UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO BIOLOGIA DE AGENTES INFECCIOSOS E PARASITÁRIOS INTERAÇÃO PARASITO HOSPEDEIRO ENTRE METACESTÓIDES E Ageneiosus ucayalensis CASTELNAU 1855 (PISCES SILURIFORMES) ORIUNDOS DA BAIA DO GUAJARÁ-BELÉM- PARÁ: ASPECTOS MORFOLÓGICOS, MOLECULARES, BIOLÓGICOS E ANGIOGÊNICOS FABRISIA SILVA D’ENCARNAÇÃO Belém-Pará 2013 FABRISIA SILVA D’ENCARNAÇÃO INTERAÇÃO PARASITO HOSPEDEIRO ENTRE METACESTÓIDES E Ageneiosus ucayalensis CASTELNAU 1855 (PISCES SILURIFORMES) ORIUNDOS DA BAIA DO GUAJARÁ-BELÉM- PARÁ: ASPECTOS MORFOLÓGICOS, MOLECULARES, BIOLÓGICOS E ANGIOGÊNICOS Dissertação de Mestrado apresentado ao Curso de Mestrado do Programa de PósGraduação em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Pará como requisito para obtenção do grau de Mestre em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários. Orientadora: Profa. Dra. Jeannie Nascimento dos Santos. Belém-Pará 2013 FABRISIA SILVA D’ENCARNAÇÃO INTERAÇÃO PARASITO HOSPEDEIRO ENTRE METACESTÓIDES E Ageneiosus ucayalensis CASTELNAU 1855 (PISCES SILURIFORMES) ORIUNDOS DA BAIA DO GUAJARÁ-BELÉM- PARÁ: ASPECTOS MORFOLÓGICOS, MOLECULARES, BIOLÓGICOS E ANGIOGÊNICOS Dissertação de Mestrado apresentado ao Curso de Mestrado do Programa de PósGraduação em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Pará como requisito para obtenção do grau de Mestre em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários. Orientadora: Profa. Dra. Jeannie Nascimento dos Santos Laboratório de Biologia Celular e Helmintologia ICB/UFPA Banca Examinadora: Prof. Dr. Arnaldo Maldonado Junior Laboratório de Biologia e Parasitologia de Mamíferos Silvestres e Reservatório, FIOCRUZ/RJ Prof. Dr. Maurílio José Soares Laboratório de Biologia Celular, Instituto Carlos Chagas, FIOCRUZ/PR Profa. Dra. Elane Guerreiro Giese Laboratório de Histologia e Embriologia Animal, ISPA – UFRA Prof. Dr. Adriano Penha Furtado (Suplente) Laboratório de Biologia Celular e Helmintologia, ICB/UFPA Belém, 06 de Dezembro de 2013 ―A mente que se abre a uma nova ideia jamais voltará ao seu tamanho original‖. Albert Einstein (1879 – 1955) Dedico este trabalho a Deus, criador de todas as coisas inclusive os parasitos. Aos meus pais e a todos os meus amigos pela presença constante e encorajamento durante essa jornada. Fabrisia D`Encarnação AGRADECIMENTOS Em primeiro lugar expresso meu agradecimento a Deus que me direcionou em todos os momentos e colocou ao meu dispor todos que de alguma forma contribuíram para a realização desse trabalho. Aos meus familiares pelo encorajamento, compreensão e orações, mesmo de longe, direcionadas ao meu favor. Á minha orientadora Profa. Dra. Jeannie Nascimento dos Santos, pela diligência e sabedoria em orientar e contornar todos os obstáculos que sobrevieram durante a realização desse trabalho. À Prof. Dra. Elane Guerreiro Giese, do Laboratório de Histologia e Embriologia Animal, ISPA – UFRA pelas ajudas nunca negadas quando foram necessárias e apeladas, durante a realização dessa monografia. As Prof. Dr Adriano Penha Furtado do Laboratório de Biologia Celular e Helmintologia ―Profa. Dra. Reinalda Marisa Lanfredi‖, pelas contribuições durante a realização deste trabalho. Ao Prof. Dr. Paulo Pimenta do Laboratório de Entomologia Médica do Instituto Osvaldo Cruz de Belo Horizonte – Minas Gerais (FIOCRUZ-MG) que colocou o seu laboratório à disposição para a realização de treinamentos e parte do procedimento da Microscopia Eletrônica de Varredura e Transmissão. À mestranda Luciana de Cássia Silva do Nascimento, pela paciência, contribuição na realização dos experimentos e esclarecimento de dúvidas sempre que foi necessário. Ao Prof. Dr. Evonnildo Gonçalves do Laboratório de Tecnologia Biomolecular do Instituto de Ciências Biológicas - UFPA, pelo fornecimento do espaço físico para concretização de algumas etapas desse trabalho e pelas valiosas contribuições na realização deste trabalho. À Profa. Dra. Edilene Oliveira, responsável pelo Laboratório de Ultraestrutura do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Pará pelo espaço cedido para utilização de equipamentos necessários durante a realização de técnicas histológicas. Ao Prof. Dr. Antonio Vallinoto do Laboratório de Virologia do Instituto de Ciências Biológicas - UFPA, pela disposição, opiniões cedidas e tentativas de ajuda em algumas áreas do desenvolvimento dessa dissertação. Aos mestrandos e doutorandos do laboratório de Biologia Celular e Helmintologia ―Profa. Dra. Reinalda Marisa Lanfredi‖ pelo carinho, alegria, choro e risadas que demos juntos nessa jornada e que muito nos acrescentou como cidadãos. A todos os estagiários do Laboratório de Biologia Celular e Helmintologia ―Profa. Dra. Reinalda Marisa Lanfredi‖, que de alguma forma deram sua contribuição para realização desse trabalho. Às minhas conterrâneas, Elisabeth Correia Rodrigues, Tânia Carlice dos Reis, Núria Jussara Silva, Andreneida Letícia Santos, e à Kátia do Amorim pela paciência, compreensão e palavras de conforto, demonstradas e proferidas em muitos momentos difíceis. À todos os meus Irmãos em Cristo que se fizeram presentes por meio de orações ao meu favor e que contribuiu para o encorajamento e finalização deste trabalho SUMÁRIO LISTA DE FIGURAS ................................................................................................... 8 RESUMO................................................................................................................... 11 ASTRACT ................................................................................................................. 12 1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 13 1.1 Ageneyosus ucayalensis (CASTELNAU, 1855). ............................................... 15 1.1.1 Classificação Taxonômica ................................................................................ 15 1.1.2 Distribuição geográfica e hábitos de vida ......................................................... 16 1.1.3 Helmintos Parasitos de Ageneiosus ucayalensis ............................................. 17 1.2 CESTODA ........................................................................................................... 19 1.2.1 Características dos Cestodas da Família Proteocephalidae ............................ 25 1.2.2 Ciclo de vida dos Cestodas da família Proteocephalidae ........................... 26 1.3 PRODUTOS DE EXCREÇÃO E SECREÇÃO (E/S) DE CESTÓDEOS .............. 27 1.4.1 Fatores de Indução da Angiogênese ................................................................ 37 1.4.2 Helmintos e angiogênese ................................................................................. 40 1.4.3 Helmintos cestodas e angiogênese .................................................................. 45 1.5 OBJETIVOS ........................................................................................................ 48 1.5.1 Objetivo geral ................................................................................................... 48 1.5.2 Objetivos específicos........................................................................................ 48 2 MATERIAL E MÉTODOS ...................................................................................... 49 2.1 COLETA DE HOSPEDEIROS E AMOSTRAS DE PARASITOS CESTODAS .. 49 2.2 MICROSCOPIA DE LUZ ..................................................................................... 50 2.2.1 Análise taxonômica de Cestoda ....................................................................... 50 2.2.2 Análise histológica pelo método de inclusão em historesina® ......................... 50 2.2.3 Análise histológica pelo método de inclusão em parafina ................................ 51 2.3 BIOLOGIA MOLECULAR .................................................................................... 51 2.3.1 Extração de DNA e sequenciamento para Taxonomia e Filogenia .................. 51 2.4 MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE TRANSMISSÃO .......................................... 53 2.5 MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA (MEV)................................... 54 3 RESULTADOS ....................................................................................................... 55 3.1 AMOSTRAS DE CESTÓDEOS PARASITOS ..................................................... 55 3.2.ASPECTOS MORFOLÓGICOS DAS LARVAS ................................................... 58 3.2.1 Morfotipo I (Larvas Plerocercóides) .................................................................. 58 3.2.2 Morfotipo II (Larvas Merocercóides) ................................................................. 66 3.2.3 Morfotipo III (Larvas Merocercóides) ................................................................ 73 3.3 ANÁLISE MOLECULAR COMPARATIVA ENTRE OS MORFOTIPOS LARVARES I E II ....................................................................................................... 74 3.4 ANÁLISE DOS ASPECTOS ANGIOGÊNICOS DO PARASITISMO ................... 79 3.4.1 Descrição histológica........................................................................................ 79 3.4.2 Reconstrução tri- dimensional .......................................................................... 88 3.4.3 Microscopia Eletrônica de Varredura da massa cística .................................... 92 4 DISCUSSÂO ........................................................................................................ 103 4.1 ANÁLISE MORFOLÓGICA ............................................................................... 103 4.2 BIOLOGIA MOLECULAR .................................................................................. 106 4.3 CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS DA RELAÇÃO ENTRE AS LARVAS METACESTÓIDES E A.ucayalensis ....................................................................... 107 4.3.1 Aspectos histológicos ..................................................................................... 107 4.3.2 Aspectos ultraestruturais ................................................................................ 108 4.3.3 Aspectos Angiogênicos .................................................................................. 111 4.4 ASPECTOS BIOLÓGICOS ............................................................................... 113 4.4.1 Prospecção Parcial do Ciclo Biológico ........................................................... 113 4.4.2 Ecologia do parasitismo ................................................................................. 115 5 CONCLUSÕES .................................................................................................... 117 REFERÊNCIAS ....................................................................................................... 119 LISTA DE FIGURAS Figura 1: Características morfológicas de Ageneiosus ucayalensis ......................... 16 Figura 2: Mapa da distribuição geográfica de Ageneiosus ucayalensis ................... 17 Figura 3: Helmintos Parasitos de Ageneiosus ucayalensis visualizados pela Microscopia Eletrônica de Varredura e Microscopia de Luz ...................................... 18 Figura 4: Representação esquemática e ilustrativa das estruturas externas constituintes do corpo de cestódeos. ........................................................................ 20 Figura 5: Organização tegumentar de cestódeos). .................................................. 21 Figura 6: Representação esquemática das estruturas de excreção e osmorregulação contituintes dos cestódeos.............................................................. 22 Figura 7: Representação esquemática de seis formas larvares de cestóides ou metacestoides. .......................................................................................................... 23 Figura 8: Desenho ilustrativo das estruturas dos ovos de parasitos da classe Cestoda. .................................................................................................................... 24 Figura 9: Processo de desenvolvimento de formas larvares dos parasitos da família Proteocephalidae, em hospedeiros intermediários e definitivos. ............................... 26 Figura 10: Ciclo de vida de Cestoda da Família Proteocephalidae .......................... 27 Figura 11: Representação esquemática das estruturas que compõe o sistema circulatório. ................................................................................................................ 31 Figura 12: Ilustração das camadas de revestimento dos vasos sanguíneos. .......... 32 Figura 13: Processo angiogênico desencadeado pela desestabilização do equilíbrio das substâncias pró e anti-angiogênicas. ................................................................. 33 Figura 14: Esquema ilustrativo dos tipos de angiogênese que podem ocorrer a partir de plexus capilares primitivos ou vasculogênese)..................................................... 34 Figura 15: Esquema ilustrativo do processo de migração e proliferação das células endoteliais para formar novos vasos sanguíneos. .................................................... 36 Figura 16: processo de indução da proliferação celular e formação de vascularização em eventos patogênicos. .................................................................. 37 Figura 17: Mecanismo de sinalização do VEGF nas células endoteliais). ............... 38 Figura 18: Mecanismo de liberação e ligação do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) desencadeando a formação de novos vasos sanguíneos ............. 39 Figura 19: Variantes do fator de crescimento endotelial vascular e os possíveis receptores, aos quais estas substâncias se ligam para desencadear eventos angiogênico ............................................................................................................... 40 Figura 20: Esquema ilustrativo da angiogênese desencadeada por parasitos helmintos. .................................................................................................................. 41 Figura 21: Estimulação das células endoteliais e formação de capilares ................. 42 Figura 22: Papel das galectinas 1 e 3 na imunomodulação do sistema imune do hospedeiro e na indução da proliferação celular e angiogênese, desencadeado pelos patógenos.................................................................................................................. 43 Figura 23: Hospedeiro Ageneiosus ucayalensis e a localização e disposição dos cistos de cestóides e os vasos sanguíneos dentro do hospedeiro. ........................... 56 Figura 24: Desenho morfológico da fase larval Plerocercóide do Morfotipo I .......... 58 Figura 25: Características morfológicas das Larvas do Morfotipo I visualizadas por meio de técnicas histológicas. ................................................................................... 60 Figura 26: Caracteristicas morfológicas da bolsa cistica e das formas larvares de cestóides, observados pela Microscopia Eletrônica de Varredura.. .......................... 63 Figura 27: Características morfológicas das larvas plerocercóides de Cestódeos encontrados parasitando Ageneiosus ucayalensis, observados pela Microscopia Eletrônica de Varredura. ........................................................................................... 64 Figura 28: Desenho morfológico de larvas do Morfotipo II (Merocercóides). ........... 66 Figura 29: Características morfológicas das Larvas do Morfotipo II visualizadas por meio de técnicas histológicas. ................................................................................... 68 Figura 30: Características morfológicas de larvas do Morfotipo II (fase larvar Merocercóide). .......................................................................................................... 71 Figura 31: Desenho morfológico da larva do Morfotipo III (merocercóide) ............... 73 Figura 32: Árvore filogenética obtida pelo método da Máxima Parcimônia, avaliando parte da Subunidade menor do DNA ribossomal de Cestódeos ............................... 76 Figura 33: Árvore filogenética feita utilizando o método da Inferência Baesiana, com a finalidade de comparar parte da Subunidade menor do DNA ribossomal de Cestódeos ................................................................................................................. 77 Figura 34: Análise de cortes histológicos de amostras embebidas em historesina® e coradas pelo Azul de Toluidina. ................................................................................ 81 .Figura 35: imagens de secções histológicas semi-finas do tecido contendo cistos de parasitos Cestódeos e vasos sanguineos ao redor ................................................... 83 Figura 36: Análise histológica de Cistos e vasos em amostras embebidas em parafina e submetidos à coloração pela Hematoxilina – Eosina, Tricrômio de Mallory e Orceína................................................................................................................... 84 Figura 37: Análise histológica de Cistos e vasos embebidos em parafina e submetidos à coloração pelo Tricrômio de Gomori e pelo Ácido Periódico de Schiff (PAS). ........................................................................................................................ 86 Figura 38: Reconstrução tri-dimensional dos cistos de cestóides e vasos sanguíneos adjacentes a partir da somatória de 201 secções seriadas de material embebido em Historesina®, obtido do parasitismo por cestóide em Ageneiosus ucayalensis da Baia do Guaja, Belém-PA. ................................................................ 89 Figura 39: Diversos ângulos da reconstrução tri-dimensional obtidas a partir de rotações no eixo X e Y, permitindo a visualização detalhada das estruturas envolvidas no processo angiogênico induzida por larvas de Cestódeos em Ageneiosus ucayalensis. ........................................................................................... 91 Figura 40: Características morfológicas do saco de tecido conjuntivo e vasos sanguíneos que envolvem os cistos de Cestódeos, observados pela Microscopia Eletrônica de Varredura. ........................................................................................... 93 Figura 41: Estruturas celulares e teciduais da bolsa cística ricamente vascularizada e formada por larvas de Cestódeos em Ageneiosus ucayalensis observados através da técnica de Microscopia Eletrônica de Transmissão. ............................................. 97 Figura 42: Aspectos da inter-relação vasos sanguíneos, cisto e, tegumento de larvas de Cestódeos ou Metacestódeos observados através da técnica de Microscopia Eletrônica de Transmissão. ................................................................... 99 Figura 43: Ultraestrutura do tegumento de larvas de Cestódeos ou Metacestódeos observados através da técnica de Microscopia Eletrônica de Transmissão. .......... 101 Figura 44: Diagrama ilustrativa de possíveis formas de atuação de Ageneiosus ucayalensis, no ciclo biológico de Metacestódeos Proteocephalídeos de Belém –PA. ................................................................................................................................ 113 RESUMO Os helmintos parasitos interagem com seus hospedeiros modulando o sistema imune e desta forma garantindo o seu desenvolvimento, crescimento e longevidade nesses hospedeiros. Um dos meios encontrados para garantir esta permanência é a formação de uma vascularização que atua no transporte de oxigênio e nutrientes do hospedeiro para os parasitos e na excreção de metabólitos desses parasitos para o hospedeiro. Este processo é bem caracterizado No parasitismo de alguns helmintos como o Schistosoma mansoni, porém pouco se sabe a respeito desse aspecto em relação a outros helmintos parasitos. Assim, o presente trabalho tem como objetivos caracterizar os aspectos estruturais e moleculares básicos de larvas de Cestoda da família Proteocephalidae parasitos de Ageneiosus ucayalensis, assim como caracterizar aspectos da biologia e do parasitismo dessas larvas, incluindo processo angiogênico no hospedeiro. Exemplares de Ageneiosus ucayalensis da Baía do Guajará foram adquiridos ainda vivos de pescadores ribeirinhos e as larvas de Cestoda encistadas foram retiradas e submetidas à identificação através das técnicas de taxonomia clássica e biologia molecular. Técnicas histológicas e de microscopia eletrônica foram aplicadas para descrição dos aspectos celulares e estruturais do parasitismo por estas larvas. Entre as larvas de Cestoda, três morfotipos distintos, possivelmente pertencentes a gêneros e espécies distintas, em diferentes fases (Plerocercóide e Merocercóide) foram identificados. Os cistos estabelecem contato íntimo com a superfície dos vasos sanguíneos e os parasitos mostram aspectos ultraestruturais característicos de atividades de troca de metabólitos entre tecido do hospedeiro e parasito. No entanto são necessários estudos futuros sobre as moléculas envolvidas no estabelecimento do quadro deste parasitismo bem como a caracterização de fatores angiogênicos. Palavras- chave: Metacestódeos, Ageneiosus ucayalensis, Baia do Guajará, Belém, Angiogênese ASTRACT The helminth parasites interact with their host by modulating the immune system and ensuring the growth, longevity and their development in these hosts. One way found to guarantee the stay inside the host is the formation of a vasculature that mediate the transport of oxygen and nutrients from the host to the parasites and excretion of metabolites of these parasites to the host. This process is well characterized in some parasitic helminths such as Schistosoma mansoni, but little is known about those aspects to other helminth parasites. Thus, the present study has the objective to characterize the structural and molecular aspects of Proteocephalidae metacestoes parasites of Ageneiosus ucayalensis, as well as characterize the biology and parasitism of the larvae, including the angiogenic process in the host. Samples of live Ageneiosus ucayalensis from Guajará Bay were acquired by local fishermen and encysted metacestode were removed and identified using classical taxonomy and molecular biology techniques. Histological and electron microscopy techniques were applied to describe the cellular and structural aspects of parasitism by these larvae. Among the metacestode found, we observed three distinct morphotypes, possibly belonging to different genera and species, in different phases (Plerocercoid and Merocercoid). The cysts establish intimate contact with the surface of blood vessels and ultrastructural aspects of trading activities of metabolites between the host tissue and parasites were observed. However, future studies are necessary to understand the molecules involved in the larval estabilishment as well as to characterize the possible angiogenic factors. Keywords: Angiogenesis Metacestodes, Ageneiosus ucayalensis, Guajará Bay, Belem, 13 1 INTRODUÇÃO A interação entre o sistema imunológico de vertebrados e alguns dos principais grupos de helmintos ocorre desde o início da co-evolução entre hospedeiro e parasito (Jackson et al., 2008). A capacidade que estes parasitos têm de modular o sistema imunológico aumenta sua longevidade no hospedeiro vertebrado. A base molecular dessa imunomodulação realizada por helmintos é de grande interesse científico uma vez que irá refletir a história de vida, estratégias de transmissão e nichos fisiológicos de Nematoda, Cestoda e Trematoda (Hewitson et al., 2009). Para se evadir do sistema imunológico do hospedeiro, os parasitos produzem uma série de enzimas e proteínas que atuam inibindo ou alterando o funcionamento do sistema imune em favor dos parasitos, e isso os possibilita um ambiente estável para o seu desenvolvimento, crescimento e permanência no hospedeiro. Assim, o equilíbrio entre as respostas pró e anti-inflamatórias determinam o destino do parasito e as imunopatologias induzidas no hospedeiro (Klaus, 2007). Várias pesquisas em Biologia Molecular da interação parasito-hospedeiro têm demonstrado a ação dessas substâncias protéicas e enzimáticas, como por exemplo: 1) na inibição da proliferação de células T e produção de óxido nítrico por macrófagos, desencadeado por Heligmosomoides polygyrus (Rzepecka et al., 2006); 2) na indução da resposta Th2 e inibição da migração de neutrófilos por Equinococcus granulosus (Siracusano et al., 2008); 3) na promoção da invasão parasitária e infeção de hospedeiros mamíferos por Fasciola hepatica (Robinson et al., 2009); 4) na inibição do processamento de antígenos e modulação da resposta imune antígeno específico por Nipostrongilus brasiliensis (Dainichi et al., 2001); 5) na inibição da sinalização de receptores Toll Like por Schistosoma mansoni (Brannstrom et al., 2009); 6) na inibição da proliferação de células TCD4+ e células B por Acanthocheilonema viteae (Marshall et al., 2005), entre outros. Estes e demais estudos têm contribuído para a comprovação e elucidação desses mecanismos imunomoduladores (Hewitson et al., 2009). A análise sistemática de produtos de Excreção/Secreção (E/S) de helmintos só se tornou possível com os avanços das técnicas de Biologia Molecular, favorecendo a compreensão do parasitismo e da interação existente entre parasitos e hospedeiros, assim como o fornecimento de dados relevantes para a aplicação 14 terapêutica, como o desenho de novas drogas anti-helmínticas, vacinas e diagnósticos (Brehm et al., 2006). Além da imunomodulação da resposta do hospedeiro induzida pelos helmintos, também há evidências de uma possível relação entre infecções helmínticas e doenças alérgicas. As infecções por helmintos constituem um dos fatores ambientais que estão associados ao risco de desenvolvimento ou não de alergias (Flohr et al., 2008). Klaus (2007) estabeleceu a hipótese de bloqueio de imunoglobulina E, onde se acredita que as IgEs não específicas (policlonais) induzida pela infecção por helmintos saturam os sítios de ligação da IgE impedindo a ligação de alérgenos IgE específicos, mostraram que esta interação pode suprimir a resposta imunológica contra alergia. A hipótese mencionada anteriormente não foi constatada por Wohlleben et al. (2004) quando estes utilizaram dois grupos de camundongos, um infectado por Nipostrongylus brasiliensis e imunizado com ovalbumina e outro apenas imunizado com ovalbumina, e avaliaram o grau de competição das IgEs de N. brasiliensis, e IgEs de ovalbumina pelos sítios de ligação de IgEs. Após os experimentos observaram que não houve diferença significativa na expressão alérgica pelos dois grupos. Este tipo de interação pode se mostrar positiva ou negativa dependendo da espécie estudada, o tempo e a intensidade da infecção, e são de grande relevancia, pois podem trazer novidades quanto ao desenvolvimento de drogas derivados de parasitas não só para o tratamento como, também, para a prevenção de doenças alérgicas. Outro aspecto da relação helminto-hospedeiro é a indução da proliferação celular verificada na associação entre o parasitismo por helminto e fibrose hepática, assim como entre o parasitismo por helminto e a angiogênese. O quadro de fibrose no organismo se caracteriza pelo acúmulo de matriz extracelular e exibe tanto neovascularização, quanto a proliferação de células secretoras de matriz (Lemos et al., 2010). Dentre os diversos fatores que podem desencadear a fibrose hepática, encontram-se as infecções helmínticas provocadas principalmente por Schistosoma mansoni Silva, 1908 e Capillaria hepatica Bancroft, 1893. Em ambas patologias a fibrose ocorre devido ao acúmulo de ovos desses parasitos no fígado do hospedeiro, causando obstrução com o comprometimento da fisiologia hepática e esclerose. 15 Segundo os experimentos de Kanse et al. (2005) e Lemos et al. (2010), os ovos são as únicas formas de vida de S.mansoni, capazes de secretar/excretar substâncias que estimulam a proliferação e a migração das células endoteliais, e células dos músculos lisos dos vasos. A progressão da doença para o estágio de fibrose na capilaríase hepática envolve a proliferação de vasos sanguíneos. Nos dois casos, a presença dessas formas parasitárias no tecido, estimula uma resposta inflamatória que culmina na ativação de leucócitos, fibroblastos e células endoteliais desencadeando uma reação de cicatrização da área lesionada. Esta reação se traduz inicialmente em um processo angiogênico e, posteriormente, em uma fibrose nesse local. Os mecanismos para elucidação da origem desses estímulos, do hospedeiro ou do parasito, são alvos dos pesquisadores no quesito interação ParasitoHospedeiro. 1.1 Ageneyosus ucayalensis (CASTELNAU, 1855). 1.1.1 Classificação Taxonômica Ageneiosus ucayalensis, peixe siluriforme conhecido popularmente como mandubé, é um integrante da Familia Auchenipteridae e se caracteriza, principalmente, por apresentar corpo não revestido por escamas, cabeça afilada na sua extremidade anterior, fenda bucal larga e ampla, olhos situados lateralmente no prolongamento da boca, dentes diminutos, viliformes e localizados em placas. Os barbilhões maxilares são geralmente reduzidos e os mentonianos, ausentes (Fig. 1). Apresentam dimorfismo sexual em que os machos têm barbilhões maxilares e os espinhos da nadadeira dorsal rígidos, hipertrofiados e providos de ganchos. São todos carnívoros pelágicos e ocorrem geralmente no leito dos rios. Além desta espécie, existem outras três espécies que ocorrem no Brasil: Ageneiosus brevifilis Valenciennes, 1840 e Ageneiosus dentatus Kner, 1858 de maior valor comercial e Ageneiosus inermis Linnaeus, 1766 (Santos et al., 2006). 16 Figura 1: Características morfológicas de Ageneiosus ucayalensis, evidenciando o corpo sem escamas, a cabeça afilada na estremidade anterior e olhos laterais em relação ao prolongamento da boca. Barra = 3 cm. Fonte: Laboratório de Biologia Celular e Helmintologia (2012). 1.1.2 Distribuição geográfica e hábitos de vida Os peixes ocupam a maioria dos níveis tróficos, desde herbívoros até carnívoros secundários, podendo ser generalistas, sem especificidade alimentar, ou especialistas, fazendo uso de um número restrito de tipos de alimentos. Estas informações permitem estabelecer a dinâmica de uma determinada comunidade, e as relações que podem influenciar a estrutura e interações ecológicas como predação e competição (Ribeiro et al., 2003). Neste estudo os autores constataram que A. ucayalensis era um consumidor ―de topo‖ de cadeia e mais tarde Froese & Pauly (2010) o caracterizaram como uma espécie carnívora, podendo alimentar-se de pequenos peixes e camarões. A espécie A. ucayalensis encontra-se distribuída na Amazônia e bacias do Rio Orinoco mais especificamente, na América do Sul desde a bacia do Amazonas e Orinoco, até a bacia do alto Paraná (Fig. 2) (Froese & Pauly, 2010). 17 Figura 2: Mapa da distribuição geográfica de Ageneiosus ucayalensis, indicado pelo círculo em vermelho. Adaptado de www.fishwise.co.za › Search › Species Detail Page, acessado em 12 de agosto de 2012. 1.1.3 Helmintos Parasitos de Ageneiosus ucayalensis Relatos de helmintos parasitando espécies de peixes tem se tornado frequente na literatura. O interesse nesse tipo de parasitismo deve-se ao fato da importação de cardápios com peixes crus da culinária oriental, destacando o potencial zoonótico como um problema de saúde pública, uma vez que muitos peixes servem como hospedeiros intermediários ou paratênicos de helmintos e muitos desses parasitos tem o homem como hospedeiro definitivo (Oliveira, 2005). Giese (2010), em sua tese de doutorado, realizou a primeira descrição da helmintofauna de A. ucayalensis da Foz do rio Guamá e Baia do Guajará em Belém, Pará relatando a presença de parasitos dos filos Platyhelminthes, Acanthocephala e Nematoda. Para o filo Platyhelminthes foram descritos parasitos das classes Cestoda (larvas plerocercóides da família Proteocephalidae e adultos representantes do gênero Gibsoniela) e Monogenea (integrantes da família Dactylogyridae). Como representantes do filo Acantocephala apenas exemplares do gênero Neoechinorhynchus foram encontrados, e do filo Nematoda foram observados 18 integrantes dos gêneros Anisakis, Pseudoproleptus, Cucullanus e Procamallanus (Fig. 3). Figura 3: Helmintos Parasitos de Ageneiosus ucayalensis visualizados pela Microscopia Eletrônica de Varredura e Microscopia de Luz: A) Cucullanus ageneiosus com 2 pares de papilas cefálicas (cp), e anfídios (am). Barra = 15 µm. B) Pseudoproleptus sp com colar cefálico (cl), e anfídio (an). Barra = 10 µm. C) Procamallanus (Spirocamallanus) belenensis com abertura oral (ma), deirídio (d) e poro excretor (ep). Barra = 50 µm. D) Anisakis sp com dente larvar (dl), boca (b), papilas cefálicas (pc), anfídio (an) e poro excretor (pe). Barra = 4 µm. E) Neoechinorhynchus sp mostrando Proboscide com ganchos grandes (g) e pequenos (gp). Barra = 10 µm. F) Gibsoniela sp mostrando escólex com ventosas triloculadas (Vtl). Barra = 50 µm. G) Monogenea Dactylogiridae da ordem Ancyrocephalinae, mostrando a regiao cefálica (lb), e opistohaptor (oh). Barra = 10 µm. H) Larva Plerocercoide da família Proteocephalídea com órgão apical (oap) e ventosa circular (v). Barra = 10 µm. Fonte: Adaptado de Giese (2010); Giese et al. (2009) e Giese et al. (2010. 19 1.2 CESTODA Os cestódeos formam um grupo de helmintos que se distinguem da classe Trematoda e do filo Nematoda por dois fatores morfológicos: a ausência de um canal alimentar que determina a fisiologia desses parasitos, e por possuírem um corpo bastante alongado. O parasito adulto tem preferência por habitats com níveis nutricionais elevados como o tubo digestivo, vesícula biliar e dutos pancreáticos; enquanto que as larvas têm seus habitats em sítios mais inespecíficos e por esta razão são de difícil visualização em órgãos dos hospedeiros vertebrados e invertebrados (Smyth, 1994; Schmidt et al., 2009 ). A classe Cestoda subdivide-se em duas subclasses: Cestodaria (cestódeos cujo corpo não se divide em segmentos e que possuem apenas um tipo de órgão reprodutor) e Eucestoda (cestódeos com corpo dividido em segmentos ou proglótides e que possuem ambos os órgãos reprodutores feminino e masculino). Os parasitos pertencentes à Subclasse Eucestoda possuem as três formas evolutivas (helmintos adultos, ovos e larvas) e têm como principais características a presença de escólex na extremidade anterior, corpo ou estróbilo dividido em proglotes, o hermafroditismo e ovos com embrião hexacanto (Schmidt et al., 2009). As formas adultas são parasitos de vertebrados, geralmente achatados dorsoventralmente e não apresentam cavidade geral nem tubo digestivo. São constituídos por uma extremidade anterior denominada escólex, onde se situam os órgãos de fixação, seguido do pescoço ou colo, região que une o escólex ao restante do corpo do parasito, e do estróbilo onde ocorre a segmentação dos proglotes e o desenvolvimento do parasito (Fig. 4). Os proglotes podem ser encontrados nas fases imaturas, sem total desenvolvimento dos órgãos sexuais, maturas, com os órgãos sexuais masculinos e femininos bem desenvolvidos, e gravídicos, repletos de ovos embrionados (Fig. 4). Nesta fase final, esses proglotes podem se destacar do restante do corpo do parasita e possuem movimentos próprios. Localizado no excólex, está o sistema nervoso composto por gânglios cerebrais que inervam o mesmo assim como toda a extensão do corpo do parasito (Schmidt et al., 2009). 20 Figura 4: Representação esquemática e ilustrativa das estruturas externas constituintes do corpo de cestódeos: A) Cabeça ou escólice com os órgãos de fixação; B) Pescoço ou colo; C) Proglotes imaturas, com os órgãos sexuais pouco desenvolvidos e sem ovos; D) Proglotes maduros, com órgãos sexuais masculino e feminino bem desenvolvidos; E) Proglotes gravídicos repletos de ovos, incorporadas ao estróbilo e soltas. Fonte: Adaptado de Fonseca et al. (2002). O corpo do parasito é revestido por uma camada homogênea elástica de tecido vivo com alta capacidade metabólica denominada tegumento. Este se constitui de uma camada distal anucleada (citoplasma distal) contínua, isto é, sem intervenção da membrana celular, o que faz com que o tegumento seja do tipo sincicial. O citoplasma distal comunica-se com as células corporais nucleadas que se encontram abaixo da camada muscular superficial por meio de canais citoplasmáticos (Fig. 5) (Schmidt et al., 2009). Na superfície do parasito observam-se numerosas projeções denominadas microtríquias cuja finalidade é aumentar a área absortiva do tegumento. As microtríquias possuem uma porção distal densa que se separa da base por uma camada multilaminar. A base é composta por arranjos de microfilamentos (Fig. 5) (Schmidt et al., 2009). 21 Figura 5: Organização tegumentar de cestódeos. A) Estruturas constituintes do tegumento sincicial: B) Detalhes da contituição das microtríquias na parte superficial do tegumento onde se observa uma região apical pontiaguda (c), uma região basal (b), separadas por placas basais multilaminares (bp) e microfilamentos basais (mf). Fonte: Adaptado de Schmidt et al., (2009). A excreção de metabólitos ocorre por meio das células flama ou solenócitos, que se externalizam por meio de canais eferentes localizados nas bordas laterais de cada proglote. Normalmente dois pares de canais, um ventrolateral e outro dorsolateral, percorrem o comprimento do parasito e um terceiro canal transversal une o canal ventral à margem posterior da proglote. As células flamas se conectam a ductos coletores que desembocam dentro desses canais e, neste aparato, ainda se encontram flagelos que fornecem a força motriz para os fluidos do sistema (Fig. 6). A função desse sistema inclui o transporte ativo e regulação iônica de resíduos excretórios (Schmidt et al., 2009). 22 Figura 6: Representação esquemática das estruturas de excreção e osmorregulação contituintes dos cestódeos. Fonte: Adaptado de Schmidt et al. (2009). De acordo com Smyth et al. (1999), as formas larvares de parasitos de vertebrados ou invertebrados, se desenvolvem no intestino do hospedeiro intermediário ou definitivo; porém, o desenvolvimento em forma adulta ocorre apenas no hospedeiro definitivo quando este, ingere um hospedeiro intermediário infectado por este parasito. De acordo com estes autores o termo metacestóide pode ser usado para classificar todos os estágios larvais dos cestódeos. Chervy (2002) fez uma revisão sobre a nomenclatura de tais formas larvais e baseando-se nas características morfológicas classificou e denominou como mostra a Figura 7. 23 Figura 7: Representação esquemática de seis formas larvares de cestóides ou metacestoides: A) Procercóide (parasito sem escólex, geralmente caudado, com lacuna primária, e só desenvolve quando ingerido por um segundo hospedeiro intermediário); B) Plerocercóide (possui desenvolvimento parcial do escólex e este apresenta evaginado, sem lacuna, com ou sem sarcômero e infectante para hospedeiro definitivo); C) Merocercóide (presença de escólex invaginado, sem lacuna primária, caudado ou não); D) Plerocerco (lacuna primária ausente, escólex retraído, caudado, com ou sem bexiga); E) Cisticercóide (presença de lacuna primária, escólex retraído, com sarcômero evidente ou reduzido; F) Cisticerco (lacuna primária presente, escólex invaginado, com ou sem sarcômero e bexiga). Fonte: Adaptado de Chervy (2002). 24 Dependendo do grupo de Cestoda e da espécie, o processo de formação dos ovos podem ser diferentes devido à diversidade da forma uterina, mas de um modo geral resultam em uma oncosfera ou embrião hexacanto dotado de três pares de ganchos, o embrióforo, membrana que envolve a oncosfera, e a cápsula que reveste externamente o ovo. Em algumas espécies observa-se a formação de três membranas (Fig. 8) (Schmidt et al., 2009). Figura 8: Desenho ilustrativo das estruturas dos ovos de parasitos da classe Cestoda. 1 – Cápsula; 2 - Casca externa; 3 – Envoltório externo; 4 - Envoltório interno 5 – Embrióforo; 6 – Oncosfera com seis ganchos. Adaptado de Schmidt et al., 2009. A Subclasse Eucestoda é composta por cinco Ordens, onde duas possuem o maior número de representantes parasitos de peixes: Trypanoryncha e Proteocephalidea. A Ordem Proteocephalidea possui duas famílias: Monticellidae e Proteocephalidae. Esta última, com número representativo de espécies parasitas de peixes já descritas, se encontra subdividida em seis Subfamílias, com 18 gêneros e 77 espécies. O gênero Proteocephalus é o maior representante, em número de espécies descritas (Chambrier & Scholz, 2008). 25 Até a década de 30, menos de 50 espécies de proteocefalídeos eram conhecidos na América do Sul. Com o passar dos anos, este conhecimento aumentou, resultando em cerca de 100 espécies de proteocefalídeos descritos em aproximadamente 70 espécies hospedeiras de peixe (Rego, 2003). Rego (2003) considerou que a classificação sulamericana de proteocefalídeos tem sido controversa, devido às diversificações morfológicas e o enquadramento das espécies nas respectivas Famílias Proteocephalidae e Monticellidae. Em estudos de filogenia, este autor questionou a validade da Família Monticellidae, sugerindo a eliminação da mesma e de suas Subfamílias, ficando apenas a Família Proteocephalidae dentro da Ordem Proteocephalidea. Os parasitos que pertenciam aos gêneros da Família Monticellidae foram transferidos para as Subfamílias Corallobothriinae ou Proteocephalinae, dependendo da presença ou não de um metascólex. Assim considerando esta classificação de Rego (2003), o parasito que constitui o objeto desse estudo pertence ao: Filo – Platyhelminthes Gegenbaur, 1859. Classe – Cestoda Monticelli, 1892. Sub-classe – Eucestoda Southwall, 1930. Ordem - Proteocephalidea Mola, 1929. Família – Proteocephalidae Mola 1929. 1.2.1 Características dos Cestodas da Família Proteocephalidae De acordo com Smyth (1994) os membros da Família Proteocephalidae são parasitos de peixes de água doce, anfíbios ou répteis e são de pequena ou nenhuma importância econômica. Os helmintos adultos se caracterizam por possuírem escólex com quatro ventosas e, algumas vezes, apresentam um órgão apical.Os proglótides são semelhantes aos observados na Ordem Tetraphyllidea com folículos vitelínicos localizados nas margens laterais dos proglótides. Possuem poro genital lateral, com ovários localizados posteriormente e os numerosos testículos preenchendo a região anterior (Scholz, 1999). Baseando-se nas características larvares dos cestóides apresentados anteriormente na Figura 4, os proteocefalídeos podem ter dois tipos de formas 26 larvais: plerocercóides ou merocercoides. As características comumente observadas nas formas larvares da Família Proteocephalidae é a presença do Sarcômero, mais especificamente em espécies do gênero Proteocephalus, que pode permanecer ligado ao metacestóide ou separar-se, até três dias após a infecção dos hospedeiros intermediários (Fig. 9). Também é característico a invaginação do escólex por estes parasitos (Scholz, 1999). Figura 9: Processo de desenvolvimento de formas larvares dos parasitos da família Proteocephalidae, em hospedeiros intermediários e definitivos. A) Ovo liberado pelos adultos no ambiente, contendo o embrião hexacanto; B) Quando ingerido pelo hospedeiro intermediário, a casca do ovo rompe e o embrião é liberado; C) Embrião desenvolve para as fases larvares seguintes, denominados de metacestóides. Primeiramente origina a larva plerocercóide com ou sem sarcômero e este posteriormente evolui para larva merocercóide ainda dentro do hospedeiro intermediário. Nesta fase, o crescimento larvar se estaguina, até este encontrar um hospedeiro definitivo onde continua o desenvolvimento até a fase adulta, completando o ciclo evolutivo. Fonte: Adaptado de Chervy (2002). 1.2.2 Ciclo de vida dos Cestodas da família Proteocephalidae O ciclo de vida dos parasitos desta Família envolve os crustáceos como hospedeiros intermediários. A infecção inicia quando o hospedeiro intermediário ingere ovos infectantes que contêm a larva oncosfera multicelular (Fig. 10). No intestino os ovos eclodem e liberam as oncosferas que penetram a barreira intestinal, e passam por um processo de metamorfose para as fases larvares seguintes, chamados de metacestóides em órgãos-alvo específicos (Fig. 10). A transição segue-se para a fase de desenvolvimento do protoescólex (uma forma primitiva de escólex do adulto) que 27 eventualmente é retomada por hospedeiros definitivos. Estas transições sofrem influência do hospedeiro e são eventos chave no desenvolvimento do cestóide (Brehm et al., 2006). Figura 10: Ciclo de vida de Cestoda da Família Proteocephalidae. Os adultos habitam o intestino delgado de peixes e liberam ovos nas fezes que são embrionados no ambiente aquático. Os copépodes ingerem o ovo contendo uma larva na forma de oncosfera que eclode na cavidade intestinal e libera a larva plerocercóide. O copépode pode ser ingerido por um hospedeiro definitivo, onde continua o desenvolvimento da larva até a fase adulta e completa o ciclo, ou por um hospedeiro paratênico, onde o parasita não se desenvolve. Neste último caso o ciclo se completa quando um predador (grandes peixes) se alimenta do hospedeiro paratênico infectado. Fonte: Laboratório de Biologia Celular e Helmintologia (2013) 1.3 PRODUTOS DE EXCREÇÃO E SECREÇÃO (E/S) DE CESTÓDEOS Os cestódeos interagem com o ambiente em que vivem (hospedeiro intermediário ou definitivo) através do tegumento. Este contém uma variedade de proteínas e enzimas estruturais, algumas produzidas pelo parasito a exemplo de actina, tubulina, queratina, colágeno e outras adsorvidas dos fluidos do hospedeiro como colesterol, glucose, glicerol, todas envolvidas na evasão do sistema imune do hospedeiro pelo parasito, uma vez que o sistema imune reconhece e distingue o parasito, do hospedeiro, por meio dessas moléculas. Esta evasão pode ser explicada através de proteínas do glicocálice e da membrana das microtríquias capazes de proteger a digestão do parasita pelas enzimas proteolíticas do 28 hospedeiro ou pela internalização, conversão e exposição de proteínas na superfície dos parasitos que mimetizam as proteínas do hospedeiro, fazendo com que o organismo os reconheça como próprias (Marr et al., 2003). Apesar dos cestódeos constituírem a terceira maior Classe de helmintos, estudos relacionados aos seus ciclos de vida e dos produtos de secreção e excreção são relativamente poucos. No entanto, substâncias excretadas e secretadas, capazes de mimetizar ou modificar a função das substâncias endógenas dos hospedeiros são as armas principais de evasão do sistema imune pelos parasitos. Johnston et al. (2009) reuniram em um quadro os principais cestódeos descritos na literatura cujos produtos de excreção/secreção condicionam a imunomodulação, bem como as atividades biológicas desses produtos nas células dos hospedeiros (Quadro 1). Além destes, outros trabalhos têm mostrado a relação entre parasitismo por cestódeos e os locais alvos de seus produtos de E/S com função imunomoduladora. Como evidenciado por Miura et al. (2000), produtos de E/S de larvas plerocercóides de Spirometra erinaceieuropaei, possivelmente uma proteína, suprime a expressão do gene TNF-α e Lipopolissacarídeos (LPS) em macrófagos (Miura et al., 2000). Carmena et al. (2005), analisaram 12 amostras sorológicas de cães naturalmente infectados com Equinococus granulosus e identificaram sete componentes de antígenos de excreção/secreção. Mais tarde, Maity et al.(2007), ao realizar experimentos com isolados de E. granulosus parasitando búfalos na India constatou a presença de 7 peptídeos de flúidos do cisto que possuíam homologias com antígeno B de vertebrados. A Família de antígenos B influencia na migração de neutrófilos (Siracusano et al., 2008). Outro aspecto que merece ser considerado é o fato desses parasitos possuírem sistemas de sinalização semelhantes aos do hospedeiro, e secretam substâncias com funções idênticas dos mamíferos podendo haver uma comunicação crucial entre as citocinas secretadas e os receptores correspondentes, tanto do hospedeiro quanto do parasita, contribuindo para atividades imunomoduladoras ou favorecendo o tropismo dos parasitos para os órgãos. Um exemplo disso é demonstrado na presença da secreção de citocinas do tipo EGF e de receptores para EGF (Spiliotis et al., 2003), filogeneticamente homólogas a outros organismos, expressados em metacestóides e protoescólex de E. multiloculares. Apesar de ainda não existir uma comprovação de acoplamento ligante-receptor entre essas 29 moléculas, sabe-se que o gene codificante de EGF é expresso cerca de 10 vezes mais em vesículas de metacestóide em condições que promovem o crescimento e diferenciação do parasita (Spiliotis et al., 2003). Também há relatos de que E. multilocularis expressa receptores sinalizantes da família de insulina (IGF), que regulam processos metabólicos, controlam o crescimento, reprodução e envelhecimento (Geer et al., 1994) e evidências para a sinalização de TGF-ß que atuam no controle da proliferação, diferenciação, apoptose e regulação imune (Zavala et al., 2003). 30 Quadro 1: Exemplos de moléculas imunomoduladoras de cestódeos e suas funções biológicas em sítios alvos do hospedeiro. Cestódeo Produtos E/S Echinococcus granulosus Taenia multiceps Taenia taeniaeformis Taenia crassiceps Taenia solium Referência Rakha et al. (1991) Glicoesfingolipídeos de metacestóides Modifica função de macrófagos e inibe a proliferação de linfócitos in vitro. Inibe a proliferação de PBMC; diminui a expressão do receptor de IL-2. Proteinas 14-3-3 em produtos de E/S Inibe a produção de óxido nítrico induzida por LPS em macrófagos de ratos. Andrade et al. (2004) Produto de E/S Echinococcus multilocularis Bioatividade E4Gala1, 4Galglicanode extrato de protoscolesces Antigeno inibidor da proteaseBno fluido dahidatidose Inibe a proliferação induzida por mitogenicos; aumenta IL-10 Persat et al. (1996) Dematteis et al. (2001) Inibe recrutamento de neutófilo in vitro; aumenta a produção de IL-4 e IL-13 pelas PBMCs humanas; Shepherd et al. (1991) Rigano et al. (2001, 2007) Lectinade glicose nosfluidos císticos Pode ter função semelhante aos produtos de E/S de E.multilocularis Judson et al. (1987) Proteinase (19,5 kDa) Inibidor de extrato somático; inibe a proliferação de esplenócitos em resposta a estímulos mitogênicos e antigênica Leid et al.(1984, 1986) Suquet et al.(1984) Produtos de E/S Sequestra complemento; diminui a proliferação da produção de IL-2 induzida por esplenócitos mitogénicos Aumenta a proliferação e produção de IFNC e IL-10 induzida por esplenócitos mitógenos; aumenta a produção de óxido nítrico por macrófagos Rikishia et al. (1985) Burger et al. (1986) Spolski et al. (2002) Inibe a resposta e a proliferação de antigenos de Salmonella; inibe a resposta inflamatória a antigenos de metacestóide e causa diminuição da IL-2, IFNC e IL-4; produção de TNFα reduzida por macrófagos após a estimulação com LPS Arechavaleta et al. (1998) Interferon-c análogo a p66 em produtos E/S Peptídeos de RNA em extratos de metacestóides Fonte: Adaptado de Johnston et al .(2009). 31 1.4 ANGIOGÊNESE Os vasos sanguíneos constituem uma rede de tubos que transportam o sangue por todo o organismo distribuindo oxigênio e nutrientes, transportando hormônios e outros compostos e coletando resíduos metabólicos e materiais tóxicos para os órgãos excretores (Dias et al., 2003). Morfológica e funcionalmente, os vasos sanguíneos podem ser divididos em artérias que são vasos sanguíneos elásticos que transportam o sangue do coração para os tecidos e, nesta direção, ramificam-se cada vez mais em estruturas de menor calibre até atingirem o nível capilar e veias que transportam o sangue proveniente de vários tecidos em direção ao coração, formando ramos de calibre cada vez maior (Fig.11). As artérias apresentam um espessamento da parede em relação às veias, em decorrência da sua função pulsatória do sangue, enquanto que nas veias observa-se um fluxo sanguíneo lento (Dias et al., 2003). Figura 11: Representação esquemática das estruturas que compõe o sistema circulatório: A) Veia com camada delgada; B) Arteria com espessamento da camada; C) Capilar que é a etrutura que faz ligação entre veia e artéria. Fonte: http://www.cabuloso.xpg.com.br/Anatomia Humana/SistemaCardiovascular/VasosSanguineos.htm, acesso em 05 de dezembro de 2012. Estruturalmente os vasos são organizados em três camadas: uma túnica externa ou adventícia composta de tecido conjuntivo e pequenos filetes nervosos e vasculares; uma túnica média que constitui a camada intermediária composta por fibras musculares lisas e pequenas quantidades de tecido conjuntivo elástica; e uma 32 túnica íntima ou endotélio, com uma camada única de células endoteliais interconectadas que reveste a superfície luminal dos vasos revestida pela matriz extracelular e por camadas de células com função de suporte (Fig. 12) (Dias et al., 2002). Figura 12: Ilustração das camadas de revestimento dos vasos sanguíneos. Fonte: Adaptado de http://www.auladeanatomia.com/cardiovascular/vasos.htm, acesso em 05 de dezembro de 2012. Quando intacto, o endotélio controla a permeabilidade vascular regulando o tráfego de moléculas pequenas e grandes e/ou células. Em resposta a fatores ou sinais específicos, as células endoteliais e as células musculares lisas apresentam um crescimento desenfreado para formar novos vasos sanguíneos em um processo conhecido como angiogênese que pode sofrer alterações e desencadear doenças como a psoríase, cegueira em casos de diabete, artrite e câncer (Dias et al., 2002). A angiogênese representa uma complexa formação de novos vasos a partir de células endoteliais diferenciadas de um vaso pré-existente (Yoshida, 2005). Em condições normais, existe um equilíbrio entre moléculas pro-angiogênicas e antiangiogênicas com favorecimento das moléculas anti-angiogênicas. Contudo quando o equilíbrio é invertido, devido à ação de fatores metabólicos, mecânicos, mutações genéticas e reações imuno-inflamatórias, angiogênese (Fig. 13) (Folkman et al., 2002). têm-se o processo denominado 33 Figura 13: Processo angiogênico desencadeado pela desestabilização do equilíbrio das substâncias pró e anti-angiogênicas: A – equilíbrio das substâncias com favorecimento das anti-angiogênicas verificado em condições normais do organismo; B – cascata de eventos desencadeado a partir da quebra do equilíbrio entre essas substâncias com favorecimento das pró-angiogênicas. Fonte: Adaptado de Quintavalle et al. (2011). De acordo com Rissaw (1997), durante a embriogênese de vertebrados a formação dos plexos vasculares primários (vasculogênese) origina-se do mesoderma pela diferenciação de angioblastos e subsequente produção dos vasos sanguíneos primitivos. Estes angioblastos expressam os receptores do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF-R), enquanto que este é produzido e secretado pelas células do endoderma. A ativação desses receptores pelo VEGF dá início à diferenciação de angioblastos cuja sobrevivência e manutenção está condicionada aos níveis de VEGF. Um precursor bipotencial, induz o mesoderma a expressar o receptor de VEGF do tipo 2 (VEGF-R2) que influencia o processo de formação do haemangioblasto (desenvolvimento tanto da linhagem hematopoiética quanto da linhagem angioblástica), levando a formação dos primeiros vasos sanguíneos (Fig. 14). 34 Figura 14: Esquema ilustrativo dos tipos de angiogênese que podem ocorrer a partir de plexus capilares primitivos ou vasculogênese. Fonte: Adaptado de Rissaw (1997). Após a formação do plexo vascular primário, muitas células endoteliais são regeneradas e podem formar novos capilares através de duas fases: de brotamento e de maturação. O brotamento pode ocorrer através do processo denominado angiogênese verdadeira (formação de capilares de vasos pré-existentes), ou pela junção de dois vasos que se romperam, formando um só. Posteriormente, ocorre a remodelagem do plexo vascular formado, determinada por sinais que suprimem o VEGF, fator de sobrevivência das células endoteliais, acarretando a morte dessas células. Em seguida ocorre a fase de maturação, originando um sistema vascular maduro (Rissaw, 1997; Yoshida, 2005). A angiogênese normal ocorre durante o desenvolvimento embrionário e é observada, ao longo da vida adulta, em alguns eventos fisiológicos, tais como: ovulação, ciclo endometrial, desenvolvimento da placenta, reparação de feridas, constituindo assim um importante papel nos processos de reprodução, desenvolvimento e reparação tecidual (Fechine-Jamacaru et al., 2005). A angiogênese também pode ser observada em eventos patológicos como no câncer, no desenvolvimento da placa de ateroma e em doenças cujas células 35 endoteliais têm participação importante, como na psoríase, retinopatia diabética, degeneração macular, artrite reumatóide, angiofibroma, hemangioma, glaucoma vascular (Malucelli et al., 2002). Recentemente a angiogênese também vem sendo relatada em infecções por helmintos como, por exemplo, em infeções por S.mansoni (Loeffler et al., 2002; Kanse et al., 2005; Lemos et al., 2010; Dennis et al., 2011), filárias (Esterre et al., 2005), Spirocerca lupi (Dvir et al., 2010), Taenia solium (Sikasunge et al., 2009) entre outros. A angiogênese em vertebrados na fase pós-embrionária, pode ser resumida nas seguintes etapas: a) aumento da permeabilidade vascular e depósito de fibrina extra-vascular; b) desestruturação da parede vascular, com remoção dos pericitos; c) desestruturação da membrana basal e da matriz extracelular; d) migração da célula endotelial através da matriz extracelular remodelada; e) proliferação da célula endotelial; f) formação de estruturas tubulares; g) inibição da proliferação e migração da célula endotelial; h) reconstituição da membrana basal; i) maturação dos complexos juncionais; j) construção da parede vascular, através do recrutamento e diferenciação de células murais, pericitos e células de músculo liso e k) estabelecimento de fluxo sanguíneo no novo vaso (Fig. 15) (Lemos et al., 2010). Nesse caso, a estimulação desse processo é decorrente de outros fatores, diferentes daqueles da embriogênese, como é o caso da hipóxia e da presença de integrantes da família do fator de crescimento endotelial. 36 Figura 15: Esquema ilustrativo do processo de migração e proliferação das células endoteliais para formar novos vasos sanguíneos. A) Mecanismos de estimulação das células endoteliais através da produção de fatores de crescimento; B) Processo de alongamento e direcionamento das células endoteliais (EC); C) Formação e maturação do novo vaso. Fonte: Adaptado de Carmeliet et al. (2011). 37 1.4.1 Fatores de Indução da Angiogênese Diferentemente da embriogênese, o processo angiogênico em indivíduos maduros surge em decorrência da liberação de diversas proteínas como: fator de crescimento fibroblástico básico (bFGF), fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e enzima ciclo-oxigenase-2 (COX-2), que são desencadeados por fatores locais estimulantes como a hipóxia e a elevação de CO2 ou óxido nítrico (Fig. 16) (Pinho, 2005). Figura 16: processo de indução da proliferação celular e formação de vascularização em eventos patogênicos, mediado por diversos fatores em resposta a fatores locas estimulantes, a exemplo da hipóxia. COX-2 = Ciclo Oxigenase 2; VEGF = Fator de Crescimento Endotelial vascular; FGF = Fator de Crescimento Fibroblasto; CO2 = Dióxido de Carbono; NO = Óxido Nítrico. Fonte: Adaptado de Bikfalvi (2012). Moraes (2008), ao realizar experimentos com células endoteliais de aorta de coelho, elucidou o papel do óxido nítrico no processo da angiogênese. O óxido nítrico, substância mediadora da inflamação, fosforila os receptores EGFR provocando a liberação de VEGF. Além disso, esses autores observaram que a bradicinina aumenta a fosforilação em resíduos de tirosina de EGFR similarmente à produção do óxido nítrico. A hipóxia em resposta às mudanças do meio ambiente, aciona mecanismos de adaptação que levam a alterações ao nível sistêmico tecidual e celular que tendem a reduzir o consumo de oxigênio e melhorar a oferta deste. Entre essas adaptações alternativas adotadas pelo organismo encontra-se a angiogênese, pela 38 indução do VEGF. A hipóxia leva a um aumento da transcrição do VEGF ao nível de RNA mensageiro por meio da estimulação da atividade do fator 1 de indução de hipóxia (HIF-1) , que se liga a promotores de VEGF e forma um complexo que resulta na transcrição do gene de VEGF (Fig.17) (Levy et al., 1995). Figura 17: Mecanismo de sinalização do VEGF nas células endoteliais. Em condições de injúria tecidual como a hipóxia, o gene de VEGF é expresso e transcrito. Após transcrição, este se liga aos seus respectivos receptores e estimula a migração das células endoteliais e irrigação vascular no sítio afetado. HIF-1α = Fator de Indução da Hipóxia 1 alfa; VEGF = Fator de Crescimento Endotelial Vascular; sFIt = gene de transcrição do receptor solúvel 1 de VEGF; VEGFR1 (Fit1) = receptor do Fator de Crescimento Endotelial Vascular 1; VEGFR2 (KDR) = receptor do Fator de Crescimento Endotelial Vascular 2; PLCy = Phospholipase Cgamma; PKC = Proteina Kinase C; MAPK = Proteína Kinase ativado por Mitógeno; Fonte: Adaptado de Bikfalvi (2012). Além disso, a hipóxia pode também mudar a abundância de micro RNAs em células endoteliais, como por exemplo a produção de miR-210, e promover a migração de células endoteliais e formação de capilares e estruturas semelhantes. MIR-210 tem atividade pro-angiogênica devido seu direcionamento de ephrin A3 que é dependente do VEGF (Quintavalle et al., 2011). 39 O VEGF é o fator principal no processo angiogênico, e um regulador crucial do desenvolvimento vascular durante embriogênese (vasculogênese) e formação dos vasos sanguíneos (angiogênese) nos adultos (Fig. 18) (Olsson et al., 2006). Esta molécula foi isolada pela primeira vez do líquido ascítico de cobaias e primeiramente foi denominado como fator de permeabilidade vascular (VPF) (Senger et al., 1986). Hoje se sabe que o VEGF é liberado por células endoteliais, fibroblastos, plaquetas, neutrófilos e macrófagos, e tem expressão acentuada em situações de hipóxia (Bao et al., 2008). Figura 18: Mecanismo de liberação e ligação do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) desencadeando a formação de novos vasos sanguíneos.Fonte: Adaptado de https://www.Vascular_endothelial_growth, acessado em março de 2013. A biologia do VEGF é complexa, pois existem seis variantes deste fator de crescimento: VEGFA, B, C, D, E e o fator de crescimento placentário (PLGF). Estas variantes podem interagir com um dos três receptores tirosino-kinase específicos para VEGF e conduzir a angiogênese. O VEGFA, B e PLGF ligam-se ao receptor VEGFR1; VEGFA e E ligam-se ao receptor VEGFR2, e VEGFC e D ao receptor VEGFR3 (Fig. 19) (Ferrara, 2004; Takahashi et al., 2005). 40 Figura 19: Variantes do fator de crescimento endotelial vascular e os possíveis receptores, aos quais estas substâncias se ligam para desencadear eventos angiogênico. Fonte: Adaptado de Cao (2009). Além da atividade angiogênica, o VEGF também apresenta atividade próinflamatória e neuroprotetora. Suas funções incluem a quimiotaxia para leucócitos e indução da permeabilidade vascular, promovendo a desorganização das zônulas de oclusão e retração das células endoteliais (Ferrara et al., 1996; Bao et al., 2008). 1.4.2 Helmintos e angiogênese Muitos helmintos parasitos estimulam a formação de vascularização no hospedeiro (angiogênese), como um dos pré-requisitos para o sucesso no crescimento parasitário destacando a maturidade e a reprodução. Este fenômeno pode ocorrer nos tecidos do hospedeiro tanto por um mecanismo de reparo de dano tecidual causado pelo parasito, quanto por moléculas pró-angiogênicas derivados dos parasitos para benefício próprio (Fig. 20). No sistema vascular este processo pode ocorrer através de uma co-adaptação, de forma ativa ou passiva, do sistema vascular do hospedeiro na região intra-vascular e ou linfático (Dennis et al., 2011). 41 Figura 20: Esquema ilustrativo da angiogênese desencadeada por parasitos helmintos. A) Fatores de crescimento endotelial vascular A ou C (VEGF-A-C) derivados de helmintos ou fatores proangiogênicos do hospedeiro; B) Ativação de células endoteliais (CEs) por esses fatores; C) Formação da vascularização parasitária através da penetração da membrana basal, formação de uma matriz provisória, remodelação da matriz extracelular, ativação do sistema plasminogênio– plasmina, proliferação, migração, brotamento e ramificação das células endoteliais (CE) produzindo um sistema vascular imaturo e instável; D) Interação entre as células endoteliais e os pericitos, estabilizando os vasos e auxiliando na maturação da vascularização parasitária. Fonte: Adaptado de Dennis et al. (2011). Um dos processos angiogênicos induzidos por helmintos mais bem estudados é o processo desencadeado pelo S.mansoni. Durante as etapas do ciclo evolutivo, o parasito passa por diferentes tecidos e vai adquirindo alterações morfológicas e bioquímicas significantes (Souza, 2011). O estabelecimento da patogenia da esquistossomose está ligado a vários fatores como espécie do parasito, estado nutricional, idade e resposta imunológica do hospedeiro e a carga parasitária adquirida que é mensurada pela contagem de ovos por grama de fezes. Os ovos são os elementos fundamentais para a patogenia da esquistossomose, pois em números elevados atingem o fígado e podem provocar alterações como hemorragias, edemas de submucosa e fenômenos degenerativos que são reparadas através da reconstituição da integridade dos tecidos. Por outro lado a resposta imunológica do paciente frente aos antígenos dos esquistossômulos e dos ovos leva a alterações cutâneas e hepáticas (Rey, 2005). Segundo Loeffler et al. (2002) e Kanse et al. (2005) os ovos de S.mansoni secretam fatores angiogênicos que ativam células endoteliais. Em seus experimentos in vitro, antígenos solúveis de ovos de S.mansoni, desprovidos de lipopolissacarídeos, adicionados a cultura de células endoteliais de veia umbilical 42 humana contendo soro bovino fetal, apresentaram uma proliferação celular significativamente maior do que cultura de células endoteliais de veia umbilical humana contendo apenas soro bovino fetal. Ao substituirem esses antígenos por fatores de crescimento, a proliferação celular continuou. Estes achados mostraram que os produtos de secreção do ovo de S.mansoni podem contribuir para a ativação e proliferação de células endoteliais e, subsequentemente, promoção da resposta inflamatória, formação de granuloma e vascularização através de um mecanismo de liberação de fatores de crescimento. A liberação desses fatores pró-angiogênicos foi verificado no trabalho de Kanse et al. (2005) os quais demonstraram que a presença de ovos vivos de S.mansoni em cultura de células endoteliais marcadas com microcarregadores, estimula a neovascularização, da mesma forma que cultura de células tratadas com substâncias estimuladores de crescimento endotelial (Fig. 21). Figura 21: Estimulação das células endoteliais e formação de capilares. A) Estimulação por ovos vivos de S.mansoni; B) Estimulação por uma solução contendo fatores de crescimento endotelial. Fonte: Adaptado de Kanse et al. (2005). Shariati et al. (2011), também constataram a presença de VEGF em amostras sorológicas de pacientes com diagnóstico de esquistossomose, assim como a produção de VEGF e FGF2 por macrófagos alveolares estimulados pelos antígenos de cercária de S.mansoni. Estes autores também verificaram a redução de vermes, ovos e granulomas no fígado de ratos infectados com S.mansoni após estes serem tratados com endostatina, um inibidor da angiogênese. Estimulação e proliferação de células endoteliais também pode ocorrer por mecanismos secundários, através da super expressão de substâncias endógenas como integrina ß8 e galectinas 1 e 3 por macrófagos ativados com extrato somático 43 de ovos de Schistosoma (Zaccone et al., 2013). Dependendo do grau de expressão, a integrina ß8 tem papel comprovado na angiogênese ou na capacidade de invasão de células tumorais (Tchaicha et al., 2011) e as galectinas, além de modularem a resposta imune contra os parasitos, estimulam a migração das células endoteliais (Fig. 22) e, consequentemente, a angiogênese (Alves, 2009). Figura 22: Papel das galectinas 1 e 3 na imunomodulação do sistema imune do hospedeiro e na indução da proliferação celular e angiogênese, desencadeado pelos patógenos; a-d eventos desencadeados pela galectina 1 e e-i são eventos desencadeados pela galactina 3 ambos nos compartimentos intra e extracelular: a) associação de galectina 1 a H-RAS e indução de crecimento tumoral no espaço intracelular; b) indução de apoptose de células do sistema imune como Th1 e Th17; c) inibição de migração transendotelial de células Th1; d) liberação de galectina 1 pelas células endoteliais e promoção de angiogênese na luz dos vasos sanguíneos; e) associação de galectina 3 a K-RAS e indução de P13K que por sua vez induz crescimento tumoral no espaço intracelular; f) inibição de apoptose pela galectina 3 no espaço intracelular; g) indução de Cyclin D1, c-MYC e crescimento tumoral por galectina 3 associada a β-Catenin; h) inibição de galectina e crescimento tumoral e indução de apoptose pelo p53 i) indução da angiogênese por galectina 3 na luz de vasos sanguíneos. Fonte: Adaptado de Yang et al. (2008). 44 Acredita-se que os pericitos (células mesoteliais que envolvem as células do endotélio capilar e vênulas) estão envolvidos no processo angiogênico verificado na esquistossomose, não só pela sua capacidade contrátil e plasticidade na formação de fibrose, mas também como reguladores obrigatórios do desenvolvimento vascular, estabilização da maturação e remodelação (Andrade et al., 2010). Além do Schistosoma, processos de formação de vasos sanguíneos ou produção de substâncias pelos parasitas, como os fatores de crescimento e proteínas, com papel importante no desenvolvimento deste processo vem sendo relatado em outras espécies de helmintos e tem ganhado relevância não só pelos danos causados no hospedeiro, mas também como forma de inibição das funções vitais do parasito através do entendimento dos mecanismos de liberação de substâncias pro-angiogênicas e desenvolvimento de drogas que culminam na morte do parasita. Segundo Esterre et al. (2005), VEGF-A (responsável pelo extravasamento do sangue e linfa para os tecidos circundantes) e VEGF-C (responsável pela dilatação linfática) podem ser importantes fatores angiogênicos no desenvolvimento de linfedema e hidrocele em filariose linfática e a associação destas tem efeito sinérgico na indução de angiogênese.Isto foi comprovado por Debrah et al. (2007), quando verificaram que a presença ou a morte natural de vermes adultos de filária na região escrotal de pessoas infectadas leva a liberação de antígenos de filária e Wolbachia, que induzem a super-expressão de VEGF-A e VEGF-C. Estes seriam os responsáveis pelo extravasamento e acúmulo de líquidos a partir dos vasos sanguíneos e linfáticos, levando à formação de hidrocele. Jo et al. (2010) descobriram que timosina b4, uma proteína multifuncional anti-inflamatória expressada em locais inflamatórios, induz a expressão de VEGF pela crescente estabilidade da proteína HIF-1. Um ano mais tarde Kang et al. (2011), realizaram infecção experimental de camundongos com Triquinela spiralis e apesar de não constatarem a ocorrência de hipóxia nas fibras musculares infectadas verificaram uma expressão elevada de timosina b4 na fase tardia da infecção sugerindo que a infecção por T.spiralis induz a expressão desta proteína que estimula VEGF levando a angiogênese. Dvir et al. (2010), avaliou a expressão de fatores de crescimento em espirocercose canina (Spirocerca lupi) onde constatou a expressão de VEGF, FGF e Fator de Crescimento derivado de Plaquetas (PDGF) e, apesar de não esclarecer se 45 estas proteínas eram produzidas nos nódulos ou vinculadas aos receptores após serem secretadas por células inflamatórias, endotélio ou pelo próprio parasita, concluiu que a expressão desses fatores está associada aos nódulos de espirocercos. 1.4.3 Helmintos cestodas e angiogênese Os cestódeos e helmintos em geral, necessitam de um sistema que lhes ofereça oxigênio, nutrientes, hormônios e fatores de crescimento necessários para a sua colonização no hospedeiro parasitado. Além disso, este sistema também auxilia na remoção de resíduos metabólicos para o meio externo ao parasita. Para isso estes seres desenvolvem mecanismos para o estabelecimento de plexos capilares a partir de outros já existentes nesses hospedeiros, e que podem o acompanhar durante toda a sua existência (Dennis et al., 2011). Estudos sistemáticos de cestódeos relacionados com a formação de vasos sanguíneos nos tecidos dos hospedeiros são relativamente escassos. Os primeiros relatos da literatura foram voltados para a fase larval metacestóide de Mesocestoides corti presente em camundongos (hospedeiro intermediário deste parasita) e de cisticercos de Taenia solium, infectante tanto para porcos quanto para os seres humanos (Dennis et al., 2011). Mesocestoides corti tem aspectos do ciclo de vida semelhante a T. solium, em que ambos necessitam de hospedeiros intermediários para o desenvolvimento de suas fases larvares e estas, posteriormente, quando ingeridas por um hospedeiro definitivo desenvolvem-se em tênias intestinais capazes de reproduzir, liberar ovos e manter o ciclo. Apesar de não haver relatos de Mesocestoides corti desenvolvendo a infecção no sistema nervoso central dos seus hospedeiros, quando a infecção é contraída pela via fecal-oral, tal como ocorre com T. solium, este parasito tem servido como modelo de estudo laboratorial para compreensão dos diferentes aspectos da interação parasito-hospedeiro através da injeção direta do parasito no cérebro de camundongos (Alvarez et al., 2009). Na maioria das vezes, metacestódeos de M. corti encontram-se envoltos por tecido conjuntivo, e o seu crescimento está associado com a formação de novos vasos sanguíneos ao redor do parasito, importantes interfaces para a captação de 46 fatores nutricionais, bem como mediadores de sinais que regulam a relação parasitohospedeiro (Stadelmann et al., 2010). Alvarez et al. (2002), ao analisar o tecido nervoso humano na proximidade de lesões granulomatosas induzidas por metacestóides de T. solium, em cinco regiões cerebrais diferentes, mostrou que as células cerebrais adjacentes exibiram moléculas pró-inflamatórias, como IFNу e IL-18, com atividade associada a células da microglia/macrófagos e componentes da barreira hematoencefálica (células endoteliais e / ou pericitos). Além disso, destacaram o efeito imunomodulador através da produção de citocinas anti-inflamatórias (TGF e IL-10) e uma atividade de reparo tecidual promovido pelo bFGF (substância vasoativa e profibrótica) devido à presença de uma cicatriz glial e deposição de colágeno, evidenciando a ocorrência do processo angiogênico. Sikasunge et al. (2009), mostraram que o tecido cerebral de 30 suínos infectados com cisticercos de T. solium apresentaram astrogliose (aumento de astrócitos em número e tamanho), extensa formação de cicatriz glial e fibrose e dano neuronal e axonal a partir de fibras nervosas dilatadas, aumento do número de vasos sanguíneos e da permeabilidade da barreira hematoencefálica. Estes aspectos evidenciaram claramente a angiogênese nesses tecidos. Segundo Gottstein & Hemphill (2008), os metacestóides de Equinococus multilocularis possuem dois fatores distintos, ambos sintetizados na camada germinativa, que podem ser os principais agentes envolvidos no processo de evasão do sistema imune: a camada acelular altamente glicosilada e laminada formando um glicocálix estendida sobre a superfície do parasita e produtos de excreção/secreção (E/S) dos parasitos encontrados no líquido das vesículas ou no ambiente exterior e que podem influenciar a resposta imune do hospedeiro e / ou processos fisiológicos. Mais tarde, Stadelmann et al. (2010) realizaram cultivo in vitro de metacestóides de E.multilocularis, extraíram células das vesículas do parasito, e identificaram uma proteína de E/S denominado EmPGI (fosfoglicose isomerase de E.multilocularis) que atua na proliferação celular e / ou diferenciação tecidual. Além disso, foi detectado expressão de RNA para EmPGI em metacestóides, protoescólex e em culturas primárias de células da camada germinativa do parasito. Não existem relatos na literatura do desenvolvimento do processo angiogênico por cestóides em peixes. Porém estudos realizados por Fouquet et al. (1997), Pichler et al. (2003), Lam et al. (2006) e Tobia et al. (2011) com embriões de 47 Danio rerio (peixe-zebra), um teleósteo da Ordem Siluriforme, mostram que este peixe tem grande potencial para ser usado futuramente como um modelo angiogênico de câncer humano. Assim o uso de peixes como D.rerio representa uma ferramenta interessante para testes de bioensaio de moléculas pequenas e dissecção das vias biológicas como alternativa a outros modelos de vertebrados, devido as suas inúmeras vantagens, como a facilidade de experimentação e a administração de fármaco bem como a receptividade na manipulação in vivo. O entendimento imunomoduladoras e dos princípios indutoras de básicos processo de ação angiogênico, de substâncias associado aos mecanismos de liberação dessas substâncias em órgãos-alvos poderão contribuir para o desenvolvimento de novos agentes terapêuticos. Deste modo, pesquisas básicas sobre a relação parasito-hospedeiro entre helmintos e peixes podem contribuir com informações importantes nos processos patológicos em demais vertebrados e em humanos. Em virtude da constatação macroscópica da presença de cistos de cestódeos da Família Proteocephalidae associada com intensa formação de vasos sanguíneos ao seu redor e por entre esses cistos, na cavidade celomática de Ageneiosus ucayalensis e, da escassez de informações sobre a interação de parasitos cestódeos com seus hospedeiros, objetivou-se caracterizar morfológica e ultraestruturalmente o processo angiogênico visualizado na interação parasito hospedeiro entre estes parasitos e Ageneiosus ucayalensis. 48 1.5 OBJETIVOS 1.5.1 Objetivo geral Caracterizar os aspectos estruturais e moleculares elementares de larvas de Cestoda da família Proteocephalidae parasitos de Ageneiosus ucayalensis e os aspectos do parasitismo destas larvas. 1.5.2 Objetivos específicos a) Caracterizar por morfologia e sequências moleculares os metacestódeos envolvidos no parasitismo de Ageneiosus ucayalensis b) Descrever por meio de técnicas histológicas e de ultraestrutura o processo angiogênico da relação de metacestódeos proteocephalídeos e A. ucayalensis. c) Relacionar as estruturas teciduais neo-formadas à presença das larvas de Cestódeos. 49 2. MATERIAL E MÉTODOS 2.1 COLETA DE HOSPEDEIROS E AMOSTRAS DE PARASITOS CESTODAS Um total de 40 exemplares de Ageneiosus ucayalensis foram adquiridos ainda vivos, através da pesca artesanal com isca e anzol, de pescadores ribeirinhos da baia do Guajará no Município de Belém, Estado do Pará (01º24'S e 48º28'W), conduzidos ao Laboratório de Biologia Celular e Helmintologia do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Pará, para realização da necropsia e pesquisa de parasitos cestódeos. Durante a necropsia, tecidos e órgãos foram removidos para placas de Petri com solução de tampão fosfato salino (PBS), a pH 7,4 e analisados através de estereomicroscópio (Carl Zeiss modelo 475032) para retirada dos helmintos e vasos sanguíneos associados. A partir daí, os procedimentos para fixação, processamento e posterior análise de acordo com as metodologias empregadas decorreram como mostra o organograma a seguir: 50 2.2 MICROSCOPIA DE LUZ 2.2.1 Análise taxonômica de Cestoda As larvas de Cestoda fixadas com uma solução de ácido acético glacial, formol a 37% e álcool etílico a 70% (AFA) sob compressão entre lâmina e lamínula foram utilizadas para análise direta ao microscópio de luz. Após a fixação, desidratação em série etanólica de concentrações crescentes (Etanol 70%, Etanol 80%, Etanol 90%, Etanol 100%) por 10 minutos em cada etapa, os cistos foram corados com Carmim alcoolico, clarificados com salicilato de metila e montados com Entellan® entre lâmina e lamínula segundo Moraes Neto et al. (1998). Posteriormente foram analisados em Microscópio Olympus BX 41 equipado com câmara clara (sem ajuste de Zoom) no LBCH – ICB – UFPA, para realização dos desenhos e identificação dos caracteres taxonômicos. 2.2.2 Análise histológica pelo método de inclusão em historesina® Algumas amostras de cistos contendo formas larvares de Cestoda e vasos adjacentes foram fixados em solução de ácido acético glacial, formol a 37% e álcool etílico a 70% (AFA). Após período mínimo de 24 horas de fixação, foram desidratadas em série etanólica crescente (30%, 50%, 70%, 80%, 90%, e 100%) por 30 minutos em cada etapa. Após a desidratação realizou-se a infiltração em resina, utilizando EtanolHistoresina® em diferentes proporções: 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1 e Historesina® pura. Cada etapa de infiltração teve uma duração de 24 horas.Para inclusão, os cistos contendo as formas larvares foram inseridos em placas de nove poços, em molde de inclusão preenchidos com uma solução de Historesina®-polimerizador em uma proporção 15:1, de acordo com o protocolo do fabricante LEICA®. Após 2 horas de repouso em temperatura ambiente até o início da polimerização da resina, os moldes foram levados a uma estufa a 40 ºC por três dias, para a finalização da polimerização. Os blocos polimerizados foram então seccionados de forma seriada, com cortes de 3 μm de espessura, com navalhas de vidro, em ultra micrótomo LEICA EM UC6 no Laboratório de Biologia Estrutural – ICB – UFPA. Os cortes seriados foram capturados um a um e então colocados ordenada e sequencialmente, em lâminas de 51 microscopia; corados diretamente com Azul de Toluidina 1% levemente aquecido; lavados em água corrente, secados, montados em Entellan®, analisados e fotografados serialmente em microscópio Olympus BX 53 equipado com sistema capturador de imagem. As imagens capturadas foram processadas e alinhadas no programa RECONSTRUCT® Versão 1.1.0.0 1996-2009, desenvolvido pelo Institutes of Health and the Human Brain Project. 2.2.3 Análise histológica pelo método de inclusão em parafina Após a fixação prévia em AFA, as amostras foram lavadas e desidratadas em concentrações crescentes da bateria etanólica: 70%, 80%, 90% e 100%, por 30 minutos cada, seguida da diafanização em três sucessivos banhos de Xileno durante 20 minutos cada. A infiltração foi realizada com banhos de parafina líquida em estufa a 60 ºC e a inclusão ocorreu à temperatura ambiente. Cortes obtidos pela microtomia foram desparafinizados em xileno, hidratados em concentrações decrescentes da bateria alcoólica (100%, 90%, 80% 70% 50% e 30%) e lavados com água destilada. Em seguida foram corados para análise histológica e também processados para análise histoquímico, através das colorações de Orceína, Tricrômios de Malllory e Gomori e pelo Ácido Periódico de Schiff. 2.3 BIOLOGIA MOLECULAR 2.3.1 Extração de DNA e sequenciamento para Taxonomia e Filogenia O DNA genômico total foi extraído a partir de pools de larvas pequenas e pools de larvas grandes, previamente preservada em etanol a 70% a – 4 ºC, pela técnica do fenolclorofórmio segundo o protocolo descrito por Sambrook et al. (1989). Seguindo este protocolo, os parasitos foram lisados em 300 µL de tampão de homogeinização, 300 µL de tampão de lise celular, 15 µL de Proteinase K (10 ng/mL), 15 µL de RNase (10µg/mL) e incubados a 56 ºC durante 1 hora.Após completa digestão, as proteínas foram separadas do restante do material a partir da adição de 600 µL de fenolclorofórmio alcool - isoamil (25 : 24 : 1) e lavagem com 600 µL de clorofórmio álcool isopropílico (24:1).O DNA foi precipitado com 100µL de acetato de sódio (3M, pH 4,8) e 500 µL de álcool isopropanol sob -20 ºC durante 15 52 minutos. Após congelamento, as amostras foram centrifugadas por 10 minutos, o sobrenadante descartado e o pellet de DNA lavado com 500 µL de etanol a 70%.O DNA resuspenso em 50 µL de tampão de eluição (TE) foi armazenado a -20 ºC até a reação em cadeia da polimerase. A subunidade menor do rDNA (18S) foi amplificada através da reação em cadeia da polimerase, utilizando o par de primers Ces1 (5-’ CCAGCAGCCGCGGTAACTCCA-3') e Ces2 (5'- CCCCCGCCTGTCTCTTTTGAT-3') que amplificam um fragmento de aproximadamente 400 bp. O volume final da reação foi de 25 µL, contendo 6mM de MgCL2, tampão 10X (20 mM de Tris HCL pH 8.4 e 50mM de KCL), 0.2 pmol/µL de dNTP, 1U de taq polimerase, 0,4 pmol/µL de cada primer e 10ng de DNA. A reação ocorreu sob as seguintes condições: desnaturação do DNA a 95 ºC durante 2 min e 30 ciclos de amplificação (95 °C, por 1 min, 65 °C por 1 min, 72 °C por 2 min) e uma etapa de extensao final a 72 ºC por 5 min. Os produtos de PCR foram purificados com Exosap - IT® (Affymetrix®), clonados no vetor pGEM®-T (Promega®) e introduzidos em Escherichia coli Top 10 (Invitrogen®). O sequenciamento ocorreu com ambos os iniciadores forward (Ces 1) e reverse (Ces 2), cujas variações térmicas consistiram em desnaturação inicial de 2 min a 95 ºC, seguido de 35 ciclos de 1min a 95 ºC, 1 min a 50 ºC e 2 min a 72 ºC e uma fase final de extensão a 72 ºC por 5 min, com auxílio de um analisador automático DNA modelo ABI 3130 (Applied Biosystem ®) em conjugação com BigDye Terminator V3.1 Kit, de acordo com as instruções do fabricante.As sequências obtidas foram editadas no BioEdit (Hall, 2007). Para a análise filogenética, a distância P não corrigidao foi avaliada pelo programa PAUP (Swofford, 2002) e a análise de Máxima Parcimônia (MP) baseada em um algorítimo de busca heurística foi realizada no MEGA com 1000 réplicas de bootstrap para avaliar o nível de confiança dos nós definidos por esta análise. A inferência Baesiana (BI) Mr Bayes 3.1.2 (Ronquist & Huelsenbeck, 2003) foi realizada com o banco de dados rodados utilizando 5.000.000 gerações com freqüência de amostragem de uma árvore a cada 1000 em duas corridas independentes com quatro cadeias cada e os resultados das primeiras 1000 árvores descartadas como burn-in. As demais árvores foram utilizadas pelo programa Mr Bayes para estimar a probabilidade posterior de cada nó na reconstrução filogenética. 53 2.4 MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE TRANSMISSÃO Após a fixação inicial em Glutaraldeido 2,5% em tampão Cacodilato de Sódio 0,1 M a p.H 7.2, as amostras de cistos foram lavadas em tampão e pós-fixadas em tetróxido de ósmio (OsO4) por 2 horas.Em seguida foram lavadas com tampão e desidratados em concentrações crescentes de acetona (30%, 50%, 70%, 80%, 90%, e 100%) com uma duração de 30 minutos em cada etapa. Após a desidratação foi realizada a fase de infiltração em resina epóxi, utilizando o kit Epon® (Luft, 1961). Os cistos foram infiltrados em concentrações crescentes de epon, iniciando em solução acetona + epon, na proporção 5:1 até epon puro por 24 horas em cada etapa. A inclusão ocorreu à temperatura ambiente e a polimerização em estufa à temperatura de 60 ºC por 72 horas. Os blocos polimerizados foram então cortados em secções semi-finas de 1 µm de espessura, com navalhas de vidro, para análise prévia e secções ultrafinas de 70 nm foram feitas em ultra micrótomo LEICA EM UC6 no Laboratório de Biologia Estrutural – ICB – UFPA.Os cortes ultrafinos foram capturados por grades de 300 mesh, contrastados com uranila, lavados em solução de citrato de chumbo e analisados em microscópio eletrônico de transmissão para identificação dos constituintes celulares. 2.4.1 Citoquímica Para a análise citoquímica, foi empregada a técnica de Vermelho de Rutênio para localização de componentes ácidos, associados à superfície celular e à matriz extracelular. As amostras previamente fixadas em Glutaraldeido 2,5% em tampão cacodilato de sódio 0,1 M a p.H 7.2, contendo 0,5mg/mL de Vermelho de Rutênio, foram lavadas em tampão Cacodilato de Sódio 0,1M adicionado de 0,5mg/mL de Vermelho de Rutênio, pós-fixadas em OsO4 1% com tampão Cacodilato de Sódio 0,1M acrescido de 0,5mg/mL de Vermelho de Rutênio e lavadas novamente no mesmo tampão contendo 0,5mg/mL de Vermelho de Rutênio para retirar o excesso do segundo fixador (OsO4). Ambas as lavagens no tampão foram realizadas por duas vezes com duração de 10 minutos em cada etapa.Após esse procedimento, seguiu-se as etapas de desidratação, infiltração, inclusão e microtomia, conforme descrito no procedimento de rotina e a visualização ao Microscópio Eletrônico de Transmissão, sem contrastação prévia. 54 2.5 MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA (MEV) Os cistos e fragmentos de tecidos parasitados com cistos contendo formas larvares de Cestódeos e vasos sanguíneos foram fixados em AFA, pós-fixados em OsO4 a 1%, e lavados em tampão fosfato 0,1M pH 7,4.Em seguida foram submetidos à desidratação em serie crescente de Acetona a partir de Acetona 30%, até o ponto crítico do CO2. Os helmintos desidratados foram então montados cuidadosamente em ―stubs‖, metalizados com ouro e analisados ao Microscópio Eletrônico de Varredura JEOL JSM 5600. 55 3 RESULTADOS 3.1 AMOSTRAS DE CESTÓDEOS PARASITOS A prevalência do parasitismo foi observada em 93,3% dos peixes coletados. Durante a necropsia foi possível observar uma massa de cistos, delimitada por um saco de tecido conjuntivo aqui denominado de ―bolsa cística‖, com os parasitos ainda vivos e distribuídos na cavidade abdominal de Ageneiosus ucayalensis. Macroscopicamente esta bolsa cística não mostrou evidências de alterações fisiológicas e, nem danos anatômicos ao hospedeiro, podendo passar despercebido por possuir textura semelhante aos órgãos deste hospedeiro. A bolsa cística apresentava vários cistos agrupados, com formato esférico a ovalado, escólex invaginados e tamanhos diferentes, característico de larvas Merocercóides segundo critérios de classificação estabelecidos por Chervy (2002). Vasos sanguíneos de pequeno e médio calibre se estendem e se entremeiam por toda a extensão da massa cística, circundando, interconectando e irrigando os cistos, assim como o tecido que os envolve. Esses pequenos e médios vasos se conectam com um vaso de grande calibre que emerge de órgãos como o fígado, ou outro órgão altamente irrigados e que estejam nas proximidades onde a massa cística se instalou após a infecção (Fig. 23). 56 Figura 23: Hospedeiro Ageneiosus ucayalensis e a localização e disposição dos cistos de cestóides e os vasos sanguíneos dentro do hospedeiro. Figura 23A: Visão geral de exemplar da espécie Ageneiosus ucayalensis Barra = 3 cm. Figura 23B: Ageneiosus ucayalensis á necropsia mostrando a cavidade abdominal e a disposição dos órgãos internos (OI) antes de serem removidos para a placa de Petri (seta). Barra = 2 cm. Figura 23C: Detalhe da conectividade da bolsa cística (Bc) com o fígado (F) através de um pedúnculo composto de grandes vasos (Gv) que emergem do fígado e pequenos vasos (Pv) que ramificam para dentro da bolsa cística e irriga os cistos. Barra = 3 cm. Figura 23D: Detalhe da bolsa cística (Bc), observado ao estereomicroscópio, repleto de cistos de cestódeos, com um grande vaso (Gv) penetrando a bolsa e ramificando em vasos pequenos (Pv) ao redor dos cistos. Barra = 30 µm. Figura 23E: Detalhes da intensa vascularização da bolsa cística e disposição dos vasos sanguíneos (Vs) envolvendo os cistos.Ainda se observa cistos pequenos (Cp) intercalados por cistos maiores (Cg). Barra = 10 µm. 57 58 3.2.ASPECTOS MORFOLÓGICOS DAS LARVAS As formas larvares de Cestódeos observadas pertencem à Famlia Proteocephalidae. De acordo com as características morfológicas, e morfométricas, agrupamos os parasitos em três morfotipos larvares, em diferentes fases conforme as descrições seguintes: 3.2.1 Morfotipo I (Larvas Plerocercóides) 3.2.1.1 Análise Taxonômica Este grupo de larvas possuem as seguintes características: corpo ovoide sem segmentação, medindo 0,2801 mm ± 0,0736983 de comprimento por 0,1836 mm ± 0,0303975 de largura, com escólex bem desenvolvido mensurando 0,2070 mm ± 0,0533623 x 0,131µ± 0,0248527. Este pode ser encontrado invaginado, ou evaginado. Essas larvas apresentam escólex provido de quatro ventosas musculares com formato redondo, medindo 0,0474mm ± 0,0078255 x 0,0383mm ± 0,0064356, e um órgão apical desarmado dividido em lóbulos com 0,0515mm ± 0,0099263 de comprimento e 0,0498 mm ± 0,0114957 de largura. Na cavidade e nos bordos das ventosas se observam estruturas filamentosas semelhantes a microtríquias volumosas (Fig. 24). Além disso, não se observou a lacuna primária e o sarcômero. Figura 24: Desenho morfológico da fase larval Plerocercóide do Morfotipo I, mostrando o escólex curto evaginado, corpo alongado e ausência de pescoço ou colo. Barra = 100 µm. 59 3.2.1.2 Análise histológica das larvas do Morfotipo I Nos exemplares com escólex evaginado é possível observar escólex pequeno e redondo, com quatro ventosas musculares sendo duas láteroventrais e duas laterodorsais e uma quinta ventosa apical circular característica do órgão apical. O escólex se liga ao corpo do parasito por uma pequena constrição, o que caracteriza colo ou pescoço ausente para esses parasitos. O corpo é delimitado por uma membrana hialina espessa, que caracteriza o tegumento do parasita (Fig. 25A). Este se mostrou altamente basofílico pela coloração com azul de toluidina. Pela observação de cortes histológicos, o corpo desses parasitos encontra-se preenchido por células vacuolizadas e o tegumento bastante espesso é interrompido por uma pequena abertura, por onde o escólex se invagina. Estruturas celulares alongadas e basofílicas são observadas circundando toda a superfície do escólex (Fig. 25B). As ventosas asseptadas apresentam padrões de bandas musculares e algumas células basofílicas nos bordos. Nas cavidades e no ápice das ventosas são observadas estruturas pontiagudas enfileiradas, característico de microtríquias. As ventosas se conectam umas as outras e com o órgão apical por meio de canalículos (Figs. 25C, D e E). O órgão apical apresenta-se lobado e rodeado de células basofílicas. A glândula apical esférica é perceptível no ápice do órgão apical emitindo raios que se espalham por toda a extensão deste órgão conferindo-lhe a característica de lobos (Fig. 25F). 60 Figura 25: Características morfológicas das Larvas do Morfotipo I visualizadas por meio de técnicas histológicas. Figura 25A: Visão geral da larva após evaginação do escólex. Barra = 100 µm. Figura 25B: Larva com escólex invaginado, apresentando o corpo coberto por células vacuolizadas e estruturas celulares ao redor do escólex e do órgão apical. Barra = 100 µm. Figura 25C: Visão das estruturas constituintes do escólex. Detalhe das quatro ventosas musculares arredondadas e do órgão apical protuberante dividido em lobos. Barra = 50 µm. Figura 25D: Detalhe da conectividade das ventosas por meio de um canalículo e dos espinhos pontiagudos nos bordos das ventosas.Células basofílicas são observadas ao redor das ventosas e por toda a extensão do escólex. Barra = 20 µm. Figura 25E: Detalhe da ventosa muscular com a cavidade repleta de espinhos ou volumosas microtríquias e células basofílicas ao redor.Barra = 50 µm. Figura 25F: Glândula apical esférica no ápice do órgão apical com radiações conferindo aspecto lobado deste órgão. Barra = 20 µm. 61 62 3.2.1.3 Microscopia Eletrônica de Varredura de larvas do Morfotipo I A análise pela Microscopia Eletrônica de Varredura mostrou os cistos envolvidos por um saco de tecido conjuntivo de forma irregular e aspecto bastante enrugado (Fig. 26A). Quando livres do saco de tecido conjuntivo, os cistos apresentaram superfície lisa com formato oval (Figs. 26B e 26C). Pequenas estriações foram observadas neste cisto, indicativo de elasticidade, e que provavelmente estão associado aos movimentos de contração e relaxamento deste parasito. Fora da cavidade cística, o parasito apresentou tegumento desprovido de espinhos, papilas, ganchos ou qualquer outra estrutura sensorial ou de fixação. Além disso, o tegumento apresentou estruturas semelhantes a soluções de continuidade indicando a alta atividade absortiva pelo mesmo (Fig. 26D). Larvas desses parasitos com escólex evaginado foram observados fora da cavidade cística (Figs. 26E e 27A). Estes apresentaram corpo alongado, escólex curto e arredondado e ausência de pescoço ou colo, apresentando uma pequena constrição que faz separação entre o corpo e o escólex. O escólex é provido de quatro ventosas arredondadas que constituem os órgãos de fixação, com espinhos pontiagudos na cavidade, nos bordos e em todo o contorno das ventosas (Fig. 27B). Os espinhos apresentam-se enfileirados de forma ordenada com convergência dos bordos para a região central da cavidade. Nestas regiões, os espinhos são maiores e mais pontiagudos que os encontrados nos contornos das ventosas, que vão se tornando mais truncadas quanto maior a distância dos bordos das ventosas (Fig. 27C). Nos espaços entre as ventosas o tegumento apresenta-se liso, semelhante ao observado no corpo destas formas larvares. A região apical do escólex apresenta levemente protuberante, característico do órgão apical.Este se encontra coberto por pequenos filamentos em forma de bastão, diferentes dos espinhos das ventosas (Fig. 27D). O tegumento desses parasitos não apresenta especializações como espinhos e papilas (Fig. 27E). 63 Figura 26: Caracteristicas morfológicas da bolsa cistica e das formas larvares de cestóides, observados pela Microscopia Eletrônica de Varredura. A: Visão geral de um grupo de cistos envoltos pelo saco de tecido conjuntivo. Barra=100 µm. B: Detalhe parcial do cisto quando livre do saco de tecido conjuntivo apresentando a musculatura lisa (seta). Barra: 50 µm. C: Cisto inteiramente livre do saco de tecido conjuntivo apresentando formato oval e estriações externas que garantem a elasticidade do parasito. Barra: 100 µm. D: Detalhe do tegumento rugoso do corpo do parasito quando retirado do cisto (seta). Barra: 20 µm. E: Forma larval apresentando escólex e o corpo do parasito e as aberturas das ventosas no escólex. Barra: 200 µm. 64 Figura 27: Figura 27: Características morfológicas das larvas plerocercóides de Cestódeos encontrados parasitando Ageneiosus ucayalensis, observados pela Microscopia Eletrônica de Varredura. Figura 27A: Visão geral de uma larva plerocercóide, apresentando corpo alongado e escólex arredondado e curto. Barra = 30 µm. Figura 27B: Destaque para o escólex mostrando as ventosas com formato arredondado, repleto de microtríquias volumosas na cavidade e na parte externa. Barra = 10 µm. Figura 27C: Detalhe das microtíquias volumosas enfileiradas, confluindo para o centro da cavidade cística. Observa-se que são maiores e mais pontiagudas nas cavidades e nos bordos do que na parte externa das ventosas. Barra = 3 µm. Figura 27D: Região apical do escólex com estruturas filamentosas semelhantes a volumosas microtríquias. Barra = 7 µm. Figura 27E: Visualização da superfície do tegumento do corpo do parasito, sem estruturas evidentes na superfície. Barra = 3 µm. 65 66 3.2.2 Morfotipo II (Larvas Merocercóides) 3.2.2.1 Análise taxonômica Morfologicamente, essas larvas foram caracterizadas da seguinte forma: corpo ovóide sem segmentação, medindo 1.033 mm ± 0.191 de comprimento por 0.468 mm ± 0.047 de largura, com escólex invaginado bem desenvolvido mensurando 0,4070 mm ± 0,093 x 0,24 mm ± 0,045. Essas larvas são monocefálicas, acetabuladas e apresentam escólex provido de quatro ventosas musculares com formato redondo medindo 0,057 mm ± 0,0085 de comprimento por 0,049 mm ± 0,0063 de largura, e um órgão apical desarmado medindo 0,053 mm ± 0,0094 x 0,05 mm ± 0,013. Na cavidade e nos bordos das ventosas se observam estruturas pontiagudas semelhantes a espinhos ou microtríquias longas. Além disso, observa-se a ausência da lacuna primária e do sarcômero. Figura 28: Desenho morfológico de larvas do Morfotipo II (Merocercóides), evidenciando ocorpo ovóide, escólex invaginado, órgão apical grande e as ventosas musculares arredondadas. A: Visão geral da larva e escólex invaginado contraído. Barra = 150 µm; B: Visão geral da larva e escólex invaginado relaxado. Barra = 100 µm. 67 3.2.2.2 Análise histológica de larvas do Morfotipo II A análise histológica de parasitos deste moroftipo mostrou-se semelhante ao observado na análise do Morfotipo I. Os parasitos encontravam encistados, sendo estas larvas e os cistos maiores que os do Morfotipo I. O corpo desses parasitos é preenchido internamente por células em formato de vacúolos acidofílicos ao azul de toluidina e externamente por um tegumento espesso altamente basofílico ao mesmo corante (Fig. 29A). O tegumento é interrompido por uma pequena abertura, por onde o escólex se invagina para dentro do corpo do parasito (Fig. 29B). O escólex apresenta tegumento composto de estruturas celulares basofílicas alongadas e o conteúdo interno acidofílico quando corados com o azul de toluidina. Além disso, estruturas especializadas do escólex, como as ventosas e o órgão apical se fazem presentes. As ventosas são asseptadas, uniloculares e apresentam padrões de bandas musculares na região de circunferência das bordas, além de células basofílicas. Estruturas pontiagudas, semelhantes a espinhos são observados nos bordos das ventosas e na região de conexão destes com o órgão apical, porém não foram observadas nas cavidades (Fig. 29C). As ventosas estabelecem conexões umas com as outras e com o órgão apical por meio de estruturas semelhantes a canalículos. O órgão apical é bastante protuberante e apresenta-se com aspecto granulado, também rodeado de células basofílicas. A glândula apical não foi observada neste órgão (Fig. 29D). 68 Figura 29: Características morfológicas das Larvas do Morfotipo II visualizadas por meio de técnicas histológicas. Figura 29A: Visão geral do cisto e da larva apresentando escólex invaginado e órgão apical protuberante. Barra = 200 µm. Figura 29B: Detalhe da ligação do escólex invaginado com o tegumento externo do corpo do parasito através de um orifício (seta). Notam-se estruturas celulares basofílicas alongadas ao redor do escólex. Barra = 100 µm. Figura 29C: Ventosas musculares com corpos celulares basofílicos e microtríquias volumosas nas bordas. Barra = 50 µm. Figura 29D: Detalhe do órgão apical protuberante, granuloso.Glândula apical não observada. Barra = 50 µm. com aspecto 69 70 3.2.2.3 Microscopia Eletrônica de Varredura de larvas do Morfotipo II A análise desses parasitos pela Microscopia eletrônica de Varredura mostrou que estes possuem corpo arredondado, com escólex invaginado. A superfície corporal apresenta-se lisa e não foram observadas estruturas especializadas como espinhos, microtríquias e papilas (Fig. 30A). Em uma das extremidades observou-se o orifício por onde o escólex se invagina para dentro do corpo do parasito.Este possui inúmeras pregas ao redor (Figs. 30B e 30C). O escólex e suas estruturas constituintes foram observados quando estes parasitos tiveram o corpo rompido. Este apresentou formato arredondado e curto, e o pescoço ou colo ausente (Fig. 30D). As ventosas apresentaram formato arredondado e séssil, constituindo assim os órgãos de fixação desses parasitos. Espinhos pontiagudos são observados nas cavidades e nos bordos. Estes estão presentes na região apical dessas ventosas confluíndo para o centro da cavidade das ventosas. Na parte basal dessas ventosas não se verifica padrões de espinhos (Figs. 30E e 30F). O órgão apical não foi visível por esta técnica nestes parasitos. 71 Figura 30: Características morfológicas de larvas do Morfotipo II (fase larvar Merocercóide) encontrados parasitando Ageneiosus ucayalensis, observados pela Microscopia Eletrônica de Varredura. Figura 30A: Visão geral do formato corpóreo da larva com escólex invaginado. Barra = 100 µm. Figura 30B: Presença do orifício de invaginação do escólex em uma das extremidades do corpo do parasito. Barra = 30 µm. Figura 30C: Detalhes do orifício, com abertura pequena circundada por pregas. Barra = 10 µm. Figura 30D: Disposição do escólex dentro do corpo deste parasito, mostrando as ventosas arredondadas. Barra = 50 µm. Figura 30E: Visão em maior aumento de uma das ventosas, apresentando microtríquias volumosas do centro da cavidade para o ápice e ausência destes na outra parte da ventosa. Barra = 5 µm. Figura 30F: Detalhe das microtríquias volumosas nas regiões central e apical da ventosa, sendo estes pontiagudos e dispostos em fileiras. Barra = 5 µm. 72 73 3.2.3 Morfotipo III (Larvas Merocercóides) 3.2.3.1 Análise Taxonômica As formas larvares deste grupo apresentaram as seguintes características: corpo alongado a subesférico, sem segmentação afinando posteriormente mensurando 0,904 mm ± 0,163 x 0,572mm ± 0,062. Escólex invaginado bem desenvolvido com órgão apical e quatro acetábullos mensurando 0,440 mm ± 0,061 x 0,397mm ± 0,034; acetábulos em forma de ventosas. Órgão apical desarmado e pequeno 0,056mm ± 0,027 x 0,052mm ± 0,022; ventosas redondas a oblongas, semelhante a botrídias, sésseis e uniloculadas medindo 0,086 mm ± 0,005 x 0,101mm ± 0.004. Na cavidade e nos bordos das ventosas se observam estruturas pontiagudas semelhantes a microtríquias volumosas. Não foram observadas lacuna primária e sarcômero. Figura 31: Desenho morfológico da larva do Morfotipo III (merocercóide), evidenciando o corpo alongado, escólex invaginado, órgão apical pequeno e as ventosas musculares arredondadas, com a base em formato cônico, confluindo para o centro do órgão apical. A: Visão geral do formato das larvas. Barra = 150 µm; B: Detalhe das ventosas e do órgão apical. Barra = 100 µm 74 3.3 ANÁLISE MOLECULAR COMPARATIVA ENTRE OS MORFOTIPOS LARVARES I E II Para a análise filogenética foram obtidas 544 nucleotídeos da subunidade menor do rDNA do morfotipo I e 635 nucleotídios do Morfotipo II. Estes nucleotídeos foram blastados e alinhados com as sequências de Cestódeos Proteocephalídeos neotropicais previamente depositadas no GenBank conforme mostra o Quadro 2. Após a comparação das sequências pelo programa Blast, o Morfotipo I apresentou 99% de identidade com 68% de cobertura com as espécies Endorchis piraeeba e Amphoteromorphus parkamoo enquanto o Morfotipo II apresentou a mesma taxa de similaridade com 69% de cobertura com as espcies Proteocephalus brooksi e Megathylacus brooksi. A análise filogenética pelo método de Máxima Parcimônia e pela Inferência Baesiana demonstrou que as fases larvares do Morfotipo I e do Morfotipo II pertencem a gêneros distintos, pois o Morfotipo I formou um clado monofilético com as espécies Amphoteromorphus parkamoo, Endorchis piraeeba e Choanoscolex abscisus, enquanto que o morfotipo II se agrupou em outro clado com a espécie Ageneiella brevifilis. Os valores de bootstrap e da probabilidade posterior foram superiores a 30 e 0,60 respectivamente (Figs. 28 e 29). Pela Inferência Baesiana, apenas as espécies de Proteocephalus ficaram completamente separadas das demais espécies ao se agruparem em um clado com valor de probabilidade posterior 0,9. A distância ―P‖ inferida pelo PAUP, corroborou com os dados obtidos anteriormente mostrando que o Morfotipo I e o Morofotipo II pertencem a gêneros diferentes.No entanto por este parâmetro, o Morfotipo I mostrou semelhanças com a espécie Endorchis piraeeba, e o morfotipo II mostrou-se diferente de todos os demais gêneros analisados (Tabela 1). 75 Quadro 2: Espécies de parasitos neotropicais depositadas no genbank e utilizadas neste trabalho para construção filogenética juntamente com os parasitos em estudo. Hospedeiro Origem Genbank Morfotipo I –larvas cestódeos Ageneiosus ucayalensis Pará - brasil ________ Morfotipo II –larvas cestódeos Ageneiosus ucayalensis Pará - brasil ________ Endorchis piraeeba Brachyplatistoma filamentosum Amazonas Brasil AY551107 Amphoteromorphus parkamoo Paulícea luetkeni Amazonas Brasil AY551103 Nomimoscolex sudobim Pseudoplatystoma fasciatum Amazonas Brasil AY551117 Choanoscolex abscisus Pseudoplatistoma coruscans Paraguai Proteocephalus hemioliopteri Phractocephalus hemioliopterus Amazonas – Brasil AY551129 Proteocephalus pirarara Phractocephalus hemioliopterus Amazonas – Brasil AY551131 Goezeella siluri Pinirampus pirinampu Amazonas – Brasil AY551110 Ageneiella brevifilis Ageneiosus breviffilis Paraguai Gibsoniela meursaulti Ageneiosus breviffilis Paraguai MesoCestódeos corti _______ _______ Parasitos AY551105 AY551102 AY551109 AF286984 76 Figura 32: Árvore filogenética obtida pelo método da Máxima Parcimônia, avaliando parte da Subunidade menor do DNA ribossomal de Cestódeos. O círculo preto indica a amostra dos parasitos do Morfotipo II e os círculos brancos representam as amostras dos parasitos do Morfotipo I, ambos fases larvares de Cestódeos encontrados parasitando Ageneiosus ucayalensis. As demais sequências foram obtidas do GenBank e compõem diversos gêneros e espécies Neotropicais da Família Proteocephalidae. São elas: Anphoteromorphus Parkamoo ( A parkam), Endorchis Piraeeba (E Piraeba), Coanoscolex absiscis (Ch abscis), Nomimosclex sudobim (N sudobim), Anphoteromorphus piraeeba (A piraeba), Gibsoniela meursatus (G meursa), Ageneiela brevifilis (A brevif), Goezela siluri (G siluri), Proteocephalus pirarara (P pirar), Proteocephalus hemioliopteri (P hemio). Mesocestides corti (M corti) foi utilizado como grupo externo, para esta análise. 77 Figura 33: Árvore filogenética feita utilizando o método da Inferência Baesiana, com a finalidade de comparar parte da Subunidade menor do DNA ribossomal de Cestódeos. Os Morfotipos I (plerocercóides) e II (merocercóides) são fases larvares de Cestódeos encontrados parasitando Ageneiosus ucayalensis.As demais sequências foram obtidas do GenBank e compõem diversos gêneros e espécies Neotropicais da Família Proteocephalidae. São elas: Anphoteromorphus Parkamoo ( A parkam), Endorchis Piraeeba (E Piraeba), Coanoscolex absiscis (Ch abscis), Nomimosclex sudobim (N sudobim), Anphoteromorphus piraeeba (A piraeba), Gibsoniela meursatus (G meursa), Ageneiela brevifilis (A brevif), Goezela siluri (G siluri), Proteocephalus pirarara (P pirar), Proteocephalus hemioliopteri (P hemio). Mesocestides corti (M corti) foi utilizado como grupo externo, para esta análise. 78 Tabela 1: Distância ―p‖, obtida utilizando as sequências das fases larvares dos Morfotipos I e II e as sequências de Proteocephalídeos Neotropicais disponíveis no GenBank. Morfotipo Morfotipo E_piraeba A_parkam A_piraeba Ch_abscis G_siluri N_sudobim G_meursa A_brevif P_hemio M_corti I II Morfotipo I 0.0000 Morfotipo II 0.0114 E_piraeba 0.0000 0.0115 A_parkam 0.0022 0.0137 0.0022 A_piraeba 0.0088 0.0162 0.0088 0.0110 Ch_abscis 0.0088 0.0206 0.0088 0.0110 0.0176 G_siluri 0.0198 0.0232 0.0197 0.0221 0.0198 0.0286 N_sudobim 0.0242 0.0319 0.0242 0.0264 0.0286 0.0286 0.0330 G_meursa 0.0220 0.0209 0.0220 0.0242 0.0264 0.0307 0.0286 0.0418 A_brevif 0.0330 0.0276 0.0330 0.0330 0.0330 0.0374 0.0396 0.0484 0.0417 P_hemio 0.0844 0.0843 0.0844 0.0869 0.0844 0.0911 0.0777 0.0914 0.0887 0.0933 P_pirar 0.0505 0.0531 0.0505 0.0529 0.0549 0.0593 0.0549 0.0615 0.0637 0.0703 0.0822 M_corti 0.1185 0.1216 0.1187 0.1211 0.1185 0.1184 0.1184 0.1319 0.1226 0.1225 0.1419 0.1319 79 3.4 ANÁLISE DOS ASPECTOS ANGIOGÊNICOS DO PARASITISMO 3.4.1 Descrição histológica Os cortes histológicos do tecido contendo os cistos mostram um tecido conjuntivo com poucas fibras e abundantes células ao redor dos cistos, característico de tecido conjuntivo frouxo (Fig. 34A). Pequenos vasos sanguíneos são visualizados compondo este tecido, circunvizinho aos cistos e, apresentam circundados por uma substância de consistência viscosa, característico de substância fundamental. Esta substância também é observada ocupando a maior parte da cavidade cística, ao redor dos parasitos, o que faz com que esta representa o maior volume observado neste tecido (Fig. 34B). Neste tecido ainda é possível observar diferentes tipos celulares basofílicos como células epiteliais alongadas ou fusiformes, com núcleo e nucléolo evidentes, característico de fibroblastos e células granulocíticas agrupadas, formando pequenos inchaços típicos de infiltrados inflamatórios.Hemácias nucleadas podem ser vistas na luz dos vasos sanguíneos (Fig. 34B). Os parasitos encontram-se envoltos por uma bolsa cística, cuja membrana é fina, irregular e com ondulações típicas de tecido fibroelástico. Esta última característica também foi observado no tegumento do parasito que apresentou levemente metacromático ao azul de toluidina. Células basofílicas se apresentam em grande abundância ao redor do escólex, principalmente na região muscular das ventosas e nas redondezas do órgão apical (Fig. 34C). Mais externamente ao agrupamento de cistos, os pequenos vasos sanguíneos vão se convergindo em vasos de calibre cada vez maior, até a fusão completa em um vaso de grande calibre (Fig. 34D) que normalmente é recrutado de órgãos do hospedeiro altamente irrigados, como fígado e estômago. Estes vasos estão sustentados por um tecido conjuntivo com muitas fibras e poucas células, caracterizando possivelmente tecido conjuntivo denso. Em alguns casos foram observados cistos destes psrasitos no fígado de Ageneiosus ucayalensis e estes apresentaram uma pequena área de necrose, caracterizado por poucas células (hepatócitos) ao redor e rico em fibras (Figs. 34E e 34F). Secções semi-finas coradas com azul de toluidina mostraram vasos de médio calibre no tecido conjuntivo ao redor dos cistos e a íntima relação entre pequenos 80 vasos e a membrana cística (Figs. 35A e 35B). Detalhes das estruturas internas do parasito referentes ao escólex também foram evidenciadas tais como a musculatura da parte apical arredondado das ventosas e as células basofílicas alongadas ao redor do escólex (Fig. 35B). Vasos de grande calibre foram observados mais externamente ao agrupamento cístico, com a luz repleta de hemácias nucleadas e tecido fibroso na constituição da parede (Fig. 35C). Colorações mais específicas, tais como a Hematoxilina-Eosina (HE) e os Tricrômios de Mallory e Gomori, objetivando melhor caracterização das estruturas celulares e o tipo de tecido conjuntivo envolvido neste processo foram utilizadas. A coloração pela HE evidenciou células extremamente basofílicas na região do escólex, principalmente ao redor das ventosas, do órgão apical e na bainha de invaginação do escólex (Figs. 36A e 36B), além de células teciduais e hemácias no interior dos vasos sanguíneos presentes no tecido conjuntivo que albergam os cistos.Em contrapartida, o tecido conjuntivo ao redor dos cistos mostrou-se altamente acidofílico (Fig. 36A). A coloração pela orceína denunciou a presença de fibras elásticas como o principal constituinte fibroso do escólex, membrana cística e tegumento do parasito (Fig. 36C). Fibras colágenas também foram evidenciadas como constituintes desses tecidos, pela coloração com tricrômio de Mallory (Fig. 36D). Os vasos sanguíneos assim como o tecido conjuntivo ao redor dos cístos também mostraram presença de fibras elásticas e colágenas em suas constituições, porém com menor intensidade (Figs. 36C e 36E). Fibras musculares na região apical do escólex e células basofílicas ao redor deste órgão foram visualizadas pela coloração com os tricrômios de Mallory (Fig. 36F) e Gomori. Vestígios nucleares corados em preto se fizeram presentes no escólex (Figs. 37A e 37 B). A reação ao Ácido Periódico de Schiff mostrou-se intensamente positiva para as regiões do escólex, tegumento, e conteúdo cístico ao redor dos parasitos evidenciando a presença de compostos glicídicos nessas regiões. Estes compostos também se fizeram presentes nas membranas dos vasos sanguíneos, porém com menor intensidade (Figs. 37 C e 37D). Corte tratado apenas com o reagente de Schiff foi tomado como controle negativo (Fig. 37E). 81 Figura 34: Análise de cortes histológicos de amostras embebidas em historesina® e coradas pelo Azul de Toluidina. Figura 34A: Visão geral do tecido contendo cistos de Cestódeos e vasos sanguíneos, com destaque para os tecidos conjuntivos frouxo (tcf) e denso (tcd) presentes nessa estrutura ricamente vascularizada. Pequenos vasos são vistos por todo o tecido (setas brancas). Barra = 100 µm. Figura 34B: Detalhe de vasos sanguíneos (V) na proximidade dos cistos; cavidade cística (Cc) com ausência de parasito; parasito dentro do cisto com células basofílicas na região do escólex (seta) circundando as ventosas e o órgão apical; e infiltrado inflamatório (Inf) ao redor dos cistos. Barra = 20 µm. Figura 34C: Visão geral da disposição de vasos e cistos, com destaque para vaso de grande calibre (Vgc) de onde ramificam os vasos de médio calibre (Vmc) que entrelaçam os cistos, caracterizando a rica vascularização nesse tecido. Barra = 100 µm. Figura 34D: Detalhe de vasos sanguíneos grandes (Vg) e pequenos, com destaque para o pequeno infiltrado inflamatório (inf) e células epiteliais fusiformes (setas), observados no epitélio e na luz dos vasos (seta). Barra = 10 µm. Figura 34E: Fragmento de fígado do hospedeiro (F), com um parasito encistado em seu interior (C). Barra = 100 µm. Figura 34F: Detalhe do cisto no fígado do hospedeiro, mostrando a pequena área fibrosada (f) com poucos hepatócitos ao redor. Barra = 20 µm. 82 83 .Figura 35: imagens de secções histológicas semi-finas do tecido contendo cistos de parasitos Cestódeos e vasos sanguineos ao redor. A- cistos com parasito e vaso de médio calibre no tecido conjuntivo. Barra: 50 µm. B – detalhe de estruturas do escólex invaginado e pequenos vasos próximos à membrana cística. Barra: 50 µm. C – vasos de grande calibre no tecido mais distante do cisto. Barra: 50 µm. 84 Figura 36: Análise histológica de Cistos e vasos em amostras embebidas em parafina e submetidos à coloração pela Hematoxilina – Eosina, Tricrômio de Mallory e Orceína. Figura 36A: Visão geral de cistos, vasos e tecido adjacente corados com hematoxilina eosina, destacando tecido basofílico na região do escólex, acidofilia do tecido conjuntivo e vasos sanguíneos ao redor dos cistos. Barra = 200 µm. Figura 36B: Detalhe da parte interna do corpo do parasito com destaque para as células basofílicas ao redor das ventosas e do órgão apical; o tecido entre as ventosas e na região central do órgão apical mostraram-se acidofílicos. Barra = 20 µm. Figura 36C: Visão geral da coloração do tecido com cistos de cestóides pequenos (Cp) e grande (Cg) e vasos sanguíneos pelo tricrômio de Mallory. Barra = 100 µm. Figura 36D: Detalhe de cisto corado por tricrômio de Mallory, mostrando as fibras musculares (Fm) do escólex, mais precisamente na região das ventosas e as fibras colágenas (Fc) presentes no corpo do parasito e na região tegumentar. Barra = 20 µm. Figura 36E: Visão geral do tecido com cistos e vasos mostrando as fibras elásticas em marrom, após coloração com Orceína. A região do escólex, tegumento do parasito e tecido em volta destes mostraram maior afinidade por este corante. Barra = 100 µm. Figura 36F: Detalhe da região do escólex rico em fibras elásticas (marrom), após coloração pela Orceína. Barra = 20 µm. 85 86 Figura 37: Análise histológica de Cistos e vasos embebidos em parafina e submetidos à coloração pelo Tricrômio de Gomori e pelo Ácido Periódico de Schiff (PAS). Figura 37A: Visão geral da coloração do tecido conjuntivo e cistos de cestóides pelo Tricrômio de Gomori. Barra = 100 µm. Figura 37B: Detalhe de cisto corado por Tricrômio de Gomori, mostrando as fibras musculares (seta) e as células basofílicas ao redor do escólex (asterisco). Barra = 20 µm. Figura 37C: Visão geral de cistos de Cestódeos e vasos sanguíneos do tecido conjuntivo com reação positiva para a coloração do P.A.S. Barra = 100 µm. Figura 37D: Detalhe da região do escólex, mais especificamente a região das ventosas e do órgão apical, do tegumento do parasito e do conteúdo cístico intensamente positivos pelo P.A.S. Barra = 20 µm. Figura 37E: Visão geral do controle negativo da massa cística, tratada pela reação do P.A.S. Note a ausência de reação desse tecido ao Ácido Periódico de Schiff. Barra = 100 µm. 87 88 3.4.2 Reconstrução tri- dimensional A reconstrução Tri-dimensional foi realizada para reconstruir a complexa estrutura e a relação entre os vasos sanguíneos de diferentes calibres, desde a conexão com órgãos do hospedeiro até as ramificações em vasos menores circundando os cistos.(Figs. 38A, 38 B e 38C). A disposição e a sobreposição dos cistos com parasitos maiores e menores (Fig. 38D); a espessura dos vasos sanguíneos e o seus direcionamentos ao longo da bolsa cística formando assim uma espécie de rede de conexão (Fig. 38E) e a íntima relação entre os cistos contendo os parasitas e os vasos sanguíneos (Fig. 38F) foram observadas. Através de rotações no eixo X em diferentes ângulos (Fig. 39), é possível visualizar detalhes da relação cisto e vaso sanguíneo, desde as primeiras camadas da área de reconstrução, até à última secção. 89 Figura 38: Reconstrução tri-dimensional dos cistos de cestóides e vasos sanguíneos adjacentes a partir da somatória de 201 secções seriadas de material embebido em Historesina®, obtido do parasitismo por cestóide em Ageneiosus ucayalensis da Baia do Guaja, Belém-PA. Figura 38A: Área do corte histológico, tomado para obtenção da reconstrução tri-dimensional através do alinhamento em série de 201 cortes. Barra = 200 µm. Figura 38B: Demonstração do contorno dos cistos, que foram seguidos ordenada e sequencialmente até o término das 201 secções, para obtenção da estrutura tri-dimensional dos mesmos. Barra = 200 µm. Figura 38C: Demonstração do contorno dos vasos sanguíneos que foram seguidos ordenada e sequencialmente até o término das 201 secções para obtenção da estrutura tri-dimensional dos mesmos. Barra = 200 µm. Figura 38D: Estrutura tri-dimensional dos cistos originado após o alinhamento e contorno em software Reconstruct® Versão 1.1.0.0 19962009. Figura 38E: Estrutura tri-dimensional dos cistos originado após o alinhamento e contorno em software Reconstruct® Versão 1.1.0.0 19962009. Figura 38F: Estrutura tridimensional dos cistos e vasos sanguíneos, mostrando a íntima relação entre estes. 90 91 Figura 39: Diversos ângulos da reconstrução tri-dimensional obtidas a partir de rotações no eixo X e Y, permitindo a visualização detalhada das estruturas envolvidas no processo angiogênico induzida por larvas de Cestódeos em Ageneiosus ucayalensis. A- Visão basal do aglomerado de cistos e vasos sanguíneos entralaçados entre estes. B-Rotação no eixo do X em um ângulo de 180º levógero, mostrando a fase inicial da reconstrução, expessura e dimensão dos cistos e vasos. C-Rotação no eixo do Y em um ângulo de 270º sentido descendente com destaque para dimensão lateral e o entrelaçamento dos vasos com os cistos. D – Rotação no eixo do Y, em um ângulo de 90º sentido descendente, mostrando a massa de cistos bem mais ampla e pequenos vasos entre eles. 92 3.4.3 Microscopia Eletrônica de Varredura da massa cística A análise do tecido contendo os parasitos e os vasos sanguíneos, que juntos caracterizam um tecido ricamente vascularizado encontrado em Ageneiosus ucayalensis. Pela técnica de Microscopia Eletrônica de Varredura observou-se um saco cístico mostrou que o saco cístico, formado de tecido conjuntivo conectado com um pedúnculo de vasos sanguíneos emergentes de órgãos do hospedeiro, a exemplo do fígado (Fig. 40A). Dentro deste saco é possível observar outros pequenos sacos albergando grupos de cistos, assim como cistos de tamanhos diferentes, maiores e menores, (Fig. 40B), que caracteriza as formas larvares distintas, descritas anteriormente, nas diferentes fases de vida. Ainda neste saco podemos observar uma intensa rede de vasos sanguíneos, composto de vasos de pequeno e médio calibre que se ramificam em todas as direções, envolvendo toda a massa cística (Figs. 40C e 40D). Estes vasos se difundem pelo tecido conjuntivo, e apresentam uma íntima relação com os cistos em particular. (Figs. 40E e 40F). 93 Figura 40: Características morfológicas do saco de tecido conjuntivo e vasos sanguíneos que envolvem os cistos de Cestódeos, observados pela Microscopia Eletrônica de Varredura. Figura 40A: Visão geral do saco de tecido conjuntivo (stc) envolvendo os cistos e o pedúnculo de vasos (p) ligado ao fígado (f). Barra = 1 mm. Figura 40B: Detalhe da diferença de tamanho dos cistos, podendo ser grandes (cg) e pequenos (cp) extremamente irrigados por uma rede de vasos sanguíneos. Barra = 500 µm Figura 40C e 40D: Detalhe da intensa rede de vasos sanguíneos de pequeno e médio calibre multidirecionadas, de acordo com a disposição dos cistos. Barra = 100 µm e 200 µm respectivamente. Figura 40E: Em maior aumento observa-se diversas ramificações dos vasos, contornando os cistos, direcionando desta forma o sentido do crescimento e a formação de uma rede desordenada de vasos. Barra = 200 µm. Figura 40F: Detalhe da conexão de um vaso de médio calibre com um grupo de cistos dentro de um pequeno saco de tecido conjuntivo. Barra = 100 µm. 94 95 3.4.4 Microscopia Eletrônica de Transmissão da massa cística A análise pela Microscopia Eletrônica de Transmissão evidenciou estruturas teciduais e celulares na interface da relação entre os parasitos, vasos sanguíneos e o tecido conjuntivo formado durante o processo angiogênico verificado no parasitismo de larvas de Cestódeos em Ageneiosus ucayalensis. No tecido conjuntivo circunvizinho aos cistos dos parasitos, agregados filamentosos frouxamente arranjados foram observadas, característico de fibrilas ou microfibrilas de colágeno, constituinte desse tecido como demonstrado anteriormente pelas colorações de orceína e tricrômio de Mallory (Figs. 41A e 41B). Além disso, células com núcleo esférico e excêntrico, possuindo uma extensa área de heterocromatina periférica que alterna com áreas de eucromatina, característico de células plasmocíticas foram visualizadas nesse tecido (Fig. 41C). Também foi possível observar estruturas apresentando aspecto proliferativo para formação de membranas celulares (Fig. 41D ). Para o estabelecimento do processo angiogênico, vasos sanguíneos migram pelo tecido em direção aos cistos contendo os parasitos (Fig. 42A) e se estendem por toda a circunferência dos cistos. Pela técnica de vermelho de rutênio evidenciouse as estruturas membranosas, fazendo separação nítida entre a membrana cística e a membrana epitelial dos vasos (Fig. 42B). Regiões eletrondensas características de íntima associação entre membranas sugerem conexão entre a membrana cística e a membrana epitelial dos vasos sanguíneos (Fig. 42C). Densa camada de aspecto fibrilar eletrondenso é observada no cisto, entre os vasos de pequeno calibre e a superfície do parasito (Fig. 42D). Uma camada eletronlúcida preenchida por estruturas vesiculares separa a limitação externa do citoplasma distal do tegumento do parasito e a interface fibrosa do cisto. Na região cortical próximo á superfície do tegumento do parasito, existem numerosas vesículas de aspecto caveolar característico de vesículas pinocíticas (Fig. 42F). Ainda nessa região de interface foi possível observar estruturas celulares características de figuras mielínicas (Fig. 42G). Os parasitos apresentam tegumento do tipo sincicial composto pelo citoplasma distal anucleado, lâmina basal e células tegumentares perinucleares situados abaixo da camada muscular do tegumento (Fig. 43A). 96 O citoplasma distal é composto quase na sua totalidade por vesículas eletronlúcidas. Corpos eletrondensos são visualizados em algumas áreas intercalando com as vesículas. Externamente o citoplasma distal é limitado por microtríquias filamentosas que se estendem por toda a superfície corpórea, sendo estas melhor visualizadas em áreas de depressão tegumentar (Figs. 43B e 43C). Estas microtíquias apresentam duas áreas distintas: uma capa eletrondensa, cujo centro é também homogeneamente eletrondenso e o ápice composto por glicocálix, e uma base cujo centro é eletronlúcido. Esta última é inserida na superfície do citoplasma distal por uma membrana eletrondensa (fig. 43D). A lâmina Basal se subdivide em duas camadas, sendo uma camada eletrondensa que parece intimamente ligada ao citoplasma distal e uma camada fibrosa que se conecta com o restante do aparato tegumentar. Bandas musculares circulares e longitudinais são observadas abaixo da lâmina basal (Fig. 43E). Processos internunciais, fazem conexão entre o citoplasma distal e o proximal, conferindo característica de sincício observado neste tegumento. Estes são visualizados em dois formatos diferentes: um com espessura fina, formando pequenos canalículos entre o citoplasma distal e o proximal e outro largo, mais elaborado, formado pela invaginação da membrana basal. Este cresce em direção ao citoplasma proximal, atravessando a lâmina basal e a camada muscular (Fig. 43E e 43 F). 97 Figura 41: Estruturas celulares e teciduais da bolsa cística ricamente vascularizada e formada por larvas de Cestódeos em Ageneiosus ucayalensis observados através da técnica de Microscopia Eletrônica de Transmissão. Figura 41A: Arranjos fibrosos do tecido conjuntivo ao redor dos cistos. Barra = 2µm. Figura 41B: Detalhe da estrutura filamentosa das fibras organizadas em feixes longitudinais (setas longas) e ou em secções aleatorias (setas curtas). Barra =1 µm. Figura 41C: Detalhe de célula do tecido conjuntivo com destaque para o núcleo com extensa área de heterocromatina periférica e eucromatina central eletronlúcida. Barra = 2µm. 98 99 Figura 42: Aspectos da inter-relação vasos sanguíneos, cisto e, tegumento de larvas de Cestódeos ou Metacestódeos observados através da técnica de Microscopia Eletrônica de Transmissão. Figura 42A: Detalhe de vasos sanguíneos (v) que se estendem por toda a superfície dos cistos (c). Barra = 1µm. Figura 42B: Pontos de conexão entre os vasos, e a camada fibrilar, disposta na superfície dos parasitos (setas). Barra = o,5µm Figura 42C: Visão geral da associação dos vasos sanguíneos, membrana cística fibrosa, tegumento do parasito e o espaço comunicante entre o parasita e os constituintes do cisto. Detalhe da área cortical da larva repleto de grânulos. Barra = 5µm. Figura 42D: Detalhe da interface fibrilar disposta na superfície do parasito e do espaço eletronlúcido com inúmeras vesículas próximo ao tegumento do parasito (p). Barra = 2µm. Figura 42E: Detalhe da região cortical do parasito com intensa atividade pinocítica caracterizada pela formação de cavéolos (setas). Barra = 1µm. Figura 42F: Figura mielínica observada dentro do espaço cístico, na interface entre o parasito e o meio exterior a este. Barra = 0,5µm. 100 101 Figura 43: Ultraestrutura do tegumento de larvas de Cestódeos ou Metacestódeos observados através da técnica de Microscopia Eletrônica de Transmissão. Figura 43A: Detalhe do Citoplasma apical (cd) cheio de grânulos, do tegumento de larvas de Cestódeos com células eletronlúcidas, lâmina basal (Lb), bandas musculares (m) e células tegumentares do citoplasma proximal (cp). Barra = 1µm. Figura 43B: Detalhe de microtríquias por toda a extensão da superfície do tegumento da larva (setas). Barra = 2µm. Figura 43C: Detalhe das microtríquias filamentosas (mf) na região de depressão tegumentar. Abaixo das microtríquias observa-se vesículas absortivas. Barra = 0,5µm. Figura 43D: Detalhe de uma microtríquia filamentosa eletrondensa, composta pela capa (ca) eletrondensa e a base (b) eletronlúcida. Barra = 0,5µm. Figura 43E: Detalhe da invaginação do citoplasma distal (setas) em direção ao citoplasma proximal e das camadas de músculos circulares (mc) e longitudinais (ml), situados abaixo da lâmina basal. Barra = 2µm. Figura 43F: Detalhe dos processos internunciais largo (seta branca) e finos (setas pretas) fazendo conexão entre o citoplasma distal e o proximal. Barra = 1µm. 102 103 4 DISCUSSÂO 4.1 ANÁLISE MORFOLÓGICA As formas larvares deste estudo pertencem à Ordem Proteocephalidea, Família Proteocephalidae, pois se encontravam encapsuladas, possuindo um escólex com quatro ventosas musculares, acetabulares e uniloculadas, órgão apical, e são parasitos de cavidade celomática de Ageneiosus ucayalensis. De acordo com a chave taxonômica para fases larvares de Cestódeos proposta por Rego et al. (1999) estas são as principais características de diagnose para formas larvares da Ordem Proteocephalidea, Família Proteocephalidae. Todas as formas larvares deste estudo apresentaram escólex invaginado e bem desenvolvido pelo que foram classificados inicialmente como sendo larvas Merocercóides da Família Proteocephalidae, pois segundo Chervy (2002), os parasitos pertencentes a esta Família possuem duas fases larvares: a fase Plerocercóide cuja característica principal é a presença do escólex evaginado, e a fase Merocercóide que apresenta escólex invaginado. Pelas características morfológicas, morfométricas e biológicas, encontramos três morfotipos de larvas de Cestódeos: o Morfotipo I com tamanho pequeno e excólex com órgão apical grande; o Morfotipo II com tamanho grande e escólex possuindo órgão apical grande; e o Morfotipo III com tamanho relativamente grande e apresentando o órgão apical muito pequeno. As larvas do Morfotipo I e do Morfotipo II são idênticas morfologicamente, diferindo apenas em morofmetria e prevalência, onde o Morfotipo I (menor) é mais abundante que o Morfotipo II (mais volumoso), aparentando assim, tratar-se de um mesmo tipo, podendo a diferença de tamanho estar relacionada com o tempo de infecção do hospedeiro Ageneiosus ucayalensis. Contudo, de acordo com Schoolz (1991), os platelmintos não são capazes de desenvolver dentro de seus hospedeiros de transporte ou paratênicos. No entanto, podem permanecer vivos durante muito tempo. Diante disso, investigamos a hipótese de que as formas larvares menores (Morfotipo I) poderiam ser do tipo Plerocercóide, enquanto que as maiores (Morfotipo II) seriam do tipo Merocercóide, uma vez que é comum a invaginação do escólex pelos Plerocercóides Proteocephalídeos, visando a proteção do parasito frente às condições do meio em que está exposto. Esta hipótese foi fundamentada 104 ao observamos a evaginação de excólex por alguns exemplares do Morfotipo I quando estes foram expostos a uma solução tampão fosfato salino (PBS); reação que não foi observada no Morfotipo II. Assim, a invaginação do escólex por esta forma larvar pode ser explicado pelo fato de Ageneiosus ucayalensis entrar no ciclo de vida como hospedeiro paratênico, e, portanto não possui as características físicoquímicas adequadas para o crescimento e desenvolvimento desta larva. Anikieva (1983) relatou a invaginação do escólex de larvas de Proteocephalus logo após a ingestão por seus hospedeiros definitivos, como forma de proteção contra a acidez do estômago e, quando em meios alcalinos, os parasitos evaginariam o escólex. Em contrapartida, Freeman (1964) observou ocasionalmente a invaginação do escólex de metacestóides em meio salino, mas não observou in situ. Agusti et al., (2005) também observou evaginação do escólex de Phyllobothrium delphini e Monorygma grimaldii, ambas as espécies pertencentes à Ordem Tetraphyllidea, após exposição dos parasitos em meio salino. No entanto pelas características moleculares, concluímos que estas formas larvares se tratam de três morfotipos larvares em estágio diferente, estando o Morfotipo I na fase Plerocercóide e os Morfotipos II e III na fase Merocercóide. Estes dados levantam uma questão importante do ponto de vista ecológico onde Ageneiosus ucayalensis seria tanto hospedeiro intermediário quanto paratênico para diferentes fases larvares da Família Proteocephalidae. Os três morfotipos larvares não possuem metascólex, aspecto característico de espécies dos gêneros Zygobothrium, Brayela, Chambriella, Gibsoniela, Harriscolex, Houssayela, Travassiella, Crepidobothrium, Proteocephalus, Cangatiella, Nomimoscolex, Nupelia, Monticellia e Ophiotaenia de acordo com Rego et al. (1999). Scholz et al. (1998) e Rego (1999) consideram que a presença ou não de metascólex, as característricas de escólex referentes a glândulas frontais, órgão apical, apêndices das ventosas, presença de espínhos ou microtríquias, associadas à descrição da disposição das gônadas e vitelarias em relação à musculatura interna longitudinal, forneceriam informações mais precisas na separação de subfamílias e gêneros dentro do grupo Proteocephalidea. No entanto, de acordo com Rego (1999) esses caracteres têm sido negligenciados pelos autores na classificação de Proteocephalídeos da América do Sul que consideram apenas as características dos órgãos reprodutivos. Além disso, Rego (1999) afirma que as características de 105 escólex de formas larvares de Proteocephalídeos não sofrem muitas modificações quando este se desenvolve para a forma adulta. Deste modo, foi observado em A. ucayalensis que ambos os Morfotipos I, II e III apresentam escólex pequeno, arredondado, com quatro ventosas musculares sem apêndices e repletas de microtríquias volumosas semelhantes a pequenos espinhos nos bordos e nas cavidades, glândula apical na região apical do escólex e um órgão apical característico e desarmado. Este último é bem protuberante nos Morfotipo I e II, enquanto que no Morfotipo III se apresenta de forma sutil. Segundo Rego, 1999, nas espécies de Cestódeos Neotropicais descritas, o órgão apical é frequentemente encontrada nas espécies dos gêneros Proteocephalus e Ophiotaenia, podendo ser bastante notável ou em alguns casos de difícil observação. Por outro lado, Yamaguti (1959) utiliza como características de diagnose do gênero Ophiotaenia a presença do órgão apical vestigial. A glândula apical, também conhecida como glândula frontal é mais frequente em espécies dos gêneros Proteocephalus, Ophiotaenia e Nomimoscólex. Já os espinhos podem ser encontrados recobrindo toda a superfície das ventosas em algumas espécies dos gêneros Monticellia, como M. Spinulífera e M. Lenha, e Nomimoscolex, a exemplo de N. piraeeba, N. Sudobim, N. Lenha e N. Semenasae (Rego, 1999). Por outro lado, Yamagutti (1959) considera que o gênero Monticellia não possui órgão apical, podendo este estar ou não presente no gênero Nomimoscolex. Estes dados nos dão indício de que as larvas do Morfotipo I e II possuem algumas características que se assemelham a espécies do gênero Proteocephalus e outras que tendem para espécies do gênero Nomimoscolex; enquanto que as características do Morfotipo III direciona este parasito para o gênero Nomimoscólex. Rego (1999) acrescenta que as espécies de Proteocephalídeos Neotropicais não necessitam de estudos minuciosos dos sistemas reprodutivos para diferenciações morfológicas espécies-específicas, como acontece nas espécies de Proteocephalídeos da região paleártica, podendo a identificação ser feita pelas características morfológicas de escólex e metascólex. Em nossa opinião, para a identificação taxonômica clássica de espécies de proteocephalídeos, ainda se faz necessário o estudo dos órgãos reprodutores através da análise de gônadas e vitelárias em cortes histológicos de proglotes maturas, o que não é possível para este estudo, pois os parasitos em questão tratam-se de fases larvares da Família 106 Proteocephalidae. Para esclarecer este impasse buscou-se técnicas de Biologia molecular na tentativa de esclarecer os gêneros e mesmo espécies aos quais pertencem os parasitos dos Morfotipos I e II. O emprego desta técnica para o Morfotipo III não foi possível, por falta de exemplares. 4.2 BIOLOGIA MOLECULAR Os resultados obtidos pelas técnicas de biologia molecular inferiram uma separação em nível de gêneros das fases larvares dos Morfotipos I e II, uma vez que estes se separaram em clados diferentes, agrupando com diferentes espécies. Pelos dados da distância ―P‖, o Morfotipo I mostrou similaridade com a espécie Endorchis piraeeba, podendo se tratar da mesma espécie. O Morfotipo II mostrou distância significativa com todos os gêneros analisados, inclusive o Morfotipo I. No entanto, estes dados não são suficientes para afirmar com precisão a quais gêneros esses parasitos pertencem. Isto provavelmente se deve ao fato das sequências obtidas oferecerem poucas informações nucleotídicas para garantir a separação desses parasitos, uma vez que apenas cerca de 400 pares de bases da região 18S foram utilizados para análise. Outro aspecto a ser considerado é o fato de que a região gênica 18S é bastante conservada, sendo necessário um estudo mais criterioso utilizando regiões com maiores especificidades para a separação de espécies, a exemplo da região ITS. Este fato foi comprovado por Hypsa et al. (2004), que ao analisarem espécies de proteocephalídeos das regiões neotropical e paleártico, não obtiveram resultados satisfatórios apenas com a região 18S, sendo isto possível após a combinação dessa região com as regiões ITS, 16S e 28S para se obter um suporte significativo dos ramos filogenéticos. Além disso, estes autores observaram que destas sequências de proteocephaíideos analisadas, a região 18S foi a que apresentou maior nível de conservação, enquanto a região ITS foi o que apresentou maiores informatições. Estes autores realçaram ainda que a região ITS pode ser útil futuramente para estudos mais complexos. Assim, acreditamos que a princípio o gene 18S é útil para separação e/ou distinção entre os morfotipos larvares I e II encontrados em A. ucayalensis; no entanto, é necessário a utilização de outros genes para se investigar a identificação de gêneros e, por que não, espécies destes dois Morfotipos. 107 4.3 CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS DA RELAÇÃO ENTRE AS LARVAS METACESTÓIDES E A.ucayalensis 4.3.1 Aspectos histológicos O intenso parasitismo culmina com a formação de uma massa individualizada composta por centenas de cistos e complexa irrigação sanguínea a partir de um tronco venoso que se origina de órgãos parenquimatosos ou não. As numerosas larvas agregam-se por meio de tecido conjuntivo tipo frouxo, com fibras escassas, frouxamente arranjadas e abundantes células de diferentes tipos. Segundo Ross et al. ( 2008) estes são os principais ítens que caracterizam um tecido conjuntivo frouxo. A matriz extracelular também está composta por material amorfo, viscoso e abundante, ocupando maior volume que as fibras. A complexa rede de vasos sanguíneos ao redor dos cistos provavelmente atua no transporte de oxigênio e nutrientes para o tecido conjuntivo frouxo e os parasitos, e ainda na condução de produtos de excreção/secreção dos parasitos. De acordo com Ross et al. (2008) a substância fundamental dos tecidos conjuntivos frouxos circunda os pequenos vasos sanguíneos e tem papel importante na difusão de oxigênio e nutrientes a partir dos pequenos vasos assim como na difusão de dióxido de carbono e resíduos metabólicos até os vasos. Assim, a partir deste conceito é possível inferir sobre a necessidade dos parasitos de estabelecer a relação com seu hospedeiro, visando à manutenção de sua permanência e sobrevivência em A. ucayalensis. A presença de fibroblastos na massa cística sugere atividade de síntese de colágeno, fibras elásticas e reticulares e os complexos carboidratos da substância fundamental. Além disso, a presença de outros tipos celulares pode caracterizar discretas manifestações de reações inflamatórias e imunes, por migração de células transitórias dos vasos sanguíneos em resposta a estímulos específicos. Estes aspectos são similares aos padrões conceituais de tecido conjuntivo frouxo descritos em vertebrados por Ross et al. (2008). Os vasos sanguíneos de diferentes calibres que irrigam este tecido e os cistos dos parasitos e convergem posteriormente ou ramificam-se a partir de um único vaso de calibre maior sugerem um processo angiogênico induzido pelo parasitismo. O tecido conjuntivo que envolve os vasos maiores fornece a força significativa para resistir ao estiramento e à distensão excessiva do tecido conjuntivo frouxo, 108 provocada pela movimentação das larvas dentro dos cistos o que justifica a presença de abundantes fibras e escassez de células caracterizando o tecido conjuntivo denso. As fibras elásticas e colágenas evidenciados neste tecido são condizentes com os tipos de fibras que compõem os tecidos conjuntivos frouxo e denso descrito por Ross et al. ( 2008), o que reforça mais uma vez a correta caracterização desses tecidos. As fibras elásticas e colágenas permitem que o tecido responda dinamicamente aos movimentos dos parasitos e mesmo a possíveis agregações posteriores de novas larvas infectivas. Os compostos glicídicos evidenciados pela reação do P.A.S. nas regiões do escólex, tegumento, e conteúdo cístico ao redor dos parasitos sugerem que estes parasitos possuem uma alta taxa metabólica, podendo estes compostos atuarem ainda como uma barreira de reconhecimento deste parasito pelo sistema imune do hospedeiro. Coggins et al. (1979) relatou a presença de um componente no órgão apical de larvas Plerocercóides de Proteocephalus ambloplitis positivo para P.A.S., ao contrário do que tinha sido relatado anteriormente por Wood (1965) em órgão apical de Ophiotaenia filaroide, quando submetido à coloração pelo P.A.S. Ainda segundo Coggins et al. (1979) estes achados sugerem diferenças químicas e morfológicas entre órgãos apicais de Cestódeos Proteocephalídeos. Contudo, acreditamos que nas larvas parasitas de A. ucayalensis, podem atuar como reserva energética, além de fonte para manutenção de glicocálice e mesmo para produção de componentes de matriz extracelular e outros produtos de secreção. 4.3.2 Aspectos ultraestruturais Aspectos ultraestruturais mostram íntima associação entre a membrana cística e a membrana das células endoteliais dos vasos sanguíneos dando origem em alguns pontos de junções, o que sugere que estas membranas estão em estreito contato, permitindo e facilitando o transporte de líquidos e eletrólitos. Ross et al. (2008), destacou a importância das junções, fundamentais nos tecidos em que a atividade de células adjacentes devem ser coordenadas pela troca de íons, moléculas reguladoras e pequenos metabólitos. Os compostos glicídicos do conteúdo cístico, como mostrado na histoquímica do P.A.S., podem ser visualizados como uma extensa e espessa área de 109 microfibrilas eletrondensas que recobre o corpo do parasito. Esta espessa estrutura que cria uma interface entre a larva e o tecido conjuntivo do hospedeiro encerra a larva em um cisto individual e pode ser produzida por ambos (cisto e hospedeiro), atuando ainda como um filtro protetor do parasito. A presença de vesículas no espaço entre o parasito e a ―capa‖ cística fibrosa indica grande atividade metabólica na superfície do parasito, através do transporte vesicular. Este aspecto também é bastante evidente abaixo da membrana do tegumento, no córtex do citoplasma sincicial apical. Mais uma vez representando alta atividade metabólica caracterizada por vesículas pinocíticas caveolares. Atividades pinocíticas no tegumento de larvas de cestódeos foram relatadas por Hopkins et al. (1978), Threadgold et al. (1981), Threadgold et al. (1983) e Schramlová et al. (1988). Segundo Schramlová et al. (1988), os cestódeos não possuem sistema digestivo e todos os transportes de substâncias realizados através do tegumento são mediados não apenas pela difusão mas também por microporos presentes na membrana, pelos quais ocorre a endocitose. Estes autores ainda ressaltam que a atividade de pinocitose ocorre apenas no tegumento corpóreo e não no tegumento do escólex de Cisticercus bovinos, sendo notório aproximadamente quatro semanas após a infecção. A finalidade pela qual estes parasitos internalizam vesículas por meio de pinocitose não é bem entendida. Threadgold et al. (1981), acreditam que a pinocitose no tegumento tem caráter nutricional, porém não descartam a possibilidade de outra função das macromoléculas internalizadas. Por outro lado, Beffus (1977), Threadgold et al. (1983) e Schramlová et al. (1988), sugerem que a pinocitose dessas moléculas possui papel importante na degradação de enzimas e anticorpos que aderem na superfície dos parasitos, protegendo os parasitos contra a destruição pelas células imunes do hospedeiro. A degradação de tais substâncias ocorreria nas células tegumentares do citoplasma proximal, pela localização de heterolisossomos nestas células. Porém em alguns casos estas macromoléculas não seriam degradadas, mas sim modificadas e transportadas novamente para o citoplasma distal onde contribuiriam para mascarar o parasito e este sobreviver contra o sistema imune do hospedeiro (Schramlová et al., 1988). Acredita-se que ambas as funções (nutritiva e protetora) podem ocorrer através da internalização vesicular nesses organismos, tal como ocorre no tegumento de Schistosoma. Segundo Hellemond et al. (2006), a superfície do 110 tegumento de schistosoma é a única estrutura de membrana com função dupla de modulação da resposta imune do hospedeiro e sobrevivência parasitária. Este é o primeiro relato de pinocitose no tegumento de larvas de Cestódeos proteocephalídeos. Os parasitos de A.ucayalensis apresentam tegumento sincicial dividido em três partes: citoplasma distal, lâmina basal e citoplasma proximal. Este aparato tegumentar é comum em Cestódeos como observado por Jones et al. (1998); Palm et al. (1998); Levron et al. (2008) e Dey et al. (2009) e em Trematódeos de acordo com Dorsey et al. (2002) & Cavalcanti et al. (2009). A presença de vesículas eletronlúcidas preenchendo toda a estensão do citoplasma distal também foi verificada nos trabalhos de Palm et al. (1998), e Levron et al. (2008); porém elas se mostram muito mais numerosas no presente estudo. Diferente do pressuposto anteriormente, Jones et al. (1998) sugeriram que estas vesículas são produzidas pelo tegumento sincicial dos Cestódeos e transportadas para o citoplasma distal onde realizam a manutenção da superfície do parasito e sintetizam novas estruturas apicais. Ainda segundo estes autores, a natureza do conteúdo dessas vesículas é pouco entendida, mas poderiam estar envolvidas na formação de microtríquias. Microtríquias filamentosas preenchem a superfície externa do citoplasma distal do tegumento desses parasitos. Diferentes tipos de microtríquias podem ser vistas por toda a extensão do corpo de Cestódeos. Microtríquias filamentosas são comumente encontradas na região do escólex, mais precisamente no órgão apical e rostelo, e nas proglotes imaturas do corpo de adultos de Proteocephalus tidswelli de acordo com Thompson et al. (1980). Estas estruturas atuam ampliando a área superficial de digestão e absorção de nutrientes através da agitação do microhabitat adjacente onde estão depositados os nutrientes o que resulta em um movimento passivo dos filamentos e ocorre em simultâneo com a contração e o relaxamento do parasito, de acordo com Thompson et al. (1980) e Jones et al. (1998). Além dessas funções, elas também atuam na ancoragem e na função mecanoreceptora de receptores sensoriais segundo Palm et al. (1998). Nas larvas metacestóides parasitos de A.ucayalensis, a lâmina basal encontra-se dividida em duas regiões distintas. Uma região eletrondensa intimamente ligada ao citoplasma distal e uma região fibrosa que se estende para o citoplasma proximal. Segundo Jones et al. (1998), a lâmina basal é geralmente observada abaixo do citoplasma apical e nunca abaixo das células tegumentares do 111 citoplasma proximal, pois a matriz basal tem a função de manter a polaridade e a integridade estrutural do citoplasma distal. Os dois tipos de processos internunciais observados neste estudo, caracterizados como estreitos e expessos estão intimamente associados à troca de metabólitos entre o parasito e o meio externo onde os processos estreitos carreiam informações do citoplasma proximal para o distal e os processos espessos atuariam no sentido inverso. Os processos internunciais estreitos têm sido relatados como uma extensão citoplasmática progressiva de células tegumentares que culminam no citoplasma distal por Chappell (1980), Coil (1991), Smyth (1994), Roberts et al. (2000) e Dey et al. (2009); carreando informações do citoplasma proximal para o distal de acordo com Dey et al. (2009). Os processos espessos foram descritos pela primeira vez por Dey et al. (2009) que mostrou sua função contrária aos processos finos. Ainda segundo Dey et al. (2009) os processos espessos estariam atuando no transporte vesicular por estes serem mais elaborados e com diâmetro superior a de uma vesícula; ao contrário dos processos estreitos que apresentam diâmetros curtos e não são, portanto suficientemente largos para a passagem de uma vesícula. Maiores estudos de ultraestrutura são necessários para melhor entendimento da relação parasito hospedeiro entre esses metacestódeos e A.ucayalensis. 4.3.3 Aspectos Angiogênicos A formação de granuloma cística, neoformação de tecido conjuntivo com estruturas celulares típicas, e vasos sanguíneos ao redor dos parasitos caracteriza o processo angiogênico à presença de larvas de Cestódeos no peritônio visceral de A. ucayalensis. Esses eventos podem ocorrer de diferentes modos e nas infecções por parasitos das diferentes classes como Cestódeos, Trematódeos e Nematódeos. Tecido granuloso e remodelação tecidual, com proliferação vascular e hiperplasia endotelial, associado ao aumento de colágenos tipos I e III e expressão de Fator de Crescimento Fibroblástico básico foram observados por Alvarez et al. (2002) e Alvarez et al. (2002) em Cisticercose suína e Neurocisticercose humana induzidas por Metacestóides de Taenia solium. A presença de citocinas como Interleucina 10 (IL-10) e Fator de Crescimento Tumoral beta (TGF-β) e ausência das 112 Interleucinas 4 e 13 (IL-4 e IL13), presentes na resposta imune do tipo Th2, em Neurocisticercose humana caracterizaram atividade imunomodulatória nesse tecido. Estes eventos também são observados e bem caracterizados em infecções por S. mansoni (Trematódeo conhecido por desenvolver angiogênese e fibrose hepática em humanos), como mostra os trabalhos desenvolvidos por Lenzi et al. (2002), Sobky et al. (2002), Baptista et al. (2005), Andrade (2009), Andrade et al. (2010), Lemos et al. (2010), Shariati et al. (2011), e Raso et al. (2012). Além disso, estudos de ultraestrutura de células teciduais vêm sendo correlacionados quanto a suas funções no estabelecimento desses processos. Weinberg et al. (1992) observaram intensa atividade angiogênica associada a atividade de plasmócitos no peritônio de ratos infectados por Schistosoma mansoni e segundo estes autores, os plasmócitos estão associados à produção de anticorpos diretamente no peritônio para controle específico deste local e com formação de estruturas particulares para produção em larga escala de outros plasmócitos maturos. Lenzi et al. (2002) atribui a síntese de fibras a fibroblastos presentes em nódulos fibrovasculares causados por S.mansoni. De semelhante modo, processos fibróticos e formação de angiogênese e linfangiogênese são relatados em infecções por Nematódeos como mostra os trabalhos de Attout et al. (2009), Shariati et al. (2010), Gaban et al. (2010) e Lemos et al. (2010). O organismo que melhor desencadeia este quadro é a Capillaria hepática que semelhante a S. mansoni ocasiona quandros fibróticos e angiogênese no fígado. O processo angiogênico verificado em A.ucayalensis é induzido provavelmente, pela secreção/excreção de substâncias angiogênicas pelas larvas Metacestódeos visando garantir a nutrição, desenvolvimento, e sobrevivência nesse hospedeiro. De acordo com Dennis et al. (2011), durante o desenvolvimento tecidual dos parasitos helmintos, ocorrem interações diretas e indiretas entre estes e o sistema vascular do hospedeiro, e os parasitos podem ter a capacidade de iniciar eventos pro-angiogênicos. Tais substâncias angiogênicas podem ser similares a Fatores de Crescimento Vascular e Fibroblasto com ação direta na formação de vasos sanguíneos como verificado em Ceanorabditis elegans (Tarsiano et al., 2006) e Equinococcus multilocularis (Stadelman et al., 2010) ou podem ter ação secundária na indução da angiogênese de acordo com Higazi et al. (2003), Kanse et al. (2005), Maity et al., 113 (2007), Kreider et al. (2007), Gottstein et al., (2008), Shariati et al., (2010) entre outros. Contudo estudos de expressão gênica e de Proteômica desses parasitos se fazem necessários para elucidar as moléculas e os genes envolvidos na formação de vasos sanguíneos e proliferação celular em A. ucayalensis. 4.4 ASPECTOS BIOLÓGICOS 4.4.1 Prospecção Parcial do Ciclo Biológico Com base em todas as técnicas empregadas bem como os resultados obtidos das mesmas e, na observação da interação entre esses parasitos com o hospedeiro Ageneiosus ucayalensis, postulamos três hipóteses referentes ao papel desse hospedeiro no ciclo de vida e na biologia desses parasitos conforme o diagrama a seguir. Figura 44: Diagrama ilustrativa de possíveis formas de atuação de Ageneiosus ucayalensis, no ciclo biológico de Metacestódeos Proteocephalídeos de Belém –PA. 114 Na primeira hipótese, Ageneiosus ucayalensis atua como hospedeiro paratênico para as larvas Plerocercóides (Morfotipo I). Neste caso o hospedeiro se infecta pela ingestão da forma larval Plerocercóide. Estas larvas são conduzidas para o intestino onde atravessam a parede e se encistam na cavidade celomática de A. ucayalensis, estabelecendo deste modo a infecção. Estas larvas permanecem em quiescência até que este hospedeiro sofre predação por peixes maiores onde estas larvas conseguem se desenvolver para formas adultas. Na segunda hipótese, Ageneiosus ucayalensis possivelmente está atuando como hospedeiro intermediário das formas larvares dos Morfotipos II e III. O hospedeiro se infecta ingerindo as formas larvares Plerocercóides que sofrem mudas no trajeto pelo trato gastrointestinal transformando em larvas Merocercóides que atravessam a parede intestinal e se instalam na cavidade celomática de A. ucayalensis. Neste local estas larvas então aguardam o momento em que o hospedeiro intermediário será ingerido pelo hospedeiro definitivo onde poderão se desenvolver em formas adultas. Na terceira hipótese, Ageneiosus ucayalensis seria um hospedeiro paratênico para as formas larvares dos Morfotipos II e III, onde este se infecta pela ingestão das formas larvares Merocercóides. No intestino estas larvas atravessam a parede intestinal e se instalam na cavidade celomática de A. ucayalensis, onde permanecerão aguardando a ingestão pelo hospedeiro adequado para, posteriormente, se desenvolverem em formas adultas. Das três hipóteses apenas a primeira parece estar completamente elucidada, uma vez que as larvas não crescem neste local, permanecendo na primeira fase larval do ciclo biológico desses parasitos e a invaginação do escólex está associado provavelmente ao desconforto da larva frente às condições fisicoquímicas a ela oferecidas, e que são diferentes da sua exigência para o desenvolvimento em fase adulta. A segunda e a terceira hipótese só seriam completamente elucidadas se soubéssemos a fase larvar da forma ingerida, o que seria possível através de infecção experimental. Quaisquer das três hipóteses só serão confirmadas a partir da observação e identificação das fases adultas que podem ser encontradas em possíveis predadores de A.ucayalensis ou no estabelecimento de protocolos de infecção experimental. 115 4.4.2 Ecologia do parasitismo As diversas formas larvares deste estudo coabitam um mesmo nicho dentro do hospedeiro Ageneiosus ucayalensis, onde provavelmente compartilham dos mesmos nutrientes necessários á sua sobrevivência tendo em vista que exploram de maneira semelhante a mesma classe de recursos nutritivos. Do ponto de vista ecológico, duas espécies coexistem em um ambiente de forma estável, se houver uma diferenciação de seus nichos, isto é, um espectro limitado de condições e recursos que permitem a permanência de uma espécie, mesmo na presença de competidores e predadores. Caso contrário, uma das espécies eliminará ou excluirá a outra (Peroni et al., 2011). No entanto o que nós observamos é que os três Morfotipos larvares (I, II e III) estão em um mesmo nicho; a bolsa cística rica e complexamente vascularizada. A difusão de nutrientes proporcionada pela arquitetura tecidual e vascular desta bolsa não permite a compartimentalização de nicho e ou aporte de nutrientes, promovendo a ampla distribuição de nutrientes. Os diferentes morfotipos apresentam diferenças significativas de tamanho corpóreo. Segundo Peroni et al. (2011), a competição entre espécies coexistentes em um mesmo ambiente é resultado da diferenciação dos nichos e ambos são evidenciados por padrões morfológicos em que, animais que competem fortemente tendem a exibir diferenças regulares em tamanho do corpo. Como verificado anteriormente, não há diferenciação de nicho e logo não há competição entre as espécies. Deste modo, os diferentes tamanhos dos três Morfotipos larvares podem estar relacionados a características genéticas implícitas à espécie de origem de cada larva. Além disso, observamos que o Morfotipo I é mais abundante que os Morfotipos II e III, sendo o Morfotipo III o menos frequente de todos. Isto pode estar relacionado ao facto das espécies I, II e III ocorrerem com diferentes índices de frequência na natureza. Com base nestas observações, nós acreditamos que o que pode estar acontecendo é a união das larvas I, II e III, promovendo a modulação conjunta do hospedeiro e consequentemente remodelação tecidual em prol da nutrição e manutenção de todos. Em um processo inicial, poucas larvas vão sendo adquiridas pelo peixe e vão invadindo a cavidade, localizando-se dispersamente. Provavelmente produtos de excreção/secreção (E/S) promoveriam inicialmente a 116 aglomeração das larvas I e II e com a proximidade e aumento do número, estas podem entrar num segundo momento de síntese e sinalização de produtos de E/S que induzem a neoformação de vasos e tecido conjuntivo, tornando-se perceptíveis ao hospedeiro que os encerra em uma bolsa cística. Nas infecções sucessivas proporcionadas pela alimentação do peixe, as larvas que chegarem posteriormente ao processo de angiogênese migrariam por quimiotaxia ao sítio formado anteriormente pelas larvas e somariam ao grupo, inclusive na sincronização da síntese de produtos de E/S fazendo o aumento da bolsa cística e a manutenção da neoformação tecidual e de vasos. Considerando que as larvas dos Morfotipos I e II são mais numerosas que as larvas do Morfotipo III, esta última pode ser oportunista e se associar à estrutura induzida pelas larvas dos Morfotipos I e II e com isto garantir a sobrevivência ou compartilhar da capacidade de produzir esses produtos de E/S, porém por ocorrer em menor número, necessita desta associação das espécies I e II para ocorrer e sobreviver. 117 5 CONCLUSÕES a) As formas larvares de Cestódeos observadas neste estudo parasitando Ageneiosus ucayalensis pertencem à Família Proteocephalidae e foram agrupadas em três morfotipos diferentes com grande probabilidade de pertencerem a três gêneros e espécies distintas. Essas espécies podem estar em fases diferentes do ciclo de vida, estando o primeiro Morfotipo na fase Plerocercóide e o segundo e terceiro Morfotipos na fase Merocercóide. b) A presença dessas larvas na cavidade celomática de Ageneiosus ucayalensis estimula a proliferação celular resultando em um tecido conjuntivo, rico em fibras e células, altamente irrigado que envolve as larvas, conferindo-lhes a sustentação, proteção e alimentação e, atuam no transporte de oxigênio e nutrientes aos parasitos, e na condução da excreção de produtos metabólicos dos parasitos através dos vasos sanguíneos. c) A membrana cística e a membrana do endotélio dos vasos sanguíneos estabelecem contato íntimo através de junções evidenciando a troca de metabólitos entre esses compartimentos. d) Os parasitos absorvem os metabólitos do compartimento cístico por meio das microtríquias presentes na superfície corporal e através de transporte vesicular do tipo pinocitose. e) Ageneiosus ucayalensis pode ter participação tanto como hospedeiro paratênico quanto hospedeiro intermediário para o ciclo de vida desses parasitos, em virtude das formas larvares se encontrarem em fases diferentes. f) As diversas formas larvares deste estudo coabitam em um mesmo nicho dentro do hospedeiro Ageneiosus ucayalensis, compartilhando nutrientes necessários à sua sobrevivência, sem a necessidade de eliminação de uma dessas formas. 118 PRESPECTIVAS DE ESTUDOS FUTUROS 1. Identificação de formas adultas dos três Morfotipos larvares por infecção experimental. 2. Utilização da técnica de Reação em cadeia da Polimerase em Tempo Real (RT-PCR) para identificação da expressão de genes de Fator de Crescimento de Fibroblastos e Fator de Crescimento Endothelial Vascular, nos parasitos e em tecidos vizinhos. 3. Estudos de Biologia Molecular com outros genes além do gene 18S para separação mais específica entre as formas larvares. 4. Estudos de Proteômica das três formas larvares para caracterização de substâncias angiogênicas e supressoras de sistema imume. 5. Estudos de influência de extratos somáticos das larvas em meio de cultivo cellular para verificação de inibição de macrófagos, ativação de fibroblastos e ativação de células endoteliais. 119 REFERÊNCIAS AGUSTI, C., AZNAR, F.J., OLSON, P.D., LITTLEWOOD, D.T.J., KOSTADINOVA, A., RAGA, J.A. 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