DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE PATOLOGIAS INFECCIOSAS

II Simpósio de Sanidade Avícola
14 e 15 de setembro de 2000 — Santa Maria, RS
DIAGNÓSTICO MOLECULAR DE PATOLOGIAS
INFECCIOSAS AVIÁRIAS
Nilo Ikuta
Simbios Biotecnologia
Pesquisador da Universidade Luterana do Brasil – ULBRA
e–mail: [email protected]
Introdução
Diagnóstico Molecular é uma área da biologia molecular que utiliza técnicas
baseadas nos princípios de hibridização e replicação de ácidos nucleicos, permitindo
a detecção e caracterização de microrganismos patogênicos associados com doenças
infecciosas.
Atualmente, considera-se irreversível a tendência desta área obter um lugar de
destaque nos laboratórios de análises microbiológicas, sejam eles de análises clínicas
e patológicas humanas, de sanidade animal ou de controle de qualidade industrial de
alimentos.
Técnicas como a REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR – Polymerase
Chain Reaction), têm permitido grande evolução nas análises de rotina de laboratórios clínicos e industriais. Organismos não adaptados ao cultivo tornaram-se passíveis
de serem analisados. Novos patógenos estão sendo descobertos e os mecanismos
de associação com doenças elucidados. Em poucos anos, o diagnóstico molecular
evoluiu de uma mera curiosidade tecnológica para um campo vasto e complexo, com
o potencial para revolucionar a ciência e a prática da medicina e áreas correlatas.
A PCR consiste na síntese enzimática in vitro de cópias de DNA a partir de
uma seqüência alvo. A especificidade do teste é obtida a partir da utilização
de seqüências complementares à específica do patógeno. Num ensaio de PCR,
caso haja complementariedade entre os “iniciadores” (primers) e o DNA da amostra
analisada, haverá a ligação de ambos, seguida pela reação de síntese de DNA in vitro.
A repetição desta reação por 30 a 40 vezes (ciclos) dá origem a bilhões de cópias
do alvo num processo de amplificação (a quantidade dobra a cada ciclo), conferindo
extraordinária sensibilidade.
Numa rotina de detecção molecular, a única variável é a presença/ ausência do
DNA do patógeno (ou RNA, no caso de alguns vírus). Assim, só haverá síntese in
vitro do ácido nucleico quando o patógeno estiver presente na amostra.
No campo do diagnóstico molecular de doenças infecciosas aviárias, há trabalhos
de investigação científica contemplando praticamente todos os patógenos de relevância econômica. Dentre outros, valem destacar: a detecção vírus da bronquite
infecciosa (18–19, 29, 39), mycoplasmas (30–33), salmonelas (5, 22, 36), vírus
da doença de gumboro (7, 9–11, 12–15, 21), vírus da anemia infecciosa (34),
pneumovírus, vírus da leucose linfóide (28) e mielóide (6, 8), vírus da doença de marek
(27, 38), vírus da reticuloendoteliose (28, 35), reovírus (37), vírus da laringotraqueíte
(1, 4), vírus da doença de Newcastle (17) etc.
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Via de regra, a detecção molecular obtém resultados semelhantes aos de
isolamento, sendo ainda, adicionalmente interessante, nos casos de patógenos de
difícil cultivo ou em casos em que se busca diferenciação de sorotipos, cepas, etc.
Basicamente, os equipamentos e reagentes utilizados na detecção molecular de
diferentes patógenos são os mesmos; o que muda, obviamente, são os iniciadores,
que são patógeno-específicos, tornando a técnica altamente versátil.
Uma sofisticação das técnicas de diagnóstico molecular é a tipagem molecular
(análogas a testes convencionais como a vírus-neutralização e sorotipagem) que,
além de indicar a presença do patógeno no campo, permite caracterização específica
do agente causal, diferenciando-o (caso de distinção entre cepas vacinais, entre
cepas vacinais e de campo, etc). Isto possibilita avaliação refinada, onde os testes
sorológicos são menos específicos, e também a avaliação de programas de vacinação.
Por não necessitarem de cultivo ou isolamento, são técnicas que permitem a obtenção
de resultados em curto espaço de tempo. A tipagem do vírus da bronquite infecciosa
(ibv) e do vírus da doença de gumboro (ibdv) são bons exemplos da aplicação destas
técnicas.
Existem possíveis variações nas técnicas de tipagem molecular, como a aplicação
de (a) sondas ou de (b) primers genótipos/sorotipos específicos; uma terceira forma,
que alia praticidade e sensibilidade consiste da (c) caracterização do produto da PCR
que advém do processo de detecção, aproveitando-o na tipagem molecular. Esta
última, é valida no caso do IBDV, por exemplo, onde se amplifica uma região do
antígeno VP2, comum a qualquer isolado do vírus. Apesar dos primers utilizados
para esta PCR serem comuns a todos os ibdvs, o produto da síntese apresenta
variações internas nas seqüências sintetizadas. Estas variações são evidenciadas
pela digestão com enzimas de restrição, que reconhecem seqüências específicas de
ácidos nucleicos e promovem clivagens. Neste caso, cada sorotipo apresenta padrão
próprio de restrição.
Modalidades de Diagnóstico Molecular em patologias
aviárias disponíveis no país.
O uso corrente de técnicas moleculares já é realidade no país. Várias empresas já
aplicam parâmetros de diagnóstico molecular em diferentes circunstâncias de manejo.
A Simbios Biotecnologia tem oferecido pioneiramente modalidades de diagnóstico
molecular, dentre as quais, citam-se:
1. Patógenos relacionados com o trato respiratório MG, MS, IBV, reovírus,
pneumovírus, ILT
2. Patógenos que afetam o sistema imunológico ibdv, cav, reovírus
3. Patógenos neoplásicos mdv, alv–j e outros alv’s, reticuloendoteliose
4. Outros patógenos salmonelas, adenovírus etc.
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Projetos de pesquisa do grupo
Trabalhos de pesquisa executados por nosso grupo (sumariados a seguir) com
Mycoplasma gallisepticum, Salmonella, ibdv, ALV–J são exemplos de como o
diagnóstico molecular pode contribuir para a elucidação de casos.
Com a aplicação de metodologias moleculares, descreveremos, a seguir, abordagens que consideram:
• a tipagem de cepas vacinais de Mycoplasma gallisepticum, possibilitando a
avaliação de programas vacinais;
• metodologia para identificação de sorotipos de Salmonella;
• a caracterização de cepas de ibdv distintas das clássicas e de variantes
encontradas em outros países e;
• estudo de ocorrência de ALV–J e de cepas de vírus da doença de gumboro de
alta virulência, indicando tratarem-se de patógenos introduzidos em nosso país.
Tipagem de Mycoplasma gallisepticum
O Mycoplasma gallisepticum(MG) causa prejuízos à avicultura pela diminuição da
produção e da qualidade de ovos, má eclodibilidade, queda na eficiência alimentar,
altas taxas de mortalidade e condenação de carcaças.
A vacinação com cepas vivas é ferramenta utilizada para controle desta enfermidade. Estão atualmente disponíveis no mercado 3 vacinas vivas, baseadas nas cepas
F, TS–11 e 6/85.
A diferenciação molecular destas cepas com as de campo pode ser utilizada como
um dos parâmetros para monitorização da eficiência de vacinação.
O desenvolvimento da técnica se baseou na caracterização de 2 genes de
MG (Lipoproteína e Adesina). DNA de cepas vacinais e de isolados de campo
foram amplificados pela Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) e posteriormente
submetidos a análise de perfil de restrição (RFLP).
A análise destes genes permitiu a identificação de polimorfismos específicos
para cada uma das cepas vacinais e também de padrões de cepas de campo.
Amostras obtidas diretamente de traquéias de aves infectadas (“swabs”) com MG,
submetidas à análise pela metodologia proposta, demonstraram-se também passíveis
de diferenciação molecular.
A técnica desenvolvida mostrou-se rápida, não necessitando de cultivo celular,
permitindo não só detectar a presença do MG em aves infectadas, como também
diferenciar cepas em grupos compatíveis com TS11, F, 6/85 e cepas de campo.
Detecção e Identificação molecular de sorotipos de
Salmonella.
Já foram descritos mais de 2.000 sorotipos de Salmonella. Alguns destes,
distinguem-se pela adaptação a hospedeiros específicos nos quais causam patologias
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definidas (Gallinarum e Pullorum em aves e perus, Dublin em bovinos, Cholerasuis
em suínos, Typhi em humanos). Um segundo grupo, se caracteriza pela adaptação
a diferentes espécies animais, podendo causar infecções de grau variável na
sua gama de hospedeiros (principais exemplos são Enteritidis e Typhimurium).
Finalmente, um terceiro grupo, não associado a patologias graves, pode ocorrer em
animais domésticos, alimentos para consumo humano e componentes utilizados na
alimentação animal (farinha, ração, etc.).
A prevenção e controle dos sorotipos de Salmonella que representam risco para a
segurança, produtividade e rentabilidade da agroindústria avícola, bem como ameaça
para a saúde pública através da contaminação de alimentos, depende de um efetivo
instrumento de detecção e caracterização destes microorganismos.
As metodologias tradicionais para detecção de Salmonella são demoradas e
laboriosas. Na expectativa de proporcionar uma alternativa tecnológica a esta
problemática, o nosso grupo vem trabalhando no desenvolvimento de métodos de
detecção e caracterização de Salmonella (22–26). Já desenvolvemos métodos de
detecção altamente sensíveis a nível de gênero, através da amplificação de alvos
conservados como o gene da invasina (INV–A).
Para identificação de sorotipos de relevância, foi desenvolvida uma metodologia
que consiste em amplicações de genes distintos: 1) Invasina, 2) multiplex flagelina (fliC
g e i) e 3) multiplex fimbrias (sef A, pef A). Em função dos produtos de amplificação,
consegue-se identificar especificamente sorotipos como Enteritidis e Typhimurium.
Com análise de restrição destes alvos (RFLP), pode-se distinguir os sorotipos como
Gallinarum e Pullorum. A especificidade deste sistema foi analisado com 213
isolados pertencentes aos 47 sorotipos mais freqüentes no país (identificados pelo
Instituto Adolfo Lutz), demonstrando excelente correlação com os métodos clássicos
de identificação de Salmonella.
Tipagem de IBDV
O vírus da doença de Gumboro (infectious bursal disease virus – ibdv) é o
agente causal de uma doença imunossupressora altamente contagiosa que afeta
principalmente aves jovens. O controle desta doença é realizado através de programas
de vacinação, sendo que um dos fatores preponderantes para sua eficiência está
relacionado com as diferenças antigênicas (principalmente do antígeno VP2) entre
os ibdvs de campo e as cepas vacinais.
A caracterização dos subtipos pode ser realizada por ensaios de soroneutralização
(Jackwood & Saif, 1987) ou, mais recentemente, através de métodos moleculares
(Jackwood & Jackwood, 1994; Lin et al., 1993, Ikuta et. al 1997). Estas metodologias
avaliam o gene VP2 viral, responsável pela produção de anticorpos neutralizantes.
Através da técnica de tipagem molecular, nosso grupo caracterizou cepas vacinais,
cepas de referência e amostras de campo provenientes de diferentes regiões do país
(7). A metodologia de genotipagem possibilitou agrupar vacinas comerciais com
cepas de referência: Ultravac, Bursine 2 com Lukert Gumbor-Vet, Gumboro Nobilis,
Gumboral CT com D78 e a Variante E, com a vacina bivalente Gumborvet.
Muitas cepas de campo apresentaram padrão distinto das vacinais e das cepas
clássicas e variantes descritas em outros países. Um grupo de cepas, posteriormente
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classificado como GRUPO MOLECULAR 15 (G15), mostrou-se bastante disseminado
em todas as regiões do país. Outras cepas (GRUPO MOLECULAR 16 – G16),
mostraram-se restritas à região Sul (10, 11). Posteriormente, caracterizando a
seqüência da região variável do gene do antígeno VP2, foi confirmado que nossas
cepas de campo são distintas antigenicamente de cepas vacinais e de cepas clássicas
e variantes descritas nos EUA (9).
Em estudo mais recente, foram caracterizadas cepas altamente virulentas em
estados da Região Sudeste, Sul, Centro Oeste e Nordeste. Estas cepas causam alta
mortalidade com sintomas clínicos severos. Caracterizando seu genoma, verificamos
que são cepas distintas das até então encontradas no país, seja dentre as vacinais
ou dentre as variantes brasileiras. O padrão mostrou-se compatível com as cepas de
alta virulência encontradas em várias regiões da Europa e Ásia, que segundo nossa
classificação, correspondem ao Grupo Molecular 11 (G11).
ALV–J
O vírus da leucose aviária (avian leukosis virus – ALV) é um retrovírus associado
a doenças neoplásicas. O virion é sua forma infectante (RNA) e o pró-vírus (DNA)
é a forma integrada ao genoma do hospedeiro. Os ALVs são classificados em
subgrupos, sendo A, B, C, D, E e J os relevantes na avicultura. O ALV J foi isolado
a partir de matrizes de frangos de corte e está relacionado com leucose mielóide
(mielocitomatose) (2). A patogenicidade do ALV J é variável em função do estado
sanitário dos lotes, observando-se, além do comprometimento na produtividade,
mortalidade de 1–2%, com perdas ocasionais superiores a 20%. Atualmente, o
subgrupo J apresenta-se disseminado em vários países, inclusive no Brasil.
A leucose mielóide acomete essencialmente aves imuno-tolerantes ao ALV–J ou
aves com resposta imune comprometida. Desta forma, duas situações devem ser
evitadas para diminuir a presença de aves neoplásicas nos lotes: (a) transmissão
vertical ou horizontal precoce, que dá origem a aves com imuno-tolerância e (b)
transmissão horizontal em idade adulta em aves imuno-comprometidas.
Existe consenso de que aves com resposta imune ao ALV–J poderão portar o
vírus, de forma transiente, sem resultar em neoplasias e mortalidade. Adicionalmente,
existem evidências de que aves imuno-tolerantes, que por conseqüência mantém
cargas virais constantemente altas, têm papel determinante na disseminação (vertical
e horizontal) do patógeno.
O diagnóstico clássico da infecção do ALV J envolve a caracterização patológica
dos tumores com posterior identificação, através de isolamento viral e ensaios de vírus
neutralização. Esta identificação é complexa e laboriosa devido (1) ao genoma do
ALV J com regiões semelhantes a vários ALVs e ASVs (AVIAN SARCOMA VIRUS),
(2) às variações genéticas e antigênicas existentes entre os vários isolados de ALV
J e (3) à similaridade do ALV J com elementos endógenos (endogenous avian
retroviruses – EAV), não causadores de neoplasias e presentes em todas as linhagens
conhecidas (3).
Baseados nestas dificuldades, nosso grupo desenvolveu recentemente metodologia rápida e eficiente para detecção direta e específica do ALV–J exógeno (6, 8),
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através da técnica da reação em cadeia da polimerase (PCR). Dentre as principais
aplicações da PCR na detecção do ALV J, destacam-se as investigações de:
• tumores – na confirmação do ALV J como agente etiológico – particularmente
interessante quando em uso consorciado com as técnicas de detecção de MDV
e REV (por PCR, também disponíveis em nossa rotina);
• albúmen – na evidenciação da transmissão vertical;
• mecônio ou sangue total anticoagulado (ou soro/plasma) de pintos – como a anterior, na evidenciação da transmissão vertical. Possibilita identificar aves
infectadas em seus primeiros dias de vida proporcionando (a) informações
para implementação de programas de erradicação e/ou; (b) definição da
prevalência do patógeno no lote (através de uma amostragem com bases
estatísticas). A definição da prevalência do ALV J por transmissão vertical tem
implicações prognósticas, por estabelecer potencial de expressão de ocorrência
de neoplasias.
• sangue total anticoagulado (ou soro/plasma) – para definição da incidência/prevalência do patógeno no lote;
• swab cloacal – para definição da incidência/prevalência do patógeno no lote e
caracterização de aves transmissoras do ALV J.
Desde o início do ano de 1998, investigamos vários plantéis de avós, matrizes
e frangos de corte. Em todas as linhagens de corte investigadas, observamos a
ocorrência do vírus. Neste contexto, destaca-se uma interessante particularidade:
grande heterogeneidade de resultados, inclusive numa mesma linhagem, com lotes
ocasionalmente negativos, enquanto, outros, com prevalência em percentuais muito
variados (de 2–3% a 10–30%, chegando a extremos de 60–70%). Estudos de
seqüenciamento e filogenia, demonstraram que as cepas encontradas aqui são
semelhantes aos descritos nos EUA e Inglaterra.
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