos, na preparação de fibra permeabilizada na
presença de F9 (10 µM) usando o Rutênio vermelho (30 µM, n=5), um inibidor
específico do receptor de rianodina presente no reticulo sarcoplasmático.
7.5.4 Hemodinâmica Sistêmica
Foram utilizados cobaios machos (300 - 400g), anestesiados com uretana
(1.5 g/kg, i.p). Após a perda dos reflexos de dor profunda, o procedimento cirúrgico
se inicia com secção da linha mediana da região cervical ventral até a exposição da
traquéia para a realização da traqueostomia usando uma cânula de polietileno (PE
240), facilitando a ventilação e aspiração de possíveis secreções respiratórias. Após
o acesso a região medial esquerda e identificação do feixe vásculo-nervoso,
procede-se o isolamento da artéria carótida direita. Ocorre então, a inserção de um
cateter de pressão-volume (SPR-869, Millar Instruments; Houston, TX), através do
qual é monitorada a pressão intracavitária do ventrículo esquerdo. Igual manobra é
realizada para o acesso da região medial direita com vistas à cateterização da veia
jugular direita (PE 10) para a infusão do agente farmacológico.
Para registro eletrocardiográfico (ECG) na derivação II (DII) serão
introduzidos eletrodos de agulha nos membros superiores e no membro inferior
esquerdo para a obtenção da frequência cardíaca (FC) e avaliação do padrão do
ritmo cardiológico.
Concluída a cirurgia, é feito um período de 1 hora de estabilização onde o
animal recebe a solução nutridora (Dextrose 5%) continuamente. Após este período
é iniciada a infusão de F9 (25 µg/Kg/min) através da veia jugular por 90 minutos.
Após a infusão, segue-se um período de recuperação de 30 minutos e
posteriormente, a injeção de 1µg bólus de Isoproterenol como controle positivo.
Durante todo o período experimental foram avaliados parâmetros de Pressão
do Ventrículo esquerdo, incremento máximo de pressão sistólica (dP/dt máxima) e
decremento máximo de pressão diastólica (dP/dT mínima), tempo para diástole,
frequência cardíaca, débito cardíaco, fração de ejeção e tau. Ao final do
experimento, os animais são eutanasiados com cloreto de potássio (KCl 3M) via
endovenosa.
7.6 Análise estatística
Os dados foram expressos como média ± erro padrão da média. Para análise
estatística foi usado o programa de computador GraphPad Prism versão 5.0. O
mesmo programa foi utilizado para confecção dos gráficos. As diferenças
estatísticas entre os grupos foram analisadas pela de variância ANOVA seguida do
teste de Bonferroni, e para comparação entre dois grupos individuais foi aplicado o
teste estatístico T Student, considerando 5% de significância para rejeição da
hipótese nula.·.
8. RESULTADOS
8.1 Avaliação do efeito de F9 na Hemodinâmica Sistêmica de cobaio.
Os resultados da infusão de F9 (25 µg/Kg/min) nos mostram um aumento
funcional em marcadores de função sistólica. F9 foi capaz de produzir aumento na
pressão ventricular máxima desenvolvida no ventrículo esquerdo do cobaio (p<
0.05), assim como na dP/dt máxima, a taxa máxima de mudança de força através do
tempo , sendo considerados índices de contratilidade miocárdica e assim
caracterizando um efeito inotrópico positivo .
Pressão Ventricular Máxima (% )
8.1.1 Pressão Ventricular
Pressão Ventricular Máxima
100
80
60
40
20
*
0
F9
Isoproterenol
Figura 12: Efeito da infusão de F9 (25 µg/Kg/min) ou injeção em bólus de Isoproterenol (1 µg) sobre
pressão ventricular máxima desenvolvida no ventrículo esquerdo de cobaio.Os valores foram
expressos como
controle (n=4).
média ± e.p.m, tomado o controle como 100%.*p<0.05 quando comparado ao
8.1.2 dP/dT:
dP/dT Máxima
dP/dT Mínima
200
60
**
150
50
dP/dT( %)
dP/dT( %)
175
125
100
75
50
25
*
40
30
20
10
0
0
F9
Isoproterenol
F9
Isoproterenol
Figura 13: Efeito da infusão de F9 (25 µg/Kg/min ) ou injeção em bólus de Isoproterenol ( 1 µg)
sobre o incremento máximo na pressão ventricular (dP/dT máxima) e decremento máximo da pressão
ventricular máxima (dP/dT mínima) desenvolvida no ventrículo esquerdo de cobaio. Os valores foram
expressos como média ± e.p.m, tomado o controle como 100%.*p<0.05 em relação ao controle,**
p<0.01 quando comparado ao controle tomado como 100%.(n=4)
8.1.3 Fração de Ejeção, Débito Cardíaco, Frequência Cardíaca e Tempo de
duração da diástole e tau:
A)
B)
Frequência Cardíaca
150
30
125
25
100
20
BPM (%)
Fração de Ejeção (%)
Fração de Ejeção
75
50
25
15
10
5
0
-5
0
F9
Isoproterenol
-10
F9
Isoproterenol
C)
D)
Tempo de Duração da Diástole
10
150
5
125
segundos( %)
Débito Cardíaco ( V/min)
Débito Cardíaco
100
75
50
**
25
0
-5
-10
-15
-20
-25
-30
0
F9
Isoproterenol
F9
Isoproterenol
E)
Tau-Tempo de Relaxamento Isovolumétrico
segundos( %)
200
150
100
50
0
-50
F9
Isoproterenol
Figura 14: Efeito da infusão de F9 (25 µg/Kg/min) ou injeção em bólus de Isoproterenol (1 µg) sobre
a fração de ejeção (A) , Frequência cardíaca (B), Débito cardíaco (C) , Tempo de duração da diástole
(D) e Tau (E) em cobaio. Os valores foram expressos como média ± e.p.m, tomado o controle como
100%.*p<0.001 quando comparado ao controle. (n=4)
A infusão de F9 (25 µg/Kg/min) demonstrou alterar também parâmetros précarga dependentes; fração de ejeção, ou seja, a fração volumétrica de sangue
ejetado do ventrículo esquerdo, de cobaios submetidos à infusão, e débito cardíaco,
ou seja, o volume de sangue ejetado do coração a cada ciclo cardíaco.
Alterações em marcadores de função diastólica também ocorreram como o
aumento do tempo de duração da diástole, justificando assim, o aumento visto na
fração de ejeção. O aumento da dP/dt mínima e a diminuição do Tau, um índice de
relaxamento isovolumétrico, se caracteriza como uma atuação na função diastólica
que demonstra um aumento da capacidade de relaxamento miocárdica.
8.2 Avaliação do efeito de PHY, F9, F13, Veículo e Ouabaína na frequência
cardíaca em átrio direito de cobaio.
Quanto aos resultados obtidos em relação à frequência de contração do átrio
direito na curva dose-resposta cumulativa de PHY (0,1 – 100 μg/ml; n = 4), F9 (0,2 200 μM; n = 4), F13 (0,2 - 200 μM; n = 4) e Ouabaína (1.5 -106 µM; n = 4) ou Veículo
(adicionado isovolumetricamente; n = 3). Não houve alterações quanto à frequência
cardíaca em batimentos espontâneos nos grupos experimentais testados, havendo
uma tendência à bradicadia nas maiores doses de PHY, F9 e F13, porém não houve
significância estatística em relação ao controle (Tabela 2). Nas maiores doses de
ouabaína (106 μM) manifestaram-se alterações na frequência sob formas de
arritmias cardíacas e tonotropismo positivo, demonstrando a citotoxicidade do
composto digitálico no tecido em altas doses, fato que não ocorre nas maiores doses
da fração esteroidal PHY ou F9 e F13.
Tabela 1: Efeito na frequência de contração em átrio direito isolado de cobaio promovido por PHY
(0,1- 100 µg/mL; n = 4), F9 (0,2- 200 µg/mL; n = 4), F13 (0,2- 200 µg/mL; n = 3) e Ouabaína (1.5 -106
µM; n = 4) e Veículo (adicionado de forma isovolumétrica). Os valores são expressos como
percentual da média ± e.p.m. acima do controle tomado como 100%. Houve uma tendência à redução
da frequência nas maiores doses de PHY, F9 e F13, mas não houve significância estatística (p<0,05)
entre as doses testadas.
Δ%
Controle
Δ%
Controle
Veículo
0,00 ± 0,00
PHY
0,00 ± 0,00
F9
0,00 ± 0,00
F13
0,00 ± 0,00
0,1
µg/mL
0,3
µg/mL
0,2 µM
-1,82 ± 1,82
-3,42 ± 2,52
1,29 ± 1,33
0,28 ± 2,94
0,6 µM
-0,55 ± 4,08
-4,73 ± 2,47
1,51 ± 0,55
-3,84 ± 5,13
0.88 µM
1.5 µM
1 µg/mL
2 µM
2.60 µM
4.4 µM
3 µg/mL
6 µM
6.20 µM
10.6 µM
10
µg/mL
20 µM
26 µM
44.4 µM
Ouabaína
0,00 ± 0,0o
-0,39 ±2,16
-0,12 ± 5,24
-2,45 ± 0,94
-2,57 ± 1,50
-10,57 ±
7,25
-1,08 ±3,39
1,39 ± 4,47
-6,16 ± 1,89
0,07 ± 2,41
-11,30 ±
6,71
3,96 ± 4,74
4,89 ± 11,51
-4,96 ± 1,83
-1,65 ± 3,62
-15,26 ±
7,83
27,53±15,46
30
µg/mL
60 µM
14,48± 14,93
-7,60 ± 5,67
-10,32 ± 2,95
-13,44 ±
9,10
62. µM
100
µg/mL
106 µM
200 µM
14,36 ±16,24
-1,16 ± 8,63
-7,98 ± 4,25
-18,42 ±
11,31
7,42 ± 31,42
8.3 Avaliação do efeito de F9 na relação força- frequência cardíaca em átrio
direito de cobaio
Quando avaliamos a relação força-frequência em átrio direito de cobaio de
cobaio sob ação de F9 (0.2 – 200 µM) obtivemos uma correlação negativa quanto as
variáveis mensuradas. É possível predizer um aumento da força por uma diminuição
da frequência cardíaca.
-25
-20
-15
-10
-5
Frequência (%)
5
10
-100
-30
Força (%)
100
200
300
r2=0,89
p=0,0029
400
Relação Força -Frequência
Figura 15: Efeito F9 (0,2- 200 µM; n = 4) sobre a relação força-frequência em batimentos
espontâneos de átrio direito de cobaio. Os valores são expressos como média. Houve uma
2
correlação negativa (r = 0,7949 ) entre as variáveis.
8.4 Avaliação do efeito de PHY, F9, F13, Veículo, Ouabaína e Digoxina no
tempo para atingir pico máximo (Tmáx) e para relaxar 80% da contração (TR80)
em átrio esquerdo.
Foram avaliados parâmetros relacionados à distensibilidade do músculo
cardíaco, como o tempo para atingir pico máximo (Tmáx) e para relaxar 80% da
contração (TR80), correspondente a uma dada concentração de PHY (0,1 - 100
μg/mL; n = 5), F9 (0,2 - 200 μM; n = 4), F13 (0,2 - 200 μg/mL; n = 5), Digoxina (0,2 200 μM; n = 4) e Ouabaína (1.5 -106 µM; n = 6) ou Veículo (adicionado
isovolumetricamente; n = 4), em preparações de átrio esquerdo de cobaio
estimulados eletricamente (supramáxima, 10 ms e 0,1Hz).Cada ponto corresponde à
média ± e.p.m. e representam a alteração percentual sobre o respectivo controle
tomado como 100%. A leitura de cada ponto se deu 5 minutos após a administração
da dose correspondente.
Quando comparados aos seus respectivos controles, não houve alterações do
tempo Tmáx nas maiores concentrações de PHY (0,1- 100 μg/mL; n = 5), F9 (0,2 200 μM; n = 4), F13 (0,2 - 200 μg/mL; n = 5) e Veículo (adicionado
isovolumetricamente; n=5). Ocorreu uma diminuição, porém não significante, no
Tmáx na concentração de 4.47 μM de Ouabaína (controle – 0.00 ± 0.00% versus
4.47 μM -17.85 ± 10.58%). (Figura 16)
Digoxina promoveu um aumento de Tmáx de forma concentração dependente
quando comparado aos vitaesteróides. Nas concentrações (6 e 60 µM), Digoxina
promoveu um aumento de maneira significativa quando comparado a F9, F13 e
PHY.
Tempo para Resposta Máxima(%)
Tempo para resposta máxima em Atrio esquerdo
50
40
**
30
20
**
10
F9
F13
Veículo
PHY
Ouabaina
Digoxina
0
-10
-20
0.06
0.2
0.63
2
6.32
20
63.25 200
Concentração (M)
Figura 16: Efeito de PHY (0,1- 100 µg/mL; n = 5), F9 (0,2- 200 µM; n = 4), F13 (0,2- 200 µM; n = 5),
Ouabaína (1.5 -106 µM; n = 6), Digoxina (0,2- 200 µM; n = 4) e veículo (adicionado de forma
isovolumétrica; n= 4) sobre o tempo para atingir o pico máximo no átrio esquerdo de cobaio
estimulado eletricamente (supramáxima; 10 ms; 0,1 Hz). Os valores são expressos como média ±
e.p.m. Não houve alterações sobre o tempo para atingir o pico máximo em músculo de átrio esquerdo
nas maiores doses de Veículo, F9, F13 e PHY. ** p < 0,01 quando comparado Digoxina com F9,
Digoxina com F13 e Digoxina com PHY.
Quando comparados aos seus respectivos controles, não houve alterações do
TR80 nas maiores concentrações de PHY (0,1- 100 μg/mL; n = 5), F9 (0,2 - 200 μM;
n = 4), F13 (0,2 - 200 μM; n = 5) e Veículo (adicionado isovolumetricamente; n=5).
(Figura 17).
Digoxina apresentou um aumento estatisticamente significante no tempo para
ocorrer 80% do relaxamento. As concentrações de 6 e 20 μM apresentaram um
aumento no TR80 (* p < 0,05 ) de 14.28 ± 5.83 % e 104.46 ± 57.31 %,
respectivamente.As maiores concentrações promoveram um aumento no TR80 (***
p< 0.001) de 229.76 ± 23.71 % e 364.28 ± 75.76 %, respectivamente.
Tempo para 80% do relaxamento(%)
Tempo para relaxar 80% em átrio esquerdo
460
***
360
***
260
F9
Ouabaina
PHY
F13
DMSO
Digoxina
*
160
60
*
-40
0.06
0.2
0.63
2
6.32
20
63.25 200
Concentração (M)
Figura 17: Efeito de PHY (0,1- 100 µg/mL; n = 5), F9 (0,2- 200 µM; n = 5), F13 (0,2- 200 µM; n = 5),
Ouabaína (1.5 -106 µM; n = 6), Digoxina (0,2- 200 µM; n = 4) e Veículo (adicionado de forma
isovolumétrica) sobre o tempo para atingir 80% do relaxamento átrio esquerdo de cobaio estimulado
eletricamente (supramáxima; 10 ms; 0,1 Hz). Os valores são expressos como média ± e.p.m. O efeito
foi avaliado 5 minutos após a respectiva dose. * p < 0,05 quando comparado Digoxina (6 e 20 µM)
com PHY, F9 e F13.*** p< 0.001, quando comparado Digoxina (60 e 200 µM) com F9, F13 e PHY.
8.5 Avaliação do efeito de PHY, F9, F13, Veículo e Ouabaína na força máxima
desenvolvida em átrio esquerdo de cobaio.
O registro original (Figura 18) demonstra a atuação do veículo em preparação
de átrio esquerdo estimulado eletricamente, demonstrando que DMSO não tem
efeitos de aumento ou diminuição na força de contração do tecido atrial de cobaio.
Figura 18: Registro das contrações em átrio esquerdo em átrio esquerdo isolado de cobaio
estimulado eletricamente (supramáxima, 10 ms e 0,1Hz) na curva cumulativa dose- resposta de
DMSO (adicionado isovolumetricamente: n= 5).Velocidade do registro 10 cm/s.
Figura 19: Registro das contrações em átrio esquerdo em átrio esquerdo isolado de cobaio
estimulado eletricamente (supramáxima, 10 ms e 0,1Hz) na curva cumulativa dose- resposta de PHY
(0,2- 200 μM: n= 5). Velocidade de registro 5 cm/s.
Em um screening farmacológico inicial (Figura 19), uma mistura esteroidal,
PHY, demonstrou efeito inotrópico quando testado em tecido atrial de cobaio.
Após a identificação de seus compostos majoritários, os quais se mostraram
ser F9 e F13, experimentos para caracterização do efeito inotrópico positivo foram
feitos em tecido atrial de cobaio.
Quanto à experimentos com F9 e F13, o registro (Figura 20 e 21) ilustra um
efeito inotrópico positivo em átrio esquerdo de cobaio estimulado eletricamente,
demonstrando um aumento gradual de força concentração dependente de força de
contração.
Figura 20: Registro das contrações em átrio esquerdo em átrio esquerdo isolado de cobaio
estimulado eletricamente (supramáxima, 10 ms e 0,1Hz) na curva cumulativa dose- resposta de F9
(0,2- 200 μM: n= 5). Velocidade de registro 5 cm/s.
Figura 21: Registro das contrações em átrio esquerdo em átrio esquerdo isolado de cobaio
estimulado eletricamente (supramáxima, 10 ms e 0,1Hz) na curva cumulativa dose- resposta de F13
(0,2- 200 μM: n= 5). Velocidade de registro 5 cm/s.
Experimentos realizados com esteródies digitálicos, ouabaína e digoxina,
sendo ouabaína um mediador endógeno e digoxina um fármaco exógeno
classicamente usado nos tratamentos de desordens cardiovasculares foram feitos,
afim de comparação, demonstraram seu efeito já comprovado. O traçado original
abaixo (Figuras 22 e 23) ilustra o efeito inotrópico positivo de ouabaína e digoxina
em átrio esquerdo de cobaio estimulado eletricamente.
Figura 22: Registro das contrações em átrio esquerdo isolado de cobaio estimulado eletricamente
(supramáxima, 10 ms e 0,1Hz) na curva cumulativa dose- resposta de Ouabaína (1.5- 106 μM: n= 5).
Observe a presença de arritmias em 10.6 μM .Velocidade do registro 10 cm/s.
Figura 23: Registro das contrações em átrio esquerdo isolado de cobaio estimulado eletricamente
(supramáxima, 10 ms e 0,1Hz) na curva cumulativa dose- resposta de Digoxina (0,2- 200 μM: n= 5).
Observe a presença de arritmias em 2 μM .Velocidade do registro 10 cm/s.
Quanto à avaliação na tensão máxima desenvolvida em curva cumulativa
dose-resposta de PHY (0,1 - 100 μg/mL; n = 5), F9 (0,2 - 200 μM; n = 5), F13 (0,2 200 μM; n = 6) Ouabaína (1.5 -106 µM; n = 6) e Veículo (adicionado
isovolumetricamente; n=3) em átrio esquerdo de cobaio estimulado eletricamente
(supramáxima, 10 ms e 0,1Hz).(Figura 24)
Quando comparados aos seus controles, tivemos um aumento na tensão
máxima desenvolvida significativamente maiores (* p<0,05) na curva cumulativa
concentração – resposta de PHY (incremento de 260.03 ± 84.89 %).
F9 demonstra uma força máxima desenvolvida de modo significativa que
chega a ser quase quatro vezes em relação ao respectivo controle (incremento de
346.97± 33.82 %), sem a presença de arritmias ou tonotropismo positivo na maior
concentração (200 μM).
F13 também mostrou uma atividade inotrópica positiva significativamente na
dose de 200 μM (incremento de 312.72 ± 98.63 %) em relação ao controle, porém
menos eficaz do que F9 (Figura 24). Comparando as duas frações, não se observa
diferenças quanto a força gerada por F9 e F13.
Observa-se que as duas frações possuem uma atividade inotrópica positiva
maior que a fração PHY, e onde se originam F9 e F13, sendo assim as frações
substâncias de caráter purificado com atividade inotrópica positiva intrínseca. F13 e
F9 mostraram atividade inotrópica positiva maior em relação ao digitálico Digoxina
em concentração equivalente (F9 200 µM 346.97 ± 33.82 % vs Digoxina 200 µM 70.83 ± 3.60 %).
F9 foi destacada para caracterização devido ao aparecimento de eventos
arrítmicos nas maiores concentrações de F13, sendo possível inferir nesta fase
inicial, que F9 em concentrações equinotrópicas não produz efeitos cardiotóxicos
nas maiores concentrações, descartando a possibilidade de seu efeito farmacológico
ser caracterizado como digitálico.
Força Desenvolvida em Atrio esquerdo
500
##
*
Força desenvolvida ( % )
400
300
F9
F13
DMSO
Ouabaina
PHY
Digoxina
200
100
0
-100
0.06
0.2
0.63
2
6.32
20
63.25
200
Concentração (M)
Figura 24: Efeito de PHY (0,1- 100 µg/mL; n = 5), F9 (0,2- 200 µM; n = 5), F13 (0,2- 200 µM; n = 6),
Ouabaína (1.5- 106 µM), Digoxina (0,2- 200 µM; n = 4) e Veículo (adicionado de forma isovolumétrica;
n=3) sobre a força de contração de átrio esquerdo de cobaio estimulado eletricamente (supramáxima;
10 ms; 0,1 Hz).Os valores são expressos como percentual da média ± e.p.m. acima do controle
tomado como 100%. A leitura de cada ponto se deu 5 minutos após a administração da dose
correspondente * p < 0,05 comparando F9 com DMSO, F13 com DMSO e PHY com DMSO. ## p <
0,01 comparando F9 com Digoxina e F13 com Digoxina.
Foram realizadas curvas-dose resposta para F9 para vias clássicas nos quais
agentes cardiotônicos atuam como a via beta-adrenérgica e ativação de canais de
cálcio regulados por voltagem. O uso do bloqueador beta-adrenérgico não especifico
Propranolol (10
-6
M) e um bloqueador dos canais de cálcio regulados por voltagem
Verapamil (10-7 M) não provocaram decréscimo do efeito inotrópico postivo
inicialmente visto nestas preparações.O traçado original abaixo (Figuras 25 e 26 )
nos mostra na presença de bloqueio o aumento contrátil.
Figura 25: Registro das contrações em átrio direito isolado de cobaio na curva cumulativa doseresposta de F9 (0,2- 200 μM: n= 5) sob ação de propranolol (10
-6
M). .Velocidade do registro 0.25
cm/s.
Figura 26: Registro das contrações em átrio direito isolado de cobaio na curva cumulativa doseresposta de F9 (0,2- 200 μM: n= 5) sob ação de verapamil (10
-7
M) .Velocidade do registro 0.5 cm/s.
Quanto à avaliação na tensão máxima desenvolvida em curva cumulativa
dose-resposta de F9 (0,2 - 200 μM; n = 5) em átrio direito de cobaio quando
incubados com inibidores; propranolol (10-6 M), um bloqueador beta-adrenérgico não
seletivo, e verapamil (10-7 M), bloqueador dos canais de cálcio voltagem dependente
(Figura 27). Comparativamente aos seus controles obtivemos um aumento na
tensão máxima desenvolvida na curva cumulativa dose – resposta de F9, na qual a
força máxima desenvolvida (190.35 ± 0.44%) não foi acompanhada de arritmias ou
tonotropismo positivo na maior concentração (200 μM). Comparando F9 (200 μM) à
Propranolol (220.23 ± 35.39%) ou Verapamil (164.58 ± 21.59%), não se observa
diferenças estatísticas na força de contração máxima desenvolvida pelo músculo
cardíaco.
Força desenvolvida ( %)
Força Desenvolvida em Atrio direito
300
275
250
225
200
175
150
125
100
75
50
25
0
-25
-50
F9
F9 + Propranolol ( 1 M)
F9 + Verapamil (100 nM)
0.06
0.2
0.63
2
6.32
20
63.25 200
Concentração (M)
Figura 27: Efeito de F9 (0,2- 200 µM; n = 4), F9 (0,2- 200 µM; n = 5) + Propranolol (1 µM) e F9 (0,2200 µM; n = 4) + Verapamil ( 100 nM ) sobre a força de contração de átrio direito de cobaio .Os
valores são expressos como variação do percentual da média ± e.p.m. acima do controle tomado
como 100%. A leitura de cada ponto se deu 5 minutos após a administração da dose correspondente.
Dados qualitativos mostram também, que após a perfusão de átrio esquerdo
estimulado eletricamente com solução Krebs-Henseleit com pH ácido ( pH 6.5),
ocorreu somente uma diminuição do efeito inotrópico causado por F9 (0,2- 200 µM,
n=2) no tecido cardíaco, demonstrando uma relação de dependência aos receptores
de rianodina que nesta condição, possuem o nível de atividade máxima de RYR2 e
[Ca2+] livre diminuídas (MEISSNER, 2004 ).Curvas dose resposta de F9 (0,2-200
µM, n=2) sob uma condição de acidose (pH 6.5 ) incubado com Verapamil ( 100 nM)
reforçam a teoria de que o efeito inotrópico positivo de F9 não atua via canais de
cálcio regulados por voltagem ( Figuras 28 e 29)
Figura 28: Registro das contrações em átrio esquerdo isolado de cobaio estimulado eletricamente
(supramáxima, 10 ms e 0,1Hz) na curva cumulativa dose- resposta de F9 (0,2- 200 μM: n= 5) em
condição de acidose ( pH 6.5).Velocidade do registro 10 cm/s.
Figura 29: Registro das contrações em átrio esquerdo isolado de cobaio estimulado eletricamente
(supramáxima, 10 ms e 0,1Hz) na curva cumulativa dose- resposta de F9 (0,2- 200 μM: n= 5) em
condição de acidose (pH 6.5) incubado com verapamil( 10 -7 M).Velocidade do registro 10 cm/s.
8.6 Avaliação do Efeito de F9 quanto na força máxima desenvolvida em átrio
esquerdo de cobaio sob ação de inibidor de Proteína Quinase dependente de
AMPc (PKC) e Proteína Quinase dependente de Ca2+(PKA).
O fenômeno de liberação de cálcio através de RYR2 está intrinsecamente
ligado a mudança do estado de fosforilação do receptor (MEISSNER, 2004), na qual
as proteínas quinases PKC e PKA exercem um papel fundamental na regulação de
RYR2 em processos fisiológicos (MACKRILL, 1999).
Foram feitos experimentos usando bloqueadores de PKA, H89 (Figura 30) e
PKC, Estaurosporina (Figura 31), a fim de verificar a relação das vias PKA-AMPcRYR2 e PKC-IP3-IP3R, no fenômeno de inotropismo positivo em tecido atrial de
cobaio.
Figura 30: Registro das contrações em átrio esquerdo isolado de cobaio estimulado eletricamente
(supramáxima, 10 ms e 0,1Hz) na curva cumulativa dose- resposta de F9 (0,2- 200 μM: n= 5) sob
ação de H89 ( 10 μM).Velocidade do registro 10 cm/s.
Figura 31: Registro das contrações em átrio esquerdo isolado de cobaio estimulado eletricamente
(supramáxima, 10 ms e 0,1Hz) na curva cumulativa dose- resposta de F9 (0,2- 200 μM: n= 5) sob
ação de estaurosporina ( 100 nM).Velocidade do registro 10 cm/s.
Força Desenvolvida em Atrio esquerdo
440
F9+H89( 10 M)
F9 + estaurosporina(100 nM)
F9
Força desenvolvida ( %)
390
340
290
240
190
140
90
**
40
-10
-60
0.06
0.2
0.63
2
*
*
*
6.32
20
63.25
200
concentração(M)
Figura 32: Efeito de F9 (0,2- 200 µM; n = 5), F9 (0,2- 200 µM; n = 5) + H89 (10 µM) e F9 (0,2- 200
µM; n = 4) + estaurosporina (100 nM ) sobre a força de contração de átrio esquerdo de cobaio .Os
valores são expressos como variação do percentual da média ± e.p.m. acima do controle tomado
como 100%.A leitura de cada ponto se deu 5 minutos após a administração da dose correspondente.
*p< 0.05 quando comparado F9 com F9 + H89, ** p< 0.01 quando comparado F9 e F9 + H89.
O efeito inotrópico positivo causado por F9 foi avaliado com a realização de
curva cumulativa dose-resposta (0,2 - 200 μM; n = 5) em átrio esquerdo de cobaio
quando incubados com inibidores de proteínas quinases; H89 (10 µM) um inibidor de
proteína quinase dependente de AMPc ou Estaurosporina (100nM), um inibidor de
proteína quinase dependente de Ca2+.
Comparativamente, o efeito de F9 foi inibido por H89 nas maiores
concentrações (6, 20, 60 e 200 µM) obtendo 91 % de inibição em 200 µM (F9 346.97
± 33.82 % comparado a F9 + H89 31.11 ± 18.47 %, n=4), demonstrando uma
estreita relação entre o efeito inotrópico de F9 e a modulação de proteína quinase no
receptor de rianodina. Quanto à atuação de F9 sobre a proteína quinase C, não foi
obtido significância quando comparado F9 e F9 + estaurosporina.(Figura 32)
8.7 Avaliação do efeito de F9 e Ouabaína sobre o tonotropismo em átrio
esquerdo de cobaio.
Quanto à avaliação na tensão diastólica desenvolvida em curva cumulativa
dose-resposta de F9 (0,2 - 200 μM; n = 4), Digoxina (0,2 - 200 μM;n= 4) e Ouabaína
(1.5- 106 µM, n=4) em átrio esquerdo de cobaio estimulado eletricamente
(supramáxima, 10 ms e 0,1Hz).
Quando comparado ao controle, F9 promoveu uma diminuição da tensão
diastólica (-39,81 ± 18,85 %) nas maiores doses (200 μM), ao passo que Ouabaína
(44.4 μM) promoveu um aumento da tensão diastólica chegando ao máximo de
115,90 ± 82,26 %. Digoxina não promoveu aumento de tonotropismo positivo,
porém, houve o aparecimento dose dependente de arritmias associadas em ambos
os grupos com esteróides digitálicos (Tabela 2)
O aumento da tensão diastólica causada por ouabaína está relacionado à
dificuldade de relaxamento do átrio, devido ao mecanismo de ação dos compostos
estarem intrinsecamente ligados à inibição da NKA e aumento constante dos níveis
de cálcio intracelular no miócito. Por outro lado, em comparação à ouabaína mesmo
nas maiores doses, F9 produziu uma discreta diminuição da tensão diastólica, sem o
aparecimento de arritmias e tonotropismo positivo, aumentando o relaxamento atrial
e com isso, obtendo uma melhora na mecânica do aparato cardíaco.
Tabela 2: Efeito de F9 (200 µM; n = 4), Digoxina (200 µM; n=4) e Ouabaína (44.4 µM; n = 3) sobre
força basal no átrio esquerdo de cobaio estimulado eletricamente (supramáxima; 10 ms; 0,1 Hz).
Cada ponto corresponde à média ± e.p.m. e representam a alteração percentual sobre o respectivo
controle tomado como 100%. A leitura de cada ponto se deu 5 minutos após a administração da dose
correspondente.
Tensão Diastólica
Tempo para atingir
efeito máximo
F9 200 µM
-37.50  1.58 %
10 min
Digoxina 200 µM
0.00  0.00%
31 min
Ouabaína 44.4 µM
115.90  71.24 %
25 min
8.8 Avaliação do efeito de F9, PHY, Forscolina e Veículo sobre os níveis
intracelulares de AMPc.
Para examinar se o efeito inotrópico causado por F9 se correlaciona com os
níveis intracelulares de AMPc, foram feitas curvas cumulativas dose-resposta para
F9 (0,2- 200 µg/mL; n = 5), Veículo (adicionado de forma isovolumétrica; n=3) e
Forscolina (1 e 10 µM; n=5) .
Foram mensurados os níveis teciduais de AMPc a fim de estudar a relação
entre os valores de contratilidade cardíaca e o nível de nucleotídeos cíclicos,
verificando se o possível mecanismo de aumento inotrópico promovido por F9 é
semelhante a fármacos como agonistas beta adrenérgicos, inibidores de
fosfodiesterase e Forscolina símiles. (Figura 33a)
Quanto aos níveis de AMPc em tecidos atriais sob ação de PHY (3 – 100
µg/mL; n = 5) (Figura 16) e F9 (6 – 200 µg/mL; n = 5)(Figura 33B) , mesmo nas
maiores doses não foi encontrada correlação entre o aumento de força para F9 200
µM (351,03 ± 79,33 %) e o nível de AMPc (80,65 ± 17,33 pmol/mg de proteína)
quando comparados ao controle DMSO (132.76 ± 18.42; n=4).O mesmo se aplica
para a fração esteroidal PHY 100 µg/mL (255,18 ± 81,73 %) e o nível de AMPc
(67,37 ± 13,41 pmol/mg de proteína) quando comparada à DMSO (132.76 ± 18.42;
n=4).
A.
600
550
500
450
Incremento
400
350
300
250
200
150
100
50
0
3
30
PHY
100
3
30
F9
100
1
DMSO
10
Forscolina
B.
pmol/mg de Proteína
600
***
PHY
500
F9
400
DMSO
Forscolina
300
200
100
0
3
6
g/mL M
30 60
g/mL M
100 200
g/mL M
DMSO
1
10
Forscolina M
Figura 33: A. Incremento inotrópico em átrio esquerdo de cobaio sob ação de PHY ( 3, 30 e 100
µg/mL; n = 5), F9 (6 , 60 e 200 µM; n = 5), Veículo e Forscolina (1 e 10 µM; n=5).B.Avaliação do nível
de AMPc intracelular em átrio esquerdo de cobaio sob ação de PHY (3 ,30 e 100 µg/mL; n = 5), F9 (6
, 60 e 200 µM; n = 5), Veículo e Forscolina (1 e 10 µM; n=5). O nível intracelular de AMPc no tecido
está expresso em função da concentração de proteína no mesmo.*** p< 0.001 quando comparado
com DMSO.
8.9 Avaliação da mobilização de cálcio em cardiomiócito de cobaio sob ação
de F9.
8.9.1 Protocolo de Liberação de Cálcio
A fim de verificar a integridade do reticulo sarcoplasmático, foi realizado
carregamento do retículo com 2.57 x 10
-7
M (pCa 6.6) durante 3 minutos, as fibras
foram lavadas com solução W para eliminação de contaminante de cálcio, e então ,
seguidas de exposição a cafeína 20 mM para evocar contração.O processo foi
repetido para cada concentração, substituindo a cafeína por F9 (0,1, 1 e 10 µM),
para avaliar se a mesma possuía a capacidade de liberação de cálcio per si do
retículo, e uma exposição à cafeína 20 mM ao final do protocolo para avaliação
novamente da integridade do retículo sarcoplasmático(Figura 28).
Figura 34: Registro original de experimento feito com fibra permeabilizada de cobaio para protocolo
de liberação de cálcio mediante administração de F9.
Foram obtidas contrações em resposta a exposição da fibra cardíaca a
cafeína 20 mM (73.98 ± 1.57 %p0, n=6), refletindo a preservação do retículo
sarcoplasmático em todas as preparações. F9 (0,1, 1 e 10 µM) provocou contração
em fibras cardíacas permeabilizadas de forma dose dependente, com um percentual
máximo de 52.93 ± 3.26 %p0 na concentração máxima. Quando comparados à
cafeína 20 mM, todos os grupos obtiveram resultados significantes (p< 0.001)(Figura
35).
Figura 35: Efeito de F9 na liberação de cálcio em fibras permeabilizadas de cobaio. As contrações
foram induzidas com cafeína 20 mM após um carregamento com solução pCa 6.6 por 3 minutos. O
procedimento foi repetido, substituindo-se cafeína por F9 (0,1,1 e 10 µM).As tensões isométricas são
registradas considerando-se p0( pCa 4.8) como 100%.***p< 0.001 quando comparado F9 (0,1,1 e 10
µM) vs cafeína 20 mM.
8.9.2 Protocolo de Sensibilização ao cálcio
Para determinar se F9 produz o efeito inotrópico no músculo cardíaco pelo
aumento da sensibilização das proteínas contráteis ao cálcio, a relação pCa/tensão
foi avaliada.As fibras cardíacas foram tratadas com Triton X-100 por 60 minutos para
que ocorresse a destruição da membrana do retículo sarcoplasmático.
O dano ao retículo sarcoplasmático foi confirmado pela inibição da contração
induzida por cafeína, indicando que a única fonte disponível de cálcio para ativar as
proteínas contráteis era da solução adicionada a cuba. Então as fibras foram
expostas sequencialmente a soluções de pCas ( 7.0 – 4.8), na presença ou ausência
de F9 10 µM para cada pCa utilizado(Figura 36)
Figura 36: Registro original de experimento feito com fibra permeabilizada de cobaio para protocolo
de liberação de cálcio mediante administração de F9.
Sensibilização ao cálcio
150
Controle
F9 10 M
135
120
105
%p0
90
75
60
45
30
15
0
7.5
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
- Log [Ca2+ ]
Figura 37: Efeito de F9 na sensibilização das proteínas contráteis ao cálcio em fibras
permeabilizadas de cobaio. Após o tratamento (60 min) com Triton X-100, segue-se uma curva
concentração resposta com pCas (7.0-4.8) na presença e ausência de F9 10
µM.As tensões
isométricas são registradas considerando-se p0 ( pCa 4.8) como 100%.
F9 (10 µM) não deslocou a curva de sensibilização ao cálcio para esquerda.
Um deslocamento da curva para a esquerda indicaria que para uma dada tensão
seria preciso um menor pCa .O efeito de F9,então, não se deve a um aumento na
sensibilidade dos miofilamentos contráteis ao cálcio(Figura 37).
8.9.3 Protocolo de Captação de cálcio
Para determinar se F9 (10 µM) produz o efeito inotrópico no músculo cardíaco
pelo aumento da atividade de recaptação do cálcio no retículo sarcoplasmático a
relação tensão/tempo de carregamento foi avaliada. Foi feita uma curva tempo de
carregamento-resposta (180, 120, 60, 30, 20,10 s). F9 (10 µM) não produziu
deslocamento da curva (Figura 38).
Captação de cálcio
100
controle
F9 10 uM
90
80
%p0
70
60
50
40
30
20
10
0
0
20
40
60
80 100 120 140 160 180 200
segundos
Figura 38: Efeito de F9 na captação de cálcio em fibras permeabilizadas de cobaio. As contrações
foram induzidas com cafeína 20 mM após um carregamento com solução pCa 6.6 por 3 minutos. O
tempo foi variado (180, 120, 60, 30, 20,10 s) na presença ou ausência de F9 10 µM.As tensões
isométricas são registradas considerando-se p0( pCa 4.8) como 100%.
8.10 Bloqueio Farmacológico
8.10.1 Xestonpongina C
Para determinar se o efeito de F9 (10 µM) é dependente da ativação de
receptores para inositol 1,4,5-trifosfato e posterior liberação de cálcio, utilizou-se o
bloqueador Xestonpongina C ( 3 µM) para bloqueio dessa via farmacológica.
Não foi obtido bloqueio do efeito inotrópico de F9 (10 µM) quando usado
Xestonpongina C (3 µM) (Figura 39).
Figura 39: Efeito de F9 na liberação de cálcio em fibras permeabilizadas de cobaio. As contrações
foram induzidas com cafeína 20 mM após um carregamento com solução pCa 6.6 por 3 minutos.
Contrações induzidas por administração de F9 10 µM foram feitas na presença ou ausência de
Xestonpongina C (3 µM). As tensões isométricas são registradas considerando-se p0 (pCa 4.8) como
100%.
8.10.2 Herbimicina A
Para determinar se o efeito de F9 (10 µM) está envolvida com a via de
transdução localizada na Na+,K+-,ATPase, mediada pela proteína Src, foi usado o
bloqueador Herbimicina A (100 µM) para bloqueio dessa via farmacológica.
Não foi obtido bloqueio do efeito inotrópico de F9 (10 µM) quando usado
Herbimicina A (100 µM), excluindo a participação de Src como passo inicial para
uma cascata de fosforilação e posterior liberação de cálcio. (Figura 40)
Figura 40: Efeito de F9 na liberação de cálcio em fibras permeabilizadas de cobaio. As contrações
foram induzidas com cafeína 20 mM após um carregamento com solução pCa 6.6 por 3 minutos.
Contrações induzidas por administração de F9 10 µM foram feitas na presença ou ausência de
Herbimicina A (100 µM).As tensões isométricas são registradas considerando-se p0 ( pCa 4.8) como
100%
8.10.3 Rutênio Vermelho
Para determinar se o efeito de F9 (10 µM) é dependente da ativação de
receptores de rianodina, foi utilizado o bloqueador Rutênio Vermelho (30 µM) para
bloqueio dessa via farmacológica.
O efeito inotrópico de F9 (10 µM) foi inibido (F9 10 µM 36.97 ± 5.69 % vs F9
10 µM + Rutênio Vermelho 10.47 ± 2.95 %, n=5)
quando adicionado Rutênio
Vermelho (30 µM), indicado uma participação direta dos receptores de rianodina no
processo de liberação de cálcio.(Figura 42)
Figura 41: Efeito de F9 na liberação de cálcio em fibras permeabilizadas de cobaio. As contrações
foram induzidas com cafeína 20 mM após um carregamento com solução pCa 6.6 por 3 minutos.
Contrações induzidas por administração de F9 10 µM foram feitas na presença ou ausência de
Rutênio Vermelho (30 µM).As tensões isométricas são registradas considerando-se p0 ( pCa 4.8)
como 100%.* p< 0.05 quando comparado F9 10 µM vs F9 10 µM + Rutênio Vermelho 30 µM .
9 DISCUSSÃO
A integridade do processo de acoplamento excitação-contração cardíaca é
um passo essencial na homeostase da função cardiovascular. Alterações neste
sistema já foram descritas como fator decisivo para o surgimento de patologias,
como hipertermia maligna (MCCARTHY et al, 2005), taquicardia ventricular
polimórfica catecolaminérgica tipo 1 (BLAYNEY & LAI, 2009) e insuficiência cardíaca
(GYÖRKE & TERENTYEV, 2008).
Agonistas β1-adrenérgicos ainda constituem uma das principais opções para
o tratamento de desordens cardiovasculares, possuindo importância na manutenção
dos
parâmetros
hemodinâmicos
de
pacientes
cardiopatas
(II
DIRETRIZ
BRASILEIRA DE INSUFICIÊNCIA CARDÍACA AGUDA, 2009). Diferentemente de
isoproterenol, intrinsecamente envolvido com a ativação da via sinalizadora PKAAMPc e cronotropismo positivo, F9 atuou no aumento de inotropismo cardíaco,
aumentando a pressão interna do ventrículo, débito cárdico e fração de ejeção.
Medidas de inotropismo como dP/dT máxima e mínima explicam o aumento
visto no débito cardíaco e na fração de ejeção em relação a F9. Estes, por sua vez,
também dependem diretamente de parâmetros como volume diastólico final e
volume sistólico final, portanto, mesmo com a diminuição da frequência cardíaca, é
possível relacionar a influência desses parâmetros tanto no incremento do débito
cardíaco quanto na fração de ejeção. Isoproterenol também obteve aumento da
fração de ejeção e débito cardíaco, explicados através do aumento da frequência
cardíaca, influenciando diretamente índices lusitrópicos como tempo de duração da
diástole.
A diminuição da frequência cardíaca vista com a infusão de F9 está
diretamente relacionada ao aumento do tempo de diástole, contribuindo assim para
um possível aumento no volume diastólico final e consequentemente débito cardíaco
e fração de ejeção. Não foi registrado incremento inotrópico concomitante à
frequência, excluindo assim a possibilidade de o desenvolvimento de um fenômeno
do tipo “staircase”.
A conservação de índices lusitrópicos, como o tau e dP/dt mínima demonstra
a preservação do estado de relaxamento do coração durante o período de
preenchimento ventricular, sem prejuízo do processo de relaxamento, melhorando
assim a função cardíaca, sem a presença de arritmias durante o tempo de infusão
ou no período de repouso.
Nosso estudo visa à caracterização de F9 como cardiotônico, porém, existem
limitações quanto à ausência de experimentos com a infusão de digoxina in vivo,
não podendo haver, portanto, uma comparação fidedigna aos efeitos tempodependentes e concentração-dependentes entre F9 e Digoxina. Outra limitação
concerne a respeito da atuação de F9 em leitos vasculares, avaliando parâmetros
importantes na pós-carga, como a resistência vascular sistêmica, pressão arterial
média e pressão aórtica.
Dados da literatura mostram a atuação de glicosídeos na manutenção de
condições patológicas como insuficiência cardíaca, aumentando a capacidade
contrátil e de relaxamento, e a [Ca2+]i durante o ciclo cardíaco. Porém há um limite
citosólico de cálcio, que se excedido, não permite o incremento de contratilidade e
relaxamento, ocorrendo o aparecimento de arritmias. Digoxina, em um modelo de
coração isolado, mediante protocolo de isquemia e reperfusão em cobaio, foi capaz
de modificar a curva de [Ca2+] /Pressão do Ventrículo, aumentando em período préisquemia e de reperfusão, parâmetros contrateis como a pressão sistólica e
diastólica no ventrículo esquerdo e dP/dt máxima , também como disponibilidade de
cálcio , como
Ca2+-sistólico e d[Ca2+]/dtmax comparado ao controle ( CHEN et
al,2003; RHODES et al, 2003 ).
Demiryürek e colaboradores (2002) relatou em modelo de coração isolado de
cobaio perfundido, alterações mediante infusão de digoxina (8 µg/ml/min) ocorrendo
tanto o aparecimento de eventos de taquicardia ventricular, fibrilação ventricular e
batimentos ectópicos ventriculares, registrando o aumento da duração do fenômeno
nas preparações, quanto a incidência desse tipo de arritmias comparado ao controle.
Guo e colaboradores (2010) demonstraram através de modelo de
cardiomiócito derivado de célula-tronco pluripotente humana, alterações celulares
mediante administração de ouabaína e digoxina. Digoxina e Ouabaína aumentaram
de forma dose-dependente a amplitude da onda de cálcio, reduziram a amplitude
dos “spikes” de Na+, e induziram arritmias em cardiomiócito derivado de célulatronco pluripotente.
Já em cardiomiócitos ventriculares de cobaio, ouabaína foi capaz de
aumentar de forma dose - dependente a concentração intracelular de Ca2+ e induziu
arritmias nas maiores concentrações (QIAN & GUO, 2010).
Constituindo uma das opções terapêuticas para o tratamento de desordens
cardiovasculares (FIGUEIREDO & MACHADO, 2010), os digitálicos foram alvo de
muitos estudos envolvendo seu efeito inotrópico positivo que tem sido relacionado à
citotoxicidade, sendo, portanto um fármaco cujo mecanismo de ação por influxo de
cálcio externo está relacionado a seus efeitos pró-arrítmicos.
A disfunção diastólica é o maior problema clínico na hipertrofia cardíaca e
insuficiência cardíaca, tanto quanto a disfunção sistólica, e algumas vezes a
insuficiência cardíaca pode ser induzida somente pela disfunção diastólica, mesmo a
função sistólica estando preservada (BONOW & UDELSON, 1992; DOUGHERTY et
al, 1984; GROSSMAN, 1991).
O aumento concentração-dependente de digoxina reflete seu mecanismo de
ação intrínseco por influxo contínuo de cálcio, havendo uma sobrecarga dos
mecanismos responsáveis pela extrusão de cálcio e posterior relaxamento. PHY,
F13 e F9 demonstraram uma conservação da dinâmica diastólica em comparação à
digoxina.
O desempenho de compostos digitálicos em preparações cardíacas
classicamente promove alterações de parâmetros como aumento do tempo para
atingir o pico máximo e tempo para o relaxamento de 80% da contração, fato este
que não se assemelha ao perfil farmacológico das substâncias estudadas nos
parâmetros mensurados, sendo possível inferir um mecanismo de ação diferente
dos digitálicos para estes compostos.
Uma das vias de sinalização clássicas no coração para aumento da
contratilidade é a dos receptores β1-adrenérgicos (AHLQUIST, 1948). Usada na
insuficiência cardíaca descompensada, dobutamina, uma catecolamina sintética,
exerce grandes efeitos inotrópicos acompanhados de menor cronotropismo em
baixas doses, porém com consumo de O2 miocárdico significativo e desenvolvimento
de tolerância a longo prazo (CHRISTOPHER, 2008).
F9 não compartilha com catecolaminas a capacidade de ativação de
receptores β1-adrenérgicos. Por exemplo, seu efeito inotrópico positivo na
contratilidade cardíaca não é afetado em átrios previamente incubados com
propranolol, antagonista não específico de receptores β-adrenérgicos. Este dado é
corroborado pela ausência de aumento de frequência cardíaca induzida por F9 em
preparação de átrio direito.
Entre vários fatores que pré-dispõem o desenvolvimento de insuficiência
cardíaca, um deles é o infarto do miocárdio, que por sua vez, trazem consigo uma
condição
de
isquemia
INSUFICIÊNCIA
no
CARDÍACA
cardiomiócito
CRÔNICA,
(III
2009).
DIRETRIZ
Condições
BRASILEIRA
DE
isquêmicas
são
acompanhadas de alterações no pH intracelular (COBBE & POOLE –WILSON,
1980), induzindo a um estado de acidose celular, promovendo mudanças na
fisiologia de elementos envolvidos no processo do acoplamento excitação-contração
, como a dessensibilização dos receptores de rianodina e enfraquecimento da
ligação do cálcio à troponina C (VAUGHAN-JONES et al, 2009) e a diminuição do
influxo de cálcio via canais de cálcio ativados por voltagem (CHENG et al, 2009).
F9 não foi capaz de manter o efeito inotrópico positivo máximo em condições
de acidose intracelular na presença ou ausência de verapamil, sendo possível inferir
a dependência do efeito inotrópico de estruturas afetadas por essa condição, ao
passo que experimentos realizados na ausência de acidose e incubados
antecipadamente com verapamil conservaram o efeito inotrópico positivo, refletindo
dissociação do efeito contrátil quanto à modulação de canais de cálcio regulados por
voltagem, contribuindo para a exclusão da participação dos canais de cálcio
regulados por voltagem no fenômeno do aumento de força.
Entre uma ampla variedade de proteínas quinases presentes nas células de
mamíferos, proteína quinase cálcio/fosfolipídio dependente (PKC) e proteína quinase
dependente de AMPc (PKA) são conhecidas por mediar uma gama de reações de
fosforilações no miocárdio, resultando em liberação de cálcio intracelular (WANG et
al, 2003).
Elementos cruciais na via de sinalização para o incremento de força, PKA e
PKC têm como alvo; receptores de rianodina, canais de Cálcio, Ca 2+- Calmodulina
quinase, trocador Na+- Ca2+ e sensibilidade dos miofilamento contrateis (BERS,
2001).
F9
manteve
seu
efeito
inotrópico
em
preparações incubadas com
estaurosporina, inibidor específico de PKC, enfraquecendo ainda mais a teoria da
participação das vias de sinalização α-adrenérgica. No entanto, não observamos o
mesmo na presença de H89, inibidor específico de PKA. O efeito inotrópico induzido
por F9 é fortemente inibido por este fármaco. Este fato demonstra que a ativação de
PKA tem papel fundamental na via de sinalização farmacológica responsável pelo
incremento de força induzido por F9.
Desde a descoberta do AMPc como segundo mensageiro, este tem sido
considerado responsável pela resposta inotrópica de vários agentes (TSIEN, 1977).
O efeito inotrópico positivo do AMPc é consequência da fosforilação de proteínas
sarcoplasmáticas resultando no aumento do influxo de cálcio através de canais
lentos de cálcio em resposta a despolarização da membrana e ativação de proteínas
quinases dependentes de AMPc.
Muitos inotrópicos usados atualmente na terapêutica da insuficiência cardíaca
agem no aumento dos níveis intracelulares de AMPc no miócito.Tanto a fração
esteroidal PHY quanto a fração isolada F9 mostraram uma disparidade quanto à
correlação no nível de AMPc e a força inotrópica em átrio esquerdo quando
comparados à forscolina, indicando que o mecanismo de ação de PHY e F9 não
possuem similaridades com os fármacos que atuam por este mecanismo.
O aumento da contratilidade do miocárdio por mecanismos via AMPcindependente têm sido mostrada recentemente em diversos trabalhos. Nikolai
O.Dulin et al demonstrou que a degradação de IΚB, um fator inibitório de NFΚβ, que
complexado com PKA mantinha a enzima em um estado inativo, após a ativação de
ET1 por endotelina, ativava PKA independente do aumento de AMPc (2001). Já
Mark Kohr e colaboradores demonstrou a ativação de PKA por baixas
concentrações de peroxinitrito em preparações enzimáticas com PKA purificada, na
ausência de incremento de AMPc (2010).
Através da observação dos níveis de AMPc em átrios sob ação de F9,
concluímos que a ativação de PKA, como passo intermediário no efeito inotrópico
positivo, independe do aumento dos níveis de AMPc no miocárdio (Figura 27), pelo
menos
pelos mecanismos clássicos
como a ativação de receptores β1 ou
estimulação direta de adenilato ciclase.
A mobilização de Ca2+ entre o meio extracelular e os compartimentos
celulares atua como um fator marcante na manutenção e modulação da
contratilidade cardíaca (CLAPHAM, 2007). Diversos mecanismos celulares são
utilizados para a regulação positiva ou negativa dos níveis de Ca 2+ dentro do
ambiente intracelular (BERRIDGE & BOOTMAN, 2000). A liberação de cálcio no
retículo sarcoplasmático via RYR2 ou IP3R, permite modificações transitórias dos
níveis intracelulares de Ca2+ e ativação de vias de sinalização específicas ou
internalizações de íons Ca2+ como meio para retirada do ambiente intracelular,
através da SERCA (CLAPHAM, 2007).
A alteração da atividade de captação de cálcio ou sensibilidade dos
miofilamentos contrateis não foi alterada por F9 em fibra permeabilizada excluindo a
atuação de F9 sobre o aumento da concentração de Ca2+ no retículo
sarcoplasmático pela SERCA2a ou a interação dos miofilamentos no processo dos
filamentos deslizantes. F9 se mostrou um ativador para liberação de cálcio, agindo
semelhantemente a cafeína.
O rutênio vermelho é um dos inibidores mais potentes da liberação de cálcio a
partir do retículo sarcoplasmático. A partir de experimentos de liberação, verificou-se
que rutênio vermelho aumentou a taxa de captação de cálcio e decresceu a taxa de
liberação em concentrações efetivas variando desde 1nM até 20 mM ( ZUCCHI &
RONCA-TESTONI ,1997).
A hipótese de um possível desencadeamento de cascatas sinalizadoras por
proteínas quinases que tem como alvo final RYR2 se confirmou com uso de Rutênio
vermelho, indicando que existe uma via de sinalização upstream ao RYR2.
Trabalhos mostram que a concentração do segundo mensageiro inositol
1,4,5-trifosfato (IP3) aumenta através da ativação da cascata de sinalização
proveniente da quebra de um fosfoinositídio de membrana , assim , aumentando o
efluxo de cálcio do reticulo sarcoplasmático no músculo cardíaco (NOSEK et al,
1986). A transdução de sinal através do complexo de sinalização presente na bomba
Na+,K+ -ATPase está envolvida em uma gama de feitos celulares como hipertrofia do
miócito e regulação da transcrição para fatores de crescimento (HUANG et al,1997;
PENG et al,1996 ).
O bloqueio farmacológico dessas vias de sinalização através do receptor de
IP3 no reticulo sarcoplasmático ou da proteína Src na NKA tem sido utilizado em
pesquisas no âmbito do processo de acoplamento excitação contração.
A hipótese de que F9 estivesse atuando no receptor de IP3 ou na proteína Src
acoplada via sinalizadora da Na+,K+-ATPase (XIE & ASKARI, 2002; APERIA , 2007)
foi descartada após F9 induzir aumento de tensão na fibra permeabilizada na
presença dos inibidores Xestonpongina C (IP3) e Herbimicina (Src).
Outra limitação do nosso trabalho é a ausência de experimentos utilizando
técnica de Western Blotting avaliando a expressão do RYR2 fosforilado em átrios
incubados com F9, F9 + H89 e Forscolina, pois nos proveria evidências a respeito
de RYR2 e seus respectivos sítios de fosforilações: RYR2 - 2814 RYR2- 2808 e
RYR2 - 2030 e nos informaria sobre uma provável ativação de cascatas
dependentes de cálcio- calmodulina quinase ou PKA.
No entanto, o efeito cardiotônico de F9 parece ser dependente de um
mecanismo metabotrópico associado à regulação de sistema de controle de
homeostase do cálcio. Outra limitação desse estudo, portanto é a ausência de
medidas de dinâmica do cálcio livre no miócito cardíaco na presença de F9 e em
outras condições experimentais, como na presença do inibidor H89.
Uma via farmacológica condizente com os dados gerados à administração de
F9 é a via das purinas e pirimidinas. Estudos realizados em corações isolados de
rato demonstraram o efeito inotrópico positivo de adenosina através da ativação de
receptores de adenosina A2a (MONAHAN, 2000) e vasodilatadores por aumento do
fluxo coronário (CHANDRASEKERA, 2010). Também é relatado em átrio de cobaio
e rato efeitos inotrópico positivo após um rápido e transitório decréscimo, devido à
administração de ATP (VASSORT, 2001). Já em miócito isolado de rato foi descrito o
aumento de cálcio e contratilidade em virtude da ativação de receptores A 2a e
consequente ativação de PKA, enquanto estimulação de receptores A 1 estaria ligada
a uma inibição de adenilato ciclase e inotropismo negativo (DOBSON, 2008).
O mecanismo de transdução de sinal mais comum reconhecido para
receptores A2a é a ativação de adenilato ciclase, sendo mediado por estimulação da
proteína Gs, e envolvendo uma via AMPc-dependente (RALEVIC,1998). Entretanto,
vias AMPc-independente também podem estar envolvidas (LIANG, 1996),
explicando o efeito inotrópico visto por F9, concomitantemente à ausência de
crescimento nos níveis de AMPc.
Outro possível mecanismo para ação de F9 no cardiomiócito é através de
uma proteína crucial para a contratilidade cardíaca: a fosfolambam. Estudos
mostraram que o aumento dos níveis de AMPc e ativação de PKA promoveram
aumento da taxa e quantidade da captação de Ca 2+ em vesículas cardíacas
(KIRCHBERGER,1972;KATZ, 1998), através da fosforilação de fosfolambam, colocalizada com SERCA2a (TADA,1975;LA RAIA, 1974). Experimentos em coração
isolado perfundido mostraram o aumento de inotropismo e lusitropismo em resposta
a catecolaminas através da fosforilação de fosfolambam PKA-dependente em serina
16(LINDEMAN, 1983). O aumento de força capacidade de relaxamento, visto
através do aumento da dP/dT máxima quanto dP/dT mínima, poderia ser explicado
pela fosforilação de fosfolambam PKA-dependente.
Apesar disto, o efeito cardiotônico induzido por F9, que não está associado à
tonotropismo positivo e arritmias, nos encoraja a agregar mais esforço para o melhor
entendimento da farmacodinâmica desse composto.
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