323 AVALIAÇÃO EXPERIMENTAL DO EFEITO TÓXICO

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AVALIAÇÃO EXPERIMENTAL DO EFEITO TÓXICO DE METAIS PESADOS
FRENTE AO PROTOZOÁRIO CILIADO Paramecium caudatum
Miranda, Manoel Messias Pereira1; Seleghim, Mirna Helena Regali1; Fatibello,
Orlando Filho2. Melo, Brian Alvarez Ribeiro3.
1 Departamento de Ecologia de Biologia Evolutiva Laboratório de Ecologia de Microrganismos AquáticosUFSCar; 2 Departamento de Química- UFSCar; 3 Departamento Estatística UFSCar
RESUMO
No presente trabalho o protozoário ciliado Paramecium caudatum foi isolado da
Represa do Monjolinho (São Carlos-SP) e mantido em cultura monoxênica onde foi
verificada sua condição ótima de cultivo (pH 8 e temperatura de 30°C, no escuro).
Experimentos de toxicidade utilizando indivíduos obtidos na fase log de crescimento foram
realizados com doze metais em íons cloreto (alumínio, bário, cádmio, chumbo, cobre,
chumbo, cobalto, ferro, lítio, manganês, mercúrio, níquel, e zinco), em diferentes
concentrações, visando definir as faixas de tolerância desse protozoário para esses metais
e também a possibilidade de sua utilização como bioindicador ambiental em um bioensaio
padronizado. Os resultados mostraram uma maior sensibilidade do protozoário frente ao
mercúrio e uma menor sensibilidade frente ao lítio.
ABSTRACT
In the present work, the ciliated protozoan Paramecium caudatum was isolated from
The Monjolinho Reservoir (São Carlos- SP) and maintained in a monoxenic culture under
optimal conditions previously defined. Toxicity experiments with 12 heavy metals (Al, Ba,
Cd, Pb, Cu, Co, Fe, Li, Mn, Hg, Ni and Zn), at different concentrations, were conducted
using protozoans obtained from a log phase culture. The results showed that the protozoan
was more sensitive to mercury and less to lithium.
INTRODUÇÃO
Dentre os diversos poluentes depositados no ambiente, os metais pesados geram
preocupação, pois podem atingir concentrações nas quais podem ser altamente tóxicos
para a biota local e pelo fato de poderem ser bioacumulados e passados pela cadeia
trófica. Dentre os organismos aquáticos, os protozoários são organismos unicelulares
eucarióticos que estão no início da cadeia trófica, tornando um modelo apropriado para
prever os efeitos de substâncias químicas em toda biota aquática. Eles têm sido utilizados
em estudos toxicológicos e propostos como excelentes indicadores biológicos de poluição
aquática também devido à sua sensibilidade a alterações ambientais, ao seu curto ciclo de
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vida e facilidade para cultivo. O objeto desse estudo foi o verificar a sensibilidade do
protozoário ciliado Paramecium caudatum, isolado da Represa do Monjolinho (São CarlosSP), e mantido na coleção de cultura de protozoários do laboratório de Ecologia de
Microrganismos Aquáticos da UFSCar, frente a diversos metais poluentes.
MATERIAIS E MÉTODOS
Isolamento do protozoário
Para seu isolamento, o protozoário foi identificado e capturado por meio de
microcapilares de vidro, sob microscopia ótica, em uma amostra coletada no Reservatório
do Monjolinho. Após lavagens sucessivas em gotas com água mineral estéril (Minalba®), o
organismo foi colocado em um tubo de cultivo com ágar 2% inclinado e uma suspensão em
água mineral autoclavada com Enterobacter aerogenes à 107 organismos/mL adicionado
de um grão de arroz, com casca (fervido por 10 minutos e autoclavado) e incubado a 25°C.
O crescimento dos protozoários foi monitorado em lupa por vários dias e a pureza da
cultura foi verificada posteriormente utilizando microscopia ótica.
Experimentos de otimização de cultivo
Três tubos de ensaio (tréplicas) com o meio de cultura acima descrito foram
inoculados, cada um com cinco microrganismos, e foram incubados em três condições
diferentes de temperatura (20ºC, 25ºC e 30ºC), cinco de pH (5, 6, 7, 8, 9, e 10) e duas de
iluminação. Estes tubos foram incubados por três dias nas condições pré-definidas e ao
final desse período, três alíquotas de 1 mL de cada frasco foram fixadas com solução
saturada de cloreto de mercúrio (HgCl2), coradas com solução 0,04% de azul de
bromofenol (Pace; Orcutt, 1981) e contadas em microscópio óptico (aumento de 100X),
utilizando câmaras de Sedgewick-Rafter.
Curva de crescimento
Para a realização da curva, um tubo de ensaio com meio de cultura padrão foi
inoculado com cinco organismos nas condições definidas nos experimentos de otimização
de cultivo de pH e temperatura. O crescimento dos protozoários foi acompanhado pela
contagem direta dos organismos presentes em alíquotas (1 mL) retiradas em intervalos de
tempo pré-definidos após 24 horas (6 em 6 horas) e fixadas segundo Pace & Orcutt
(1981). Após a contagem, como descrito acima, os resultados foram plotados em um
gráfico de densidade pelo tempo e o tempo de geração que foi calculado a partir do
crescimento máximo encontrado na fase logarítmica (log) da curva obtida entre 24 e 120
horas.
Bioensais com metais pesados
Os bioensaios para verificar a toxicidade aguda dos metais pesados foram realizados
com: cloreto de alumínio (AlCl2 2H2O4); Cloreto de Bário (BaCl2 6H2O); cloreto do cádmio
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(CdCl2 2H2O); cloreto de cobre (CuCl2 2H2O); cloreto de chumbo (PbCl2 2H2O); cloreto de
cobalto (CoCl2 2H2O); cloreto de ferro (FeCl2 2H2O); cloreto de lítio (LiCl2 2H2O); cloreto de
manganês (MnCl2 2H2O); cloreto de mercúrio (HgCl2 2H2O); cloreto de níquel (NiCl2 6H2O);
cloreto de zinco (ZnCl2 6H2O). Foram feitas cinco diferentes concentrações em triplicata
para cada metal utilizando água destilada como diluente. Os experimentos tiveram duração
de 24 horas e foram realizados em microplacas de cultivo com 24 perfurações. Em cada
perfuração da microplaca foi avaliado um tratamento (controles e diferentes concentrações
de metais pesados); e cada tratamento foi feito em triplicatas (três poços). Em cada poço
foram adicionados 1 mL da solução a ser testada e vinte protozoários originados de uma
pré-cultura em fase logarítmica de crescimento. Os protozoários foram transferidos para os
poços por meio de micropipetas de Pasteur após prévia lavagem em uma gota de água
mineral esterilizada por filtração. Após 24 h de incubação, cada tratamento foi checado em
estereomicroscópio quanto à mortalidade ou sobrevivência dos protozoários. Foram
consideradas mortas às células desaparecidas, vacuolizadas ou deformadas. Em seguida,
foi determinada a concentração média letal (24h LC50= concentração que produz
mortalidade em 50% da população do protozoário comparado com os controles) com 95%
de confiança. Os organismos não foram alimentados durante as 24 horas destes
experimentos.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
O Gráfico 1 mostra o desempenho do crescimento de Paramecium caudatum nas
diferentes condições de cultivo no escuro. Os crescimento do protozoário apresentou os
melhores resultados à temperatura de 30ºC, e pH 8 ; inoculados no escuro total. Os
ensaios inoculados à temperatura de 20ºC apresentaram o pior desempenho,
provavelmente devido às exigências das condições de cultivo da bactéria enterobacter
aerogenes que tem um cultivo ideal em temperatura de 30ºC. O pH 8 apresentou uma
ótima condição para todos os ensaios e a temperatura de 25ºC foi boa, porém não foi a
melhor.
Após a verificação das condições ideais para o cultivo foi realizado um ensaio em
diferentes condições de luminosidade, realizados em triplicata; os resultados obtidos
mostram um excelente crescimento no escuro, e com iluminação de 12h por dia os
resultados não foram satisfatórios. O volume do meio de cultivo também foi testado e não
apresentou influência alguma sobre o desempenho do microrganismo, em ambos os
ensaios foram obtidos resultados satisfatórios de cultivo.
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Grafico 1 : Crescimento de Paramecium caudatum (n° de ind/mL) no escuro em diferentes
pH e temperaturas
A curva de crescimento de Paramecium caudatum, obtida na condição de cultivo
determinada no experimento anterior, está mostrada no Gráfico 2. Após uma fase lag até
36 horas, o crescimento celular se iniciou de forma irregular e apresentou ótimo na faixa
de 96 horas após inoculo. As contagens foram feitas de seis em seis horas, após 24 horas
de inoculo.
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Gráfico 2: Curva de crescimento de Paramecium caudatum a 30°C , pH 8 e no escuro
Os resultados dos testes de toxicidade frente aos diferentes metais estão
representados na Figura1. A tolerância do protozoário ciliado é maior ao Lítio ( LC50 > 3,5
mg/L), enquanto que a sua tolerância ao mercúrio e ao cobre se revelaram muito menor, ou
seja o paramecium caudatum apresenta uma grande sensibilidade quando exposto á
contaminações com esses metais, a figura 2 apresenta uma ANOVA com essa relação. A
LC 50 está representada na Tabela 1. A LC50 24 horas (concentração letal a 50%),
apresentou uma ANOVA, conforme Tabela 2, onde o P-valor igual a zero com um intervalo
de confiança de 95% significa que há diferença na tolerância do protozoário ás diferentes
concentrações dos doze metais.
Tabela 1: LC 50 após 24h em mg/L com intervalo de confiança (I.C.) de 95 %
metal
Al
Ba
Cd
Pb
Co
Cu
Fe
Li
Mn
Hg
Ni
Zn
LC 50(mg/L)
0.31
0.23
0.21
0.23
0.21
0.02
0.47
3.71
0.25
0.0017
0.48
0.41
I.C. (0.95%)
0.27
0.35
0.19
0.29
0.16
0.27
0.19
0.29
0.16
0.27
0.015
0.025
0.41
0.54
3.65
3.91
0.19
0.31
0.0011
0.0022
0.35
0.53
0.36
0.47
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Tabela 2 : ANOVA: LC-50 dos experimentos com os Metais, P-valor=0,00
Metais
erro
total
GL
11
24
35
SQ
34.41894
0.09972
34.51866
QM
3.12899
0.00415
F
753.09
P-valor
0,000
S = 0.06446 R-Sq = 99.71% R-Sq (adj) = 99.58%
A tabela 2 apresenta um resumo da analise estatística, dos resultados obtidos frente
aos doze metais e as diferentes concentrações, ás quais foram submetidos os
protozoários. Nestas analises pode se verificar que houve uma diferença significativa em
relação às concentrações dos metais e a aceitação dos resultados é satisfatório com um Pvalor = zero, que mostra uma diferença de comportamento do protozoário ciliado frente as
diferentes concentrações.
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Figura 1 Média da mortalidade (95% de confiança) registrada para o paramecium cudatum
depois de 24h expostos às diferentes concentrações dos doze metais.
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CONCLUSÕES
O protozoário Paramecium caudatum apresentou melhores condições de
crescimento em temperatura de 30ºC e pH 8 . O volume dos frascos não interfere no seu
cultivo, porém seu crescimento é melhor no escuro total. A faixa de crescimento
populacional que o cultivo apresentou maior densidade foi entre 78 e 96 horas após o
inoculo. Os testes de toxicidade realizados em diferentes concentrações mostram que a
maior sensibilidade do protozoário é em relação ao Mercúrio, e a menor sensibilidade ao
Lítio. A LC50 entre os doze metais testados nos mostra uma pouca tolerância do
paramecium caudatum ás concentrações exibidas nas faixas máximas permitidas aos
organismos superiores.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS:
MADONI, P.; ROMEO, M. G.; Acute toxicity of heavy metals towards freshwater ciliated
protists. Environmental Pollution, 141: 1-7. 2006.
PACE, M.L. & ORCUTT, JR J.D. The relative importance of protozoans, rotifers and
crustaceans in a freshwater zooplankton community. Limnology and Oceanography 36,
822-830. 1981.