ATIVIDADE NEUROTÓXICA DO VENENO DE Rhinella icterica (Spix

ATIVIDADE NEUROTÓXICA DO VENENO DE Rhinella icterica
(Spix, 1824) EM BARATAS DA ESPÉCIE Nauphoeta cinerea(1)
Yuri Correia Barreto(2), Allan Pinto Leal(3), Raquel Soares Oliveira (4), Lúcia
Vinadé(5), Tiago Gomes dos Santos(6), Cháriston André Dal Belo (7).
(1) Trabalho
executado com recursos do Edital 063/2010 Toxinologia CAPES.
de Biotecnologia; Universidade Federal do Pampa; São Gabriel, RS;
[email protected];
(3) Mestrando do Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas (PPGCB); Universidade Federal do
Pampa; São Gabriel, RS; [email protected];
(4) Doutoranda do Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas (PPGCB); Universidade Federal
do Pampa; São Gabriel, RS; [email protected];
(5)
Professora
associada
Universidade
Federal
do
Pampa;
São
Gabriel,
RS;
[email protected];
(6) Professor adjunto Universidade Federal do Pampa; São Gabriel, RS; [email protected];
(7) Orientador; Professor Associado, LANETOX; Universidade Federal do Pampa; São Gabriel, RS;
[email protected];
(2) Graduando
Palavras Chave:
neuromuscular.
Veneno
de
sapo,
atividade
inseticida,
cardiotoxicidade,
bloqueio
INTRODUÇÃO
O sapo Rhinella icterica é uma espécie de anuro presente no estado do Rio Grande do Sul,
principalmente em regiões de mata Atlântica. Apesar de vários estudos ecológicos já terem
sido feitos com esse animal, nosso grupo é pioneiro na investigação da atividade biológica do
veneno desse animal. Nesse trabalho investigamos o mecanismo de atividade do veneno do
sapo Rhinella icterica (VSRI) sobre o sistema nervoso periférico e cardiovascular de baratas.
METODOLOGIA
a. Veneno de Rhinela icterica (VSRI): O VSRI foi extraído de sapos coletados no município de
derrubadas (RS), com autorização do Sistema de Autorização e Informação em Biodiversidade
(SISBIO) licença de coletor n°: 24041-2. A extração do veneno se deu por compressão manual
das glândulas paratóides e os animais foram tombados em coleção. Após a coleta do veneno o
mesmo foi dissolvido em metanol e submetido a liofilização para a retirada de aminas
biogênicas. O material resultante foi dissolvido em solução salina para insetos (SSI) em
concentração estoque de 1000x a desejada. A SSI possuía a seguinte concentração em mM:
NaCl, 214; KCl, 3.1; CaCl2, 9; sucrose, 50; HEPES, 5, pH 7.2.
b. Animais: Foram utilizadas baratas da espécie Nauphoeta cinerea (Olivier) de ambos os
sexos. Os animais ficaram alojados em insetário com temperatura controla (22-25°C) e água e
ração ad libitum. Para os ensaios as baratas foram anestesiadas por resfriamento a 8°C (7min)
e afixadas com alfinetes entomológicos em placa de dissecação para posterior montagem das
preparações.
c. Preparação coração semi-isolado (CSI). A avaliação da cardiotoxicidade foi realizada em
preparações coração semi-isolado. A preparação CSI foi montada como descrito por
(RODRIGUES et al., 2012). Para a montagem da preparação a cutícula que recobre o abdome
foi removida com o auxílio de uma tesoura oftálmica expondo os órgãos viscerais que foram
cuidadosamente afastados com o auxílio de uma pinça, para a perfeita visualização do sistema
vascular. A seguir, o animal foi colocado sob uma lupa com aumento de 60X (Olympus, EUA) e
os batimentos cardíacos contabilizados visualmente durante 30min.
d. Preparação músculo coxal adutor metatorácico (MCAM). A preparação MCAM foi montada
de acordo com (MARTINELLI et al., 2014). Após a fixação do animal em decúbito dorsal, foi
feita a dissecação da quitina da região metatoráxica que compreende o último par de pernas,
para a exposição do nervo 05. Foi inserido um par de eletrodos de Ag/AgCl em alfinetes, pelos
quais foram aplicados os estímulos elétricos (2-5V, 0.5 Hz, 0.5ms). A perna do animal foi
amarrada com linha de costura que foi conectada a um transdutor isométrico acoplado a um
sistema para registros eletromiográficos (AVS, São Carlos, Brasil). Os registros
neuromusculares foram feitos durante 120 min. Os resultados foram expressos como a média ±
EPM em porcentagem. Foi usado o teste two-way ANOVA como análise estatística, onde foram
considerados significativos valores de *p<0.05
RESULTADOS e DISCUSSÃO
Em ensaios em preparação CSI onde os animais foram incubados apenas com SSI a
freqüência cardíaca média foi de 90 ± 5 batimentos.min-1. Quando o VSRI (1, 2, 4 e 8g.g-1) foi
ensaiado na mesma preparação houve uma diminuição dose-dependente da frequência
cardíaca, que foi máxima (504 batimentos.min-1) para a maior dose, em 30min de incubação
(n=6, p<0.05). Mesmo após lavagem das preparações com SSI não foi observado recobro na
frequência cardíaca. Em registros eletromiográficos para a determinação da atividade do VSRI
sob a junção neuromuscular de baratas a aplicação das doses (20, 50, e 100g/g), induziu
diminuição progressiva e dose-dependente na resposta contrátil, em 120min (n=6,
respectivamente). Nesses ensaios, a inibição completa da resposta contrátil ocorreu com a
dose de 100g/g aos 110min de registro (n=6, p<0.05). Nossos resultados demonstram que o
VSRI induz alterações na freqüência cardíaca de baratas, bem como bloqueio neuromuscular
irreversível. Sugere-se que o VSRI esteja atuando na via octopaminérgica para reduzir a
freqüência cardíaca de Nauphoeta cinerea. O bloqueio da resposta contrátil em insetos
sugere que toxinas presentes no veneno atuem possivelmente de duas maneiras: ou
interagindo diretamente com os receptores glutamatérgicos, como um antagonista ou mesmo
aumento a liberação gabaérgica pelo aumento da sinalização octopaminérgica no gânglio
metatorácico.
CONCLUSÕES
Em conclusão, VSRI apresentou atividade cardiotóxica em conjunto com a neurotoxicidade
periférica. A atividade entomotóxica apresentada pelo veneno do sapo Rhinella icterica, reforça
o interesse preservacionista, demonstrando a aplicabilidade biotecnológica de um composto
natural oriundo da fauna local.
REFERÊNCIAS
RODRIGUES, V.; DÖRR, F. A.; MORI, B.; PINTO, E.; DAL BELO, C. A.; COLEPICO, P. Effects of a
cyanobacterial extract containing-anatoxin-a(s) um the cardiac rhythm of Leurolestes circunvagans.
Revista Brasileira de Farmacognosia. vol.22 no.4 Curitiba Jul./Agt. 2012 Epub May 29, 2012.
MARTINELLI, A. H.; KAPPAUN, K.; LIGABUE-BRAUN, R.; DEFFERRARI, M.S.; PIOVESAN, A.
R.; STANISCUASKI, F.; DEMARTINI, D. R.; DAL BELO, C. A.; ALMEIDA, C. G.;FOLLMER, C.; VERLI,
H.; CARLINI, C. R.; PASQUALI, G. Structure–function studies on jaburetox, a recombinant insecticidal
peptide derived from jack bean (Canavalia ensiformis) urease. Biochimica et BiophysicaActa (BBA) General Subjects. Volume 1840, Issue 3, March 2014.