Determinação dos níveis de imunidade humoral induzidos pela

RPCV (2005) 100 (553-554) 75-84
2 % 6 ) 3 4 ! 0 / 2 4 5 ' 5 % 3 !
$%
#)Ÿ.#)!36%4%2).¸2)!3
Determinação dos níveis de imunidade humoral induzidos pela vacinação
contra a Esgana e a Parvovirose Caninas
Determination of humoral immunity levels elicited by vaccination against
Canine Distemper and Parvovirus
C. Almendra1, O. Pinto1, L. Carmichael2, L. Tavares1*
1
Laboratório de Virologia e Imunologia, Centro de Investigação Interdisciplinar em Sanidade Animal (CIISA), Faculdade de Medicina Veterinária,
Universidade Técnica de Lisboa, Pólo Universitário do Alto da Ajuda, Av. da Universidade Técnica de Lisboa – 1300-477 LISBOA
2
NYSCVM, Cornell University, Ithaca, NY USA
Resumo: A vacinação dos animais de companhia é um dos temas
mais discutido internacionalmente pela comunidade científica.
Assuntos controversos como a revacinação anual e a eficácia/
segurança vacinal justificam a recolha de informação rigorosa,
coerente e exaustiva. Esta informação é essencial para avaliar os
protocolos vacinais e conhecer quais os factores que têm maior
importância na optimização de estratégias imunitárias antivirais. Em Portugal, a vacinação contra a Esgana e a Parvovirose
Caninas é bastante frequente mas desconhece-se qual o grau de
protecção que esta confere. A resposta imunitária humoral contra
estes dois vírus foi avaliada em 780 soros de animais vacinados,
utilizando dois testes serológicos, Seroneutralização e Inibição
de Hemaglutinação. A quantificação de anticorpos revelou que,
na maioria dos casos, existe uma resposta adequada para ambos
os vírus (76%), embora no caso da Esgana as falhas de imunidade (22%) sejam muito mais frequentes do que na Parvovirose
(2%). Nos animais adultos verificámos que os níveis de protecção foram idênticos tanto para animais vacinados anualmente
como para animais vacinados há mais de um ano. O sexo, raça
ou idade, não afectaram o grau de protecção, mas este diferiu
significativamente em relação à vacina utilizada. Nos animais
jovens as características individuais também não afectaram de
forma significativa o estabelecimento de imunidade. Variáveis
como o número de inoculações, a associação de antigénios ou
a idade a que se inicia/termina o protocolo vacinal, também
não foram associadas a diferenças significativas nos níveis de
imunidade. Nos animais primovacinados a vacina utilizada foi a
variável que mais influenciou o nível de anticorpos. Os nossos
resultados indicam que a determinação dos níveis de imunidade
humoral é muito útil para identificar situações de susceptibilidade em animais vacinados e para adequar os protocolos vacinais
individualmente.
Summary: The vaccination of companion animals is one of the
issues most debated by the international scientific community.
Controversial subjects such as annual revaccination and vaccine
efficacy/safety, require the collection of rigorous, coherent and
exhaustive information. This type of information is essential to
evaluate the different vaccination protocols and to identify the
most important variables in the optimization of immune strategies. In Portugal, although vaccination against Canine Distemper
and Parvovirus is common, the degree of protection it confers is
not known. The immune response against these two viruses was
* Correspondência: Tel 213652800 – Fax 213652824 e-mail:
[email protected] / [email protected]
assessed in 780 sera from vaccinated animals by two serological tests (Seroneutralization and Hemagluttination Inhibition).
The quantification of antibodies revealed that, in the majority
of the cases, an adequate response exists for both viruses (76%).
However, immunity failures occurred more frequently against
distemper (22%) than against parvovirus (2%). In adult dogs,
protection levels obtained were identical for animals vaccinated
annually and for those vaccinated at intervals greater than one
year. Sex, breed or age, did not influence the degree of protection, but this differ significantly in relation with the vaccine used.
In young animals, the individual characteristics did not affect the
establishment of immunity either. Variables such as the number
of inoculations, antigen association, or the age when the vaccination program starts/finishes, did not interfere significantly with
the protection levels obtained. The vaccine type influenced the
antibody levels in young animals. Our results show that the determination of humoral immunity levels is very useful to identify
susceptibility in vaccinated animals and to individually adjust
the vaccination protocols.
Introdução
Actualmente, a vacinação dos animais de companhia
é objecto de grande controvérsia nos meios médico-veterinários. Os assuntos relacionados com este procedimento médico: duração de imunidade e necessidade de
revacinação anual, eficácia e segurança vacinal, protocolos utilizados e avaliação de risco, utilização de novas
vacinas, entre outros, têm sido largamente debatidos,
quer pela comunidade científica internacional, quer por
clínicos, proprietários e pela indústria farmacêutica.
Frequentemente, como resultado destes debates, tornase evidente a escassez da informação que fundamente e
esclareça estas questões. A necessidade de conhecer de
forma objectiva e rigorosa os protocolos de vacinação
utilizados e a protecção que eles conferem, impele os
cientistas a investigar estes problemas.
Num trabalho anterior (Almendra et al., 2000), alertámos para a importância da avaliação da imunidade
antiviral em canídeos e para as vantagens da utilização de testes serológicos para servir este fim. Tendo
por objectivo a recolha de dados científicos que per75
Almendra, C. et al.
mitissem conhecer a imunidade humoral induzida pela
vacinação na nossa população canina, procedemos à
avaliação serológica referente à Esgana e à Parvovirose Caninas. Em Portugal, estas duas doenças infecciosas continuam a ter um grande impacto na saúde dos
nossos animais. Embora a vacinação tenha reduzido
bastante a sua prevalência, é do conhecimento geral
(embora insuficientemente documentado por estudos
epidemiológicos) que elas continuam a afectar um
grande número de animais e que os respectivos agentes etiológicos, Vírus da Esgana Canina (Canine Distemper Virus – CDV) e o Parvovírus Canino (Canine
Parvovirus - CPV) continuam presentes na população
de cães. A resposta imunitária à vacinação pode não
conferir uma protecção eficaz e esta pode apresentar
grandes variações nos diferentes membros de uma população. A quantificação de anticorpos é o método mais
utilizado internacionalmente para determinar o estado
imunitário de animais vacinados e a eficácia vacinal
dos protocolos utilizados. Vários estudos apontam para
uma boa correlação entre a imunidade humoral e a protecção antiviral, isto é, os níveis de anticorpos são bons
indicadores da capacidade de resistência anti-viral do
animal vacinado (Greene,1998, Tizard e Ni, 1998).
Por outro lado, a vacinação, apesar de fundamental,
não é um procedimento inócuo, tem riscos inerentes e
pode provocar reacções adversas no animal. Nos últimos anos, a necessidade de revacinação anual tem sido
uma das questões mais debatidas por cientistas e peritos em vacinologia veterinária. O aumento da incidência de efeitos secundários, a maior predisposição para
doenças imunomediadas e os resultados de estudos de
persistência da imunidade, estimularam o debate a nível internacional e levaram a que se questionasse cada
vez mais a necessidade de fazer revacinações anuais.
Apesar da imunidade induzida pelas vacinas não durar
indefinidamente, a revacinação demasiado frequente também pode ser contraproducente. O aumento da
incidência de algumas doenças imunomediadas levou
a que se suspeitasse da existência de uma ligação entre a vacinação demasiado frequente e a ocorrência de
problemas imunitários tais como: alergias, poliartrite,
doenças da tiróide, reacções de hipersensibilidade,
anemia hemolítica , trombocitopénia , osteopatias, etc.
Idealmente, o intervalo de revacinação deveria ser determinado por forma a que a imunidade nunca decaísse
abaixo de níveis protectores, assegurando também que
o animal não seria submetido a revacinações desnecessárias (Tizard e Ni,1998).
É neste contexto, e tendo em conta os aspectos por
nós descritos no artigo já referido que surge o presente
trabalho. Este teve por objectivo conhecer a resposta
imunitária humoral desenvolvida individualmente em
animais, em resposta à vacinação praticada de acordo
com o protocolo preconizado pelo respectivo clínico
assistente. Não se trata, portanto, de um estudo realizado com base num desenho experimental, mas sim de
um rastreio serológico a animais vacinados. A determinação serológica do nível de anticorpos permitiu, ainda
76
RPCV (2005) 100 (553-554) 75-84
que de forma indirecta, conhecer o grau de protecção
que as vacinas comumente utilizadas na prática clínica
podem conferir (Tizard e Ni,1998). Com os resultados
obtidos e o preenchimento de um questionário pretendemos recolher informação pertinente para responder a
questões como: qual a eficácia de vacinas e protocolos
adoptados? Qual a persistência de níveis de anticorpos
protectores em diferentes períodos após a vacinação?
Quais os factores que interferem com o estabelecimento da imunidade na primovacinação?
Materiais e Métodos
Para avaliar os níveis de resposta imunitária humoral
contra a Esgana e Parvovirose Caninas foram seleccionadas de forma aleatória 780 amostras de sangue. Os
soros foram obtidos de animais de ambos os sexos, de
diferentes raças e idades, observados na Consulta Externa do Hospital Escolar da F.M.V., em clínicas privadas ou em centros de criação. Todas as colheitas foram
acompanhadas do preenchimento de um questionário
em que se registaram: a identificação do proprietário,
a identificação do médico-veterinário assistente, os
dados relativos à identificação do animal (idade, sexo,
raça, estado clínico) e a história vacinal anterior à colheita da amostra (vacinas utilizadas, datas de aplicação e fabricante) (consultar em http://www.fmv.utl.
pt/labs/virologia/formvirologia.PDF, pág. 3). Do total
de amostras recebidas (n=1300), seleccionámos as que
correspondiam a animais saudáveis, não submetidos
a qualquer tipo de terapêutica (ex.: imunosupressiva,
anti-inflamatória, etc.) e cuja história vacinal fosse conhecida.
A população testada é constituída por animais com
idades compreendidas entre os 2 meses e os 15 anos de
idade), 54% dos quais do sexo masculino. A maioria
dos animais (79,6%) são de raça pura distribuindo-se
por um total de 51 raças diferentes, entre as quais algumas raças portuguesas (Tab. I). De um modo geral,
as raças e idades incluídas parecem representar a distribuição que ocorre na população portuguesa de cães
de companhia.
Após a colheita asséptica de 1-5 ml sangue total para
tubo seco (sem anticoagulante), procedeu-se à separação do soro e à sua conservação a –20ºC até posterior
processamento. Os anticorpos específicos presentes em
cada soro foram quantificados por Seroneutralização
(CDV) e Inibição da Hemaglutinação (CPV).
Seroneutralização (SN)
A avaliação quantitativa de anticorpos contra o Vírus
da Esgana Canina (CDV) foi realizada através de provas Seroneutralização. A técnica utilizada é uma adaptação do método de microtitulação desenvolvido por
Appel e Robson (1973) e baseia-se na neutralização do
efeito citopático (ECP) do CDV por anticorpos específicos neutralizantes presentes no soro dos animais.
Almendra, C. et al.
RPCV (2005) 100 (553-554) 75-84
Tabela I – Distribuição de acordo com a RAÇA
Raça
n
Raça
n
Boxer
32
Labrador Retriever
167
Bulldog
8
Pastor Alemão
83
Bull Terrier
21
Pastor Belga
10
Caniche
13
Perdigueiro Português
8
Cão de Água Português
8
Rafeiro Alentejano
6
Cocker Spaniel
48
Rottweiller
41
Dobermann
19
São Bernardo
7
Dogue Alemão
20
Serra da Estrela
18
Golden Retriever
12
Outras
70
Husky Siberiano
30
Indeterminada
159
“Outras” inclui (n<5): Basset Hound, Beagle, Boston Terrier, Braco
Alemão, Castro Laboreiro, Chihuahua, Chow Chow, Collie, Dálmata,
Dachshund (baixote), Dogue Argentino, Dogue de Bordéus, Epagneul
Bretão, Fila de São Miguel, Fox Terrier, Galgo Afegão, Jack Russel Terrier, Leão da Rodésia, Malamute do Alasca, Mastiff, Montanha dos Pirinéus, Pastor de Beauce, Pequinois, Pinsher, Pit Bull, Podengo, Pointer,
Pug, Samoiedo, Shar Pei, Springer Spaniel, Spitz, Teckel, Terra Nova,
Yorkshire Terrier.
Após uma primeira diluição a 1:2 em meio de cultura
(Minimum Essential Medium with Earle’s Salts, suplementado com soro fetal bovino inactivado, solução de
antibiótico-antimicótico e L-glutamina), as amostras
e os soros controlo são inactivados pelo calor (56 ºC)
durante 30 min. Diluições seriadas do soro (base 2) são
incubadas com uma concentração padronizada de CDV
- estirpe atenuada Onderspoort (10-30 TCID50 / 50 µL).
Passadas as 2 horas de incubação à temperatura ambiente adicionam-se células VERO (2x105 células / 50
µL / pocilho), que servirão de sistema indicador, uma
vez que o vírus tem sobre elas um ECP característico.
A mistura é colocada em atmosfera controlada (37ºC,
5% CO2, 80% humidade relativa) e observa-se a presença/ausência do ECP ao fim do 4º dia de incubação.
O título do soro (Unidades Seroneutralizantes – USN)
é representado pelo inverso da maior diluição que inibe
o ECP. Considerou-se que títulos superiores ou iguais a
64 USN são protectores (P) e resultam de uma resposta
adequada à vacinação (valor preconizado pelo Laboratório de Diagnóstico da Universidade de Cornell).
Inibição da Hemaglutinação (IHA)
A titulação de anticorpos contra o Parvovírus Canino (CPV) foi realizada através da prova de Inibição da
Hemaglutinação (Carmichael et al., 1980). O CPV tem
a capacidade de aglutinar glóbulos vermelhos de diferentes espécies em condições de pH e temperatura específicos. A presença de anticorpos no soro de animais
imunizados ou convalescentes inibe esta reacção. Após
diluições sucessivas do soro (base 2), este é incubado
(1h/TA) com uma concentração padronizada de CPV
(estirpe Cornell, 4-8 UHA /25 µL). Depois de se adicionarem eritrócitos de suíno, incuba-se durante cerca
de 1 hora a 4ºC e em seguida faz-se a leitura da prova.
O título do soro (Unidades Inibidoras de Hemagluti-
nação – UIHA) é representado pelo inverso da maior
diluição que inibe completamente a hemaglutinação.
Considerou-se que títulos superiores a 80 UIHA são
protectores (P) e resultam de uma resposta adequada
à vacinação (valor preconizado pelo Laboratório de
Diagnóstico da Universidade de Cornell).
Análise de Resultados e Estatística
Todos os resultados obtidos foram introduzidos e
trabalhados numa base de dados em folha de cálculo
(Microsoft EXCEL versão 9.0). Para fazer a análise
estatística, relativamente à informação obtida com as
provas laboratoriais, foi utilizado o programa informático SPSS versão 12.0. A comparação da resposta imunitária à vacinação para as diferentes variáveis
foi feita através de testes de Chi-quadrado (testes de
comparação de duas proporções). Para cada teste foi
assumido um nível de significância de 5%.
Para analisar os resultados obtidos, a população testada foi subdividida em dois grupos: animais adultos a
cumprir esquemas de revacinação e animais jovens em
primovacinação. Em relação aos animais adultos determinámos a prevalência de animais protegidos e qual
a sua relação com intervalos de revacinação (duração
de imunidade), características do animal, e vacina utilizada. Nos primovacinados, avaliámos a eficácia dos
esquemas de primovacinação adoptados, bem como a
importância de determinados factores para o estabelecimento da imunidade (número de inoculações, associação de antigénios, idade na primeira/última inoculação e vacina utilizada).
Resultados
Resposta imunitária no total da população
A avaliação da imunidade humoral revelou que a
maioria dos animais responde de forma adequada à
vacinação. Num total de 780 animais vacinados e testados, 76,3% (n=595) possuíam títulos de anticorpos
considerados protectores para ambos os vírus. As falhas de imunidade (23,7%) foram mais frequentes para
o CDV.
Revacinação de Animais Adultos
Dos 556 animais adultos (≥1 ano) testados, cerca de
77,8% apresentaram títulos protectores para ambos os
vírus.
Imunidade contra a Esgana Canina (revacinação)
A quantificação de anticorpos contra o CDV revelou
que 29,7% dos animais vacinados não tem protecção
(NP) humoral contra o vírus (<64 USN). Para avaliar a
persistência de imunidade contra o CDV e a importância da revacinação, agruparam-se os animais de acordo
77
Almendra, C. et al.
RPCV (2005) 100 (553-554) 75-84
com o intervalo entre a última vacinação e a colheita de
sangue (Tab. II). Verificámos que, embora a proporção
de animais protegidos (P) diminua em função de maiores intervalos vacinação/colheita, dos 23 animais vacinados há mais de 3 anos, 16 (69,6%) mantêm títulos
de anticorpos protectores. Mesmo no caso de animais
vacinados à mais de 7 anos (n=5), a proporção de protegidos é grande (60,0%)(Tab. II).
Tabela II – Taxas de Protecção contra a ESGANA em função
do Intervalo Vacinação/Colheita (Animais Adultos)
Intervalo Vacinação/ Resultados SN (n)
Colheita
(Anos)
NP
P
da, uma vez que existem diferenças significativas nos
resultados obtidos (P= 0,001) (Tab. IV, Fig. 2).
Tabela IV – Taxas de Protecção contra a ESGANA
em função do Fabricante da Vacina (Animais Adultos)
Resultados SN (n)
% Animais
Tabela IV – Taxas de Protecção contra a ESGANA em função
Fabricante#
Protegidos
do Fabricante da Vacina (Animais Adultos)
NP
P
% Animais
Protegidos
Fabricante#
2
1
2
3
3
4
4
114
269
69,9
1-3
42
106
71,6
3-5
3
9
75,0
5-7
2
4
66,7
>7
2
3
60,0
Resultados SN (n)
30
NP
9
30
110
9
110
5
5
11
11
64
64
% Animais
Protegidos
68,1
P
64
68,1
87,7
64
87,7
32
86,5
22
66,7
209209
32
65,5
65,5
86,5
22
66,7
100%
80%
60%
40%
Tabela III – Taxas de Protecção contra a ESGANA e Valores do teste χ2
(Animais Adultos)
% Animais
5
5
% de Animais
<1
Variável em estudo
1
20%
Teste χ2
Protegidos
Os resultados obtidos indicam
que os níveis de pro<1 Ano (n=385)
69,9
Intervalo
P= 0,725vacinatecção
foram
idênticos
quer
o
intervalo
entre
Vacinação/Colheita
>1 Ano (n=171)
71,3
ção e colheita de amostra fosse inferior ou superior a
Indeterminada (n=104)
77,9
0,061O sexo,
um anoRaça(diferençaPura
não
significativa)
(Tab. P=
III).
(n=452)
68,9
idade ou a raça (pura
vs.
indeterminada)
do
animal
não
Feminino (n=264)
68,9
Sexo
P=0,497
influenciaram
o Masculino
tipo de
resposta
imunitária
(Tab.
III,
(n=292)
71,6
Fig. 1).
Idade (1 a >10 anos)
P=0,509
O mesmo não Fabricante
aconteceu em relação às vacinas
utiliP=0,001*
zadas
e
respectivo
fabricante.
A
análise
estatística
reve(*diferença significativa)
lou que o grau de protecção depende da vacina utiliza-
0%
1
P
2
3
4
5
NP
Fabricante
Fig. 2-Fig.
Protecção
CDVCDV
vs Fabricante
Adultos)
2- Protecção
vs FabricantedadaVacina
Vacina (Animais
(Animais Adultos)
(#Por razões
éticas não são revelados os nomes dos fabricantes.)
(#Por razões éticas não são revelados os nomes dos fabricantes.)
No que diz respeito à distribuição dos títulos SN presentes em animais protegidos (P, superior a log2(64)=6),
verificou-se que uma grande proporção de animais tinha títulos relativamente baixos (Fig. 3).
No que diz respeito à distribuição dos títulos SN presentes em animais protegidos (P,
superior a log2(64)=6), verificou-se que uma grande proporção de animais tinha títulos
Imunidade
relativamente
baixos (Fig. contra
3).
% de Animais
(revacinação)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
>10
NP
37,5
34,7
21,6
25,6
26,1
30,2
28,6
35,7
36,0
41,2
P
62,5
65,3
78,4
74,4
73,9
69,8
71,4
64,3
64,0
58,8
Idade (anos)
O mesmo
Fig.
1- Protecção
CDV
vs Idade
Adultos)
Fig. 1Protecção
CDV vs(Animais
Idade (Animais
Adultos)
relação
às
não aconteceu em
vacinas utilizadas e
a Parvovirose Canina
A quantificação de anticorpos contra o CPV revelou
que somente 1,8% dos animais vacinados não tem protecção humoral contra o vírus (≤ 80 USN). Relativamente aos animais não protegidos (n=10), 8 são de raça
Fig. 3- Distribuição dos valores de USN (Animais Adultos)
pura e dois de raça indeterminada. Sete destes animais
tinham sido vacinados há menos de um ano, para os
restantes o intervalo entre a última vacina e a colheita
respectivo fabricante. A análise Tabela
estatísticaIII
revelou
que o de
grauProtecção
de protecçãocontra
depende
da
– Taxas
a ESGANA
e
Valores do teste χ2 (Animais Adultos)
% Animais Protegidos
<1 Ano (n=385)
69,9
vacina utilizada, uma vez que existem diferenças significativas nos resultados obtidos (P=
Variável em estudo
0,001) (Tab. IV, Fig. 2).
Intervalo Vacinação/Colheita
Raça
Sexo
(*diferença significativa)
78
>1 Ano (n=171)
Indeterminada (n=104)
Pura (n=452)
Feminino
(n=264)
10
Masculino (n=292)
Idade (1 a >10 anos)
Fabricante
71,3
77,9
68,9
68,9
71,6
Teste χ2
P= 0,725
P= 0,061
P=0,497
P=0,509
P=0,001*
11
Almendra, C. et al.
RPCV (2005) 100 (553-554) 75-84
Tabela V - Taxas de Protecção contra o CPV em função do
Intervalo Vacinação/Colheita (Animais Adultos)
18
16
% de Animais
14
Intervalo Vacinação/
Colheita
(Anos)
12
10
8
2
0
NP
NP
NP
NP
NP
P
P
P
P
P
P
P
ND
(<8)
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
Protecção (log 2 USN)
Fig. 3- Distribuição dos Valores de USN (Animais Adultos)
Fig. 3- Distribuição dos valores de USN (Animais Adultos)
% Animais
Protegidos
NP
P
<1
7
377
98,2
1-3
2
146
98,6
3-5
1
12
92,3
5-7
-
6
100,0
>7
-
5
100,0
6
4
Resultados IHA
(n)
de sangue foi de 1, 2 e 4 anos. O número de amostras
animais de raça indeterminada (diferença significativa)
Imunidade
a Parvovirose
Caninavacinados
(revacinação)há mais de um ano redecontra
animais
que foram
(Tab. VI), contudo, uma vez que estes são em númeA quantificação
de anticorpos
contra o CPV
revelou que
somente
1,8% dos animais
presenta 31%
da população
amostrada.
Destes
animais,
ro muito inferior (25% do total de animais estudados),
vacinados98,3%
não tem têm
protecção
humoral
contra o víruso(≤que
80 USN).
Relativamente
aos animais
títulos
protectores,
indica
que, uma
não podemos determinar se as diferenças têm algum
não protegidos
(n=10), 8 são de
raça boa
pura e
dois de raçacontra
indeterminada.
Sete destes
vez estabelecida
uma
imunidade
o CPV,
significado
biológico. Títulos inferiores a 64 USN foanimais tinham
sido vacinados
menos de um ano, para os restantes o intervalo entre
a
esta persiste
(Tab.háV).
ram
frequentes
em algumas raças (ex.: Dogue Alemão,
última vacinaComo
e a colheita
de sangue foi
1, 2 e 4 anos.
número de amostras
a proporção
dedeanimais
nãoO protegidos
é bas-de animais
Bull
Terrier,
Boxer,
Labrador).
que foram vacinados há mais de um ano representa 31% da população amostrada. Destes
tante baixa, não é possível avaliar estatisticamente a
animais, 98,3% têm títulos protectores, o que indica que, uma vez estabelecida uma boaOs níveis de protecção foram idênticos para ambos
relação entre a protecção contra o CPV e as outras vaos sexos (Tab. VII). Relativamente às outras variáveis
imunidade contra o CPV, esta persiste (Tab. V).
riáveis (raça, sexo, idade, fabricante). Embora fosse inrelacionadas com o protocolo utilizado não foram deteressante averiguar os motivos das falhas imunitárias,
Como a proporção de animais não protegidos é bastante baixa, não é possível avaliar
tectadas diferenças significativas. Um dos factores que
o número de animais não protegidos é muito reduzido.
estatisticamente a relação entre a protecção contra o CPV e as outras variáveis (raça, sexo,
se pretendia analisar era a importância do número de
idade, fabricante). Embora fosse interessante averiguar os motivos das falhas imunitárias,
o
inoculações
em relação à resposta imunitária desenPrimovacinação em Cachorros
de
Tabela V - Taxas de Protecção contra o CPV em função do número
cadeada.
Nos resultados obtidos, o facto do animal
Intervalo Vacinação/Colheita (Animais Adultos)
animais
não inoculado apenas 2 vezes não implicou um menor
ser
No total dos 224 animais
primovacinados
o protegidos
nível
Resultados
IHA
é
Intervalo
nível
de protecção (proporção de animais é idêntica).
Animais
de protecção
foi ligeiramente(n) inferior%(69,2%)
aomuito
dosreduzido.
Vacinação/Colheita
Protegidos
Em
relação
à associação ou não de vírus numa mesma
(Anos)
adultos.
NP
P
administração, os dados indicam que o uso de vacinas
<1
7
377
98,2
associadas não determina que a eficácia vacinal seja
Imunidade contra
a Esgana
Canina
1-3
2
146
98,6
menor (Tab. VI).
(primovacinação)
3-5
1
12
92,3
12
A marca de vacina utilizada no protocolo de primo5-7
6
100,0
vacinação
influenciou a resposta imunitária (Tab. VII
Neste grupo>7de animais,- a análise
da resposta
humo5
100,0
e
Fig.
4).
Apesar
de cada fabricante estar representaral à vacinação contra a Esgana Canina, revelou que
do
por
uma
proporção
diferente de animais (de n=12 a
31% dos animais não respondeu de forma eficaz. As
n=101),
as
diferenças
de
eficácia são grandes, sendo a
falhas imunitárias parecem ser mais frequentes nos
Tabela VI – Taxas de Protecção contra a ESGANA e Valores do teste χ2 (Animais Primovacinados)
Variável
Raça
Sexo
N.º de inoculações
Associação Antigénios
Idade - 1ª vacina
Idade - Última Vacina
% Animais Protegidos
Indeterminada(n=55)
80, 0
Pura(n=169)
64,5
Feminino(n=94)
64,9
Masculino(n=130)
70,8
≤ 2 (n=176)
68,8
>2 (n=48)
66,7
Não(n=58)
62,1
Sim(n=166)
70,5
≤ 7 semanas(n=67)
70,1
> 7 semanas(n=157)
67,5
≤ 12 meses(n=42)
71,4
> 12 meses(n=182)
67,6
Teste χ2
P= 0, 032*
P=0,351
P=0,783
P=0,236
P=0,698
P=0,629
79
Almendra, C. et al.
RPCV (2005) 100 (553-554) 75-84
vacina 3 aquela em que a eficiência é significativamente inferior.
Discussão
Revacinação de Animais Adultos
Tabela VII - Taxas de Protecção contra a ESGANA em função
do Fabricante da Vacina (Animais Primovacinados)
Nº animais
A prática de revacinação anual foi estabelecida à
mais
de 30 anos atrás, com base em informação cientíResultados SN (n)
% Animais
fica escassa e limitada (Hustead et al., 1999; Klingborg
Fabricante#
Protegidos
P
NP
et al., 2002). Em 1982, Schultz publicou o primeiro artigo em que levantava a hipótese da revacinação anual
1
10
2
83,3
contra o CDV (vacina atenuada) não ser essencial. Esta
2
59
3
95,2
ideia foi reforçada pelos resultados obtidos por Olson
et al. (1988): 63% dos cães vacinados há mais de três
3
52
49
51,5
anos apresentavam títulos protectores contra o CDV.
4
16
6
72,7
Para além das questões relacionadas com a persistência da imunidade, desde o início dos anos 90, têm
5
16
11
59,3
surgido várias publicações que expressam a preocupação com a ocorrência dos efeitos secundários causados
pela revacinação frequente (Smith, 1995; Duval e Gi100%
ger, 1996; Elliott, 1997; Greene, 1998; Appel, 1999;
Glikman, 1999; Hustead et al., 1999; Meyer, 2001;
80%
Gaskell et al., 2002). O aumento da incidência de algu60%
mas doenças imunomediadas levou a que se suspeitasse
40%
da existência de uma ligação entre a vacinação e distúrbios imunitários tais como alergias, poliartrite imuno20%
mediada, doenças da tiróide, reacções de hipersensibi0%
lidade, anemia hemolítica imunomediada, trombocito1
2
3
4
5
pénia imunomediada, osteopatias, etc. Este alerta e a
Fabricante
P
NP
escassez de informação, têm suscitado na comunidade
científica muitas dúvidas e opiniões controversas (SmiFig. 4- Protecção
CDV
vs
Fabricante
(Animais
Primovacinados)
Fig. 4- Protecção CDV vs Fabricante (Animais Primovacinados)
th, 1995; Dym, 1998; Lewcock e Bragg, 1998; Kusi,
1999; Povey, 1999; Hines, 2000; McLaughlin, 2000;
Imunidade contra a Parvovirose Canina
Petzel, 2000; Land, 2001; Palmquist, 2004) A generaImunidade
contra
a
Parvovirose
Canina
(primovacinação
)
(primovacinação)
lidade dos autores admite a falta de estudos publicados
Dos 224 animais a cumprir esquemas de primovacinação, apenas 4% não estavam
sobre estes assuntos mas muitos consideram também
protegidos contra a Parvovirose. Relativamente aos animais não protegidos (n=9), cinco são
Dos 224 animais a cumprir esquemas de primovade raça pura e quatro de raça indeterminada. Oito destes animais foram imunizados com
que existem cada vez mais resultados que comprovam
cinação, apenas 4% não estavam protegidos contra a
vacinas múltiplas e um com vacina monovalente. Na Tabela VIII estão representados os
a persistência de imunidade por mais de um ano para as
Parvovirose. Relativamente aos animais não protegiresultados em relação às vacinas utilizadas. A proporção de animais não protegidos é muito
vacinas vivas modificadas (Smith, 1995; Carmichael,
dosnão
(n=9),
cinco
sãoestatisticamente
de raça pura
e quatro
raça indebaixa, logo
é possível
avaliar
a relação
entre ade
protecção
contra o CPV
1997; Olson, 1997; Greene, 1998; Kruth e Ellis, 1998;
terminada.
Oito destes animais foram imunizados com
e as variáveis
em estudo.
Tizard e Ni, 1998; Schultz, 1999; Carmichael, 1999;
vacinas múltiplas e um com vacina monovalente. Na
Hustead et al., 1999; Schultz, 2000; Ford, 2001; GreTabela VIII
estão
representados
osaresultados
Tabela
VIII - Taxas
de Protecção contra
Parvovirose em em relaene et al., 2001; Coyne et al., 2001; Klingborg et al.,
função do Fabricante da Vacina (Animais Primovacinados)
ção às vacinas utilizadas. A proporção de animais não
Resultados IHA
2002; Paul et al., 2003).
protegidosFabricante
é muito baixa,(n)logo não %é Animais
possível avaliar
Protegidos
A duração da imunidade (DI) resulta de uma interacNP
P
estatisticamente a relação entre a protecção contra o
ção
complexa entre a resposta imunitária do hospedei12
1
100,0
CPV e as variáveis em estudo.
2
61
2
96,8
ro, o tipo de vacina utilizado e o acto de imunização. A
6
91
3
93,8
imunidade pós vacinal traduz-se na existência de células
Tabela VIII 4- Taxas de Protecção
Parvovirose em
1
23 contra a 95,8
de memória e anticorpos circulantes. Realizar a contrafunção do Fabricante
da Vacina28
(Animais Primovacinados)
5
100,0
prova virulenta seria a forma mais rigorosa de determiResultados IHA (n)
nar a DI, contudo estes estudos são muito dispendiosos,
% Animais
Fabricante#
Protegidos
envolvem a manutenção de animais em isolamento por
NP
P
longos períodos de tempo e são questionáveis quer do
16
1
12
100,0
ponto de vista ético quer da aplicabilidade a situações
reais (Mouzin et al, 2004). Avaliar a resposta celular
2
2
61
96,8
também é caro, difícil e demorado. Assim, os testes
3
6
91
93,8
serológicos são os mais utilizados. Nestas situações, a
definição do título protector é muito importante para a
4
1
23
95,8
interpretação dos resultados, uma vez que a variação
5
28
100,0
inerente ao sistema biológico impossibilita a utilização
#
80
Almendra, C. et al.
de um título que distinga de forma absoluta animais
protegidos de não protegidos (Böhm et al, 2004). De
acordo com alguns estudos já publicados e o preconizado pelo Laboratório de Diagnóstico da Universidade
de Cornell, considerámos como protectores títulos >80
UIHA (Parvovirose) e títulos ≥64 USN (Esgana).
Os resultados do nosso estudo indicam que a vacinação pode induzir uma resposta serológica que perdura
para além de um ano. Quer no caso da Esgana, quer no
da Parvovirose, os animais vacinados há mais de uma
ano apresentam níveis de protecção idênticos aos vacinados anualmente. Num estudo realizado por Olsson et
al. (1997), 73% dos animais vacinados contra a esgana
há mais de 50 meses apresentavam títulos ≥16USN.
No nosso trabalho 78,6% dos animais nas mesmas condições, apresentaram valores idênticos. Mouzin
������� et al.
(2004) também verificaram que a vacinação contra estas duas doenças pode induzir uma resposta serológica
igual ou superior a 48 meses. Os nossos resultados estão
também de acordo com os de Rikula et al. (2000), uma
vez que este grupo de investigadores não encontrou diferenças significativas nos título de animais vacinados
há menos de um ano relativamente aos vacinados há
mais de um ano. Aparentemente, a revacinação anual
não traz vantagens relativamente às situações em que o
intervalo de revacinação foi superior a 1 ano.
A proporção de animais protegidos contra a Parvovirose (98,2%) encontrada por nós está de acordo com
os valores obtidos por Twark e Dodds (2000) (95,1%)
e Mouzin et al. (2004) (98,1%). Os nossos resultados
também são semelhantes aos de Böhm et al. (2004),
uma vez que neste caso 94,4% dos animais vacinados
há mais de 3 anos apresentavam títulos >64UIHA e no
nosso grupo a protecção ocorreu em 95,7% (>80UIHA).
No estudo realizado por McCaw et al. (1998) a proporção de animais protegidos foi inferior (73% com ≥
80UIHA). Valores idênticos (70,9%) foram encontrados por Olsson et al. (1996). Esta diferença pode ser
devida ao maior tamanho da amostra, a uma maior estimulação pelo vírus selvagem, ou à utilização de vacinas mais imunogénicas no nosso grupo de animais.
No caso da Esgana, Twark e Dodds (2000) encontraram uma maior percentagem (97,6%) de animais
protegidos do que nós (70,6%), mas a prova serológica
utilizada, Imunofluorescência Indirecta (IFA) não foi
a mesma e, embora os autores demonstrem que é concordante com a SN, os títulos tidos em conta não são
os mesmos. O mesmo se passa no estudo de Mouzin,
et al. (2004) (98,1%) mas neste caso a prova utilizada
é a SN e o título considerado é ≥32USN. McCaw
������ et al.
(1998) obtiveram uma proporção idêntica de animais
protegidos (79%), mas consideraram como limite títulos ≥96USN. O grupo de Böhm et al. (2004) verificou
que 71,5% dos seus animais (vacinados há mais de 3
anos) apresentavam títulos ≥64 USN, resposta serológica idêntica ao obtido por nós (69,6% de animais
protegidos). De notar que, além das metodologias e o
título considerado protector serem diferentes, também
RPCV (2005) 100 (553-554) 75-84
a amostragem, exposição ambiental, protocolos e vacinas utilizadas variam de trabalho para trabalho, o que
dificulta ainda mais a comparação de resultados.
Os nossos resultados indicam que, embora a generalidade dos animais responda de forma adequada à vacinação, a imunidade contra a esgana é mais difícil de
obter exibindo também títulos menos expressivos. Isto
pode acontecer por variação biológica, falhas vacinais,
ou utilização de vacinas pouco imunogénicas. Pode
também acontecer que nestes animais a imunidade celular seja mais importante do que a imunidade humoral, protegendo os animais apesar de estes possuirem
um título baixo de anticorpos neutralizantes. A ausência de protecção merece atenção, em particular no caso
da Esgana, pois sabe-se que o aumento de falhas de
vacinação resulta em decréscimo da imunidade da população e surtos de doença, tal como o que ocorreu na
Finlândia no início dos anos 90 (Ek-Kommonen, 1997;
Mouzin, 2004; Böhm et al., 2004).
No nosso estudo, o sexo, idade ou raça do animal não
influenciaram o tipo de resposta imunitária. Outros grupos de investigadores obtiveram os mesmos resultados
(McCaw et al., 1998; Rikula et al., 2000; HogenEsch
et al., 2004). O mesmo não aconteceu em relação às
vacinas utilizadas, pois encontrámos diferenças significativas no grau de protecção conferido. Apesar de cada
marca estar representada por um pequeno número de
animais, a vacina menos eficaz tem uma amostragem
razoável, pelo que consideramos este resultado importante. As vacinas, mesmo sendo do mesmo tipo (viva
atenuada), podem não estimular respostas imunitárias
equivalentes por diferirem em relação à concentração
de antigénio, capacidade imunogénica do antigénio e
estirpe; grau de atenuação, etc. Sendo este um estudo
de campo em que muitas outras variáveis podem interferir, não foi possível aprofundar quais os motivos
destas diferenças.
Primovacinação
Tal como aconteceu nos animais adultos, as falhas
no estabelecimento de imunidade foram mais frequentes no caso da imunização contra a Esgana. Diversos
factores podem ter contribuído para as falhas vacinais,
mas os nossos resultados parecem realçar dois: a interferência de características da raça e a capacidade
imunogénica das estirpes vacinais. É provável que nos
animais de raça pura, em que as fêmeas reprodutoras
são submetidos a vacinações mais frequentes, a persistência de anticorpos maternos seja um factor determinante para as diferenças encontradas.
De notar que a vacinação precoce (antes das 7 semanas de idade) não conferiu uma maior taxa de protecção, tal como a utilização de vacinas monovalentes não
resultou numa maior eficácia vacinal. A utilização de
vacinas monovalentes implica protelar a imunização
contra um dos antigénios e consequentemente aumentar o período de susceptibilidade para o animal. Neste
81
Almendra, C. et al.
estudo a associação dos dois vírus não influenciou negativamente a resposta imunitária do hospedeiro, pelo
que consideramos prudente a utilização de vacinas associadas ou polivalentes.
Ao contrário do que esperávamos, um maior número
de inoculações nem sempre foi suficiente para induzir
uma imunidade protectora. A eficácia dos diferentes
protocolos vacinais depende de inúmeros factores e os
nossos resultados comprovam isso. Infelizmente, não
existe um protocolo de vacinação ideal para os animais
de companhia. Actualmente, a comunidade científica
defende a necessidade de desenvolver um programa
eficiente de vacinação ao nível do indivíduo e a avaliação serológica da sua resposta imunitária.
Este rastreio serológico permitiu-nos conhecer a resposta imunitária humoral contra os vírus da Esgana e
Parvovirose Caninas numa amostra da população portuguesa de canídeos vacinados. Os resultados obtidos
vêm confirmar a importância da avaliação serológica
da imunidade induzida pela vacinação, uma vez que
foram detectadas inúmeras situações de não protecção
sobretudo significativas contra a Esgana Canina. Confirma-se a utilidade dos testes serológicos na optimização de protocolos vacinais adequados a cada situação específica de imunização activa contra estes dois
vírus.
Agradecimentos
Ao Dr. Edward Dubovi, director do Animal Health
Diagnostic Laboratory, College of Veterinary Medicine, Cornell Univesity pela cedência de materiais biológicos e intercâmbio de técnicas. Ao sector de Doenças
Infecciosas da FMV / UTL pela recolha de sangue de
suíno. Aos colegas que colaboraram na recolha de soros: Luís Quintino, Pedro Serra, Lina Cavaco e outros.
À Companhia Cinotécnica da Guarda Nacional Republicana (Dr. Miguez Barroso), ao Corpo de intervenção
- Pelotão Cinotécnico da PSP (Dr. Pedro Mira Crespo)
e aos criadores, em especial o Dr. Pedro Ródo, pela
disponibilização de um número muito expressivo de
soros.
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