estudo morfológico e detecção de clones, através de marcadores

ESTUDO MORFOLÓGICO E DETECÇÃO DE CLONES, ATRAVÉS DE MARCADORES
MOLECULARES ISSR, EM POPULAÇÕES DA PLANTA AQUÁTICA Pistia stratiotes L. NO
NORTE DO ESTADO DO PIAUÍ
Jaiany Oliveira Silva (bolsista do PIBIC/UFPI), Ivanilza Moreira de Andrade (Orientadora, Depto.
de Ciências Biológicas – UFPI/CMRV)
Pistia stratiotes L., conhecida popularmente como alface-d´água, é uma macrófita aquática
flutuante da família Araceae, com propagação vegetativa vigorosa em ambientes aquaticos
eutrofizados. Objetivou-se com este estudo avaliar o polimorfismo apresentado por marcadores ISSR
em populações naturais de Pistia stratiotes. Foram amostrados 25 indivíduos de duas populações
provenientes de estado do Piauí (Barragem do Itararé, Luzilândia e Lagoa do Bebedouro, Parnaíba) e
uma do Ceará (Lagoa do Porangabussu, Fortaleza), no total de 75 indivíduos, e 25 clones de quatro
indivíduos, totalizando 100 clones. Foram utilizados oito primers de ISSR (UBC 807, UBC 811, UBC
813, UBC 814, UBC 847, UBC 853, UBC MAO e UBC TERRY). Os oito iniciadores ISSR
permitiram a obtenção de 1.156 (58,3%) e 1.331 (37,1%) fragmentos polimórficos nas três populações
e nos clones, respectivamente. Dentre os oito marcadores moleculares o UBC 814 destacou-se com
100% de polimorfismo. Foi observado que a população de LU obteve o maior número de fragmentos
polimórficos, 510 marcas, o que confere 74,4% de polimorfismo. Já a população de FO apresentou
uma menor frequência polimórfica, 45%, em 307 de 682 fragmentos. A população de LUZ, em todas
as análises, mostrou mais diversidade genética. Estes resultados podem estar associados a pouca
interferência antropológica que há nesta população. A população de FOR apresentou baixos resultados
de diversidade genética em relação as populações de PHB e LUZ, o que pode ser devido a distância
geográfica de Fortaleza para as populações do Piauí. Com relação aos clones obtidos dos indivíduos da
população de PHB, parece haver, pelo menos, três genótipos. Estes resultados merecem estudos mais
aprofundados para verificar as diversidades apresentadas entre os agrupamentos. O baixo
polimorfismo pode ser associado a alta capacidade de se propagar vegetativamente, permitindo a
produção de numerosos clones em um curto espaço de tempo.
Palavras-chave: Alface-d´água, Marcador molecular, Polimorfismo.
INTRODUÇÃO
Pistia stratiotes L. é a única espécie de seu gênero, pertencente à família Araceae Juss (Pistia
in Flora do Brasil 2020 em construção.). É uma erva aquática flutuante, amplamente distribuída por
todo o mundo, cuja origem ainda não foi totalmente definida, sendo atribuída a África ou América do
Sul (LORENZI, 2000; CARDOSO et al, 2005). Devido à beleza do rearranjo de suas folhas, em forma
de roseta, elas são utilizadas para fins ornamentais, embora possa causar grandes prejuízos quando o
meio é favorável para sua propagação vegetativa. Devido ao rápido crescimento, a alface d’água
geralmente é responsável pela formação de densos tapetes de plantas sobre a superfície aquática
(COELHO et al., 2009). A multiplicação vegetativa vigorosa de P. stratiotes, naturalmente leva à
suposição de que as populações observadas no habitat são provavelmente clones. No entanto, flores
desta planta em abundância produzem numerosas sementes férteis e por isso parece possível que em
uma determinada área onde ocorrem, vários clones distintos podem estar presentes.
Marcadores moleculares são ferramentas eficazes no estudo dos genomas, pois detectam
polimorfismos diretamente no DNA, não sofrem influência ambiental e são independentes do estádio
de desenvolvimento da planta (FERREIRA; GRATTAPAGLIA 2008). O marcador molecular ISSR
tem se mostrado uma poderosa ferramenta para análise da diversidade genética (CHARTERS,
WILKINSON, 2000; ISSHIKI et al., 2008). O ISSR é uma técnica de baixo custo, de fácil uso e de
grande reprodutibilidade (MATTHEWS et al. 1999).
Tendo em vista a escassez de estudo molecular em população clonal de Araceae, e a
importância de Pistia stratiotes como fitorremediadora, objetivou-se com estudo verificar a
diversidade genética em populações e indivíduos clonais de Pistia stratiotes utilizando marcadores
moleculares ISSR (Inter Simple Sequence Repeats).
METODOLOGIA
Foram utilizados 25 indivíduos de três populações de P. stratiotes (Fortaleza-CE, LuzilândiaPI e Parnaíba-PI) e 25 clones de quadro indivíduos da população de Parnaíba-PI, totalizando 100
clones. Posteriormente foi feita a extração do material genômico das folhas jovens em CTAB 2%
utilizando o protocolo de Doyle e Doyle (1987) com modificações. Para a amplificação das amostras
foi realizada uma seleção de dezesseis iniciadores ISSR e destes foram selecionados os oito melhores
(UBC 807, UBC 811, UBC 813, UBC 814, UBC 847, UBC 853, UBC MAO, UBC TERRY). Os géis
resultantes foram fotografados e posteriormente foi feita uma matriz binária de ausência de presença
de fragmentos. Foi realizada análise UPGMA com o coeficiente de Jaccard e fenograma, e Análise de
coordenadas principais (PCoA) utilizando o programa PAST 2.17.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os oito iniciadores ISSR permitiram a obtenção de 1156 (58,3%) e 1331 (37,1%) fragmentos
polimórficos nas três populações e nos clones, respectivamente. Dentre esses marcadores, o UBC 814
destacou-se com 100% de polimorfismo. Foi observado que a população de LUZ obteve o maior
número de fragmentos polimórficos, 510 marcas, o que confere 74,4% de polimorfismo. Já a
população de FOR apresentou menor frequência polimórfica, 45%, em 307 de 682 fragmentos. A
partir da população de Parnaíba foi realizado o estudo intrapopulacional utilizando 100 indivíduos
divididos em quatro agrupamentos de 25, obtendo-se um total de 3581 marcas das quais 1331 (37,1%)
foram polimórficas. O número total de fragmentos variou de 356 (UBC 807) a 562 (UBC 853).
Mesmo tendo o menor total de fragmentos, o primer UBC 807 obteve o maior número de fragmentos
polimórficos entre os primers utilizados, ao todo foram 206 (57,8%) marcas polimórficas. O estudo
intrapopulacional também apresentou um maior número de fragmentos únicos (21) e estáveis (38).
O fenograma obtidos pelo método de agrupamento UPGMA, utilizando coeficiente de
similaridade de Jaccard para as populações, revelaram que PHB e LUZ mostraram-se mais similares
entre si do que a população de FOR (Figura 1).
A diversidade genética das três populações evidenciou Heterozigosidade esperada (He) e
índice de Shannon (I) de 0,091 e 0,139, respectivamente. As taxas do índice de Shannon de 0 a 1,
quanto mais próximo de 0, serão mais baixas as diversidades genéticas (ROCHA, 2013). Essa baixa
diversidade genética provavelmente está associada a alta propagada vegetativa da alface d’água. A
população de LUZ obteve a maior diversidade, enquanto a de FOR deteve a menor diversidade entre
as três populações. A maior diversidade em LUZ deve estar associada a pouca intervenção
antropológica no local. A população de LUZ obteve a maior diversidade (41,67%), enquanto a de FOR
deteve a menor diversidade (20,83%) entre as três populações. A maior distância observada foi de
0,696 entre as populações de FOR e PHB e menor foi entre LUZ e PHB com 0,427.
Figura 9: Árvore de análise UPGMA, utilizando Jaccard com as três populações de Pistia stratiotes L.
gerada pelo Programa Past. Fort: Fortaleza, Luz: Luzilândia e Phb: Parnaíba.
Na PCoA das três populações, usando PC1 e PC2 as populações mostram-se separadas,
formando três agrupamentos. Entretanto, a população de FOR mostra-se mais isolada. Além disso, na
população de LUZ existe um maior afastamento entre seus indivíduos do que nas outras duas
populações. No PC2 e PC3, a população de LUZ está separada das populações de FOR e PHB, que
formam um único agrupamento. Os clones mostraram se geneticamente próximos, embora a
população D, constituída por clones de indivíduo mais distantes dos indivíduos que deram origem as
populações A, B e C, apresentou-se mais diversa. Os resultados das análises de PCoA evidenciaram
pelo menos três genótipos.
CONCLUSÃO
A população de LUZ, em todas as análises, mostrou maior diversidade genética. Estes
resultados podem estar associados a pouca interferência antropológica que há nesta população. A
população de FOR apresentou baixos resultados de diversidade genética em relação as populações de
PHB e LUZ, o que pode está associado a distância geográfica de Fortaleza para as populações do
Piauí. Com relação aos clones obtidos dos indivíduos da população de PHB, parece haver, pelo menos,
três genótipos. Estes resultados merecem estudos mais aprofundados para verificar as diversidades
apresentadas entre os agrupamentos.
APOIO: (EDITAL Nº. 001/2014 – Edital MAC-Doubles Fernandes do Nascimento de apoio à
ciência, tecnologia e inovação).
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS:
Araceae in Flora do Brasil 2020 em construção. Jardim Botânico do Rio de Janeiro. Disponível em:
<http://floradobrasil.jbrj.gov.br/reflora/floradobrasil/FB51>. Acesso em: 28 Ago. 2016.
CARDOSO, L. R; MARTINS, D; MORI, E. S; TERRA, M. A. Variabilidade genética entre
populações de Pistia stratiotes. Planta Daninha, Viçosa, MG, v. 23, 2005. p. 181-185.
CHARTERS. Y. M; WILKINSON, M. J. The use of self-pollinated progenies as “in-groups” for the
genetic characterization of cocoa germplasm. Theoretical and Applied Genetics, v.100, 2000.
p.160-166.
COELHO, M. A. N.; WAECHTER, J. L.; MAYO, S. J. Rodriguésia, 2009, 60, 799.
DOYLE, J. J; DOYLE, J. L. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus. v. 12, 1987. p.13-15.
FERREIRA, M.E.; GRATTAPAGLIA, D. Introdução ao uso de marcadores moleculares em
análise genética. 3.ed. Brasília: Embrapa Cenargen, 2008. 220p.
ISSHIKI, S.; IWATA, N; KHAN, M. R. ISSR variations in eggplant (Solanum melongena L.) and
related Solanum species. Scientia Horticulturae, v.117, 2008. p.186-190.
LORENZI, H. (ed.) Plantas daninhas do Brasil: terrestres, aquáticas, parasitas e tóxicas. Plantarum.
São Paulo. 2000.
MARQUES, J. M.et al. Estudo de variabilidade genética entre indivíduos de populações de Heliconia
bihai e Heliconia rostrata. Brasília-DF: Embrapa: Recursos Genéticos e Biotecnologia. 2004. 15p.
MATTHEWS, D.; MCNICOLL, J.; HARDING, K.; MILLAM, S. 5’-anchored simple-sequence repeat
primers are useful for analysing potato somatic hybrids. Plant Cell Reports, v.19, 1999. p. 210-212.
ROCHA, J.A. Caracterização molecular e avaliação antibacteriana dos alcaloides pilosina,
epiisopilosina, macaubina e isopilosina de jaborandi (Pilocarpus microphyllus Stapf ex
Wardlew). 2012. 103 p. Dissertação (Mestrado em Biotecnologia) – Programa de Pós-Graduação em
Biotecnologia, Universidade Federal do Piauí, Parnaíba.
Pistia in Flora do Brasil 2020 em construção. Jardim Botânico do Rio de Janeiro. Disponível em:
<http://floradobrasil.jbrj.gov.br/reflora/floradobrasil/FB5069>. Acesso em: 02 Set. 2016
SOUZA, G. A. et al. Diversidade genética estimada com marcadores ISSR em populações brasileiras
de Zabrotes subfaciatus. Pesquisa Agropecuária Brasileira, v. 43, n. 7, p. 843-849. 2008.