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UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE MEDICINA TROPICAL
PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL
AVALIAÇÃO DA N-ACETILCISTEÍNA NA
IMUNOPATOLOGIA DA ESQUISTOSSOMOSE
MANSONI EXPERIMENTAL

ANDRÉ DE LIMA AIRES
RECIFE - PE
2010
ANDRÉ DE LIMA AIRES
AVALIAÇÃO DA N-ACETILCISTEÍNA NA
IMUNOPATOLOGIA DA ESQUISTOSSOMOSE
MANSONI EXPERIMENTAL
Dissertação apresentada ao Colegiado do
Programa de Pós-Graduação em Medicina
Tropical do Departamento de Medicina Tropical
do Centro de Ciências da Saúde da Universidade
Federal de Pernambuco, como parte dos requisitos
para obtenção do título de Mestre em Medicina
Tropical na área de concentração em Doenças
Infecciosas e Parasitárias.
Orientadoras: Profª. Drª. Elizabeth Malagueño de Santana
Profª. Drª. Mônica Camelo Pessôa de Azevedo Albuquerque
RECIFE-PE
2010
Aires, André de Lima
Avaliação da N-acetilcisteína na imunopatologia da
esquistossomose mansoni experimental / André de Lima
Aires. – Recife: O Autor, 2010.
94 folhas: il., fig., tab. e quadros.
Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de
Pernambuco. CCS. Medicina Tropical, 2010.
Inclui bibliografia e anexos.
1.
Esquistossomose
mansoni.
2.
Imunomodulação granulomatosa. 3. N-acetilcisteína
e Praziquantel. I. Título.
616.995.122
CDU (2.ed.)
UFPE
616.96
CDD (20.ed.)
CCS2010-116
DEDICATÓRIA
“Tudo o que um sonho precisa para ser realizado
é de alguém que acredite que ele possa ser realizado”.
Roberto Shinyashiki
DEDICATÓRIA
A DEUS, por ter colocado pessoas especiais no meu caminho que me
possibilitou conhecer a verdadeira intimidade do que é estar ao lado DELE.
Em especial à minha mãe, Alcione de Lima, que me ensinou a importância
do respeito e por ter suportado minha distância para a realização deste
trabalho. Sua luta nunca será esquecida. À Maria das Graças (Gracinha)
que tolerou a minha chata presença diária e ao meu pai Antônio Tadeu
Aires que desde o meu ingresso na Universidade sempre me apoiou em
todos os momentos. A vocês sou-lhes eternamente agradecido.
À minha irmã, Alcilene de Lima, cujo apoio em tudo sempre pude contar,
pelos bons momentos de infância e pela incansável dedicação na luta pelo
seu espaço. Obrigado por tudo.
Aos meus irmãos, Alberto, Eduardo e Suely, que sempre me apoiaram em
muitos momentos difíceis.
A todos os outros de minha família que sinceramente torceram pelo meu
sucesso.
Amo-os incondicionalmente!
AGRADECIMENTOS
“Aprendi com a esperança,
Que não devemos ser donos de nossos sonhos,
Pois eles devem ser livres, sempre.”
George Nascimento
AGRADECIMENTOS
Gostaria de sinceramente agradecer a todos que direta ou indiretamente puderam contribuir
não só com o desenvolvimento deste trabalho, como, principalmente, com o meu
amadurecimento pessoal e profissional.
À Profª. Drª. Elizabeth Malagueño por ter aceitado a orientação e confiança depositada neste
trabalho, à Profª Drª Mônica Albuquerque pela amizade, atenção, ajuda e incremento ao meu
desejo pela Parasitologia. A todos do Laboratório de Imunologia do LIKA pelo constante
apoio, especialmente à Profª. Drª. Vlaudia Costa e o Biomédico Luiz Henrique.
À coordenação, professores, alunos e todos que formam a Pós-Graduação em Medicina
Tropical da UFPE.
Às Profas. Drª. Sônia Leite e Drª. Paloma Medeiros, responsáveis pelos meus primeiros passos
na pesquisa e docência. Ao Grande Amigo e Profo. Dro. Haroudo Satiro Xavier pelo apoio
durante toda a iniciação cientifica. Agradeço imensamente aos meus mestres pelo crédito ao
meu trabalho.
À Drª. Constança Barbosa pelo caráter profissional que representa na minha formação, por ter
aberto as portas de seu laboratório e assim ter me feito ganhar além de muito conhecimento,
AMIGOS que levo sempre na memória.
Ao Profo. Dro. Marco Souza pelo constante apoio durante meu estágio no Centro de Pesquisa
Aggeu Magalhães, e por ter depositado confiança em meu trabalho e me fazer acreditar no
crescimento profissional.
À Juliana Kelle, Amanda Farias e Renata Ramos pela desprendida e importante ajuda durante
a conturbada administração diária das drogas e por terem atenuado minhas crises de surtos.
Obrigado pelo apoio!
À Maria Helena, Filipe, Paulo e todos os outros competentes profissionais do Biotério do
LIKA.
Às amigas Ana Patrícia, Sara, Nilza, Juliana e Talita e a todas que juntas formam o Círculo de
Oração. Obrigado pelas orações ao meu favor e por sempre levar meus pedidos ao mais alto
dos céus.
Ao Profo. Dro. Nicodenos Teles e a Mestre Mariana Ramos pela fundamental ajuda durante a
análise morfométrica.
A TODOS da Turma “Biologia: Arte e Ciências pela Vida” pelo orgulho e o diferencial que
juntos fizemos durante toda a graduação e pós-graduação em ser BIÓLOGOS
LICENCIADOS. Obrigadão pelo agradável convívio.
Ao André Ricardo pelo longo convívio durante a iniciação cientifica, apesar dos trancos e
barrancos saímos ilesos.
À Fernanda Francisca e Emily, amigas incondicionais que sempre me impulsionaram em
todos os meus momentos.
À Profª. Drª. Marilene da Silva e todos os amigos do Laboratório de Fungos Aquáticos da
UFPE pela agradável amizade que construímos.
"Gestos de carinho, atenção e delicadeza fazem-nos perceber quanto algumas pessoas são
especiais na forma de ser e como são bem-vindas as suas ações. A atenção, a paciência, o
carinho, a companhia, a amizade e os surtos têm me torna leve a cada dia. Encontrei um novo
Nascimento que tem me proporcionado tudo isto. Muito obrigado!"
E a todos os outros amigos que sempre recordam de mim com carinho, que me admiram e
torcem pelo meu sucesso.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela concessão
da bolsa de estudo.
RESUMO
“Fácil é jugar pessoas que estão sendo expostas pelas circunstâncias.
Difícil é encontrar e refletir sobre seus erros,
ou tentar fazer diferente algo que já fez de muito errado.”
Carlos Drummond de Andrade
RESUMO
As principais alterações na esquistossomose mansoni (EM) ocorrem no fígado em decorrência
da deposição de ovos do parasito neste órgão. O Praziquantel (PZQ) é eficaz sobre o
S.mansoni, porém, não altera as lesões histopatológicas já instaladas, as quais podem deixar
sequelas irreversíveis. A N-acetilcisteína (NAC) tem atenuado danos em hepatopatias
crônicas, efeitos atribuídos as suas propriedades antiinflamatórias, antioxidantes e
desintoxicante hepático. Assim, investigamos a ação da NAC e/ou PZQ na modulação
imunopatologica na EM experimental em diferentes fases da infecção (aguda, intermediária e
crônica). Na fase aguda, a intervenção com NAC (200mg/Kg/dia) se deu do dia subseqüente à
infecção até o 60º dia, nas fases intermediária e crônica a partir do 45º ao 90º dia e do 45º ao
120º dia respectivamente. O PZQ (100mg/Kg/dia) foi administrado do 45° ao 49º dia após a
infecção. Cada grupo foi formado por 4 subgrupos (n=9) de acordo com a terapia: Controle,
NAC, PZQ e NAC+PZQ. Após tratamento foram determinados: a carga parasitológica,
padrão de ovoposição, análise histomorfométrica de tecido hepático e os níveis de citocinas
(IL-4, IL-10 e INF-γ) e óxido nítrico (NO) das culturas de esplenócitos. De acordo com a
terapia e o tempo decorrido de infecção, os subgrupos PZQ ou NAC+PZQ alcançaram 100%
de eficácia e com alteração do oograma. Entretanto, os subgrupos NAC apresentaram
oograma padrão e sem alteração na carga parasitária. A análise histopatológica sugere que os
granulomas esquistossomóticos variaram em composição e organização celular de acordo
com o tempo. Os subgrupos PZQ ou NAC+PZQ apresentaram número reduzido de
granulomas. Apesar da modulação natural no diâmetro do granuloma, a terapia com NAC
e/ou PZQ incrementam de forma significativa essa modulação. O grau de fibrose sugere
menor deposição de colágeno nos subgrupos NAC e NAC+PZQ. Aos 60 dias da infecção os
níveis de IL-10 são bem reduzidos. Entretanto aos 90 dias é observado aumento significativo
da IL-10 nos subgrupos NAC e NAC+PZQ, já aos 120 dias ocorre diminuição desta citocina
nos subgrupos NAC e NAC+PZQ. Foi evidenciada modulação negativa da NAC nos níveis de
INF e NO nos subgrupos NAC e NAC+PZQ. Os níveis de IL-4 nos subgrupos NAC foram
semelhantes ao controle, mostrando que o NAC neste modelo experimental não exerce
influência sobre esta citocina. Neste estudo, a NAC através da modulação imunopatologica
atenuou o dano ao tecido hepático de camundongos esquistossomóticos.
Palavras
chaves:
Esquistossomose
acetilcisteína e Praziquantel.
mansoni,
Imunomodulação
granulomatosa,
N-
ABSTRACT
"Para realizar grandes conquistas, devemos não apenas agir, mas também
sonhar; não apenas planejar, mas também acreditar."
Anatole France
ABSTRACT
The main pathological alterations in the schistosomiasis mansoni (SM) affect the liver due to
the deposition of parasite eggs in this site. Although the praziquantel (PZQ) is highly effective
on S. mansoni, it does not change the inflammatory course already installed, which can leave
irreversible tissue consequences. The N-acetylcysteine (NAC) decreases the damage from
chronic liver diseases through its anti-inflammatory, antioxidant, and hepatic detoxifying
properties. For these reasons, we investigated the action of NAC and/or PZQ in the
immunopathological modulation on the experimental SM in different phases of the infection.
In the acute phase, NAC (200 mg/Kg/day) was orally administered to the mices from the day
after the cercariae infection to the 60th day, and in the intermediary and chronic phases this
drug was administered from the 45 th day after the infection to the 90th day and from the 45th to
the 120th day, respectively. PZQ (100 mg/Kg/day) was used from the 45th day after the
cercariae infection to the 49th day. Moreover, each experimental group was composed by 4
subgroups (n = 9) according to the following therapeutic regimens: control, NAC, PZQ, and
NAC+PZQ. The parasite load, pattern of ovoposition, histomorphometrical analysis of the
hepatic tissue, and the levels of IL-4, IL-10, INF- γ, and NO found in splenocytes cultures
were determinate. Only PZQ and NAC+PZQ subgroups reached 100% of efficacy with
alteration on the oogram. However, NAC subgroups presented standard oogram with no
alteration on the parasite load. According to the time of infection, histopathological analysis
of schistosomotic granulomas varied in the composition and cellular organization and the
PZQ and NAC+PZQ subgroups showed decreased number of granulomas. Despite the normal
modulation of the diameter of the schistosomotic granulomas, the therapy with NAC and/or
PZQ increased this modulation significantly. The level of fibrosis of granulomas in the NAC
and NAC+PZQ subgroups was lower than in other groups. At 60 days of infection, the levels
of IL-10 were very low in all studied subgroups, but at 90 days it was observed a significant
increase of this cytokine in the NAC and NAC+PZQ subgroups while at 120 days its levels
decreased in these same subgroups significantly. It was observed that NAC negatively
influenced the levels of INF- and NO in the NAC and NAC+PZQ subgroups. Additionally,
levels of IL-4 in the NAC subgroups were similar to controls suggesting that this drug did not
execute any influence upon the levels of this cytokine. In this study, NAC seemed to attenuate
the damage on the tissue liver of schistosomotic mices through the immunopathological
modulation.
Keywords: Schistosomiasis mansoni. granuloma formation. N-acetylcysteine. Praziquantel.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
“O lucro de nosso estudo é tornarmo-nos melhores e mais sábios.”
Michel de Montaigne
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
QUADROS
Quadro 1 - Definição dos grupos experimentais e esquema terapêutico. ............................. 48
FIGURAS
Figura 1 - Distribuição Geográfica da Esquistossomose no mundo ...................................... 26
Figura 2 - Distribuição Geográfica da Esquistossomose mansoni no Brasil .......................... 27
Figura 3 - Formas evolutivas do Schistosoma mansoni. A – ovo; B –
miracídio; C; esporocisto; D – cercária; E – esquistossômulos e F – vermes
adultos macho e fêmea ......................................................................................................... 29
Figura 4 - Ciclo Biológico do Schistosoma mansoni. .......................................................... 32
Figura 5 - Estruturas químicas das drogas esquistossomicidas clássicas ................................40
Figura 6 - Estrutura molecular da N-acetilcisteína ..................................................................41
Figura 7 – Fotomicrografias de tecido hepático de camundongos
esquistossomóticos nas fases aguda (A e B), intermediária (C e D) e crônica
da infecção pelo S. mansoni (H.E). A – G1-NAC – granuloma periovular
exsudativo evidenciando intenso infiltrado inflamatório composto por
eosinófilos, neutrófilos e escassos macrófagos e linfócitos circundando ovo
central em degeneração (400x); B – G1-NAC+PZQ – necrose coagulativa
central em granuloma periovular (200x); C - G2-Controle – granuloma
esquistossomótico produtivo de margem bem-delimitada composto por
macrófagos, linfócitos e escassos eosinófilos (400x); D – G2-NAC+PZQ –
granuloma periovular produtivo apresentando menor tamanho que o da figura
C e deposição de pigmento esquistossomótico (seta) (400x); E – G3-NAC –
granulomas periovulares isolados ou coalescentes (100x); F – G3-NAC+PZQ
– granulomas isolados e nódulos fibróticos exibindo menor tamanho que os
observados na figura E (100x); G – G3-Controle – extensa fibrose,
proeminente vascularização e hiperplasia de ductos biliares entre espaçosporta (fibrose hepática periportal murina) (400x). ................................................................ 65
Figura 8 – Fotomicrografias de tecido hepático de camundongos infectados
pelo S. mansoni empregadas para a classificação do grau de fibrose definida
através das colorações histoquímicas de tricrômico de Masson (lado direito) e
picrosirius-red (lado esquerdo), segundo critérios adotados para as análises
histopatológicas. A e B - G1-NAC - leve grau de deposição de fibras
colágenas, delicadas, irregulares, fragmentadas, frouxamente organizadas e
distribuídas de forma concêntrica no perímetro dos granulomas
esquistossomóticos (400x); C e D – G2 – Controle - moderada deposição de
fibras colágeno (400x); E e F – G2-PZQ - intensa deposição de colágeno,
sendo visualizada fibras colágenas compactadas e densamente distribuídas de
forma periférica e central ao granuloma esquistossomótico (400X). .................................... 69
Figura 9 – Níveis de IL4, (A) IL-10 (B), NO (C) e IFN- (D) secretados por
células esplênicas de camundongos infectados pelo S. mansoni tratados com
N-acetilcisteína (NAC) e/ou Praziquantel (PZQ), eutanasiados aos 60, 90 e
120 dias após a infecção. As células foram estimulas por antígeno solúvel de
ovos de S. mansoni (SEA). Os resultados estão expressos em média das
culturas em duplicatas de 5-8 animais por subgrupo ± erro padrão. ..................................... 71
LISTA DE TABELAS
“Os homens mais valentes e os soldados mais esforçados
nascem dos camponeses."
Plínio
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Vermes adultos de Schistosoma mansoni recuperados pela técnica
de perfusão do fígado e veias mesentéricas e o oograma em de camundongos
tratados com N-acetilcisteína e/ou Praziquantel em diferentes fases de
infecção .............................................................................................................................. 63
Tabela 2 – Número médio de granulomas esquistossomóticos em tecido
hepático de camundongos infectados pelo Schistosoma mansoni e tratados
com N-acetilcisteína e/ou Praziquantel em diferentes fases de infecção ................................ 67
Tabela 3 – Classificação do grau de fibrose nos granulomas
esquistossomóticos em tecido hepático de camundongos infectados pelo
Schistosoma mansoni em diferentes fases da infecção e tratados com Nacetilcisteína e/ou Praziquantel, através das análises histoquímicas de
Tricrômico de Masson e Vermelho de Picrosirius ................................................................ 68
SUMÁRIO
“Você bloqueia seu sonho quando você permite
que seu medo fique maior do que a sua fé."
Mary Manin Morrisey
SUMÁRIO
1
INTRODUÇÃO
23
2
REVISÃO DE LITERATURA
26
2.1
Epidemiologia da Esquistossomose
26
2.2
Biologia do Schistosoma mansoni
30
2.3
Patogenia da Esquistossomose
33
2.4
Imunopatologia da Esquistossomose
34
2.5
Tratamento da Esquistossomose
38
2.6
N-acetilcisteína
42
3
OBJETIVOS
45
3.1
Objetivo geral
45
3.2
Objetivos específicos
45
4
OPERACIONALIZAÇÃO DA PESQUISA
47
4.1
Desenho do estudo
47
4.2
Animais
47
4.3
Infecção de caramujos, obtenção das cercárias
e infecção dos camundongos
4.4
48
Formação dos grupos de estudo e
esquema terapêutico com NAC e/ou PZQ
48
4.5
Suscetibilidade in vivo do S. mansoni frente à NAC e/ou PZQ
50
4.6
Determinação da suscetibilidade in vivo
do S. mansoni frente à NAC e/ou PZQ
50
4.6.1 Recuperação dos vermes
50
4.6.2 Oograma
51
4.7
Estudo histopatológico e morfométrico de tecido hepático
51
4.8
Avaliação dos níveis de citocinas e óxido nítrico
51
4.8.1 Cultura de células esplênicas
51
4.8.2 Dosagem de citocinas
52
4.8.3 Dosagem de óxido nítrico
53
4.9
Análise estatística
54
4.10
Considerações éticas
54
5
ARTIGO - Efeito imunopatológico do tratamento da
N-acetilcisteina na esquistossomose mansoni experimental
56
RESUMO
57
1
INTRODUÇÃO
58
2
OPERACIONALIZAÇÃO DA PESQUISA
59
2.1
Animais, infecção e considerações éticas
59
2.2
Formação dos grupos experimentais e esquema terapêutico com NAC e/ou PZQ
59
2.3
Estudo parasitológico
61
2.4
Recuperação dos vermes
61
2.5
Oograma
61
2.6
Estudo histopatológico e morfométrico de tecido hepático
61
2.7
Cultura de células esplênicas
62
2.7.1 Dosagem de Nitrito
61
2.7.2 Dosagem de Citocinas
63
2.8
Análise Estatística
63
3
RESULTADOS
63
3.1
Análise parasitológica
63
3.2
Análise histopatológica
64
3.2.1 Fase aguda – 60 dias
64
3.2.2 Fase intermediária- 90 dias
65
3.2.3 Fase crônica – 120 dias
65
3.3
Análise morfométrica dos granulomas esquistossomóticos
67
3.4
Análise do grau de fibrose nos granulomas esquistossomóticos
68
3.5
Níveis de citocinas e óxido nítrico
70
4
DISCUSSÃO
72
6
CONCLUSÕES
79
7
REFERÊNCIAS
81
8
ANEXO
101
INTRODUÇÃO
“Se não existe possibilidade de fracasso,
então a vitória é insignificante."
Robert H. Schuller
23
1 INTRODUÇÃO*
A esquistossomose é uma doença produzida por trematódeos do gênero Schistosoma.
Considerada a mais importante helmintíase em termos de morbidade e mortalidade,
atualmente, encontra-se endêmica em 76 países com estimativa de 300 milhões de pessoas
infectadas, 20 milhões dos quais desenvolvem sérias complicações crônicas, o que acarretam
cerca de 500.000 mortes por ano em todo o mundo (BINA; PRATA, 2003;
CHIRAKALWASAN et al., 2006; WHO, 2006; PARISE FILHO et al., 2007).
No Brasil a estimativa é que existam cerca de seis milhões de pessoas infectadas pelo
S. mansoni, única espécie encontrada nas Américas (KATZ; PEIXOTO, 2000). Anualmente
mais de 100 mil novos casos e 500 óbitos são notificados no território nacional, sendo Minas
Gerais e Pernambuco os estados com maior índice de prevalência (Secretaria de Estado da
Saúde de São Paulo, 2009). Em Pernambuco, a esquistossomose é considerada uma endemia
rural, entretanto este quadro tem sofrido alterações, pois inúmeros casos autóctones em
localidades indenes do litoral do Estado e região metropolitana do Recife têm sido
notificados, além da existência de novos sítios de transmissão em regiões de turismo e férias
de verão (BARBOSA et al., 1996a, 1998a, 1998b, 2000a, 2000b, 2001; SOUZA, 2008).
O principal elemento patogênico da infecção pelo S. mansoni são os ovos depositados
pelas fêmeas nos vasos mesentéricos, os quais, posteriormente, são arrastados através do fluxo
sangüíneo para diversos órgãos especialmente para o fígado. Inicialmente, forma-se um
processo inflamatório agudo ao redor do ovo, em decorrência da eliminação de antígenos do
miracídio. Estes antígenos estimulam células e citocinas especificas que modulam a formação
do granuloma esquistossomótico no decorre de toda a infecção (BRUNET et al., 1999).
No período pré-patente há um predomínio da resposta imune Th1, com produção de
IFN-γ e IL-2 que contribui para a formação do granuloma agudo (PEARCE et al., 1991). A
resposta Th1, após a deposição de ovos no tecido do hospedeiro, sofre uma substituição
progressiva para um perfil Th2. No curso crônico o granuloma decresce de tamanho e
celularidade, devido à imunomodulação, apesar de haver progressão da fibrose hepática
(WYNN et al., 1998). Ainda nesta fase, inúmeros nódulos fibróticos podem coalescer levando
à diminuição da luz dos vasos sanguíneos e à perda da elasticidade, que conduz a hipertensão
portal, achado clínico mais severo na esquistossomose mansoni (MELO; COELHO, 2005).
Por consequência, as manifestações clínicas podem ser caracterizadas por: varizes
esofagianas, hemorragias digestivas e ascite (GRYSEELS et al., 2006).
_________________
*
Dissertação normatizada e apresentada acordo com a ABNT NBR 14724:2005
24
A falta de vacinas e de ações eficazes em saúde pública faz da quimioterapia o único
recurso imediato para minimizar a prevalência e incidência da esquistossomose no mundo.
Atualmente o praziquantel (PZQ) é o fármaco de primeira escolha, devido a longa
experiência clínica, mostrando que é seguro e efetivo contra todas as espécies de
Schistosoma, com cura parasitológica entre 80% a 90% (CIOLI, 2004). Com a descoberta do
PZQ e a ocorrência da esquistossomose exclusivamente em países em desenvolvimento, a
indústria farmacêutica pouco tem investido em novas tecnologias para o desenvolvimento de
novos fármacos para o controle dessa parasitose. Ainda não existe uma droga eficaz para o
tratamento da fibrose hepática, embora muitas tenham sido ensaiadas (FRIEDMAN, 2003).
Este quadro, não apenas justifica, mas aponta a necessidade de planejamento,
desenvolvimento e pesquisas com novos fármacos que apresentem propriedades
hepatoprotetoras ou que possam modular a formação granulomatosa esquistossomótica.
Em humanos e animais experimentais a N-acetilcisteína (NAC) inibe lesões teciduais
devido as suas propriedades anti-inflamátorias, antioxidantes e desintoxicantes hepático
(KELLY, 1998; ZAFARULLAH et al., 2003). Na clínica tem sido empregada para tratar uma
variedade de patologias, incluindo a fibrose cística (TIROUVANZIAM, 2006; HENKE;
RATJEN, 2007), doença pulmonar obstrutiva crônica (HENKE; RATJEN, 2007), toxicidade
associada às lesões hepáticas (PRESCOTT, 2005) e a cirrose biliar (MANI et al., 2006).
Estudos em pacientes com insuficiência hepática fulminante aguda e cirrose estável
demonstraram que a administração da NAC melhora a hemodinâmica portal (JONES et al.,
1994). Lauz e colaboradores (2004) concluíram que a NAC previne a lise celular e mantém a
função hepática diante da isquemia e reperfusão que o órgão é submetido no ato operatório.
Perreira-Filho e colaboradores (2008) evidenciaram em fígado de animais cirróticos,
induzidos por tetracloreto de carbono, que a NAC confere proteção contra a fibrose hepática e
estresse oxidativo, observando redução de 400% no depósito de colágeno, no grau de fibrose
classificada como leve a moderada, nos níveis de glutationa peroxidase e menor expressão da
iNOS quando comparado com o grupo controle sem tratamento.
Considerando as propriedades farmacológicas da NAC sobre a função hepática e
sendo a esquistossomose mansoni uma patologia com extensas alterações neste órgão,
propomos investigar neste trabalho os efeitos deste fármaco na imunopatologia em
camundongos infectados pelo S. mansoni em diferentes fases de infecção, podendo desta
forma junto à terapia convencional do PZQ contribuir na modulação granulomatosa.
25
REVISÃO DA LITERATURA
“O destino não reina sem a cumplicidade secreta do instinto e da vontade.”
Giovanni Papini
26
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Epidemiologia da Esquistossomose
A esquistossomose é uma infecção parasitária causada por espécies de Schistosoma,
helmintos, trematódeos, cujo hospedeiro definitivo é o homem. Endêmica em 76 paises e
territórios com estimativa de aproximadamente 300 milhões de pessoas infectadas, 20
milhões das quais desenvolvem sérias complicações crônicas, o que acarretam cerca de
500.000 mortes por ano (CHITSULO, 2000; BINA; PRATA, 2003; CHIRAKALWASAN et
al., 2006; WHO, 2006; PARISE FILHO et al. 2007).
A gravidade que a doença assume em muitos casos e o déficit orgânico que produz
fazem da esquistossomose a segunda mais importante doença tropical em termo de morte e
morbidade, ficando atrás apenas da malária. Em termos epidemiológicos, uma doença é
considerada endêmica com base na análise das características espaciais e temporais que
definem um determinado agravo à saúde. Sendo assim, a esquistossomose é considerada uma
endemia em muitos países e regiões, pois acomete ampla faixa de populações sob riscos
específicos, há um longo tempo. Em 2005, King e colaboradores já referem à
esquistossomose como uma pandemia, e a responsabiliza por 2 - 15% do subdesenvolvimento
da população portadora da doença.
Segundo o comitê da Organização Mundial de Saúde (WHO) (1993), considerando as
características de distribuição geográfica, morfológicas do verme adulto, localização do
espículo no ovo, desenvolvimento do ciclo biológico, especificidade dos hospedeiros e
padrões genéticos, espécies do gênero Schistosoma são assim classificadas:

S. haematobium (BILHARTZ, 1852)

S. japonicum (KATSURADA, 1904)

S. mansoni (SAMBON, 1907)

S. intercalatum (FISCHER, 1934)

S.mekongi (VOGE; BRICKNER; BRUCE, 1978)
As esquistossomoses apresentam-se amplamente distribuídas em países dos
continentes asiático, africano e americano, incluindo neste o Brasil (figura 1) (GRYSSELS et
al., 2006). Estimativas sugerem que o maior número de pessoas infectadas esteja no
continente africano, onde poucos esforços têm sido implantados no sentido de controlar a
infecção (CHITSULO et al., 2000).
27
A África apresenta baixos índices de esquistossomose mansoni na região Norte,
porém na região do delta do Nilo e no Sul do Saara são concentrados os maiores focos, onde
existem 85% de todos os casos de esquistossomose no mundo (WHO, 2006). Na Ásia apenas
ocorrem focos na Arábia Saudita, Iêmen e Oman. Na América Central e América do Sul, os
locais de infecção estão em vários Estados do Brasil, Venezuela, Suriname, Porto Rico,
República Dominicana e Antilhas (ROSS et al., 2002).
Figura 1 - Distribuição Geográfica da Esquistossomose no mundo.
Fonte: GRYSSELS et al., 2006.
Embora existam cinco espécies que acometem o homem, o Schistosoma mansoni é o
de maior prevalência, apresentando-se endêmico em 55 países, principalmente no Sul do
Saara africano como também em grande parte da América do Sul (CHITSULO, 2000).
As espécies do gênero Schistosoma provavelmente chegaram às Américas com o
tráfico de escravos africanos e com a imigração asiática e oriental, porém apenas o S.
mansoni adaptou-se à região, devido ao encontro de bons hospedeiros intermediários e
condições ambientais semelhantes à de sua origem (KATZ; ALMEIDA, 2003). Apesar da
Europa também ter recebido populações de escravos e imigrantes asiáticos e de ser
comprovada a existência de ovos de S. mansoni em coprólitos, o parasito ali não se
estabeleceu, devido, muito provavelmente, à inexistência de hospedeiros intermediários
suscetíveis (BOUCHET et al., 2002).
28
No Brasil o S. mansoni chegou entre os séculos XVI e XVII durante a colonização
portuguesa (TCHUEM TCHUENTE et
al., 1995). Aqui, encontrou hospedeiros
intermediários (caramujos do gênero Biomphalaria) com distribuição geográfica ampla e
condições ambientais favoráveis para adaptação, o que facilitou sua instalação e propagação
(REY, 2002). Atualmente, o S. mansoni é encontrado em 19 Estados brasileiros (figura 2),
desde o Maranhão até Minas Gerais, concentrando-se na região Nordeste. Entretanto, focos
isolados têm ocorrido no Rio de Janeiro, São Paulo, Goiás e Distrito Federal, porém o
número de casos vem aumentando na região Sul do país devido à mobilidade populacional
(REY, 2001).
Figura 2 - Distribuição da esquistossomose mansoni no Brasil.
Fonte: Amaral et al., 2006.
29
A estimativa é que no Brasil 25 milhões de pessoas habitam áreas de risco e cerca de
seis milhões de indivíduos encontram-se infectados pelo S. mansoni (KATZ; PEIXOTO,
2000; REY, 2001). Dados do Ministério da Saúde mostram que a esquistossomose, no Brasil,
causa mais óbitos (em média, mais de 500 a cada ano) que a dengue, a leishmaniose visceral e
a malária. Mais de 100 mil casos da doença são identificados a cada ano no território
nacional, sendo Minas Gerais, Bahia, Pernambuco, Alagoas e Sergipe os estados com maior
índice de prevalência (Divisão de Doenças de Transmissão Hídrica e Alimentar, 2009).
Barbosa e colaboradores (2006), utilizando dados da Fundação Nacional de Saúde,
constataram que entre os estado brasileiros, Pernambuco exibe o maior número de casos, com
cerca de um quarto de sua área tendo prevalência acima de 25%, apresentando crescentes
taxas de infecção. Adicionalmente, existem localidades na região da Zona da Mata deste
estado com 80% de indivíduos cronicamente parasitados. É de aproximadamente cinco
milhões o número de pessoas que reside nesta região e, assim, cerca de 62% da população
pernambucana está sob risco de infecção (FAVRE et al., 2001; RESENDES et al., 2005),
onde só em 2006 foram notificados 762 casos de esquistossomose (BRASIL. S. V. S., 2006).
Historicamente, a esquistossomose é considerada uma doença endêmica rural em
Pernambuco, sendo comprovada a existência de casos e focos de transmissão em quase todos
os municípios da Zona da Mata, principalmente nas regiões canavieiras do Estado. Esta
parasitose vem em expansão gradual ocasionada pelo êxodo de trabalhadores rurais em busca
de trabalho, indivíduos que saem de suas regiões infectados e acabam assumindo papel de
potente disseminador dos ovos do parasito, pois devido as suas condições de vida precárias,
sem saneamento básico e moradia, adequada, acabam contaminando criadouros de moluscos
existentes no litoral. Este fato tem sido comprovado pela existência de casos autóctones na
região indene do litoral do Estado e região metropolitana do Recife, além de existir novos
sítios de transmissão em regiões de turismo e férias de verão (BARBOSA et al., 1996a,
1996b, 1998a, 1998b, 2000a, 2000b, 2001; SOUZA, 2008).
Como consequência, o perfil epidemiológico da esquistossomose vem sofrendo
profundas alterações comportamentais em termos de morbidade, mortalidade e situação
socioeconômica. Em áreas rurais, a esquistossomose se apresenta predominantemente sob a
forma crônica, incidindo na classe social de baixa renda e tendo como vetor o B. straminea.
Enquanto no litoral e região metropolitana do Recife, a doença é destacada por casos agudos
em pessoas de classe média e alta, sendo o vetor o B. glabrata (BARBOSA et al., 2001).
Apesar do diagnóstico e tratamento serem relativamente simples, o controle da
esquistossomose requer, tanto medidas de saneamento básico, como mudança dos hábitos das
30
pessoas que residem em áreas endêmicas. Essas medidas têm como finalidade interromper o
ciclo evolutivo do parasito (KATZ; ALMEIDA, 2003). No entanto, esse controle é
particularmente difícil por razões que variam consideravelmente, tais como: extensa
disseminação do hospedeiro intermediário; inexistência de vacina; tempo necessário para que a
educação sanitária seja efetivamente aceita e implantada pela população e o alto custo das
obras de engenharia sanitária que garantam adequado abastecimento de água para as
residências e eliminação adequada dos dejetos, impedindo, assim, a contaminação dos recursos
hídricos (COURA; AMARAL, 2004).
Desta forma, fazem-se necessários, associado a essas medidas de controle, novos
estudos no sentido de melhor conhecer a infecção e a dinâmica das interações hospedeiroparasito, bem como avanços de novas terapias esquistossomicidas com a finalidade de
controlar a expansão da esquistossomose mansoni.
2.2 Biologia do Schistosoma mansoni.
Os aspectos morfológicos e biológicos do S. mansoni são analisados de acordo com
seus vários estágios de desenvolvimento no decorrer do ciclo biológico no hospedeiro
definitivo e intermediário. Este parasito apresenta-se sobre as formas evolutivas de ovo,
miracídio, esporocisto I e II, cercária, esquistossômulo e verme adulto (figura 3).
Figura 3: Formas evolutivas do S. mansoni. A - ovo; B - miracídio;
C - Esporocisto; D – Cercária; E - Esquistossômulo e F - vermes adultos macho e fêmea
31
O ciclo biológico do S. mansoni é do tipo heteroxênico com passagem obrigatória em
dois hospedeiros: um definitivo representado pelo homem e alguns roedores, onde ocorre à
reprodução sexuada dos vermes, e o hospedeiro intermediário que são moluscos do gênero
Biomphalaria no qual ocorre a reprodução assexuada. O ciclo completo ocorre em cerca de
80 dias, tanto no hospedeiro definitivo quanto no intermediário, com média de 40 dias em
cada. No hospedeiro definitivo tem início com a penetração das cercárias até a eliminação de
ovos juntos com as fezes e no intermediário da penetração do miracídio até a liberação de
cercárias (figura 4) (KATZ; ALMEIDA, 2003).
Uma característica peculiar do ciclo biológico é o meio aquático, onde são
encontradas as formas infectantes. Os hospedeiros intermediários são moluscos de água doce,
hermafroditas, inclusos na família Planorbidae, caracterizados por terem a concha enrolada
em espiral plana, e, por essa razão, conhecidos como planorbídeos. No Brasil os moluscos
capazes de serem infectados com S. mansoni são três: B. glabrata, B. straminea e B.
tenagophila (MALAGUEÑO; SANTANA, 1994).
Desde as fases iniciais de formação do ovo no interior da fêmea até sua eliminação,
profundas modificações morfológicas e fisiológicas ocorrem. O ovo é posto de forma imatura
(1º estádios) e até sua eliminação passa por mais três estádios de maturação (2º, 3º e 4º
estádio) até atingir a completa maturação (formação completa do miracídio) que decorre no
intervalo de uma semana após eliminação pelo verme fêmea. Os ovos maduros têm em média
150µm de comprimento por 65µm de largura e são facilmente reconhecidos pela presença de
um espículo lateral, situado no pólo posterior (REY, 2001).
Os ovos são excretados juntos com as fezes que em contato com a água por meios de
condições específicas de luminosidade intensa, temperatura em torno de 28°C e boa
oxigenação, eclodem liberando uma larva ciliada denominada miracídio, que nada ativamente
até o encontro do hospedeiro intermediário (HAAS, 1995).
Em contato com o molusco, o miracídio movimenta-se ativamente, fazendo com que
suas glândulas de penetração liberem enzimas proteolíticas capazes de favorecer sua
penetração pela digestão dos tecidos moles principalmente na base das antenas e no pé do
caramujo vetor (COELHO, 1957). Após a penetração ocorrem profundas e rápidas alterações,
o miracídio permanece no ponto de penetração, onde cresce e transforma-se em um “saco”
com forma oval ou alongada e no decorrer de três dias tem-se formado o esporocisto primário
(I) ou mãe (NEVES, 2000).
Em aproximadamente 72 horas, as células germinativas contidas no esporocisto
primário sofrem intensa multiplicação, originando os esporocistos secundários (II). Estes
32
migram ativamente através dos tecidos do molusco atingindo a glândula digestiva, sofrendo
modificações anatômicas e agora passando a conter no seu interior cercárias (REY, 2001).
Decorrendo entre 5 a 6 semanas, os caramujos liberam cercárias em meio aquático, que
nadam ativamente penetrando através da pele ou mucosas no hospedeiro definitivo. Logo
após ação, as cercárias perdem a cauda, restando o corpo cercariano então denominado de
esquistossômulos (NEVES, 2005).
Os esquistossômulos migram pelo tecido subcutâneo até alcançar a circulação
sanguínea. Ao acessarem o sistema circulatório, os esquistossômulos são carregados pelo
fluxo sanguíneo venoso para coração, posteriormente atingem os pulmões, retornam ao
coração, ganhando, assim, a grande circulação. O desenvolvimento final de esquistossômulos
para vermes adultos se completa quando os mesmos se instalam nos vasos intra-hepáticos
(PINTO; ALMEIDA, 1948).
O verme adulto macho mede cerca de 1cm de comprimento, tem cor esbranquiçada,
com tegumento recoberto de minúsculas projeções (tubérculos). Apresenta o corpo dividido
em duas regiões: anterior, na qual encontramos a ventosa oral, e a ventosa ventral (acetábulo)
e logo após esta região o corpo sofre uma dobra das laterais no sentido longitudinal
dorsoventralmente formando um canal chamando ginecóforo, que tem a função de albergar a
fêmea (NEVES, 2000). Seguindo a ventosa oral, tem-se o esôfago, que se bifurca ao nível do
acetábulo e funde-se depois formando um ceco único. Logo atrás do acetábulo, encontra-se
de sete a nove massas testiculares, que se abrem diretamente no canal ginecófaro. (NEVES,
2000).
A fêmea apresenta cor castanho-escura, de topografia mais simples do que as dos
machos, com tegumento liso, corpo fino, cilíndrico e delicado, medindo aproximadamente de
1,2 a 1,6cm de comprimento. A presença das ventosas e sistema digestório é semelhante a do
macho. Após a venosa ventral segui-se a vulva, útero, e ovário único oblongo, na metade
anterior do corpo. Na região posterior da fêmea localizam-se as glândulas vitelogênicas, que
ocupam os dois terços posteriores de seu corpo (OLIVEIRA et al., 2000).
Os schistosomas adultos acasalam, migram para as veias mesentéricas inferiores,
principalmente ao nível da parede intestinal superior, onde ocorre a postura dos ovos.
Contudo, uma parte destes chegará ao ambiente externo dando continuidade ao ciclo
biológico, o restante fica retido na mucosa intestinal ou são arrastados, pela circulação, para o
fígado, dando origem ao quadro mais característico da esquistossomose: a reação inflamatória
granulomatosa hepática (REY, 2001).
33
Figura 4. Ciclo Biológico do Schistosoma mansoni.
Fonte: Centro de Controle de Doenças e Prevenção – Esquistossomose
2.3 Patogenia da Esquistossomose
As lesões que ocorrem no organismo parasitado pelo S. mansoni são decorrentes, tanto
da agressão direta do parasito ou de seus elementos, quanto da resposta imune do hospedeiro
a tais agressões. Estudos anatomoclínicos mostram que existem diferenças significativas entre
os indivíduos portadores das várias formas clínicas que se desenvolve em duas fases: aguda
(pré-postural e pós-postural) e crônica (leve ou grave) (CHITSULO, et al., 2000).
Na fase aguda pré-postural, pode ocorre dermatite cercariana decorrente da morte de
algumas cercárias que penetram na pele. As manifestações clínicas são micropápulas
eritematosas
e
pruriginosas,
com
intensidade
e
duração
geralmente
pequenas
(LAMBERTUCCI; SILVA; VOIETA, 2005). Após desaparecimento dos sinais cutâneos,
com posterior desenvolvimento dos esquistossômulos, os pacientes podem apresentar febre
alta, mal estar, astenia, urticária, tosse, anorexia, náuseas, vômitos, mialgias, cefaléia e
diarréia (REY, 2001). Em virtude dos sintomas mencionados ocorrerem também em várias
outras doenças infecciosas e parasitárias, apenas o quadro clínico pode não sugerir o
diagnóstico para esquistossomose. O exame físico pode ser detectado abdome distendido e
34
doloroso, com fígado e baço aumentados (REY, 2001). Essas manifestações não são
evidenciadas em moradores de áreas endêmicas, caracterizando a forma inaparente da
esquistossomose (LAMBERTUCCI et al., 2000).
Dos ovos postos pelas fêmeas, parte chegará ao ambiente externo, o restante ficará
retido na mucosa intestinal ou serão conduzidos embolicamente até outros órgãos
especialmente para o fígado, dando início a uma reação de hipersensibilidade tardia do tipo
granulomatosa (REY, 2001). Os ovos retidos no epitélio intestinal induzem um processo
inflamatório com hiperplasia, ulceração e formação de microabscessos (CHEN et al., 1978;
CHEN, 1991, CHEN, 1999).
Inicialmente, tem-se a formação do processo inflamatório granulomatoso agudo, que
se desenvolve ao redor dos ovos, em decorrência da eliminação de antígenos do miracídio,
chamados genericamente de SEA (Soluble egg antigens - Antígenos solúveis do ovo), que
são eliminados através dos microporos da casca do ovo e estimulam células e citocinas
específicas (HANG et al., 1974; WYLER et al., 1978), favorecendo, assim, a formação de um
infiltrado de células inflamatórias, processo que termina com a formação de uma cicatriz
fibrótica (HORII et al., 1984; BOROS, 1989).
O curso da inflamação granulomatosa esquistossomótica apresenta três estágios
evolutivos: exsudativo, produtivo e de cicatrização por fibrose (RASO et al., 1978;
BOGLIOLO, 2000).
O primeiro estágio é característico durante a fase inicial da infecção, por ovos maduros
(embrionados) circundados por zona de necrose, onde comumente são encontrados
imunocomplexos. Nesta fase os numerosos granulomas são periovulares, ditos “hiperérgicos”,
isto, é, granulomas grandes, com predominante componente exsudativo, formado por
granulócitos (neutrófilos e eosinófilos) e, mais perifericamente, por linfócitos, plasmócitos e
macrófagos, periferia pouco delimitada, com escassas fibras colágenas finas e frouxamente
arranjadas em disposição concêntrica e frequente necrose central ou halo de necrose
periovular (RASO et al., 1978, SILVA et al., 2006). Esta fase pode durar, em média, trinta a
sessenta dias, desaparecendo quando o paciente é submetido a tratamento específico ou
podendo evoluir para a fase crônica, caso não haja tratamento (KATZ; ALMEIDA, 2003).
No estágio produtivo, o ovo habitualmente se encontra fragmentado ou deformado e o
infiltrado celular é constituído por macrófagos, linfócitos e plasmócitos e escassos neutrófilos
e eosinófilos, e o granuloma nessa fase é ligeiramente menor quando comparado com o
estágio exsudativo. Durante o processo granulomatoso, as células inflamatórias vão sendo
substituídas por células semelhantes a fibroblastos, que se orientam em camadas concêntricas
35
que fabricam e depositam abundantes quantidades de colágenos, que devido ao aumento da
deposição desta proteína na matriz extracelular, a estrutura do granuloma se completa com a
formação de um nódulo fibrótico (ZILTON, 2005), caracterizando a fase de cicatrização por
fibrose, onde o granuloma é ainda menor e se resume ao vestígio da casca do ovo, circundado
por escasso infiltrado inflamatório mononuclear e, mais externamente, por zona de fibrose
(VON LICHTEMBERG, 1987; ANDRADE, 2004).
A forma crônica habitual ou leve é a forma mais comum dos casos, encontra-se em
cerca de 90% dos infectados, principalmente em áreas endêmicas. Estes portadores são
assintomáticos ou com vagas queixas, geralmente discretas e inespecificas. Os granulomas
hepáticos são periovulares isolados, em varias fases de evolução para a cicatrização, o
número de granulomas é habitualmente pequeno, pois geralmente a carga parasitária nestes
portadores é baixa. Na forma grave ou avançada da esquistossomose, no curso crônico da
infecção, os diversos pontos fibróticos podem se coalescer levando à diminuição da luz dos
vasos sanguíneos e à perda da elasticidade, configurando a alteração patológica mais
importante desta fase, a hipertensão portal (DAVIS; KRESINA, 1996; MELO; COELHO,
2005).
Nessa fase, podem existir pacientes que permanecem na sua forma clínica estacionária
ou compensada, conservando um bom estado geral, com sintomatologia de pequena
intensidade. Outros, porém, podem evoluir para as formas mais graves ou descompensadas
apresentando circulação colateral, varizes esofagianas, hemorragias digestivas, fibrose
periportal e ascite (DOMINGUES; DOMINGUES, 1994; REY, 2001, GRYSEELS et al.,
2006).
Como consequência do bloqueio portal, há redução do fluxo sanguíneo no território
drenado pela veia porta. A esplenomegalia ocorre em grande parte em virtude desta
congestão venosa, bem como da hiperplasia e hipertrofia das células do sistema macrofágicolinfocitário, com diferenciação plasmocitária e produção de imunoglobulinas, em virtude da
presença de grande quantidade de substâncias antigênicas (PEARCE; MacDONALD, 2002;
GRYSEELS et al., 2006).
O processo inflamatório e o tamanho dos granulomas variam com a intensidade e
duração da infecção, com a fase evolutiva de cada granuloma e até mesmo entre os diversos
órgãos comprometidos. O decréscimo no tamanho do granuloma, observado entre as fases
aguda e crônica, foi chamado de modulação, processo extremamente complexo que envolve
células T, macrófagos, fatores solúveis, prostaglandinas, anticorpos e imunocomplexos
(RASO et al., 1978, VON LICHTEMBERG, 1987; ANDRADE, 2004).
36
A lesão macroscópica, em si, já é caracterizada, porém assume maior significado
microscopicamente, ao exibir vários graus de lesões inflamatórias destrutivas e obstrutivas
dos ramos porta intra-hepáticos. Uma das características mais importantes da lesão hepática
esquistossomótica é o padrão de fibrose descrito por Symmers, em 1904, que do ponto de
vista anatômico consiste em uma inflamação crônica causada pelos ovos que penetram no
conjuntivo periportal (peripileflebite) e pela propagação desta à parede dos ramos porta
(pileflebite). Nesta fase verifica-se a neoprodução conjuntivo-vascular intensa e sistematizada,
porém não ocorre subversão da arquitetura lobular do fígado (BOGLIOLO, 2000 BAPTISTA;
ANDRADE, 2005; SILVIA et al., 2006).
Macroscopicamente a lesão é caracterizada, ao corte, por grandes e fibrosos espaços
porta que aparecem como manchas brancas circundadas por parênquima hepático normal,
lembrando hastes de cachimbo branco (claypipestem fibrosis). O aspecto externo do órgão
revela bocelamento da cápsula de Glisson mostrando-se espessa e opaca nas depressões e
distendida e translúcida nas áreas protuberantes (ANDRADE; SILVA; SOUZA, 1997).
Contraditoriamente, apesar dos granulomas serem patogênicos, eles também protegem
o hospedeiro, ao sequestrar moléculas hepatotóxicas liberadas pelo ovo, prevenindo o dano
hepático maior, assunto este que vem sendo amplamente estudado em modelo murino com o
propósito de avaliar a dinâmica da formação e modulação granulomatosa esquistossomótica
(PATTON et al., 2001; ANDRADE; BAPTISTA; SANTANA, 2006).
2.4 Imunopatologia da esquistossomose
A formação do granuloma hepático esquistossomótico é um processo complexo que
envolve a resposta imune celular e humoral. Os diversos tipos celulares envolvidos neste
processo desempenham funções variadas com o objetivo de aprisionar e reter os antígenos
liberados pelos ovos evitando assim, uma necrose tissular mais ampla. Neste sentido, vários
tipos celulares produzem citocinas que desempenham as mais variadas funções ao longo de
todo o processo infeccioso (AMIRI et al., 1992; PATTON et al., 2001).
De acordo com a capacidade de produzir citocinas, os linfócitos auxiliadores T CD4 +
(Helper) foram classificados em dois grupos (MOSMANN e COFFMAN, 1989).
Denominados de Th1 os linfócitos T que possuem a capacidade de secretar as citocinas IL-2 e
IFN-γ e de Th2 aqueles que produzem IL-4, IL-5 e IL-10. Esses dois grupos possuem
atividades antagônicas, uma vez que citocinas do tipo Th1 inibem a secreção de citocinas Th2,
37
e citocinas Th2 inibem a secreção de citocinas Th1 (ROCHA; TANGHOT, 2004;
STOCKINGER; BOURGEOIS; KASSIOTIS, 2006).
O perfil Th1 está associado com as reações de hipersensibilidade tardia e com controle
de infecções por microorganismos intracelulares, enquanto a resposta Th2 está relacionada à
resposta humoral (FALLON et al., 2000a; JAKUBZICK et al., 2002; JAKUBZICK et al.,
2003) e a IL-10 apresentando papel essencial no controle dos dois perfis de resposta imune
(LUKACS; BOROS, 1993; HOFFMANN et al., 2000).
Stadecker (1999) e Fallon (2000), concluíram que as respostas do perfil Th2 são
protetoras, agindo como mediadores antiinflamatório e as Th1 estariam, relacionadas com a
formação do granuloma esquistossomótico, predominantes na fase aguda da infecção que
induz a imunopatologia letal devido a ausência de granulomas bem formados e exposição a
hepatotoxinas derivadas do ovo do parasito. No decorrer das quatro primeiras semanas de
infecção, período pré-patente há um predomínio da resposta Th1, com produção de IFN-γ e
IL-2 contribuindo para a formação do granuloma agudo (ANDRADE; AZEVEDO, 1987;
PEARCE et al., 1991).
Com o início da deposição de ovos nos tecidos do hospedeiro a resposta Th1
normalmente sofre uma substituição progressiva por uma resposta Th2 (GRZYCH et al.,
1991; PEARCE et al., 1991; RAMASWAMY et al., 1997). Desta forma a imunodolação
granulomatosa inicia-se durante o período Th1 e continua durante a emergência de citocinas
Th2 (STADECKER, 1999).
Os granulomas periovulares que se formam, à medida que a doença evolui da fase
aguda para a fase crônica, decrescem em tamanho e em celularidade, devido à
imunomodulação, apesar de haver progressão da fibrose hepática (WYNN et al., 1998). Esse
perfil será mantido ao longo de toda a infecção, porém para o desenvolvimento assintomático
ou oligossintomático é necessária que exista um balanço entre os perfis Th1 e Th2 (BRUNET
et al., 1999).
O IFN-γ é uma citocina diretamente envolvida na resposta granulomatosa. De suas
inúmeras funções podemos citar que ela age como agente supressor da síntese de colágeno por
fibroblastos, sendo associada com a proteção contra a fibrose na esquistossomose (KOVACS,
1991; HENRI et al., 2002). Em modelos experimentais a administração de IFN-γ exógeno,
durante a infecção esquistossomótica, leva a inibição da fibrose hepática com produção de
granulomas de menor tamanho (CZAJA et al., 1989). Estudos em infecção por S. japonicum
demonstraram que IFN-γ é um forte indutor da produção de óxido nítrico, que apresenta
importância na patologia da esquistossomose, bem como também é um regulador das
38
citocinas do perfil Th2, as quais possuem papel chave na formação dos granulomas
(HIRATA; FUKUMA, 2003).
A IL-4 deflagra a produção de IgE, em decorrência do aumento de eosinófilos
propiciado pela IL-5. Juntas IL-4 e IL-5 desempenham o papel efetor da resposta aos
antígenos de parasitos extracelulares. Em camundongos tratados com anti-IL-4 ocorre a
diminuição da fibrose hepática apesar de pouca interferência no tamanho dos granulomas
neste órgão (CHEEVER et al., 1994; ELTOUM et al., 1995). Enquanto que, a administração
exógena de IL-4 ocorre um aumento do tamanho dos granulomas hepáticos (YAMASHITA;
BOROS, 1992).
Dentre as funções da IL-5, estão a proliferação e a ativação de eosinófilos, que
parecem ser essenciais no decorre da migração dos esquistossômulos, e participa da destruição
dos mesmos (CAPRON et al., 1979). Os eosinófilos representam cerca de 50% da composição
do infiltrado inflamatório que compõe o granuloma esquistossomótico na fase aguda, a função
primordial dos eosinófilos é na neutralização das hepatotoxinas liberadas pelos ovos de S.
mansoni (OLDS; MAHMOUD, 1980).
Com base nas respostas imunes no decorrer da
infecção pelo S. mansoni e evolução dos granulomas hepáticos, é importante o estudo da
mudança do padrão imune, a fim de melhor compreender a imunopatologia.
2.5 Tratamento da Esquistossomose
Diante dos altos índices de morbidade e mortalidade provocada pelo Schistosoma, a
esquistossomose representa uma das dez doenças tropicais que estão sob programas de
controle da Organização Mundial de Saúde (MOREL, 2000). Mesmo inserida neste programa
a esquistossomose ainda é considerada uma doença negligenciada. O termo “negligenciado”
ou “doença de pobre” é empregado a todas as doenças onde não existe investimento em
pesquisa e desenvolvimento de novos fármacos (RENSLO et al., 2006; MRAZEK et al.,
2003).
O primeiro quimioterápico com atividade esquistossomicida foi relatado por
Christopherson em 1918, através do tratamento com antimoniais, com tártaro emético,
mencionados em papiros médicos com o nome de msdmt, no tratamento de hematúria,
provavelmente causada pelo S. haematobium, os efeitos colaterais tóxicos, levaram a busca
de
outros
fármacos,
livres
de
metal
e
que
fossem
administrados
via
oral
(CHRISTOPHERSON, 1918). A partir de então, surgiram novos fármacos como a
lucanthona (KIKUTH; GÖNNERT, 1948) e o niridazol (LAMBERT, 1964) com atividade
39
contra as três principais espécies de Schistosoma que parasitam o homem, o S. mansoni, S.
haematobium e S. japonicum. No entanto, esses fármacos, por apresentarem graves efeitos
colaterais, não foram considerados seguros o suficiente para serem utilizados em larga escala
nas regiões endêmicas.
Durante um programa específico para o desenvolvimento de novas drogas
esquistossomicidas, em 1964, pela indústria farmacêutica Pfizer (Sandwich, Inglaterra),
Richards, Foster e Baxter desenvolveram uma nova série de derivados 2-aminometil-tetrahidroquinolínicos que apresentaram ação esquistossomicida, muito embora em sua maioria
tenha exibido pouca eficácia, alta toxicidade e elevados efeitos colaterais. O composto que
apresentou maior potencial esquistossomicida foi o UK3883 que apresenta estrutura
semelhante ao lucanthone (miracil D). Posteriormente, a oxidação microbiológica do UK3883 pelo fungo Aspergillus sclerotiorium dá origem ao UK-4271, chamado de oxamniquine
(OXA) (RICHARDS; FOSTER, 1969; FOSTER, 1973).
O oxamniquine inicialmente chamado de Mansil®, mistura das palavras mansoni e
Brasil, pois, o fármaco apresenta atividade exclusiva sobre o S. mansoni e no Brasil ter sido
realizados os primeiros ensaios clínicos. O Mansil® apresentou atividade terapêutica com
eficácia em torno de 90%, sendo bem tolerada, eficiente tanto na atividade profilática quanto
na ação em todos os estágios imaturos do parasito, com a administração em dose única
intramuscular e apresentando como único efeito colateral, a dor local (KATZ et al, 1973).
Devido à dor local a droga passou a ser fabricada para o uso oral. Com o advento desta droga,
pela primeira vez um fármaco esquistossomicida poderia ser administrado sem grandes riscos
em tratamento individual ou em massa. Só no Brasil, o Programa Especial de Controle da
Esquistossomose, tratou mais de 13 milhões de pessoas com o oxamniquine nas zonas
endêmicas sem relato de óbito relacionado ao uso do medicamento.
Na década de 1970, as indústrias alemãs Merck e Bayer desenvolveram uma nova
droga, o praziquantel (PZQ). A mesma surgiu dos estudos da atividade anti-helmíntica de
compostos tranquilizantes, selecionado entre mais de quatrocentos compostos que apresentou
ação anti-helmíntica polivalente. No Brasil a droga foi lançada comercialmente para o
tratamento de cestóides, com o nome de Cestox® ou Cisticide®(SEUBERT et al, 1977).
O praziquantel atualmente é o fármaco de primeira escolha para o tratamento da
esquistossomose, tendo como segunda opção o OXA. Isso se deve a razões como: atividade
contra todas as espécies de Schistosoma; ausência de efeitos colaterais sérios; administração
por via oral; custo competitivo; e longa experiência clínica, mostrando que é seguro, efetivo e
de fácil administração, com cura parasitológica de 80% a 90%. Os efeitos colaterais mais
40
frequentes são dores abdominais, diarréia, náusea, vômito e anorexia (SANTOS et al, 1979).
Diversos estudos com o PZQ demonstraram que a droga não apresenta mutagenicidade e
genotoxicidade nos esquemas terapêuticos utilizados (KRAMERS et al., 1991), mesmo com
muitos estudos, os mecanismos moleculares de ação do PZQ não são bem conhecidos
(CIOLI, 2004).
A maior desvantagem do PZQ sobre o Schistosoma é a sua baixa eficácia contra as
formas imaturas (GRYSSELS et al., 2001) e vermes fêmeas imaturos (PICA-MATTOCIA;
CIOLI, 2004). Entretanto, alternativas têm sido propostas para solucionar este problema, tais
como a associação do PZQ com outras drogas capazes de eliminar as formas imaturas do
parasito. A associação terapêutica do PZQ com a OXA apresenta maior atividade sobre o S.
mansoni quando comparada a terapia isolada de cada droga (DELGADO et al., 1992;
GRYSCHECK et al., 2004).
O desenvolvimento do PZQ em 1970 e o vasto uso na década de 80 reduziram de
forma significativa a morbidade e mortalidade provocada pelo Schistosoma (BERGQUIST,
2002). Entretanto, a droga não impede a reinfecção, e o tratamento repetido é geralmente uma
prática comum em áreas endêmicas (MAGNUSSEN, 2003). Contudo, o surgimento de cepas
Schistosoma praziquantel-resistentes (STELMA et al., 1995; STELMA et al., 1997; LIANG
et al., 2001) tem levado a um grande número de trabalhos, sejam experimentais ou de campo,
visando evitar este problema potencial (DOENHOFF et al., 2002).
Nos últimos 30 anos houve uma melhora significativa na terapêutica da
esquistossomose, caracterizada pelo desenvolvimento do PZQ, considerada droga “ideal”
pelas propriedades farmacologias que apresenta. É possível que a descoberta desta droga,
associado à ocorrência exclusiva da esquistossomose em países em desenvolvimento ou
subdesenvolvidos, ou seja, países com baixo poder aquisitivo de compra e de pessoas
economicamente ativas, tenham levado a indústria farmacêutica a não se interessarem em
investir em novas tecnologias para desenvolver novos fármacos para o controle da
esquistossomose, bem como de drogas que atuem sobre as lesões granulomatosas já
instaladas.
A terapia convencional com o PZQ é eficaz sobre o S. mansoni, porém, não altera as
lesões histopatológicas já instaladas, as quais podem deixar sequelas irreversíveis. Ainda não
existe uma droga eficaz para o tratamento da fibrose hepática na esquistossomose, embora
muitas tenham sido ensaiadas. Desde 1990, pesquisas vêem sendo desenvolvidas para
identificar terapêuticas antifibróticas, porém ainda, não existe nenhuma droga dita “ideal”
(FRIEDMAN, 2003). Este quadro, não apenas justifica, mas aponta a necessidade de
41
planejamento, desenvolvimento e pesquisas com novos fármacos que apresentam potencial
atividade esquistossomicida (CIOLI, 2000; TDR, 2009) e de outras drogas que apresentem
efeitos
hepatoprotetores
ou
que
possam
modular
a
formação
granulomatosa
esquistossomótica. A Figura 5 ilustra as principais estruturas químicas das drogas
esquistossomicidas clássicas.
Figura 5 - estruturas químicas das drogas esquistossomicidas clássicas.
42
2.6 N-ACETILCISTEÍNA
A N-acetilcisteína (NAC) (figura 6) é um tiol de baixo peso molecular, composto
precursor da L-cisteína e glutationa reduzida nas células. É uma fonte de grupos sulfidril e
removedores de substâncias reativas como OH e H2O2 geradas pela reação dos peroxinitritos,
com NO e superóxido (ZAFARULLAH, 2003, PINHO et al., 2005).
Figura 6 – estrutura molecular da N-acetilcisteína
A NAC contribui para a síntese da glutationa, um dos desintoxicantes naturais mais
importantes e poderosos no organismo humano, especialmente no fígado (DE FLORA et al,
2001, PINHO et al., 2005). Possui papel-chave na homeostase celular, visto que a depleção de
glutationa pode causar morte celular devido à peroxidação lipídica e declínio nos níveis de
tiol-proteínas (REED et al., 1984). A NAC pode atuar diretamente reduzindo os níveis de
ROS in vivo e in vitro (ARUOMA et al., 1989) ou diretamente como “varredora” de radicais
de peróxido de hidrogênio, ácido hipoclórico e radical hidroxil, assim como inibir a liberação
de TNF-α, a ativação de citocinas pró-inflamatórias e apoptose celular (PINHO et al., 2005).
Exercer efeito antioxidante indireto por facilitar a biossíntese da glutationa, através da enzima
glutationa peroxidase, que é uma das três enzimas necessárias à sobrevivência celular por
serem antioxidantes endógenos (CONESA et al., 2001).
É uma droga bem absorvida e rapidamente metabolizada, somente cerca de 10% da
amostra ingerida permanece na circulação por um tempo razoável, sendo a maior parte da
droga consumida na produção de glutationa intracelular, em um extenso metabolismo de
primeira passagem no fígado (VINCENZINI et al., 1998).
Em humanos e animais experimentais a NAC inibe o dano tecidual causado pelo
estresse oxidativo devido as suas propriedades anti-inflamatórias, antioxidantes e
desintoxicantes sobre o tecido hepático (KELLY, 1998; ZAFARULLAH et al., 2003). Por
43
estas propriedades, a NAC tem sido a droga de escolha para o tratamento da insuficiência
hepática induzida por paracetamol, além de apresentar diversas propriedades farmacológicas
com benefícios potenciais em pacientes criticamente doentes (ATKINSON, 2001; ATKURI et
al., 2007).
Na clínica tem sido empregada para tratar uma variedade de patologias, incluindo a
fibrose cística (TIROUVANZIAM, 2006; HENKE; RATJEN, 2007), a doença pulmonar
obstrutiva crônica (KASIELSKI; NOWAK 2001; HENKE; RATJEN 2007), a toxicidade
associada às lesões hepáticas (PRESCOTT, 2005) e a cirrose biliar (MANI, et al., 2006), além
de ter sido empregada para elevar os níveis de glutationa em eritrócitos e linfócitos
melhorando a função das células T em portadores da imunodeficiência adquirida humana (DE
ROSA et al., 2000). Ademais, De Flora et al. (2001) afirmam que a NAC apresenta
propriedade mucolítica devido à reação de seu grupamento químico sulfidrila com as pontes
dissulfeto das secreções mucosas, dissolvendo-as.
Estudos em pacientes com insuficiência hepática fulminante aguda e cirrose estável
demonstraram que a administração de NAC melhora a hemodinâmica portal (JONES et al.,
1994). Lauz e colaboradores (2004) estudaram a ação da NAC a fim de prevenir a lise celular
e assim manter a função hepática diante da isquemia e reperfusão que o órgão é submetido no
ato operatório e concluíram que a NAC previne a lise celular e mantém a função hepática.
O tratamento com antioxidantes, entre eles a NAC tem mostrado atenuar fibrose
intersticial em vários processos patológicos (POLI; PAROLA, 1997; ZAFARULLAH et al.,
2003). Pereira-filho (2008) avaliaram os efeitos da NAC sobre o estresse oxidativo no fígado
de animais cirróticos por inalação de tetracloreto de carbono e evidenciaram através de análise
bioquímica uma redução de 400% no depósito de colágeno no fígado dos animais tratados
com a NAC quando comparados aos animais cirróticos controle. Ainda neste estudo, a análise
histoquímica pela coloração de Picrossírius red evidenciou redução no grau de fibrose
classificada como leve a moderada nos animais tratados com NAC, por outro lado o grupo
cirrótico controle apresentou classificação severa. Neste estudo os autores concluem que este
fármaco confere proteção ao tecido hepático de animais cirróticos.
Diante do exposto e considerando as propriedades da NAC sob a função hepática e
sendo a esquistossomose mansoni uma patologia com extensas alterações hepáticas,
propomos neste trabalho, investigar os efeitos deste fármaco na modulação granulomatosa
esquistossomótica em camundongos infectados pelo S. mansoni em diferentes fases de
infecção (aguda, intermediário e crônico), podendo assim contribuir junto à terapia
convencional do Praziquantel na melhora da morbidade pelo S. mansoni.
44
OBJETIVOS
“A neve e a tempestade matam as flores,
mas nada podem contra as sementes.”
Kahlil Gibran
45
3 OBJETIVOS
3.1 Objetivo geral
Avaliar a ação da N-acetilcisteína e Praziquantel na imunopatologia da
esquistossomose mansoni experimental em diferentes fases na infecção.
3.1 Objetivos específicos
Em camundongos tratados ou não tratados com NAC e/ou PZQ em diferentes fases de
infecção pelo Schistosoma mansoni:
● Comparar os parâmetros parasitológicos através da quantificação de vermes
recuperados e padrão de ovoposição;
● Comparar as analises histopatológicas e histomorfométricas em tecido hepático;
● Comparar a produção das citocinas IL-4, IL-10 e INF- e Óxido nítrico nos
sobrenadantes das culturas de células esplênicas.
46
OPERACIONALIZAÇÃO
DA PESQUISA
“No estudo da história natural existem dois obstáculos igualmente perigosos:
o primeiro é não possuir nenhum método,
o segundo referir tudo a um sistema particular.”
George Louis Leclerc
47
4 OPERACIONALIZAÇÃO DA PESQUISA
4.1 Desenho do estudo
Estudo experimental de intervenção para avaliar camundongos fêmeas infectadas pelo
S. mansoni, tratados e não-tratados com a NAC e/ou PZQ em diferentes tempos após a
infecção.
Os modelos experimentais animais são extremamente importantes para a melhor
compreensão de diversos processos infecciosos (DRUILHE et al., 2002). Na esquistossomose
mansoni diversos modelos já foram utilizados para avaliar a infecção, desde modelos simples
até mais complexos com o propósito de descobrir possíveis controles ou melhores condutas
terapêuticas para essa parasitose (CHEEVER et al., 2002). Vários animais têm sido
empregados como modelos experimentais na avaliação de drogas esquistossomicidas, entre
eles estão macacos (SADUN et al., 1966), coelhos (CHEEVER et al., 1980) e camundongos
(WARREN, 1966, ANDRADE; SILVA; SOUZA, 1997). Sendo este último o melhor modelo
e o de escolha para o presente trabalho, pois, desenvolver ciclo biológico e quadro
histopatológico semelhante ao que ocorre no homem, por ser de fácil manipulação e
manutenção e baixo custo.
O modelo murino é empregado para esclarecer aspectos que não podem ser
investigados em seres humanos, por questões éticas e operacionais. A linhagem de escolha
para o presente estudo foi a Swiss webster, frequentemente empregada, pois apresenta
variabilidade genética, o que facilita extrapolar relativamente os resultados para os seres
humanos e neste animal as dificuldades de realização por questões éticas são menores. Os
animais foram mantidos nas mesmas condições ambientais e alimentares. Desta forma,
qualquer diferença existente entre os grupos e subgrupos será atribuída à intervenção
terapêutica.
4.2 Animais
Foram utilizados camundongos fêmeas, Swiss webster, pesando entre 28-30 gramas,
com 28 dias de idade, fornecidos e mantidos no biotério do Laboratório de Imunopatologia
Keizo Asami da Universidade Federal de Pernambuco (LIKA-UFPE) de acordo com
condições padronizadas de criação.
48
Para a infecção dos camundongos foi utilizada a cepa de S. mansoni, Belo Horizonte –
Minas Gerais (BH), mantida pelo Laboratório de Imunologia de Doenças Parasitárias e de
Esquistossomose Experimental - LIKA-UFPE, pela passagem sucessiva da cepa em
caramujos da espécie Biomphalaria glabrata fornecidos pelo moluscário da Disciplina de
Parasitologia, do Departamento de Medicina Tropical, da UFPE.
4.3 Infecção de caramujos, obtenção das cercárias e infecção dos camundongos
Para infecção dos hospedeiros intermediários, fezes de camundongos infectados pelo
S. mansoni (camundongos de manutenção) foram coletadas e tratadas de acordo com a técnica
de sedimentação espontânea. O sedimento foi exposto à iluminação e a temperatura de 28oC,
até a eclosão dos ovos e visualização dos miracídios com auxilio de lupa. Os miracídios foram
postos em contado com caramujo individualmente, permanecendo exposto à luz artificial e ao
calor 28ºC por aproximadamente duas horas. Posteriormente, os moluscos foram mantidos em
aquários com água desclorada e livres de exposição luminosa (STANDEN, 1952). Para cada
ciclo de infecção, 80 moluscos eram expostos à infecção para que forneçam quantidade
razoável de indivíduos positivos e houvesse equilíbrio entre os sexos do parasito
(PELLEGRINO; KATZ, 1968).
Decorridos 35 a 40 dias após a infecção, os moluscos foram novamente expostos à luz
e à temperatura de 28ºC por cerca de 40-60 minutos, em recipientes de vidro, contendo água
destilada, agora para permitir a liberação de cercárias. (STIREWALT, 1954). Após a
obtenção de uma suspensão cercariana, os camundongos foram infectados, via subcutânea
com uma fração desta suspensão, que continha, em média, 50 cercárias. (OLIVIER;
STIREWALT, 1952).
4.4 - Formação dos grupos de estudo e esquema terapêutico com NACe/ou PZQ.
Estudos indicam que a fase crônica da infecção esquistossomótica em camundongos é
estabelecida a partir da 12ª semana após a infecção (FALLON, 2000a; PEARCE;
MCDONALD, 2002), entretanto a fibrose hepática periportal começa se esboçar a partir da
16ª semana (ANDRADE; CHEEVER, 1993; COUTINHO et al., 2007). Para o presente
estudo, foi estabelecido que o tempo decorrido entre o tempo de infecção e eutanásia fosse de
60 (G1), 90 (G2) e 120 (G3) dias, para avaliação das fases aguda, intermediária e crônica,
respectivamente.
49
Os camundongos foram divididos em três grupos experimentais de acordo com o
tempo de intervenção terapêutica e eutanásia. Cada grupo experimental foi formado por 4
subgrupos com 9 animais cada de acordo com o quadro abaixo.
QUADRO 1 – Definição dos grupos experimentais e esquema terapêutico.
Esquema terapêutico
Grupos
Subgrupos
experimentais experimentais
NAC
200mg/Kg/dia
PZQ
100mg/Kg/dia
Controle
Grupo 1 (G1) NAC
Fase aguda
PZQ
Administrada do dia subsequente Administrado do 45º dia após
à infecção até o 60º dia*.
a infecção até o 49º dia.
Administrado do 45º dia após a
Administrado do 45º dia
NAC+PZQ
Controle
Grupo 2 (G2)
NAC
Fase
PZQ
intermediária
NAC+PZQ
Grupo 3
(G3)
Fase crônica
*
infecção até o 90º dia .
após a infecção até o 49º dia.
Controle
NAC
Administrado do 45º dia após a Administrado do 45º dia
PZQ
infecção até 120º dia*.
após a infecção até o 49º dia.
NAC+PZQ
* O término do tratamento corresponde ao dia da eutanásia.
Antes de iniciar o tratamento todos os animais foram marcados e pesados
individualmente. O tratamento com a NAC na concentração de 200mg/Kg/dia está baseado
nos trabalhos de Jones AL e colaboradores (1994) e Yang e colaboradores (2008) envolvendo
estudos com humanos e com animais cirróticos e de Fan e colaboradores (2007) ao estudar o
efeito da NAC na infecção experimental pelo S. japonicum.
O esquema terapêutico adotado com o praziquantel teve por objetivo alcançar a cura
parasitológica, desta forma interferindo na postura diária dos ovos de S. mansoni considerado
potencial fator fibrogênico. Assim buscamos a uniformidade do quadro fisiopatológico dos
granulomas já instalados podendo mensurar com maior fidedignidade a ação da NAC como
50
fármaco adjuvante no tratamento da esquistossomose após terapia especifica com o
praziquantel.
A NAC (Sigma) foi diluída em solução salina e o PZQ (Sigma) foi suspendido em
Cremophor EL a 2%, ambos administrados por tubagem esofágica. Os animais dos subgrupos
controle, livre de NAC e/ou PZQ, foram submetidos as mesmas condições que os demais
subgrupos experimentais.
4.5 Suscetibilidade in vivo do S. mansoni frente à NAC e/ou PZQ
O procedimento experimental recomendado e utilizado neste trabalho para avaliação
da suscetibilidade in vivo do S. mansoni está de acordo com os trabalhos desenvolvidos por
Pellegrino e Faria (1965), Katz e colaboradores (1966) e Katz e Pellegrino (1973).
4.6 Determinação da suscetibilidade in vivo do S. mansoni frente a NAC e/ou PZQ
A avaliação da suscetibilidade in vivo da NAC e/ou PZQ sobre o S. mansoni foi
baseada na recuperação final dos vermes e alteração no padrão de ovoposição pelo método do
oograma.
4.6.1 Recuperação dos vermes
Decorrido o tempo de tratamento de cada grupo, os animais foram eutanasiados por
deslocamento cervical (MARTINEZ et al., 2003). Após eutanásia, foi efetuada uma incisão
próxima aos órgãos genitais, com auxílio de pinças e tesouras cirúrgicas, indo até a caixa
torácica, posteriormente foi realizada a perfusão do sistema venoso portal através da injeção
de solução salina heparinizada (cloreto de sódio a 0,85% e citrato de sódio 1,5%), na veia
cava inferior com a mesma solução (PELLEGRINO; SIQUEIRA, 1956). A mesma solução
foi injetada na aorta descendente, procedendo-se à perfusão das veias mesentéricas
(DUVALL; DE WITT, 1967). Ao final foi realizada a quantificação dos vermes adultos
machos e fêmeas.
51
4.6.2 Oograma
Fragmentos do intestino dos camundongo foram retirados para a leitura do oograma.
Estudo que avalia o desenvolvimento dos ovos de S. mansoni encontrados na parede intestinal
do hospedeiro, sob a ação de terapias esquistossomicidas. Foram contados e classificados os
ovos nos seus diferentes estágios de desenvolvimento e ovos mortos. Para a classificação
seguiram-se os critérios propostos por Pellegrino e colaboradores (1962). A susceptibilidade
do S. mansoni é então avaliada pela alteração de oograma, sendo considerado alterado quando
estiverem ausentes um ou mais estádios (PELLEGRINO, FARIA, 1965).
4.7 Estudo histopatológico e morfométrico de tecido hepático
Fragmentos de fígado de cada animal foram fixados em formaldeído a 10%
tamponado em PBS e processados para inclusão em parafina. Posteriormente, realizado cortes
histológicos de 5µm de espessura. Para cada amostra de tecido hepático foram confeccionadas
três laminas histológicas, coradas pelas técnicas de hematoxilina-eosina (HE), picrosirius-red
(PR) e tricrômico de Masson (TM) (Junqueira; Bignolos and Brentani, 1979). Para a análise
do infiltrado inflamatório foram utilizadas as amostras coradas pela técnica de HE. As
colorações de PR e TM foram empregadas para a determinação do grau de fibrose
(classificados em: leve, moderado e intenso, de acordo com o arranjo das fibras de colágeno e
a deposição desta proteína no tecido hepático), mensuração do diâmetro médio dos
granulomas viáveis (com ovo, ou vestígio de ovo central) e do número médio de granulomas
capturados em cinco campos aleatórios (área total de campo = 12.234 μm2, área total
visualizada = 61.170μm2) em amostras histológicas de cada animal por subgrupo. Para
obtenção das imagens das amostras foi utilizado microscópio óptico acoplado a câmera digital
e sistema computadorizado com linguagem orientada para leitura de imagem pelo software
Motic Images Plus 2.0 ML®.
4.8 Avaliação dos níveis de citocinas e óxido nítrico
4.8.1 Cultura de células esplênicas
Após término da terapia experimental de cada grupo, os baços dos camundongos
foram retirados de maneira asséptica, e colocados em meio RPMI 1640 para transporte. Em
52
fluxo laminar os mesmos foram macerados em placas de Petri junto ao meio RPMI 1640
(Sigma Chemical, St. Louis, Mo., USA) complementado com HEPES (10mM), 2mercaptoetanol (0,05mM) 216mg de L-glutamina e antibiótico gentamicina 50mg/L e
posteriormente levados à centrifugação a 4°C por 10 minutos, a 1500 rpm.
Após este procedimento as hemácias foram lisadas pela adição de água estéril ao
precipitado por 18 segundos (1mL/baço). Posteriormente as células foram ressuspendidas em
meio RPMI complementado e mantidas refrigeradas durante cinco minutos para a formação
de grumos. O sobrenadante foi então transferido para outro tubo de ensaio para a realização
de uma nova centrifugação a 4°C por 10 minutos, a 1500 rpm. e o precipitado foi
ressuspendido
em meio RPMI suplementado com 10% de Soro Bovino Fetal (Sigma
Chemical, St. Louis, Mo., USA).
As células foram contadas e avaliadas quanto à viabilidade diluindo-se a suspensão em
Azul de Trypan 0,2%. (1:10) e contando as células em câmara de Newbauer. As células
ressuspendidas foram cultivadas em placas de 48 poços nunca concentração de 5x10 6
células/mL estimuladas por na SEA (20μg/mL). As placas foram incubadas a 37ºC, a 5% de
CO2 e após 24h e 72h coletado os sobrenadantes para posterior análise da produção das
citocinas IL-4, IL-10, INF- γ e Oxido nítrico.
4.8.2 Dosagem de citocinas
Os níveis das citocinas IL-4, IL-10 e INF-γ no sobrenadante das células esplênicas
foram determinados por ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay) sanduíche. As placas
para realização do ELISA (Costar, Cambridge, MA, USA) foram sensibilizadas com os
primeiros anticorpos de captura [anti-IL-4 (11B11 a 4μg/ml, anti-IL-10 (C252-2A5, a 8μg/ml)
e anti-INF- (XMG 1.2, a 4μg/ml)], diluídos em tampão salina fosfato (PBS 0,01M pH 9,6)
sendo e distribuídos 50l em cada poço da placa e incubadas à temperatura de 4°C por 18h.
Após este período, as placas foram lavadas três vezes com PBST (Tampão salina fosfato com
0,05% de Tween 20) e bloqueadas por 30 minutos com 150μl PBST a 10% de SBF.
Após este período as placas foram novamente lavadas com PBST e, em seguida,
adicionados 50μl dos respectivos padrões recombinantes de camundongos: rIL-4, rIL-10 e
rIFN-, diluídos nas concentrações indicadas pelo fabricante ou das amostras dos
sobrenadantes da cultura de células esplênicas. As placas novamente incubadas a 4°C por 18
horas. Após esta incubação, as placas foram lavadas com PBST e 50 μl dos segundos
anticorpos biotinilados [anti-IL-4 (BVD6.24G2, a 1μg/ml, anti-IL-10 (SXC1, a 2μg/ml) e
53
anti-INF-μ (AN18, a 2μg/ml),] diluídos com PBST e 0,1% de BSA, foram distribuídos nos
poços, seguido de incubação à temperatura ambiente por 1 hora. Após esta incubação, cada
placa foi novamente lavada três vezes com PBST e o conjugado enzimático diluído 1:6000
(estreptoavidina marcada com peroxidase, Sigma Chemical, St. Louis, Mo., USA) em PBST
contendo BSA 0,1 % foi adicionado às placas, 80μl/poço, e estas foram incubadas à
temperatura ambiente por uma hora. As placas foram lavadas novamente com PBST e a
reação revelada pela adição do substrato contendo H2O2 30% e o cromógeno ABTS [(2,2’azinobis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)], Sigma Chemical, St. Louis, Mo., USA)
dissolvidos em tampão citrato 0,1 M e fosfato de sódio 0,2 M pH = 5,5. A reação foi então
bloqueada com 50 μl/poço ácido cítrico 0,2 M e a leitura realizada em leitor de ELISA (BIO
RAD modelo 2550) em comprimento de onda de 405nm.
As quantidades de citocinas nos sobrenadantes são calculadas a partir de curvas
padrão, obtidas com concentrações de 0,625 a 10ng/ml de rINF-, 0,625 a 10ng/ml de rIL-4 e
0,625 a 10ng/ml de rIL-10. Os resultados são apresentados com as médias aritméticas das
dosagens de culturas em duplicatas de 5-8 animais por subgrupo ± erro padrão.
4.8.3 Dosagem de Óxido nítrico
Os níveis de óxido nítrico nas culturas de células esplênicas foram realizados através
da dosagem de nitrito pela reação de Griess. 50µL de amostras ou padrão (NaNO2-251-4
Sigma Chemical, St. Luis, Mo, USA) foram colocados em placas de vinil (2595, Costar),
diluídas em meio RPMI 1640 (Cultilab) com 5% de SBF. Em seguida, adicionado o reagente
de GRIESS (1% sulfanilamida, 0.1% naftiletilenodiamina e 3% H3PO4). A quantidade de NO
é calcalculado a partir de curva padrão obtidas com concentração de 1,65 a 50µ μM. A leitura
foi realizada a 540nm em leitor de ELISA. Os resultados são expressos como as médias
aritméticas das dosagens de culturas em duplicatas de 5-8 animais por subgrupo ± erro padrão
(GREEN et. al. 1982).
5 Análise estatística
Para comparação dos diferentes grupos, foi empregada a análise de variância
(ANOVA). Quando a ANOVA revelou diferença significativa, foi utilizado o teste de Tukey
para identificar as diferenças entre os grupos. A significância estatística foi considerada,
admitindo-se um nível crítico de 5%, em todos os casos.
54
6 Considerações éticas
Os procedimentos descritos para a utilização experimental dos animais foram
aprovados pela Comissão de Ética em Experimentação Animal do Centro de Ciências
Biológicas da Universidade Federal de Pernambuco (CEEA-UFPE). Os critérios de avaliação
e julgamento pela CEEA-UFPE são de acordo com as normas sugeridas pelo Colégio
Brasileiro para Experimentação Animal, e com as normas internacionais estabelecidas pelo
National Institute of Health Guide for Care and Use of Laboratory Animals.
55
ARTIGO
“O pessimista se queixa do vento,
o otimista espera que ele mude e o realista ajusta as velas.”
William Ward
56
ARTIGO ORIGINAL
EFEITO IMUNOPATOLOGICO DO TRATAMENTO DA N-ACETILCISTEINA NA
ESQUISTOSSOMOSE MANSONI EXPERIMENTAL
André de Lima Aires 1
Renata Alexandre Ramos Silva1
Giuliana Viegas Schirato2
Nicodemos Teles de Pontes Filho3
Sidcley Bernardino de Araújo4
Valdênia Maria Oliveira Souza1
Vlaudia Maria Assis Costa1,
Mônica Camelo P. A. Albuquerque1
Elizabeth Malagueño de Santana1*.
1
Laboratório de imunologia de Doenças Parasitárias e de esquistossomose Experimental do Laboratório de
Imunopatologia Keizo Asami da Universidade Federal de Pernambuco (LIKA/UFPE), Recife, Pernambuco,
Brazil.
2
Biotério do Centro de Pesquisa Aggeu Magalhães, Fundação Oswaldo Cruz – CpqAM - Brasil
3
Departamento de Patologia do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal de Pernambuco e
Laboratório de Imunopatologia Keizo Asami da (LIKA/UFPE), Recife, Pernambuco, Brazil.
4
Departamento de Patologia do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal de Pernambuco
*
Endereço para correspondência:
Elizabeth Malagueño de Santana
Campus Universitário, Cidade Universitária, Recife-PE-Brasil. CEP: 50670-901
E-mail: [email protected] e/ou [email protected]
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RESUMO
A N-acetilcisteína (NAC) atenua danos em hepatopatias crônicas, efeitos atribuídos as suas
propriedades antiinflamatórias, antioxidantes e desintoxicante hepático. Assim, investigamos
a ação da NAC e/ou Praziquantel (PZQ) na imunopatologia da esquistossomose mansoni
experimental. Três grupos experimentais foram formados, os quais corresponderam às fases
aguda, intermediária e crônica da infecção. Cada grupo foi formado por 4 sub-grupos de
acordo com o esquema terapêutico: Controle, NAC, PZQ e NAC+PZQ. A intervenção com a
NAC, 200mg/Kg/dia, via oral, na fase aguda teve inicio no dia subsequente a infecção com
duração de 59 dias consecutivos. Nas fases intermediária e crônica, a NAC foi administrada a
partir do 45º dia após a infecção e manteve-se durante 45 e 75 dias respectivamente. O PZQ,
100mg/Kg/dia, via oral, foi administrado do 45° ao 49º dia após a infecção. Os animais foram
mortos aos 60, 90, e 120 dias após a infecção correspondendo às fases aguda intermediária e
crônica da infecção, respectivamente. A NAC modulou negativamente a sínteses de INF-γ e
NO e positivamente IL-10, entretanto não influenciou a produção de IL-4. Na análise
histopatológica de tecido hepático sugere que os granulomas esquistossomóticos variaram em
composição e organização celular de acordo com o tempo de infecção e esquema terapêutico.
Os animais tratados com a NAC e/ou PZQ apresentaram redução significativa no tamanho dos
granulomas hepáticos e aqueles tratados com NAC apresentaram menor grau de fibrose.
Concluímos que a NAC neste modelo experimental modulou a resposta imune, atenuando o
dano tecidual hepático em camundongos infectados pelo S. mansoni.
Palavras-chaves: Schistosoma mansoni, N-acetilcisteína, Praziquantel e fisiopatologia
granulomatosa.
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1 INTRODUÇÃO
A esquistossomose é uma infecção parasitária produzida por espécies de helmintos
trematódeos do gênero Schistosoma com ampla distribuição mundial. Presente em 76 países e
territórios, aproximadamente 300 milhões de pessoas encontram-se infectadas e, destas, cerca
de 20 milhões desenvolvem sérias complicações crônicas, resultando em aproximadamente
500.000 mortes por ano (Chitsulo 2000; Bina; Prata, 2003; Blanchard, 2004, Chirakalwasan,
2006).
A inexistência de vacinas e de ações eficazes em saúde pública faz da quimioterapia o
recurso imediato para minimizar a prevalência e incidência da esquistossomose. O
praziquantel é o único fármaco para o tratamento da esquistossomose por atuar sobre todas as
espécies de Schistosoma com importância em saúde pública, com cura parasitológica de 80 a
90% (Botros et al. 2005, Walter et al. 2006). Contudo, um dos grandes problemas na terapia
da esquistossomose diz respeito a inexistência de tratamento para fibrose hepática. Não há
ainda uma droga eficaz, embora muitas tenham sido ensaiadas (Arthur, 2002, Friedman,
2003). Este quadro, não apenas justifica, mas aponta a necessidade de planejamento,
desenvolvimento e pesquisas com fármacos que apresentem propriedades hepatoprotetoras ou
que possam modular a formação granulomatosa esquistossomótica.
A N-acetilcisteína (NAC) por apresentar propriedades anti-inflamatórias, antioxidantes
e desintoxicantes sobre o tecido hepático, inibi o dano tecidual causado pelo estresse
oxidativo em humanos e animais experimentais (Kelly, 1998; Zafarullah et al., 2003). O
tratamento com antioxidantes, inclusive a NAC tem mostrado atenuar fibrose intersticial em
vários processos patológicos (Poli e Parola, 1997; Zafarullah et al., 2003). Por estas
propriedades, a NAC tem sido a droga de escolha para o tratamento da insuficiência hepática
induzida por paracetamol (Hardman, Limbird e Gilman; 2001). Lauz e colaboradores (2004)
concluíram que a NAC previne a lise celular e mantém a função hepática diante da isquemia e
reperfusão que o órgão é submetido no ato operatório em modelo experimental.
A N-acetilcisteína (NAC) é um tiol de baixo peso molecular, composto precursor da
L-cisteína e glutationa reduzida nas células. É uma fonte de grupos sulfidril e removedores de
substâncias reativas como OH e H2O2 geradas pela reação dos peroxinitritos, com NO e
superóxido (Zafarullah, 2003, Pinho et al., 2005). É uma droga bem absorvida e rapidamente
metabolizada, somente cerca de 10% da amostra ingerida permanece na circulação por um
tempo razoável, sendo a maior parte da droga consumida na produção de glutationa
59
intracelular, em um extenso metabolismo de primeira passagem no fígado (Vincenzini et al.,
1998).
Diante do que foi exposto e considerando as propriedades farmacológicas da NAC sob
a função hepática e sendo a esquistossomose mansoni uma patologia com extensas alterações
hepáticas, propomos neste trabalho, investigar os efeitos deste fármaco na modulação
granulomatosa esquistossomótica e imunológica em camundongos infectados pelo S. mansoni
em diferentes fases de infecção (agudo, intermediário e crônico), podendo assim contribuir
junto à terapia convencional do Praziquantel na melhora da morbidade na esquistossomose.
2 Operacionalização da Pesquisa
2.1 Animais, infecção e considerações éticas
Foram utilizados camundongos fêmeas, Swiss Webster, pesando entre 28-30 gramas,
com 28 dias de idade, mantidos no biotério do Laboratório de Imunopatologia Keizo Asami
da Universidade Federal de Pernambuco (LIKA-UFPE) de acordo com condições
padronizadas de criação. Para a infecção dos camundongos foi utilizada a cepa de
Schistosoma mansoni, Belo Horizonte – Minas Gerais (BH), mantida pelo Laboratório de
Imunologia de Doenças Parasitárias e de Esquistossomose Experimental – LIKA - UFPE,
através de passagens sucessivas da cepa em caramujos da espécie Biomphalaria glabrata.
Após obtenção de suspensão cercariana, os camundongos foram infectados via percutânea
com 50 cercárias (Olivier and Stirewalt, 1952). Todo procedimento experimental foi aprovado
pela Comissão de Ética em Experimentação Animal (CEEA/UFPE) (processo numero
23076.021878/2008-66).
2.2 Formação dos grupos experimentais e esquema terapêutico com NAC e/ou PZQ
Estudos indicam que a fase crônica da infecção esquistossomótica em camundongos é
estabelecida a partir da 12ª semana após a infecção (Fallon, 2000a; Pearce and Mcdonald,
2002), entretanto a fibrose hepática periportal começa a esboçar-se a partir da 16ª semana
(Andrade and Cheever, 1993; Coutinho et al., 2007). Para o presente estudo, foi estabelecido
que o tempo decorrido entre o tempo de infecção e eutanásia fosse de 60 (G1), 90 (G2) e 120
(G3) dias, para avaliação das fases aguda, intermediária e crônica, respectivamente.
60
Os camundongos foram divididos em três grupos experimentais de acordo com o
tempo de intervenção terapêutica e eutanásia. Cada grupo experimental foi formado por 4
subgrupos com 9 animais cada de acordo com o quadro abaixo:
QUADRO 1 Definição dos grupos e subgrupos experimentais e esquema terapêutico com a
N-acetilcisteina (NAC) e Praziquantel (PZQ).
Esquema terapêutico
Grupos
Subgrupos
experimentais experimentais
NAC
200mg/Kg/dia
PZQ
100mg/Kg/dia
Controle
NAC
PZQ
NAC+PZQ
Administrada do dia Administrado do 45º
subsequente à infecção dia após a infecção
até o 60º diaa.
até o 49º dia
Controle
Grupo 2 (G2)
NAC
Fase
PZQ
intermediária
NAC+PZQ
Administrado do 45º Administrado do 45º
dia após a infecção até dia após a infecção
o 90º diaa.
até o 49º dia
Grupo 1 (G1)
Fase aguda
Controle
Administrado do 45º dia Administrado do 45º
Grupo 3 (G3) NAC
após a infecção até 120º dia após a infecção
Fase crônica
PZQ
diaa.
até o 49º dia.
NAC+PZQ
a
O término do tratamento corresponde ao dia da eutanásia.
O tratamento com a NAC na concentração de 200mg/Kg/dia foi baseado nos trabalhos
de Jones AL e colaboradores (1994) e Yang e colaboradores (1998) envolvendo estudos com
humanos e com animais cirróticos e de Fan e colaboradores (2007) ao estudar o efeito da
NAC na infecção experimental pelo S. japonicum. O esquema terapêutico adotado com o
praziquantel teve por objetivo alcançar a cura parasitológica, desta forma interferindo na
postura diária dos ovos considerado potencial fator fibrogênico. Assim buscamos a
uniformidade do quadro fisiopatológico dos granulomas já instalados podendo mensurar com
maior fidedignidade a ação da NAC como fármaco adjuvante no tratamento da
esquistossomose após terapia especifica.
A NAC (Sigma) foi diluída em solução salina e o PZQ (Sigma) foi suspendido em
Cremophor EL a 2%, ambos administrados por tubagem esofágica. Os animais dos subgrupos
controle, livre de NAC e/ou PZQ, foram submetidos as mesmas condições que os demais
61
subgrupos experimentais. Decorrido o tempo de tratamento de cada grupo, os animais foram
eutanasiados por deslocamento cervical (Martinez et al., 2003).
2.3 Estudo parasitológico
2.4 Recuperação dos vermes
Os vermes foram recuperados por meio da perfusão do sistema venoso portal e veias
mesentéricas de acordo com a técnica Pellegrino e Siqueira (1956) e Duvall e De Witt (1967).
Ao final foi realizada a quantificação dos vermes adultos machos e fêmeas.
2.5 Oograma
Fragmentos intestinais dos animais foram empregados para a avaliação do padrão de
ovoposição através da técnica do oograma. Os ovos encontrados foram contados e
classificados em seus diferentes estágios de desenvolvimento e ovos mortos, segundo critérios
propostos por Pellegrino e colaboradores (1962).
2.6 Estudo histopatológico e morfométrico de tecido hepático
Fragmentos de fígado de cada animal foram fixados em formaldeído a 10%
tamponado em PBS e processados para inclusão em parafina. Posteriormente, realizado cortes
histológicos de 5µm de espessura. Para cada amostra de tecido hepático foram confeccionadas
três laminas histológicas, coradas pelas técnicas de hematoxilina-eosina (HE), picrosirius-red
(PR) e tricrômico de Masson (TM) (Junqueira; Bignolos and Brentani, 1979). Para a análise
do infiltrado inflamatório foram utilizadas as amostras coradas pela técnica de HE. As
colorações de PR e TM foram empregadas para a determinação do grau de fibrose
(classificados em: leve, moderado e intenso, de acordo com o arranjo das fibras de colágeno e
a deposição desta proteína no tecido hepático), mensuração do diâmetro médio dos
granulomas viáveis (com ovo, ou vestígio de ovo central) e do número médio de granulomas
capturados em cinco campos aleatórios (área total de campo = 12.234 μm2, área total
visualizada = 61.170μm2) em amostras histológicas de cada animal por subgrupo. Para
obtenção das imagens das amostras foi utilizado microscópio óptico acoplado a câmera digital
62
e sistema computadorizado com linguagem orientada para leitura de imagem pelo software
Motic Images Plus 2.0 ML®.
2.7 Cultura de células esplênicas
Após término da terapia experimental de cada grupo, os baços dos camundongos
foram retirados de maneira asséptica, e colocados em meio RPMI 1640 para transporte. Em
fluxo laminar os mesmos foram macerados em placas de Petri junto ao meio RPMI 1640
(Sigma Chemical, St. Louis, Mo., USA) complementado com HEPES (10mM), 2mercaptoetanol (0,05mM) 216mg de L-glutamina e antibiótico gentamicina 50mg/L e
posteriormente levados à centrifugação a 4°C por 10 minutos, a 1500 rpm.
Após este procedimento as hemácias foram lisadas pela adição de água estéril ao
precipitado por 18 segundos (1mL/baço). Posteriormente as células foram ressuspendidas em
meio RPMI complementado e mantidas refrigeradas durante cinco minutos para a formação
de grumos. O sobrenadante foi então transferido para outro tubo de ensaio para a realização
de uma nova centrifugação a 4°C por 10 minutos, a 1500 rpm. e o precipitado foi
ressuspendido
em meio RPMI suplementado com 10% de Soro Bovino Fetal (Sigma
Chemical, St. Louis, Mo., USA)
As células foram contadas e avaliadas quanto à viabilidade diluindo-se a suspensão em
Azul de Trypan 0,2%. (1:10) e contando as células em câmara de Newbauer. As células
ressuspendidas foram cultivadas em placas de 48 poços nunca concentração de 5x10 6
células/mL estimuladas por na SEA (20μg/mL). As placas foram incubadas a 37ºC, a 5% de
CO2 e após 24h e 72h coletado os sobrenadantes para posterior análise da produção das
citocinas IL-4, IL-10, INF- γ e Oxido nítrico.
2.7.1 Dosagem de Nitrito
O acúmulo de Nitrito (NO2-) em sobrenadantes de cultura de células de 72 h foi usado
como indicador de produção de NO, determinado pela reação de Griess. Nitrite de sódio foi
utilizado como padrão (1,56 a 50 μM). 50 μL de sobrenadante foi incubado 10 min, ao abrigo
da luz, a temperatura ambiente com 50μL de reagente de Griess (N-[1-naphthyl]ethylenediamine (1mg/mL), sulfanilamide (10 mg/mL), e 5% ácido fosfórico em água
destilada. A absorbância foi medida a 540 nm em leitor de ELISA.
63
2.7.2 Dosagem de Citocinas
Os níveis das citocinas IL-4, IL-10 e INF- γ no sobrenadante das células esplênicas
foram determinados por ELISA sanduiche (Enzyme linked immunosorbent assay). A
produção das citocinas foi determinada utilizando pares de anticorpos e citocina recombinante
da BD seguindo as instruções do fabricante: anti-IL4 (11B11 a 4g/ml) e anti-IL4 biotinilado
(BVD6.24G2, a 1g/ml), anti-IL10 (C252-2A5, a 8g/ml); anti-IL10 biotinilado (SXC1, a
2g/ml)) e anti-INF(XMG 1.2, a 4g/ml) anti-INF biotiniladoN18, a 2g/ml). A reação
foi incubada com streptavidin-peroxidase (Sigma) e revelada utilizando ABTS [(2,2’-azinobis
(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid)] (Sigma Chemical, St. Louis, MO, USA). A leitura foi
determinada a 405 nm. Os resultados são apresentados como as médias aritméticas das
dosagens de culturas em duplicatas de 5-8 animais por subgrupo ± erro padrão.
2.8 Análise Estatística
Foi utilizado o programa GraphPad Prism 3.02 e aplicado o teste de Tukey para
comparar diferenças entre os grupos e subgrupos com nível de significância de 5% (p< 0,05)
para todos os casos.
3 RESULTADOS
3.1 Análise parasitológica
Na tabela 1 encontram-se os dados referente a recuperação de vermes e o padrão de
ovoposição de camundongos infectados pelo S. mansoni, tratados ou não tratados com Nacetilcisteína e/ou Praziquantel. Em todos os grupos, os subgrupos Controle e NAC não
apresentaram diferença significativa no número de vermes adultos. Entretanto, os subgrupos
PZQ e NAC+PZQ nenhum verme foi recuperado atingindo, portanto 100% de eficácia
terapêutica. O padrão de ovoposição mostrou-se normal, não havendo diferença significativa
entre os subgrupos Controle e NAC nos diferentes tempos de tratamento. Entretanto, nos
subgrupos PZQ e NAC+PZQ o oograma apresentou alteração.
64
Tabela 01 - Vermes adultos de S. mansoni recuperados pela técnica de perfusão do fígado e
veias mesentéricas e oograma em camundongos tratados com N-acetilcisteína e/ou Praziquantel
em diferentes fases de infecção.
Grupos
Experimentais
Média de vermes adultos
recuperados
% de ovos por estádios de
desenvolvimento
% de
redução
de
vermes
Imaturos
Maduros
Inviáveis
11,0±2,23 8,0±1,12 19,0±3,28
-
58,12±2,0
33,14±2,2
8,74±0,81
6,75±0,75 6,25±0,94 13,0±1,68
0,0±0,0
0,0±0,0
0,0±0,0
0,0±0,0
0,0±0,0
0,0±0,0
31,58
100,0
100,0
Machos
Fêmeas
Total
G1-60 dias
Subgrupos (n=9)
Controle
NAC
PZQ
NAC+PZQ
59,34±2,35 32,96±2,58 7,69±0,67
0,0±0,0
9,7±1,26
90,3±1,26
0,0±0,0
17,38±3,17 82,63±3,17
G2-90 dias
Subgrupos (n=9)
Controle
NAC
PZQ
NAC+PZQ
9,8±0,73
7,0±0,89
16,8±0,73
-
49,95±2,91 42,23±2,46
7,824±0,67
10,5±0,5
0,0±0,0
0,0±0,0
6,75±1,1
0,0±0,0
0,0±0,0
17,25±1,1
0,0±0,0
0,0±0,0
100,0
100,0
51,46±2,47
0,0±0,0
0,0±0,0
10,48±0,92
0,0±0,0
0,0±0,0
9,75±0,75 6,25±1,54 16,0±1,08
-
51,6±2,12
38,06±1,18 10,34±1,09
11,2±1,74 8,8±1,49 20,0±3,03
0,0±0,0
0,0±0,0
0,0±0,0
0,0±0,0
0,0±0,0
0,0±0,0
100,0
100,0
53,63±3,3
0,0±0,0
0,0±0,0
33,89±2,5
0,0±0,0
0,0±0,0
38,06±1,8
0,0±0,0
0,0±0,0
G3-120 dias
Subgrupos (n=9)
Controle
NAC
PZQ
NAC+PZQ
12,49±1,42
0,0±0,0
0,0±0,0
Notas: Valores expressos em média ± erro padrão
3.2 Análise histopatológica
3.2.1 Fase aguda – 60 dias
Nos subgrupos G1-Controle e G1-NAC foram visualizados no tecido hepático,
granulomas periovulares do tipo exsudativo, caracterizados por intenso infiltrado inflamatório
composto por polimorfonucleares eosinófilos e neutrófilos, além de escassos macrófagos e
linfócitos circundando ovo central em degeneração (figura 7A), sendo distribuídos
predominantemente de modo isolado nos pequenos e grandes espaços-porta. Os subgrupos
G1-PZQ e G1-NAC+PZQ apresentaram granulomas periovulares exsudativos, alguns em
conglomerados devido a coalescência desses granulomas nos espaços-porta, exibindo, alguns
animais, necrose coagulativa central (figura 7B) e focos isolados de hepatite reacional
65
eosinofílica difusa visualizados nos médios e grandes espaços-porta. Ademais, e em todos os
subgrupos a cápsula hepática encontrava-se íntegra.
3.2.2 Fase intermediária- 90 dias
Aos 90 dias após a infecção, independente do esquema terapêutico empregado, as amostras de
tecido
hepático
exibiram granulomas periovulares,
distribuídos nos espaços-porta
isoladamente ou em coalescência, predominantemente do tipo produtivo com margens bemdelimitadas, sendo compostos por macrófagos e alguns linfócitos dispostos em proximidade
ao ovo ou vestígio de ovo central, além de escassos eosinófilos (figuras 7C e 7D). Em alguns
campos microscópicos, foram visualizados granulomas caracteristicamente exsudativos nos
animais dos subgrupos G2-Controle e G2-NAC. Adicionalmente, a cápsula hepática
encontrava-se íntegra e grande quantidade de pigmentação pardo-amarelada, compatível com
pigmento esquistossomótico, foi visualizada nos espaços-porta e no parênquima hepático
(figura 7D).
3.2.3 Fase crônica – 120 dias
Após 120 dias de infecção, as análises histopatológica do tecido hepático dos animais
avaliados apresentaram diferenças consideráveis entre os subgrupos experimentais. Nos
subgrupos G3-Controle e G3-NAC, os granulomas esquistossomóticos foram, em sua
maioria, do tipo produtivo, dispondo-se nos espaços-porta e no parênquima hepático de forma
coalescente ou isolada (figura 7E), exibindo em algumas áreas extenso comprometimento
periportal, decorrente da grande deposição de ovos, ocasionando aumento da vascularização,
hiperplasia de ductos bilíferos e intenso infiltrado inflamatório crônico (fibrose hepática
periportal murina) (figura 7G). Ainda nestes grupos, visualizou-se grande acúmulo de
pigmento esquistossomótico nos espaços-porta e a cápsula hepática encontrava-se íntegra,
embora em alguns animais tenha sido visualizado significativo abaulamento da superfície
externa do fígado devido ao crescimento periférico dos granulomas. Os subgrupos G3-PZQ e
G3-NAC+PZQ apresentavam em sua maioria granulomas do tipo produtivo com evolução
para cicatrização fibrótica, distribuídos isoladamente ou em coalescência nos espaços-porta
(figura 7F).
66
Figura 7 – Fotomicrografias de tecido hepático de camundongos esquistossomóticos nas fases aguda (A e B),
intermediária (C e D) e crônica (E, F e G) da infecção pelo S. mansoni (H.E). A – G1-NAC – granuloma
periovular exsudativo com intenso infiltrado inflamatório composto por neutrófilos e escassos macrófagos e
linfócitos circundando o ovo central em degeneração (400x); B – G1-NAC+PZQ – necrose coagulativa central
em granuloma periovular (200x); C – G2-Controle – granuloma esquistossomótico produtivo de margem bemdelimitada, composto por macrófagos, linfócitos e escassos eosinófilos (400x); D – G2-NAC+PZQ – granuloma
periovular produtivo apresentando menor tamanho que o da figura C e deposição de pigmento esquistossomótico
(seta) (400x); E – G3-NAC – granulomas periovulares isolados ou coalescente (100x); F – G3-NAC+PZQ –
granulomas isolados e nódulos fibróticos exibindo menor tamanho que os observados na figura E (100x); G –
G3-Controle – extensa fibrose proeminente vascularização e hiperplasia dos ductos biliares entre espaços-porta
(fibrose periportal murina (400x).
67
3.3 Análise morfométrica dos granulomas esquistossomóticos
De acordo com a tabela 2 o esquema terapêutico e o tempo decorrido após a infecção
(60, 90 e 120 dias) são fatores que influenciaram na redução do número e no tamanho do
diâmetro médio dos granulomas hepáticos esquistossomóticos.
O número médio dos granulomas em todos os tempos de infecção apresentou
diferença significativa (p < 0.001) entre os subgrupos Controle e NAC quando comparados
aos subgrupos PZQ e NAC+PZQ, com redução percentual variando entre 71,09% (G1-PZQ) e
94,07% (G3-NAC+PZQ) (tabela 2). Entretanto, o subgrupo G1-NAC apresentou redução
percentual no número médio dos granulomas de 43,64%. Porém, tal redução pode ser
justificada pela menor carga parasitária encontrada neste subgrupo (tabela 2).
Com relação ao diâmetro médio dos granulomas esquistossomóticos na fase aguda da
infecção, foi visualizada discreta redução entre os subgrupos G1-NAC e G1-PZQ quando
comparados ao G1-Controle. Apenas o subgrupo G1-NAC+PZQ apresentou diferença
significativa (p < 0.001) quando comparado ao seu respectivo controle (tabela 02). Entretanto,
a análise intragrupo das fases intermediária (G2) e crônica (G3) da infecção, mostrou redução
significativa (p < 0.001) no diâmetro dos granulomas entre todos os subgrupos experimentais
quando comparados ao subgrupo controle. Adicionalmente, a análise intergrupo mostrou que
mesmo havendo uma modulação natural no diâmetro médio do granuloma no decorre da
infecção, o tratamento com NAC e/ou PZQ incrementam de forma significativa essa
modulação, especialmente nos subgrupos G2 (tabela 2 e Figura 7D).
68
Tabela 2 Número e diâmetro médio de granulomas esquistossomóticos em tecido hepático de
camundongos infectados pelo S. mansoni e tratados com N-acetilcisteína (NAC) e/ou Praziquantel
(PZQ) em diferentes fases de infecção.
Granulomas esquistossomóticos
Grupos
experimentais
Número
médio*
% de
redução
Diâmetro
médio**(µm)
% de
Redução
G1-60 dias
Subgrupos (n=9)
Controle
NAC
PZQ
NAC+PZQ
10,38±1,29
5,85±0,55a
3,0±0,63a
1,87±0,35a
43,64
71,09
81,98
340,1±7,73
312,0±14,91
321,1±12,64
293,0±5,08a
8,26
5,58
13,84
G2-90 dias
Subgrupos (n=9)
Controle
NAC
PZQ
NAC+PZQ
13,71±1,71
11,13±1,59
1,22±0,46a
1,25±0,36a
18,81
91,10
90,88
295,1±7,26b
184,1±4,56a,c
176,1±11,62a,d
163,8±7,34a,e
37,61
40,32
44,49
G3-120 dias
Subgrupos (n=9)
Controle
NAC
PZQ
NAC+PZQ
13,0±1,94
12,4±1,69
1,37±0,37a
0,77±0,27a
4,61
89,46
94,07
249,7±11,72b
160,6±6,6a,c
170,7±12,67a,d
154,2±6,4a,e
35,68
31,63
38,24
Notas: Valores expressos em média ± erro padrão
* Número de granulomas em cinco campos aleatórios.
** Diâmetro do granuloma em cinco campos aleatórios.
a
diferença significativa intragrupo com o subgrupo controle (p < 0.001).
b
diferença significativa intergrupo com o subgrupo G1-veículo (p < 0.001).
c
diferença significativa intergrupo com o subgrupo G1-NAC (p < 0.001).
d
diferença significativa intergrupo com o subgrupo G1-PZQ (p < 0.001).
e
diferença significativa intergrupo com o subgrupo G1-NAC+PZQ (p < 0.001).
3.4 Análise do grau de fibrose nos granulomas esquistossomóticos
A tabela 3 mostra a distribuição do grau de fibrose nos granulomas esquistossomóticos
em tecido hepático em diferentes fases da infecção. Na fase aguda, foi evidenciado leve grau
de deposição de fibras colágenas, delicadas, irregulares, fragmentadas, frouxamente
organizadas e distribuídas de
forma
concêntrica
no
perímetro
dos granulomas
esquistossomóticos, em todos os subgrupos estudados (figura 8 A e B). Na fase intermediária
da infecção, o grau de deposição de fibras colágenas variou de acordo com os subgrupos
69
estudados. O subgrupo G2-Controle apresentou 66.6% das amostras de tecido hepático
classificadas com grau de fibrose moderado, sendo visualizada moderada deposição de fibras
colágeno, definidas e organizadas com feixes mais densos e de coloração mais intensa que o
grau leve (figura 8 B e C). No subgrupo G2-PZQ 5 das 9 (55%) amostras de tecido hepático
foram classificados como intensa deposição de colágeno, sendo visualizada fibras colágenas
compactadas e densamente distribuídas de forma periférica e central ao granuloma
esquistossomótico e intensa coloração em azul pelo Tricromico de Masson e vermelho pelo
picrosiruis red (figura 8C e D). Por outro lado, os subgrupos G2-NAC e G2-NAC+PZQ
apresentaram 77.7% das amostras histológicas classificados como grau leve no depósito de
colágeno. Na fase crônica da infecção, observou-se que o grau de fibrose foi de moderado a
intenso no subgrupo G3-Controle (44.4%), intenso no G3-PZQ (66.6%) e eleve no G3-NAC
(55.5%), de leve a moderado no subgrupo G3-NAC+PZQ (44.4%).
Tabela 3 Distribuição do grau de fibrose nos granulomas esquistossomóticos em tecido
hepático de camundongos infectados pelo S. mansoni em diferentes fases da infecção e
tratados com N-aceitlcisteína (NAC) e/ou Praziquantel (PZQ).
Grau de fibrose
Grupos
experimentais
Leve
n (%)
Moderado
n (%)
Intenso
n (%)
G1-60 dias
Subgrupos (n=9)
Controle
NAC
PZQ
NAC+PZQ
8/9 (88.8)
8/9 (88.8)
8/9(88.8)
6/9(66.6)
1/9 (11.1)
1/9 (11.1)
2/9 (22.2)
1/9 (11.1)
1/9 (11.1)
G2-90 dias
Subgrupos (n=9)
Controle
NAC
PZQ
NAC+PZQ
3/9 (33.3)
7/9 (77.7)
1/9 (11.1)
7/9(77.7)
6/9 (66.6)
1/9 (11.1)
3/9 (33.3)
2/9 (22.2)
1/9 (11.1)
5/9 (55.5)
-
G3-120 dias
Subgrupos (n=9)
Controle
NAC
PZQ
NAC+PZQ
1/9 (11.1)
5/9 (55.5)
2/9 (22.2)
4/9 (44.4)
4/9 (44.4)
2/9 (22.2)
1/9 (11.1)
4/9 (44.4)
4/9 (44.4)
2/9 (22.2)
6/9 (66.6)
1/9 (11.1)
70
Figura 8 – Fotomicrografias de tecido hepático de camundongos infectados pelo S. mansoni
empregadas para a classificação do grau de fibrose definida através das colorações
histoquímicas de tricrômico de Masson (lado direito) e picrosirius-red (lado esquerdo), segundo
critérios adotados para as análises histopatológicas. A e B - G1-NAC - leve grau de deposição
de fibras colágenas, delicadas, irregulares, fragmentadas, frouxamente organizadas e
distribuídas de forma concêntrica no perímetro dos granulomas esquistossomóticos (400x); C e
D – G2 – Controle - moderada deposição de fibras colágeno (400x); E e F – G2-PZQ - intensa
deposição de colágeno, sendo visualizada fibras colágenas compactadas e densamente
distribuídas de forma periférica e central ao granuloma esquistossomótico (400X).
71
3.5 Níveis de Citocinas e Óxido Nítrico
Na figura 9 encontram-se expressos os níveis de IL-4, IL-10, NO e INF das culturas
de células esplênicas estimuladas por antígeno solúvel de ovos de S. mansoni.
Em todas as fases da infecção os níveis de IL-4 nos subgrupos NAC foram
semelhantes ao respectivo Controle, mostrando assim que para este modelo experimental a
NAC não exerce influência sobre os níveis desta citocina. Por outro lado, nos subgrupos PZQ
aos 60 e 90 dias após a infecção, ocorreu redução significativa (p<0,001) nos níveis de IL-4.
Entretanto, aos 120 após a infecção níveis mais elevados de IL-4 são produzidos neste
subgrupo (figura 9A).
Com relação a citocina IL-10 foi observada diferença no perfil de resposta dependendo
do tempo de infecção e esquema terapêutico. Aos 60 dias após a infecção os níveis de IL-10
mostraram-se reduzidos em todos os subgrupos estudados (figura 9B). Entretanto, 90 dias
após a infecção ocorreu aumento significativo (p<0,001) da IL-10 nos subgrupos NAC e
NAC+PZQ. Ao passo que, aos 120 dias após a infecção os níveis desta citocina foram
semelhantes ao controle nestes subgrupos. Adicionalmente, os animais tratados com o PZQ
apresentaram uma inversão nos níveis de IL-10, sendo esta negativa aos 90 dias e positiva aos
120 dias após a infecção (figura 9B).
Os animais tratados com NAC e NAC+PZQ apresentaram redução na síntese de NO
em todas as fases de infecção, por outro lado os animais tratados com PZQ apresentaram
níveis semelhantes ao controle (figura 9C). Com relação aos níveis de INF- os subgrupos
tratados com NAC apresentaram redução em todos os tempos de infecção (figura 9D). Por
outro lado, nos animais tratados com PZQ foram observados aumento de INF- aos 60 dias
após a infecção, redução aos 90 e níveis semelhantes ao controle aos 120 dias após a infecção.
72
A
140
IL-4 (pg/mL)
120
100
80
*
60
*
40
20
*
*
60 DIAS
le
N
AC
N PZ
AC Q
+P
ZQ
tro
le
N
AC
N PZ
AC Q
+P
ZQ
C
on
tro
C
on
C
on
tro
le
N
AC
N PZ
AC Q
+P
ZQ
0
90 DIAS
120 DIAS
B
14000
IL-10 (pg/mL)
12000
*
*
10000
*
8000
6000
4000
2000
60 DIAS
AC
P
N
AC ZQ
+P
ZQ
on
t
C
90 DIAS
N
ro
l
e
AC
P
N
AC ZQ
+P
ZQ
N
e
ro
l
C
on
t
N
AC
N PZ
AC Q
+P
ZQ
C
on
t
ro
l
e
0
120 DIAS
C
Óxido nítrico (M)
60
50
40
30
20
*
*
*
*
10
on
t ro
le
N
AC
P
N
AC ZQ
+P
ZQ
C
on
t ro
le
N
AC
P
N
AC ZQ
+P
ZQ
C
C
on
t ro
le
N
AC
P
N
AC ZQ
+P
ZQ
0
60 DIAS
90 DIAS
120 DIAS
D
14000
*
10000
*
8000
*
6000
*
4000
*
2000
60 dias
90 dias
on
t ro
le
N
AC
N PZ
AC Q
+P
ZQ
C
on
t ro
le
N
AC
N PZ
AC Q
+P
ZQ
C
on
t ro
le
N
AC
N PZ
AC Q
+P
ZQ
0
C
IFN gama (pg/mL)
12000
120 dias
.
Figura
9 Níveis de IL4, (A) IL-10
(B), NO (C) e IFN- (D) secretados
por
células
esplênicas
de
camundongos infectados pelo S.
mansoni
tratados
com
Nacetilcisteína
(NAC)
e/ou
Praziquantel (PZQ), eutanasiados
aos 60, 90 e 120 dias após a
infecção. As células foram estimulas
por antígeno solúvel de ovos de S.
mansoni (SEA). Os resultados estão
expressos em média das culturas em
duplicatas de 5-8 animais por
subgrupo ± erro padrão.
*p < 0,001 comparado ao subgrupo
controle.
73
4 DISCUSSÃO
A quimioterapia com o Praziquantel (PZQ) tem se mostrado eficaz na redução da
morbidade e mortalidade esquistossomótica (Ferrari et al., 2003; Doenhoff and PicaMattoccia, 2006). Na atualidade o PZQ é o único fármaco responsável por essa ação, sendo
altamente eficaz contra todas as espécies de Schistosoma com importância em saúde pública.
Mesmo assim, a investigação e desenvolvimento de novas drogas esquistossomicidas é uma
necessidade premente (Albuquerque et al, 2005; Albuquerque et al. 2007; Magalhães et al.
2009; Abdul-Ghani et al. 2009; Magalhes et al. 2010).
Na terapia experimental da esquistossomose mansoni em camundongos a cura
parasitológica com o PZQ esta na dependência do tempo da infecção, do sexo dos vermes, se
estes estão ou não pareados, da dose e da cepa do parasito (You-Sheng et al., 2001; CIOLI;
PICA-MATTOCCIA, 2004). No presente estudo, a dose de 100 mg/Kg/dia de PZQ
administrada durante cinco dias consecutivos, entre o 45º e 49º dias após a infecção conferiu
cura parasitológica de 100% em todos os subgrupos onde o PZQ fazia parte do esquema
terapêutico. Este resultado é semelhante ao de Drescher e colaboradores (1993), cuja
sensibilidade da cepa BH de S. mansoni frente ao PZQ apresentou eficácia de 99,4% com a
dose de 100mg/kg por cinco dias.
Com a descoberta do PZQ e a ocorrência da esquistossomose exclusivamente em
países em desenvolvimento, a indústria farmacêutica pouco tem investido em novas
tecnologias para o desenvolvimento de novos fármacos esquistossomicidas, bem como
drogas capazes de atuarem sobre as alterações fisiopatológicas na esquistossomose.
Na clínica a N-acetilcisteina vem sendo amplamente empregada para tratar uma
variedade de patologias, incluindo a fibrose cística (Tirouvanziam, 2006; Henke and Ratjen,
2007), a doença pulmonar obstrutiva crônica (Kasielski and Nowak, 2001; Henke and Ratjen,
2007), a toxicidade associada às lesões hepáticas (Prescott, 2005) e a cirrose biliar (Mani et al.
2006), além de ter sido empregada para elevar os níveis de glutationa em eritrócitos e
linfócitos melhorando a função das células T em portadores da imunodeficiência adquirida
humana (De Rosa et al. 2000).
A NAC contribui para a síntese da glutationa, um dos desintoxicantes naturais mais
importantes e poderosos no organismo humano, especialmente no fígado (De Flora et al,
1991; Pinho et al. 2005). Possui papel-chave na homeostase celular, visto que a depleção de
glutationa pode causar morte celular devido à peroxidação lipídica e declínio nos níveis de
tiol-proteínas (Reed et al. 1984). A NAC pode atuar diretamente reduzindo os níveis de
radicais superóxidos in vivo e in vitro (Aruoma et al. 1989) e como “varredora” de radicais de
74
peróxido de hidrogênio, ácido hipoclórico e radical hidroxil, assim como inibir a liberação de
TNF-α, a ativação de citocinas pró-inflamatórias e apoptose celular (Pinho et al. 2005).
Na esquistossomose mansoni os ovos são responsáveis pelas manifestações clinicas
mais importantes da doença ao serem retidos na mucosa intestinal ou arrastados pela
circulação sanguinea até o fígado. Inicialmente, o ovo induz a formação de um processo
inflamatório granulomatoso agudo, que se desenvolve ao redor dos mesmos, em decorrência
da eliminação de antígenos do miracídio, chamados genericamente de SEA (Soluble egg
antigens), que estimula células e citocinas específicas (Hang et Al., 1974; Wyler et al., 1978),
favorecendo, assim, a formação de um infiltrado de células inflamatórias, processo que
termina com a formação de uma cicatriz fibrótica no curso mais avançado da infecção (Zilton
2005). Os granulomas são compostos, principalmente, por fibras colágenas, macrófagos,
eosinófilos, linfócitos e plasmócitos em proporções diferentes, variando nos diferentes órgãos
e em função da fase de sua evolução (Pearce and Macdonald 2002) e é coordenado pela
influência de uma rede de mediadores inflamatórios (Wynn et al. 1995; Conlon 2005).
Imunologicamente a esquistossomose mansoni é caracterizada por uma dicotomia na
síntese de interleucinas. No período prepatente é observado aumento das citocinas do tipo Th1
(Wynn et al. 1993), seguido, pelo aumento de citocinas do perfil Th2 logo após a deposição
de ovos do parasito no hospedeiro (Gryzch et al. 1991). Esta mudança de perfil imune
apresenta relação direta com a formação do granuloma, mostrando assim, um importante
papel da imunomodulação pelas citocinas na esquistossomose.
Estudos demonstram que a quimioterapia com o PZQ modula a resposta imune
humoral e celular de indivíduos infectados pelo S. mansoni. Algumas dessas mudanças
conferem uma proteção parcial envolvendo respostas do tipo Th2 (Reimert et al. 2006; Walter
et al. 2006). Entretanto, tem sido sugerido que respostas polarizadas em Th1 ou Th2 são
prejudiciais. Desta forma, é necessário que exista regulação destes perfis para conferir melhor
proteção no curso da infecção (Hoffmann et al. 2000).
Os achados histopatológicos em nosso estudo mostraram que nos animais tratados
com NAC e/ou PZQ houve redução significativa no diâmetro médio dos granulomas
esquistossomóticos hepáticos. Embora o tipo de granuloma predominante entre os subgrupos
Controle e NAC nas diferentes fases de infecção não tenham diferido de forma significativa.
A diminuição no tamanho do granuloma nos animais tratados com a NAC e/ou PZQ pode ser
justificada pelo aumento da IL10. Neste estudo os níveis de IL-10 foram bem reduzidos aos
60 dias após a infecção. Estudos em seres humanos e camundongos infectados pelo
Schistosoma indicam níveis mais elevados da IL-10 nas fases mais avançada da infecção
75
esquistossomótica (Bosshardt et al. 1997; Wynn et al. 1993; Montenegro et al. 1999; Van Den
Biggelaar et al. 2000). Este fato foi evidenciado neste estudo nas fases intermediária (90 dias)
e crônica (120 dias) da infecção. Aos 90 dias após a infecção os subgrupos tratados com NAC
e NAC+PZQ apresentaram altos níveis de IL-10, sugerindo que neste grupo a NAC tenha
apresentado efeito sobre a regulação desta citocina. Este resultado está de acordo com
trabalhos que mostram que a administração de IL-10 leva a redução do tamanho do
granuloma enquanto o inverso é observado em animais deficientes em IL-10 e infectado com
S. mansoni (De'broski et al. 2008). Ademais, essa citocina exerce um papel essencial no
processo de imunomodulação que ocorre na fase crônica da infecção esquistossomótica
(Flores Villanueva et al., 1994; Sadler et al. 2003). A presença de IL-10 em pacientes com
hepatoesplenomegalia tem sido considerada benéfica (Montenegro et al. 1999; Alves-Oliveira
et al. 2006).
A IL-10 regula a produção de várias citocinas pró-inflamatórias, sendo considerada
um inibidor da síntese de IFN-γ. No presente estudo, os níveis de INF- nos subgrupos
tratados com a NAC apresentaram redução em todos os tempos de infecção. Recentemente
Martins-Leite e colaboradores (2008) demonstraram que indivíduos infectados pelo S.
mansoni e tratados com PZQ, mas que ainda apresentavam fibrose tinham um perfil de baixa
produção de IFN- e elevada produção de IL-13. Sendo esta última citocina destacada como
importante marcador da morbidade nestes pacientes. Ainda neste trabalho os autores também
observaram uma correlação negativa entre presença de IL-10 e fibrose antes e após
tratamento.
Pirrho e colaboradores (2003) demonstraram que camundongos infectados com S.
mansoni e tratados com Dexametasona apresentaram redução no tamanho dos granulomas e
deposito de colágeno, associando este fato à redução de IFN-, IL-12 e IL-4 e aumento da
produção de IL-10. Hoffmann e colaboradores (2000) também observaram a participação da
IL-10 em camundongos knockout para esta citocina e infectados pelo S. mansoni os quais
manifestaram respostas Th1 e Th2 mistas e elevadas, com grande proliferação de linfócitos,
maior número de células produtoras de IFN- e IL-4 e grande ampliação do quadro
inflamatório, mostrando que a IL-10 é fundamental para o controle da polarização excessiva
tanto das respostas Th1 quanto Th2, o que limita de forma significativa os danos causados
pela intensa inflamação decorrente destas polarizações. De'Broski e colaboradores (2008)
demonstraram que animais tratados com anti-IL-10 tem aumento da produção de IL-4, IFN-,
76
TNF e IL-17, com conseqüente aumento de granuloma hepático e exacerbação do dano
hepatocelular.
Neste modelo experimental, todos os subgrupos onde a NAC fazia parte do esquema
terapêutico adotado os níveis de óxido nítrico foi significativamente reduzidos. Sugerindo
influencia da ação da NAC como agente removedor de radical livre (NO) causado pelo
estresse oxidativo na esquistossomose mansoni. Fan e colaboradores (2007) também
observaram redução nos niveis de NO em camundongos infectados com S. japonicum e
tratados com NAC. Halliwell e Gutteridge (2007) sugerem que a redução dos niveis de NO
pela NAC seja por sua atuação como scavenger direto de NO e peroxinitrito e também pela
redução dos níveis de IFN- e aumento na síntese de IL-10, dados semelhante aos nossos
resultados.
Talaat e colaboradores (2007) ao estudarem pacientes infectados pelo S. mansoni, não
encontraram diferenças entre os níveis de IL-4 entre os indivíduos com diferentes graus de
fibrose e nem entre eles e os indivíduos portadores da forma clínica intestinal. Morais e
colaboradores (2002) ao avaliarem os níveis de IL-4 estimulados por SEA e SWAP de
portadores da esquistossomose mansoni, concluem que não há diferença entre os indivíduos
controle e os portadores da forma clínica aguda e crônica da infecção. Em nosso estudo a
NAC parece não afetar a síntese de IL-4, visto que em todos os subgrupos níveis semelhantes
aos respectivos controles foram observados. Por outro lado a administração do PZQ regulou
negativamente a síntese desta citocina IL-4 aos 60 e 90 dias e positivamente aos 120 dias após
a infecção.
A fibrose é o resultado mais temível das doenças crônicas que afetam o fígado (Zilton,
2005). A fibrose hepática é caracterizada pelo acúmulo de matriz extracelular fibrótica, cuja
presença danifica a arquitetura e funções hepáticas. No presente estudo a administração da
NAC foi capaz de atuar sobre a síntese de colágeno, reduzindo o depósito desta proteína sobre
o tecido hepático e o grau de fibrose nos granulomas esquistossomóticos. Segundo Makoto
Segawa e colaboradores (2002) a diminuição no grau de fibrose pode ser explicada pelo fato
da NAC estar suprimindo o gene promotor de colágeno a2, diminuindo assim sua síntese.
Outra proposta para tal redução seria a capacidade da NAC em inativar parcialmente o fator
nuclear kappa B (NFKB), o qual está implicado na ativação das células estreladas (Schereck
et al, 1992). Em lesões agudas ou crônicas a célula estrelada de Ito, célula-chave na
fibrogênese, sob influência de citocinas fibrogênicas, (TGF-β, TNF-α, PDGF e outras), se
diferencia em miofibroblasto e fibroblasto, se engajando na síntese dos elementos da matriz
77
(colágenos, elastina, proteoglicanos e proteínas de constituição) (Geerts et al. 1994, Geerts
2001, Ramadori e Sail, 2002).
O tratamento com antioxidantes, inclusive a NAC tem mostrado atenuar fibrose
intersticial em vários processos patológicos (Poli; Parola, 1997; Zafarullah et al., 2003).
Perreira-Filho e colaboradores (2008) evidenciaram em fígado de animais cirróticos,
induzidos por tetracloreto de carbono que a NAC confere proteção contra a fibrose hepática e
estresse oxidativo, observando redução de 400% no depósito de colágeno, no grau de fibrose
classificada como leve a moderada, nos níveis de glutationa peroxidase e menor expressão da
iNOS quando comparado com o grupo controle sem tratamento.
Além da cura parasitológica na esquistossomose, o reparo das alterações hepáticas
provocadas pelo processo granulomatoso é desejável. De acordo com os nossos resultados a
NAC e a associação NAC+PZQ levou a uma redução da morbidade em camundongos
experimentalmente infectados pelo S. mansoni, uma vez evidenciada a redução no tamanho
dos granulomas hepáticos. Além disso, estes granulomas apresentaram uma menor deposição
de fibra de colágeno o que pode proporcionar uma menor hipertensão portal e fibrose hepática
e por consequência a não levaria a angiogênese. Também foi evidente que o tratamento com a
NAC levou a uma redução significativa nos níveis de INF-γ e NO e um aumento de IL-10,
citocina hoje considerada como chave para o desenvolvimento de um curso mais ameno da
esquistossomose mansoni. Concluindo que a NAC neste modelo experimental através da
modulação imunopatologica atenuou o dano ao tecido hepático de camundongos
esquistossomóticos.
78
CONCLUSÕES
“O desejo cumprido regozija a alma.”
Provérbios 13:19
79
CONCLUSÕES
Diante dos resultados apresentados, podemos concluir que:
● A NAC não apresenta atividade esquistossomicida, não altera o padrão de
ovoposição e não tem influencia sobre o número médio de granulomas esquistossomóticos
distribuídos em tecido hepático de camundongos infectados pelo S. mansoni.
● No esquema terapêutico adotado a administração do PZQ resultou em 100% de
eficácia sobre os vermes adultos, e na diminuição do número médio de granulomas
esquistossomóticos distribuídos em tecido hepático de camundongos infectados pelo S.
mansoni.
● O modelo experimental adotado mostrou que há regressão natural no tamanho dos
granulomas esquistossomóticos no curso da infecção, e que no esquema terapêutico
empregado a NAC, PZQ e NAC+PZQ incrementaram esta regressão conduzindo a um
processo patológico ameno.
● Neste modelo experimental a fibrose hepática esquistossomótica parece ser
modulada pela NAC, a qual favoreceu a diminuição do grau de fibrose nos granulomas
esquistossomóticos.
● A NAC e associação NAC+PZQ parece modular a resposta imunopatológica em
camundongos infectados pelo S. mansoni ao conduzir aumento nos níveis de IL-10 e redução
nos níveis de NO e INF-.
80
REFERÊNCIAS
"Não basta conquistar a sabedoria, é preciso usá-la."
Cícero
81
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100
ANEXO
“A valentia não é apenas uma virtude,
mas a forma que adotam todas as virtudes nos momentos de prova.”
C. S. Lewis
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