Investigação Epidemiológica da Infecção pelo - PPGBAIP

UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ
INSTITUTO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO
BIOLOGIA DE AGENTES INFECCIOSOS E PARASITÁRIOS
INVESTIGAÇÃO EPIDEMIOLÓGICA DA INFECÇÃO PELO HPV E CORRELAÇÕES
CITOPATOLÓGICAS EM AMOSTRAS CERVICAIS DE MULHERES ATENDIDAS
NO CENTRO DE REFERÊNCIA INTEGRADO À SAÚDE DA MULHER, EM
MARABÁ, PARÁ
MARINEIDE SOUSA BASTOS
Belém - Pará
2014
MARINEIDE SOUSA BASTOS
INVESTIGAÇÃO EPIDEMIOLÓGICA DA INFECÇÃO PELO HPV E CORRELAÇÕES
CITOPATOLÓGICAS EM AMOSTRAS CERCVICAIS DE MULHERES ATENDIDAS
NO CENTRO DE REFERÊNCIA INTEGRADO À SAÚDE DA MULHER, EM
MARABÁ, PARÁ
Dissertação de mestrado apresentada à banca
examinadora do Programa de pós Graduação em
Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários da
Universidade Federal do Pará, como requisito
para obtenção do grau de mestre em Biologia de
Agentes Infecciosos e Parasitários.
Orientador: Prof. Dr. Juarez Antonio Simões
Quaresma
Belém-Pará
2014
UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARÁ
INSTITUTO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO
BIOLOGIA DE AGENTES INFECCIOSOS E PARASITÁRIOS
MARINEIDE SOUSA BASTOS
INVESTIGAÇÃO EPIDEMIOLÓGICA DA INFECÇÃO PELO HPV E CORRELAÇÕES
CITOPATOLÓGICAS EM AMOSTRAS CERVICAIS DE MULHERES ATENDIDAS
NO CENTRO DE REFERÊNCIA INTEGRADO À SAÚDE DA MULHER, EM
MARABÁ, PARÁ
Dissertação de mestrado apresentada para obtenção do título de Mestre em Agentes
Infecciosos e Parasitários.
Aprovada em:
Conceito:
Banca Examinadora:
_________________________________________________
Prof. Dr. Juarez Antônio Simões Quaresma - Orientador
Centro de Ciências Biológicas e da Saúde-CCBS/UEPA
_________________________________________________
Prof.ª Dra. Antônia Margareth Moita Sá – Membro Titular
Centro de Ciências Biológicas e da Saúde-CCBS/UEPA
______________________________________________
Prof.ª Dra. Tinara Leila de Sousa Aarão – Membro Titular
Centro de Ciências Biológicas e da Saúde-CCBS/UEPA
_________________________________________________
Prof.ª Dra. Denise da Silva Pinto – Membro Titular
Instituo de Ciências da Saúde- ICS/UEPA
_______________________________________________
Prof.ª Dra. Ana Cecília Ribeiro Rodrigues Cruz- Membro Suplente
Instituto de Ciências da Saúde IEC/PA
“Talvez não tenha conseguido fazer o
melhor, mas lutei para que o melhor
fosse feito. Não sou o que deveria ser,
mas Graças a Deus, não sou o que
era antes”. (Marthin Luther King)
DEDICATÓRIA
Ao meu Deus que todos os dias, me abençoa, guia meus passos e opera maravilhas
em minha vida.
Às minhas queridas irmãs Luzia e Liane Gaby, pelos momentos de compreensão e
descontração durante os períodos mais críticos desta jornada.
Às minhas filhas Rafaela e Ana Carolina pelas palavras diárias de incentivo.
Ao meu querido e incrível companheiro Manoel Almeida, pai das minhas maravilhosas
filhas, dedico todo este trabalho. Obrigado pelos momentos de compreensão, carinho
e envolvimento desde a concepção do projeto até a finalização do mesmo, pois suas
contribuições e intervenções em Marabá verdadeiramente contribuíram para o
alcance desta meta.
AGRADECIMENTOS
Ao Programa de Pós Graduação em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários
da UFPA pela oportunidade a mim concedida para alcançar este ideal.
Ao Professor Doutor Juarez Antônio Simões Quaresma, meu orientador, que mesmo
sem me conhecer me confiou este projeto e me guiou ao incrível mundo da pesquisa
científica e pacientemente me compreendeu nos meus difíceis momentos. Muito
obrigado!
À Secretaria Municipal de Saúde de Marabá, Pará, na pessoa do Dr. Nagib Mutran
que de imediato deu a anuência para a realização deste projeto em seu município,
disponibilizando parceria para a etapa da citologia.
À Professora Doutora Hellen Thais Fuzii que me acolheu no Laboratório de
Imunopatologia do NMT/UFPA e não mediu esforços para o sucesso da etapa dos
testes moleculares sem os quais não seria possível a concretização deste projeto.
À equipe do CRISMU nas pessoas da Citologista Maria Augusta Lacerda e demais
profissionais da enfermagem, Ana Claudia, Neci, Valdiza, Zeudina e Rosilena que
profissionalmente contribuíram para as coletas cervicais, recebendo de forma
carinhosa as mulheres participantes desta pesquisa.
À Fundação HEMOPA, em especial às equipes da unidade de Marabá e do Setor de
Sorologia do HEMOPA Belém que compreenderam a importância da pesquisa e
colaboraram para a logística do armazenamento e transporte das amostras até o
NMT/UFPA.
Às colegas de trabalho e profissão, Márcia Basílio, Renata Hermes, Carmen Cordero
e Rita Xavier que acreditaram em mim e me incentivaram a realizar este mestrado.
Ao admirável Professor Doutor Evonildo Costa que brilhantemente me ensinou
Biologia Molecular e me estimulou a estudar cada vez mais sobre o tema.
Às minhas colegas de curso de mestrado Edna e Cristiane pela amizade, conselhos,
discussões científicas e momentos de descontração.
Aos acadêmicos jovens talentos que harmoniosamente frequentam o Laboratório de
Imunopatologia do NMT e com avidez e responsabilidade conduziram os testes
moleculares desta pesquisa.
Aos secretários do BAIP, Hosana e Mirna, pela atenção e assistência prestadas a
mim. À bibliotecária Célia Ribeiro e ao estatístico Alex Santos, obrigado pela
disponibilidade.
A todas as mulheres participantes desta pesquisa, admiráveis guerreiras que
silenciosamente contribuíram para o avanço dos conhecimentos sobre a
epidemiologia da infecção pelo HPV na Região Norte.
RESUMO
A infecção pelo Papillomavírus humano (HPV) apresenta ampla distribuição mundial
encontrando-se entre as mais frequentes doenças sexualmente transmissíveis (DST)
no mundo com pico de incidência na população feminina jovem, sexualmente. Os
HPVs de alto risco estão comprovadamente envolvidos na gênese de tumores
diversos e são detectados em 92,9 a 99,7% dos casos de carcinoma cervical.
Estimam-se para o Brasil, 15.590 novos casos de câncer do colo do útero onde a
Região Norte destaca-se em primeiro lugar para este câncer. Alguns fatores como
precocidade sexual, multiplicidade de parceiros, tabagismo e imunossupressão em
coinfecções com outras DST estão reconhecidamente associados à infecção pelo
HPV. As técnicas da biologia molecular são extremamente eficazes na detecção do
HPV, entretanto encontra-se alta frequência de DNA do HPV em mulheres com
citologia cervical sem atipias celulares. Objetivos: Este estudo, do tipo transversal
analítico descritivo, analisou a prevalência da infecção genital pelo HPV, através das
técnicas da PCR e citopatologia, em amostras cervicais de mulheres rastreadas para
o câncer cervical em uma unidade de saúde pública na cidade de Marabá, Pará,
coletadas num período de cinco meses, no ano de 2014. Investigou as possíveis
associações entre a infecção e fatores sóciodemográficos, comportamentais, sexuais
e reprodutivos; pretendeu ainda reforçar o conhecimento sobre os genótipos de HPV
circulantes na população do estudo. Metodologia: Foram analisadas 191 amostras
elegíveis para o estudo. A todas as participantes, após a assinatura de um TCLE, foi
aplicado um questionário clínico-epidemiológico e colhidas amostras cervicais
destinadas a citopatologia, extração de DNA e PCR para detecção do DNA do HPV.
As participantes foram agrupadas em: mulheres com história de antecedentes de
infecção pelo HPV, mulheres com citologia atual com atipias celulares, mulheres com
DNA HPV (+). Para estes grupos foram investigados os fatores de risco associados à
aquisição da infecção pelo HPV e ao desenvolvimento do câncer cervical.
Resultados: Encontrou-se uma prevalência de 4,7% para a infecção pelo HPV pela
técnica da PCR, com predomínio em mulheres entre 18 e 29 anos (55,6%) seguido
da faixa de 30 a 39 (44,4%); pela citopatologia encontrou-se prevalência de 5,8%
distribuída entre ASC-US com 66,6%, LSIL com 44,4% e ASC-H com 11,1%. A
distribuição dos tipos de HPV foi de: HPV 6, 31, 35 e 58 em 33,3% das amostras DNA
HPV (+) sendo 22,2% com infecção mista. Conclusões: A prevalência da infecção
pelo HPV (4,7%) apresentou-se abaixo de outros estudos dessa natureza, entretanto
foi fortemente influenciada pela alta frequência de mulheres previamente tratadas para
a infecção. A infecção pelo HPV apresentou associação significante para a faixa etária
entre 18 e 29 anos. A estabilidade conjugal apresentou-se tendenciosa para a
aquisição desta infecção fator que remete a ações públicas de intervenção para esse
grupo. Encontrou-se uma fraca associação entre a citologia e a PCR. Não foram
detectados os HPV 16 e 18 nas amostras examinadas sugerindo a necessidade de
realizar novos estudos abrangendo outros serviços de saúde neste município para um
melhor detalhamento dos genótipos circulantes.
Palavras chave: HPV, câncer cervical, epidemiologia, citopatologia, PCR.
ABSTRACT
Infection with human papillomavirus (HPV) has worldwide distribution and are among
the most common sexually transmitted diseases (STD) in the world with a peak
incidence in young females, sexually. The high-risk HPV are demonstrably involved in
the genesis of many tumors and are detected in 92.9 to 99.7% of cases of cervical
carcinoma. Are estimated for Brazil, 15,590 new cases of cervical cancer where the
North stands out first for this cancer. Some factors such a sexual precocity, multiple
partners, smoking and immunosuppression in co-infections with other STDs are known
to be associated with HPV infection. The molecular biology techniques are extremely
effective in detection of HPV, though there is high frequency of HPV DNA in women
with cervical cytology without atypical cells. Objectives: This study, descriptive
analytical cross-sectional examined the prevalence of genital HPV infection, through
the techniques of PCR and cytology in cervical samples of women screened for
cervical cancer in a public health unit in the city of Maraba, Para, collected a period of
five months in 2014. Investigated the possible association between infection and
sociodemographic factors, behavioral, sexual and reproductive rights; also sought to
enhance knowledge on circulating HPV genotypes in the study population.
Methodology: We analyzed 191 samples eligible for the study. To all the participants
after the signing of an TCLE, we applied a clinical and epidemiological questionnaire
and collected cervical samples for cytology, DNA extraction and PCR for detection of
HPV DNA. Participants were grouped in women with a history of infection with HPV
history, women with current cytology with atypical cells, women with HPV DNA (+). For
these groups, we investigated the risk factors associated with the acquisition of HPV
infection and the development of cervical cancer. Results: We found a prevalence of
4.7% for HPV infection by the PCR technique, predominantly in women between 18
and 29 years (55.6%) followed by the range 30-39 (44.4%); by cytopathology found a
prevalence of 5.8% distributed between ASC-US with 66.6%, 44.4% with LSIL and
ASC-H with 11.1%. The distribution of HPV types was: HPV 6, 31, 35 and 58 in 33.3%
of the HPV DNA samples (+), 22.2% with a mixed infection. Conclusions: The
prevalence of HPV infection (4.7%) is presented below other studies of this nature,
however was strongly influenced by the high frequency of women previously treated
for the infection. HPV infection was significantly associated to the age group between
18 and 29 years. Marital stability was presented biased to an individual's infection
factor that refers to public actions of intervention for this group. We found a weak
association between cytology and PCR. The HPV 16 and 18 in the examined samples
were not detected suggesting the need for further studies covering other health
services in this city for a more detailed circulating genotypes.
Keywords: HPV, cervical cancer, epidemiology, cytopathology, PCR.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Representação do capsídeo viral do HPV. ................................................ 16
Figura 2: Estrutura gênica do HPV. Representação das três regiões do genoma:
Região inicial Early (E), Região tardia Late (L) e Região de controle longa (LCR). .. 17
Figura 3: Alterações citomorfológicas do tipo coilocitose (A) e disceratose (B)
associadas à infecção pelo HPV, em esfregaços cervicais corados pela técnica de
Papanicolaou............................................................................................................. 21
Figura 4: Demonstração das formas de interação do DNA viral na célula hospedeira.
.................................................................................................................................. 25
Figura 5: Esquema mostrando a expressão de proteínas do HPV em epitélio
estratificado até a liberação de virions. ..................................................................... 26
Figura 6 - Prevalência da infecção pelo HPV* estimada em metanálise de 78 estudos
envolvendo mulheres com citologia normal nos diferentes continentes.....................29
Figura 7: Prevalência da infecção pelo HPV em mulheres com citologia normal, de
acordo com a idade....................................................................................................30
Figura 8: Prevalência dos tipos de HPV de alto risco entre mulheres com citologia
normal. Demonstração dos cinco genótipos de HPV mais frequentes no mundo. .... 30
Figura 9: Sequencia temporal de eventos na história natural do câncer cervical. .... 32
Figura 10: Representação da taxa bruta de incidência por 100 mil mulheres para
novos casos de câncer do colo do útero, estimada para o estado do Pará, para o ano
de 2014. .................................................................................................................... 47
Figura 11: Distribuição de citologias anteriores alteradas e procedimento médicos
sugerindo história antecedente de infecção pelo HPV (n=40), registrados em
comparecimentos anteriores em mulheres rastreadas para o câncer cervical no
CRISMU, no período de Janeiro a Maio de 2014, na cidade de Marabá-PA. ........... 62
Figura 12: Distribuição da classificação citomorfológica para os esfregaços cervicais
com atipias celulares (n=11) em mulheres rastreadas para o câncer cervical no
CRISMU, no período de Janeiro a Maio de 2014, na cidade de Marabá-PA ............ 63
Figura 13: Distribuição quanto à história de antecedentes de infecção pelo HPV e
persistência da infecção confirmada pelo PCR-DNA HPV (+) (2/40) em mulheres
rastreadas para o câncer cervical no CRISMU, no período de Janeiro a Maio de 2014,
na cidade de Marabá-PA. .......................................................................................... 69
Figura 14: Distribuição da classificação citomorfológica para os esfregaços cervicais
com atipias celulares (n=11) em mulheres rastreadas para o câncer cervical no
CRISMU, no período de Janeiro a Maio de 2014, na cidade de Marabá-PA ............ 70
Quadro 1: Funções das proteínas expressas pelos genes do HPV ......................... 18
Quadro 2: Orientações para laudos citopatológicos cervicais em amostras adequadas
para análise citológica ............................................................................................... 40
LISTA DE TABELAS
Tabela 1- Distribuição das variáveis sóciodemográficas em mulheres (n=191)
rastreadas para o câncer cervical no CRISMU, no período de Janeiro a Maio de 2014,
na cidade de Marabá-PA............................................................................................59
Tabela 2 - Distribuição das variáveis comportamentais em mulheres (n=191)
rastreadas para o câncer cervical no CRISMU, no período de Janeiro a Maio de 2014,
na cidade de Marabá-PA............................................................................................61
Tabela 3 - Distribuição das variáveis epidemiológicas quanto à citopatologia com
atipias celulares (n=11) em mulheres rastreadas para o câncer cervical no CRISMU,
no período de Janeiro a Maio de 2014, na cidade de MarabáPA...............................................................................................................................65
Tabela 4 - Associação entre a frequência de realização de PCCU e os resultados das
citologias atuais coletadas em mulheres rastreadas para o câncer cervical no
CRISMU, no período de Janeiro a Maio de 2014, na cidade de MarabáPA...............................................................................................................................66
Tabela 5 - Distribuição das variáveis epidemiológicas em mulheres com DNA HPV (+)
e DNA HPV (-) mulheres rastreadas para o câncer cervical no CRISMU, no período
de Janeiro a Maio de 2014, na cidade de Marabá-PA.................................................68
Tabela 6 - Concordância entre o resultado da Citologia e o resultado do PCR em
amostras cervicais de mulheres rastreadas para o câncer cervical no CRISMU, no
período de Janeiro a Maio de 2014, na cidade de Marabá-PA .................................70
LISTA DE ABREVIATURAS
ASC-H- Atypical Squamous Cells of Undetermined Significance, Atipias celulares de
significado indeterminado, não se podendo excluir lesão intraepitelial de alto grau.
ASC-US-Atypical Squamous Cells of Undetermined Significance, Células escamosas
atípicas de significado indeterminado.
β-globina- Gene da globina
CCU- Câncer de Colo uterino
CDC/USA- Center for Diseases Control and Prevention-United States of America
CH- Captura Híbrida
CI- Carcinoma invasor
CRISMU- Centro de Referência Integrado à Saúde da Mulher
DNA- Ácido Desoxirribonucleico
DP- Desvio padrão
DST- Doença Sexualmente Transmissível
E- Early Region (região precoce do genoma viral)
EGF- Fator de crescimento epidermal
FDA- Food and Drug Administration
HIV - Human Immuno deficiency Vírus (Vírus da Imunodeficiência Humana)
HPV - Papillomavirus humano
HSIL- High grade Squamous intraepithelial lesion, Lesão intraepitelial escamosa de
alto grau.
IARC- International Agency for Research on Cancer
IC 95% - Intervalo de Confiança de 95%
ICO- Information Center on HPV and Cancer in World
ICTV- International Committee on Taxonomy of Viruses (Comitê Internacional de
Taxonomia de Virus)
INCA- Instituto Nacional do Câncer
JEC- Junção Escamo-Colunar
L- Late Region (Região tardia do genoma viral)
LCR- Long Control Region (região longa de controle)
LSIL- Low grade Squamous intraepithelial lesion, Lesão intraepitelial escamosa de
baixo grau.
MS- Ministério da Saúde
NIC- Neoplasia Intra-Epitelial Cervical
OMS - Organização Mundial da Saúde
ORF - Open Reading Frames (região codificadora do genoma viral)
ORp- Odds ratio (razão de chances) de prevalência
p53- Proteína 53, Gene humano protetor a indução do câncer
pb - Pares de base
PBS- Solução salina tamponada com fosfato
PCCU - Prevenção do Câncer de Colo do Útero (exame de preventivo)
PCR- Polymerase Chain Reaction (Reação em Cadeia da Polimerase)
PNI- Programa Nacional de Imunização
pRb- Proteína do retinoblastoma
USA- United States of America
VLPs- Viral like particles
WHO - World Health Organization (Organização Mundial da Saúde)
ZT- Zona de transformação
SUMÁRIO
1
INTRODUÇÃO.................................................................................................15
1.1
PAPILLOMAVÍRUS HUMANO (HPV) ..............................................................15
1.1.1 Classificação e estrutura genômica do HPV.................................................15
1.1.2 História natural da infecção pelo HPV...........................................................19
1.1.3 Classificação dos HPV quanto ao potencial oncogênico............................23
1.1.4 Ciclo fisiopatológico da infecção e a expressão gênica do HPV................24
1.2
ASPECTOS EPIDEMIOLÓGICOS DA INFECÇÃO PELO HPV ......................28
1.2.1 Distribuição epidemiológica das infecções pelo HPV..................................28
1.2.2 Epidemiologia do câncer cervical ..................................................................32
1.2.3 Fatores de risco associados à infecção pelo HPV e ao desenvolvimento
do câncer cervical ..........................................................................................34
1.3
DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DA INFECÇÃO PELO HPV........................38
1.3.1 Diagnóstico citológico de lesões intraepiteliais cervicais ..........................38
1.3.2 Diagnóstico molecular da infecção pelo HPV ...............................................41
1.4
VACINA CONTRA HPV ...................................................................................44
2
JUSTIFICATIVAS DO ESTUDO ......................................................................47
3
OBJETIVOS ....................................................................................................49
3.1
OBJETIVOS GERAIS ......................................................................................49
3.2
OBJETIVOS ESPECÍFICOS.............................................................................49
4
MATERIAIS E MÉTODOS................................................................................50
4.1
TIPO DE ESTUDO............................................................................................50
4.2
POPULAÇÃO DO ESTUDO.............................................................................50
4.3
CÁLCULO DA AMOSTRA................................................................................50
4.4
INSTRUMENTO DA PESQUISA.......................................................................51
4.4.1 Critérios de inclusão .......................................................................................51
4.4.2 Critérios de exclusão ......................................................................................52
4.5
VARIÁVEIS DO ESTUDO ................................................................................52
4.6
COLETA E ROCESSAMENTO DAS AMOSTRAS ..........................................53
4.6.1 Coleta de amostras para citologia oncótica ..................................................53
4.6.2 Coleta de amostras para testes moleculares ...............................................54
4.6.3 Extração de DNA .............................................................................................54
4.6.4 Detecção do DNA do HPV pela PCR .............................................................55
5
PROCESSAMENTO E ANÁLISE DOS RESULTADOS...................................57
6
VIABILIDADE E ASPÉCTOS ÉTICOS ............................................................58
7
RESULTADOS ..................................................................................................59
7.1
ANÁLISE DESCRITIVA DAS VARIÁVEIS CATEGÓRICAS PARA TODO
O GRUPO ESTUDADO....................................................................................59
7.2
DISTRIBUIÇÃO PERCENTUAL DAS MULHERES COM HISTÓRIA DE
ANTECEDENTRES DE INFECÇÃO PELO HPV.............................................62
7.3
ANÁLISE DAS VARIÁVEIS CATEGÓRICAS PARA MULHERES QUE
APRESENTARAM ATIPIAS CELULARES .......................................................63
7.4
ANÁLISE DAS VARIÁVEIS CATEGÓRICAS PARA MULHERES QUE
APRESENTARAM DNA HPV (+) .....................................................................67
7.5
ANÁLISE COMPARATIVA PARA A EFICIÊNCIA DO TESTE CITOPATO
LÓGICO PCCU E O TESTE MOLECULAR PCR FRENTE AOS RESUL
TADOS OBTIDOS NO DIAGNÓSTICO DA INFECÇÃO PELO HPV................69
7.6
DISTRIBUIÇÃO DOS GENÓTIOS DO HPV DE ALTO E BAIXO RISCO
DETECTADOS EM AMOSTRAS DNA HPV (+) ..............................................70
8
DISCUSSÕES ...................................................................................................71
9
CONCLUSÕES .................................................................................................79
REFERÊNCIAS .................................................................................................80
APÊNDICE A - TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO ….93
APÊNDICE B – QUESTIONÁRIO CLÍNICO-EPIDEMIOLÓGICO .....................95
15
1 INTRODUÇÃO
1.1 PAPILLOMAVÍRUS HUMANO (HPV)
1.1.1 Classificação e estrutura genômica do HPV
O Papillomavírus humano (HPV) é considerado o agente viral causal de
tumores benignos como papilomas, verrugas comuns e condilomas. Com o avanço
das técnicas de detecção molecular, o genoma do HPV tem sido identificado em
células neoplásicas malignas passando desta forma a ser associado a cânceres,
principalmente ao câncer cervical (SOUTO et al., 2005; PINHEIRO et al., 2013).
As diversas espécies de papillomavirus atualmente identificadas são
semelhantes em sua estrutura física e organização genômica. São vírus que infectam
inúmeras espécies de vertebrados principalmente felinos, bovinos e humanos,
entretanto apresentam DNA espécie-especifico (SCHEURER et al.,2005). Diferentes
mamíferos abrigam estes vírus que infectam células do epitélio basal de peles e
mucosas onde são locais específicos. Em humanos, alguns tipos causam apenas
verrugas cutâneas e outros tipos lesam tecidos causando neoplasias especialmente
na região ano genital (BERNARD, 2005).
Inicialmente os papillomavirus e os poliomavírus foram agrupados na família
Papovaviridae em decorrência de semelhanças estruturais como a ausência de
envelope e apresentarem DNA circular e de dupla fita. Através da utilização da
microscopia eletrônica e técnicas da biologia molecular para estudo do DNA
evidenciaram-se diferenças no tamanho e organização de seus genomas e desta
forma o International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV) os considerou
pertencentes a famílias distintas: Papillomaviridae e Polyomaviridae respectivamente.
A família Papillomaviridae é composta por 30 gêneros sendo que os HPV associados
às lesões da mucosa genital encontram-se agrupados no gênero Alphapapillomavirus
(DE VILLIERES et. al., 2004; BERNARD, 2005).
Os HPVs caracterizam-se por serem vírus não envelopados, com
aproximadamente 55nm; apresentam um capsídeo composto por 72 capsômeros
dispostos em simetria icosaédrica (Figura 1). O genoma é caracterizado por uma dupla
fita de DNA circular com aproximadamente 8.000 pares de base (pb) de nucleotídeos
16
(PASSOS et al., 2008; CHOW et al., 2010). Devido à ausência do envelope estes vírus
parecem possuir a capacidade de manter-se viável em meio extracelular por até uma
semana (DOORBAR, 2005). O genoma do HPV pode sofrer mutações pontuais,
deleções e inserções, que podem se tornar permanentes numa população, se
selecionadas positivamente (BERNARD et al., 2010).
Figura
1:
Representação
do
http://www.korona.ro/artcole.htm).
capsídeo
viral
do
HPV.
(Fonte:
O genoma do HPV apresenta uma organização simples constituída por
aproximadamente oito sequencias de leitura aberta, Open Reading Frames (ORF) e
uma região não codificadora Long Control Region (LCR) conforme a figura 2. A região
ORF é composta de genes que se expressam precocemente (Early-E) e dentre eles
destacam-se os genes E1, E2, E4, E5, E6, E7 com aproximadamente 4.000 pb além
de dois genes que se expressam tardiamente (Late-L), sendo denominados
respectivamente de L1 e L2, com cerca de 3000 pb e que codificam proteínas do
capsídeo. A região reguladora LCR localiza-se entre as regiões L1 e E6, possui entre
400 a 1000 pb, contém a origem da replicação viral e o controle dos elementos para
a transcrição e replicação do HPV (DOORBAR, 2006; BURK et al., 2009; FERRARO
et al., 2011).
17
Figura 2: Estrutura gênica do HPV. Representação das três
regiões do genoma: Região inicial Early (E), Região tardia Late (L)
e Região de controle longa (LCR). (Fonte: Adaptado de Munõz et
al.2006)
Na região Early o gene E1 tem relação com a replicação viral e E2 com a
transcrição e replicação. O gene E2 codifica proteínas relacionadas com a replicação
epissomal do DNA viral e pode regular positiva ou negativamente a transcrição viral.
A função da proteína E4 é predominantemente atuar sobre a maturação viral
modulando alterações na matriz intracelular por interagir com a citoqueratina da célula
infectada promovendo mudanças estruturais do citoplasma elevando à formação de
coilócitos (SOUTO et al., 2005; CONCHA, 2007; NOMELINE et al., 2007; LIMA et al.,
2013).
A proteína E5 ainda não apresenta suas funções bem elucidadas, no entanto
estudos demonstram que ela é expressa desde o início da infecção até a fase prémaligna de lesões em células escamosas. Contribui para as primeiras etapas de
iniciação da lesão e formação do câncer desempenhando um papel importante
durante o curso inicial da infecção pela ligação ao fator de crescimento epidermal
(EGF), ao receptor beta (β). Entretanto, a sequência codificadora de E5 geralmente é
deletada do DNA viral epissomal durante a integração ao genoma hospedeiro na
progressão maligna. Desta forma, a expressão de E5 é perdida no carcinoma, não
sendo, portanto, necessária para a manutenção do fenótipo transformado (TALBERTSLAGLE & DI MAIO, 2009; CHOW et al., 2010; MAUFORT et al.,2010).
18
As proteínas E6 e E7 estão envolvidas com a transformação celular e
relacionadas com a oncogênese e progressão de malignidade principalmente em HPV
de alto risco tornando-se desta forma as proteínas mais estudadas. Outra proteína, a
E3, encontra-se presente em uma minoria dos papillomavirus e sua função ainda é
desconhecida (SCHEURER, 2005; HOWLEY, 2006; GHITTONI et al., 2010,
DOORBAR et al., 2012).
A região tardia (Late) do genoma do HPV corresponde a 40% do genoma viral,
situa-se após a região precoce, é constituída pelos genes L1 e L2 e são importantes
na etapa final da replicação do vírus através da tradução das grandes e pequenas
proteínas do capsídeo respectivamente. Cinco proteínas L1 juntas formam um
pentâmero e, 72 pentâmeros lado a lado conformam o capsídeo viral, responsável
pela resposta imune humoral e formação de anticorpos (WOODMAN et al., 2007;
ROSA et al., 2009).
Resumidamente as funções das proteínas expressas pelos principais genes do
HPV encontram-se resumidas no quadro 1.
Quadro1: Funções das proteínas expressas pelos genes do HPV. (Adaptado
pela autora, 2014).
GENES HPV
PRECOCES
FUNÇÃO DA PROTEINA
E1
Replicação viral
E2
Controle de transcrição
E3
Função desconhecida, encontrada em minora dos HPV
E4
Maturação do vírus e alteração da matriz celular
E5
Ligação com fator de Crescimento EGF na fase
epissomal, estímulo na proliferação, desaparece na
oncogênese.
E6, E7
TARDIOS
Transformação celular, oncogênese.
L1
Codifica proteína principal do capsídeo viral
L2
Codifica proteína secundária do capsídeo viral
19
1.1.2 História natural da infecção pelo HPV
Verrugas em humanos eram conhecidas pelos greco-romanos desde a
antiguidade quando pela ocorrência frequente em áreas genitais foram denominadas
de condilomas pelos médicos da época e agrupadas como doenças sexualmente
transmissíveis juntamente com a sífilis e a gonorreia (WU et al., 2008).
Somente em 1933 estudos publicados por Shope & Hurst publicaram a
descoberta do HPV a partir de lesões em coelhos selvagens. Observaram que
poderiam ser transmitidas a outros coelhos através de um extrato filtrado e sem
nenhuma célula, deduzindo assim que a doença seria de origem viral. Já em 1940,
Rous & Kidd demonstraram que este vírus tinha potencial para induzir a formação de
cânceres cutâneos em pele de coelho previamente infectado. Em 1954, Barret e
colaboradores, após estudarem soldados regressos da guerra da Coréia e que
apresentavam verrugas penianas obtidas após contatos sexuais com mulheres
coreanas, sugeriram a transmissão sexual da verruga genital (CAMARA et al., 2008).
Em 1974, Hausen e colaboradores anunciaram a descoberta da presença do
HPV em lesões de carcinoma de colo de útero apoiados pelas evidencias das técnicas
da biologia molecular, disseminadas no meio científico à época. Ao final da década de
70, Hausen escreveu sobre o condiloma acuminado e o câncer genital e o possível
papel dos papillomavirus humanos nos carcinomas escamosos. Em 1979 Syrjänen
também discutiu a associação entre o condiloma e o carcinoma cervical e concluiu
que as alterações celulares sugestivas de condiloma poderiam representar alterações
precursoras de carcinoma cervical invasivo. Em 1983, Hausen foi um dos ganhadores
do Prêmio Nobel de Medicina por evidenciar a presença do HPV16 e 18 em
aproximadamente 70% das biopsias de pacientes com câncer cervical analisadas em
seu estudo (ROSA et al., 2009).
A transmissão do HPV ocorre pelo contato direto com órgãos genitais, na
prática sexual e também em relações anais ou mesmo pelo sexo oral sendo assim
qualificada como doença sexualmente transmissível (DST). A aquisição da infecção
celular pelo HPV é o principal percursor de uma sequência de eventos que poderão
levar ao desenvolvimento do câncer cervical, entretanto evidencia-se que a história
20
natural da infecção pelo HPV é a eliminação viral em aproximadamente 80% dos
casos (TROTTIER et al., 2006; BOSCH et al., 2008; PASSOS et al., 2008).
Em lesões celulares benignas e pré-malignas o DNA do HPV encontra-se
comumente extra cromossômico. A integração do DNA do HPV ao genoma da célula
hospedeira é usualmente observada em carcinomas cervicais invasivos e em
linhagens celulares de outros carcinomas. Nestes casos o genoma viral mantido na
forma epissomal passa em determinado momento a integrar o genoma celular do
hospedeiro, alterando o ciclo celular e causando significantes alterações morfológicas
(ROSA et al., 2009; PINHEIRO et al., 2013).
O papillomavirus apresenta tropismo específico por células epiteliais
escamosas e induz a formação de tumores epiteliais e fibroepitelias em seus
hospedeiros naturais. As lesões causadas pelo HPV contêm características visuais e
histológicas fundamentais. Nas infecções cutâneas queratinizadas observa-se o
aumento da epiderme que se caracteriza pelo aspecto verrucoso e pela presença de
papilomatose em decorrência da proliferação celular. Observam-se ainda grânulos de
querato hialina comuns a epitélios queratinizados. Microscopicamente observam-se
alterações celulares caracterizadas pela disceratose, presença de coilócitos, células
estas caracterizadas por apresentarem halo perinuclear com bordo bem delimitado
sendo frequentemente binucleadas, com núcleos hipercromáticos e de contorno
irregular (Figura 3). Estas e outras importantes atipias celulares associadas a certos
tipos de HPV principalmente aos de alto risco induzem a formação de carcinomas,
entretanto o curso da doença pode demorar de 10 a 20 anos (FEHRMANN et al., 2005;
LETO et al., 2011).
21
Figura 3: Alterações citomorfológicas do tipo coilocitose (A) e disceratose (B) associadas
à infecção pelo HPV, em esfregaços cervicais corados pela técnica de Papanicolaou.
(Fonte: http://antonini.med.br/geral/alteracoes_celulares_causadas_por_infeccao_viral.html)
A infecção pelo HPV inicia-se com a penetração do vírus no epitélio, através de
microtraumas, atingindo a camada basal seguindo-se de um período de incubação
que varia de meses a anos. Nas células da epiderme de mãos e pés o período de
incubação pode variar entre 6 e 18 meses enquanto que em células de órgão genitais
este período varia entre 2 a 6 meses (SILVA et al., 2003). A infecção pode evoluir
para uma infecção latente, sem multiplicação viral, na qual não se evidencia mesmo
microscopicamente, ação do vírus. De outra forma pode evoluir para uma infecção
subclínica ou clínica, com multiplicidade viral. Nesta forma ocorre discreta
manifestação clínica instalada na cérvice uterina, geralmente detectada com auxílio
da colposcopia. Pode ainda evoluir com lesões vegetantes facilmente observáveis, os
condilomas, também conhecidos como verrugas (ROSA et al., 2009; BICCA et al.,
2013).
A infecção é considerada persistente quando há a detecção de um mesmo tipo
de HPV em mais de duas ocasiões em certo período, porém ainda não há consenso
para esse período. A persistência é um preditor para lesões pré-neoplásicas
particularmente frente às infecções por HPV oncogênicos, e em especial o HPV 16
seguido do HPV18. A infecção pelo HPV 16 parece persistir por um período maior que
a média dos outros tipos que é de 6 a 12 meses (ROSA et al., 2009; LUCENA et al.,
2011).
22
Em qualquer das manifestações citadas pode haver regressão espontânea. A
regressão da infecção, assim como o tempo de incubação do HPV nas células
hospedeiras é variável em decorrência da competência imunológica do hospedeiro
frente às respostas humorais e celulares e também da origem das células infectadas
(MICHELIN et al., 2009). Um receptor para a entrada do HPV, nas células epiteliais
não foi ainda funcionalmente identificado, no entanto uma proteína denominada
integrina α-seis-ß-quatro tem sido sugerida como uma forte candidata a receptor para
HPV. Esses proteoglicanos interagem com a porção carboxi-terminal da proteína L1
do HPV, porém apesar de serem largamente distribuídas na superfície de muitas
células, podem não ser suficientes para permitir uma entrada eficiente do vírus
(SELINKA et al., 2003; SOUTO et al., 2005).
As taxas de regressão espontânea entre mulheres infectadas por HPV variam
entre 50,4% a 56,7% nas Lesões Intraepiteliais de Baixo Grau (LSIL) e em média de
12,2% nas Lesões Intraepiteliais de Alto Grau (HSIL). A progressão para carcinoma
invasivo em mulheres positivas para HPV é de 14,2% para as LSIL variando entre
22,4% a 64% nas HSIL (BRENNA & SYJRÄEN, 2003).
Um estudo de coorte realizado com 1.425 mulheres na cidade de São Paulo,
Brasil, demonstrou uma mediana de persistência de positividade do HPV de 4,8
meses para os não oncogênicos e de 8,1 para os oncogênicos. Neste estudo
observou-se uma persistência maior em mulheres com menos de 35 anos (FRANCO
et al., 1999). Em outro estudo de coorte, no Arizona (USA), envolvendo 331 mulheres,
foi encontrada a mediana de tempo de regresso da infecção pelo HPV de 4,3 meses
para os tipos não oncogênicos e 9,8 meses para os tipos oncogênicos (SCHLECHT,
2001; GIULIAN et al., 2002; FERENCZY& FRANCO, 2002).
23
1.1.3 Classificação dos HPVs quanto ao potencial oncogênico
Os HPVs são um grupo heterogêneo de vírus nos quais o sequenciamento do
DNA tem permitido identificar mais de 150 tipos; destes, 85 genótipos já foram
totalmente caracterizados (LIMA JUNIOR, 2011). Aproximadamente 40 tipos infectam
especificamente o epitélio anal e genital. Segundo Bernard e colaboradores (2005),
considera-se um novo tipo de HPV quando as sequencias de nucleotídeos dos genes
L1, E6 e E7 que correspondem a aproximadamente 30% do genoma viral, apresentem
diferenças maiores que 10% com relação aos tipos conhecidos. Quando esse
percentual cai para menos que 2%, o novo vírus isolado é designado como uma
variante do mesmo tipo (DE VILLIERS et al., 2004; ZHENG & BAKER, 2006; DUNNE
& MARKOWITZ, 2006).
A classificação do HPV encontra-se ainda correlacionada ao seu tropismo
tissular e seu potencial oncogênico. Na primeira categoria, de acordo com o tropismo
são classificados como cutaneotrópicos, aqueles capazes de infectar a epiderme e
como mucosotrópicos, aqueles capazes de infectar mucosas em geral. (GARCIAESPINOSA et al., 2009). Na segunda categoria, de acordo com o risco para o
desenvolvimento de neoplasias encontram-se classificados como de baixo risco e de
alto risco (MUNOZ et al., 2003). Os vírus considerados de baixo risco estão
associados comumente a lesões benignas, como papilomas e verrugas simples
principalmente os condilomas; os vírus classificados como de alto risco encontram-se
associados a diferentes graus de lesões escamosas intraepiteliais e neoplasias
(SILVA et al., 2003).
Dentre os tipos de HPV de baixo risco, encontram-se principalmente os tipos 6,
11, 40, 42, 44, 54, 61,70, 72 e 81; dentre os de alto risco oncogênico, os tipos 16, 18,
31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 68, 73 e 82. Além destes, existe um grupo
intermediário de HPV, os tipos 26, 53, 54 e 66, para os quais ainda não existe base
epidemiológica que defina seu potencial oncogênico. Essa correlação entre tipos de
HPV de alto risco, câncer cervical e suas lesões precursoras ficou mais evidente após
os estudos nos quais se identificou DNA de HPV de alto risco em 84 a 99,7% dos
cânceres cervicais (MUNOZ, et al., 2003; DE VILLIERE et al., 2004; TROTTIER et al.,
2006; NORONHA, 2007).
24
Alguns HPV como os tipos 6 e 11 são na maioria das vezes detectados em
verrugas genitais benignas e são considerados de baixo risco oncogênico uma vez
que provocam malignidade das lesões em baixa frequência (DUNNE & MARKOWITZ,
2006). HPV de alto risco como os tipos 16, 18, 31,33 e 45 estão associados a uma
alta frequência para o desenvolvimento de lesões malígnas sendo detectados em
cerca de 80% dos carcinomas de células escamosas. Para os adenocarcinomas
cervicais a espécie mais prevalente é o HPV18 com 55% dos casos no mundo todo,
seguido do HPV16 com 32% e o HPV45 com 10% (CLIFFORD et al., 2003;
BERNARD, 2005).
1.1.4 Ciclo fisiopatológico da infecção e a expressão gênica do HPV
O HPV é um organismo exclusivamente intracelular que infecta células
mitoticamente ativas do tecido epitelial e seu ciclo de vida se inicia após o alcance de
células da camada basal do epitélio ou steam cells, do epitélio estratificado. Este
comportamento explica porque tanto carcinomas escamosos como glandulares se
originam na junção escamo colunar (JEC) e dentro da zona de transformação (ZT),
local este de acesso imediato às células metaplásicas imaturas, basais e para-basais
do epitélio cervical (MÜNGER et al., 2004; FEDRIZZI et al., 2008).
Após a entrada do HPV na célula o genoma viral se estabiliza como elemento
extra cromossômico, na forma epissomal, no núcleo e o número de cópias virais
aumenta para aproximadamente 50 por célula. Ao se dividirem (Figura 4), essas
células infectadas distribuem equitativamente o DNA viral entre as células filhas. Nas
lesões malignas, o DNA viral encontra-se integrado aos cromossomos da célula
hospedeira e não acontece a replicação viral (o que ocorre é a divisão celular que
carrega o cromossoma integrado). Uma das células filhas migra da camada basal e
inicia o programa de diferenciação celular. Nesta etapa há inativação da expressão
da proteína E2, que funciona como regulador negativo da expressão dos oncogenes
E6 e E7. Estes últimos promovem a imortalização celular ao inibirem as proteínas
celulares p53 e pRb (proteína do retinoblastoma), reguladoras do ciclo celular e que
são fundamentais para a supressão tumoral. As demais células filhas continuam
dividindo-se na camada basal e servem de reservatório de DNA viral para as
25
posteriores divisões celulares. Sendo a produção do HPV restrita às células supra
basais, as células na camada basal não são lisadas pela produção de novos vírus,
continuando a proliferação (ZHENG & BAKER, 2006; FERRARO et al., 2011;
OLIVEIRA et al., 2012).
Figura 4: Demonstração das formas de interação do DNA viral na célula
hospedeira. (Fonte: adaptado de ALBERTS et al., 1994).
De acordo com Passos e colaboradores (2008), poderá estabelecer-se tanto
uma infecção produtiva do HPV quanto não produtiva. A forma de DNA epissomal do
HPV é encontrada em verrugas genitais e lesões de menor gravidade e caracteriza a
forma produtiva da infecção. Na infecção improdutiva não ocorrerá a produção de
outras partículas virais embora haja a integração do genoma viral com o genoma do
hospedeiro. Neste processo há o rompimento do gene E2, havendo dessa forma
bloqueio na capacidade de sintetizar várias proteínas, inclusive as do capsídeo viral
(SCHEURER et al., 2005; FERRARO et al., 2011).
A progressão celular para a malignidade resulta da integração do DNA do HPV
ao genoma celular seguido da expressão de alguns genes decorrente de alterações
na relação entre o hospedeiro e o vírus. O DNA viral toma a forma linear e incorporase ao DNA da célula hospedeira. Os primeiros genes expressos nesse ciclo são E1
que tem ação de uma helicase e E2 que formam um complexo que se liga à origem
da replicação do genoma viral e recrutam elementos necessários à replicação como
as polimerases e outras proteínas acessórias; ocorre então a interrupção do controle
26
transcricional exercido por E2. O resultado da clivagem entre E1 e E2 é a perda da
função destes dois genes, bloqueio na capacidade de sintetizar várias proteínas,
inclusive as do capsídeo, acompanhada de desregulação dos genes E6 e E7,
resultando em transformação da célula hospedeira. Quando o gene E2 é mantido
funcional, existe a repressão das oncoproteinas do HPV (Mc CANCE, 2005;
FERRARO et al., 2011; TRISTÃO et al., 2012).
Seguindo-se à etapa da ruptura de E1 e E2 inicia-se a expressão das proteínas
não estruturais E4 e estruturais L1 e L2 até a completa montagem e liberação dos
virions (partícula viral completa fora da célula hospedeira) conforme esquema
ilustrativo à figura 5. A proteína E4 promove o rompimento do citoesqueleto
citoplasmático e nesta etapa há a migração de uma célula infectada para a camada
celular superior do epitélio com a finalidade de acompanhar o programa de
diferenciação dos queratinócitos, entretanto a célula filha infectada permanece na
camada basal em estado de multiplicação, mantendo um reservatório de DNA viral
(Mc CANCE, 2005; SIMONETTI et al., 2009; HEBNER & LAIMINS, 2006).
Figura 5: Esquema mostrando a expressão de proteínas do HPV em epitélio estratificado
até a liberação de virions. (Fonte: Modificado a partir de Simonetti et al., 2009).
A carcinogênese pelo HPV resulta da expressão dos genes E6 e E7; nos HPV
de alto risco, após a integração do DNA ao genoma celular, estes passam a codificar
oncoproteinas E6 e E7 que promovem o processo maligno. A E6 atua inibindo a p53
e nos HPV de alto risco, como o HPV16, atua como uma proteína ligadora de DNA
27
que interage não apenas com a p53, mas com outros fatores celulares, resultando em
bloqueio da apoptose, alterações na transcrição celular, distúrbios na sinalização
intracelular e no aumento do ciclo de vida das células, o que pode contribuir para a
transformação maligna. Nos HPVs de baixo risco a E6 liga-se com menor afinidade à
proteína p53 e não causa sua degradação (ZHENG et al., 2004; MC CANCE, 2005;
GARNETT& DUERKSEN-HUGHES,2006; GANGULY & PARIHAR, 2009; FRAGA et
al., 2011).
A oncoproteína E7 liga-se à proteína de pRb e esta associação causa
perturbação no controle do ciclo celular resultando em um estímulo excessivo para a
proliferação de células infectadas pelo HPV. Assim como a E6 dos vírus de baixo
risco, a E7 desses vírus também se liga com menor afinidade à pRb quando
comparada aos vírus de alto risco (SOUTO et al., 2005; ZHENG et al., 2006; PASSOS
et al., 2008; GANGULY & PARIHAR et al., 2009; GHITTONI et al., 2010).
O efeito combinado das oncoproteínas E6 e E7 resulta em fenótipo com
mutação, no qual a célula perpetua-se ciclando e incorpora qualquer mutação
espontânea que ocorra. Por razões ainda desconhecidas, as proteínas E6 e E7 dos
HPVs de baixo grau não são capazes de transformar as células hospedeiras
GHITTONI et al., 2010). Outro aspecto a ser considerado é a infecção múltipla, sendo
que alguns dados sugerem que estas podem ter um efeito sinérgico na carcinogênese.
Estudos científicos publicados entre 1999 e 2002, sobre a história natural da infecção,
mostraram que mulheres já infectadas possuem um risco aumentado para a aquisição
de novos tipos de HPV se comparadas com mulheres negativas para HPV.
O tempo da infecção até a liberação das partículas virais ocorre em até três
semanas, tempo este necessário para que ocorra a diferenciação e descamação de
queratinócitos basais (STANLEY, 2006). O tempo entre a infecção e o aparecimento
de papilomas pode estar na dependência da concentração e do tipo de vírus que
infecta o tecido assim como o estado de latência é sugerido em decorrência de baixa
concentração do vírus inoculado (BERNARD, 2005). Para atingir a malignidade o
processo de transformação celular ocorre de forma contínua, parte do epitélio normal
e progride com Lesão intraepitelial de baixo grau (LSIL) e Lesão intraepitelial de alto
grau (HSIL) até tornar-se um carcinoma invasor (CI) (DOORBAR, 2005; OLIVEIRA et
al., 2012; LUCENA et al., 2011; LIMA et al., 2013).
28
1.2 ASPECTOS EPIDEMIOLÓGICOS DA INFECÇÃO PELO HPV
1.2.1 Distribuição epidemiológica das infecções pelo HPV
A infecção genital pelo HPV é considerada uma das mais frequentes e
importantes DST em homens e mulheres, representando dessa forma um grande
problema de saúde pública, em decorrência de sua elevada incidência e alta taxa de
mortalidade no mundo todo. Estudos, nos últimos 20 anos, apontam alguns tipos de
HPV como responsáveis pelo desenvolvimento de malignidade nas regiões que
comumente infectam e que na mulher compreende o períneo, vulva, vagina, colo do
útero e região anal e no homem, pênis, uretra, sacro escrotal e região anal (DE VUYST
et al., 2009). Além das áreas citadas, o desenvolvimento de pesquisas demonstrou a
presença de HPV de alto risco oncogênico em carcinomas de cabeça e pescoço
principalmente nos sítios anatômicos da cavidade oral, orofaringe, hipofaringe e
laringe (BRAGAGNOLO, 2010; LETO et al., 2011).
O Center for Diseases Control and Prevention (CDC/USA) estima que pelo
menos metade das pessoas sexualmente ativas em todo o mundo será infectada pelo
HPV em algum momento de suas vidas. A estimativa mundial da prevalência das
infecções por HPV entre mulheres de 15 a 75 anos varia de 1,4 a 25,6% (SANJOSÉ
et al, 2007). Entretanto, segundo Steben e Duarte-Franco (2007), a prevalência geral
em mulheres infectadas, porém assintomáticas, varia entre 2 a 44%. Estas variações
são dependentes da região e população estudada e explicadas pelas diferentes faixas
etárias analisadas considerando ainda a sensibilidade dos métodos de diagnóstico
molecular utilizados na detecção do vírus (MUNÕZ et al., 2004; CLIFFORD et al.,
2005; NAKAGAWA et al., 2010).
Em 2005, o International Agency for Research on Cancer (IARC) publicou
importante estudo de metanálise de pesquisas realizadas em 11 países nos quatro
continentes do mundo envolvendo 15.613 mulheres rastreadas para câncer cervical e
que apresentaram citologia sem alterações celulares importantes. Neste estudo a
prevalência da infecção pelo HPV foi de 10,5%. Foi encontrada uma variação de até
20 vezes nesta taxa, entre os diferentes países envolvidos na pesquisa. A menor taxa
de prevalência foi encontrada na Espanha com 1,4% e a mais alta na Nigéria com
29
25,6%. O continente europeu apresentou na totalidade uma taxa de 5,2%, sendo a
menor. O continente asiático apresentou uma taxa de 8,7%. Na América do Sul, a taxa
foi de 14,3% e na África, de 25,6%. Embora a Europa tenha apresentada baixa
prevalência, esta apresentou a maior prevalência para o HPV16 enquanto que o HPV
18 teve distribuição homogênea. Neste grupo estudado a presença de vírus HPV de
alto risco representou 66,3% contra 27,5% para os de baixo risco e 5,5% distribuídos
entre outros tipos (CLIFFORD et al., 2005). Ajustando-se as taxas em decorrência do
tempo do estudo, Fedrizzi (2011) apresentou-as de forma resumida em estudo
publicado recentemente (Figura 6).
Figura 6: Prevalência* da infecção pelo HPV estimada em metanálise
de 78 estudos envolvendo mulheres com citologia normal nos diferentes
continentes (Fonte: Adaptada de Fedrizzi, 2011).
Local
Nº de
Estudos
n
157.879
Prevalência
Ajustada
(%)
10,41
Global
78
África
América
Europa
Ásia
08
24
27
19
95% IC
10,16-10,67
6.226
40.399
70.129
41.125
22,12
12,95
8,08
7,95
20,87-23,43
12,41-13,51
7,77-8,41
7,53-8,40
*Ajustada por região, tipo e desenho de estudo, ano de publicação, forma de
coleta da amostra, meio de armazenamento celular, técnica para detecção de
HPV, primer utilizado e idade para cada estudo.
Segundo dados da Organização Mundial de Saúde (OMS), publicados em
2009, a prevalência da infecção pelo HPV na América do Sul é de 13,2% enquanto
que no Brasil é de 14,1% entre as mulheres com citologia dentro dos limites da
normalidade. Conforme se observa na figura 7, adultos jovens sexualmente ativos,
principalmente no início da vida sexual são os mais expostos ao risco de aquisição de
HPV. A prevalência de infecção neste grupo é de 3-4 vezes maior do que em mulheres
de 35 a 55 anos com uma tendência de declínio da curva em faixas etárias mais
velhas. Esta mesma tendência é encontrada nos dados da OMS e em estudo de
metanálise realizada por Sanjosé e colaboradores em 2007 (FEDRIZZI, 2011).
30
Figura 7: Prevalência da infecção pelo HPV em mulheres com citologia normal, de
acordo com a idade (IC 95%%, em sombra cinza). Adaptado por Fedrizzi, 2011. Fonte:
WHO/ICO – Information Center on HPV and Cancer in World.
Cancers-Brazil, Summary Report 2009.
Papillomavirus and Related
A prevalência dos genótipos de HPV de alto risco mais frequentes no mundo,
detectados em mulheres com citologia dentro dos limites da normalidade, varia de
acordo com a região estudada e pode ser visualizada na figura 8.
Figura 8: Prevalência dos tipos de HPV de alto risco entre mulheres com citologia normal.
Demonstração dos cinco genótipos de HPV mais frequentes no mundo. (Fonte: modificado de
www.int/hpvcentre, 2009).
31
Segundo estudo de Baseman e colaboradores (2005), a prevalência de
infecções por HPV de alto risco em uma população dos Estados Unidos com idade de
25 anos foi de 27,4%. Em um estudo realizado também nos Estados Unidos entre os
anos de 2003 e 2005, envolvendo 9.657 mulheres entre 14 e 65 anos rastreadas para
o câncer cervical a prevalência para HPV de alto risco foi de 23% (DATTA et al., 2008).
Entretanto, um recente estudo na Escócia com mulheres de 36 anos demonstrou
prevalência de aproximadamente 17,7% para HPV de alto risco e 20,5% para todos
os tipos (KULASINGAM et al, 2002).
No Brasil, estudos nacionais registraram um perfil de prevalência da infecção
por HPV de alto risco semelhante ao de países subdesenvolvidos: 17,8 a 27% com
uma prevalência maior nas mulheres nas faixas etárias abaixo de 35 anos; a partir
dos 35 até 65 anos, as taxas permanecem de 12 a 15% (RAMA et al., 2008).
Em um estudo realizado na cidade de São Paulo, Brasil, com 2.300 amostras
cervicais de mulheres na faixa etária de 15 a 65 anos encontrou-se uma prevalência
de 17,8% para a infecção por HPV de alto risco com predomínio em mulheres com
idade menor que 25 anos (RAMA et al.,2008). Em Porto Alegre, Brasil, em um estudo
transversal envolvendo 975 mulheres rastreadas para o câncer cervical a prevalência
do HPV foi de 27% (NONNENMACHER et al., 2002).
No nordeste brasileiro, Soares e colaboradores (2003) observaram uma
prevalência de 26% na infecção pelo HPV entre mulheres da zona rural em idade
reprodutiva. No norte do Brasil em um estudo comparativo entre duas populações,
urbana e rural, na Amazônia Oriental a prevalência encontrada para DNA de HPV nas
amostras cervicais examinadas variou entre 15% para as amostras da zona urbana e
14,2% para as da zona rural numa população feminina na faixa etária entre 13 a 71
anos (PINTO et al., 2011). Em Belém, em um estudo transversal, realizado por
Noronha (2005) envolvendo 433 mulheres na faixa de 30 a 45 anos, com citologia
dentro da normalidade encontrou uma prevalência de 6,9% para o DNA do HPV.
32
1.2.2
Epidemiologia do câncer cervical
O câncer cervical é o segundo câncer mais comum entre mulheres nos países
em desenvolvimento e, por conseguinte maior causador de morte por câncer entre
mulheres adultas. Constitui-se em uma doença de progressão lenta, podendo levar
até 15 anos para atingir o estágio de câncer invasivo (Figura 9), e apresenta alta
possibilidades de ser debelado se detectado precocemente. Os HPVs de alto risco
encontram-se envolvidos na gênese desses tumores, sendo detectado em 99,7% dos
casos de carcinoma cervical (TROTTIER & FRANCO, 2006; INCA, 2013).
Figura 9: Sequencia temporal de eventos na história natural do câncer
cervical. (Fonte: Brasil, 2006).
A detecção precoce do câncer do colo do útero é realizada através do exame
de Papanicolaou, procedimento este de baixo custo e de fácil execução e estabelecido
em programas de prevenção em todo o mundo sendo recomendado para mulheres
entre 25 e 65 anos. Um alto benefício é alcançado quando o exame é realizado em
mulheres acima de 35 anos, priorizando-se, assim, o rastreamento na faixa etária
entre 35 e 59 anos, faixas de idade onde detectam-se as mulheres mais acometidas
pela doença. O câncer do colo do útero, mundialmente, apresenta incidência
aproximada de 530 mil novos casos por ano podendo provocar cerca de 275 mil
mortes anualmente. É considerado o quarto tipo de câncer mais comum entre as
33
mulheres ocupando o sétimo lugar geral para todos os tipos de câncer (GAMARRA et
al., 2010; WHO, 2013; SILVA et al., 2014).
De acordo com dados da IARC, as regiões Oriental e Ocidental da África
apresentam taxa de incidência para o câncer cervical maior que 30 por 100 mil
habitantes; a África do Sul com 26,8 por 100 mil; o Centro-Sul da Ásia com 24,6 por
100 mil; a América do Sul e África Central com 23,9 e 23,0 por 100 mil
respectivamente. As taxas de menor incidência são Ásia Ocidental, América do Norte
e Austrália /Nova Zelândia com menos de 6 por 100 mil. Verifica-se desta forma uma
diferença significante na incidência deste tipo de câncer em países europeus e
americanos, quando comparados com dados de países da América do Sul, da Ásia e
da África. Assim sendo, mais de 80% da incidência e mortalidade relacionadas aos
casos de câncer do colo do útero ocorrem em regiões que oferecem recursos limitados
para a prevenção, intervenção e tratamento de mulheres acometidas por este agravo
(PARKIN, 2006).
O Brasil apresentava em 2012 uma população de mulheres com idade superior
a 15 anos estimada em 78.18 milhões e que se encontravam em risco de desenvolver
o câncer cervical (WHO, 2012). Estimativas do INCA para o Brasil em 2014 revelam
que o câncer cervical ocupa atualmente o terceiro lugar geral sobre todos os tipos de
canceres e o segundo sobre os cânceres feminino sendo o primeiro o câncer de mama
(DA SILVA et al., 2014; BRASIL, 2014).
Para o ano de 2014 são esperados, no Brasil, 15.590 novos casos de câncer
do colo do útero, com um risco estimado de 15,33 casos a cada 100 mil mulheres.
Apresenta a seguinte incidência estimada de novos casos de acordo com as regiões:
Região Norte ocupa o primeiro lugar com 24/100.000 habitantes; Região CentroOeste, 22/100.000; Região Nordeste 19/100.000 sendo que esta ocupa a segunda
posição geral; Região Sudeste, 10/100.000; Região Sul, 16/100.000 sendo esta quinta
com maior incidência. Neste contexto o Brasil é considerado área de alta incidência
para este câncer feminino com uma taxa variando em 17/100.000 habitantes/ano
(BRASIL, 2014).
34
1.2.3
Fatores de risco associados à infecção pelo HPV e ao desenvolvimento
do câncer cervical
Considerando-se os conhecimentos atuais sobre a história natural da infecção
pelo HPV, sabe-se que embora um grande número de mulheres encontre-se infectada
pelo vírus do HPV apenas um percentual pequeno desenvolverá câncer cervical.
Ainda não está bem estabelecido porque a infecção pelo HPV evolui com resolução
em alguns indivíduos e resulta em lesões mais graves em outros. Para o fato de que
a infecção por HPV oncogênico é causa necessária, porém não suficiente para
desencadear o câncer cervical, admitem-se outros fatores que conjuntamente com o
vírus modulam o risco de evolução da infecção cervical para a malignidade. A
progressão tumoral em indivíduos infectados parece estar estimulada por fatores
mutágenos químicos, físicos e infecciosos e vem sendo estudados nos últimos 20
anos (CASTELLSAGUE & MUNOZ, 2003; AU et al., 2007).
Esses fatores interagem em maior ou menor intensidade com as oncoproteinas
e outros elementos do HPV potencializando a ação do vírus na célula hospedeira
facilitando o desenvolvimento dos processos da imortalização viral e da
carcinogênese. Dentre eles os mais investigados são: uso de contraceptivos orais,
tabagismo, fatores genéticos como o polimorfismo da proteína p53, infecção
associada à síndrome da imunodeficiência adquirida, infecção concomitante com
Chlamydia trachomatis e Herpes sp., (PELUZIO et. al., 2006; GARCÊS et al., 2013).
A idade da sexarca, o número de parceiros sexuais, a multiparidade e história
de DST estão ligados ao processo de aquisição da infecção pelo HPV, entretanto não
são considerados cofatores para a progressão da infecção e o desenvolvimento de
lesões cervicais. Fatores sociais como baixa renda e baixa escolaridade também têm
sido abordados em estudos epidemiológicos (SILVA et al., 2006; ROSA, 2009;
GARCÊS et al., 2013).
Alguns sociólogos têm demonstrado repetidamente uma correlação linear entre
a atividade sexual precoce e a posição social desfavorecida com relação à situação
sócio econômica para o desenvolvimento do câncer cervical. Em populações de
35
condições sociais precárias, o início da vida sexual é mais precoce por diversas
razões: vida comunitária de homens e mulheres, breve período de dependência
familiar, ausência de guia familiar, amadurecimento forçado com idade precoce,
ausência de perspectivas e consideração da sexualidade como substituto de outras
atividades e valores, bem como forma de aceitação, proteção ou fonte de renda.
Todas essas observações epidemiológicas destacam o papel dos carcinogênios
sexualmente transmitidos na etiologia do câncer do colo uterino e seus precursores
(ALBUQUERQUE et al., 2009; SANTOS et al., 2014).
O início precoce das atividades sexuais aumenta o risco de meninas contraírem
a infecção pelo HPV, entretanto a chance parece estar diretamente relacionada ao
número de parceiros e também ao histórico sexual destes parceiros. O
desenvolvimento de lesões que precedem o câncer cervical pode estar relacionado
ao fato de o epitélio cervical de adolescentes encontrar-se mais vulnerável em
decorrência da imaturidade biológica antes dos 18 anos (MOSCICKI, 2007; ROTELIMARTINS et al., 2007; RAMA et al., 2008).
Para Baseman & Koutsky (2005) o número de parceiros sexuais, em qualquer
das faixas etárias femininas é um fator de risco muito consistente a considerar em
decorrência dos hábitos sexuais destes. Ho e colaboradores (1998) demonstraram em
um estudo que mulheres que tiveram quatro ou mais parceiros, num período de seis
meses, apresentaram um risco quatro vezes maior de adquirir HPV oncogênico
quando comparadas com mulheres com três parceiros ou menos no mesmo período.
Estudos relatam que parceiros sexuais de mulheres com câncer cervical
apresentaram variadas infecções genitais inclusive câncer peniano com etiologia por
HPV de alto risco (WATTLEWORTH, 2011).
A idade parece ser um fator de risco e tem sido associada à persistência da
infecção pelo HPV. A incidência aumentada em mulheres jovens, logo após o início
das atividades sexuais, entre 18 e 28 anos tem se apresentado elevada. Na faixa
etária seguinte, entre os 30 e 40 anos de idade, ocorre um declínio visível na
incidência pela provável redução à exposição a novos parceiros e também ao
desenvolvimento de imunidade a alguns tipos virais. Mulheres com mais de 40 anos
e infectadas pelo HPV apresentam um risco 30 vezes maior de desenvolver câncer
cervical do que mulheres mais jovens. Verificam-se, em alguns estudos, um aumento
36
da prevalência da infecção pelo HPV em mulheres menopausadas (BRASIL, 2006b).
Em um estudo, Castle e colaboradores (2005) constataram que em mulheres acima
de 65 anos a infecção apresentou-se persistente em mais de 50% das investigadas
(CLIFFORD et al., 2005; ROTELI-MARTINS et al., 2007; SANJOSÉ et al., 2007;
EDUARDO et al., 2012).
Hormônios esteroides na forma de contraceptivos habitualmente usados na
fase reprodutiva em mulheres jovens parecem aumentar a atividade transformadora
das oncoproteinas do HPV e interferir desta forma na resolução das lesões cervicais
causadas por este vírus. Uma das causas seria a interferência direta no metabolismo
do ácido fólico ou ainda na interferência sobre a imunovigilância tumoral que estando
deficiente promove a integração do DNA viral ao genoma do hospedeiro, estimulando
a transcrição das oncoproteinas E6 e E7. Foi demonstrado através de estudos que
mulheres que referem uso de contraceptivos hormonais por períodos superiores a
cinco anos tem a chance para o desenvolvimento de LSIL e carcinoma cervical
aumentada em até 2,8 vezes. No entanto, não há estudos com suficiência de
evidencias que permitam comprovar esta correlação (UCHIMURA et al., 2005; ROSA
et al., 2009; SKEGG,2012).
Uma consistente associação entre o tabagismo e o câncer cervical tem sido
relatada em diversos estudos. Carcinógenos químicos como a nicotina e o alcatrão,
apresentam-se em alta concentração no muco cervical em mulheres tabagistas
provocando efeito mitogênco e causando danos ao DNA. Estudos avaliam a influência
direta da nicotina na diminuição das Células de Langherans estas importantes
apresentadoras de antígenos e ativadoras de linfócitos T-CD4, na diminuição do
número e atividade de linfócitos e de imunoglobulinas estes atuantes na imunidade
celular, podendo assim interferir na resolução de infecções cervicais pelo HPV
(VINEIS et al., 2004; UCHIMURA, 2004; TELES et al., 2013).
A gestação pode influenciar o desenvolvimento de lesões cervicais de forma
direta ou indireta. A ocorrência de partos antes dos 20 anos é um fator de risco
consistente para desenvolvimento de lesões intraepiteliais em mulheres infectadas
pelo HPV. O risco dobra em mulheres com mais de quatro partos quando comparadas
com as que nunca pariram. Sugere-se que haja maior susceptibilidade a algumas
infecções durante a gravidez. Uma das explicações para tal, além dos traumas na
37
cérvice promovidos pelos partos transpélvicos, é que as alterações imunes na
gravidez tendem a manter normal a resposta humoral e suprimir a imunidade celular,
favorecendo infecções por patógenos intracelulares (MAESTRI & FONSECA, 2009).
Outros fatores sugeridos seriam as deficiências dietéticas do período gestacional e a
participação dos hormônios femininos no aumento da replicação do HPV, entretanto
estes fatores ainda não se encontram suficientemente comprovados (SILVEIRA et al.,
2008; RAMA et al., 2008).
As respostas imunológicas frente às infecções pelo HPV ainda são pouco
conhecidas podendo estar relacionadas à ativação do sistema imunológico ou à
própria composição genética do hospedeiro. Na maior parte dos indivíduos a infecção
natural por HPV desencadeia fraca resposta local da imunidade celular, já que não
ocorre citólise ou necrose, e consequentemente a resposta inflamatória está
diminuída. Além disso, não ocorre viremia durante o ciclo de vida do HPV, ocorrendo
apenas pequena exposição deste ao sistema imunológico. Os anticorpos anti-L1
produzidos em resposta à infecção natural aparecem tardiamente e têm
concentrações baixas. Estima-se que em apenas 50% dos casos haja produção de
anticorpos (STANLEY et al., 2006).
Diversos estudos têm associado DST e carcinogênese cervical com foco na
Chlamydia trachomatis, entretanto o papel destes ainda permanece pouco entendido.
Não existem evidências de que o HPV sozinho induza um processo inflamatório,
assim, células infectadas por Chlamydia trachomatis secretariam maior quantidade de
citoquinas que resultariam na indução de um processo inflamatório mais acentuado
na cérvice uterina levando-a a danos por metabólitos oxidativos (MARCOLINO et al.,
2008; ROSA et al., 2009; GARCÊS et al., 2013).
Alguns autores acreditam que o estado de imunocompetência do hospedeiro
possa ter relação com a evolução de lesões cervicais. A capacidade de o vírus persistir
no hospedeiro pode ser aumentada por fatores que levam à supressão ou abolição da
imunidade celular, como o uso de drogas citotóxicas em transplantados,
imunodeficiências
inatas
ou
adquiridas
como
a
causada
pelo
vírus
da
imunodeficiência humana (HIV). Estudos mostraram que mulheres HIV positivas
apresentam chance 13,3 vezes maior de desenvolver neoplasias malignas no colo
uterino, e que infecções pelo HPV e HIV são mais frequentes em mulheres no auge
38
da capacidade produtiva e reprodutiva (CAMPOS et al., 2005; UCHIMURA et al.,
2005; ENTIAUSPE et al., 2010).
1.3 DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DA INFECÇÃO PELO HPV
1.3.1 Diagnóstico citológico de lesões intraepiteliais cervicais
A associação existente entre a infecção pelo HPV e o câncer cervical é a
principal razão para a realização da análise citomorfológica das células cervicais. O
diagnóstico clínico de uma infecção pelo HPV pode ser estabelecido pela observação
de verrugas genitais ou condilomas planos pigmentados ou não. A colposcopia
identifica as lesões subclínicas nos diversos sítios humanos, diferencia as condições
fisiológicas das patológicas, orienta a biópsia para esclarecer dúvidas na informação
citológica e no diagnóstico diferencial (infecção viral, lesão intraepitelial de baixo ou
alto grau, carcinoma invasor) através da histologia e delimita ainda a extensão da
enfermidade (DERCHAIN et al, 2005).
Historicamente a prevenção do câncer de colo do útero tem-se baseado no
exame de Papanicolaou, colpocitologia oncótica ou preventiva do câncer do colo do
útero (PCCU). Constitui-se em uma técnica desenvolvida na década de 30 por George
Papanicolaou que avalia células cervicais, fixadas em lâmina de vidro e coradas de
forma especial. Permite detectar, em análise microscópica, alterações morfológicas
sugestivas de câncer ou de suas lesões precursoras tais como presença de coilócitos,
disceratose e outras anomalias celulares compatíveis com a infecção pelo HPV,
(DERCHAIN, 2005).
Países que implementaram programas eficientes de prevenção para câncer
cervical baseados no teste de Papanicolaou conseguiram reduzir acentuadamente a
incidência e a mortalidade associada a esta doença. No Brasil, o Ministério da Saúde
(MS) implantou em 1998, o programa “Viva Mulher” de rastreio do câncer do colo do
útero e de mama, priorizando mulheres na faixa etária de 25 a 29 anos e desta forma
promoveu em curto prazo uma redução de 50% da mortalidade para o câncer cervical.
Entretanto apesar dos esforços dos subsequentes programas de governo a
39
manutenção de taxas desfavoráveis de incidência e mortalidade no Brasil revela que
as medidas adotadas não conduziram aos resultados esperados (PINHO & FRANÇAJUNIOR, 2003; MARTINS et al., 2005).
A realização do exame de Papanicolaou apresentou-se mais eficaz em países
desenvolvidos como Itália e Inglaterra, onde estudos revelaram a prevalência de 53%
de mulheres que realizaram o exame, pelo menos uma vez na vida entre italianas, e
de 77% entre inglesas. Nos países latinos, a prevalências de mulheres que realizaram
o Papanicolaou, pelo menos uma vez na vida, foi mais baixa, em torno de 30%
(MARTINS et al., 2005). Estudos apontam que em torno de 40% da população
feminina brasileira nunca foi submetida a esse teste e que apenas 7,7% das mulheres
público alvo tem a cobertura efetiva de programas governamentais (MARTINS et al.,
2005; ALBUQUERQUE et al, 2009).
A classificação citomorfológica atualmente utilizada para descrever as
observações feitas na citologia e na histologia encontra-se, desde 1991 apoiada no
“Bethesda System” amplamente discutido pela classe científica durante a década de
80, na cidade de Bethesda. Em 1999, a Sociedade Brasileira de Patologia publicou
um manual de padronização de laudos citológicos baseado no Sistema Bethesda. Foi
incluída a terminologia “lesão escamosa intraepitelial cervical” em associação com o
termo “neoplasia intraepitelial cervical” (CURY, 2011).
A sensibilidade do exame citopatológico varia entre os diferentes trabalhos,
mas pode ser considerada em torno de 70% e quando associado à colposcopia
(visualização do colo do útero por um sistema ótico de aumento, após coloração das
células por ácido acético e lugol), pode aumentar em até 80%, sendo a estratégia
adotada pela maioria dos programas de rastreamento, ou seja, a utilização da
colposcopia em casos selecionados pelo exame citopatológico. Apesar da importância
do exame de Papanicolaou para a prevenção do câncer cervical, o mesmo
apresentava limitações relacionadas principalmente à sua baixa sensibilidade
decorrente da alta taxa de falsos negativos e a natureza subjetiva do teste pela falta
de critérios morfológicos seguros para descrever micro invasão, pela ausência de
amostragem da junção escamo-colunar ou mesmo pela escassez de células
neoplásicas na amostra (DENNY & WRIGHT, 2005; CURY,2011).
40
Neste sentido, em 2003 o Ministério da Saúde (MS), através do Instituto
Nacional do Câncer (INCA) lançou o livro Nomenclatura Brasileira para Laudos
Citológicos Cervicais e Condutas Clínicas Preconizadas e que atualmente encontrase em sua 3ª versão - Nomenclatura Brasileira para Laudos Citopatológicos Cervicais,
devendo ser utilizado pelos laboratórios vinculados à rede SUS e orienta para as
terminologias conforme o quadro 2 (BRASIL, 2012).
Quadro 2: Orientações para laudos citopatológicos cervicais em amostras
adequadas para análise citológica. (Fonte: INCA, 2012. Adaptado pela autora).
OBSERVADO
DIAGNÓSTICO CITOLÓGICO DESCRITIVO
Células completamente
normais
Dentro dos limites da normalidade, no material
examinado.
Alterações Celulares
Benignas sugestivas de:
Inflamação por agentes Específicos /Inespecíficos,
Metaplasia Imatura,
Reparação, Atrofia, Radiação.
Atipias Celulares de
significado indeterminado
ASC-US- Atipias celulares de significado indeterminado,
possivelmente não neoplásico.
ASC-H- Atipias celulares de significado indeterminado, não
se podendo excluir lesão intraepitelial de alto grau.
Atipias Celulares
LSIL - Lesão intraepitelial de baixo grau (efeito citopático
pelo HPV e NIC I).
HSIL - Lesão intraepitelial de alto grau (NIC II E NICIII).
HSIL - Lesão Intraepitelial de alto grau, não podendo
excluir microinvasão.
Carcinoma Epidermóide Invasor.
Há de se considerar ainda que a probabilidade de uma paciente com citologia
anterior sem sinais de infecção pelo HPV vir a apresentar na citologia seguinte um
diagnóstico LSIL é de 0,4%, diante disso Murta e colaboradores (1997) demonstraram
em um trabalho que 5,3% das pacientes com sinais citológicos desta infecção
evoluíram para LSIL. Igualmente, aproximadamente 60% dos casos de condiloma
apresentam coilócitos óbvios no esfregaço, entretanto 30 % das infecções por HPV
podem passar despercebidas se o diagnóstico for baseado apenas no encontro de
células coilocíticas. Finalmente, a conduta protocolar frente a mulheres com
diagnóstico citológico com ASC-US constitui-se em uma problemática, pois esse
41
diagnóstico pode significar que se está diante de uma alteração celular reativa ou
frente a uma pré-neoplasia/neoplasia (NOMELINE et al., 2007).
1.3.2 Diagnóstico molecular da infecção pelo HPV
Com o advento de técnicas de detecção de genomas virais, os métodos de
análise citomorfológica revelaram-se de menor sensibilidade no diagnóstico da
Infecção pelo HPV. Como o risco de câncer cervical invasivo na mulher está
diretamente relacionado à presença de HPV de alto risco, a pesquisa desses tipos
virais por meio de métodos moleculares tem sido extremamente útil para o
acompanhamento de mulheres com alterações citológicas. Estudos diversos têm
avaliado a eficácia da aplicação de testes moleculares de detecção do DNA do HPV
no rastreamento primário do câncer cervical e, também em mulheres que
apresentaram LSIL ou mesmo ASC-US. A mesma aplicação tem sido feita para o
acompanhamento de mulheres que foram submetidas a tratamentos de HSIL
(GIRIANELLI et al., 2004; DO CARMO & FIORINI, 2007; WOLSCHICK et al., 2007;
NOMELINE et al., 2007; BRINGHENTI et al., 2010).
A utilização de métodos da biologia molecular, em especial os testes da
Polymerase Chain Reaction (PCR) ou Reação em Cadeia da Polimerase e Captura
Híbrida (CH) tem sido relatada por vários pesquisadores como extremamente
sensíveis na identificação do DNA viral (DO CARMO & FIORINI, 2007). As duas
técnicas possuem especificidade semelhante, em torno de 95%, e quando
associadas, a sensibilidade aproxima-se de 100% (LIMA JÚNIOR et. al., 2011;
DRUMOND et al., 2011).
Em um estudo realizado em Porto Alegre, Brasil, com 975 pacientes oriundas
de um programa de rastreamento para o câncer cervical, foi encontrada uma
prevalência de HPV de 15%, quando utilizada a técnica de CH, e de 16% quando
utilizada a técnica de PCR. Quando combinadas as duas técnicas, a prevalência de
HPV foi elevada a 27% (NONNENMACHER et al., 2002). A partir do ano de 2003,
42
alguns países passaram a utilizar técnicas moleculares para a pesquisa de genótipos
oncogênico do HPV em mulheres acima de 30 anos para o rastreamento de
neoplasias cervicais, em associação ao exame citológico alterado (MAYRAND et. al.,
2007).
A PCR constitui-se em uma técnica de amplificação de uma sequência
específica do DNA viral, delimitada por um par de primers com a ajuda de uma enzima
termoestável, a Taq DNA polimerase. Teoricamente pode produzir um milhão de
cópias de uma única molécula de DNA fita dupla após 30 ciclos de amplificação em
um equipamento termociclador, entretanto deve-se ter atenção à possibilidade de
reações falso-positivas em decorrência de espécimes ou reagentes contaminados.
Pode ser aplicado de forma genérica para detecção de ácido nucleico viral e também
de forma específica com o objetivo de genotipar o vírus (DO CARMO& FIORINI, 2007).
Os primers mais utilizados numa PCR genérica são os primers degenerados
MY09/11 com protocolo descrito por Manos e colaboradores em 1989. Amplificam
uma região altamente conservada dentro do gene L1 do HPV comum a 43 tipos de
HPV e reproduzem amplicons de 450 pb sendo capazes de detectar mais de 25
genótipos de HPV. Utilizam-se também os primers de consenso GP05/06 e sua versão
estendida GP05+/GP06+ descritos por Roda-Husman e colaboradores em 1995. A
versão modificada destes, os pares PMGY09/11, umas misturas de 18 primers
diferentes possuem a finalidade de eliminar degenerações e melhorar a sensibilidade,
especificidade e reprodutibilidade do teste (GIRIANELLI et al., 2004). A PCR
específica, aplicada na tipificação viral, utiliza primers complementares específicos às
regiões com variações nucleotídicas de um determinado genótipo sendo que para o
HPV, os alvos são os genes E6 e E7 (MAGALHÃES et al, 2008).
A sensibilidade e a especificidade do método PCR podem sofrer variações
dependendo dos primers utilizados, do tamanho de produto da PCR, do desempenho
da DNA polimerase termoestável utilizada na reação e da quantidade de DNA-HPV
amplificado e capacidade de detecção de múltiplos tipos. Em um estudo brasileiro com
116 amostras cervicais, Magalhães e colaboradores (2008) encontraram maior
sensibilidade e especificidade ao usar o par de primers PMGY09/11 (59,5% de
positividade) frente ao par MY09/11 que apresentou 56% de positividade na detecção
do HPV.
43
Em protocolos de pesquisa conta-se ainda com a versão “real time” da PCR ou
PCR em Tempo Real para as tipificações de vírus. Para o DNA HPV utiliza-se um tipo
específico de primer que combinado com sondas fluorescentes diante da qual se pode
observar o aumento exponencial do produto amplificado ao longo de uma ou mais
reações. Tem a vantagem de eliminar a etapa trabalhosa da pós-amplificação
(eletroforese em gel de agarose) para a visualização do produto amplificado. Outra
vantagem é a velocidade, reprodutibilidade e capacidade de quantificação do produto,
porém requer alta habilidade técnica, pois a mistura de iniciadores para diferentes
tipos de HPV em uma mesma reação pode dificultar a padronização da técnica em
um laboratório (MOLIJN et al., 2005).
A captura híbrida é um método mais recente e possui a vantagem de utilizar
reagentes não radioativos, facilitando seu manuseio e diminuindo seu custo.
Apresenta alta sensibilidade, reprodutibilidade e objetividade. O método é baseado na
hibridização de DNA viral de único filamento e utiliza dois coquetéis de sondas de
RNA, marcadas com fluorescentes, que reconhecem 13 tipos de HPV de alto risco e
5 de baixo risco que se hibridizam com o DNA do HPV presente na amostra. A seguir
os híbridos são capturados por anticorpos presentes nas paredes da microplaca da
reação e então são revelados por quimioluminescência (NOMELINE et al., 2007;
RODRIGUES et al., 2009).
Naucler e colaboradores (2007, 2009) consideram que a maior especificidade
dos testes de DNA-HPV ocorra em mulheres com mais de 35 anos, pois embora a
prevalência tenha seu pico nas mulheres em torno de 20 anos de idade, esta infecção
é geralmente transitória neste período e o desenvolvimento da carcinogênese resulta
da infecção HPV persistente com replicação viral sustentada no epitélio escamoso,
apresentando um pico de incidência do câncer cervical por volta dos 40 anos de idade.
Através de estudo realizado em 22 países, com 1.000 amostras de câncer
cervical, constatou-se que em 93% dos casos havia a presença de DNA do HPV.
Acredita-se que as amostras negativas, encontradas neste estudo, correspondam a
tipos ainda não genotipados ou, a outros fatores causais ainda desconhecidos
(BOSCH et al.,2002).
44
1.4
VACINAS CONTRA HPV
As VLPs (viral like particles) são estruturas moleculares altamente
imunogênicas e quando injetadas em coelhos induzem a produção de títulos elevados
de anticorpos tipo-específicos. A descoberta de que a proteína L1 do HPV – expressa
em diversos sistemas como células eucarióticas, leveduras e bactérias– é capaz de
organizar-se em partículas de estrutura icosaédrica, semelhantes ao capsídeo viral,
tornando-se assim uma VLP, porém sem o DNA do vírus, possibilitou o avanço do
conhecimento sobre a imunogênese do HPV e a perspectiva de desenvolver vacinas
profiláticas (CAMARA et al., 2008; ROSA et al., 2009).
A escolha dos tipos de HPV a serem usados para a produção de VLPs para
vacinas contra HPV depende fundamentalmente do conhecimento da prevalência dos
diversos genótipos em diferentes populações sintomáticas e assintomáticas. Em 99%
das neoplasias malignas cervicais encontram-se porções de DNA do HPV de alto risco
oncogênico em seus cromossomos, sendo os principais o HPV 16, seguidos pelos
tipos 18, 45 e 31. Diante desses dados, a prevenção primária do câncer do colo uterino
é de fundamental importância (NADAL et al, 2006, 2008; LINHARES & VILLA, 2006;
ZARDO, 2014).
As duas vacinas profiláticas desenvolvidas através de tecnologia recombinante
e aprovadas pelo Food and Drug Administration (FDA)- Gardasil® (Merck&Co) e
Cervarix™ (GlaxoSmithKline), utilizam partículas de L1 viral especificas na produção
de anticorpos contra genótipos do HPV, e podem impedir o desenvolvimento da
infecção. A Cervarix® é uma vacina profilática bivalente e possui VLPs dos HPV 16 e
18; a Gardasil™, profilática quadrivalente, apresenta as VLP para os tipos de HPV
6,11,16 e 18; ambas contêm adjuvantes que incluem o hidróxido de alumínio.
Adjuvantes baseados em sais de alumínio induzem respostas imunes prolongadas
com menor dose de antigénio assim como promovem uma resposta imune 60-100
vezes superior à da infecção natural (BRAGA,2014). Para a produção das duas
vacinas foi utilizada tecnologia de DNA recombinante na produção das partículas
virais L1 em levedo de Saccharomyces cerevisae sendo, portanto, seguras, pois são
constituídas por partículas não infecciosas (BAZAN, 2007).
45
Estas duas vacinas, utilizadas em vários países atualmente, têm demonstrado
uma redução significativa na incidência de infecções persistentes pelo HPV,
apresentando-se seguras, bem toleradas e altamente imunogênicas. Estudos
apontam a vacina contra HPV como método profilático eficaz diante do câncer
cervical, em virtude de a citologia oncótica possuir algumas limitações, como baixa
sensibilidade, baixo valor preditivo positivo e baixa reprodutibilidade (ARAÚJO et al.,
2013).
As experiências realizadas em mulheres entre 16 e 26 anos de idade, em um
período de 42 meses, comprovaram que a vacina quadrivalente apresenta alta
eficácia profilática contra as lesões de baixo grau assim como no aparecimento de
condilomas, sendo essa proteção mantida por até quatro anos. A vacina quadrivalente
foi aprovada pelo FDA para mulheres entre 9 e 26 anos entretanto é recomendada
para jovens entre 11 a 12 anos de idade, idealmente antes da iniciação sexual
(NADAL, 2008). É aceitável em mulheres até 26 anos embora sua eficiência diminua
com o aumento da idade; é necessário o uso de três doses para a adequada
imunização (MASSAD et al., 2009).
Frente à alta prevalência de infecções múltiplas pelo HPV, a vacinação antes
da exposição sexual feminina poderá reduzir em até 70% a taxa de prevalência dessas
infecções. Estudos longitudinais preveem que a imunização poderá também impactar
em uma redução de até 17% sobre as anormalidades citológicas em todo o mundo
incluindo as ASC-US (8%), LSIL (23%) e HSIL (45%) (SCHIFMAN et al., 2007;
MASSAD et al., 2009).
Em estudo recente foi evidenciado que a janela de eficácia da vacina é mais
elevada antes do início da atividade sexual, por isso esse processo deve ser
estabelecido através de ações educativas e do vínculo construído entre profissionais
de saúde, pais e adolescentes. Um programa de vacinação contra o HPV tem grande
valor principalmente em países em desenvolvimento, onde ocorrem cerca de 80% dos
casos de câncer cervical. Atualmente, no Brasil, a prevenção do câncer de colo do
útero que ficava no âmbito da prevenção secundária, com a introdução da vacinação
em questão na rotina do Programa Nacional de Imunização (PNI), alcançou também
o âmbito da prevenção primária e apresenta um calendário vacinal iniciado neste ano
de 2014 (BRASIL, 2014).
46
Considerando a introdução dessa vacina na rotina do PNI, no Brasil, é
importante analisar aspectos técnicos, operacionais e os recursos envolvidos para
iniciar e manter o programa de imunização sem interrupção. Assim, sua incorporação
requer a realização de estudos de avaliação de resultados obtidos com a sua adição
e compará-los com os benefícios da estratégia da imprescindível prevenção
secundária, que é o rastreamento de Lesões Intraepiteliais Escamosas (SIL) pelo
exame citopatológicos.
47
2 JUSTIFICATIVA DO ESTUDO
Considerando ser Brasil um país com elevada desigualdade social e
econômica, o mesmo apresenta portanto, elevada incidência para o câncer cervical
com destaque para as regiões Norte e Nordeste e, de acordo com manifestações do
INCA, ainda não foi capaz de reduzir as taxas de mortalidade pelo câncer do colo do
útero nestas regiões. Os tratamentos atuais oferecidos de imediato são mais
direcionados a tratar lesões causadas por HPV na forma de verrugas e lesões em colo
do útero do que propriamente para eliminar o vírus. O diagnóstico tardio ainda é
frequente e possivelmente encontra-se relacionado às dificuldades da população
feminina ao acesso aos serviços e programas de saúde, à baixa captação de recursos
humanos envolvidos na atenção oncológica, à incapacidade do sistema de saúde para
absorver a demanda populacional e a dificuldade de gestores municipais e estaduais
em estabelecer um fluxo assistencial hierarquizado e contínuo nos diversos níveis de
atenção (BRASIL, 2006b).
Na Região Norte, o estado do Pará, localizado na porção oriental da Amazônia
Brasileira, apresenta elevada incidência do câncer do colo do útero (Figura 10). Esta
região apresenta, para o ano de 2014 uma estimativa de 830 novos casos e destes,
260 a ocorrer na capital do estado, Belém, e outros 570 a ocorrerem nos diversos
municípios do estado (BRASIL, 2014).
Figura 10: Representação da taxa bruta de incidência por 100 mil mulheres
para novos casos de câncer do colo do útero, estimada para o estado do Pará,
para o ano de 2014. Fonte: http://www.inca.gov.br/estimativa/2014/mapa.asp?ID=5
48
Neste contexto este estudo foi elaborado com a intenção de determinar a
prevalência da infecção pelo HPV em mulheres sexualmente ativas, na cidade de
Marabá, no estado do Pará, assim como verificar a correlação desta infecção com os
fatores de risco associados à aquisição da infecção pelo HPV e ao desenvolvimento
do câncer do colo do útero. Espera-se que os achados possam contribuir para uma
melhor compreensão e elaboração de políticas públicas voltadas à saúde das
mulheres, principalmente na região amazônica do país, de maneira a promoverem a
redução da morbimortalidade pelo câncer cervical considerando que esta neoplasia
apresenta um elevado potencial de prevenção e cura se detectada precocemente.
49
3 OBJETIVOS
3.1 OBJETIVOS GERAIS
Descrever a ocorrência da infecção genital pelo HPV e os possíveis fatores de
risco associados, em mulheres que, num período de cinco meses, compareceram ao
Centro de Referência Integrado à Saúde da Mulher (CRISMU), para o rastreamento
precoce do câncer do colo do útero, no ano de 2014, no município de Marabá, no
estado do Pará.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Determinar a prevalência da infecção genital por meio da detecção do DNA
do HPV pela técnica da PCR;

Traçar o perfil epidemiológico para todo o grupo estudado;

Verificar e analisar, para todo o grupo estudado, história de antecedentes de
infecção pelo HPV;

Determinar a frequência de citologias com atipias celulares em amostras
cervicais colhidos durante a pesquisa;

Correlacionar as variáveis clinicas e sócio comportamentais com os grupos
DNA HPV (+) e citologia com atipias celulares;

Determinar os genótipos de HPV incidentes na população do estudo.
50
4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 TIPO DE ESTUDO
Foi realizado um estudo observacional descritivo, analítico, do tipo transversal.
Neste estudo, as amostras cervicais assim como os dados clínico-epidemiológicos
foram obtidas em um único momento.
4.2 POPULAÇÃO DO ESTUDO
A cidade de Marabá planeja tornar-se importante polo siderúrgico do aço e
referência como porto hidroviário com a implantação da hidrovia do Tocantins.
Localiza-se a 654 km de Belém, capital do estado do Pará e apresenta uma população
estimada em 2013 em 251.885 mil habitantes e destas 115.457 mil somente para o
sexo feminino (IDESP, 2013). A população do estudo foi composta de mulheres com
situação domiciliar na zona urbana e rural deste município e que buscaram
espontaneamente o serviço público de atenção à saúde da mulher com o objetivo de
realizar o exame de prevenção de câncer do colo do útero (PCCU), oferecido pelo
CRISMU, unidade da rede de saúde pública, na cidade de Marabá-Pa, Brasil, num
período de cinco meses, no ano de 2014.
4.3 CÁLCULO DA AMOSTRA
Para realizar este estudo foi coletada uma amostragem aleatória, entre a
população de mulheres atendidas no CRISMU. No período da coleta houve um
comparecimento de 370 mulheres que estavam completamente adequadas aos
critérios de inclusão e exclusão estabelecidos para este estudo. A partir daí foi
utilizada a técnica amostral de Cochran (1977), considerando um grau de confiança
de 95% sob o pressuposto de um erro amostral máximo 5% para uma população finita
a qual resultou no tamanho amostral de n=191 mulheres.
51
4.4 INSTRUMENTOS DA PESQUISA
A coleta das informações e amostras cervicais ocorreu apoiada no
instrumento legal Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE) conforme
APENDICE A e em um questionário clínico-epidemiológico semiestruturado conforme
APENDICE B, este adaptado pela pesquisadora baseado em modelos utilizados em
estudos epidemiológicos diversos disponíveis em literatura científica sobre
investigações epidemiológicas da infecção pelo HPV. As usuárias do serviço de
saúde eram recebidas pela equipe de enfermagem, previamente treinada pela
pesquisadora sobre a metodologia da pesquisa. Eram esclarecidas previamente sobre
os objetivos da pesquisa ao mesmo tempo em que recebiam informações sobre
prevenção do câncer do colo do útero e sua associação com a infecção pelo HPV e a
seguir eram convidadas a participar como voluntárias. A elas era dada a oportunidade
de realizar perguntas livres sobre o tema. Às mulheres voluntárias, e adequadas aos
critérios de inclusão, era solicitada a leitura e assinatura do TCLE. A partir de então
lhes era aplicado um questionário clínico-epidemiológico. O ambiente do atendimento
ocorreu de forma a garantir tranquilidade e lhes propiciasse o sigilo das respostas.
4.4.1 Critérios de Inclusão

Mulheres com idade entre 18 e 75 anos.

Realizar a leitura, compreender, ser esclarecida nas dúvidas e assinar o
TCLE. Se iletrada, deve ouvir a leitura e demonstrar compreensão sobre os
termos lidos.

Deve concordar em responder ao questionário proposto na pesquisa.

Ter funções cognitivas preservadas no momento da coleta das informações
contidas no questionário.

Ter útero e/ou colo preservado.

Ter vida sexual iniciada.

Obtenção de laminas com esfregaço satisfatório para análise citológica.

Obtenção de amostra cervical com viabilidade de DNA para testes
moleculares.
52
4.4.2 Critérios de Exclusão

Mulheres com idade inferior a 18 anos e superior a 75 anos.

Recusa em assinar o TCLE.

Recusa em responder ao questionário do estudo.

Referir gravidez ou amamentação no período da coleta cervical.

Apresentar deficiência mental ou déficit cognitivo.

Relatar qualquer história de distúrbio neurológico ou convulsões.

Esfregaço cervical inadequado para leitura citológica.

Amostra cervical com inviabilidade de DNA para testes moleculares.
4.5 VARIÁVEIS DO ESTUDO
Para a obtenção de informações clínicas e epidemiológicas sobre cada
participante aplicou-se um questionário (APENDICE B) este, baseado em modelos
utilizados em estudos epidemiológicos diversos disponíveis em literatura científica
sobre investigações epidemiológicas da infecção pelo HPV. Obtiveram-se então
dados sobre as seguintes condições:

Sóciodemográficas.

Comportamental sexual.

História de uso de Contraceptivo Hormonal.

História de Gravidezes e paridades.

Tabagismo.

Frequência da realização de PCCU.

Informações sobre citologias anteriores alteradas e não alteradas.

Antecedentes ginecológicos envolvendo ou não intervenções médicas sobre
patologias na genitália externa e cérvice uterina.

História de realização sorológica para doenças infectantes virais, em especial
para HIV.
53
4.6 COLETA E PROCESSAMENTO DAS AMOSTRAS
4.6.1 Coleta de amostras para citologia oncótica
Num período de cinco meses, no ano de 2014 foram coletadas 191 amostras
cervicais de mulheres que compareceram voluntariamente para realizar o exame
preventivo do câncer do colo do útero, no serviço de saúde CRISMU, na cidade de
Marabá, no estado do Pará. As coletas cervicais foram realizadas sob controle visual,
após colocação de um espéculo vaginal estéril, com esfoliação da ectocérvice
utilizando-se uma espátula de madeira do tipo Espátula de Ayre num movimento
giratório de 360º em torno do orifício cervical. O material era rapidamente distendido
horizontalmente em até um terço do espaço livre de uma lâmina de microscopia. A
seguir era utilizada uma escovinha com cerdas de nylon (citobrush) estéril, introduzida
delicadamente no canal endocervical realizando-se movimentos de rotação completa
a fim de captar células da JEC, ricas em células proliferativas de transição. A citobrush
era então rolada sobre os dois terços restantes da lamina a fim de depositar as células
obtidas.
As coletas ocorreram de forma extremamente cuidadosa, conforme
procedimento operacional padronizado em treinamento considerando ser esta uma
importante etapa para a obtenção de amostragem celular de qualidade. As lâminas,
fixadas em álcool etílico a 95 % eram encaminhadas ao laboratório de citologia do
CRISMU juntamente com formulários próprios do serviço e destinavam-se à coloração
pela técnica de Papanicolaou seguida de leitura citológica por profissional habilitado
e qualificado disponível no serviço de saúde municipal. Foi realizada análise de
adequabilidade de cada amostra e os resultados citológicos foram expressos na forma
descritiva, adotando-se a nomenclatura brasileira para laudos citopatológicos
cervicais.
54
4.6.2 Coleta de amostras para testes moleculares
Para a coleta de amostra cervical destinada ao fornecimento de DNA para os
testes biomoleculares, após a realização do esfregaço celular para exame citológico,
a escova cervical (citobrush) contendo ainda grande quantidade de material celular,
era submersa em um microtubo estéril, contendo 1 ml de tampão PBS (solução salina
tamponada com fosfato), a seguir era agitado suavemente a fim de provocar
desprendimento das células aderidas às cerdas da escova. Após esse procedimento
os microtubos, dispostos em estantes, eram armazenados em freezer a -20ºC. Para
a logística do transporte foi estabelecida uma parceria entre a pesquisadora e os
profissionais responsáveis pelo transporte terrestre e aéreo de amostras biológicas do
Hemocentro Coordenador de Marabá, no qual foi seguido um rigoroso protocolo para
o transporte das amostras, via aérea, em containers de parede resistente contendo
gelo reciclável. Após a chegada em Belém, as mesmas eram imediatamente
encaminhadas ao Laboratório de Imunopatologia do Núcleo de Medicina Tropical da
Universidade Federal do Pará (NMT/UFPA), juntamente com o TCLE e o questionário
clínico-epidemiológico, para o processamento e extração de material genômico que
permitisse a realização de testes biomoleculares.
4.6.3 Extração de DNA
Todas as amostras obtidas do escovado cervical e mantidas congeladas a 20ºC em tampão PBS foram submetidas à extração de DNA conforme protocolo
estabelecido pelo Laboratório de Imunopatologia do NMT/UFPA. Neste protocolo as
etapas de lise celular e digestão de proteínas são realizadas conforme se segue: em
um microtubo de 1,5ml contendo 200µl de esfoliado celular adiciona-se 20µl de
Proteinase K e 20µl de RNase A, realiza agitação em vortex por 15” e repousa a
suspensão a TA por 2’; adiciona-se 200µl de Tampão de Lise, homogeneíza e incuba
em BM a 55ºC por 10’; adiciona-se 200µl de etanol absoluto, leva para agitação em
vortex para completar a lise celular, transfere o volume para uma coluna de filtragem
contendo filtro de sílica e centrifuga, repetindo o processo. Prossegue com a lavagem
55
do extrato retido na coluna de filtragem com adição de tampão de lavagem 1 e 2 em
concentrações diferentes. Finalizando, o extrato retido em filtro é eluído com água
Milli-Q ultrapura. Obtém-se então alíquotas de DNA purificado porém inespecífico,
para cada amostra inicial sendo estas armazenadas a -20ºC para os testes
moleculares seguintes.
Como controle da extração do DNA foi realizado para cada amostra, uma
reação de amplificação em cadeia da polimerase, a PCR, utilizando-se um par de
oligonucleotídeos iniciadores que amplificam o gene da globina (β-globina) que se
encontra presente normalmente em células humanas. Ao final da reação, a presença
de amplicons da globina em segmentos de DNA de 269 pb, visualizada em
eletroforese em gel de agarose, monitora e confirma a amplificação in vitro do DNA,
atestando sua qualidade e suficiência, condições que viabilizam a eficácia dos testes
moleculares (NONNENMACHER et al., 2002).
4.6.4 Detecção do DNA do HPV pela PCR
Após a constatação da suficiência do DNA extraído prosseguiu-se com a
testagem biomolecular realizando-se uma PCR ou PCR 1, para detecção do DNA do
HPV conforme protocolo estabelecido no laboratório de Imunopatologia, utilizando os
oligonucleotídeos degenerados: MY09: 5’ ... CGTCCMAARGGAWACTGATC... 3’ e
MY11: 5’ ...GCMCAGGGWCATAAYAATGG... 3’ descritos por Manos et al.(1989).
Estes primers, MY09/MY11, amplificam um fragmento de 450 pb da região de
transcrição tardia, a L1, a qual constitui-se na região mais conservada e comum do
genoma viral do HPV e que codifica proteínas do capsídeo.
Na realização da PCR1, para um volume final de 25ul submeteu-se cada
extrato de DNA ao seguinte protocolo: para 2ul de DNA adiciona-se 23µl de um mix
produzido comercialmente (12,5µl de Go Taq® Green + 1 µl de primer MY 09/11+
9,5µl de H²0 Ultra Pura). Esse mix contem além do primer, a Taq-polimerase, dNTPs
e MgCl² em concentrações ideais para a amplificação dos moldes de DNA.
56
As reações ocorreram em um termociclador Mastercycler da Eppendorf onde
eram submetidas à seguinte ciclagem: ciclo de desnaturação inicial a 94ºC durante 5’;
a seguir, 35 ciclos de amplificação (etapa de hibridação dos primers e extensão da
Taq-polimerase) sendo que cada um destes consistiu de 30” a 94ºC, 30” a 52ºC e 30
segundos a 72ºC; a extensão final do DNA amplificado ocorreu por 5 minutos a 72ºC
e a reação estabilizou-se a 4ºC. Juntamente a cada conjunto de amostras submetidas
à PCR foram ensaiadas amostras controle positivo de reações que apresentam
fragmento de 450pb; como controle negativo utilizou-se substancia isenta de DNA,
como controle positivo amostra DNA HPV (+) do banco de amostras do laboratório.
Seguindo-se à PCR 1, o produto amplificado foi disposto em gel de agarose a
1,5%, utilizando-se tampão TAE 1x (TAE 50x solução de estoque: Tris Base 1,6M,
Acetato de Na 0,8M e EDTA-Na² 40mM/100ml de água deionizada) preparado com
adição de corante brometo de etídio. As bandas de DNA migraram na extensão do
gel, numa cuba de eletroforese e foram visualizadas mediante a utilização do Geliance
200 (Gel Imaging System), um transiluminador com fonte de luz ultravioleta, e
capturadas por fotografia através do software GeneSnap. Observam-se nessa etapa
bandas moleculares que, comparadas com bandas de peso molecular conhecido
atestam a positividade do teste comprovando-se assim a presença de DNA do HPV,
de forma inespecífica.
A baixa positividade para DNA do HPV resultante da PCR 1 pode ser
explicada por falhas de amplificação, por ineficiência de primers ou decorrente de um
erro de extração de DNA o que resulta em falso- negativos. Para algumas amostras
realizou-se nova extração de DNA.
Nesta pesquisa teria sido conveniente a
realização da técnica Nested-PCR que é realizada a partir do produto da PCR 1 e
aumenta o grau de especificidade da técnica. Nela utilizam-se os primers GP5+/GP6+
que amplificam 140 a 150 pb da L1, atingindo a região mais interna do genoma viral
do HPV, nas amostras que apresentam resultados negativos frente aos primers de
consenso MY09/MY11 (RODA HUSMAN et al., 1995).
Aos produtos das PCR que se apresentaram DNA HPV (+) foi aplicado uma
segunda PCR ou PCR 2, realizada pela PCR em Tempo Real onde foram utilizados
sequencias iniciadoras específicas ou sondas para amplificar regiões específicas dos
genes E6 e E7 para cada subtipo pesquisado: HPV 6 e11 de baixo risco oncogênicos
57
e HPV16,18,31,33,35,52 e 58, classificados como de alto risco oncogênicos. Assim
foram determinados os tipos existentes nestas amostras, entretanto encontrou-se uma
frequência de amostras DNA HPV (+) que não amplificaram sequencias específicas
frente a estes oligonucleotídeos e, portanto na análise estatística foram agrupadas
como positivas para outros tipos não testados.
5 PROCESSAMENTO E ANÁLISES DE RESULTADOS
Foi criado um banco de dados no software Access 2010 para inserir as
informações clínicas e epidemiológicas obtidas com a aplicação do questionário
(APENDICE B). Após, o conjunto das informações foi transferido para uma planilha
do software Excel 2010 para análise e geração de tabelas e gráficos. Nesta etapa foi
realizada análise bivariada das frequências absolutas e relativas das informações
compiladas utilizando-se o software Bio Estat 5.0.
Também foram realizados cálculos das razões de prevalência (ORp) com
intervalo de confiança (IC) de 95%. As significâncias estatísticas foram verificadas
pelo teste do Qui-quadrado ou exato de Fischer com um nível de concordância alfa
de 0,05 além do teste de Kappa para análise de concordâncias (AYRES et al., 2007).
Para uma investigação mais detalhada dos resultados da pesquisa as
participantes foram agrupadas em: mulheres com história de antecedentes de
infecção pelo HPV, mulheres com citologia atual sem atipias celulares, mulheres com
citologia atual com atipias celulares, mulheres com DNA HPV (+) e mulheres com DNA
HPV (-), além do grupo geral. As variáveis epidemiológicas mais exploradas para
estes grupos foram: idade, idade da sexarca, multiplicidade de parceiros sexuais,
multiparidade, frequência de PCCU, uso de preservativo, uso de contraceptivo
hormonal oral e tabagismo.
58
6 VIABILIDADE E ASPECTOS ÉTICOS
Este projeto de pesquisa apresentou condições favoráveis para seu
desenvolvimento em decorrência da parceria obtida junto a Prefeitura Municipal de
Marabá / Secretaria Municipal de Saúde para a coleta das amostras no serviço de
atenção à saúde da mulher, pela disponibilização dos materiais e profissionais para a
efetivação da coleta e dos testes de citologia.
Da mesma forma houve a parceria com o Laboratório de Imunopatologia do
Núcleo de Medicina Tropical da Universidade Federal do Pará através de seus
professores pesquisadores que disponibilizaram equipamentos e reagentes para a
realização dos testes moleculares para o agente infeccioso foco desta pesquisa, pois
este se integra a outros projetos para investigação epidemiológica da infecção pelo
HPV na região amazônica do Brasil conduzidos por este centro de pesquisa. A
logística envolvida na coleta e transporte de amostras ocorreu de responsabilidade da
pesquisadora titular do projeto.
Em observância à Resolução CNS/MS nº 466, de 12 de dezembro de 2012,
que regulamenta a pesquisa envolvendo seres humanos, o presente projeto esteve
inserido no sistema Plataforma Brasil sob nº 18287213.0.0000.5172 e foi submetido à
avaliação pelos membros do Comitê de Ética em Pesquisa do Núcleo de Medicina
Tropical da Universidade Federal do Pará tendo sido aprovado em 14 de Fevereiro de
2014.
Como parte da documentação prevista nesta legislação, elaborou-se um Termo
de Consentimento Livre e Esclarecido-TCLE (APENDICE A) em linguagem simples a
fim de orientar os pacientes sobre os procedimentos da coleta de amostra cervical e
desconforto que poderiam sentir assim como os riscos e os benefícios em participar
da pesquisa. Foi esclarecido às participantes sobre a garantia do anonimato e respeito
à participação ou não nesta pesquisa. A anuências das mesmas foi obtida através da
assinatura do TCLE. Somente após o cumprimento destas legalidades, realizava-se a
entrevista com o preenchimento de um questionário clínico-epidemiológico
(APENDICE B) seguido da coleta das amostras cervicais.
59
7 RESULTADOS
7.1 ANÁLISES DESCRITIVAS DAS VARIÁVEIS CATEGÓRICAS PARA TODO O
GRUPO ESTUDADO
O presente estudo avaliou dados de 191 mulheres. A média da idade das
participantes da pesquisa foi de 34,2± 9,6 para uma a idade mínima de 18 e máxima
de 61 anos. Ao se analisar o perfil sócio demográfico das participantes em geral,
obteve-se as seguintes informações: 25,1% (48/191) eram solteiras enquanto que
68,6% (131/191) eram casadas ou possuíam união estável; 94,3% (180/191)
possuíam o ensino médio ou fundamental e apenas 5,2% (10/191) possuíam o ensino
superior. A maioria (62%) declarou-se com renda mensal de um salário mínimo
(119/191); duas (1,0%) com renda superior a 6 salários mínimos (Tabela 1).
Tabela 1- Distribuição das variáveis sóciodemográficas em mulheres (n=191) rastreadas para
o câncer cervical no CRISMU, no período de Janeiro a Maio de 2014, na cidade de MarabáPA.
Variáveis Sóciodemográficas
Grupo geral
n
%
Idade
18 a 29 anos
63
33,0
30 a 39 anos
74
38,7
40 a 49 anos
37
19,4
≥ 50 anos
17
8,9
Estado Civil
Solteira
48
25,1
Casada/ União Estável
131
68,6
Separada/Divorciada/Viúva
12
6,3
Escolaridade
Iletrada
1
0,5
Fundamental/Médio
180
94,3
Superior
10
5,2
Renda Mensal
Sem renda
1
0,5
1 SM
119
62,4
2 a 3 SM
60
31,4
3 a 4 SM
9
4,7
>6 SM
2
1,0
Situação Domiciliar
Marabá Zona Rural
10
5,2
Marabá Zona Urbana
178
93,2
Outra Cidade
3
1,6
*p-valor <0,0001, tendência pelo teste do Qui-quadrado de aderência.
Tendência
p-valor
<0,0001*
<0,0001*
<0,0001*
<0,0001*
<0,0001*
60
Em continuidade à análise da tabela 1, quanto à situação domiciliar, 93,5 %
(178 /191) residiam na zona urbana de Marabá, 5,2% (10/191) na zona rural e 1,6%
(3/191) estavam de passagem pela cidade. Em relação ao local de habitação, os
resultados evidenciaram uma tendência altamente significante para residência
habitual na zona urbana de Marabá (93,2%).
Quanto às variáveis comportamentais distribuídas na tabela 2, a média de
idade para o início da vida sexual foi de 16,4±2,8 com uma mediana de 16 anos. Um
quantitativo de 171 mulheres (89,3%) relatou possuir vida sexual ativa enquanto que
20 mulheres declararam relacionar-se sexualmente de forma esporádica. Quanto à
estabilidade do parceiro sexual, houve uma tendência ao parceiro fixo onde 83,3%
(159/191) informaram possuir um único parceiro, 9,4% (18/191) declararam uma
variação de 2 a 3 parceiros e apenas 2,1% (4/191) relataram possuir mais de 4
parceiros. Em relação à quantidade de novos parceiros nos últimos doze meses,
também 2,1% (4/191) sinalizaram positivamente.
A média da idade gestacional foi de 18,9±4,2 com uma mediana de 18 anos. A
tabela 3 demonstra que 42,5% (81/191) engravidaram de 2 a 3 vezes e 25,1% (48/191)
tiveram mais de 4 gestações. A quantidade de partos transpélvicos predominou em
67,5% (129/191) das participantes com uma variação de 1 a 4 partos. A ocorrência de
abortos foi observada em 30,9% (59/191) das mulheres dentre estas 7,9% (15/191)
relataram ter tido entre 2 a 3 abortos enquanto que 3 participantes (1,6%) tiveram mais
4 abortos. Quanto ao uso de contraceptivo hormonal na forma oral 46,6% (89/191)
relataram uso por tempo longo, porém não quantificado na pesquisa. Com relação ao
tabagismo 23% (44/191) relataram que abandonaram o hábito de fumar enquanto que
7,9% (15/191) fumam atualmente em torno de uma carteira ao dia. Houve um
predomínio de mulheres não fumantes (69,1%).
61
Tabela 2 - Distribuição das variáveis comportamentais em mulheres (n=191) rastreadas
para o câncer cervical no CRISMU, no período de Janeiro a Maio de 2014, na cidade de
Marabá-Pa.
Variáveis Comportamentais
Grupo geral
n
%
Idade do início da vida sexual
10 a 14 anos
15 a 17 anos
18 a 21 anos
22 a 30 anos
Vida sexual ativa
Não
Sim
Nº de Parceiros sexuais na vida
Nenhum
Somente 1
2a3
≥4
Novos parceiros em 12 meses
Nenhum
Somente 1
2a3
≥4
Idade da 1ª Gestação
10 a 14 anos
15 a 17 anos
18 a 21 anos
22 a 37 anos
Não teve gestação
Nº de Gestações
Sem gestação
Somente 1
2a3
≥4
Nº de Abortos
Nenhum
Somente 1
2a3
≥4
Nº de Partos Transpélvicos
Nenhum
Somente 1
2a3
≥4
Nº de Partos Cesáreos
Nenhum
Somente 1
2a3
Uso prolongado de Contraceptivo oral
Sim
Não
Tabagismo
Fumou no passado
Fuma menos 1 carteira
Fuma 1 carteira ou mais
Nunca fumou
*Qui-quadrado de aderência.
Tendência
p-valor
<0,0001*
46
92
45
8
24,1
48,2
23,5
4,2
20
171
10,5
89,5
10
159
18
4
5,2
83,3
9,4
2,1
165
7
15
4
84,3
3,7
7,9
2,1
16
51
59
38
27
8,4
26,7
30,9
19,9
14,1
27
35
81
48
14,1
18,3
42,5
25,1
132
41
15
3
69,1
21,4
7,9
1,6
62
39
64
26
32,5
20,4
33,5
13,6
139
30
22
72,8
15,7
11,5
89
102
46,6
53,4
<0,0001*
<0,0001*
<0,0001*
<0,0001*
<0,0001*
<0,0001*
<0,0001*
<0,0001*
0,3852
<0,0001*
44
11
4
132
23,0
5,8
2,1
69,1
62
Dando um melhor direcionamento aos resultados laboratoriais obtidos assim
como correlacioná-los com as variáveis epidemiológicas investigadas as participantes
do estudo foram agrupadas conforme se segue: mulheres com história de
antecedentes de infecção pelo HPV (n=40), mulheres com citologia atual sem atipias
celulares (n=180), mulheres com citologia atual com atipias celulares (n=11), mulheres
com DNA HPV (+) (n=9) e mulheres com DNA HPV (-) (n=182).
7.2 DISTRIBUIÇÃO PERCENTUAL DAS MULHERES COM HISTÓRIA DE
ANTECEDENTES DE INFECÇÃO PELO HPV
Para o grupo total estudado evidenciou-se que 20,9% (40/191) mulheres
apresentavam registros em seus prontuários de antecedentes de infecção pelo HPV.
Estas informações foram estratificadas e demonstradas na figura 11: 15% (6/40) com
citologia anterior com LSIL com sinal citopático do HPV, 5% (2/40) com antecedente
de ASC-US; 40% das participantes (16/40) possuíam registros de procedimentos de
cauterização de verrugas externas e/ou de colo uterino assim como 37,5% (15/40)
haviam realizado biopsia de lesão pré-neoplásica; apenas 2,5% (1/40) com registro
de procedimento de conização (CAF). Estas observações apontam para 40 pacientes
que se encontravam em seguimento conforme protocolo clínico do serviço.
Figura 11: Distribuição de citologias anteriores alteradas e procedimento médicos
sugerindo história antecedente de infecção pelo HPV (n=40), registrados em
comparecimentos anteriores em mulheres rastreadas para o câncer cervical no
CRISMU, no período de Janeiro a Maio de 2014, na cidade de Marabá-PA.
63
Objetivando investigar situações de coinfecção entre o HIV e o HPV foi
solicitado às entrevistadas informações sobre realização de teste sorológico para HIV
verificando-se que 58,6% (112/191) o haviam realizado pelo menos uma vez em suas
vidas não tendo sido relatado positividade em nenhum deles. Embora para a pesquisa
esta informação não apresente significância estatística, pela forma da abordagem
pode ter promovido reflexões nas participantes sobre outras doenças virais
sexualmente transmissíveis.
7.3 ANÁLISE DAS VARIÁVEIS CATEGÓRICAS PARA AS MULHERES QUE
APRESENTARAM ATIPIAS CELULARES
Sobre a análise citomorfológica para o rastreamento de lesões intraepiteliais
pré-neoplásicas, do total examinado 94,24% (180/191) foram classificadas como
dentro dos limites da normalidade onde se incluem alterações benignas reativas ou
reparativas para o conjunto de laminas normais e Inflamatórias. Encontrou-se uma
prevalência de 5,8% (11/191) de esfregaços cervicais que apresentaram atipias
celulares. Observou-se neste grupo uma tendência para o ASC-US com 66,6% (6/11),
seguida de 44,4% (4/11) como LSIL e 11,1% (1/11) como ASC-H conforme detalhado
na figura 12. Do total das amostras analisadas nenhum esfregaço cervical apresentouse inadequada para a citologia.
Figura 12: Distribuição da classificação citomorfológica para os esfregaços
cervicais com atipias celulares (n=11) em mulheres rastreadas para o
câncer cervical no CRISMU, no período de Janeiro a Maio de 2014, na
cidade de Marabá-PA.
64
Dentre as mulheres agrupadas com ausência de atipias celulares (N=180) as
variáveis epidemiológicas foram detalhadas na tabela 3 onde se observou que a
maioria (70,6%) encontrava-se em idade reprodutiva, correspondendo ao intervalo de
18 a 29 anos; 93,9% eram casadas ou possuíam união estável (169/180) e somente
5% (9/180) declarou possuir o ensino superior. No que se refere às variáveis
comportamentais, verificou-se que 71,1% iniciaram a vida sexual entre 10 e 17 anos;
todas se declararam sexualmente ativas, entretanto 19,4% informaram não possuir
parceiros fixos e 63,9 % (115/180) declararam que não utilizam preservativo no ato
sexual assim como 12,8% (23/181) referiram novos parceiros nos últimos doze meses.
O uso de contraceptivo foi relatado por quase metade das mulheres (45,6%). A
realização de PCCU com frequência habitual está disseminada na maioria do grupo
onde 88,90% (160/180) declararam ter realizado duas ou mais vezes em suas vidas.
Sobre as mulheres que apresentaram citologia com atipias celulares (ASCUUS, ASC-H, LSIL), detalhadas ainda na tabela 3 observou-se uma forte tendência para
a faixa etária de 18 a 29 anos (90,9%) e também para o início precoce das atividades
sexuais com 81,8% (9/11) com sexarca entre os 10 e 17 anos. Com relação situação
conjugal 90,9% (10/11) possuíam união estável ou eram casadas sendo que estas
informações apresentaram significância estatística para o risco de desenvolver lesões
pré-neoplásicas; 4 mulheres (36.4%) declaram-se possuir mais de um parceiros e 3
(27,3%) declaram novos parceiros nos últimos doze meses ; 63,6% (7/11) não utilizam
preservativos no ato sexual. Com relação ao uso de contraceptivos hormonais por
tempo prolongado 63,6% (7/11) referiram uso, o tabagismo não apresentou nenhuma
significância estatística, pois 90,9% (10/11) declararam-se não fumantes. Como
informação relevante, porém também sem significância estatística, 81,8% (9/11) havia
realizado mais de 4 exames preventivo de colo de útero em suas vidas. Após
aplicação do teste do Qui- quadrado e teste exato de Fisher, o p-valor destas variáveis
não foi significante, logo, essas variáveis, à exceção da situação conjugal, não
apresentaram real correlação com a presença de atipias celulares.
65
Tabela 3 - Distribuição das variáveis epidemiológicas quanto à citopatologia com atipias
celulares (n=11) em mulheres rastreadas para o câncer cervical no CRISMU, no período
de Janeiro a Maio de 2014, na cidade de Marabá-PA.
Citologia x Atipias Celulares
VARIÁVEIS EPIDEMIOLÓGICAS
Presentes
Ausentes
n
%
n
%
18 a 29 anos
8
27,3
127
70,6
30 anos ou mais
3
72,2
53
29,9
Idade
Estado Civil
Solteira/Separada/Divorciada/Viúva
3
27,3
11
6,1
Casada/União Estável
8
72,7
169
93,9
Escolaridade
Fundamental/Médio
10
90,9
171
94,4
Superior
1
9,1
09
5,0
Partos Normais
2 ou mais
8
72,7
121
67,2
Um ou nenhum
Uso prolongado de
Contraceptivo oral
3
27,3
59
32,8
Sim
7
63,6
82
45,6
Não
4
36,4
98
54,4
Tabagismo
Sim
1
9,1
14
7,8
Não
10
90,9
166
92,2
Idade início vida sexual
10 a 17 anos
9
81,8
128
71,1
18 anos ou mais
2
18,2
52
28,9
Sim (somente um)
7
63,6
145
80,6
Não
4
36,4
35
19,4
Parceiro sexual fixo
Novos parceiros em 12 meses
Sim
3
27,3
23
12,8
Não (nenhum)
8
72,7
157
87,2
Usa preservativo
Sim
4
36,4
65
36,1
Não
7
63,6
115
63,9
Nº de realização de PCCU
Este é o primeiro
2
18,2
20
OR¹
IC95%²
p-valor³
1,1
0,28 a 4,35
0,8514
5,76
1,33 a 24,7
0,0435*
1,48
0,16 a 12,14
0,8162
1,39
0,33 a 5,08
0,9626
2,09
0,59 a 7,39
0,3922
1,18
0,14 a 9,95
0,6744
1,82
0,38 a 8,74
0,6740
0,42
0,11 a 1,52
0,3340
2,55
0,63 a 10,3
0,3638
1,01
0,28 a 3,58
0,7593
1,77
0,35 a 8,81
0,8257
11,1
2 vezes ou mais
9
81,8
160
88,9
¹ ORp=Razão de Chances de Prevalência, ² IC 95%=Intervalo de confiança a 95%,³ Teste do Qui-quadrado ou
exato de Fisher (nível de significância=0,050).
66
Durante a análise das informações observou-se uma tendência para a
realização de modo frequente dos testes de detecção precoce do câncer do colo do
útero (PCCU) onde 58,3% (105/191) já o realizaram entre 4 a 10 ou mais vezes na
vida conforme se observa na tabela 4, entretanto, após aplicação do teste de
aderência estes dados não apresentaram significância frente ao risco de infecção pelo
HPV e desenvolvimento de câncer cervical.
Tabela 4 - Associação entre a frequência de realização de PCCU e os resultados
das citologias atuais coletadas em mulheres rastreadas para o câncer cervical no
CRISMU, no período de Janeiro a Maio de 2014, na cidade de Marabá-PA.
Frequência da realização do
PCCU durante a vida
Este é o primeiro
Realizou 2 a 3 vezes
Realizou 4 a 5 vezes
Realizou 6 a 10 vezes
Realizou Mais de 10 vezes
Total
Citologia sem
Atipias
celulares
n
%
20
55
45
31
29
180
90,9
96,5
93,8
93,9
93,5
94,2
Citologia
ASC-US
n
%
Citologia
LSIL
n
%
2
0
2
2
1
7
0
2
1
0
1
4
Obs.: Qui-quadrado de independência p-valor = 0,6061
9,1
0
4,2
6,1
3,2
3,7
0
3,5
2,1
0
3,2
2,1
Total
22
57
48
33
31
191
67
7.4 ANÁLISE DAS VARIÁVEIS CATEGÓRICAS PARA AS MULHERES QUE
APRESENTARAM DNA HPV (+)
Para todas as participantes, independente dos resultados das citologias, as
amostras com DNA viável foram submetidas a PCR, a fim de amplificar um
segmento da ORF L1 (450 pb) do HPV. A visualização do produto da PCR revelou
que das 191 amostras testadas nove amplificaram o segmento alvo, confirmando
positivamente presença de DNA específico do HPV, correspondendo a uma
prevalência de 4,7% para o grupo estudado.
No grupo DNA HPV (+), as variáveis estratificadas na tabela 5 demonstram
que a média da idade foi de 34.1±9.9 anos e não foi um fator diferenciador, pois
neste grupo houve tendência para idade 31.3±8.2 anos e no grupo DNA HPV (-)
houve tendência para a idade 34.7±9.8 anos, a diferença entre as idades foi
avaliada pelo teste t de Student e verificou-se que o p-valor =0.1097 não foi
significante. Observou-se que 66,7% eram casadas ou possuíam união estável,
situação esta a qual apresentou alta significância estatística para a aquisição da
infecção pelo HPV com p=0.0228 e Odds ratio igual a 7,08; 77,8% (7/9) tiveram o
início da vida sexual com idade entre 10 e 17 anos, 66,7% (6/9) mulheres declaramse possuir parceiros fixos, 22,2 % (2/9) referiram novos parceiros nos últimos 12
meses; 55,6% tiveram 2 ou mais partos transpélvicos. Com relação ao uso
prolongado de anticoncepcional oral 77,8% (7/9) referiram uso, porém com tempo
não quantificado na pesquisa. Na mesma proporção (77,8%) realizam com
frequência o exame preventivo do colo de útero. Somente uma participante deste
grupo declarou-se tabagista, portanto observa-se predomínio de não fumantes
(89,9%).
68
Tabela 5 - Distribuição das variáveis epidemiológicas em mulheres com DNA HPV (+) e DNA
HPV (-) mulheres rastreadas para o câncer cervical no CRISMU, no período de Janeiro a
Maio de 2014, na cidade de Marabá-PA.
Teste molecular - PCR
VARIÁVEIS
EPIDEMIOLÓGICAS
DNA HPV (+)
n
%
DNA HPV (-)
n
%
Idade
18 a 29 anos
5
55,6
129
70,9
30 anos ou mais
4
44,4
53
29,1
Estado Civil
Solteira/Separada/Divorciada/Viúv
a
3
33,3
12
6,6
Casada/União Estável
6
66,7
170
93,4
Fundamental/Médio
9
100,
0
170
94,5
Superior
0
0,0
10
5,4
2 ou mais
5
55,6
124
68,1
Um ou nenhum
Uso prolongado de
Contraceptivo oral
4
44,4
58
31,9
Sim
7
77,8
82
45,1
Não
2
22,2
100
54,9
Sim
1
11,1
14
7,7
Não
8
88,9
168
92,3
Escolaridade
Partos Normais
Tabagismo
Idade início vida sexual
10 a 17 anos
7
77,8
130
71,4
18 anos ou mais
2
22,2
52
28,6
Parceiro sexual fixo
Sim (somente um)
6
66,7
146
80,2
Não
3
33,3
36
19,8
Novos parceiros em 12 meses
Sim
2
22,2
24
13,2
Não (nenhum)
7
77,8
158
86,8
Sim
3
33,3
66
36,3
Não
7
66,7
116
63,7
Usa preservativo
Nº de realização de PCCU
Este é o primeiro
2
22,2
20
11,0
2 vezes ou mais
7
77,8
162
89,0
OR¹
IC95%²
p-valor³
0,51
0,13 a 1,98
0,5435
7,08
1,57 a 31,8
0,0228*
---
---
---
0,58
0,15 a 2,25
0,6731
4,26
0,86 a 21,1
0,1144
1,51
0,17 a 12,86
0,7929
1,40
0,28 a 6,69
0,9731
0,49
0,11 a 2,06
0,5748
1,88
0,36 a 9,59
0,7843
0,87
0,21 a 3,63
0,8597
2,3
0,44 a 11,91
0,6202
¹ ORp=Razão de Chances de Prevalência, ² IC95%=Intervalo de confiança a 95%,³ Teste do Qui-quadrado ou exato de Fisher (nível de
significância=0,05).
69
Reporta-se como importante informação, conforme figura 13, que dentre as
mulheres em seguimento encontrou-se persistência viral em 5% (2/40) confirmadas
nesta pesquisa pela detecção de DNA HPV em PCR, não tendo sido possível
identificar para estas amostras o tipo de HPV infectante.
Figura 13: Distribuição quanto à história de antecedentes de infecção pelo HPV e
persistência da infecção confirmada pelo PCR-DNA HPV (+) (2/40) em mulheres
rastreadas para o câncer cervical no CRISMU, no período de Janeiro a Maio de 2014,
na cidade de Marabá-PA.
7.5
ANÁLISE COMPARATIVA PARA A EFICIÊNCIA DO TESTE
CITOPATÓGICO PCCU E DO TESTE MOLECULAR PCR FRENTE
AOS RESULTADOS OBTIDOS NO DIAGNÓSTICO DA INFECÇÃO
PELO HPV
No que se refere à associação entre os resultados das análises
citomorfológicas (PCCU) com os resultados da PCR a frequência da concordância
entre as duas metodologias é demonstrada na tabela 6. Observa-se que somente uma
amostra (11,1%) apresentou concordância sendo esta avaliada pela aplicação do
teste Kappa, que resultou em p-valor = 0.2704, o qual não é significante, indicando
que existe apenas uma fraca concordância entre os dois métodos.
70
Tabela 6 - Concordância entre o resultado da Citologia e o resultado do PCR
em amostras cervicais de mulheres rastreadas para o câncer cervical no
CRISMU, no período de Janeiro a Maio de 2014, na cidade de Marabá-PA.
PCR
CITOLOGIAS
DNA HPV (+)
n
%
DNA HPV (-)
n
%
Total
Com Atipias
1
11,1
10
5,5
11
Sem Atipias
8
88,9
172
94,5
180
Total
9
100,0
*Teste de Kappa p-valor = 0.2704
182
100,0
191
7.6 DISTRIBUIÇÃO DOS GENÓTIPOS DO HPV DE ALTO E BAIXO RISCO
DETECTADOS EM AMOSTRAS DNA HPV (+)
Para o grupo DNA HPV (+), conforme demonstrado na figura 14, a infecção
mista pelo HPV foi encontrada em duas amostras (22,2%) sendo uma com HPV de
baixo e alto risco (HPV 6 e 35) e a outra com HPV de alto risco (HPV 31 e 58). Outra
amostra teve identificado o HPV 58, ao restante (6/9) a positividade deu-se para tipos
de HPV não investigados na PCR.
Figura 14: Distribuição das espécies de HPV detectadas no grupo D de
amostras DNA-HPV (+), em amostras cervicais de mulheres rastreadas
para o câncer cervical no CRISMU, no período de Janeiro a Maio de 2014,
na cidade de Marabá-PA.
71
8 DISCUSSÕES
O INCA estimou para o Brasil, no ano de 2014 a ocorrência de 15.590 novos
casos de câncer do colo do útero estando a Região Norte em primeiro lugar para este
tipo de câncer com uma estimativa de surgimento de 830 novos casos a ocorrer
somente no estado do Pará (Brasil, 2013). Desta forma o Ministério da Saúde por
intermédio do INCA tem desenvolvido ações que promovam a diminuição das altas
taxas de incidência e mortalidade por este tipo de câncer. Estas ações contam com
tecnologias para o diagnóstico e tratamento de lesões precursoras que promovam a
cura em 100% dos casos diagnosticados na fase inicial da doença. Envolvem a
detecção precoce de lesões pré- neoplásicas por meio de exames citopatológicos, em
mulheres entre 25 e 59 anos, e a garantia do tratamento adequado da doença e de
suas lesões precursoras (BURD, 2003).
Os HPV de alto risco encontram-se envolvidos na gênese de tumores cervicais,
sendo detectados em 92,9 a 99,7% dos casos de carcinoma cervical (RAMA et
al.,2008). As técnicas da biologia molecular são mais eficazes na detecção do HPV,
porém não se pode prescindir do exame citológico em decorrência deste descrever
informações que vão além da evidencia da presença do HPV. Conforme demonstrado
por diversos pesquisadores, no mundo todo, a frequência de DNA HPV (+) encontrase alta entre mulheres com citologias normais, situação esta que não direciona
tratamento o que pode negligenciar a progressão para a malignidade.
Este estudo foi elaborado com a finalidade de investigar a infecção genital pelo
HPV através do diagnóstico molecular e da citopatologia e correlacionar os achados
aos fatores sóciodemográficos, comportamentais, sexuais e reprodutivos em
mulheres rastreadas para o câncer cervical em uma unidade de saúde na cidade de
Marabá, Pará e para tanto foram coletadas amostras cervicais e aplicado um
questionário clínico epidemiológico para cada participante da pesquisa.
As informações obtidas com a história de antecedente de infecção pelo HPV
possibilitaram analisar a variação no ciclo da infecção pelo HPV quanto ao clearance
ou progressão da infecção. Sobre estas intenções, para as análises estatísticas, as
72
participantes foram agrupadas em: mulheres com história de antecedentes de
infecção pelo HPV, mulheres com citologia atual sem atipias celulares, mulheres com
citologia atual com atipias celulares, mulheres com DNA HPV (+), mulheres com DNA
HPV (-). Para todos os grupos foram investigados os fatores de risco associados à
aquisição da infecção pelo HPV ou ao desenvolvimento do câncer cervical. Pretendeuse ainda reforçar o conhecimento sobre os genótipos de HPV circulantes na
população do estudo.
A prevalência para a infecção pelo HPV entre mulheres no mundo todo varia entre
2% a 44% sendo esta variação explicada pela média das idades da população do
estudo e sensibilidade do método de detecção do HPV (CASTELLSAGUÉ et al.,
2002). O presente estudo avaliou amostras cervicais de 191 mulheres com idade
entre 18 e 61 anos e encontrou uma prevalência de infecção pelo HPV de 4,7% para
todo o grupo estudado sendo que esta encontra-se abaixo do perfil encontrada em
estudos realizados em diversas regiões do país.
Estudos internacionais tem demonstrado uma prevalência variando entre 16,6%
(Polonia) a 64% (população indígena na Argentina). Em estudo de coorte realizado
por Molano e colaboradores (2005), na Colombia utilizando o diagnóstico por PCR foi
verificada uma prevalência de 14,9% em mulheres colombianas entre 13 a 85 anos.
Estudos primários realizados no Brasil por Franco e colaboradores (1999) apontaram
uma prevalência inicial de HPV de 13,8% para mulheres entre 18 e 60 anos e de 25%
acumulada ao final do seguimento do seu estudo; Trottier e colaboradores (2008)
apontaram uma freqüência de 10,6% de HPV em mulheres na mesma faixa de idade.
Em uma revisão sistemática da literatura realizada por Ayres e colaboradores (2013)
, a prevalência da infecção no Brasil variou entre 13,7 e 57,3%.
A colpocitologia como exame de rastreabilidade para o câncer cervical
apresenta sensibilidade moderada porém alta especificidade, informação esta
confirmada em vários estudos (BURD, 2003). Dentre as amostras cervicais analisadas
encontrou-se um percentual de 94,24% dentro dos limites da normalidade e 5,8% de
citologias alteradas distribuídas entre ASC-US com 66,6% (6/11), seguida de 44,4%
como LSIL e 11,1% como ASC-H. Essa prevalência a princípio pode ser considerada
baixa, entretanto corrobora com achados de Bringhente e colaboradores (2010) que
73
encontraram uma prevalência de 5,77 % ao analisarem 3.000 pacientes no Rio
Grande do Sul, entre os anos de 2009 e 2010; mostrou-se superior ao achado por
Augusto e colaboradores (2014) que analisando 351 mulheres em um programa de
saúde da família, em Niterói, Rio de Janeiro, encontraram uma prevalência de 3,7%.
No estado do Acre, ao se investigar 2.226 mulheres encontrou-se uma prevalência de
5,4% (Von Zuben et al., 2007).
No Pará, Pinto e colaboradores em um estudo em 2011 encontraram uma
prevalência de 2,8% entre esfregaços com atipias celulares ao analisarem 431
amostras cervicais de mulheres, colhidas em Belém e Tucuruí, assim como Prazeres
(2010) ao analisar 144 amostras de mulheres residentes na cidade de Tomé Açú,
Pará, encontrou uma prevalência de 6,9%. Estes dados reforçam a condição da boa
qualidade dos escrutinadores dos laboratorios de citologia utilizados nestas pesquisas
e estão de acordo com as recomendações do Manual de Gestão da Qualidade para
Laboratório de Citopatologia publicado pelo INCA em 2012.
Com relação aos resultados citológicos de ASC-US o percental de 3,14%
encontrado nesta pesquisa atende ao estabelecido em consenso americano de que
não deve ultrapassar 5% dos resultados com taxa média de 2,8%, sobre todas as
amostras assim como a proporção de ASC-US e LSIL corrobora com outras pesquisas
(LIMA et al, 2002).
Estudos que incluem mulheres captadas em unidades especializadas em
saúde da mulher ou serviços de avaliação ginecológica rotineira tendem a estimar
prevalências intermediárias ou baixas. As participantes desta pesquisa, realizada no
CRISMU, em Marabá, Pará, demonstraram em sua maioria serem usuárias frequentes
deste
serviço
fato
observado
pelo
percentual
(20,9%)
de
mulheres
em
acompanhamento e também de mulheres que realizaram PCCU mais de 6 vezes na
vida (31,4%).
Sobre prevalência do DNA HPV em citologias dentro dos limites da
normalidade nosso estudo aproxima-se ao realizado por Noronha em 2002 quando
esta encontrou uma prevalência de 6,9% de DNA HPV (+) em mulheres com citologia
dentro dos limites da normalidade. Noss resultados obtidos em nosso estudo, o
percental encontrado foi de 4,4% de mulheres comprovadamente DNA HPV(+) e que
apresentaram citologia normal. Ayres e Silva (2010) mostraram em um estudo de
revisão sistemática no Brasil, uma variação da prevalência de infecção por HPV entre
74
10,4% e 24,5% entre mulheres com citologia normal no exame de Papanicolaou.
Considerando que a infecção por HPV encontra-se diretamente associada a
resultados anormais da citologia
este estudo identificou apenas uma fraca
concordância entre a citologia com atipias celulares e o DNA HPV(+) detectado pela
PCR, em amostras colhidas em um mesmo momento. Foi encontrado , em nosso
estudo um percentual de 90,9% (10/11) de mulheres com atipias celulares (ASC-US,
LSIL e ASC-H) e que apresentaram-se DNA HPV (-). Reconhecemos com de extrema
importância o acompanhamento clínico e laboratorial destas mulheres. Outrossim
corroboramos com as considerações de Nomeline e colaboradores (2007) que
reafirmam que um teste positivo para DNA HPV não implica em que a mulher tenha
SIL ou mesmo câncer, porém apresenta o risco para vir a desenvolver estas lesões.
Demonstra-se desta forma que o rastreio citológico para a infecção pelo HPV
pode
apresentar falhas fato que envida atenção redobrada para o controle de
qualidade de laboratórios de citologia, quando no Brasil estima-se que 20% das
mulheres sexualmente ativas estejam infectadas pelo HPV, o que corresponde a 10 a
12 milhões de mulheres ( BRASIL, 2014).
Este estudo identificou também um percentual significante (20,9%)
de
mulheres com história de antecedentes de infecção pelo HPV. Neste grupo, uma
mulher persistiu com lesão pré neoplásica na forma de LSIL e DNA HPV (+) assim
outra apresentou-se DNA HPV(+) com citologia sem atipias o que corrobora
novamente com a comprovação de infecção DNA HPV (+) e ausência de atipias
celulares à citologia são fatores em permanente análise investigativa em populações
femininas (BRIGHENTI et al, 2010).
Ao se analisar o grupo de mulheres DNA HPV (+) no que concerne aos
determinantes que influenciam a aquisição da infecção pelo HPV não foi encontrada
associação entre o número de parceiros pois a maioria das infectadas apresentou
constancia de parceiro sexual em um período de 12 meses fator que diminui o risco.
Outros parâmetros comportamentais tais como idade da iniciação sexual e quantidade
de parceiros ao longo da vida também não apresentaram significância.
A maior frequencia de infecção pelo HPV, ao se analisar mulheres DNA HPV
(+) esteve entre as mulheres com idade entre 18 e 29 anos (55,6%) seguida da faixa
de 30 a 39 (44,4%) , encontrou-se apenas uma com idade igual a 50 anos. Desta
75
forma nosso estudo realizado na cidade de Marabá, corrobora com estudos
epidemiológicos que demonstram um pico da infecção pelo HPV entre adultos jovens
sexualmente ativos com uma leve estabilização da curva em mulheres de 35 a 55
anos com uma tendência ao declínio da curva em faixas etárias mais velhas (
FEDRIZZI, 2011).
Fatores sóciodemográficos e comportamentais são classicamente descritos
como fatores de risco para o desenvolvimento do câncer cervical. Diversos autores
apresentam risco aumentado em mulheres com menor escolaridade entretanto neste
estudo foi encontrada uma prevalência maior da infecção entre mulheres com
escolaridade completa (100%). As diferenças nesses achados demonstram que
fatores como escolaridade e nível sócio econômico são parâmetros de difícil
avaliação.
Estudos apontam que o fator de risco mais consistente para a infecção pelo
HPV é a variedade de parceiros sexuais na vida sendo constatado em diversos
estudos. Ho e colaboradores (1998) demonstraram que mulheres que tiveram quatro
parceiros ou mais em um período de 6 a 12 meses elevaram o risco para a aquisição
do HPV em até quatro vezes quando comparadas com mulheres com três parceiros
ou menos. Em nosso estudo foi encontrada um tendencia a manutenção do mesmo
parceiro entre as mulheres DNA HPV (+) (66,6%) assim como somente 22,2%
declararam novos parceiros nos últimos 12 meses, desta forma não foi encontrada
significância estatística para a associação.
De acordo com Murta e colaboradores (2001) mulheres que apresentam
precocidade sexual comumente têm um maior número de parceiros na vida o que
contribui para a exposição ao HPV; acredita-se que grande parte destas mulheres que
vieram a desenvolveram neoplasia cervical tenham iniciado suas atividades sexuais
antes dos 18 anos. Estudo realizado por Roteli-Martins e colaboradores (2007)
envolvendo mulheres atendidas pelo Sistema Único de Saúde (SUS), em várias
cidades brasileiras encontraram significante associação entre a idade da iniciação
sexual e a aquisição do HPV. Em nosso estudo, realizada no município de Marabá, a
prevalência entre as infectadas pelo HPV, foi de 77,8% para as que a iniciaram entre
os 10 e 17 anos o que corrobora com as infomações citadas.
76
A multiparidade encontra-se relacionada , em vários estudos, ao risco para a
aquisição do HPV e também ao desenvolvimento de câncer cervical (RASMUSSEN,
2006). Estudos diversos demonstraram que mulheres com três ou mais gestações
foram consideradas de risco para a infecção pelo HPV . Quanto ao risco para o
desenvolvimento do câncer cervical, Castellsagué & Muñoz (2003) observaram um
aumento elevado de risco em mulheres com maior número de partos transpélvicos
porém considerou para estas a idade ao início da atividade sexual e o envolvimento
com vários parceiros sexuais. Os dados obtidos neste estudo, para as mulheres DNA
HPV (+) não apresentaram significância estatística pois foi observada uma baixa
tendência à multiparidade onde 44,4% relataram uma ou nenhuma gestação
completa.
Castellsagué & Muñoz (2003) descreveram um risco aumentado para o
desenvolvimento do câncer cervical realacionado ao uso de anticoncepcional oral em
mulheres que fazem uso por mais de dez anos. Para esta relação entretanto ainda há
muita controversias entre pesquisadores. Estudos questionam o fato de que mulheres
que fazem uso de contraceptivos orais deixam de usar o preservativo que atua como
barreira contra diversos microorganismos promotores de DST inclusive o HPV. Em
nosso estudo não encontrou-se associação estisticamente significante entre o uso de
anticoncepcional hormonal por período rolongado e a infecção pelo HPV no grupo das
mulheres infectadas pelo HPV (p=0,11) e nem no grupo de mulheres com citologia
alterada (P=0,39).
No que tange ao uso de preservativos, Soares e colaboradores (2003) em um
estudo com mulheres brasileiras, evidenciou baixo uso de preservativos tendo sido
relatado por apenas 3,2% das participantes, e no estudo de Lopes e colaboradores
(2004), apenas 2,5% das entrevistadas fazia uso consistente de preservativo. Neste
estudo o mesmo foi relatado como de uso pouco frequente ou nunca utilizado por mais
da metade das mulheres tanto no grupo da citologia alterada como no grupo DNA
HPV (+) sendo esta informação foi similar em ambos os grupos (63,6 e 66,7%).
Devemos considerar que para ambos os grupos, citologia com atipias e DNA HPV (+),
a variável estado civil foi considerada significante para casada /união estável após
análise de significância pelo teste de Fisher. Podemos supor que mulheres em
situação conjugal estável prescindam do uso de preservativos, pois a manutenção do
77
parceiro sexual de alguma forma as faz sentirem-se protegidas quanto ao risco de
aquisição de DST.
Assim como a variedade de parceiros sexuais impacta na elevação do risco
para a aquisição da infecção, o tabagismo também é considerado um dos mais
importantes fatores de risco para o desenvolvimento do câncer cervical em
decorrência do depósito de carcinógenos em células cervicais e tambèm pela
imunosupressão induzida pela redução das células de Langhehans. Em nosso estudo,
realizado com mulheres na cidade de Marabá, observou-se que as mulheres com
atipias celulares em sua maioria (90,9%) não eram fumantes, situação similar entre
as mulheres DNA HPV (+) onde apenas 11,1% eram fumantes. De acordo com Naud
e colaboradores (2006) uma carga mínima de 100 cigarros na vida pode ser
considerado forte preditor para a infecção pelo HPV. Em um estudo brasileiro
Uchimura (2004) analisou 22 mulheres fumantes infectadas pelo HPV, através da
quantificação das células de Langhehans e comparando com um grupo de infectadas
não fumantes não encontrou significância estatistica na redução destas células,
Estudos epidemiológicos nos últimos 30 anos revelaram que HPV de alto risco
é detectado em 99% dos casos de carcinoma cervical e os tipos mais frequentes são
o HPV 16, seguido dos tipos 18, 58,33, 45, 31, 52, 35, 59, 39,51 e 56 dispostos na
ordem de aparecimento segundo revisão literária realizada por Pinheiro e
colaboradores (2013). De acordo com o Ministério da Saúde, no Brasil os tipos mais
comuns, de alto e baixo risco, encontrados em amostras com citologia normal são o
HPV 16, seguidos dos tipos 31, 18, 6, 35, 58, 33, 11, 54 e 68. Na maioria dos casos
de câncer cervical, no mundo todo, em cerca de 90% é detectado um único tipo de
HPV o que não se observa na África, onde múltiplas infecções são detectadas em
19% dos casos (SANJOSÉ, 2010).
A detecção de HPV de baixo risco não se relaciona diretamente ao
desenvolvimento de câncer cervical, entretanto em nosso estudo o HPV 6 foi
encontrado concomitante com o HPV 35 este de alto risco o que sugere o
monitoramento dessa paciente a despeito de apresentar citologia sem atipias
celulares. Estudos moleculares envolvendo HPV de alto risco comprovam que a
persistência da infecção por este grupo oncogênico e o câncer cervical estão
diretamente relacionados, deste modo a ocorrência de testes negativos para a
78
presença de viral de HPV de alto risco confere alto valor preditivo negativo para o
desenvolvimento desta doença.
A reação de genotipagem pela PCR neste estudo foi direcionada para a
identificação dos tipos de HPV 6 e 11 de baixo risco e 16,18,31,33,35,52 e 58 de alto
risco. Como resultados, identificaram-se os tipos de HPV 6, 31, 35 e 58 em 33,3% das
amostras positivas para DNA HPV, sendo 22,2% com infecção mista (dois tipos de
HPV concomitantes). No grupo total DNA HPV (+) 66,6% não tiveram os tipos
identificados em decorrência de limitações do estudo. O tipo HPV 16 é o mais
prevalente em infecções genitais seguido dos tipos HPV 18, 45 e 31 que em conjunto
correspondem a aproximadamente 80% dos casos de carcinoma cervical (MUNÕZ et
al, 2004; 2010) porém estes não foram identificados nesta pesquisa.
Este estudo apresentou limitações a começar pela exclusão de mulheres om
idade inferior a 18 anos, considerando que estudos epidemiológicos evidenciaram
serem extremamente suscetíveis à aquisição do HPV. Outro limitante ocorreu por
conta do tamanho amostral e local da coleta, pois foi evidenciada no estudo uma alta
prevalência de mulheres já tratadas para a infecção e também uma quantidade
significante de participantes com frequência superior a 10 vezes para a realização de
PCCU durante a vida. Uma amostragem ideal envolveria outras unidades de saúde
implantadas na cidade. Ao final da análise observou-se que o desenho do estudo, e
as limitações do questionário dificultaram a análise e distinção entre mulheres com
clearance, infecção transitória e infecção persistente para o HPV.
Por fim, recomendamos, para pesquisas futuras, a utilização dos primers de
consenso GP05+/GP06+, ou mesmo a versão modificada, os pares PMGY09/11, para
a PCR genérica com a finalidade de eliminar degenerações e melhorar a
sensibilidade, especificidade e reprodutibilidade dos testes biológicos como estratégia
laboratorial que poderá o valor de prevalência da infecção pelo HPV em pesquisas
epidemiológicas.
79
9 CONCLUSÕES

A prevalência de infecção pelo HPV na população estudada foi de 4,7%.

Encontrou-se uma prevalência de 5% de infecção pelo HPV entre mulheres
com história de antecedentes de infecção pelo HPV fato que sugere
persistência viral, entretanto a genótipos de baixa frequência.

Encontrou-se uma prevalência de 95% de mulheres negativas para o DNA do
HPV e com história de antecedentes de infecção pelo HPV fato que sugere
regressão da doença e podem estar relacionadas à resposta imunológica
destas mulheres ou mesmo a tratamentos médicos bem sucedidos.

A frequência de 94,2% do total de mulheres DNA HPV (+) e que
apresentaram citologias sem atipias celulares reforça a ideia de que a
infecção pelo HPV não provoca de imediatas alterações celulares detectáveis
pelo PCCU.

Encontrou-se associação significante entre os fatores idade e precocidade
sexual e o risco para a aquisição da infecção pelo HPV.

Não se encontrou associação entre a infecção e fatores como: uso de
métodos contraceptivos, tabagismo, multiparidade e parceiros sexuais
(quantidade na vida e novos no último ano).

Não se encontrou concordância significante entre a citologia e o teste
molecular PCR.

Verificou-se a ocorrência dos tipos HPV 31 e 58, de alto risco e baixa
frequência e que não recebem cobertura pela vacina quadrivalente
Gardasil™, desta forma a população continuará susceptível a estes tipos.
80
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93
APÊNDICE A
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Estou sendo convidado a participar de uma pesquisa sobre “Infecção pelo HPV e
Câncer Cervical: Correlação Clínica Epidemiológica e Fatores de Risco em
Populações da Amazônia Brasileira”, que é desenvolvida no Laboratório de
Imunopatologia do Núcleo de Medicina Tropical / Centro de Ciências Biológicas da
Universidade Federal do Pará.
Para que eu decida em participar ou não da pesquisa me foram prestadas as seguintes
informações:
•
O título do projeto é “Epidemiologia da infecção genital pelo Papillomavirus
humano (HPV) na população feminina atendida na rede pública de
Marabá-PA”. O pesquisador responsável é o Prof. Dr. Juarez Antônio
Simões Quaresma, CRM/PA 5655, Fone de contato, (91) 3241-4681
professor pesquisador da Universidade Federal do Pará. Este projeto é
submetido ao Comitê de Ética em Pesquisa Envolvendo seres Humanos,
do Núcleo de Medicina Tropical, à Av. Generalíssimo Deodoro, nº92, CEP66005-240 Umarizal, Fone 91- 32016857.
•
O objetivo da pesquisa é determinar a prevalência do HPV em coinfecções de
colo de útero na população feminina estudada, na cidade de Marabá-Pa.
•
Essa pesquisa oferece riscos biológicos minimizados, pois as coletas de
amostra são práticas da rotina, realizadas por profissionais qualificados e os
materiais são esterilizados e descartáveis, entretanto posso sentir algum
desconforto ou mesmo sangramento.
•
Estou ciente de que uma pequena quantidade de secreção cervical será
coletada e posteriormente estocada a -20°C no Laboratório de Imunopatologia
do NMT/UFPA para ser utilizado exclusivamente em testes de biologia
molecular pertinente a esta pesquisa.
•
Minha participação é absolutamente voluntária e estou permitindo a realização
de testes biológicos necessários para a efetivação desta pesquisa assim como
estou ciente de que poderei deixar a pesquisa no momento que quiser, pois
não haverá prejuízo pessoal por esta causa.
•
Estou ciente de que esta pesquisa não oferece qualquer possibilidade de ajuda
financeira para mim.
94
•
Estou ciente de que o resultado deste trabalho será convertido em benefício
para cada uma das participantes mediante a realização de testes biológicos
que auxiliam no diagnóstico precoce e tratamento da infecção pelo HPV caso
ele venha a ser detectado.
•
Minha participação nesta pesquisa é sigilosa, isto significa que, somente os
pesquisadores ficarão sabendo de minha participação assim como os dados
laboratoriais e epidemiológicos obtidos terão uso exclusivo neste trabalho.
CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Li as informações acima sobre a pesquisa e declaro que me sinto perfeitamente
esclarecido acerca do conteúdo da mesma, assim como seus riscos e objetivos.
Declaro ainda que, por minha livre vontade, aceito participar da pesquisa cooperando
com a coleta de material para exames laboratoriais.
Marabá (PA), ____/____/____.
_______________________
Assinatura da participante
_________________________________
Prof. Dr. Juarez Antônio Simões Quaresma CRM/PA nº 5655
Núcleo de Medicina Tropical / UFPA
Av. Generalíssimo Deodoro, nº92, CEP-66005-240, Bairro - Umarizal
Fone de Contato no Trabalho: (91) -3241-4681
_____________________
Marineide Sousa Bastos CRF/PA 758
Farmacêutica-Bioquímica
Mestranda em Biologia de Agentes Infecciosos e Parasitários
Pós Graduação – BAIP - UFPA
Fone de Contato (91) 8219-5134
Prontuário:____________________
Protocolo:____________________
95
APÊNDICE B - QUESTIONÁRIO CLÍNICO- EPIDEMIOLÓGICO
Identificação da Unidade de Saúde Municipal:
LÂMINA: ______________
EPPENDORFF: __________ DATA: ___/____/____
Nome:
Data de Nascimento:
Idade:________
Endereço:
Bairro:
Fone de Contato:
( ) Reside na Cidade de Marabá ( ) Outra Procedência............................................
Estado Civil:
( ) Solteira ( )Casada ( ) União Estável ( ) Divorciada/Separada ( ) Viúva
Profissão / Ocupação:
Nível de Escolaridade:
Não Alfabetizada ( )
1º Grau ( ) Completo ( ) Incompleto
2º Grau ( ) Completo ( ) Incompleto
Curso Profissionalizante após 2º Grau ( )
Grau Universitário ( )
Renda Familiar:
( ) 1 salário mínimo
( ) 3 a 4 salários mínimos
( ) acima de 6 salários mínimos
( ) 2 a 3 salários Mínimos
( ) 5 a 6 salários mínimos
Quantas vezes você já realizou PCCU:____________
ANAMNESE
Idade da Primeira menstruação (menarca):_______
Data da última menstruação: _______/________/_______
( ) Não sabe Informar
( ) Não menstrua mais há ________anos
Idade da 1ª gestação: __________
Nº de Filhos: _________
Nº de abortos: _____ Nº de partos normais: ____ Nº de partos cesáreos: ______
Fez uso de anticoncepcional oral ou injetável nos últimos 10 anos?
( ) Sim
( ) oral ( ) Injetável
( ) Não ( ) Outro método________
Usa medicamento para tratar menopausa:
( ) Sim
( ) Não
Consegue dizer qual è ? :_____________
96
Qual das seguintes situações descreve seu hábito de fumar?
( ) Eu nunca fumei
( ) Eu fumei no passado ,mas não fumo mais
( ) Eu geralmente fumo menos de uma carteira ao dia
( ) Eu geralmente fumo em torno de uma careteira ou mais ao dia
Idade da 1ª relação Sexual: _______
Tem vida sexualmente ativa:_________ Data da última relação sexual:______
( ) Parceiro sexual Fixo ( ) Mais de um Parceiro sexual
Nº de parceiros sexuais nos últimos 12 meses: _________
Nº de novos parceiros nos últimos 12 meses: __________
Tipo de parceiros:
( ) Homem ( )Mulher ( ) Homens e Mulheres
( ) Parceiro de outro Estado
( ) Parceiro de outro País
Apresenta sangramento vaginal uterino anormal nos últimos 12 meses?
( ) Sim
( )
Não
Faz uso de preservativo durante a relação sexual?
( ) Sim ( ) Não
Apresenta sangramento durante relação Sexual fora do período da menstruação?
( ) Sim
( ) Não
Já apresentou verruga na região anal genital anteriormente?
( ) Sim
( ) Não
( ) Acho que sim
Você recebeu o resultado do seu último PCCU?
( ) Sim
( ) Não
Lembra o que deu no resultado ?__________
Você já teve seu útero removido (histerectomia)?
( ) Sim ( ) Não
Já realizou algum procedimento vaginal / cervical / uterino?
( ) Cauterização ( ) Biópsia ( ) Radioterapia ( ) Quimioterapia
( ) Não sabe informar
Já realizou pesquisa sorológica para:
( ) Hepatite B ( ) Hepatite C ( ) HIV Algum resultado Positivo? : ____
( ) Nunca realizou estes exames
Observação adicional: ________________________________________
Profissional que coletou as
Informações (nome legível) _________________________________