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50º Congresso Brasileiro de Genética
Resumos do 50º Congresso Brasileiro de Genética • 7 a 10 de setembro de 2004
Costão do Santinho • Florianópolis • Santa Catarina • Brasil
www.sbg.org.br - ISBN 85-89109-04-6
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Palavras-chave: DNA bent, origem de replicação, Rhynchosciara americana
Fiorini, A1; Gouveia, FS1; Soares, MAM2; Fernandez, MA1.
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Departamento de Biologia Celular e Genética, Universidade Estadual de Maringá, UEM, Maringá, Paraná. 2Departamento de Biologia
Estrutural, Molecular e Genética, Universidade Estadual de Ponta Grossa, UEPG, Ponta Grossa, Paraná
Caracterização de sítios intrínsecos de DNA
bent na região de origem de replicação do
pufe C3 em Rhynchosciara americana
Durante o desenvolvimento, os genes localizados nos pufes de DNA de cromossomos politênicos de sciarídeos passam por
um processo de replicação diferencial denominado amplificação gênica, que resulta na produção de grandes quantidades
de proteínas específicas em um curto período de tempo. Em Rhynchosciara americana, a replicação do DNA no pufe
C3 inicia-se em múltiplos sítios, em uma zona de ao menos 6.000 pares de bases (pb) situada à montante do promotor
da unidade de transcrição do gene C3-22, localizado nesse pufe. Seqüências de DNA envolvidas com transcrição,
replicação e organização de cromossomos podem apresentar conformações não usuais. Como exemplo dessas estruturas
não usuais temos os sítios de DNA bent (curvos) encontrados próximos a regiões ativas em transcrição e replicação. Neste
contexto, este trabalho tem como objetivo caracterizar elementos estruturais que poderão contribuir para a função de
origem de replicação na região amplificada do pufe de DNA C3 de Rhynchosciara americana. A curvatura intrínseca da
molécula de DNA ocorre em regiões contendo trechos de 3 ou mais adeninas repetidos a cada volta da hélice, ~10 pb,
ou múltiplos de 10. A metodologia utilizada foi a comparação do comportamento eletroforético de subgfragmentos de
restrição dessa região em géis de agarose (controle) e poliacrilamida. DNA bent e outras conformações estruturais exibem
migração alterada em géis de poliacrilamida por apresentarem dificuldade em migrar pelos poros regulares desse gel. A
velocidade de migração de cada fragmento foi comparada pelo cálculo do valor R, definido como a razão do tamanho
aparente nos géis pelo tamanho real do fragmento, obtido por seqüenciamento. Valores R entre 0,90 e 1,11 indicam
fragmentos com mobilidade normal; ≥ 1,12 indicam redução na mobilidade e < 0,90 indicam rápida mobilidade,
sendo os dois últimos indicativos de DNA bent. Os fragmentos analisados apresentaram valores R entre 1,13 a 1,25.
A obtenção da trajetória 2D e as análises em gráfico por meio de programas computacionais específicos comprovam a
presença de pequenos sítios curvos que, em associação, contribuem para a curvatura total da região. Fragmentos de 535
pb e 485 pb, contendo os dois primeiros sítios de curvatura, foram subclonados em plasmídeo pBendBlue e analisados
por permutação circular em géis de poliacrilamida. Este método permite localizar mais precisamente a posição dos
sítios bent. Estes resultados mostram que a região amplificada do pufe C3 de R. americana apresenta sítios intrínsecos
de curvatura. Estes resultados representam um avanço significativo na compreensão da organização estrutural de regiões
contendo sítios de replicação em organismos eucariontes.
Suporte financeiro: TWAS, CNPq, CAPES e Fundação Araucária.
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