CONTENDO ANTIBIÓTICO para Utilização em Regeneração

AVALIAÇÃO DE MEMBRANAS DE POLI(3-HIDROXIBUTIRATO)
CONTENDO ANTIBIÓTICO PARA UTILIZAÇÃO EM
REGENERAÇÃO TECIDUAL GUIADA
Marcio A. C. Silva1, Marysilvia M. F. Costa1, Rossana M.S.M. Thiré1*
1
Laboratório de Biopolímeros, Programa de Engenharia Metalúrgica e de Materiais - COPPE - Universidade
Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro (RJ), Brasil
E-mail: [email protected]
Resumo. A periodontite é a inflamação dos tecidos periodontais e leva à deterioração dos tecidos que dão
suporte ao dente. A técnica de Regeneração Tecidual Guiada (RTG) pode ser utilizada para a reconstrução do
periodonto. Esta técnica faz uso de membranas de barreira que evitam o crescimento epitelial para o local da
ferida. Além disso, as membranas de RTG também podem ser utilizadas em sistemas para liberação de
antibióticos para proteger o defeito de infecções oportunistas. Recentemente, tem sido crescente o interesse na
utilização de membranas constituídas por polímeros biodegradáveis, assim como o poli(3-hidroxibutirato) PHB, a fim de evitar a necessidade de um segundo procedimento cirúrgico para a remoção da membrana. O
PHB é um poliéster microbiano, biodegradável e biocompatível com uma grande variedade de células animais.
O objetivo deste trabalho foi produzir e caracterizar membranas periodontais absorvíveis de PHB contendo o
metronidazol. Este fármaco é um coadjuvante que possibilita um resultado mais satisfatório do que o tratamento
mecânico exclusivo. Membranas de PHB contendo 2% de fármaco e 20% de citrato de etila (plastificante) foram
fabricadas via moldagem por compressão. Essas membranas foram submetidas a ensaios de liberação de
fármaco em solução tampão de acetato de potássio a pH 5,0 e analisadas ao longo do tempo por ensaios de
tração e microscopia eletrônica de varredura (MEV). A quantidade de metronidazol liberada foi quantificada
por espectrofotometria UV-Vis. Os resultados obtidos mostraram que houve aproximadamente 100% de
liberação do fármaco após cinquenta dias. A análise da cinética de liberação do fármaco indicou a difusão
fickiana como mecanismo dominante para transferência de massa. Ensaios de tração mostraram que as
membranas mantiveram a integridade mesmo após a liberação do fármaco. Desta forma, pode-se concluir que
os filmes de PHB carregados com metronidazol apresentam propriedades desejáveis para utilização como
membranas de RTG.
Palavras-chave: poli(3-hidroxibutirato), metronidazol,
membrana periodontal, liberação de fármaco
1.
regeneração
tecidual
guiada,
INTRODUÇÃO
A periodontite é a inflamação dos tecidos periodontais. A lesão periodontal tem seu
início no acúmulo de placa bacteriana. Essa inflamação promove a perda precoce dos
elementos dentários por deterioração dos tecidos que dão suporte ao dente. A técnica de
Regeneração Tecidual Guiada (RTG) pode ser utilizada para a reconstrução do periodonto
[Magini, 2009]. Esta técnica envolve a colocação de uma membrana de barreira entre o dente
e o tecido conjuntivo gengival, a fim de evitar o crescimento epitelial para o local da ferida,
permitindo assim a formação de estruturas funcionais. Essas membranas podem ser
bioabsorvíveis ou não-bioabsorvíveis. Apesar dos resultados clínicos serem semelhantes entre
membranas bioabsorvíveis e não-bioabsorvíveis, as membranas bioabsorvíveis apresentam a
vantagem de evitar um segundo procedimento cirúrgico para a remoção da membrana [Costa
e Thiré, 2011].
O PHB é um poliéster microbiano, biodegradável e biocompatível com uma grande
variedade de células animais [Shishatskaya, 2008]. Por isso, é um material interessante para a
confecção de membranas para RTG. No entanto, é necessário acrescentar aditivos, assim
como plastificantes, aos filmes de PHB a fim de aumentar a sua ductilidade.
O fármaco metronidazol é um coadjuvante que, quando aplicado ao tratamento das
lesões periodontais, possibilita um resultado mais satisfatório do que o tratamento mecânico
exclusivo [Griffiths, 2000]. Sendo assim, este fármaco é utilizado na confecção de algumas
membranas [Tatakis, 1999].
A tecnologia de liberação controlada de fármacos busca resolver inúmeros problemas
associados à administração tradicional dos princípios ativos por meio da regulação da taxa e
da localização espacial de liberação do agente. Os sistemas de liberação controlada
proporcionam, por um longo período de tempo, efeitos terapêuticos que só poderiam ser
alcançados após múltiplas administrações pelas formas convencionais [Costa e Thiré, 2011].
O objetivo deste trabalho foi estudar a liberação “in vitro” do metronidazol contido em
membranas de PHB visando a sua aplicação em RTG.
2
MATERIAIS E MÉTODOS
As membranas periodontais foram confeccionadas em PHB, fornecido pela PHB Industrial
S/A (Biocycle 1000®, lote 141), contendo o fármaco Metronidazol e o plastificante citrato de
etila, ambos P.A. e adquiridos da Sigma-Aldrich. O fármaco (2% p/p) e o plastificante (20%
p/p) foram adicionados ao PHB por meio de agitação manual. Os filmes foram produzidos
pelo processo de moldagem por compressão. Para os ensaios de liberação de fármaco e de
tração foram produzidos corpos de prova retangulares nas dimensões de 8 mm X 100 mm x
0,284 mm (L x C x E).
A avaliação morfológica dos filmes foi realizada por microscopia eletrônica de
varredura (MEV) em um equipamento JEOL JSM (modelo 6460 LV). As amostras foram
recobertas com uma fina camada de ouro obtida por pulverização a vácuo (20 mA por 2 min)
e observadas a 10 kV. Também foi utilizada microscopia ótica em um microscópio Olympus
(modelo GX71).
Os ensaios de liberação do metronidazol foram realizados com base nos
procedimentos descritos por Shifrovitch et al. (2008). As amostras foram colocadas em tubos
Falcon contendo 15 ml de solução tampão acetato de potássio pH 5,0.
Os tubos foram
mantidos a 37˚C em agitação orbital de 120 rpm. Foram coletadas amostras de 1,5 ml da
solução tampão acetato de potássio do interior dos tubos ao longo de 48 dias. Após a coleta de
cada amostra, o nível de solução dentro do tubo foi completado com o mesmo volume de
solução tampão [Shifrovitch, 2008]. A concentração do fármaco na amostra coletada foi
determinada por espectrofotometria UV-Vis com base na curva padrão do metronidazol obtida
no comprimento de onda de 320 nm. Esse comprimento de onda foi escolhido por ser aquele
no qual o metronidazol apresentou o maior pico de absorção, Fig. (1).
Acetato pH 5
1,4
1,2
Absorbância (A)
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
-0,2
200
250
300
350
400
450
Comprimento de Onda (nm)
Figura 1 - Varredura do espectro UV (200-450 nm) para o fármaco metronidazol em meio
tampão acetato de potássio a pH 5,0.
Para eliminar o erro produzido pela diluição da solução por inserção de solvente um
fator de correção foi aplicado à concentração da amostra, conforme apresentado na Eq. (1)
[Shifrovitch, 2008]:
Fator de correção= (15/(15-1,5))(n-1),
Equação (1)
onde n é o número sequencial da amostra, 1,5 é o volume em mililitros da alíquota retirada e
15 é o volume total do tubo em mililitros.
Para a avaliação da manutenção da integridade das membranas corpos de prova foram
submetidos a ensaios de tração antes e depois da liberação de fármaco. Os corpos de prova
foram cortados com as dimensões de 0,80 cm X 10 cm, conforme a Norma ASTM D882-91
[D882-91, 1991]. Os ensaios de tração foram conduzidos numa máquina universal de testes,
INSTRON (modelo 5582), utilizando uma cela de carga de 1 KN. A velocidade do travessão
foi de 0,5 mm/min. Os resultados foram apresentados como médias de todos os ensaios
efetuados para cada uma das amostras.
3
3.1
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Análise morfológica
Os filmes de PHB carregados com metronidazol apresentaram espessura média de (284 ± 29)
μm. Em uma análise por microscopia ótica, o fármaco mostrou-se bem distribuído pela
matriz, sem a formação de agregados. Os cristais de metronidazol apresentaram comprimento
médio do eixo maior de (3,29 ± 2,37) μm (Fig. (2a)). Em função da diferença de foco, foi
possível inferir que o fármaco estava também distribuído no interior do filme.
Pelas imagens de microscopia eletrônica de varredura (MEV), os cristais do fármaco
presentes na superfície da membrana podem ser visualizados em detalhes (Fig. (2b)).
Observa-se que as membranas produzidas com (Fig. (2b)) e sem fármaco (Fig. (2c)) são
densas.
Figura 2 - Micrografias dos filmes de PHB contendo metronidazol. Imagem de Microscopia
ótica da membrana contendo metronidazol (a). Imagens de MEV da membrana de PHB (b)
contendo metronidazol e (c) sem fármaco.
3.2
Cinética de Liberação do Fármaco
A Fig. (3) mostra o perfil de liberação de metronidazol a partir de membranas de PHB
imersas em solução tampão com pH 5,0 a 37°C, simulando um ambiente de inflamação.
Os resultados obtidos mostraram que houve aproximadamente 100% de
liberação do fármaco após cinquenta dias. É possível inferir também que mais de 50% do
fármaco inicialmente contido no corpo de prova foi liberado após 1,5 dias.
Levando-se
em consideração a concentração mínima inibitória (MIC) para este fármaco contra o patógeno
Porphyromonas gingivalis descrita na literatura como sendo de 0,122 µg/ml [Poulet, 1999],
podemos afirmar que uma membrana assim produzida seria eficaz contra esse patógeno já a
partir da primeira hora após a sua implantação, uma vez que, de acordo com a Fig. (3a), neste
período, já teriam sido liberados para o meio 0,12 mg/ml de metronidazol. Podemos notar
também que a liberação do fármaco para o meio parece ter atendido a dois comportamentos
distintos, uma fase inicial de liberação rápida e uma fase tardia de liberação mais lenta. O
ponto da curva que divide esses dois comportamentos localiza-se em 80% do fármaco
liberado, o que ocorreu por volta do nono dia do ensaio. A primeira etapa pode estar associada
à liberação dos cristais de metronidazol adsorvidos na superfície do filme.
A
B
120
0,40
100
0,35
80
0,25
Liberacao (%)
ConcMed (mg/ml)
0,30
0,20
0,15
0,10
60
40
20
0,05
0,00
0
-0,05
0
10
20
30
Tempo (Dias)
40
50
0
10
20
30
40
50
Tempo (Dias)
Figura 3 - Liberação acumulada de metronidazol a partir de membranas de PHB . (a)
liberação mássica do fármaco. (b) liberação percentual do fármaco.
Para que se possa afirmar que há difusão do fármaco pela matriz polimérica do filme
de PHB algumas condições precisam estar presentes [Higuchi, 1961]:
1. A concentração inicial na matriz precisa ser muito maior do que o limite de solubilidade
do fármaco.
2. As dimensões das partículas de fármaco precisam ser menores do que as dimensões do
filme de PHB.
3. Inchamento e dissolução da matriz do polímero devem ser desprezíveis.
4. A difusão do fármaco deve ser constante.
5. O filme deve estar perfeitamente mergulhado no meio.
Como forma de checar se a liberação do fármaco atende à Lei de Fick utilizamos a
equação de Higuchi, Eq (2):
Mt=kt(1/2),
Equação (2)
onde Mt é a quantidade de fármaco liberada no tempo t e k é a taxa constante [Higuchi, 1961].
No caso da reta definida pelo gráfico traçado por essa equação possuir inclinação igual
ou superior a 1 dizemos que a liberação segue uma difusão Fickiana. Para aqueles sistemas
que se desviam da equação de Higuchi a relação de Korsmeyer-Peppas (Eq. (3)) pode mostrar
a adequação à Lei de Fick [Korsmeyer, Peppas, 1983].
Mt/Minf=ktn,
Equação (3)
onde (Mt/Minf) é a fração de fármaco liberada no tempo t, k é a constante referente ao sistema
matriz / fármaco. O n é um parâmetro que varia com o mecanismo de liberação. Se o n é 0,5
ou menos o mecanismo de liberação segue a difusão fickiana, se está entre 0,5 e 1 então segue
uma transferência de massa não fickiana.
O gráfico gerado pela equação de Higuchi para o sistema proposto pode ser visto na
Fig. (4). Embora a inclinação da reta definida pela regressão linear da curva do gráfico seja de
12,5. O coeficiente de correlação (r2) é de 0,80 mostrando que a equação de Higuchi não
descreve bem o perfil de liberação do metronidazol.
Figura 4 - Curva da liberação de fármaco traçada segundo a equação de Higuchi.
No entanto, traçando o gráfico liberação do fármaco versus tempo pela equação de
Korsmeyer-Peppas (Eq. (3)), o coeficiente de correlação (r2) de 0,96 indica um
comportamento muito mais próximo ao linear, Fig. (5). Uma vez que o coeficiente angular n
tem o valor de 0,2, é possível afirmar que a transferência de massa segue o modelo de difusão
Fickiana.
Figura 5 - Curva da liberação de fármaco traçada segundo a equação de Korsmeyer-Peppas.
3.3
Avaliação da Integridade da Membrana
Os corpos de prova foram avaliados quanto à sua integridade estrutural antes e após o ensaio
de liberação de fármaco. Os valores de módulo de elasticidade, tensão máxima e alongamento
na ruptura das amostras foram obtidas por meio de ensaios de tração, Fig. (6). Os resultados
obtidos demonstraram que as condições nas quais o ensaio de liberação de fármaco foi
conduzido levaram a uma redução pouco significativa de suas propriedades após 48 dias.
A
C
B
6
1,8
1,0
1,4
Tensao Max (MPa)
E (MPa)
Alongamento na Ruptura (%)
1,6
0,8
0,6
0,4
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
5
4
3
2
1
0,2
0,0
0,0
Antes
Depois
0
Antes
Depois
Antes
Depois
Figura 6 - Propriedades mecânicas dos corpos de prova antes e após do ensaio de liberação de
fármaco (48 dias). (a) Módulo de Elasticidade. (b) Tensão Máxima. (c) Alongamento na
Ruptura.
4.
CONCLUSÕES
O ensaio de liberação do fármaco mostrou que o metronidazol liberado para o meio
alcança rapidamente altos níveis já na primeira hora. Possivelmente, esse regime de rápida
liberação inicial deve-se, possivelmente, aos cristais adsorvidos à superfície dos filmes. Já o
segundo regime de liberação do fármaco é regido pela transferência de massa por difusão
segundo a lei de Fick e será responsável pela manutenção dos níveis de fármaco na ferida em
uma etapa mais tardia da cicatrização.
As membranas precisam manter sua resistência mecânica para funcionar como
proteção à ferida, caso contrário o tratamento pode falhar independentemente do fato dela ter
sido competente em manter o local da regeneração livre de patógenos agressivos. Como as
membranas testadas nesse trabalho tiveram pouca alteração em suas propriedades mecânicas,
mantendo assim sua integridade estrutural, podemos indicar esse material como uma boa
alternativa para a produção de membranas periodontais de barreira.
REFERÊNCIAS
Costa, M.F. e Thiré, R.M.S.M. (2011), “Materiais Poliméricos”, in Biomaterias em Odontologia: princípios,
métodos investigativos e aplicações, J.M. Granjeiro e G.D.A. Soares (eds.), V. 2, VM Cultural, São Paulo.
D882-91, ASTM. (1991). ASTM D882-91 - Standard Test Methods for Properties of Thin Plastic Sheeting.
ASTM. 1991
Griffiths, G. S., et al., Journal of Clinical Periodontology. (2000), Vol. 27, pp. 910-917.
Higuchi, T., J. Farm. Sci. (1961), Vol. 50, pp. 874-875.
Korsmeyer, R. W.; Gurny, R.; Doelker, E. M.; Buri, P.; Peppas, N. A. Int. J. Pharm. (1983), Vol. 15, pp. 25–35
Magini, Ricardo de Souza, Publicação Eletrônica em Reabilitação Oral.(2009) [Online].
Poulet, PP, et al. Journal of Clinical Periodontology. (1999), Vol. 26, pp. 261-263
Shifrovitch, Yael, et al. Journal of Periodontology. (2009) pp. 330-337.
Shishatskaya, et al. J. Mater. Sci.: Mater. Med.. (2008), Vol. 19, pp. 2493–2502.
Tatakis, D. N., Promsudthi, Ananya and Wikesjö, Ulf M. E. Periodontology 2000. (1999), Vol. 19, pp. 59-73.
EVALUATION OF A POLY (3-HYDROXYBUTYRATE) MEMBRANE
LOADED WITH ANTIBIOTIC FOR USE IN GUIDED TISSUE
REGENERATION
Marcio A. C. Silva1, Marysilvia M. F. Costa1, Rossana M.S.M. Thiré1*
1
Laboratory of Biopolymers, Program of Metallurgical and Materials Engineering - COPPE - Federal University
of Rio de Janeiro, Rio de Janeiro (RJ), Brazil
E-mail: [email protected]
Abstract. Periodontitis is the inflammation of periodontal tissues and leads to deterioration of the tissues that
support the tooth. The technique of Guided Tissue Regeneration (GTR) may be used for reconstruction of the
periodontium. This technique uses barrier membranes to prevent epithelial growth to the wound site. Membranes
of GTR also can be used in systems for the release of antibiotics to protect the defect of bacterial invasion.
Recently, there has been a growing interest in using membranes consisting of biodegradable polymers, like poly
(3-hydroxybutyrate) - PHB in order to avoid the need of a second surgical procedure to remove the membrane.
PHB is microbial polyester, biodegradable and biocompatible with a wide variety of animal cells. The objective
of this work was to produce and characterize periodontal absorbable membranes of PHB containing
metronidazole. This drug is an adjuvant that allows a more satisfactory result than the mechanical treatment
solely. PHB membranes containing 2% drug and 20% ethyl citrate (plasticizer) were produced via compression
molding. “In vitro” release studies were conducted in potassium acetate buffer pH 5.0 at 37ºC. The quantity of
metronidazole released was quantified by UV-Vis spectrophotometer. The samples were also analyzed by tensile
tests and optical and scanning electron microscopes (SEM). The results showed that approximately 100% of
antibiotic released from PHB membrane after fifty days. The analysis of the kinetics of drug release indicated
Fickian diffusion as dominant mechanism. Tensile tests have shown that membranes maintained their integrity
even after the drug release. Thus, it can be concluded that the films of PHB loaded with metronidazole have
potential to be used as membranes for RTG.
Keywords: poly(3-hydroxybutyrate), metronidazole, guided tissue regeneration, periodontal
membrane, drug release