INTRODUÇÃO RESULTADOS OBJETIVOS METODOLOGIA

CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DO PAPILLOMAVÍRUS HUMANO
E SUA PERSISTÊNCIA ENTRE MULHERES GESTANTES HIV+ NO
RIO DE JANEIRO, BRASIL
1
2
2
1,2
1,2
2
1
Siqueira Juliana D(ME) , Meyrelles ARI , Almeida GL , Seuanez HN , Soares MA , Machado ES , Soares Esmeralda A
1-Instituto Nacional de Câncer José Alencar Gomes da Silva, Rio de Janeiro, Brasil;
2-Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, Brasil
INTRODUÇÃO
RESULTADOS
Tabela 1. Fatores de risco para HPV e câncer das pacientes do estudo
A infecção por HIV é um fator de risco para a persistência do HPV e o desenvolvimento de câncer
de colo de útero. Este câncer é o terceiro tipo mais incidente em mulheres no Brasil, e o segundo
no mundo, sendo responsável pelo óbito de aproximadamente 230 mil mulheres por ano. Ao
mesmo tempo, é um câncer com grande potencial de prevenção e cura quando diagnosticado
precocemente. O câncer do colo do útero se desenvolve a partir de lesões cervicais préinvasivas, que atualmente são divididas em diferentes categorias citológicas: lesão intraepitelial
escamosa de baixo grau (LSIL), lesão intraepitelial escamosa de alto grau (HSIL) e câncer
invasivo (Figura 1).
Total de pacientes
Média de idade (anos)
Número de parceiro sexuais na vida
1a3
4 ou mais
Profissionais do sexo
Sem informação
Tabagismo
Fuma ou já fumou
Nunca fumou
Número de gestações
1 ou 2
3 ou 4
5 ou mais
Uso de anticoncepcional
Sim
Idade da primeira relação sexual
< 16
DSTs
Herpes
Sífilis
119
27 (14-44)
30%
68%
1%
1%
42%
58%
36%
41%
23%
50%
75%
5%
18%
Citologia
14 Normal
1 Ascus
1 Lsil (sugestivo de HPV)
16
PCR HPV Negativo
119
Pacientes do estudo
1a Coleta (2º trimestre
da gestação)
12
Analise não finalizada
103
PCR HPV Positivo
16
Multiploinfectados
Citologia
65 Normal
6 Ascus
27 Lsil (sugestivo de HPV)
4 Hsil (sugestivo de HPV)
1 Sem informação
91
Seqüenciados e/ou
clonados
75
Monoinfectados
Figura 2. Prevalência do HPV e citologia na 1a Coleta (2º trimestre da gestação).
#
Polimorfismo do codon 72 - p53
Pro/Pro
Pro/Arg
Arg/Arg
HPV16(6), HPV18(1),
HPV16(4), HPV33(2),
HPV16(7), HPV18(1),
Alto risco (30)
HPV33(1), HPV35(1),
HPV56(1), HPV73(1)
HPV45(1), HPV58(2)
HPV58(2)
Normal(47)
Baixo risco(4)
0
HPV61(1), HPV70(1) HPV81(2)
Risco indeterminado HPV53(1), HPV62(1), HPV53(2), HPV62(2), HPV62(1), HPV66(1),
(13)
HPV69(1), HPV85(1) HPV83(1)
HPV83(2)
Alto risco (2)
0
HPV82(1)
HPV31(1)
Baixo risco
0
0
0
Ascus (5)
Risco indeterminado
HPV53(1), HPV83(1),
0
0
(3)
HPV32(1)
HPV16(3), HPV45(1),
Alto risco (9)
HPV35(1)
HPV16(2), HPV58(1)
HPV58(1)
Lsil (17) Baixo risco (4)
0
HPV11(1), HPV81(1) HPV6(1), HPV81(1)
Risco indeterminado
0
HPV66(1), HPV69(1) HPV53(1), HPV84(1)
(4)
Alto risco (4)
HPV73(1)
HPV16 (1)
HPV16 (1) HPV35 (1)
Hsil (4) Baixo risco
0
0
0
Risco indeterminado 0
0
0
Total
14
29
30
Citologia
Figura 1. Progressão de uma lesão benigna do colo do útero para o câncer cervical invasivo. A evolução é o resultado
dos efeitos combinados de genes do HPV, particularmente aqueles que codificam as proteínas E6 e E7, que são as
duas oncoproteínas virais; a integração do DNA viral no DNA do hospedeiro; e uma série de mudanças genéticas e
epigenéticas nos genes celulares. HSIL, lesão escamosa intraepitelial de alto grau; LSIL, lesão escamosa intraepitelial
de baixo grau (modificado de Lowy & Schiller, 2006).
Os papillomavírus podem infectar diferentes vertebrados, e apresentam uma classificação filogenética
bastante complexa. Em humanos são descritos 5 gêneros (alfa, beta, gama, mu e nu). Os gêneros
são subdivididos em espécies, totalizando 28. As espécies por sua vez são classificadas em 132 tipos
diferentes até o presente. Os tipos são divididos em alto risco e baixo risco para câncer e alguns com
risco indeterminado.
A maioria das infecções pelo HPV pode ser resolvida pelo sistema imune competente, e a persistência é
determinada pela detecção do vírus por pelo menos um ano. Fatores virológicos e do hospedeiro que
estão envolvidos na persistência ainda não estão elucidados.
O HPV possui duas oncoproteías (E6 e E7) que são capazes de interagir com proteínas que regulam o
ciclo celular e que atuam como supressoras de tumores, como a p53 e pRb. Essa interação provoca a
degradação e inativação das proteínas celulares, o que levaria à transformação e imortalização celular,
e posteriormente à formação de neoplasias. O polimorfismo no códon 72 da p53 pode codificar uma
arginina ou uma prolina; quando codifica uma arginina a proteína apresenta uma velocidade de
degradação maior em presença da proteína E6 do HPV 16 ou 18, e tem sido demonstrado que
também confere maior risco na formação de tumores cervicais do que a p53 que possui uma prolina.
Estudos sugerem que a freqüência de co-infecção e da persistência do HPV aumentam ainda mais
durante a gravidez, mas são escassos dados moleculares detalhados sobre as variantes de HPV
envolvidas, especialmente nos países em desenvolvimento como o Brasil.
OBJETIVOS
Caracterizar a prevalência da infecção pelo HPV, os tipos infectantes, a ocorrência de múltiplas
infecções, a persistência da infecção e a prevalência dos diferentes polimorfismos da p53 em uma
coorte de gestantes HIV+ com diversos perfis citológicos.
METODOLOGIA
Cento e dezenove gestantes HIV+ acompanhadas na clínica pré-natal da UFRJ, que não sabiam
se eram HPV+ por testes moleculares, tiveram uma amostra cervical coletada no 2º trimestre de
gravidez e outra seis meses após o parto. O DNA viral foi extraído e usado para determinar a
seqüência de nucleotídeos parcial do gene codificante do capsídeo viral (L1), usando iniciadores
degenerados, gerando um fragmento de 450 pb. O códon 72 da p53 foi amplificado e
seqüenciado com iniciadores específicos para o éxon 4, gerando um fragmento de 450 pb. Os
vírus foram classificados por filogenia utilizando referências dos tipos encontrados selecionadas
do banco de dados do PAVE (http://pave.niaid.nih.gov/index.html). As análises foram feitas no
programa MEGA5, usando neighbor-joining e Kimura 2-parâmetros. Vírus com eletroferogramas
apresentando ambigüidade de bases foram clonados. Um questionário detalhado com histórico
clínico e laboratorial foi preenchido para cada paciente.
Potencial oncogênico
* Duas amostras não possuem dados de p53 ou citologia, mas possuem HPV16
# Pro/ Pro - homozigoto prolina; Arg/Arg - Homozigoto para arginina; Pro/Arg - heterozigoto Prolina/Arginina
Tabela 3. Prevalência dos genótipos de HPV e a
associação com a citologia cervical e o polimorfismo do
códon 72 da p53 dentre as amostras multiploinfectadas
Amostra
RJ08-001
RJ08-004
RJ09-011
RJ08-018
RJ09-030
RJ09-040
RJ10-057
RJ09-069
RJ10-071
RJ10-080
RJ10-087
RJ10-088
RJ10-089
RJ10-093
RJ10-098
RJ10-114
Tipos de HPV*
HPV31, HPV56
HPV58, HPV61, HPV62
HPV82, HPV84
HPV53, HPV83
HPV6, HPV83
HPV16, HPV35, HPV55, HPV58
HPV16, HPV53, HPV81
HPV45, HPV58, HPV81
HPV32, HPV62
HPV16, HPV35, HPV44, HPV58
HPV55, HPV56
HPV42, HPV52, HPV68
HPV53, HPV55, HPV58
HPV16, HPV35
HPV16, HPV52
HPV11, HPV16, HPV66
Citologia
LSIL
Normal
LSIL
Normal
Normal
Normal
Normal
Normal
Normal
Normal
LSIL
LSIL
LSIL
LSIL
LSIL
LSIL
*Em vermelho os tipos de HPV de alto risco
#
P/P - homozigoto prolina; A/A- Homozigoto para arginina; P/A - heterozigoto Prolina/Arginina
P53#
A/A
A/P
P/P
A/A
A/P
A/P
A/P
P/P
A/A
A/P
P/P
P/P
A/A
A/A
A/P
A/P
Prevalência dos tipos do HPV em monoinfectados
HPV6
1%
HPV69
3%
HPV66
3%
HPV32
1%
HPV70
1%
HPV61
HPV11 1%
1%
HPV84 HPV85
1%
1%
HPV83
6%
HPV16
35%
HPV81
6%
HPV62
6%
HPV53
7%
HPV31
1%
HPV56
1%HPV82
1%
HPV58
8%
HPV73
3% HPV45 HPV18 HPV35
3%
4%
3%
HPV33
4%
* Tipos em vermelho são de alto risco
Figura 3. Gráfico da prevalência dos tipos de HPV em
monoinfectados.
Prevalência dos tipos do HPV em multiploinfectados
HPV66 HPV84
HPV61 2%
2%
HPV42 2%
HPV44 2%
2%
HPV32
2%
HPV11
2%
HPV6
2%
HPV16
15%
HPV58
12%
HPV83
5%
HPV81
5%
HPV35
8%
HPV62
5%
HPV55
8%
HPV53
8%
HPV52
5%
HPV56
5%
HPV31
HPV82 HPV68 HPV45 2%
2%
2%
2%
* Tipos em vermelho são de alto risco
Figura 4. Gráfico de prevalência dos tipos de HPV em
multiplos infectados.
Dentre as 91 amostras analisadas, os tipos de HPV encontrados são do gênero alfa e estão divididos
entre as espécies 1, 3, 5, 6, 7, 9, 10, 11. O genótipo homozigoto para arginina foi encontrado em 44%
dos pacientes, o homozigoto para prolina em 22% e o heterozigoto prolina/arginina em 34%.
A citologia da amostra pós-parto de 52% dos pacientes foi coletada até o momento, e 3 pacientes
progrediram para lesão intraepitelial escamosa de alto grau, todos com HPV de alto risco. No entanto os
resultados moleculares para persistência ainda estão em andamento.
CONCLUSÃO
Uma alta diversidade genética do HPV foi encontrada em gestantes HIV+, destacando o papel da
imunossupressão causada pela infecção pelo HIV e pela gravidez na infecção pelo HPV. O HPV tipo 18
foi apenas o oitavo tipo mais prevalente, uma descoberta importante com implicações para o uso da
vacina disponível atualmente. A ocorrência de infecção por múltiplos tipos de HPV também é
primordial nesta coorte. Foi observado que mulheres infectadas pelo HIV e HPV podem
ser portadoras de subtipos oncogênicos, mesmo quando os esfregaços
citológicos mostram normalidade citológica. Mais estudos são
necessários para avaliar os resultados clínicos das
infecções por HPV neste cenário.
Projeto Gráfico: Serviço de Edição e Informação Técnico-Científica / CEDC / INCA
Tabela 2. Prevalência dos genótipos de HPV e a associação
com a citologia cervical e o polimorfismo do códon 72 da
p53 dentre as 73 pacientes monoinfectadas*