contribuição das microdeleções - Genética

UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA GERAL
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
CONTRIBUIÇÃO DAS
MICRODELEÇÕES/MICRODUPLICAÇÕES
INTERSTICIAIS PARA O FENÓTIPO DIFICULDADE
DE APRENDIZAGEM NA MATEMÁTICA
ORIENTADA: Gabriela Chadid Salazar
ORIENTADORA: Profª Drª Maria Raquel Santos Carvalho
Belo Horizonte - MG
Julho de 2013
II
GABRIELA CHADID SALAZAR
CONTRIBUIÇÃO DAS
MICRODELEÇÕES/MICRODUPLICAÇÕES
INTERSTICIAIS PARA O FENÓTIPO DIFICULDADE
DE APRENDIZAGEM DA MATEMÁTICA
Dissertação apresentada ao programa de PósGraduação em Genética do Departamento de
Biologia Geral do Instituto de Ciências
Biológicas da Universidade Federal de Minas
Gerais, como requisito parcial para obtenção
do grau de mestre em Genética.
Orientadora: Profª. Drª. Maria Raquel Santos
Carvalho
Universidade Federal de Minas Gerais.
Belo Horizonte - MG
2013
III
Dedico este trabalho ao meu eterno anjo
BÁRBARA CHADID SALAZAR
IV
AGRADECIMENTOS
O meu muito obrigada.
À Deus, por todas as bênçãos em minha vida e por permitir essa conquista;
À professora Dra. Maria Raquel Santos Carvalho, pela oportunidade, confiança,
apoio e principalmente a orientação e os ensinamentos para a concretização deste;
À colega de trabalho, amiga e exemplo Izinara Rosse, pela dedicação, ajuda,
explicações, correção da dissertação, por cada palavra de apoio, carinho, incentivo e
principalmente por acreditar em mim;
Aos colegas do LGHM, Pablo, Fernanda, Laura, Pedro, Luana, Paula e
principalmente Aline, pela ajuda e apoio no dia a dia. Em especial à Marlene, que desde o
primeiro dia de laboratório tanto me ajudou e apoiou, e que com suas doces palavras me
deu força nos momentos difíceis;
Aos alunos do Prof. Dr. Vitor Geraldi Haase pelas coletas e os testes realizados para
triagem e diagnóstico neuropsicológico das amostras. Em especial à Flávia Neves pela
ajuda na compreensão dos testes;
À todos os professores, colegas e amigos da pós-graduação pelos ensinamentos e
que de alguma forma contribuíram para o meu aprendizado. Em especial Michelle Alves,
Raiana Silva e Raphael Steinberg;
Aos colegas do LBMM em especial a Isa e Anderson e à Elisangela Monteiro e
Mariana Eduarda Lopes da Fiocruz, pela amizade e ajuda na genotipagem das amostras;
À Silvia Costa e Carla Rosenberg do Instituto de Biociências, USP, pela ajuda com a
análise do aCGH;
Aos membros da Banca Examinadora por aceitarem meu convite;
À CAPES e CNPq pelo apoio financeiro;
À minha família, em especial meus pais pelo amor incondicional. À minha mãe pelo
carinho, paciência, incentivo, apoio, ajuda, por nunca me deixar desistir e por ser meu
alicerce;
À minhas amigas Rê, Lívia, Pri e Jú pelo apoio e entenderem os momentos de
ausência;
Em especial ao Thiago Romão por compartilhar cada momento difícil, pela
compreensão, paciência, incentivo e por tornar meus dias mais alegres.
V
“Nunca existiu uma grande inteligência sem uma veia de loucura.”
Aristóteles
VI
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS
VIII
LISTA DE TABELAS
IX
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E UNIDADES DE MEDIDA
X
1 INTRODUÇÃO
1.1
A dificuldade de aprendizagem da matemática
1.1.1 Modelos neuro-cognitivos da DAM
1.1.2 Evidências para um componente genético
1.1.3 A DAM em síndromes genéticas
1.1.4 Estudos moleculares
1.2
Estratégia de investigação das bases genético-moleculares em
desenvolvimento pelo grupo de pesquisa
1.3
A técnica de MLPA
1.4
Justificativa e relevância
1.5
Objetivos
1.5.1 Objetivo geral
1.5.2 Objetivos específicos
14
14
15
17
18
20
2 MATERIAIS E MÉTODOS
2.1
Aspectos éticos
2.2
A amostra
2.2.1 Amostra ambulatorial
2.2.2 A amostra de base populacional
2.2.3 Triagem pelo TDE
2.2.4 Testagem neuropsicológica e cognitiva
2.3
Sistemática de classificação dos pacientes
2.4
Métodos moleculares
2.4.1 Extração de DNA
2.4.2 A técnica MLPA
2.4.3 Analise dos resultados
2.5
Confirmação dos resultados
28
28
28
28
28
29
29
31
33
33
33
36
37
3 RESULTADOS
3.1
Padronização da MLPA
3.1.2 Redução do protocolo original
3.1.3 Validação do kit P245-A2
3.2
Genotipagem por MLPA
3.3
Confirmação dos resultados
3.3.1 Técnica MLPA
3.3.2 Técnica de array-CGH
40
40
40
41
43
45
45
45
21
22
25
26
26
27
VII
4 DISCUSSÃO
4.1
Padronização da MLPA
4.1.1 Avaliação do desempenho da técnica
4.1.2 Redução do protocolo original
4.1.3 Validação do kit P245-A2
4.2
Genotipagem por MLPA
4.3
Confirmação dos resultados
4.4
Contribuição das síndromes de microdeleção para a DAM
48
48
48
48
49
49
52
53
5.
PERSPECTIVAS
54
6.
CONCLUSÕES
55
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
56
ANEXO 1 - APROVAÇÃO PELA COEP/UFMG
61
ANEXO 2 - TCLE
63
ANEXO 3 - PROTOCOLO ADAPTADO PARA A TÉCNICA DE MLPA
67
VIII
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Modelo neurocognitivo do Código Triplo
15
Figura 2 - Hipótese dos genes generalistas
16
Figura 3 - Redes de interação
17
Figura 4 - Constituição dos oligonucleotídeos das sondas da MLPA
23
Figura 5 - Etapa de anelamento e ligação da MLPA
23
Figura 6 - Etapa de ligação da MLPA
23
Figura 7 - Etapa de amplificação da MLPA
24
Figura 8 - Eletroferograma para interpretação dos resultados finais da MLPA
24
Figura 9 - Estratégias de avaliação utilizadas e grupos de estudo
32
Figura 10 - Ciclo utilizado na MLPA para amplificação dos fragmentos
36
Figura 11 - Gráficos de padronização da técnica de MLPA
41
Figura 12 - Gráfico de validação da MLPA com controles positivos do kit P245-A2
42
Figura 13 - Gráfico de validação da MLPA com os controles internos
43
Figura 14 - Deleção da sonda CLPTM1L na região da síndrome Cri du Chat
44
Figura 15 - Ideograma do cromossoma 5
46
Figura 16 - Gráficos para confirmação da deleção do indivíduo 2761
46
Figura 17 - aCGH para confirmação da deleção do indivíduo 2761
47
Figura 18 - Representação esquemática do braço curto do cromossoma 5
51
Figura 19 - Imagem do gene CLPTM1L e sonda do kit SALSA MLPA P245-A2
52
IX
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Tarefas de avaliação cognitiva e domínios avaliados
30
Tabela 2 - Tarefas de avaliação neuropsicológica e domínios avaliados
30
Tabela 3 - Descrição do kit SALSA MLPA P245-A2
34
Tabela 4 - Descrição do kit SALSA MLPA P245-B1
38
Tabela 5 - Descrição do kit SALSA MLPA P070-B2
39
Tabela 6 - Descrição das sondas da síndrome Cri du Chat dos kits de MLPA
44
X
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E UNIDADES DE MEDIDA
aCGH
Array-Based Comparative Genomic Hybridization
APA
American Psichiatric Association
CCDC127
Coiled-Coil Domain Containing 127
CID
Classificação Internacional Das Doenças
CLPTM1L
Cleft Lip and Palate Transmembrane Protein 1-Like
COEP
Comitê de Ética em Pesquisa
CRR9
Cisplatin Resistance-Related 9
DAM
Dificuldade de Aprendizagem da Matemática
DD
Fragmentos de Controle de Desnaturação de DNA (MLPA)
DI
Deficiência Intelectual
DSM-IV
Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, 4th
DNA
Desoxyribonucleic Acid (Ácido Desoxirribonucleico)
DNAH5
Dynein, Axonemal, Heavy Chain 5
DQ
Fragmentos de Controle de Quantidade de DNA (MLPA)
EDTA
Ácido Etilenodiaminotetracético
FISH
Fluorescence In Situ Hybridization
FMR1
Fragil X Mental Retardation
GWAS
Genome Wide Association Study
Kb
Kilobases
LGHM
Laboratório de Genética Humana e Médica
Mb
Milhões de Pares De Bases
MLPA
Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification
NCBI
National Center for Biotechnology Information
NSD1
Nuclear receptor binding SET Domain protein 1
ng
Nanograma
NGRL
National Genetics Reference Laboratory
nm
Nanomol
OMIM
Online Mendelian Inheritance in Man
pb
Pares de Base
PCR
Polymerase Chain Reaction
QI
Quociente de Inteligência
qPCR
PCR quantitativa
SEMA5A
Semaphorin-5A
SNP
Single Nucleotide Polymorphisms
SVCF
Síndrome Velocardiofacial
XI
SWB
Síndrome de Williams-Beuren
TCLE
Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
TDE
Teste de Desempenho Escolar
TE
Tris-EDTA
TERT
Telomerase Reverse Transcriptase
UFMG
Universidade Federal de Minas Gerais
λ
Lambda
μL
Microlitros
XII
RESUMO
A dificuldade de aprendizagem da Matemática (DAM) é um transtorno cognitivo que afeta as
habilidades aritméticas em cerca de 7% das crianças em idade escolar. Os impactos
decorrentes do fracasso escolar na Matemática podem repercutir na autoestima, na
empregabilidade e na renda. A DAM pode ser causada por fatores ambientais, como baixo
nível sócio-econômico, má qualidade do ensino, deficiência intelectual, embriopatia fetal
alcoólica, entre outros. Entretanto, há casos nos quais nenhuma outra etiologia ambiental
pode ser identificada. Em função disto, sugere-se etiologia genética, multifatorial e
heterogênea. Uma evidência de heterogeneidade vem do surgimento da DAM como
endofenótipo de várias síndromes de microdeleções, como Síndrome de Velocardiofacial,
Síndrome de Tuner, Síndrome do X frágil, Síndrome de Williams, Síndrome NF1, Síndrome
de Sotos, entre outras. Há poucos estudos investigando a contribuição dessas e outras
síndromes para o fenótipo DAM. Este é um estudo de base populacional, caso-controle, com
o objetivo de averiguar a frequência de microdeleções/microduplicações intertisciais em
crianças de idade escolar com DAM. A pesquisa foi previamente aprovada pela
COEP/UFMG. A amostragem foi feita em duas etapas.A primeira, de rastreio, foi feita com o
Teste de Desempenho Escolar (TDE) e teste de transcodificação numérica, aplicados em
grupo na sala de aula. A segunda etapa foi uma testagem neuropsicológica completa. A
amostra foi composta pelos grupos: Controle Normal Testado, (com TDE e toda a testagem
neuropsicológica normal), DAM (TDE<P25 e QI>P15) e Controle Positivo (previamente
diagnosticados com alguma das síndromes detectadas pelo kit de MLPA usado, mas não
submetidos a testagem neuropsicológica). A extração do DNA foi realizada a partir de
sangue periférico ou saliva, no Laboratório de Genética Humana e Médica da UFMG.Todas
as crianças foram genotipadas com o kit SALSA MLPA P245-A2. Uma criança, cujos
resultados foram alterados com este kit, foi também testada com os kit SALSA MLPA P070
e SALSA MLPA P245-B1 e pela técnica de hibridização genômica comparativa baseada em
microarranjos (aCGH) com um chip de 60K. Não foram identificadas alterações entre os 90
controles normais testados. Entre os 90 indivíduos com DAM, foi detectada uma
microdeleção do cromossoma 5p, detectada pela sonda CLPTM1L. Uma outra sonda do
cromossoma 5 presente no kit SALSA MLPA P245-A2 (TERT) assim como os demais
métodos usados para confirmar e/ou avaliar a extensão desta deleção apresentaram
resultados normais. Entretanto, nenhum destes métodos apresenta sondas se sobrepondo
exatamente com a região da sonda CLPTM1L. Consequentemente, pode se tratar de uma
deleção pequena ou de um artefato. Se confirmada, trata-se de uma microdeleção entre 70
bp (o tamanho da sonda usada na MLPA) e 70 kb (a distância entre os fragmentos com sinal
positivo no aCGH). Os resultados relatados aqui, ou seja, uma frequência de 0/90
microdeleções intersticiais entre os indivíduos com DAM(ou 1/90, caso se confirme a
microdeleção em 5p), sugerem que o conjunto de síndromes de microdeleção detectadas
pelo kit SALSA MLPA P245-A2 (incluindo as síndromes Velocardiofacial, de Tuner, de
Williams, da neurofibromatose tipo 1, de Sotos, entre outras) não sejam etiologia frequente
da dificuldade de aprendizagem da Matemática não-sindrômica.
Palavras chave: genética, dificuldade de aprendizagem, dificuldade de aprendizagem da
Matemática, discalculia do desenvolvimento, microdeleção intersticial, MLPA.
XIII
ABSTRACT
Mathematical learning disability (MLD) is a disorder that affects arithmetic cognitive abilities
in about 7% of school-age children. The impacts of failure in mathematics can affect selfesteem, employability and income. The DAM can be caused by environmental factors such
as low social and economical status, poor quality of education, intellectual disabilities, and
fetal alcohol embryopathy, among others. However, there are cases in which no
environmental etiology can be identified. Because of this, a multifactorial and heterogeneous
etiologyhas been suggested. Evidence of heterogeneity comes from the emergence of MLD
as endophenotype of several microdeletion Syndromes, such Velocardiofacial Syndrome,
Tuner Syndrome, Fragile X Syndrome, Williams Syndrome, NF1 Syndrome, Sotos
Syndrome, among others. There are few studies investigating the contribution of these and
other syndromes for MLD phenotype. This study is a population based, case-control, aiming
to ascertain the frequency of interstitial microdeletions/microduplications in school-age
children with MLD. This study was approved by the Ethics in Research Committee of the
Universidade Federal de Minas Gerais. Sampling was done in two stages. The first one was
a school achievement test (TDE) and a numerical transcoding test. The second stage of
sampling was a complete neuropsychological testing. The sample was composed by three
groups: Normal controls (children with both normal school development and
neuropsychological tests), MLD (children with TDE<P25 and IQ>P15) and Positive Control
(children, who have been previously diagnosed with any of the syndromes detected by the kit
used in MLPA. These children were not submitted to neuropsychological tests). DNA
extraction was performed from peripheral blood or saliva. All children were genotyped with
the SALSA MLPA kit P245-A2. One child, whose results with this MLPA kit were abnormal,
was also tested using the kit SALSA MLPA P070, SALSA MLPA P245-B1, and an arraybased comparative genomic hybridization (aCGH), with a 60K chip. No molecular changes
were identified among 90 normal controls tested. Among the 90 individuals with MLD, one
child presented a chromosome 5p microdeletion detected by the probe CLPTM1L. Another
probe mapping to 5p TERT, produced normal results, as well as the kit SALSA MLPA P070,
SALSA MLPA P245-B1, and the 60K aCGH. However, none of these methods provides
probe exactly the same region as SALSA MLPA kit P245-A2. Therefore, the deletion
detected by CLPTM1L probe may be a small deletion or an artifact of the technique. If
confirmed, this microdeletion pans less than 70 kb according to aCGH results. The results
reported here, a frequency of 0/90 interstitial microdeletions among individuals with MLD (or
1/90, considering the putative chromosome 5p microdeletion), suggest that the group of
interstitial microdeletion syndromes detected by SALSA MLPA kit P245-A2 (which includes
Velocardiofacial Syndrome, Tuner Syndrome, Williams Syndrome, NF1 Syndrome, Sotos
Syndrome, among others) are not common etiologies of the non-syndromic MLD.
Key words: genetics, learning disability, Math learning disability, developmental dyscalculia,
interstitial microdeletion, MLPA.
14
1
INTRODUÇÃO
1.1
A dificuldade de aprendizagem da matemática
As dificuldades de aprendizagem afetam cerca de 10% da população e possuem um
papel fundamental nos resultados dos processos educacionais (BUTTERWORTH & KOVAS,
2013). Essa manifestação pode ser definida como “uma desordem em um ou mais processo
psicológicos básicos envolvidos na compreensão ou no uso da linguagem, falada ou escrita,
que pode manifestar-se em uma habilidade incompleta para ouvir, pensar, falar, ler,
escrever, soletrar, ou fazer cálculos matemáticos” (FEDERAL REGISTER US, 1999).
Dentre as desordens de aprendizagem mais comuns, está a dificuldade de
aprendizagem na matemática (DAM), com uma frequência que varia de 3,5 a 6,5 % entre as
crianças em idade escolar (BADIAN, 1983; SHALEV & GROSS-TSUR, 2001; KOUMOULA
et al., 2004).
Apesar das divergências quanto a sua definição, de acordo com o Diagnostic and
Statistical Manual of Mental Disorders, 4th Edition (DSM-IV, APA; 1994), a DAM é definida
pela diferença entre o resultado dos testes de desempenho na Matemática e o desempenho
esperado baseado na idade, inteligência e anos de escolarização. Entretanto, devem-se
utilizar testes padronizados para a população em estudo, pois através dessa avaliação, é
possível observar se o aluno está abaixo de um ponto de corte em relação a seus pares.
A DAM pode ocorrer em função de diversos fatores, como carências nutricionais ou
socioeconômicas de maneira geral, baixa qualidade do ensino, exposição a agentes
teratogênicos, como o álcool, déficits sensório-motor, prematuridade e gemelaridade.
Entretanto, há indivíduos com DAM nos quais os sintomas não podem ser atribuídos a
quaisquer destes fatores (SHALEV & GROSS-TSUR, 2001; BUTTERWORTH, 2005). Estes
indivíduos apresentam múltiplos déficits cognitivos, afetando as funções necessárias à
aquisição da Matemática (déficit de senso numérico, estimação de magnitude simbólica e
não simbólica, subtizing, orientação especial etc). Por esses motivos essa desordem é
classificada, por diversos autores, como um transtorno de aprendizagem heterogêneo
(GEARY, 1993; MAZZOCO & MYERS, 2003; BUTTERWORTH, 2005; RUBINSTEN &
HENIK, 2009).
Considerando a heterogeneidade etiológica da DAM e sua natureza multifatorial, foi
proposta a existência de substratos neurais distintos responsáveis pelos processamentos
dos números. Dessa forma, alterações em uma ou mais redes neurais podem contribuir para
os diferentes fenótipos de déficits cognitivos (RUBINSTEN & HENIK, 2009).
Diversos estudos sobre o desenvolvimento cognitivo mostraram que essas crianças
poderiam deixar de atingir padrões aceitáveis em importantes áreas do currículo, como a
15
alfabetização e aritmética (BUTTERWORTH, 2005). O fracasso escolar na Matemática pode
gerar perda da autoestima, afetar na empregabilidade e na renda do indivíduo (JORDAN &
LEVINE, 2009).
1.1.1 Modelos neuro-cognitivos da DAM
Com o objetivo de explicar os mecanismos de cognição relacionados ao aprendizado
da Matemática, foram propostos os modelos neuro-cognitivos, Esses modelos são
importantes
também
porque
permitem
construir
uma
ponte
entre
o
nível
genético/neurobiológico e a expressão comportamental (HAASE, WOOD & WILMES, 2010).
O Modelo do Código Triplo, desenvolvido por Dehaene (1992), é considerado o mais
influente e validado para a compreensão da cognição matemática (DEHAENE & COHEN,
1995). Esse modelo prevê a existência de três sistemas interligados de representação
mental numérica: duas formas de representação simbólica – a representação numérica
visual arábica (ex: 3) e a representação numérica verbal (ex: três) e uma representação
analógica, aproximativa e não simbólica (ex: •••), conforme demonstrado na figura 1.
Figura 1 - Modelo neurocognitivo do Código Triplo
CATEGORIAS DE REPRESENTAÇÃO MENTAL
CÓDIGO
VERBAL
CÓDIGO DE
MAGNITUDE
TRÊS
•••
CÓDIGO
VISUAL-ARÁBICO
3
Legenda - Modelo neurocognitivo do código triplo, com os três sistemas de representação
mental numérica interligados: duas formas de representação simbólica – a representação
numérica visual arábica e a representação numérica verbal e uma representação analógica não
simbólica
Fonte: adaptado de Dehaene, 1992.
16
Outro modelo é a Hipótese de Genes Generalistas, que pressupõe que o conjunto
dos traços cognitivos que fazem parte do fenótipo DAM seja poligênico. Neste caso, a
maioria dos genes seria expressa por toda a extensão cerebral e não apenas em uma região
específica. Além disso, esses genes poderiam ser modulados por mecanismos como a
pleiotropia e epistasia (KOVAS & PLOMIM, 2006) (Figura 2).
Um modelo etiológico geral interessante foi proposto recentemente por Butterworth &
Kovas (2013). Este modelo busca integrar os níveis genéticos, neurais, cognitivo, e
comportamental. Nesta rede de interação, pode haver diversos tipos de relações entre os
níveis. Assim, um processo cognitivo de domínio geral e um processo cognitivo de núcleo
específico podem ter efeitos sobre mais de um teste comportamental, e o desempenho no
teste comportamental pode ser afetado por mais de um processo cognitivo. Além disso, um
processo cognitivo pode depender do outro (por exemplo, a memória na atenção), e um
comportamento pode causar efeito em outro (por exemplo, uma deficiência na interpretação
da leitura pode prejudicar a resolução de problemas matemáticos) (Figura 3).
A hipótese de um componente genético tem motivado uma séria de estudos
investigando as bases genéticas da DAM.
Figura 2 - Hipótese dos genes generalistas
Legenda - Contraste das três hipóteses dos mecanismos de efeitos de um único gene no
cérebro, associado a diversos processos cognitivos (pleiotropia). Esta imagem pode ser
estendida através da substituição do único gene por múltiplos genes, para ilustrar o efeito
poligênico.
Fonte – adaptado de Kovas & Plomim, 2006
17
Figura 3 - Redes de interação
Legenda – Modelo esquemático das relações entre os níveis de explicação (genético, neural,
cognitivo e comportamental) seguindo a rede de modelo causal.
Fonte: Adaptado de Butterworth & Kovas, 2013
1.1.2 Evidências para um componente genético
Uma das principais abordagens utilizadas para a investigação de fenótipos
complexos quando se desconhece a etiologia, é o estudo de agregação familiar (WILLCUTT
et al., 2010). A agregação familiar pode surgir devido ao compartilhamento de genes e de
fatores ambientais entre membros da família (FEITOSA & KRIEGER, 2002). Por exemplo,
através da estimativa do risco relativo, lambda (λ), é possível relacionar a frequência de
afetados nas famílias com o grau de parentesco e comparar a frequência do fenótipo na
população em geral. Quanto maior for o valor de λ, maior é a agregação familiar, sugerindo
um componente genético (BURTON, TOBIN & HOPPER, 2005). Agregação familiar tem sido
descrita para a DAM em diversas populações e condições socioeconômicas, o que sugere
um componente genético (BADIAN, 1983; GROSS-TSUR et al., 1996; SHALEV, 2000;
BUTTERWORTH, 2005; MIRANDA, 2011).
18
Outra abordagem utilizada são os estudos com pares de gêmeos monozigóticos e
dizigóticos. Esses estudos permitem separar fatores genéticos e ambientais responsáveis
por doenças em humanos. Através da comparação de gêmeos monozigóticos criados em
um mesmo ambiente ou em ambiente diferente é possível avaliar o efeito ambiental. Por
outro lado, a comparação da frequência do fenótipo entre gêmeos monozigóticos e
dizigóticos permite estimar a contribuição genética para o fenótipo (WILLCUTT et al., 2010).
Os estudos de gêmeos com DAM mostraram haver tanto influência genética quanto
ambiental, levando a proposição de um modelo de herança multifatorial (ALARCON et al.,
1997; RUBINSTEN & HENIK, 2009; KOVAS et al., 2007).
1.1.3 A DAM em síndromes genéticas
A compreensão dos mecanismos cognitivos subjacentes, que levam à DAM pode ser
reforçada pelo estudo de síndromes genéticas e/ou ambientais associadas a um
desempenho ruim em Matemática, tais como, a Síndrome Fetal Alcoólica, Síndrome do Xfrágil, Síndrome de Turner, a Neurofibromatose Tipo 1, Síndrome de Sotos, Síndrome de
Williams-Beuren (SWB),
Síndrome do Velocardiofacial (SVCF), Síndrome de Prader-
Willi/Angelman, Síndrome de Gerstmann (KOPERA-FRYE, DEHAENE & STREISSGUTH,
1996; SOTOS, 1997; MAZZOCCO, 2001; MURPHY et al., 2006; PATERSON et al., 2006;
SEMENZA et al., 2008; DeSMEDT et al., 2009; RUSCONI et al., 2009).
A síndrome fetal alcoólica é resultante do uso do álcool durante a gravidez. A
exposição do feto ao álcool durante o período pré-natal pode comprometer o
desenvolvimento cerebral e desencadear prejuízos nas habilidades numéricas, o que gera
atraso na aprendizagem da Matemática, além de problemas comportamentais (KOPERAFRYE, DEHAENE & STREISSGUTH, 1996; KODITUWAKKU, 2010).
Síndrome de Sotos pode ser causada por uma mutação de ponto ou deleção no
gene NSD1 localizado na região 5q35. É caracterizada, dentre outros fatores, pelo
crescimento excessivo durante a infância, macrocefalia e pode apresentar diferentes graus
de dificuldade de aprendizagem. Além disso, podem ser observados atrasos no
desenvolvimento cognitivo e motor, mais especificamente déficits na linguagem e
Matemática e também problemas de coordenação motora visual (SOTOS, 1997; BAUJAT &
CORMIER-DAIRE, 2007).
Síndrome do X frágil é conhecida como a mais comum causa hereditária de retardo
mental e dificuldade de aprendizagem ocorrendo em aproximadamente 1:4.000 nascidovivos. É caracterizada pela mutação do gene FMR1, localizado no cromossoma X e
mulheres portadoras dessa síndrome apresentam maior dificuldade de aprendizagem na
Matemática, quando comparada à leitura e escrita. Além disso, apresentam um
19
desempenho fraco em tarefas de rotação visual mental, mas não em todas as áreas de
desempenho de habilidades visos-espaciais (MAZZOCCO, 2001; MURPHY et al., 2006;
MURPHY & MAZZOCCO, 2008)
A Síndrome de Turner é causada pela perda total ou parcial de um dos
cromossomas X e ocorre em aproximadamente 1:1900 mulheres nascidas vivas. Embora
tenham inteligência normal, os indivíduos tendem a apresentar desempenho relativamente
mais baixo na Matemática, além disso, podem apresentar déficit de atenção e viso-espacial
(MAZZOCCO, 2001; MURPHY et al., 2006; MURPHY & MAZZOCCO, 2008).
A Neurofibromatose tipo 1 (NF1) é causada por uma mutação de um único gene no
cromossoma 17 e pode ocorrer esporadicamente ou de forma familiar. É uma das mais
comuns desordens de gene único que conduz a alterações do sistema nervoso central. A
prevalência da NF1 é de aproximadamente 1:4.000 nascido-vivos e a dificuldade de
aprendizagem é relatada em cerca de 30% a 56% dos indivíduos afetados. A NF1 tem sido
descrita como uma desordem não verbal com base nas dificuldades visos-espaciais e visomotoras. São relatados déficits na Matemática, escrita e linguagem (MAZZOCCO et al.,
1995; MAZZOCCO, 2001).
A SWB é causada por uma microdeleção em 7q11.23, uma região contendo
aproximadamente 28 genes. Trata-se de uma doença genética rara, que ocorre em
aproximadamente 1:10.000 nascido-vivos (STRØMME, BJØRNSTAD & RAMSTAD, 2002).
Suas características clínicas incluem várias anormalidades físicas, acompanhadas de DI
leve a moderada e um perfil de personalidade específica. Os indivíduos afetados mantêm
preservadas as habilidades de linguagem, apesar do déficit no processamento numérico e
viso-espacial (PATERSON et al., 2006; O’HEARN & LUNA, 2009).
A SVCF resulta de uma microdeleção na região 22q11.2. É considerada a mais
comum síndrome de microdeleção com uma prevalência de aproximadamente 1:6.000
nascido-vivos (DeSMEDT et al., 2009). Os indivíduos afetados frequentemente apresentam
dificuldade de aprendizagem, sendo relatado o desempenho melhor na leitura e escrita do
que na aritmética (WANG et al., 2000). Além disso, podem apresentar deficiência na
representação de magnitude (DeSMEDT et al., 2007)
As síndromes de Prader-Willi e Angelman podem ser causadas pela mesma deleção
na região 15q11-q13. Os efeitos são dependentes da origem parental do cromossoma
deletado. Na Síndrome de Prader-Willi, a grande maioria dos casos é devida à deleção no
cromossoma de origem paterna. Na Síndrome de Angelman, a etiologia é mais complexa,
podendo envolver deleção do cromossoma de origem materna (70-75% dos casos),
dissomia uniparental materna do cromossoma 15 (20-25%), ou um defeito no centro de
impressão genômica (2%) (BUTLER E THOMPSON, 2000). Ela tem uma prevalência
estimada em cerca de 1:8000-1:16,000 nascido-vivos. Todos os pacientes sofrem algum
20
grau de comprometimento intelectual. Há relatos de dificuldades desproporcionais com
tarefas matemáticas (BERTELLA et al. 2005; SEMENZA et al., 2008).
A Síndrome de Gerstmann é um transtorno do desenvolvimento ou adquirido,
causado pela lesão do giro angular esquerdo. Os indivíduos afetados apresentam déficits
em quatro domínios funcionais distintos: cálculo, escrita, agnosia digital e orientação
esquerdo-direita (RUSCONI et al., 2009).
Considerando o fato de que a dificuldade da aprendizagem da Matemática faz parte
do fenótipo cognitivo de diversas doenças genéticas, surgiram estudos com o objetivo de
investigar as bases moleculares da DAM.
1.1.4 Estudos moleculares
Compreender a etiologia da habilidade e da dificuldade da Matemática se pode
revelar um passo essencial na luta contra o fracasso matemático, e, além disso, fornecer
novos insights sobre o funcionamento do cérebro humano (DOCHERTY et al., 2009).
O único estudo recente de associação do genoma completo (genome wide
association study, GWAS) desenvolvido até o momento para habilidades e dificuldades
matemáticas, detectou 10 polimorfismos de nucleotídeos únicos (single nucleotide
polymorphism; SNPs) significativamente associados com o desempenho na Matemática em
uma amostra de 2356 pares de gêmeos. Esses SNPs, quando combinados, foram
responsáveis por 2,9% da variância fenotípica, sugerindo que as influências genéticas para
as habilidades e dificuldades na Matemática sejam causadas por múltiplos loci de
características quantitativas de pequenos efeitos através de um espectro de habilidades
(DOCHERTY et al., 2010). Quatro dos dez SNPs de maior significância estatística,
encontrados nesse estudo, foram localizados nos genes DNAH5 (dynein, axonemal, heavy
chain 5), NRCAM (neuronal cell adhesion molecule), MMP7 (matrix metaloproteinases) e
GRIK1 (receptor de glutamate ionotropic kainate 1). Estes genes se expressam no período
do desenvolvimento e atuam nos processos de reparo de tecidos, distribuição celular e na
formação das estruturas do sistema nervoso. Desse modo, podem contribuir como genes
candidatos para as habilidades e dificuldades matemáticas. No entanto, seria necessário
para confirmar estes achados, o sequenciamento das regiões exônicas, intrônicas, dos sítios
de splicing, elementos regulatórios e sítios de ligação de moléculas de interesse, na busca
de variantes causais, e estudos de expressão em nível de RNA e proteína.
Dessa forma, vemos a necessidade de novos estudos a fim de identificar os genes
ou variações genômicas envolvidas na DAM.
21
1.2
Estratégia
de
investigação
das
bases
genético-moleculares
em
desenvolvimento pelo grupo de pesquisa
Com o objetivo de investigar as bases moleculares da DAM estão sendo
desenvolvidos alguns trabalhos pelo nosso grupo de pesquisa.
Vianna (2011) avaliou a contribuição das microdeleções/microduplicações em
22q11.2 para o fenótipo DAM. Foram genotipadas, com a técnica de Amplificação de
Múltiplas Sondas Dependente de Ligação (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification;
MLPA) 82 crianças com DAM e 130 controles normais, testados, pareados por sexo, idade e
turma, da população escolar de Belo Horizonte. Foi observada uma frequência de
microdeleções de 1:82 indivíduos com DAM/DAME sugerindo a SD22q11.2 como a etiologia
genética mais comum identificada até o momento para dificuldade de aprendizado da
Matemática.
Miranda (2011), com o objetivo de investigar as bases genéticas da DAM, avaliou a
história familiar de 34 crianças com DAM e 24 controles normais da amostra referida no
parágrafo anterior. Foi encontrado agregação familiar e alguns heredogramas foram
compatíveis com herança autossômica dominante com penetrância incompleta, outros com
herança recessiva ligada ao cromossoma X. Em outros, ainda, havia apenas um afetado,
não sendo possível inferir padrão de herança.
Atualmente, está sendo desenvolvido um projeto pela mestranda Aline Aparecida
Martins com o objetivo de analisar a frequência de pré-mutação e mutações completas,
caudadas pela expansão do trinucleotídeo CGG na 5’UTR do gene FMR1 em indivíduos que
apresentam DAM. Serão utilizados três métodos de diagnóstico, que foram selecionados
com o intuito de que, juntos, fossem confiáveis e pouco onerosos e permitissem detectar
mesmo alelos com expansão completa e fora da faixa de amplificação da PCR (Polymerase
Chain Reaction) convencional. O primeiro método é baseado em uma PCR gene-específica,
e permite identificar o alelo normal. O segundo método é uma tri-primer PCR, e permite a
detecção dos alelos expandidos. O terceiro e último método é uma análise de metilação
baseada em real-time PCR através do uso de TaqMan, que permite inferir o padrão
expressão do gene FMR1 e é importante para a confirmação diagnóstica em meninos,
quando as duas PCRs descritas acima não gerarem amplificação.
As evidências apresentadas acima, em conjunto, sugerem que a DAM apresente
uma base genética heterogênea. Neste trabalho, optamos por investigar a contribuição das
síndromes de microdeleções/microduplicações intersticiais para o fenótipo DAM, através da
MLPA.
22
1.3
A técnica de MLPA
A técnica denominada MLPA é um método sensível, econômico, rápido e simples.
Através da MLPA, é possível estudar mais de 50 sequências de ácidos nucléicos em uma
única reação de PCR e assim detectar, simultaneamente, microdeleções e microduplicações
de diversos genes ou mutações de ponto já conhecidas (SCHOUTEN et al., 2002;
SØRENSEN et al., 2008).
A MLPA foi descrita inicialmente por Schouten et al. (2002) e posteriormente
comercializada pela empresa holandesa MRC-Holland. A técnica descrita é constituída por
quatro passos: desnaturação, hibridização do DNA, reação de ligação, amplificação por
PCR. E para interpretação dos resultados ainda são realizadas as etapas de separação dos
produtos por eletroforese capilar e a análise dos dados pro programas específicos
(SCHOUTEN et al., 2002)..
Inicialmente, a amostra de DNA é desnaturada e em seguida hibridizada a uma
mistura de sondas específicas para cada região. Cada sonda é formada por dois
oligonucleotídeos sintéticos, que são contíguos ao se anelarem ao DNA. Esses
oligonucleotídeos são compostos por três regiões: uma que se anela ao segmento de DNA
de interesse, um segmento espaçador, que não possui homologia com o DNA alvo, e uma
cauda de M13 (SCHOUTEN et al., 2002; ROOMS et al., 2005) (Figura 4).
O oligonucleotídeo A tem tamanho variável de 50-60 pb e contém um marcador
fluorescente (para reconhecimento à eletroforese capilar), seguido de uma sequência
homóloga ao primer universal X (correspondendo à região pela qual esses primers
universais serão anelados, posteriormente) (em preto; Figura 4 ), além da sequência de
hibridização homóloga ao DNA alvo (em azul; Figura 4).
O oligonucleotídeo B, com tamanho variável entre 60-450 pb, contém um fragmento
homólogo ao primer universal Y (em cinza, Figura 4), seguido de uma sequência-coringa
(com extensão diferente para cada sonda, o que definirá o tamanho do fragmento final) (em
laranja, Figura 4) e também a sequência de hibridização homóloga ao DNA-alvo (em azul,
Figura 4).
Esses oligonucleotídeos, ao serem submetidos à temperatura de anelamento,
hibridizam-se a sequências complementares no DNA alvo e, em seguida, são unidos por
uma enzima DNA-ligase termoestável, formando um único fragmento (Figura 5)
(SCHOUTEN et al., 2002; ROOMS et al., 2005).
Como resultado da reação de ligação, são obtidos fragmentos únicos, dispostos da
seguinte forma: fluoróforo – região de ligação ao primer universal – sequência complementar
ao DNA alvo – sequência coringa – região de ligação ao primer universal (Figura 6)
(SCHOUTEN et al., 2002; ROOMS et al., 2005).
23
Figura 4 - Constituição dos oligonucleotídeos das sondas da MLPA
Legenda- Oligo A, em verde o marcador fluorescente seguido de uma sequência homóloga ao
primer universal X em preto e de azul a sequência de hibridização homóloga ao DNA alvo;
Oligo B, em cinza o fragmento homólogo ao primer universal Y, seguido de uma sequênciacoringa em laranja, com extensão diferente para cada sonda, e também possui uma sequência
de hibridização homóloga ao DNA alvo em azul
Fonte: Modificado de Willis et al., 2012
Figura 5 - Etapa de anelamento e ligação da MLPA
Legenda: Anelamento dos oligonucleotídeos na sequência de DNA e posterior ligação pela
enzima DNA-ligase dependente de temperatura
Fonte: Modificado de Willis et al., 2012
Figura 6 - Fragmento único resultado da reação de ligação da MLPA
Legenda - Disposição do fragmento único resultado da reação de ligação, intermediada pela
enzima ligase
Fonte: Modificado de Willis et al., 2012
24
Em seguida, inicia-se a fase de amplificação. Nessa etapa, os fragmentos formados
pelas duas sondas, agora unidas, são amplificados por PCR, utilizando-se o par de primers
universais, que se anelam às sequências não homólogas, situadas nas duas extremidades
dos produtos de ligação (Figura 7) (SCHOUTEN et al., 2002; ROOMS et al., 2005).
Ao final da MLPA, os produtos amplificados são separados e visualizados em
eletroforese capilar (SCHOUTEN et al., 2002). A interpretação dos resultados é feita
comparando-se os picos obtidos nos eletroferogramas dos pacientes aos picos dos
controles, usando-se programas específicos para análise de dados de genotipagem ou
planilhas específicas, sendo possível a quantificação relativa ao número de cópias gênicas
(Figura 8) (SCHOUTEN et al., 2002; ROOMS et al., 2005).
Figura 7 - Etapa de amplificação da MLPA
Figura 7 - Resultado da amplificação de diferentes produtos de ligação, através de PCR, com a
utilização de primers universais
Fonte: Modificado de Willis et al., 2012
Figura 8 - Eletroferograma para interpretação dos resultados finais da MLPA
Legenda – Exemplo da imagem dos picos do eletroferograma obtidos para um indivíduo,
produzida com o Software GeneMarker . As setas indicam os picos alterados do individuo
avaliado (em azul) quando comparado à média do pico dos controles (em vermelho).
Fonte: Adaptado de Softgenetics
25
A técnica de MLPA possui algumas vantagens em relação a outras metodologias já
utilizadas para detecção de alterações genômicas. Dentre elas, destacam-se: baixo custo,
alto rendimento, simplicidade e facilidade de operação, rapidez, reprodutibilidade e
sensibilidade. Além disso, o método não requer exame dos pais, pois a detecção de
deleções e duplicações é feita baseada em um sistema de controles internos (SCHOUTEN
et al., 2002; ROOMS et al., 2005).
Diversos estudos de investigação de microdeleções/microduplicações, usando a
técnica de MLPA, tiveram resultados similares àqueles baseados em outros métodos, como
PCR quantitativa (qPCR) ou hibridização genômica comparativa baseada em microarranjos
(array-based comparative genomic hybridization - aCGH) (KOOLEN et al., 2004; LAM et al.,
2006; ROOMS et al., 2006).
Um estudo com MLPA analisando 258 indivíduos com deficiência intelectual, que
apresentavam cariótipo convencional normal, identificou alterações cromossômicas em
5,8% dos casos. Entre esses pacientes, 10 apresentaram as síndromes de deleção 1p36,
deleção 22q11, síndromes de Angelman/Prader-Willi, Miller- Dieker, Smith-Magenis, Sotos e
Williams-Beurens, e outros cinco tinham duplicações. Tais resultados são indicativos de que
a técnica de MLPA quando utilizada para identificação de alterações específicas, pode ser
uma ferramenta importante na investigação diagnóstica inicial (KIRCHHOFF et al., 2006).
Outras técnicas, como o a-CGH, seguramente podem aumentar a detecção de
anomalias, mas devido ao seu alto custo, a técnica de MLPA se apresenta como a melhor
alternativa disponível na triagem de microdeleções/microduplicações (AHN et al., 2007).
1.4
Justificativa e relevância
Classificada por diversos autores como uma síndrome genética (GEARY, 1993;
RUBINSTEN & HENIK, 2009), a DAM é uma desordem que merece atenção, pois afeta
cerca de 7% das crianças e adolescentes em idade escolar (BADIAN, 1983; SHALEV &
GROSS-TSUR, 2001; KOUMOULA et al., 2004). Até o momento, não se sabe ao certo quais
os genes e os mecanismo moleculares envolvidos na etiologia da doença. Compreender a
heterogeneidade genética da DAM é importante para estimar a contribuição dos diversos
fatores de risco. Além disso, os perfis encontrados podem ser úteis no auxílio de equipes
interdisciplinares para delineamento de estratégias de reabilitação dessas crianças e para o
aconselhamento genético.
O diagnóstico etiológico precoce da DAM é importante para fornecer intervenções
eficazes, como programas de reabilitação, e até mesmo para um planejamento mais
adequado
do
processo
educativo.
Além
disso,
permitiria
aos
indivíduos
um
acompanhamento multidisciplinar, que pode proporcionar-lhes um impacto positivo nas
26
habilidades
matemáticas
e
contribuir
para
elevar
a
autoestima
das
crianças
(BUTTERWORTH e YEO, 2004; GERSTEN, JORDAN & FLOJO, 2005).
O método de MLPA tem sido amplamente utilizado em laboratórios de pesquisa e de
diagnóstico, por ser uma técnica de baixo custo, simples, rápida, sensível e de fácil
operação (SHEN, 2009). Além disso, é possível detectar tanto deleções quanto duplicações
de até 50 sequências de DNA em um único ensaio (SCHOUTEN et al., 2002; SØRENSEN
et al., 2008). Sendo assim, a MLPA pode ser considerada a técnica de melhor custobenefício para a identificação de alterações cromossômicas numa triagem inicial, quando
não há uma suspeita clínica específica.
Por se tratar de uma condição frequentemente encontrada na população, alguns
estudos vêm sendo realizados a fim de compreender as bases genéticas da DAM. Há
trabalhos relacionando a associação entre síndromes genéticas e as dificuldades de
aprendizagem (KOPERA-FRYE, DEHAENE & STREISSGUTH, 1996; SOTOS, 1997;
MAZZOCCO, 2001; MURPHY et al., 2006; PATERSON et al., 2006; SEMENZA et al., 2008;
DeSMEDT et al., 2009; RUSCONI et al., 2009). Entretanto, nenhum deles investigou a
frequência das síndromes de microdeleção/microduplicação, que se associam a DAM, entre
indivíduos averiguados com dificuldade de aprendizagem da Matemática.
Os relatos quanto à etiologia indicam que pode haver ao menos duas formas de
DAM, uma associada a síndromes ambientais ou genéticas e outra forma etiológica é
relacionada a mecanismos multifatoriais, havendo interação de pequenos efeitos de
múltiplos genes com fatores ambientais (HAASE et al, 2012).
A principal hipótese desse projeto é de que na amostra de crianças com DAM pode
haver casos causados pelas síndromes mencionadas acima. Neste caso, o transtorno de
aprendizagem da Matemática constitui parte do fenótipo ampliado das síndromes genéticas.
As síndromes de microdeleção/microduplicação intersticial foram selecionadas para análise
porque constituem o grupo das síndromes mais frequentes na população e que apresentam
dificuldades relativamente específicas de aprendizagem da Matemática como parte do
fenótipo
(Velocardiofacial/DiGeorge,
Williams-Beuren,
Prader-Willi/Angelman,
Sotos,
Neurofibromatose tipo 1).
1.5
Objetivos
1.5.1 Objetivo geral
Averiguar, através da MLPA, a frequência de microdeleções/microduplicações
intersticiais em crianças de idade escolar com dificuldade de aprendizagem na Matemática.
27
1.5.2 Objetivos específicos

Padronizar a técnica MLPA;

Validar do kit SALSA MLPA P245-A2;

Genotipar crianças de idade escolar com DAM e controles;

Analisar os resultados através do programa GeneMarker;

Calcular a frequência de microdeleção/microduplicação intersticiais em ambas as
amostras;

Confirmar as microdeleções/microduplicações encontradas.
28
2
MATERIAIS E MÉTODOS
2.1
Aspectos éticos
Este trabalho é parte de dois projetos de pesquisa intitulados: “Discalculia do
Desenvolvimento em crianças de idade escolar: triagem populacional e caracterização de
aspectos cognitivos e genéticos moleculares”, aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa
da UFMG (COEP-MG) através do parecer nº ETIC 42/08 (Anexo I) e “Avaliação de
estratégia de diagnóstico neuropsicológico e genético-molecular dos transtornos do
desenvolvimento cognitivo (retardo mental)”, aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da
UFMG através do Parecer nº ETIC 0091.0.203.000-10. A participação no estudo foi
condicionada à leitura e assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (Anexo
II).
2.2
A amostra
A amostra analisada no presente estudo tem duas origens: parte dela foi averiguada
em um estudo de base populacional e parte de um ambulatório especializado em dificuldade
de aprendizagem da Matemática, conforme descrito abaixo.
2.2.1 Amostra ambulatorial
Ao longo deste estudo, foi criado um ambulatório específico para atendimento de
crianças com dificuldade de aprendizado da Matemática, o Número, na FAFICH/UFMG, sob
supervisão do Prof. Vitor Haase, do Departamento de Psicologia da UFMG. Neste
ambulatório,
são
atendidas
crianças/adolescentes,
encaminhados
por
psicólogos,
psicopedagogos ou professores, com a suspeita específica de dificuldade de aprendizagem
da Matemática. Esta amostra foi submetida ao mesmo conjunto de testes descrito abaixo.
Os critérios de diagnóstico usados também foram similares.
2.2.2 A amostra de base populacional
Trata-se de um estudo epidemiológico, que teve como objetivo identificar as
crianças, que apresentavam dificuldades de aprendizagem na Matemática. A fim de evitar
vieses, foi selecionada uma amostra aleatória da população de crianças matriculadas entre
a 1ª e a 6ª séries (2º ao 7º ano) do ensino fundamental de Belo Horizonte – MG. Esses
dados fizeram parte do trabalho de doutorado da Psicóloga Fernanda de Oliveira Ferreira,
29
defendido junto a Pós-Graduação em Saúde da Criança e do Adolescente, da Faculdade de
Medicina da UFMG, sob orientação do Prof. Dr. Vitor Geraldi Haase, Departamento de
Psicologia, UFMG (FERREIRA, 2010; FERREIRA et al., 2012)
A amostra foi composta por estudantes de dez escolas públicas e duas escolas
particulares de Belo Horizonte e foi coletada em duas etapas: triagem pelo Teste do
Desempenho Escolar (TDE) e avaliação cognitiva e neuropsicológica.
2.2.3 Triagem pelo TDE
Na primeira etapa, as crianças foram avaliadas quanto ao desempenho escolar em
linguagem e aritmética através de dois instrumentos de rastreio: o TDE (STEIN, 1994) e a
tarefa de transcodificação numérica (MOURA, 2010). O TDE é um teste individual de
aplicação coletiva, que compara o desempenho médio dos estudantes por série e idade. O
teste classificou as crianças em três categorias de acordo com o percentil de
aproveitamento (P). Foram elas, inferior (P<25), médio (P25<X<P75%) e superior (>P75)
(STEIN, 1994, p.19). A tarefa de transcodificação numérica tem como objetivo avaliar a
habilidade do aluno em escrever, na forma arábica, o algarismo apresentado oralmente pelo
experimentador.
2.2.4 Testagem neuropsicológica e cognitiva
Nessa etapa, foram avaliados: inteligência, habilidades somatosensoriais como
orientação direito-esquerda e percepção tátil, habilidades viso construtivas e viso espaciais,
memória e funções executivas, conforme descrito na Tabela 1. Além disso, as habilidades
numéricas foram avaliadas por uma bateria experimental (Tabela 2)
Os testes cognitivos e neuropsicológicos foram realizados pelos estudantes da PósGraduação de Neurociências ou da Saúde da Criança e do Adolescente e da Graduação em
Psicologia
da
UFMG,
em
treinamento
no
Laboratório
de
Neuropsicologia
Desenvolvimento da FAFICH-UFMG, sob supervisão do Prof. Vitor Haase.
do
30
Tabela 1 - Tarefas de avaliação cognitiva e domínios avaliados
DOMÍNIO AVALIADO
TESTE
Inteligência
RAVEN
Destreza motora
9-Hole Peg Test
Habilidades somatosensoriais
Gnosias digitais e Orientação direita-esquerda
Habilidades viso construtivas
Figura Complexa de Rey
Memória de curto prazo e
memória de trabalho
Dígitos do WISC-III e Cubos de Corsi
Funções executivas
Fluência verbal, Fluência de desenhos e TMT A e B
Processamento fonológico
Repetição de pseudopalavras, Leitura de
pseudopalavras e Supressão de fonemas
Fonte: Adaptado de Haase et al., 2008; Costa et al., 2011
Tabela 2 - Tarefas de avaliação neuropsicológica e domínios avaliados
DOMÍNIO AVALIADO
TESTE
Tempo de reação
Tempo de reação simples
Senso numérico
Comparação de magnitudes não simbólica, Comparação
de magnitude simbólica e Estimação não simbólica.
Cálculo aproximado
Adição não simbólica e Subtração não simbólica
Fatos aritméticos
Cálculos
Cálculos verbais
Problemas matemáticos
Fonte: adaptado de COSTA et al., 2011
31
2.3
Sistemática de classificação dos pacientes
DAM
O grupo DAM foi constituído pelas crianças, que apresentaram classificação inferior
ao P25 no TDE e superior a P15 no Teste das Matrizes Progressivas Coloridas de Raven e
que, ao final da avaliação cognitiva e neuropsicológica, apresentaram dificuldades de
aprendizagem de Matemática, podendo ser também de Matemática e escrita.
CONTROLE NORMALTESTADO
O grupo controles normais testados foi composto por crianças, que apresentaram um
aproveitamento superior a P25 no subteste de aritmética do TDE e superior a P15 no Teste
das Matrizes Progressivas Coloridas de Raven. Essas crianças não apresentaram
dificuldade de aprendizagem e preencheram os critérios padrões para um bom desempenho
escolar, de acordo com a média esperada para a série escolar e idade nos subtestes de
aritmética do TDE. Para cada criança, que apresentava DAM, foi selecionada uma criança
controle, da mesma série, idade e preferencialmente da mesma sala de aula, sempre que
possível. Essas crianças também foram submetidas à testagem neuropsicológica completa.
CRITÉRIO DE EXCLUSÂO
Os participantes que obtiveram resultado significativamente baixo no Teste das
Matrizes Progressivas Coloridas de Raven (P15) foram classificados com deficiência
intelectual e por esse motivo foram excluídos desta amostra. Estas crianças passaram a
integrar a amostra do projeto de pesquisa “Avaliação de estratégia de diagnóstico
neuropsicológico e genético-molecular dos transtornos do desenvolvimento cognitivo
(retardo mental)”, referido acima. Além disto, receberam o laudo de avaliação
neuropsicológica e foram referenciados a outros profissionais, para investigação ou
assistência, conforme necessário.
CONTROLE POSITIVO DO KIT SALSA MLPA P245-A2
O grupo controle positivo foi composto por cinco pacientes de ambos os sexos
previamente diagnosticados com alguma síndrome genética detectável pelo kit Salsa MLPA
P245-A2. Assim, foram dois pacientes com SWB e a SVCF, um de cada sexo, e um menino
afetado pela síndrome de WARG.
CONTROLE INTERNO DA TÉCNICA DE MLPA
Foram selecionados cinco indivíduos de cada sexo de uma amostra sem alteração
(deleção/duplicação), já disponível no Laboratório de Genética Humana e Médica (LGHM)
32
da UFMG, que constituiu o grupo controle interno exigido para padronização da técnica de
exame molecular utilizada na pesquisa, a MLPA.
Na Figura 9, estão ilustrados os grupos acima descritos e as estratégias de
averiguação utilizadas.
Figura 9 - Estratégias de avaliação utilizadas e grupos de estudo
Legenda - Das 1520 crianças avaliadas na triagem por TDE e teste de transcodificação
numérica foram diagnosticadas 78 crianças com dificuldade de aprendizagem em Matemática
e selecionadas 90 controles com avaliação neuropsicológica normal, pareados por sexo e
idade; e excluídos os indivíduos diagnosticados com Deficiência Intelectual. Para
padronização da técnica e validação do kit P245-A2 foram utilizados cinco controles internos
de cada sexo e cinco controles positivos.
Fonte: Elaborada pela autora
33
2.4
Métodos moleculares
2.4.1 Extração de DNA
Foram coletados 5mL de sangue em tubo com EDTA ou saliva, para os casos em
que as crianças apresentavam resistência à coleta de sangue. A extração de DNA foi
realizada pelo método de precipitação salina (MILLER et al., 1988), método usado
rotineiramente no laboratório, para quaisquer tipos de material biológico.
Os DNA foram quantificados, utilizando-se o espectrômetro NanoDrop® ND-2000
(Thermo Scientific, Wilmington, EUA) sendo que a razão das absorbâncias 260 nm e 280
nm, assim como a razão das absorbâncias 260 nm e 230 nm foram avaliadas a fim de
verificar a qualidade do DNA e garantir que fossem utilizados em uma concentração
uniforme.
2.4.2 A técnica MLPA
Para a padronização da técnica de MLPA, foi utilizado o kit SALSA MLPA P245-A2
Microdeletion Syndromes-1 (MRC HOLLAND, Amsterdã, Holanda), e posteriormente para
detecção de microdeleções/microduplicações intersticiais foi utilizado o mesmo kit. Esse kit
permite o diagnóstico de 21 síndromes de microdeleção, sendo estas as mais comuns em
humanos. A composição do kit, em termos de sondas, posições cromossômicas e doenças
investigadas são apresentadas na Tabela 3.
34
Tabela 3 - Descrição do kit SALSA MLPA P245-A2
Fonte: MRC - Holland
35
O kit SALSA MLPA P245-A2 é composto por 49 sondas, que geram fragmentos entre
130 a 484 pb. O kit inclui ainda dez fragmentos-controle, com produtos de amplificação
menores do que 120 pb: quatro fragmentos específicos para a análise da quantidade de
DNA (DQ) com 64, 70, 76 e 82 pb; três para controle de desnaturação de DNA (DD) com 88,
92 e 96 pb, um fragmento específico para o cromossoma X com 100 pb e dois fragmentos
específicos para o cromossoma Y, com 105 e 118 pb (MRC Holland b. v., Amsterdã,
Holanda).
O protocolo utilizado encontra-se em conformidade ao descrito por Schouten et al.,
2002, com mínimas modificações.
As reações da MLPA foram realizadas no termociclador (Applied Biosystems – Veriti
96-Well Thermal Cycler) e realizadas em quatro passos: desnaturação e hibridização do
DNA, reação de ligação, amplificação por PCR.
DESNATURAÇÃO E HIBRIDIZAÇÃO
Na desnaturação e hibridização cada amostra de DNA utilizada foi diluída em TE na
proporção de 120 – 200 ng para 2,5 μL e mantida em termociclador a temperatura de 98°C
por cinco minutos. Posteriormente, as amostras foram resfriadas a 25°C, e foram
acrescentados 0,75 μL de SALSA Probe-mix e 1,5 μL de MLPA buffer. Em seguida, foram
mantidas a 95ºC por um minuto e incubada a 60°C durante 16-20 horas.
LIGAÇÃO
Após a hibridização, foi realizada a etapa de ligação. A princípio foi preparado o Mix
Ligase com 1,5 μL de Ligase-65 buffer A, 1,5 μL Ligase-65 buffer B, 12,5 μL de água Milli-Q
e por último 0,5 μL da enzima Ligase-65. Logo após, a temperatura do termociclador foi
reduzida a 54°C, e acrescentados 16 μL de Mix Ligase-65 a cada amostra. Em seguida, a
mistura foi incubada a uma temperatura de 54°C por 15 min e a 98°C por 5 min.
PCR
E finalmente, em um novo tubo, foi preparado o Mix de PCR com 1,0 μL SALSA PCR
primer, 0,25 μL de SALSA DNA Polymerase e 3,75 μL de água Milli-Q e em seguida, foram
adicionados 5 μL dessa solução em cada amostra no termociclador. Por fim, foi iniciada a
reação de PCR segundo o protocolo descrito na Figura 10.
36
Figura 10 - Ciclo utilizado na MLPA para amplificação dos fragmentos
Fonte: Produzida pela autora
2.4.3 Analise dos resultados
As amostras foram genotipadas pela MLPA, para detecção de possíveis
microdeleções/microduplicações intersticiais, conforme a técnica descrita e posterior
padronização. Nesta etapa, também foram utilizados os controles internos, como recomenda
o fabricante.
Os produtos amplificados na MLPA foram separados e visualizados em aparelho de
eletroforese capilar ABI 3130 ou ABI 3137 (Applied Biosystems-Applera Corporation,
Estados Unidos). Foi adicionado 0,5 µL do padrão de peso molecular ROX 500 (ABI 3130)
ou LIZ 500 (ABI 3137) e 8,5 µL de Formamida Hi-Di (Applied Biosystems-Applera
Corporation, Estados Unidos) para 1,0 µL dos produtos amplificados. Essa mistura foi
submetida a choque térmico a 95oC por 3 min e resfriada rapidamente a 4oC antes da
eletroforese capilar.
A interpretação dos perfis gerados foi feita com o software GeneMarker V2 2.0
(Softgenetics, LLC, EUA). Os dados foram normalizados dividindo-se o valor da altura do
pico de cada sonda pela soma dos picos de todas as sondas presentes em cada amostra.
Esta etapa é denominada de normalização intra-amostral. Em seguida, o valor prénormalizado é dividido pela média da altura do pico da sonda correspondente nas amostras
controles. Esta segunda etapa é denominada de normalização inter-amostral. Para valores
de picos entre 0,7 e 1,3 foram considerados normais. Valores superiores a 1,3 foram
considerados indicativos de microduplicação cromossômica nas regiões cobertas pelas
sondas e valores inferiores a 0,7 foram considerados indicativos de microdeleção.
37
2.5
Confirmação dos resultados
De acordo com o fabricante, para confirmação dos resultados é indicado utilizar outro
kit de MLPA confirmatório ou outra técnica de biologia molecular. Sendo assim, para a
confirmação, foi usado a versão atualizada do mesmo kit, o kit SALSA MLPA P245-B1
MICRODELETION SYNDROMES-1 (Tabela 4) e também o kit SALSA MLPA P070-B2
HUMAN TELOMERE-5 (MRC – Holland, Amsterdã, Holanda), que contém uma sonda para
cada região subtelomérica dos cromossomas autossômicos 1 ao 22, além das regiões
pseudo-autossômicas dos cromossomas X e Y (Tabela 5).
Outro método utilizado para confirmação foi o aCGH. Essa técnica foi realizada pelo
Centro de Estudos do Genoma Humano, no Instituto de Biociências – Universidade de São
Paulo, utilizando a plataforma Human Genome CGH Microarray 60K (Agilent Technologies,
Santa Clara – CA, EUA), contendo cerca de 60.000 oligonucleotídeos distribuídos pelo
genoma humano).
38
Tabela 4 - Descrição do kit SALSA MLPA P245-B1
Fonte: MRC – Holland
39
Tabela 5 - Descrição do kit SALSA MLPA P070-B2
Fonte: MRC – Holland
40
3
RESULTADOS
3.1
Padronização da MLPA
Em virtude da dificuldade em encontrar-se na literatura dados, que pudessem
fornecer informações para a otimização da técnica, foi optado pelo uso do protocolo
elaborado pelo fabricante para em seguida testar algumas modificações.
3.1.1 Avaliação do desempenho da técnica
Inicialmente, foram avaliados a qualidade da extração, o tempo e condições de
armazenamento das amostras e a quantidade de DNA utilizado. Para verificar a qualidade
da extração do DNA, as amostras foram avaliadas por espectrofotometria. Os DNAs que
não apresentaram níveis de pureza entre 1,8 a 2,0, para as duas razões 260/280 e 260/230
nm, foram descartados da amostra para garantir a confiabilidade dos resultados.
Considerando que as coletas do material genético foram realizadas desde 2008 até o
ano de 2012, seria necessário verificar se o tempo e a qualidade do armazenamento
poderiam interferir no resultado. Entretanto, na dissertação de Mestrando da Bióloga
Gabrielle Souza Vianna (VIANNA, 2011) esses pontos foram avaliados nessa mesma
amostra apresentando resultados satisfatórios.
Em relação à quantidade de DNA utilizado, o fabricante recomenda uma
concentração entre 20 a 500 ng. Para o kit P245-A2, não houve diferença entre os
resultados de concentrações no intervalo de 75 e 150 ng. Sendo assim, essa faixa de
concentração de DNA foi adotada.
3.1.2
Redução do protocolo original
O produto final da reação de MLPA corresponde a um volume de 50 μL, mas apenas
1µL são utilizados na eletroforese capilar. Apesar de a técnica ter um custo relativamente
baixo por paciente, quando comparada a outros métodos, seria ideal reduzir os volumes
preconizados no protocolo recomendado pelo fabricante, com o objetivo de aumentar o
rendimento do kit e diminuir o volume descartado.
Para padronizar o uso das reações em 25 µL, foram feitos experimentos,
comparando-se esta quantidade de reagentes com a quantidade recomendada pelo
fabricante (50 µL). O protocolo com 25 µL foi denominado P½, e o protocolo recomendado
pelo fabricante de PO, para protocolo original. Foram utilizadas, como parâmetro, duas
amostras controles positivos de ambos os sexos e três controles negativos de cada sexo
41
para cada experimento. Em seguida, esses dados foram comparados. Não foram
observadas diferenças entre os protocolos P½ e o PO (Figura. 11).
Figura 11 - Gráficos de padronização da técnica de MLPA
Legenda - A Comparação dos controles negativos (3527, 4850, 4851) e controle positivo (5399)
do sexo feminino. B Comparação dos controles negativos (3584, 4006, 4018) e controle
positivo (5517) do sexo masculino. A primeira e a segunda linha (tanto para a parte A quanto
para a parte B mostram o resultado para o protocolo reduzido à metade (P½) e o controle
original (PO), respectivamente.
Fonte: Dados gerados pela autora através do software GeneMarker
3.1.3
Validação do kit P245-A2
De acordo com as recomendações do fabricante, qualquer kit MLPA a ser usado
deve ser inicialmente validado, testando-se indivíduos apresentando qualquer alteração
detectada pelo kit e controles sem alterações (microdeleções/microduplicações).
Dessa forma, foram selecionados controles com alterações (controles positivos)
identificadas por outros métodos moleculares, como a Hibridização In Situ com
42
Fluorescência (fluorescent in situ hydridisation FISH), qPCR ou microssatélites. São eles,
dois pacientes com SVCF, dois pacientes com SWB e um paciente com síndrome de
WARG. Na Figura 12, é mostrado o gráfico de resultado final gerado pelo software
GeneMarker, mostrando os resultados dos controles positivos da MLPA. É possível observar
que as anormalidades antes detectadas por outros métodos foram confirmadas pela MLPA.
Além dos controles positivos, é igualmente importante a escolha de amostras de
controles internos de reação, que serão utilizadas como referência para comparar o
tamanho dos picos e estimar o número de cópias nos indivíduos teste. Essas amostras de
DNA foram obtidas de indivíduos normais não testados já disponíveis no LGHM (controles
internos de reação).
Considerando-se isso, foram selecionados cinco controles internos de cada sexo,
cujo padrão de amplificação é mostrado abaixo (Figura 13). Essa seleção foi feita também,
com o objetivo de padronizar um pequeno grupo de controles internos, que posteriormente
serão utilizados ao longo de todo o estudo.
A partir dos resultados obtidos com a padronização do kit reduzido à metade e da
sua validação, foi possível demonstrar que a redução dos reagentes não altera os
resultados da MLPA com este kit (Figura 12 e 13). Dessa forma, deu-se continuidade ao
estudo.
Figura 12 - Gráfico de validação da MLPA com controles positivos do kit P245-A2
Legenda - Gráfico de resultado final, gerado com o software GeneMarker, mostrando os
resultados dos controles positivos usados para validação da técnica MLPA com o kit P245-A2.
Estes controles positivos são indivíduos afetados por algumas das síndromes detectadas por
este kit,previamente diagnosticados por outros métodos. As amostras 5511 e 5604 apresentam
deleção das 3 sondas de SVCF; 5501, a deleção de uma sonda da síndrome de WARG; e, 5399 e
5517, deleção das 3 sondas da SWB.
Fonte: Dados gerados pela autora através do software GeneMarker
43
Figura 13 - Gráfico de validação da MLPA com os controles internos
Legenda – Em A, estão apresentados os controles do sexo masculino e em B, do sexo
feminino.
Fonte: Dados gerados pela autora através do software GeneMarker
3.2
Genotipagem por MLPA
Foram genotipados 180 indivíduos através da técnica MLPA. Nos indivíduos do
grupo controle normal testado neuropsicologicamente, não foram observadas diferenças
entre as amplificações das 49 regiões analisadas, ou seja, nenhum deles apresentou
evidência de microdeleção ou microduplicação. No grupo DAM, das 90 crianças
investigadas, foi encontrada alteração em um indivíduo (1,1%).
Esta alteração é uma microdeleção e foi detectada com a sonda CRR9, que identifica
o gene CRR9, na região da Síndrome de Cri du Chat (Figura 14). Trata-se de uma
microdeleção heterozigótica, pois o valor de razão do pico é próximo a 0,5. A presença
desta microdeleção foi confirmada por repetição desta MLPA.
O gene CRR9 é mais conhecido como CLPTM1L, e por esse motivo, a partir de
agora a sonda e gene serão referidos como CLPTM1L.
O kit utilizado possui duas sondas para identificação da Síndrome do Cri du Chat, a
sonda CLPTM1L e a sonda TERT (Tabela 6). Porém, esta última, que mapeia
proximalmente à CLPTM1L, a uma distância de 0,62 Mb, apresentou padrão normal à
MLPA.
44
Figura 14 - Deleção da sonda CLPTM1L na região da síndrome Cri du Chat
Legenda - Deleção da sonda CLPTM1L na região da síndrome Cri du Chat. A) Histograma de
dosagem descriminando as 49 sondas e suas respectivas razões de pico entre a amostra
testada (2761) e a média dos controles internos, onde se observa a redução da razão na sonda
CLPTM1L destacada pela seta vermelha. B) Gráfico de ponto com a disposição das sondas
dentro do intervalo normal, exceto pela sonda CLPTM1L que está circulada de vermelho.
Fonte: Dados gerados pela autora através do software GeneMarker
Tabela 6 - Descrição das sondas da síndrome Cri du Chat dos kits de MLPA
COMPRIMENTO
GENE
KIT
(NT)
POSIÇÃO
DISTÂNCIA DA
CROMOSSÔMICA
PRÓXIMA SONDA
SÍNDROME
337
CCDC127
P070-B2
5p15.33
1Mb
Cri du Chat
437
TERT
P245-A2
5p15.33
0,62 Mb
Cri du Chat
283
CLPTM1L
P245-A2
5p15.33
8Mb
Cri du Chat
283
SEMA5A
P245-B1
5P15.31
---
Cri du Chat
Fonte: adaptado de MRC Holland
45
3.3
Confirmação dos resultados
3.3.1
Técnica MLPA
Na tentativa de confirmar a deleção encontrada no indivíduo 2761, foi realizado um
novo ensaio de MLPA com o kit SALSA MLPA P245-B1 (versão atualizada do SALSA MLPA
P245-A2). Essa nova versão passou a ser comercializada desde 11/2012 e teve alteração
de onze sondas. A sonda CLPTM1L foi retirada e em seu lugar foi inserida a SEMA5A.
Localizada também na região 5p15.33 (Figura 15), a sonda SEMA5A fica aproximadamente
8 Mb distal da sonda CLPTM1L. Sendo assim, foi feita a MLPA com essa nova versão do kit,
a fim de verificar o tamanho mínimo da deleção.
Além disso, foi utilizado um dos kits recomendados pelo fabricante (MRC
HOLLAND), o SALSA MLPA P070-B2, para confirmação de alterações nas sondas da
síndrome Cri du Chat. Esse kit possui uma sonda subtelomérica para a região 5p, CCDC127
(Tabela 4). Como mostrado na Figura 15, a sonda CCDC127 fica localizada na região
5p15.31 proximal a sonda deletada CLPTM1L, a distância aproximada de 1 Mb.
Na Figura 16, são mostrados os resultados da MLPA do indivíduo portador da
microdeleção de CLPTM1L, com os kits SALSA MLPA P245-B1 e P070-B2. Observe que as
sondas presentes em 5p tem resultado normal. Nessa situação, segundo o fabricante é
indicado confirmar o dado por outro método.
3.3.2
Técnica de array-CGH
Outro método utilizado para confirmação foi o a-CGH. Uma amostra do DNA do
indivíduo 2761 foi enviada ao Centro de Estudos do Genoma Humano, no Instituto de
Biociências – Universidade de São Paulo. Foi utilizada a plataforma Human Genome CGH
Microarray 60K que contém cerca de 60.000 oligonucleotídeos distribuídos pelo genoma
humano. A plataforma utilizada não cobre a região exata da sonda CLPTM1L, porém na
Figura 17 é possível observar que os dois oligonucleotídeos, que cercam o gene CLPTM1L,
apresentam padrão normal.
Não foi possível confirmar a deleção da sonda CLPTM1L através das técnicas
utilizadas. No caso, a microdeleção pode ser pequena, entre 0,72 Kb (tamanho da sonda
deletada) e 70 Kb (distância dos oligonucleotídeos com padrão normal no aCGH) e ter
escapado à detecção por estes métodos.
46
Figura 15 - Ideograma do cromossoma 5
Legenda - em A, as regiões do cromossoma 5 e destacado com o retângulo vermelho a região
cromossômica ampliada na Figura B. Em B a posição das sondas CCDC127, TERT, CLPTM1L
e SEMA5A e suas distâncias aproximadas.
Fonte: Produzida pela autora
Figura 16 - Gráficos para confirmação da deleção do indivíduo 2761
Legenda - em A gráfico da MLPA com o kit P245-B1 e sonda SEMA5A, circulada, com padrão
normal; em B gráfico da MLPA com o kit P070-B2 e sonda CCDC127, circulada, com padrão
normal.
Fonte: Dados gerados pela autora através do software GeneMarker
47
Figura 17 - aCGH para confirmação da deleção do indivíduo 2761
Legenda - Imagem do aCGH do indivíduo 2761 com a região próxima ao gene CLPTM1L. As
setas vermelhas indicam os dois oligonucleotídeos, que cercam o gene em estudo, com
distância aproximada de 70 Kb.
Fonte: Adaptado de Human Genome CGH Microarray 60K
48
4
DISCUSSÃO
4.1
Padronização da MLPA
4.1.1 Avaliação do desempenho da técnica
De acordo com o fabricante, a MLPA é mais sensível à contaminantes do que um
simples ensaio de PCR. Dessa forma, para garantir o sucesso da técnica é importante
avaliar entre outros fatores, a qualidade da extração, o tempo e condições de
armazenamento das amostras e a quantidade de DNA utilizado.
Concentrações elevadas de contaminantes, como sal e resíduos da extração do
DNA, e a degradação do material genético devido ao tempo e qualidade de armazenamento,
podem causar o não anelamento de algumas sondas. Esses fatores podem resultar em um
viés de normalização ou de análise e contribuir para resultados falso-positivos. Dessa forma,
o fabricante recomenda que as amostras de DNA sejam avaliadas quanto a sua pureza e
integridade através de espectrofotometria ou por eletroforese em gel.
Em relação à quantidade de DNA utilizada, o fabricante recomenda uma
concentração entre 20 a 500 ng (SCHOUTEN et al., 2002). Esses valores seriam suficientes
para o anelamento das sondas no DNA e a posterior ligação através da enzima ligase.
Como já descrito anteriormente, além dos fragmentos controle de desnaturação de DNA
(DD), existem os fragmentos controle específicos para a quantidade de DNA (DQ). A
inclusão desses fragmentos DQ serve para sinalizar se a quantidade de DNA utilizada está
correta. Quando são usados menos de 20 ng, necessários para gerar resultados confiáveis,
os fragmentos DQ amplificam. Quando a quantidade de DNA está correta, a amplificação
dos quatro fragmentos DQ é quase imperceptível.
A presença de alterações no ensaio pode ser justificada pelas diferentes quantidades
de DNA utilizado. Essa variação pode levar a uma normalização incorreta dos dados e,
portanto, a resultados errôneos. Dessa forma, recomenda-se que, para cada kit seja
estimada a faixa de concentração de DNA em que são produzidas as amplificações mais
satisfatórias, para que a normalização e a análise posterior sejam corretas (MRC Holland b.
v., Amsterdã, Holanda).
4.1.2 Redução do protocolo original
Encontramos apenas dois estudos relatando o uso de quantidades menores de
reagentes na MLPA. Em um estudo realizado por Carvalho (2009), foram testados
protocolos com 1/3 e ½ dos reagentes. Porém, para os dois casos, os resultados não foram
confiáveis. As amostras testadas, controles sem alteração, apresentaram deleções e
duplicações em várias regiões. Tais resultados foram justificados pelo autor em função dos
49
volumes dos reagentes serem pequenos e que poderia haver alguma dificuldade em se
conduzir o experimento ocasionando em resultados falso-positivos.
Outra tentativa, sem sucesso de redução de protocolo, foi realizada por Vianna
(2011). Os testes realizados com a diminuição do volume de todos os reagentes do kit não
foram satisfatórios, porém, foi indicada a redução dos volumes apenas na etapa da PCR.
Isto, do ponto de vista prático, não é uma vantagem real, sendo necessária aquisição de
novos kits para repor os reagentes das etapas de hibridação e ligação.
Como nossos resultados foram consistentes, optamos por usar o kit com o volume
de 25 µL, tomando o cuidado de repetir resultados alterados com o kit em volume normal.
Vale ressaltar, que este é o primeiro trabalho a descrever sucesso na redução do kit de
MLPA.
4.1.3 Validação do kit P245-A2
Além dos cuidados para garantir o sucesso da técnica de MLPA, é importante
considerar a especificidade de cada kit. De acordo com o fabricante, antes de iniciar o uso
de um kit é fundamental a etapa de validação através de controles internos e controles
positivos.
Como a técnica da MLPA se baseia na análise de quantificação relativa à
amplificação das sondas, é necessária uma reação de referência para comparar e estimar
as alterações com relação ao número de cópias. São consideradas reações de referências,
aquelas que as amostras de DNA obtidas correspondem a indivíduos normais (controles
internos). Recomenda-se a utilização de pelo menos três controles por ensaio, a fim de
estimar a reprodutibilidade de cada sonda no experimento.
Além disto, no caso específico do kit SALSA MLPA P245-A2, existem sondas de
controle interno no cromossoma X (em negrito na Tabela 2, acima). Assim, se são testados,
na mesma reação, indivíduos do sexo masculino e feminino, os indivíduos do sexo
masculino, que tem apenas uma cópia do cromossoma X, aparecem como deletados. Em
função disto, para o uso deste kit, cada ensaio deve ser feito apenas com indivíduos de um
sexo e os controles internos devem ser do mesmo sexo.
4.2
Genotipagem por MLPA
Com o kit SALSA MLPA 245-A2 foi possível genotipar todos os indivíduos da
amostra. Apenas um indivíduo, da amostra das crianças com DAM, apresentou uma
microdeleção. A microdeleção detectada com a sonda CLPTM1L está localizada no braço
curto do cromossoma 5, na região da Síndrome do Cri du Chat. Sendo assim, foram
50
avaliadas a correlação dessa região deletada e os endofenótipos da Síndrome. Na Figura
18, estão demarcadas as regiões responsáveis pelos principais endofenótipos, que estão
agrupados na região crítica, a 5p15.2.
A Síndrome do Cri du Chat está associada à haploinsuficiência de múltiplos genes
localizados na região crítica 5p15.2 e também do TERT na região 5p15.33 (OVERHAUSER
et al., 1994; CHURCH et al., 1997; MAINARDI et al, 2001; ZHANG et al., 2003).
Como apresentado nos resultados, a sonda que cobre o gene TERT teve padrão
normal, porém a sonda do gene CLPTM1L foi deletada. Apesar de não sabermos ao certo o
tamanho da deleção, sabemos que a sua localização fica fora do intervalo crítico onde estão
relatadas as principais manifestações fenotípicas da Síndrome, particularmente as regiões
relacionadas à deficiência intelectual. Além disso, há o relado de apenas atraso na fala para
a região deletada, sem complicações maiores como descrito na Figura 18 (OVERHAUSER
et al., 1994; CHURCH et al., 1997; MAINARDI et al, 2001; ZHANG et al., 2003).
O gene CLPTM1L codifica a proteína cleft lip and palate transmembrane protein 1like e recebeu esse nome em função de uma mutação neste gene identificada em uma
família com fissura de lábio e palato (YOSHIURA et al.,1998). Além disto, esse gene se
associa à apoptose induzida pela cisplatina (YAMAMOTO et al., 2001) e está localizado
dentro de um locus de susceptibilidade para o câncer no cromossoma 5, região 5p15.33
(OMIM:612585).
Com um tamanho de 27 Kb, o CLPTM1L possui 17 exons e está a uma distância de
aproximadamente 1,3 Mb do telômero. Na Figura 19, é mostrada a sonda da MLPA
desenhada para esse gene localizada no exon 2 com a cobertura de 70 pb.
Uma vez detectada esta microdeleção, veio a primeira hipótese: se haveria relação
desse gene com a DAM.
Para isso, buscamos na literatura se esta região já havia sido identificada em outros
estudos sobre a DAM. Docherty e colaboradores (2010) detectaram 10 SNPs
significativamente associados com o desempenho na Matemática. Entre os 10 SNPs de
maior significância encontrados nesse estudo, um está localizado na região 5p15.2, dentro
do gene DNAH5. Fora esta evidência, não há registro de associação do gene CLPTM1L ou
de outros genes próximos com a DAM. A distância entre os genes DNAH5 e CLPTM1L é de
cerca de 12 MB, uma distância grande. Portanto, é possível que os dois achados (a possível
deleção de CLPTM1L e o mapeamento por GWAS próximo ao gene DNAH5) não sejam
correlacionados.
51
Figura 18 - Representação esquemática do braço curto do cromossoma 5
Legenda - Representação esquemática do braço curto do cromossoma 5, com a localização
das regiões responsáveis pelas principais características fenotípicas da Síndrome Cri du Chat.
A seta indica a localização aproximada da região deletada no indivíduo 2761.
Fonte: Adaptado de Overhauser et al., 1994; Church et al., 1997; Mainardi et al, 2001; Zhang et
al., 2003
52
Figura 19 - Imagem do gene CLPTM1L e sonda do kit SALSA MLPA P245-A2
Legenda – na parte superior, estão destacados os exons numerados de 1 a 17. Na parte
inferior o exon 2 foi ampliado e a região sombreada em verde é o local, que a sonda CLPTM1L
do kit SALSA MLPA P245-A2 cobre do gene.
Fonte: Adaptado de Genome Browser, NCBI
4.3
Confirmação dos resultados
Em relação a região deletada, surgiu outra hipótese: se existe realmente uma
deleção na região ou trata-se de um artefato.
É importante ressaltar que as sondas de MLPA são sensíveis a pequenas alterações
na sequência de anelamento ao DNA genômico (MRC HOLLAND). Dessa forma, quando há
mudanças nucleotídicas muito próximas, a uma distância de até 10 pares de base, ao sítio
de anelamento ou dentro do mesmo, essas podem inibir ou desestabilizar o anelamento dos
oligonucleotídeos na região. Isso afetaria a posterior ligação dos oligonucleotídeos pela
enzima ligase, não havendo então a amplificação por PCR. Nesses casos, o resultado do
teste seria sugestivo de uma deleção da região estudada, porém, na realidade, se trataria de
um resultado falso-positivo (ROOMS et al., 2004; MONFORT et al., 2006; AHN et al., 2007).
Diante disto, ao buscar informações sobre a sonda investigada, o fabricante informa
que a sonda CLPTM1L possui um SNP próximo ao sítio de ligação, que poderia influenciar o
anelamento da sonda. E, por esse motivo, essa sonda foi substituída na versão atualizada
do kit. Isto sugere que a deleção identificada neste paciente possa ser um artefato.
Entretanto, os resultados obtidos até agora, nos métodos usados para tentar refinar esta
alteração (MLPA com outro kit que cobre 5p e aCGH), permitem descartar grandes deleções
em 5p, mas a hipótese de uma pequena deleção na região coberta pela sonda CLPTM1L
ainda não pode ser completamente descartada.
53
4.4
Contribuição das síndromes de microdeleção para a DAM
Este
é
o
primeiro
estudo
investigando
a
contribuição
das
microdeleções/microduplicações intersticiais para o fenótipo dificuldade de aprendizagem da
Matemática. A justificativa para esse estudo foi o fato de que pacientes com as Síndromes
de Sotos, SWB, SVCF/DiGeorge, NF1, entre outras, apresentarem frequentemente
dificuldade de aprendizagem da Matemática, ou, nos pacientes acometidos por estas
síndromes e que tem deficiência intelectual, um comprometimento maior na aritmética
quando comparada à linguagem. Em muitas destas síndromes, a deficiência intelectual é
frequente. Na verdade, estes pacientes são diagnosticados por apresentarem deficiência
intelectual ou malformações congênitas graves. Como pacientes com dificuldade de
aprendizado isolada não são alvo de investigação molecular, se existem pessoas com estas
microdeleções e dificuldade de aprendizagem (sem DI), estas são subaveriguadas.
Portanto, não se sabe qual o cenário mais provável: 1. A deficiência intelectual
nestas síndromes é a porção mais severa de um espectro de manifestações cognitivas, e a
fração de indivíduos que recebe diagnóstico é uma ponta de iceberg; 2. Estas condições
causam deficiência intelectual na maioria dos casos e casos com manifestações mais
brandas são a exceção. Por outro lado, estas síndromes não formam um grupo homogêneo.
Algumas têm deficiência intelectual mais frequentemente (por exemplo, SWB ou
SVCF/DiGeorge), outras menos (por exemplo, NF1, Síndrome de Sotos). Portanto, ao
iniciarmos o estudo, não podíamos estimar frequências esperadas destas condições entre
as crianças com DAM.
Encontramos um caso de microdeleção na região 5p15.3 entre 90 crianças com
DAM, ou seja, 1,1%. Entretanto, esta deleção pode ser um artefato, o que ainda será alvo
de investigação futura.
Assim, nossos resultados sugerem que, embora a DAM seja descrita em algumas
das Síndromes cobertas pelo kit SALSA MLPA 245-A2, estas entidades aparentemente não
contribuem importantemente para a DAM não sindrômica. Este achado favorece, portanto, o
cenário 2, proposto acima.
54
5.
PERSPECTIVAS
Apesar de não ter sido possível confirmar a microdeleção encontrada pelos métodos
utilizados, não podemos descartar a possibilidade de uma pequena deleção na região
coberta pela sonda CLPTM1L. Portanto, será feita uma PCR quantitativa para averiguar a
existência desta microdeleção na amostra com alteração e nos controles normais.
Além disto, embora tenha sido encontrada apenas uma microdeleção intersticial,
esse resultado aponta para novas investigações quanto às outras regiões não estudadas
desses
indivíduos.
Nesse
caso,
o
projeto
continua,
com
averiguação
de
microdeleções/microduplicações subteloméricas através do kit SALSA MLPA P070 e com o
aCGH.
55
6. CONCLUSÕES
A padronização da MLPA com o protocolo reduzido com metade dos reagentes foi
bem sucedida, tornando a MLPA uma técnica ainda mais econômica. Esse protocolo poderá
ser estendido para os outros kits, desde que seja validado adequadamente, sem esquecer a
confirmação dos casos positivos com o protocolo normal.
Foi possível verificar entre as crianças com DAM, um caso sugestivo de
microdeleção de uma sonda, a CLPTM1L, que mapeia em 5p15.33. Entretanto, esse
indivíduo apresenta um padrão normal para outras sondas do braço curto do cromossoma 5,
tanto proximais quanto distais. Além disto, não é possível ter-se certeza de que se trate de
uma deleção, pois esta sonda pode gerar resultados falso-positivos. Os outros métodos
usados (SALSA MLPA P070-B2, P245-B1 e aCGH) para confirmar esta deleção/avaliar sua
extensão apresentaram resultados normais. Portanto, podemos concluir que, se confirmada,
trata-se de uma microdeleção entre 70 bp (o tamanho da sonda usada na MLPA) e 70 kb ( a
distância entre os fragmentos com sinal positivo no aCGH. Não foi encontrada relação entre
o gene da sonda possivelmente deletada e os demais genes candidatos para a DAM.
Os resultados apresentados aqui, ou seja, uma frequência de 0 (ou 1, se se
confirmar o caso com deleção em 5p15.33) microdeleção intersticial entre 90 indivíduos com
DAM, sugerem que estas condições não sejam uma etiologia frequente da dificuldade de
aprendizagem da Matemática não sindrômica.
56
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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of an analysis protocol, and application in a diagnostic centre. BMC Med Genet, v. 8, p. 9,
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ALARCÓN, M. et al. A twin study of mathematics disability. J Learn Disabil, v. 30, n. 6, p.
617-23, 1997 Nov-Dec 1997.
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BADIAN, N. A.; GHUBLIKIAN, M. The personal-social characteristics of children with poor
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61
ANEXO 1 - APROVAÇÃO PELA COEP/UFMG
62
63
ANEXO 2 - TCLE
Título da Pesquisa:
Discalculia do desenvolvimento em crianças de idades escolar: triagem populacional e
caracterização de aspectos cognitivos e genético-moleculares
Prezado (a) responsável,
Este é um convite para você participar voluntariamente em uma pesquisa que irá avaliar
algumas das habilidades cognitivas de seu filho. Estamos à disposição para esclarecer
quaisquer dúvidas em relação à pesquisa antes e durante a execução da mesma.
Leia as informações abaixo antes de expressar ou não o seu consentimento para
participar da pesquisa.
1. Objetivos do estudo
A pesquisa objetiva avaliar as habilidades matemáticas de seu filho e os fatores que podem
influenciar em seu aprendizado. Acreditamos que esses dados podem contribuir para o
conhecimento do estado atual da aprendizagem da matemática entre as crianças de Belo
Horizonte, e para a obtenção de informações acerca da recorrência familiar das dificuldades
de aprendizagem aritmética. Os resultados do estudo contribuirão para a realização de um
planejamento educacional que favoreça a aprendizagem das crianças com dificuldade de
aprendizagem.
2. Procedimentos da avaliação
Caso você autorize a participação de seu filho na pesquisa, a criança será avaliada quanto
ao seu desempenho escolar, além de realizar testes que investigam funções relacionadas à
aprendizagem como inteligência, atenção, memória,
percepção, destreza motora,
velocidade
planejamento
de
realização
das
tarefas,
linguagem,
e
leitura
em
aproximadamente uma sessão de 1 hora. As tarefas serão propostas procurando-se
promover e manter a motivação da participante. Adicionalmente, acontecerá uma coleta de
sangue simples (10 ml de sangue de uma veia do braço) para realização de análise
genética, com o objetivo de investigar as bases genéticas da discalculia.
64
2.1 Coleta e análise do material genético A coleta de sangue será realizada por
profissional de saúde habilitado e com experiência na coleta de sangue, inclusive de
crianças. O sangue será utilizado para análises genéticas no Laboratório de Genética
Humana e Molecular do ICB-UFMG. As análises genéticas têm o objetivo de verificar se
existe algum padrão de variação nos genes que se associa com dificuldades de
aprendizagem na matemática. O sangue será armazenado em um banco de material
biológico sob a responsabilidade da Profa. Dra. Maria Raquel Santos Carvalho,
regulamentado pelo Conselho de Ética em Pesquisa (COEP) da UFMG e poderá ser
utilizado em outras pesquisas eventualmente aprovadas pela COEP.
3 Realização da Pesquisa
A pesquisa está sendo conduzida pelo Programa de Pós Graduação de Saúde da Criança e
do Adolescente da Faculdade de Medicina da UFMG, pelo Laboratório de Neuropsicologia
do Desenvolvimento da UFMG e pelo Laboratório de Genética Humana e Molecular da
UFMG.
4 Participação voluntária e sem compromisso financeiro
Como sua participação é voluntária, não implica em nenhum compromisso financeiro entre
você e a equipe da UFMG.
5 Liberdade de recusa e de desistência
Você poderá negar o consentimento ou mesmo retirar seu filho em qualquer fase da
pesquisa sem nenhum prejuízo para este. Ele também participa voluntariamente em todas
as etapas da pesquisa, tendo a liberdade de se recusar a participar em qualquer momento.
6 Garantia de sigilo
Os resultados da pesquisa serão utilizados em trabalhos científicos publicados ou
apresentados oralmente em congressos e palestras sem revelar sua identidade e da criança
ou adolescente.
7 Riscos
O risco biológico envolvido é mínimo. A coleta de sangue pode doer um pouco e deixar uma
mancha no local, mas como numa escoriação rotineira, desaparece com o passar do tempo.
Todo o material utilizado para coleta é estéril e descartável, não existindo nenhum risco
de contrair doenças.
65
8 Benefícios em participar da pesquisa
Ao final, você obterá oralmente e por escrito, sob a forma de aconselhamento e de um
relatório, os resultados da análise dos dados de seu filho realizada por profissionais das
áreas da neurologia, genética e psicologia. Caso seja identificado algum problema de saúde
ou alguma necessidade educacional, a família será orientada e o participante encaminhado
para os serviços disponíveis na comunidade com o objetivo de otimizar a saúde , o bemestar e as capacidades de aprendizagem deste. Assim, você receberá informações sobre o
desenvolvimento de seu filho e níveis de aprendizagem, identificando pontos positivos e
limitações que podem ser trabalhadas.
Agradecemos sua atenção e valiosa colaboração, subscrevendo-nos.
Atenciosamente,
_______________________________________________
Prof. Dr. Vitor Geraldi Haase
CRM-MG 29960-T
Coordenador da Pesquisa
Professor Adjunto do Departamento de Psicologia da UFMG
Av. Antônio Carlos, 6627, FAFICH-UFMG,Sala 4060
Laboratório de Neuropsicologia do Desenvolvimento
Tel: (31)34096295, (31)91059589/ E-mail: [email protected]
_______________________________________________
Profa. Dra. Maria Raquel Santos Carvalho
Pesquisadora responsável pela parte genética da pesquisa
Professora Adjunta do Departamento de Biologia Geral da UFMG
Av. Antônio Carlos, 6627, ICB-UFMG
Laboratório de Genética Humana e Molecular
Tel: (31)34092598/ E-mail: [email protected]
_______________________________________________
Fernanda de Oliveira Ferreira CRP 04/22247
Doutoranda em Ciências da Saúde pela Faculdade de Medicina da UFMG
Av. Antônio Carlos, 6627, FAFICH-UFMG,Sala 4060Laboratório de Neuropsicologia do
Desenvolvimento
Tel: (31)34096295/ E-mail: [email protected]
Para maiores esclarecimentos você pode consultar também o Comitê de Ética em Pesquisa
(COEP-UFMG), na Av. Antônio Carlos, 6627 – Unidade administrativa II, 2º andar/ Campus
Pampulha- UFMG
Tel: (31)34094592/ E-mail: [email protected]
66
Responsável
Eu,______________________________________________________________________,
responsável pela participante_________________________________________________,
abaixo assinado (a), declaro ter sido informado (a) sobre os procedimentos e propostas da
pesquisa “Discalculia do desenvolvimento em crianças de idades escolar: triagem
populacional e caracterização de aspectos cognitivos e genético-moleculares” e concordo
em participar voluntariamente na mesma.
Belo Horizonte, ________ de _________________de __________
__________________________________________________________________
Assinatura
-----------------------------------------------------------------------------------------------------------------Participante
Eu, ______________________________________________________________________,
abaixo assinado, declaro ter sido informada sobre os procedimentos e propostas da
pesquisa “Discalculia do desenvolvimento em crianças de idades escolar: triagem
populacional e caracterização de aspectos cognitivos e genético-moleculares” e concordo
em participar voluntariamente na mesma.
Belo Horizonte, ________ de _________________de _____________
__________________________________________________________________
Assinatura
Contato telefônico (Preenchimento não-obrigatório): (____) _____________________
67
ANEXO 3 - PROTOCOLO ADAPTADO PARA A TÉCNICA DE MLPA
Kit lote nº _______________
Data: ___/___/___
1. DESNATURAÇÃO
- Diluir as amostras de DNA em TE para uma concentração desejada entre 20 – 200ng.
- Colocar 2,5 µl de cada amostra de DNA em tubos novos
- Acionar o programa MLPA - COMPLETO no termociclador
- Desnaturar as amostras a 98ºC por 5 min.
Preparar o mix para hibridização (5 % a mais)
Número de tubos
Reagentes
Cor
1
*MLPA
Amarelo
0,75µl
Probe
Preto
0,75µl
TOTAL
-
1,5µl
*vortexar o tampão antes de usar
- Antes de abrir - Resfriar amostras no termociclador - 25ºC (Pausar o programa)
2. HIBRIDIZAÇÃO
- Homogeneizar bem o mix
- Abrir o termociclador e adicionar 1,5 µl do mix hibridização, e homogeneizar gentilmente
com a pipeta. (Reiniciar o programa)
- Incubar 95ºC por 1min, em seguida, 60ºC por 16 a 20horas (colocar no infinito)
3. LIGAÇÃO
- Preparar o mix de ligação
Preparar o mix para ligação (5 % a mais)
Número de tubos
Reagentes
Cor
1
*Buffer A
Transparente
1,5µl
*Buffer B
Branco
1,5µl
Água milliQ
-
12,5µl
TOTAL
-
15,5 µl
*vortexar os tampões antes de usar e homogeneizar bem o mix com pipeta.
68
- Adicionar a Ligase
Reagente
Cor
Ligase
Verde
Número de tubos
1
0,5 µl
*Homogeneizar gentilmente o mix com pipeta
- Abaixar a temperatura para 54ºC e aguardar até o bloco atingir 54ºC. (Pausar o programa)
- Adicionar a cada amostra 16µl do mix de ligação já com a Ligase e homogeneizar com a
pipeta.
4. PCR
- Continuar a incubação: 15min – 54ºC; 5min – 98ºC e Pausar o programa a 20ºC ou
armazenar este produto por até uma semana a 4ºC, no escuro. Neste momento os tubos
podem ser retirados do termociclador.PCR
- A PCR deve iniciar a temperatura ambiente
Preparar o mix para PCR (5 % a mais)
Cor
Número de tubos
Reagentes
1
*PCR primer
Marrom
1,0 µl
**Polimerase
Laranja
0,25 µl
Água
-
3,75 µl
TOTAL
-
5,0 µl
* vortexar o PCR primer antes de usar.
**Segurar a polimerase por 10 seg na mão para reduzir a viscosidade.
- Homogeneizar bem o mix com pipeta.
- Abrir o termociclador e adicionar 5µl do mix PCR e homogeneizar bem com pipeta (deixar
o mix no gelo até usar).
- Reiniciar o programa no termociclador para a etapa da PCR
35 ciclos
95˚C

60˚C

72˚C

30 segundos
30 segundos
60 segundos
1 ciclo
72˚C 
15˚C 
20 minutos
pausar
69
- Retirar os tubos do termociclador.
- Estocar as reações em refrigerador protegidas contra a luz a 4˚C por uma semana ou a 25˚C e -15˚C por períodos maiores.
- Preparar a solução de corrida em placa própria de corrida no ABI (para separação dos
fragmentos de amplificação por eletroforese):
1,0μl de reação de PCR
9,0μl de formamida
0,5μl de ET ROX 500 ou LIZ 500
Programa MLPA COMPLETO
1. Desnaturação
98˚C 
5 minutos
25˚C 
pause
2. Hibridização
95˚C 
1 minuto
60˚C 
pause
3. Ligação
54˚C 
54˚C 
98˚C 
20˚C 
pause
15 minutos
5 minutos
pause
4. PCR
35 ciclos
95˚C
60˚C
72˚C



30 segundos
30 segundos
60 segundos
72˚C
15˚C


20 minutos
pausar
- Estocar as reações em refrigerador.
- Realizar a análise das corridas utilizando programa GeneMarker.