universidade federal fluminense faculdade de veterinária

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UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE
FACULDADE DE VETERINÁRIA
MESTRADO EM MEDICINA VETERINÁRIA
PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO EM CLÍNICA E REPRODUÇÃO ANIMAL
RODRIGO DA ROCHA LEE
DETECÇÃO DE ANTICORPOS CONTRA O VÍRUS DA DIARRÉIA VIRAL BOVINA
(BVDV) EM AMOSTRAS COLETIVAS DE LEITE DE REBANHOS DO ESTADO DO
RIO DE JANEIRO
NITERÓI
2012
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RODRIGO DA ROCHA LEE
DETECÇÃO DE ANTICORPOS CONTRA O VÍRUS DA DIARRÉIA VIRAL BOVINA
(BVDV) EM AMOSTRAS COLETIVAS DE LEITE DE REBANHOS DO ESTADO DO
RIO DE JANEIRO
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Medicina Veterinária da
Universidade Federal Fluminense, como
requisito parcial para obtenção do Grau de
Mestre. Área de concentração: Clínica e
Reprodução Animal.
Orientador: Prof. Dr. WALTER LILENBAUM
Co-orientador: Prof. Dr. MARCELO DE LIMA
Niterói
2012
3
RODRIGO DA ROCHA LEE
DETECÇÃO DE ANTICORPOS CONTRA O VÍRUS DA DIARRÉIA VIRAL BOVINA
(BVDV) EM AMOSTRAS COLETIVAS DE LEITE DE REBANHOS DO ESTADO DO
RIO DE JANEIRO
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Medicina Veterinária da
Universidade Federal Fluminense, como
requisito parcial para obtenção do Grau de
Mestre. Área de concentração: Clínica e
Reprodução Animal.
Aprovada em
BANCA EXAMINADORA
_____________________________________________________
Prof. Dr. WALTER LILENBAUM – Orientador
UFF
_____________________________________________________
Prof. Dr. ANDRÉ LUÍS RIOS RODRIGUES
UFF
_____________________________________________________
Profa. Dra. MELISSA HANZEN PINNA
UFBA
Niterói
2012
4
EPÍGRAFE
“No que diz respeito ao empenho, ao compromisso, ao esforço, à dedicação, não
existe meio termo; ou se faz uma coisa bem feita ou não se faz.”
Ayrton Senna
5
AGRADECIMENTOS
A Deus em primeiro lugar;
À minha família pelo incentivo e apoio irrestrito, em especial
aos meus pais Ricardo Lee Gomes da Silva e Monica da
Rocha Lee, minha avó Thereza Dias da Rocha e meus irmãos
Eduardo da Rocha Lee e Guilherme da Rocha Lee;
Ao meu orientador Prof. Dr. Walter Lilenbaum pela
oportunidade concedida e confiança depositada;
Ao meu co-orientador Prof. Dr. Marcelo de Lima, por todos os
valiosos ensinamentos e compreensão ao longo deste período.
Os conhecimentos adquiridos contribuíram de forma concisa
com o meu aprimoramento profissional;
Ao pesquisador da Embrapa Gado de Leite Guilherme Nunes
de Souza pelo fornecimento de amostras e ajuda no
delineamento experimental e avaliação estatística, sua
colaboração foi primordial para o enriquecimento do estudo;
Aos professores, funcionários e colegas dos Laboratórios de
Bacteriologia e Virologia pelo tempo de convívio;
A todos que, de alguma forma, fazem parte da minha vida e
colaboraram direta ou indiretamente na elaboração desta obra;
À CAPES e PROPPi-UFF pelo apoio financeiro.
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RESUMO
A infecção pelo vírus da diarréia viral bovina (BVDV) tem sido associada a
importantes perdas econômicas na bovinocultura mundial. Diversos estudos têm
demonstrado que a infecção pelo BVDV está amplamente distribuída nos rebanhos
bovinos no país, trazendo prejuízos principalmente na área reprodutiva. As
estratégias de controle da infecção pelo BVDV se baseiam fundamentalmente na
identificação e posterior remoção de animais com infecção persistente dos
rebanhos. O presente trabalho teve como objetivo principal estudar a ocorrência da
infecção em rebanhos bovinos leiteiros de regiões produtoras do estado do Rio de
Janeiro. Amostras de tanques de leite provenientes de 836 rebanhos foram
analisadas por um kit comercial de ELISA indireto para a detecção de anticorpos
específicos contra o BVDV. Os resultados demonstraram que 73,2% das amostras
analisadas foram reativas, o que indica uma ampla disseminação da infecção nos
rebanhos estudados, visto que a grande maioria das propriedades analisadas não
utilizava vacinação contra a enfermidade. Foi ainda observada uma correlação
positiva entre o número de vacas em lactação dos rebanhos e o nível de anticorpos
no tanque de leite. Além disso, quando os resultados do ELISA são analisados de
forma criteriosa, podem fornecer informações importantes sobre a situação
epidemiológica do rebanho. Isto foi demonstrado pelos elevados valores do índice
A/P observados em uma pequena parcela das amostras analisadas sugerindo
infecção ativa pelo BVDV e possível presença de animais persistentemente
infectados nestes rebanhos.
Palavras-chave: BVDV. Infecção persistente. Amostras coletivas de leite. Anticorpos.
7
ABSTRACT
Bovine viral diarrhea virus (BVDV) has been associated to important
economical losses to the cattle industry worldwide. Several studies indicated that
BVDV infection is widespread in Brazil causing mainly reproductive disorders in cattle
herds. Control and eradication strategies are focused on the identification followed by
elimination of animals persistently infected by BVDV from the herds. The main
objective of this study was to evaluate the occurrence of BVDV infection in dairy
herds from Rio de Janeiro, Brazil. With that purpose, 836 bulk tank milk samples
were collected from different herds and tested by a commercial indirect ELISA kit for
the detection of specific BVDV antibodies. The results demonstrated that 73.2% of
the samples were reactive indicating that BVDV infection is widely distributed in the
studied region since most part of the herds were not vaccinated against BVDV. We
also observed a positive correlation between number of lactating cows and level of
antibodies in the bulk milk samples. Furthermore, when carefully analyzed, the
ELISA results can indicate essential information about the epidemiological situation
of the dairy herd. This was demonstrated in a small percentage of the studied herds
in which very high A/P values were observed. These results may suggest active
BVDV infection within these herds and possible presence of animals persistently
infected by the virus.
Key-words: BVDV. Persistent infection. Bulk tank milk. Antibodies.
8
SUMÁRIO
RESUMO, p. 6
ABSTRACT, p. 7
LISTA DE ILUSTRAÇÕES, p. 10
1 INTRODUÇÃO, p. 11
2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA, p. 13
2.1 O AGENTE, p. 13
2.2 MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS, p. 15
2.3 EPIDEMIOLOGIA, p. 16
2.3.1 Infecção persistente, p. 17
2.4 PROFILAXIA E CONTROLE, p. 18
2.4.1 Vacinação, p. 18
2.4.2 Outras estratégias de controle, p. 20
3 OBJETIVO GERAL, p. 24
3.1 OBJETIVO ESPECÍFICO, p. 24
4 MATERIAL E MÉTODOS, p. 25
4.1 DESENHO EXPERIMENTAL, p. 25
4.1.1 Rebanhos e amostras, p. 25
4.1.2 Diagnóstico sorológico, p. 26
4.2 ANÁLISE ESTATÍSTICA, p. 27
9
5 RESULTADOS, p. 29
5.1 DIAGNÓSTICO SOROLÓGICO E ANÁLISE ESTATÍSTICA, p. 29
6 DISCUSSÃO, p. 34
7 CONCLUSÕES, p. 38
8 OBRAS CITADAS, p. 39
10
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Quadro 1
Distribuição categórica do número de vacas em lactação dos
rebanhos estudados, f. 26
Quadro 2
Distribuição categórica dos índices A/P das amostras analisadas pelo
ELISA, f. 27
Tabela 1
Estatística descritiva do número de vacas em lactação e do índice
A/P, f. 29
Figura 1
Dispersão dos índices A/P em função do número de vacas em
lactação, f. 29
Tabela 2
Estatística descritiva do índice A/P de acordo com as categorias de
vacas em lactação, f. 30
Tabela 3
Distribuição de frequência dos rebanhos com o número de vacas em
lactação disponível, em função das categorias de vacas em lactação
estabelecidas pelos IQ, f. 30
Tabela 4
Distribuição de frequência dos rebanhos analisados pelo ELISA, em
relação aos clusters do índice A/P, f. 31
Figura 2
Distribuição das amostras coletivas de leite que apresentaram
reatividade (A/P ≥ 0,2) no ELISA, em diferentes clusters, f. 31
Figura 3
Análise de Correspondência entre categorias de vacas em lactação
(CATVA) e clusters do índice A/P (CLUSTERS), f. 32
11
1 INTRODUÇÃO
A doença clínica associada com a infecção pelo vírus da Diarréia Viral Bovina
(Bovine viral diarrhea virus, BVDV) foi descrita inicialmente por pesquisadores da
Universidade de Cornell, em 1946, e se caracterizava como uma enfermidade aguda
transmissível marcada por leucopenia severa, febre alta, depressão, diarréia,
erosões no trato gastrintestinal e hemorragias.
Ao longo das últimas décadas, outras manifestações clínicas foram também
associadas com a infecção pelo BVDV. Tais manifestações podem ser agrupadas
em quatro formas principais: doença aguda leve (gastrentérica, respiratória), doença
aguda severa (gastroentérica, respiratória, hemorrágica), Doença das Mucosas (DM)
e Diarréia Viral Bovina (Bovine viral diarrhea, BVD) crônica (recentemente
reconhecida como uma forma da DM). Apesar desta variedade de apresentações
clínicas, as maiores consequências da infecção pelo BVDV estão relacionadas com
perdas reprodutivas em bovinos. Os bovinos são considerados os hospedeiros
naturais do BVDV, porém o vírus possui a capacidade de infectar uma variedade de
ruminantes domésticos e silvestres, além de suínos.
Estudos têm demonstrado que entre 60-90% de toda a população mundial de
bovinos possuem anticorpos contra o BVDV. No Brasil, diversos trabalhos já
comprovaram a difusão da infecção em rebanhos bovinos de corte e leite.
Uma das características marcantes na epidemiologia da infecção pelo BVDV
é a sua habilidade em causar infecção transplacentária que, frequentemente, resulta
no nascimento de bezerros persistentemente infectados (PI). Tem sido ainda
observado que, em rebanhos com a presença destes animais PI, cerca de 90% dos
animais são soropositivos e possuem altos títulos de anticorpos circulantes. Isto
demonstra que a excreção viral contínua pelos animais PI resulta em uma
disseminação viral eficiente aos animais mantidos em contato. Deste modo, a
12
identificação precisa e a posterior remoção dos animais com infecção persistente se
constitui no ponto central de programas de controle e/ou erradicação da infecção
dos rebanhos bovinos.
Entretanto, cabe ressaltar que a prevalência de animais PI na população
bovina é geralmente baixa (cerca de 1-2%), justificando o conhecimento prévio do
status imunitário do rebanho como uma ferramenta inicial na identificação de
rebanhos portadores de animais infectados persistentemente pelo BVDV.
A identificação de rebanhos com altos níveis de anticorpos no tanque de leite
é sugestiva de infecção ativa pelo BVDV nas propriedades e tem implicação direta
na possível presença de animais com infecção persistente. Neste sentido, este
estudo teve como objetivo principal estudar a ocorrência de anticorpos contra o
BVDV em amostras coletivas de leite provenientes de rebanhos leiteiros do estado
do Rio de Janeiro.
13
2 FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
2.1 O AGENTE
O BVDV teve a sua primeira descrição em 1946 por pesquisadores do New
York State Veterinary College da Universidade de Cornell. O agente foi isolado de
surtos de diarréia e lesões erosivas no trato digestivo de bovinos nos Estados
Unidos (BAKER, 1995). Atualmente, o vírus é reconhecido como sendo um dos
principais patógenos de bovinos, responsável por diversas manifestações clínicas e
perdas econômicas importantes em rebanhos de corte e leite em todo o mundo
(LINDBERG, 2003).
O agente está classificado na família Flaviviridae, gênero Pestivirus,
juntamente com outros dois vírus relacionados: o vírus da Peste Suína Clássica
(Classical swine fever virus, CSFV) e o vírus da Doença da Fronteira, de ovinos
(Border disease virus, BDV) (HORZINEK, 1991). A partícula viral é pequena e
esférica, com cerca de 40-60nm de diâmetro. O vírion é ainda composto por um
nucleocapsídeo icosaédrico envolto por um envelope lipoprotéico, contendo três
glicoproteínas virais: gp48/E0, gp25/E1 e gp53/E2 (DONIS, 1995). O material
genético consiste em uma molécula linear de RNA de cadeia simples, polaridade
positiva, com aproximadamente 12,3 Kb, contendo uma única ORF (open reading
frame) que é traduzida em uma poliproteína de aproximadamente 4.000
aminoácidos (LINDENBACH; RICE, 2001). A clivagem posterior dessa poliproteína
por proteases celulares e virais resulta em 10 a 12 polipeptídeos estruturais e não
estruturais (DONIS, 1995).
Os isolados do BVDV apresentam uma grande variabilidade antigênica, sendo
que dois grupos antigênicos principais já foram identificados: o BVDV tipo 1, que
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abrange a maioria das cepas de referência e os vírus utilizados em vacinas, e o
BVDV tipo 2, isolado a partir de surtos graves de BVD aguda e doença hemorrágica
em bovinos na América do Norte no final da década de 1980 (PELLERIN et al.,
1994; RIDPATH et al., 1994). Estudos posteriores sugerem, no entanto, que os vírus
pertencentes ao genótipo 2 nem sempre estão correlacionados com alta virulência e
que possivelmente existam na natureza há tanto tempo quanto o BVDV-1 (FLORES
et al., 2002).
De acordo com o efeito da replicação viral em cultivo celular, os isolados do
BVDV podem ser classificados nos biotipos citopático (CP) e não-citopático (NCP),
que são encontrados em ambos os genótipos (DUBOVI, 1992). A infecção de
células permissivas pela maioria dos vírus de campo não produz efeito citopático
(ECP) característico, enquanto que amostras CP são, quase que exclusivamente,
isoladas de animais acometidos pela DM, uma forma clínica severa da infecção
(LINDENBACH; RICE, 2001). À medida que o BVDV NCP infecta as células sem
causar efeitos aparentes, o BVDV CP induz, em geral, vacuolização citoplasmática
com evolução para morte celular (FULTON et al., 2005). A citopatologia em cultivo
celular não possui correlação com a patogenicidade e virulência do vírus in vivo,
sendo que a grande maioria dos isolados virulentos do BVDV-2 são NCP (RIDPATH,
2003a).
A caracterização molecular de amostras CP e NCP demonstrou que o biotipo
CP pode ser gerado a partir da recombinação de RNA, duplicação de sequências
virais, mutações em ponto, ou ainda inserções de sequências celulares na região da
proteína não-estrutural p125/NS23 (QI et al., 1992; GREISER-WILKE et al., 1992;
KÜMMERER et al., 2000; VILCEK et al., 2000; RIDPATH et al., 2006).
As extremidades do RNA genômico são flanqueadas por duas regiões
denominadas 5’ (386 nucleotídeos) e 3’ (226 nucleotídeos) não traduzidas
[untranslated region, UTRs]. Essas regiões possuem papel importante na replicação
do genoma, estabilidade do RNA viral e expressão gênica (DONIS, 1995;
LINDENBACH; RICE, 2001). Os vírus dos genótipos BVDV-1 e 2 podem ser
diferenciados pela análise de uma sequência de nucleotídeos da região 5’ UTR do
genoma (PELLERIN et al., 1994; RIDPATH et al., 1994). Essa análise permite
agrupar os isolados nos respectivos genótipos e tem sido utilizada para se estudar a
origem, evolução e epidemiologia do BVDV. Ambos os genótipos do BVDV têm sido
15
isolados de ruminantes em todos os continentes, com exceção da Antártida
(RIDPATH, 2010).
Em 2007, a Organização Internacional de Epizootias (OIE) adicionou a
enfermidade causada pelo BVDV, apenas nos bovinos, à sua lista de doenças de
notificação compulsória (RIDPATH, 2010). No entanto, Juliá et al. (2009)
demonstraram a presença de anticorpos específicos contra BVDV-1 e do BVDV-2
em ovinos. Foi ainda demonstrado por inquéritos sorológicos a presença de
anticorpos específicos em uma ampla gama de espécies selvagens. O vírus também
já foi isolado dessas espécies, o que levanta o questionamento sobre a importância
de uma possível interação entre animais domésticos e selvagens na epidemiologia
da infecção (VILCEK; NETTLETON, 2006).
2.2 MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS
Apesar da maioria das infecções pelo BVDV cursar de forma subclínica em
animais
imunocompetentes,
tem
sido
relatada
uma
ampla
variedade
de
manifestações clínicas que incluem desde sinais leves até doença aguda fatal
(BROWNLIE, 1990; BAKER, 1995). Enfermidade gastroentérica aguda ou crônica,
doença respiratória em bezerros, síndrome hemorrágica com trombocitopenia,
afecções cutâneas, imunossupressão e infertilidade temporária estão entre as
consequências clínicas mais frequentes da infecção pós-natal pelo BVDV em
animais soronegativos. Entretanto, as maiores consequências da infecção pelo
BVDV parecem estar relacionadas com as perdas reprodutivas que o vírus
determina, embora identificado originalmente de casos de doença gastroentérica e
frequentemente associado a esse tipo de enfermidade (BAKER, 1995).
O vírus possui afinidade por células em divisão e por esta razão o feto em
crescimento é um sítio importante de replicação viral. Em fêmeas gestantes
soronegativas, a infecção fetal ocorre, independentemente do período de gestação,
em virtualmente 100% dos casos (LINDBERG, 2003). A infecção antes ou após a
cobertura ou inseminação artificial pode resultar em perdas reprodutivas como
infertilidade temporária, retorno ao cio, mortalidade embrionária ou fetal, abortos ou
mumificação, além de malformações fetais ou o nascimento de bezerros fracos e
inviáveis. As falhas reprodutivas de muitos rebanhos endêmicos ao BVDV são os
16
sinais mais evidentes, e por vezes únicos, da presença da infecção (BROWNLIE,
1990; BAKER, 1995). A doença reprodutiva é devido à infecção direta do feto e suas
manifestações dependem do biotipo viral, status imunológico da fêmea e da fase da
gestação em que ocorreu a infecção (BROCK, 1995).
2.3 EPIDEMIOLOGIA
O BVDV possui distribuição mundial e a prevalência de anticorpos chega a
atingir 60 a 90% dos animais (HOUE, 1999) e até 80% dos rebanhos na América do
Norte e em alguns países europeus. Nesses países, que são livres de Febre Aftosa,
o BVDV é considerado o agente viral mais importante de bovinos e tem sido alvo de
numerosos estudos e de programas de controle e/ou erradicação durante décadas;
(FLORES et al., 2005).
O primeiro relato do BVDV no Brasil foi uma descrição de doença
gastroentérica, com aspectos clínicos e patológicos compatíveis com a forma
clássica da infecção, a DM (CORRÊA, 1968). O primeiro isolamento e a posterior
identificação do vírus no país foram realizados a partir do soro de bezerros coletados
para utilização em cultivos celulares (VIDOR, 1974). A partir da identificação inicial
do agente, diversos relatos sorológicos, clínico-patológicos e de isolamento viral
demonstraram a ampla disseminação da infecção pelo BVDV e a presença de
amostras de ambos os genótipos no rebanho bovino brasileiro (BOTTON et al.,
1998; PITUCO; DEL FAVA, 1998; ROEHE et al., 1998; SCHERER et al., 2002; DIAS
et al., 2010). A diversidade genética e antigênica existente entre os vírus isolados no
país, de cepas européias e norte-americanas, possui implicações práticas para o
diagnóstico, produção de vacinas e programas de controle da enfermidade
(FLORES et al., 2002; RIDPATH, 2003a).
Os estudos sorológicos da infecção no país datam do início da década de
1970, no Rio Grande do Sul (WIZIGMANN et al., 1971). Desde então,
sororeatividade têm sido evidenciada em várias regiões, comprovando que o vírus
em questão está amplamente difundido no gado bovino brasileiro (FLORES et al.,
2005). A detecção de animais virêmicos e imunotolerantes ao BVDV confirma a
ampla disseminação do vírus em rebanhos bovinos no país (OLIVEIRA et al., 1996;
BOTTON et al., 1998; FLORES et al., 2005). Tem sido ainda demonstrado o
17
isolamento frequente do BVDV a partir de fetos abortados, em amostras clínicas
e/ou material de necropsia de animais com as mais diversas manifestações clínicas,
em sêmen de touros de centrais de inseminação artificial, em fetos saudáveis
coletados em matadouros e em soro bovino comercial e/ou cultivos celulares
(FLORES et al., 2005). Oliveira (1996) realizou uma triagem em rebanhos com
problemas reprodutivos no Rio Grande do Sul para identificar animais PI, detectando
1,2% (12/1.240) de amostras positivas (leucócitos e soro) para o vírus. Botton et al.
(1998) examinaram amostras de soro de 1.396 fetos coletados em matadouros,
detectando anticorpos em 19 (1,36%) e vírus em 11 (0,79%). Embora
aparentemente baixa, a prevalência de animais virêmicos observada é suficiente
para manter o vírus na população (BAKER, 1995).
Além disso,
a presença de
anticorpos contra o
BVDV tem
sido
ocasionalmente detectada em suínos (ROEHE et al., 1998), javalis cativos no Rio
Grande do Sul (FLORES et al., 2005), caprinos (CASTRO et al., 1994) e rebanhos
bubalinos com problemas reprodutivos no estado de São Paulo (PITUCO et al.,
1997). No entanto, o papel destas outras espécies de animais domésticos e
silvestres na epidemiologia do vírus ainda não é conhecido. O conhecimento sobre a
infecção pelo vírus no país tem aumentado consideravelmente nos últimos anos, à
medida que cresce o número de laboratórios envolvidos em diagnóstico e pesquisa
sobre este agente (FLORES et al., 2005).
2.3.1 Infecção persistente
A infecção de fêmeas prenhes geralmente resulta na transmissão
transplacentária do vírus. Neste caso, a exposição do feto ao BVDV antes do
desenvolvimento completo do sistema imune, período gestacional compreendido
entre o 40º e o 120º dias, com isolados NCP do vírus, frequentemente resulta na
produção de bezerros PI e imunotolerantes ao vírus (McCLURKIN et al., 1984).
Estudos in vitro e in vivo sugerem que a persistência viral pode ser, em parte,
consequência de uma falha na indução de resposta por interferon tipo I, quando o
feto é infectado por amostras NCP do vírus no terço inicial da gestação
(CHARLESTON et al., 2001; BRACKENBURY et al., 2003). Bovinos PI possuem
deficiências em diversas funções imunológicas, sendo mais susceptíveis às
18
infecções
secundárias
e
consequentemente
acabam
morrendo
ou
sendo
sacrificados antes de atingir a idade adulta (POTGIETER, 1995).
Do ponto de vista epidemiológico, os animais PI se constituem na fonte
primária de disseminação do BVDV nos rebanhos através da excreção viral
constante e em altos títulos pelas secreções e excreções corporais (BROWNLIE,
1990; BAKER, 1995, HOUE, 1999; NISKANEN et al., 2002). Podem ser clinicamente
normais, porém é detectável a excreção de títulos virais médios a altos,
principalmente em secreções nasais e oculares (ARENHART et al., 2009). Os
animais PI são positivos para o vírus e não possuem anticorpos neutralizantes em
níveis detectáveis ao nascimento. Com a ingestão do colostro, anticorpos
neutralizantes podem ser detectados 30 dias após o nascimento com uma redução
gradual após este período (ARENHART et al., 2008; 2009).
2.4 PROFILAXIA E CONTROLE
A escolha das estratégias mais adequadas para a profilaxia e controle da
infecção pelo BVDV depende das condições específicas de cada rebanho, além da
avaliação do custo-benefício (HOUE, 2003). De um modo geral, todos os esforços
devem, fundamentalmente, ser direcionados para a detecção e eliminação dos
animais PI, além da vacinação sistemática de fêmeas soronegativas para prevenir a
infecção fetal e a consequente geração de animais PI (DUBOVI, 1992; VAN
OIRSCHOT et al., 1999; FULTON; BURGE, 2001).
2.4.1 Vacinação
Nos Estados Unidos, as primeiras vacinas contra o BVDV surgiram na década
de 1960. Atualmente, estão disponíveis mais de 160 vacinas comerciais contendo
imunógenos do BVDV (RIDPATH, 2003b). Normalmente são utilizadas vacinas
multivalentes para a prevenção e controle de doenças respiratórias em bovinos. As
formulações mais comuns incluem combinações de antígenos do BVDV, herpesvírus
bovino tipo-1 (BHV-1), vírus sincicial respiratório bovino (BRSV), parainfluenza-3 (PI3) e em alguns casos, antígenos bacterianos (VAN OIRSCHOT et al., 1999). Essas
19
vacinas contêm cepas inativadas ou atenuadas do BVDV-1 e/ou BVDV-2 (FULTON
et al, 2003).
No Brasil, somente são comercializadas vacinas inativadas, sendo que a
grande maioria delas contém cepas americanas do BVDV. Acredita-se, ainda, que a
vacinação contra o BVDV no país seja praticada em uma parcela relativamente
pequena dos rebanhos (SCHERER et. al., 2002). Estudos demonstraram a indução
de níveis baixos a moderados de anticorpos neutralizantes em ovinos e bovinos
imunizados com três diferentes formulações comerciais disponíveis no país. Além
disso, a resposta imune induzida não foi capaz de prevenir a infecção
transplacentária do vírus após o desafio intranasal em ovelhas prenhes (VOGEL et
al., 2002). Diversos outros trabalhos têm demonstrado a incapacidade das vacinas
inativadas em conferir proteção fetal completa em bovinos. As taxas de proteção
obtidas variam desde 22-25% (MEYLING et al., 1985; ZIMMER et al., 2002); 40%
(ZIMMER et al., 2002), 64% (HARKNESS et al., 1985); 83% (BROWNLIE et al.,
1995), até 86% (McCLURKIN et al., 1975).
Por outro lado, a utilização de vacinas comerciais atenuadas frequentemente
resulta em níveis altos de proteção fetal e prevenção do abortamento em vacas
gestantes. Kovács et al., (2003) observaram 91% de proteção fetal frente ao desafio
com o BVDV-1 e 100% de proteção frente ao desafio com o BVDV-2. No Brasil,
resultados promissores foram demonstrados pela elaboração de uma vacina
experimental atenuada contendo cepas nacionais do BVDV (LIMA et al., 2004).
Experimentos
in
vivo
demonstraram
a
indução
de
títulos
de
anticorpos
significativamente superiores, mais duradouros e com maior espectro de reatividade
em bovinos imunizados quando comparado aos títulos induzidos por vacinas
comerciais inativadas (LIMA et al., 2005). Em um estudo posterior (ARENHART et
al., 2008), demonstrou-se que a resposta imunológica induzida pela vacina
experimental atenuada foi capaz de conferir proteção fetal e prevenir as perdas
reprodutivas frente ao desafio com um pool de amostras heterólogas de BVDV, em
89,4% dos casos.
Os melhores resultados observados em relação à resposta imune induzida
por vacinas atenuadas contra o BVDV podem ser atribuídos a uma associação entre
resposta humoral e celular (POTGIETER, 1995). No entanto, o uso de vacinas
atenuadas pode resultar em infecção transplacentária, manutenção da virulência
residual e imunossupressão em animais vacinados (VAN OIRSCHOT et al., 1999),
20
além de recombinação da cepa vacinal com vírus NCP circulando em animais com
infecção persistente (RIDPATH; BOLIN, 1995).
Uma característica comum das vacinas desenvolvidas por laboratórios
nacionais é a inclusão de isolados brasileiros de ambos os genótipos (BVDV-1 e 2),
uma vez que, além da diversidade antigênica entre isolados locais, estes isolados
também apresentam uma baixa reatividade sorológica cruzada com as cepas norteamericanas utilizadas nas vacinas. Entretanto, a legislação brasileira ainda não
permite o uso de vacinas atenuadas contra o BVDV no país (FLORES et al., 2005).
É importante ressaltar que, no Brasil, não existe um programa específico de
controle do BVDV. Assim, o uso de vacinas vem sendo realizado indiscriminada e
inadequadamente, devido à falta de um controle dos órgãos oficiais sobre a venda e
a aplicação das mesmas. Além disso, o uso de vacinas pode dar uma falsa
sensação de segurança em relação a uma determinada enfermidade, promovendo
um comportamento de risco por parte dos produtores (ENGEL; WIERUP, 1999).
2.4.2 Outras estratégias de controle
A escolha das estratégias mais adequadas para a profilaxia e controle da
infecção pelo BVDV dependem basicamente das condições específicas de cada
rebanho (HOUE, 2003). Em geral, essas estratégias consistem na prevenção da
entrada de animais PI e/ou remoção destes das propriedades, além da utilização de
vacinas (VAN OIRSCHOT et al., 1999; FULTON; BURGE, 2001; LINDBERG, 2003).
Programas de controle e erradicação da infecção pelo BVDV sem o uso de
vacinas têm sido implementados em alguns países da Europa. Estes programas se
baseiam na identificação de rebanhos infectados e certificação de rebanhos livres,
seguidos do descarte dos animais PI das propriedades positivas (LINDBERG;
ALENIUS, 1999). Para que tenham viabilidade, esses programas devem incluir uma
avaliação do desempenho dos testes de diagnóstico, bem como as condições
epidemiológicas e econômicas dos rebanhos. Assim, o sucesso dependerá da
capacidade de identificação daquelas propriedades com infecção viral ativa e/ou
presença de animais PI, o que somente é possível com o emprego de testes
sorológicos capazes de detectar altos títulos de anticorpos anti-BVDV nos rebanhos
(HOUE et al., 2006).
21
Rebanhos que possuem animais PI podem ser identificados por exames
sorológicos, já que a presença do vírus resulta em níveis altos de anticorpos na
maioria dos animais infectados (HOUE, 1995). O diagnóstico de rebanho pode ser
feito sem a necessidade de testar todos os animais individualmente e envolve várias
estratégias, tais como a detecção de anticorpos em animais jovens (9-18 meses) e
detecção viral ou do material genético em tanques coletivos de leite, ou a detecção
de anticorpos em tanques coletivos de leite (HOUE et al., 2006; DIAS et al., 2010).
A soroconversão em animais imunocompetentes ocorre entre uma a três
semanas após a infecção aguda, sendo os anticorpos classificados em dois grupos
funcionais. Anticorpos neutralizantes são produzidos contra a glicoproteína gp53/E2,
principal indutora da resposta imune, e anticorpos não-neutralizantes responsivos a
proteína viral não-estrutural p125/NS23, a qual é essencial para a replicação viral
(HOWARD, 1990; COLLETT, 1992; BROCK, 1995). Com base nesses principais
sítios antigênicos da partícula viral, as provas sorológicas foram desenvolvidas e,
com muito sucesso, estão sendo empregadas no diagnóstico laboratorial do BVDV
(HOUE et al., 2006).
A detecção de anticorpos contra o BVDV, utilizando o teste de vírusneutralização (VNT) e o ensaio imunoenzimático (ELISA) indireto, possibilita a
classificação de rebanhos entre potencialmente infectados e não-infectados (OIE,
2009). A VNT é uma prova de referência por ser muito específica e facilmente
adaptável ao tipo ou subtipo de BVDV desejado. No entanto, a técnica consiste na
detecção exclusiva de anticorpos neutralizantes; é demorada, laboriosa e envolve
obrigatoriamente o cultivo celular e manipulação de vírus (SALIKI; DUBOVI, 2004;
SANDVIK, 2005).
Scherer et al. (2002) adaptaram a VNT para uma técnica rápida com
possibilidade de testar amostras coletivas de leite e identificar rebanhos com
atividade viral e potencialmente portadores de animais PI. Em outro estudo,
amostras de tanques coletivos de leite em rebanhos do Rio Grande do Sul foram
testadas pela técnica de VNT adaptada para a detecção de anticorpos no leite,
detectando-se 8,8% (1.028/11.711) rebanhos com títulos neutralizantes > 20 no leite;
1,5% (180/11.711) das propriedades apresentaram o leite com títulos de anticorpos
≥ 80, indicando infecção ativa e/ou à presença de animais PI (BRUM et al. 2004).
Recentemente, Sturza (2011) realizou outras adaptações na técnica de VNT,
22
solucionando o problema da toxicidade das amostras de leite para as células de
cultivo.
Por outro lado, os testes de ELISA se tornaram populares no diagnóstico do
BVDV, devido a algumas vantagens sobre a VNT como a independência do cultivo
celular, ausência de contaminações por fungos e bactérias, automatização e rapidez
na leitura dos resultados a partir de amostras do soro e leite individual ou coletivo
(NISKANEN et al., 1991; PATON et al., 1998). Estas características tornam o ELISA
adequado para estudos epidemiológicos e triagens de rebanhos em grande escala
(NISKANEN et al., 1989). Em nível mundial, o ELISA indireto tem sido o mais
empregado na detecção de anticorpos anti-BVDV na triagem de rebanhos leiteiros
(NISKANEN et al., 1991; NISKANEN, 1993; PATON et al., 1998; LINDBERG;
ALENIUS, 1999). A presença de apenas um ou alguns poucos animais em lactação
com altos títulos de anticorpos para o BVDV dentro de um rebanho de vacas
soronegativas dará origem a resultado reativo no ELISA do tanque coletivo de leite
da propriedade nesta condição (NISKANEN, 1993).
O desenvolvimento do ELISA para a detecção de anticorpos anti-BVDV em
amostras coletivas de leite (NISKANEN et al., 1991), aliado à correlação existente
entre o nível de anticorpos no leite e a proporção de animais soropositivos nos
rebanhos (NISKANEN, 1993; BEAUDEAU et al., 2001), tem impulsionado programas
de vigilância, controle e erradicação da infecção pelo BVDV nos países
escandinavos (PATON et al., 1998, LINDBERG; ALENIUS, 1999). O ELISA pode ser
usado como a primeira etapa de uma estratégia de controle para avaliar a
possibilidade de rebanhos leiteiros estarem ou não infectados pelo referido vírus
(NISKANEN, 1993). Os níveis de anticorpos específicos em amostras coletivas de
leite possuem uma boa correlação com a atividade viral e com a proporção de
animais soropositivos nos rebanhos (NISKANEN, 1993; BEAUDEAU et al., 2001;
DIÉGUEZ et al., 2008). Em etapas posteriores aos testes de triagem, os rebanhos
contendo animais com altos títulos de anticorpos deveriam ser investigados para a
possível presença de animais PI (LINDBERG; ALENIUS, 1999).
Poucos estudos, porém, utilizando o ELISA indireto para detecção do BVDV
em amostras coletivas de leite, vêm sendo realizados no Brasil. Dias e Samara
(2003) relataram a detecção de anticorpos no leite do tanque de expansão, leite
individual e soro sanguíneo de animais provenientes de rebanhos de São Paulo e
Minas Gerais.
Almeida (2010) observou 26,7% (80/300) de positividade em
23
amostras de leite coletivo de rebanhos leiteiros da região central do estado do Rio
Grande do Sul. Foi demonstrado em amostras de leite coletivo provenientes do Rio
Grande do Sul que 23,1% dos rebanhos analisados foram reativos no ELISA
(STURZA, 2011).
O ELISA permite testar um grande número de amostras e identificar rebanhos
positivos através do leite enviado rotineiramente, por exemplo, para contagem de
células somáticas (CCS), reduzindo significativamente os custos com a coleta
individual, transporte e teste de amostras. A prática pode ser utilizada também em
estudos epidemiológicos, podendo fornecer informações sobre a prevalência e
distribuição dos rebanhos positivos para o BVDV (SCHERER et al., 2002).
24
3 OBJETIVO GERAL
Determinar a ocorrência de anticorpos contra BVDV em amostras coletivas de
leite provenientes de rebanhos bovinos do estado do Rio de Janeiro.
3.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1)
Verificar a ocorrência de anticorpos contra BVDV em amostras coletivas de
leite provenientes de rebanhos bovinos do estado do Rio de Janeiro.
2)
Avaliar a correlação entre rebanhos positivos e o número de vacas em
lactação nas propriedades estudadas.
3)
Estudar uma possível relação entre o percentual de positividade nos rebanhos
e vacinação contra o BVDV.
25
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 DESENHO EXPERIMENTAL
Todos os experimentos referentes ao presente estudo foram realizados no
Laboratório de Virologia do Departamento de Microbiologia e Parasitologia, Instituto
Biomédico da Universidade Federal Fluminense (Campus do Valonguinho), Niterói,
RJ. Cabe ressaltar, ainda, que o trabalho foi aprovado pelo Comitê de Ética em
Pesquisa Animal (CEPA) sob o número de registro 00220/10, em 5 de outubro de
2010.
4.1.1 Rebanhos e amostras
Foram investigados 836 rebanhos leiteiros da espécie bovina com animais da
raça holandesa ou mestiços de holandês, vacinados ou não contra o BVDV, situados
em regiões pertencentes à bacia leiteira do estado do Rio de Janeiro. O número de
animais em cada rebanho foi variável conforme a propriedade, variando de 2 a 631.
Dentre os 836 rebanhos leiteiros investigados, foram obtidos dados referentes ao
número de vacas em lactação em 785, totalizando 33.831 animais.
As amostras coletivas de leite estudadas foram obtidas a partir de coletas de
tanques de expansão/latões e incluíam leite de vacas em produção, em qualquer
fase de lactação e independente de idade ou volume de produção. Foram ainda
levantadas informações sobre o número de vacas em lactação e histórico de
vacinação contra o BVDV dos rebanhos analisados.
Todas as amostras foram armazenadas em frascos apropriados contendo
uma pastilha de conservante Bronopol (2-bromo-2-nitropropane-1, 3-diol) e,
26
submetidas ao Laboratório de Qualidade do Leite da Embrapa Gado de Leite
(CNPGL), Juiz de Fora, MG para determinação dos componentes do leite e CCS.
Após a chegada ao laboratório da EMBRAPA, alíquotas das amostras coletivas de
leite foram acondicionadas em tubos plásticos de 2 mL, identificadas, congeladas à
-20°C e remetidas ao Laboratório de Virologia da UFF. As amostras foram mantidas
à -20°C até o momento das análises.
4.1.2 Diagnóstico sorológico
As amostras de leite coletivo foram testadas para a pesquisa de anticorpos
específicos contra o BVDV por um kit comercial de ELISA indireto (HerdChek, Idexx,
Maine, EUA). É importante ressaltar que o teste de uma amostra de leite proveniente
do tanque representa um pool de amostras oriundas de várias vacas em lactação
(triagem inicial de rebanhos).
Todos os procedimentos foram conduzidos conforme as recomendações do
fabricante do kit. Para a realização do teste sorológico, as amostras de leite foram
previamente centrifugadas a 2.000 x g por 15min. A fase aquosa foi coletada para os
testes. Fora adicionado nas cavidades para os controles positivo e negativo das
placas impregnadas 100 μl de diluente, seguido de 25 μl dos controles nas
cavidades apropriadas. Nas demais cavidades foram adicionadas 100 μl das
amostras de leite (abaixo da camada de gordura). Após homogeneização do
conteúdo das cavidades, a placa foi incubada por, aproximadamente, 17 horas sob
refrigeração (2ºC – 8ºC). Passado este período, todas as cavidades foram lavadas
com 300 μl de solução de lavagem por cinco vezes. Adicionou-se, em sequência,
100 μl de conjugado e, após 30 minutos de incubação, procedeu-se nova lavagem
para posterior adição de 100 μl do substrato com tetrametilbenzidina (TMB) em cada
cavidade. Respeitado o tempo de 10 minutos de incubação à temperatura ambiente
e no escuro, foi adicionado 100 μl de solução de interrupção (ácido sulfúrico).
A leitura da densidade óptica (450 e 630 nm) foi realizada em uma leitora de
microplacas (ER–2006, Diaglobe, Shangai, China). Ainda de acordo com as
recomendações do fabricante, foram consideradas positivas as amostras que
apresentaram o índice A/P (cálculo da razão de cada amostra com relação às
médias dos controles) ≥ 0,2.
27
4.2 ANÁLISE ESTATÍSTICA
As informações obtidas sobre o número de vacas em lactação foram
utilizadas para formação de quatro categorias com base na estatística descritiva
(SAMPAIO, 1998). Os valores limites destas categorias foram estabelecidos com
base nos intervalos interquartílicos (IQ) (Quadro 1). Foi ainda aplicada a Correlação
de Pearson (r) entre o número de vacas em lactação e o índice A/P.
Para avaliação de normalidade da distribuição dos índices A/P, foi aplicado o
teste de Kolmogorov-Smirnov (DOHOO et al., 2003). Os valores do índice A/P,
então, foram submetidos à análise de variância (ANOVA) para avaliação da
diferença entre suas médias em função das categorias de vacas em lactação
(SAMPAIO, 1998). Para identificação da diferença entre as médias do índice A/P em
relação às categorias de vacas em lactação, foi realizado o pós-teste pelo Método
da Diferença Mínima Significativa [Least Squares Difference, LSD] (SAMPAIO,
1998).
Além disso, os resultados do ELISA (índice A/P) foram categorizados com
base em uma Análise de Clusters, com nível de significância de 95% (P<0,05), em
quatro classificações (DOHOO et al., 2003) (Quadro 2). A distribuição de frequência
em função das categorias do número de vacas em lactação e dos clusters do índice
A/P, foram submetidos ao teste Qui-quadrado (SAMPAIO, 1998) e à Análise de
Correspondência (SOUZA et al., 2002) para avaliação e identificação de
associações, respectivamente.
Quadro 1: Distribuição categórica do número de vacas em lactação dos rebanhos
estudados.
Categoria
Nº vacas em lactação
1
< 18
2
18 a 35
3
36 a 56
4
> 56
28
Quadro 2: Distribuição categórica dos índices A/P das amostras analisadas pelo
ELISA.
Classificação
Índice A/P
Negativo
< 0,200
Fracamente positivo
0,200 a 0,362
Moderadamente positivo
0,363 a 0,682
Fortemente positivo
> 0,682
As análises foram feitas no programa SPSS, versão 8.0 (SPSS Inc., 1998).
29
5 RESULTADOS
Foram analisadas 836 amostras de leite coletivo provenientes de rebanhos
leiteiros de pequeno, médio e grande porte localizados no estado do Rio de Janeiro.
Dentre os 467 rebanhos que disponibilizaram informações referentes à vacinação,
em apenas 12 deles foi relatada alguma estratégia de imunização dos animais
contra o BVDV. Todos os outros 455 rebanhos não utilizam nenhum tipo de vacina
para a prevenção da infecção pelo BVDV. Nas demais 369 propriedades analisadas
neste estudo, não foram obtidos dados referentes ao histórico de vacinação dos
animais.
5.1 DIAGNÓSTICO SOROLÓGICO E ANÁLISE ESTATÍSTICA
A pesquisa de anticorpos específicos contra o BVDV pelo ELISA indireto
demonstrou que 73,2% (612/836) das amostras coletivas de leite foram reativas.
A estatística descritiva referente ao número de vacas em lactação e índice
A/P está representada na Tabela 1. Estas variáveis apresentaram correlação
positiva (r2 = 0,14) e significativa (p<0,01). Estes resultados indicam que, à medida
que aumenta o número de vacas em lactação nos rebanhos, se observa um
aumento nos valores do índice A/P das amostras coletivas de leite analisadas pelo
ELISA (Figura 1).
30
Tabela 1: Estatística descritiva do número de vacas em lactação e do índice A/P
Estatística
Número de vacas em lactação
Índice AP
N
785
836
Média
43
0,365
Desvio padrão
46
0,239
IQ 25%
16
0,190
Mediana
34
0,354
IQ 75 %
55
0,515
Mínimo
2
-0,161
Máximo
631
1,274
Figura 1: Dispersão dos índices A/P em função do número de vacas em lactação
As médias do índice A/P demonstraram diferença (p<0,01) em relação às
categorias de vacas em lactação, uma vez que os índices A/P apresentaram
distribuição normal. Estes resultados estão apresentados na Tabela 2, onde se
observa um aumento nas médias do índice A/P à medida que se eleva o número de
vacas em lactação nos rebanhos analisados. Foi ainda observado que a média do
índice A/P dos rebanhos com menos de 18 vacas em lactação é diferente (p<0,05)
quando comparada às médias dos demais grupos de rebanhos, que são iguais
(p>0,05) entre si.
31
Tabela 2: Estatística descritiva do índice A/P de acordo com as categorias de vacas
em lactação
Vacas em
lactação
Média
DP
ICM 95%
EP
LI
LS
0,014
0,285
0,342
0,239
0,017
0,332
0,398
0,392b
0,248
0,018
0,357
0,427
> 56
0,399
b
0,248
0,019
0,362
0,436
Total
0,365
0,238
0,008
0,349
0,382
0,314
a
0,210
18 a 35
0,365
b
36 a 56
< 18
N – número de rebanhos; DP – desvio padrão; EP – erro padrão; ICM – intervalo de confiança da
média com 95% de confiança; LI – limite inferior; LS – limite superior; Letras diferentes entre linhas
significam diferença estatística (P<0,05) por meio do LSD
A distribuição da frequência dos 785 rebanhos com informações sobre o
número de vacas em lactação, em função das categorias de vacas em lactação, está
demonstrada na Tabela 3. Já a distribuição de frequência de todos os rebanhos
estudados, de acordo com os clusters do índice A/P, está apresentada na Tabela 4.
Os resultados das amostras positivas no ELISA estão, ainda, apresentados de
acordo com os respectivos clusters do índice A/P (Figura 2).
Tabela 3: Distribuição de frequência dos rebanhos com informações disponíveis
sobre o número de vacas em lactação, em função das categorias de vacas em
lactação estabelecidas pelos IQ
Total
Número de vacas
em lactação
N
%
< 18
213
27,1
18 a 35
200
25,5
36 a 56
193
24,6
> 56
179
22,8
Total
785
100,0
32
Tabela 4: Distribuição de frequência dos rebanhos analisados pelo ELISA, em
relação aos clusters do índice A/P
Classificação
Índice AP
Negativo
Fracamente positivo
Total
N
%
< 0,200
224
26,8
0,200 a 0,362
208
24,9
Moderadamente positivo
0,363 a 0,682
320
38,3
Fortemente positivo
> 0,682
84
10,0
TOTAL
836
100,0
Figura 2: Distribuição das amostras coletivas de leite que apresentaram reatividade
(A/P ≥ 0,2) no ELISA, em diferentes clusters
As variáveis categorias de vacas em lactação e clusters A/P demontraram
estar associadas entre si (p<0,05). Estas associações podem ser observadas na
Figura 3, que demonstra que rebanhos menores (<18 vacas em lactação) estão
associados a classificações negativas e fracamente positivas. Em contrapartida,
rebanhos maiores (>18 vacas em lactação) estão associados a classificações
moderada e fortemente positivas.
33
Figura 3: Análise de Correspondência entre categorias de vacas em lactação
(CATVA) e clusters do índice A/P (CLUSTERS)
,6
3
,4
> 0,682
,2
0,200 a 0,362
0,0
<0,200
2
-,2
4
2
Dimensão 2
1
CATVA
0,363 a 0,682
CLUSTERS
-,4
-,6
-,4
Dimensão 1
-,2
-,0
,2
,4
,6
,8
1,0
34
6 DISCUSSÃO
O ELISA utilizado para a detecção de anticorpos em amostras coletivas de
leite se constitui em uma importante ferramenta para o monitoramento da infecção
pelo BVDV em rebanhos leiteiros. A técnica tem sido empregada em programas de
controle do BVDV por ser relativamente barata, automatizada e de fácil execução.
Quando aplicada em estudos epidemiológicos, pode fornecer informações sobre a
prevalência da infecção e distribuição dos rebanhos positivos para o BVDV
(SCHERER et al., 2002). Nas etapas posteriores aos testes de triagem, os rebanhos
contendo animais com altos títulos de anticorpos poderiam ser investigados para a
possível presença de animais PI, que pode ser confirmada através de isolamento
viral de animais com idade entre 8 e 24 meses (LINDBERG; ALENIUS, 1999).
Embora seja uma importante ferramenta para o monitoramento do status
sorológico dos rebanhos, ELISA para a detecção de anticorpos contra o BVDV em
amostras coletivas de leite tem sido pouco utilizado no Brasil. No Rio Grande do Sul,
foi demonstrado sororeatividade variando entre 23,1% (STURZA, 2011) e 26,7%
(ALMEIDA, 2010). Dias e Samara (2003), por sua vez, detectaram 40% de
sororeatividade em rebanhos leiteiros dos estados de São Paulo e Minas Gerais.
O ELISA permite testar um grande número de amostras simultaneamente e
identificar rebanhos positivos por meio do exame do leite enviado rotineiramente, por
exemplo, para CCS, reduzindo significativamente os custos com a coleta individual,
transporte e teste de amostras (SCHERER et al., 2002). No presente estudo, foram
analisadas 836 amostras de tanques de leite proveniente de rebanhos leiteiros do
estado do Rio de Janeiro. As amostras de todos os rebanhos analisados eram
rotineiramente submetidas ao Laboratório de Qualidade do Leite da Embrapa Gado
de Leite (CNPGL), Juiz de Fora, MG para a determinação dos componentes do leite
35
e CCS. Deste modo, não houve a necessidade de manipulação dos animais para a
coleta e o custo foi restrito aos testes das amostras no Laboratório de Virologia.
A sororeatividade verificada no presente estudo, embora de acordo com a
estimativa de que entre 60-90% da população mundial de bovinos possua anticorpos
contra o BVDV (HOUE, 1999), foi superior à descrita recentemente no Rio Grande
do Sul; 26,7% (ALMEIDA, 2010) e 23,1% (STURZA, 2011), além de São Paulo e
Minas Gerais; 40% (DIAS; SAMARA, 2003).
No Brasil, embora a vacinação contra o BVDV seja praticada em uma parcela
relativamente pequena dos rebanhos (SCHERER et. al., 2002), anticorpos vacinais
podem potencialmente ser detectados pelo ELISA, gerando confusão com
resultados falso-positivos. No entanto, não há estudos controlados demonstrando o
limiar de detecção de anticorpos em rebanhos vacinados contra o BVDV. Deste
modo, a identificação de rebanhos positivos pela triagem deve ser seguida da
investigação do status vacinal de cada rebanho para a determinação da origem da
sorologia positiva (SCHERER et al., 2002). Neste caso, é importante ressaltar que,
de todos os rebanhos estudados que dispunham de informações referentes ao
histórico de vacinação contra o BVDV, esta era aplicada em apenas 1,4% dos
rebanhos. Já nos rebanhos onde os animais nunca foram vacinados, resultados
reativos no teste sugerem a circulação viral nos rebanhos leiteiros da região
estudada. A prática de triagem de rebanhos que não utilizam vacinação contra o
BVDV pela detecção de anticorpos no leite tem sido utilizada por diversos países
europeus em programas de controle e erradicação da infecção. (LINDBERG;
ALENIUS, 1999; BEAUDEAU et al., 2001; GREISER-WILKE et al., 2003).
É importante observar que os resultados do ELISA em amostras de tanque de
leite devem ser analisados de forma criteriosa. Além do conhecimento sobre o status
vacinal do rebanho, os valores de densidade óptica (DO) obtidos podem ser um
indicativo da presença do agente no rebanho. Na análise de amostras coletivas de
leite, a presença de apenas um ou alguns poucos animais em lactação com altos
títulos de anticorpos para o BVDV, dentro de um mesmo rebanho de vacas
soronegativas, dará origem a reatividade no ELISA (NISKANEN, 1993). Foi ainda
demonstrado que existe uma relação direta entre o nível de anticorpos no tanque de
leite e o percentual de vacas expostas ao vírus dentro de um rebanho. Nestes
casos, um elevado valor de DO detectados pelo ELISA em amostras de tanque de
36
leite poderia ainda indicar a possível presença de animais PI na propriedade em
questão (NISKANEN, 1993; BEAUDEAU et al., 2001; GREISER-WILKE et al., 2003).
De um modo similar, no presente trabalho, foi realizada uma estratificação
dos valores do índice A/P (que reflete os valores de absorbância) com base
estatística (Tabela 4). Os resultados demonstraram que 90% das amostras
analisadas (752/836) apresentaram resultado negativo ou com valores baixos ou
moderados do índice A/P. Por outro lado, 10% das amostras (84/836) apresentaram
índice A/P > 0,682 e foram classificadas como fortemente positivas de acordo com
os clusters de índice A/P utilizados neste estudo.
Importante observar que em 1,2% (10/836) dos rebanhos analisados
observou-se índice extremamente elevado (A/P ≥ 1,0 - dados não mostrados). Sete
destes rebanhos não recebiam vacinação contra o BVDV enquanto que nos outros
três tal informação não estava disponível. Porém, muito provavelmente a origem do
resultado positivo no ELISA não se deve à vacinação tendo em vista que os
imunógenos comercialmente disponíveis são formulações inativadas do vírus e
induzem níveis baixos de anticorpos em bovinos (LIMA et al., 2005). Estes rebanhos
específicos deveriam ser o foco principal de investigações posteriores para a
identificação de animais com infecção persistente pelo vírus. Os dados obtidos
corroboram com a estimativa da prevalência de animais PI em rebanhos bovinos
que fica entre 1-2% (HOUE, 1999).
Na avaliação da correlação entre o número de vacas em lactação e o nível de
anticorpos no leite coletivo dos rebanhos estudados, foi observado que o incremento
no número de vacas em lactação por propriedade implica diretamente no aumento
do nível de anticorpos detectados (indicados pelo índice A/P). Esta constatação foi
confirmada por três diferentes testes estatísticos (Correlação de Pearson,
Comparação de Médias e Qui-quadrado) que, individualmente empregados,
ratificaram o mesmo resultado. Desta forma, quanto maior a densidade populacional
de uma determinada região, maior é a concentração de indivíduos susceptíveis
expostos ao agente infeccioso e a propagação da doença. Além disso, o fato de
haver mais animais em atividade produtiva e, na grande maioria das vezes não
imunizados, torna o rebanho ainda mais suscetível à infecção pelo BVDV. Uma
provável explicação seria que o pequeno número de animais encontrados em
determinados rebanhos (principalmente nas propriedades com <18 vacas em
37
lactação) esteja favorecendo um provável controle ou até mesmo erradicação da
infecção nestas criações.
O primeiro pré-requisito no planejamento de um programa de controle e
erradicação do BVDV é o conhecimento da situação epidemiológica da região
(SANDVIK, 1999; GREISER-WILKE et al., 2003). Assim, a baixa ocorrência da
infecção encontrada pode se constituir em uma condição favorável para o início de
um programa de controle para o BVDV nestes rebanhos. Por outro lado, o pouco
conhecimento por parte dos produtores e de parte dos profissionais da área sobre a
importância da doença, associado à alta ocorrência de animais soropositivos, pode
aumentar a probabilidade de disseminação da infecção entre os rebanhos. Isto
reforça a necessidade da implantação de estratégias de controle no país já que não
existem programas oficiais de controle e/ou erradicação do BVDV (FLORES et al.,
2005).
Deve ainda ser considerado que a maioria das infecções causadas pelo
BVDV são subclínicas, e por isso, de difícil diagnóstico e mensuração das possíveis
perdas econômicas (HOUE, 1999). Apesar do conhecimento sobre a doença estar
aumentando no Brasil e no mundo, a importância da enfermidade para os produtores
é restrita aos mais tecnificados e/ou para aqueles que usufruem de um programa de
extensão (FLORES et al., 2005). Assim, o sucesso na investigação inicial dos
rebanhos com infecção viral ativa e possíveis portadores de animais PI somente
será possível com o emprego de testes sorológicos capazes de detectar altos níveis
de anticorpos anti-BVDV.
38
7 CONCLUSÕES
O presente trabalho representa a primeira descrição da ocorrência de
anticorpos contra o BVDV em amostras coletivas de leite oriundas de rebanhos
bovinos leiteiros em regiões produtoras do estado do Rio de Janeiro.
Os resultados demonstraram que 73,2% (612/836) das amostras analisadas
foram positivas no ELISA, indicando uma ampla disseminação do agente nos
rebanhos estudados visto que a grande maioria desses rebanhos não são vacinados
contra a enfermidade. Ainda foi observada uma correlação positiva entre o número
de vacas em lactação dos rebanhos e o nível de anticorpos no tanque de leite
(indicados pelo índice A/P). Além disso, quando os resultados do ELISA são
analisados de forma criteriosa, podem fornecer informações importantes sobre a
situação epidemiológica do rebanho. Isto foi demonstrado pelos elevados valores do
índice A/P observados em uma pequena parcela das amostras analisadas sugerindo
infecção ativa pelo BVDV e possível presença de animais persistentemente
infectados nestes rebanhos.
39
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