(11) (21) PI 0512421-2 A

(11) (21)
PI 0512421-2 A
(22) Data de Depósito: 20/04/2005
(43) Data de Publicação: 04/03/2008
República Federativa do Brasil
(51) Int. C17.:
A61K 39/12 (2008.01)
(RPI 1939)
Ministério do Desenvolvimento, Indústria
e do Comércio Exterior
Instituto Nacional da Propriedade Industrial
(54) Título: RECOMBINANTES DE AVIPDX
EXPRESSANDO GENES DO VÍRUS DA DOENÇA
FEBRE AFTOSA
(30) Prioridade Unionista:
(71) Depositante(s):
25/06/2004 US 60/563,786
Merial Limited (US)
(72) Inventor(es): Robert Nordgren, Sheena May Loosmore, JeanChristophe Francis Audonnet, Marvin J. Grubman
(74) Procurador:
Dannemann , Siemsen, Bigler & Ipanema Moreira
(86) Pedido Internacional:
PCT US2005/013523 de 20/04/2005
(87) Publicação Internacional: wo
2006/073431 de 13/07/2006
(57) Resumo: RECOMBINANTES DE AVIPDX EXPRESSANDO GENES
DO VIRUS DA DOENÇA FEBRE AFTOSA. A presente invenção refere-se
a vetores poxvirais modificados e a métodos de fabricação e uso dos
mesmos. Em particular, a invenção refe-re-se a avipox recombinante que
expressa produtos de gene do vírus da doença febre aftosa (FMDV) e a
composições ou vacinas que elicitam resposta imune direcionada aos
produtos de gene de FMDV e que podem conferir imunidade protetora
contra infecção por FMDV.
P1 05ez,1-21
02i00700-24.3G
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "RECOMBINANTES DE AVIPDX EXPRESSANDO GENES DO VÍRUS DA DOENÇA
FEBRE AFTOSA".
REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS
5
O presente pedido reivindica prioridade do pedido de patente
provisório U.S. N°. 60/563.786 depositado em 20 de abril de 2004.
O presente pedido faz referência ao Pedido de Patente U.S. N°.
10/327.481 depositado em 20 de dezembro de 2002, que é uma continuação-em-parte do Pedido de Patente Internacional No. PCT/FRO1/02042 de-
10 positado em 27 de junho de 2001 publicado em 3 de janeiro de 2002 como
WO 02/00251 e reivindicando prioridade do Pedido de Patente Francês No.
00/08437 depositado de 29 de junho de 2000.
Todos os pedidos acima, bem como todos os documentos citados nos pedidos acima ("documentos de pedidos") e todos os documentos
15 citados ou referidos nos documentos de pedido são aqui incorporados a título de referência. Também, todos os documentos citados no presente pedido
("documentos aqui citados") e todos os documentos citados ou referidos nos
documentos citados aqui são aqui incorporados a título de referência. Ainda,
quaisquer instruções ou catálogos do fabricante para quaisquer produtos
20 citados ou mencionados em cada um dos documentos de pedido ou documentos citados aqui são incorporados a título de referência. Os documentos
incorporados a título de referência no presente texto ou quaisquer ensinamentos deles podem ser usados na prática da invenção. Os documentos
incorporados a título de referência no presente texto não são admitidos ser
25
técnica anterior.
CAMPO DA INVENÇÃO
A presente invenção refere-se a vetores, tal como vírus, por exemplo, vírus modificados, tal como poxvírus e a métodos de fabricação e
uso dos mesmos. Em particular, a invenção refere-se a vetores de avipox
30 recombinantes e vírus que expressam antígenos do vírus da doença da febre aftosa (FMDV) e a métodos de fabricação e uso dos mesmos. A invenção refere-se ainda a métodos de elicitação de uma resposta imune para
2
FMDV em um indivíduo.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
A doença febre aftosa (FMD) é uma das doenças mais virulentas
e contagiosas que afetam os animais de fazenda. Esta doença é endêmica
5 em vários países no mundo, especialmente na África, Ásia e América do Sul.
Ainda, surtos epidêmicos podem acontecer periodicamente. A presença desta doença em um país pode ter conseqüências econômicas muito severas
resultantes da perda de produtividade, perda de peso e produção de leite em
rebanhos infectados e de embargos comerciais impostos a esses países. As
10 medidas tomadas contra esta doença consistem em aplicação rígida de restrições importantes, controles de higiene e quarentena, sacrifício dos animais
doentes e programas de vacinação usando vacinas inativadas, ou como uma
medida preventiva no nível nacional ou regional ou periodicamente quando
um surto epidêmico acontece.
A FMD é caracterizada por seu curto período de incubação, ela
15
é de natureza altamente contagiosa, a formação de úlceras na boca e na
pata e, algumas vezes, a morte de animais jovens. A FMD afeta várias espécies de animais, em particular gado, porcos, ovelhas e cabras. O agente
responsável pela doença é um vírus de ácido ribonucléico (RNA) pertencen20 te ao gênero Aphthovirus da família Picornaviridae (Cooper e outros, Intervirology, 1978, 10, 165-180). No momento, pelo menos sete tipos de vírus da
doença febre aftosa (FMDV) são conhecidos: os tipos Eropeus (A, O e C), os
tipos Africanos (SAT1, SAT2 e SAT3) e um tipo Asiático (Ásia 1). Vários subtipos foram também distinguidos (Kleid e outros, Science (1981), 214, 112525
1129).
O FMDV é um vírus icosaedral nu de cerca de 25 mm de diâmetro, contendo uma molécula de RNA de filamento simples consistindo em
cerca de 8500 nucleotídeos, com uma polaridade positiva. Esta molécula de
RNA compreende uma estrutura de leitura aberta simples (ORF), codificando
30 uma poliproteína simples contendo, inter alia, o precursor de capsídeo também conhecido como proteína P1 ou P88. A proteína P1 é miristilada em sua
extremidade amino-terminal. Durante o processo de maturação, a proteína
3
P1 é clivada pela protease 3C em três proteínas conhecidas como VPO, VP1
e VP3 (ou 1AB, 1D e 1C respectivamente; Belsham, G.J., Progress in Biophysics and Molecular Biology, 1993, 60, 241-261). No vírion, a proteína VPO
é então clivada em duas proteínas, VP4 e VP2 (ou 1A e 1B respectivamen5 te). O mecanismo para a conversão das proteínas VPO em VP1 e VP3 e para a formação de vírions maduros não é conhecido. As proteínas VP1, VP2 e
VP3 têm um peso molecular de cerca de 26.000 Da, enquanto a proteína
VP4 é menor em cerca de 8.000 Da.
A combinação simples das proteínas capsídeo forma o promotor
10 ou molécula 5S, que é o constituinte elementar do capsídeo de FMDV. Este
promotor é então complexado em um pentâmero para formar a molécula
12S. O vírion resulta da encapsidação de uma molécula de RNA genômico
através da montagem de 12 pentâmeros de 12S, deste modo constituindo as
partículas 146S. O capsídeo virai pode ser também formado sem a presença
15 de uma molécula de RNA dentro dele (daqui em diante "capsídeo vazio"). O
capsídeo vazio é também chamado partícula 70S. A formação de capsídeos
vazios pode acontecer naturalmente durante a replicação virai ou pode ser
produzida artificialmente através de tratamento químico.
Muitas hipóteses, caminhos de pesquisa e propostas foram de20 senvolvidos em uma tentativa de produzir vacinas eficazes contra FMD. Atualmente, as únicas vacinas no mercado compreendem vírus inativado. Preocupações com relação à segurança das vacinas de FMDV existem, uma vez
que surtos de FMD na Europa estiveram associados a defeitos na fabricação
de vacina (King, A.M.Q. e outros (1981) Nature 293:479-480). As vacinas
25 inativadas não conferem imunidade a longo prazo, deste modo requerendo
injeções de reforço dadas todo ano, ou mais freqüentemente no caso de surtos epidêmicos. Ainda, há riscos ligados à inativação incompleta e/ou o escape de vírus durante a produção de vacinas inativadas (King, A.M.Q., ibid).
Um objetivo na técnica foi construir imunógenos conformacionalmente corre30 tos sem o genoma de FMDV infectivo para fazer vacinas eficazes e seguras.
O vírus vaccinia tem sido usado com sucesso para imunizar contra varíola, culminando na erradicação mundial da varíola em 1980. Deste
4
modo, um novo papel para o poxvírus se torna importante, aquele de um
vetor geneticamente construído para a expressão de genes estrangeiros
(Panicali e Paoletti, 1982; Paoletti e outros, 1984). Os genes codificando antígenos heterólogos foram expressos em vaccinia, muitas vezes resultando
5 em imunidade de proteção contra provocação pelo patógeno correspondente
(revisto em Tartaglia e outros, 1990). Uma linhagem de vacinas altamente
atenuadas, designadas MVA, foi também usada como um vetor para as vacinas à base de poxvírus. Uso de MVA é descrito na Patente U.S. No.
5.185.146.
10
Sistemas de vetor de vacina adicionais envolvem o uso de vírus
avipox, que são poxvírus de hospedeiro naturalmente restrito. Ambos vírus
do epitelioma contagioso (FPV; Taylor e outros, 1998a, b) e vírus da varíola
dos canários (CPV; Taylor e outros, 1991 & 1992) foram construídos para
expressar produtos de gene estrangeiro. Vírus do epitelioma contagioso
15 (FPV) é o vírus prototípico do gênero Avipox da família Poxvírus. O vírus
causa uma doença economicamente importante de gado que tem sido controlada desde os anos 20 através do uso de vacinas atenuadas vivas. A replicação do vírus avipox é limitada a uma espécie de ave (Matthews, 1982) e
não há relatos na literatura de vírus avipox causando uma infecção produtiva
20 em quaisquer espécies de não-ave incluindo homem. Esta restrição de hospedeiro provê uma barreira de segurança inerente contra transmissão do
vírus a outras espécies e torna o uso dos vetores de vacina baseada em vírus avipox em aplicações veterinária e humana uma proposta atraente.
Outros vetores de poxvírus atenuado foram preparados através
25 de modificações genéticas de linhagens de vírus do tipo selvagem. O vetor
NYVAC, derivado através de deleção de genes de virulência e faixa de hospedeiro específicas da linhagem Copenhagem de vaccinia (Tartaglia e outros, 1992), provou ser útil como um vetor recombinante na elicitação de
uma resposta imune protetora contra um antígeno estrangeiro expresso. Um
30 outro vetor de poxvírus construído é ALVAC, derivado do vírus da varíola
dos canários (vide Patente U.S. No. 5.756.103). ALVAC não replica produtivamente em hospedeiros não-ave, uma característica imaginada melhorar
5
seu perfil de segurança (Taylor e outros, 1991 & 1992). ALVAC foi depositado sob os termos do Tratado de Budapeste com a American Type Cultura
Collection sob o número de acesso VR-2547. Ainda um outro vetor de poxvírus construído é TROVAC, derivado do vírus do epitelioma contagioso (vide
5
Patente U.S. No. 5.766.599).
Os poxvírus recombinantes podem ser construídos em duas etapas conhecidas na técnica e análogas aos métodos para criação de recombinantes sintéticos de poxvírus tal como o vírus vaccinia e vírus avipox
descritos nas Patentes U.S. N os . 4.769.330; 4.722.848; 4.603.112;
10 5.110.587; 5.174.993; 5.949.807; e 5.505.941, cujas descrições são aqui incorporadas a título de referência. Pode ser então compreendido que a provisão de um poxvírus recombinante de FMDV, e de composições de produtos
dele, particularmente recombinantes e composições de FMDV à base de
ALVAC e TROVAC e seus produtos, especialmente tais recombinantes con15 tendo o genes P1 e/ou o gene de protease C3 de FMDV, e suas composições e produtos, seda um avanço altamente desejável sobre o estado atual
de tecnologia.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Deste modo, um aspecto da presente invenção provê um vetor
20 de avipox recombinante compreendendo pelo menos uma molécula de ácido
nucléico codificando um ou mais antígeno(s) do vírus da doença febre aftosa
(FMDV). Em modalidades vantajosas, o avipox é ALVAC ou TROVAC.
Vantajosamente, o(s) antígenos de FMDV podem ser VP1, VP2,
VP3, VP4, 2A, 2B ou 3C. Vantajosamente, a molécula de ácido nucléico co25 dificando um ou mais vírus da doença febre aftosa (FMDV) é um cDNA codificando a região P1 do FMDV e um cDNA codificando a protease 3C de
FMDV de FMDV.
Em uma modalidade, os antígenos de FMDV são operavelmente
ligados a uma seqüência de promotor, que pode ser o promotor de vaccinia
30 H6, o promotor de vaccinia I3L, o promotor de vaccinia 42K, o promotor de
vaccinia 7,5K ou o promotor de vaccinia Pi. Em uma outra modalidade, o
promotor é o promotor de vaccinia H6, que é mutado de modo que os níveis
6
de expressão dos antígenos de FMDV são diminuídos comparado com os
níveis de expressão dos antígenos de FMDV sob um promotor de vaccinia
H6 do tipo selvagem (isto é, não-mutado).
-
Em uma outra modalidade, o vetor de avipox da presente inven-
5 ção compreende um local de inserção C6, onde as seqüências de flanqueamento do local de inserção C6 promovem recombinação homóloga dos antígenos de FMDV com o local de inserção C6. Vantajosamente, as seqüências de flanqueamento compreendem as estruturas de leitura aberta C6L e
C6R de vírus da varíola dos canários.
Em uma modalidade adicional, o vetor de avipox da presente
10
invenção compreende um local de inserção F8, onde as seqüências de flanqueamento do local de inserção F8 promovem recombinação homóloga dos
antígenos de FMDV com o local de inserção F8. Vantajosamente, as seqüências de flanqueamento compreendem as estruturas de leitura aberta
15 F8L e F8R de vírus do epitelioma contagioso.
Um segundo aspecto da presente invenção provê um vírus avipox recombinante compreendendo pelo menos uma molécula de ácido nucléico codificando um ou mais antígenos de FMDV. A presente invenção
também provê vírus avipox recombinantes vCP2186, vCP2181, vCP2176 e
20 vFP2215.
Um aspecto adicional da invenção refere-se a um método de
elicitação de uma resposta imune a FMDV em um indivíduo compreendendo
administrar o vetor de avipox ou vírus avipox da presente invenção ao indivíduo.
25
Em ainda um outro aspecto da presente invenção, um método
de produção de um vetor de avipox recombinante compreendendo pelo menos uma molécula de ácido nucléico codificando um ou mais antígeno(s) de
FMDV compreendendo as etapas de: a) linearização de um plasmídeo doador com uma endonuclease de restrição, onde o plasmídeo doador compre-
30 ende locais de clivagem de endonuclease de restrição ou um local de donagem múltiplo; b) ligação de pelo menos uma molécula de ácido nucléico
compreendendo (i) uma seqüência de ácido nucléico codificando um ou mais
7
antígeno(s) de FMDV, (ii) uma seqüência de promotor viral e (iii) seqüências
de inserção flanqueando (i) e (ii) que têm locais de clivagem de endonuclease de restrição complementares para o plasmídeo doador em antígenos de
FMDV, deste modo produzindo o vetor de avipox recombinante.
5
O método pode compreender ainda as etapas de c) introdução
do vetor em uma célula permissível para replicação do vetor; e d) isolamento
do vetor a partir da célula. Vantajosamente, a célula permissiva para replicação do vetor é um fibroblasto embriônico de galinha.
Em uma outra modalidade, o vetor compreende ainda um gene
10 repórter, que é selecionado do grupo consistindo em gene de resistência à
neomicina, o gene de resistência à ampicilina, lacZ ((3-galactosidase), luciferase e proteína fluorescente verde (GFP).
Esses e outros objetivos da invenção serão descritos em mais
detalhes com relação à descrição detalhada da invenção.
15 BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
A Descrição Detalhada que segue, dada a título de exemplo,
mas não pretendida limitar a invenção às modalidades específicas descritas,
pode ser compreendida em conjunto com os desenhos acompanhantes, incorporados aqui a título de referência. Várias características e modalidades
20 da presente invenção serão agora descritas a título de exemplos nãolimitantes e com referência aos desenhos acompanhantes onde:
A Figura 1 mostra o genoma do vírus da doença febre aftosa
(FMDV) e os genes inseridos nos recombinantes de avipox.
A Figura 2 mostra os iniciadores de oligonucleotídeo usados pa25 ra amplificar através de PCR o cassete do gene de FMDV H6p (SEQ ID
NOs:1-3) e os aminoácidos codificados pelos nucleotídeos (SEQ ID NOs: 4 e
5).
A Figura 3 mostra a construção de um plasmídeo doador de
P1+3C de FMDV de H6p pC5 para geração de recombinantes ALVA, com
30 inserções nos locais C5.
A Figura 4 (4A-4E) mostra as seqüências de nucleotídeo (SEQ
ID NO:6) e aminoácido (SEQ ID NO: 7) do cassete do gene de FMDV H6p
8
C5 do plasmídeo doador de P1+3C de FMDV de H6p pC5.
A Figura 5 mostra a construção do plasmídeo doador de P1+3C
de FMDV de H6p pF8 para geração de recombinantes de vírus do epitelioma
contagioso, com a inserção no local F8 único.
5
A Figura 6 (6A-6F) mostra as seqüências de nucleotídeo (SEQ
ID NO: 8) e aminoácido (SEQ ID NO:9) do cassete de gene de FMDV H6p
F8 do plasmídeo doador de P1+3C de FMDV de H6p pF8.
A Figura 7 mostra os iniciadores de oligonucleotídeo usados para amplificar através de PCR a extremidade 3' do gene do gene de FMDV
10 (SEQ ID NOs: 10-12) e a seqüência de aminoácido codificada pelos nucleotideos (SEQ ID NOs: 13 e 14).
A Figura 8 mostra a construção de um plasmídeo de inserção de
P1+3C de FMDV pC6 menos promotor para introdução de promotores diferentes.
15
A Figura 9 mostra a construção de um plasmídeo doador de
P1+3C de FMDV de H6p de pC6 para geração de recombinantes ALVAC,
com a inserção no local C6 único.
A Figura 10 (10A-10D) mostra as seqüências de nucleotídeo
(SEQ ID NO: 15) e aminoácido (SEQ ID NO: 16) do cassete de gene de
20 FMDV H6p C6 do plasmídeo doador de P1 +3C de FMDV de H6p de pC6.
A Figura 11 mostra as seqüências de nucleotídeo do promotor
H6 inicial/último do tipo selvagem (H6p) (SEQ ID NO: 17) e o promotor H6
adiantado mutante (H6p*) (SEQ ID NO:18).
As Figuras 12A e 12B mostram os iniciadores de oligonucleotí25 deo usados para amplificar um fragmento de 5'-FMDV de H6p* (SEQ ID
NOs:19-23) e os aminoácidos codificados pelos nucleotídeos (SEQ ID
NOs:24 e 25).
A Figura 13 mostra a construção de um plasmídeo doador de
P1+3C de FMDV de H6p* de pC6 para geração de recombinantes ALVAC,
30 com a inserção no local C6 único.
A Figura 14 (14A-14E) mostra as seqüências de nucleotídeo
(SEQ ID NO:26) e aminoácido (SEQ ID NO:27) do cassete do gene de
9
FMDV H6p* de C6 do plasmideo doador de P1+3C de FMDV de H6p* de
pC6.
As Figuras 15A e 15B mostram os iniciadores de oligonucleotídeo usados para amplificar o fragmento de 5'-FMDV de I3Lp (SEQ ID NOs:
5 28-33) e os aminoácidos codificados pelos nucleotídeos (SEQ ID NOs:34 e
35).
A Figura 16 mostra a construção de um plasmídeo doador de
P1+3C de FMDV de I3Lp de pC6 para geração de recombinantes de ALVAC, com a inserção no local C6 único.
A Figura 17 (17A-17D) mostra o nucleotídeo (SEQ ID NO:36) e
10
as seqüências de aminoácido (SEQ ID NO:37) dos cassetes de gene de
FMDV de 13Lp de C6 do plasmídeo doador de P1+3C de FMDV de 13Lp de
pC6.
A Figura 18 mostra os iniciadores de oligonucleotídeo usados
15 para amplificar o fragmento de 5'-FMDV de 42 Kp (SEQ ID NOs:38-43) e os
aminoácidos codificados pelos nucleotídeos (SEQ ID NOs:44 e 45).
A Figura 19 mostra a construção de um plasmídeo doador de
P1+3C de FMDV de 42 Kp de pC6 para geração de recombinantes de ALVAC, com a inserção no local único de C6.
A Figura 20 (20A-20D) mostra as seqüências de nucleotídeo
20
(SEQ ID NO:46) e aminoácido (SEQ ID NO:47) do cassete de gene de
FMDV de 42 Kp C6 do plasmídeo doador de P1 +3C de FMDV de 42 Kp
pC6.
As Figuras 21A-21C mostram os iniciadores de oligonucleotídeo
25 usados para amplificar e reparar o fragmento de 5'-FMDV de 7,5 Kp (SEQ ID
NOs: 48-54) e os aminoácidos codificados pelos nucleotídeos (SEQ
ID
NOs:55-57).
A Figura 22 mostra a construção de um plasmídeo doador de
P1+3C de FMDV de 7,5K para geração de recombinantes de ALVAC, com a
30 inserção no local único C6.
A Figura 23 (23A-23E) mostra as seqüências de nucleotídeo
(SEQ ID NO:58) e aminoácido (SEQ ID NO:59) do cassete de gene de
10
FMDV de 7,5Kp de C6 do plasmídeo doador de P1 +3C de FMDV de 7,5 Kp
de pC6.
As Figuras 24A-24E mostram os iniciadores de oligonucleotídeo
usados para amplificar e reparar o fragmento de 5'-FMDV de Pip (SEQ ID
5 NOs:60-77) e os aminoácidos codificados pelos nucleotídeos (SEQ ID
NOs:78-80).
A Figura 25 mostra a construção do plasmídeo doador de P1+3C
de FMDV de Pip de pC6 para geração de recombinantes de ALVAC, com a
inserção no local C6 único.
A Figura 26 (26A-26D) mostra as seqüências de nucleotídeo
10
(SEQ ID NO:81) e aminoácido (SEQ ID NO:82) do cassete do gene de
FMDV de Pip de C6 do plasmídeo doador de P1 +3C de FMDV de Pip de P6.
A Figura 27 descreve os iniciadores de oligonucleotídeo usados
para amplificar através de PCR um fragmento de 5'-FMDV de H6p* para in15 serção no plasmídeo doador pF8 (SEQ ID NOs:83-86).
A Figura 28 ilustra a construção de um plasmídeo doador de
P1+3C de FMDV de H6p* de pF8 para geração de recombinantes de vírus
do epitelioma contagioso.
A Figura 29 mostra as seqüências de nucleotídeo (SEQ ID
20 NO:87) e aminoácido (SEQ ID NO:88) do cassete de gene de P1+3C de
FMDV de H6p* de F8 do plasmídeo doador de P1+3C de FMDV de H6p* de
pF8.
A Figura 30 mostra a análise de expressão de recombinantes de
ALVAC contendo o cassete de gene de P1+3C de FMDV sob os promotores
25 de I3L ou 42K.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Na presente descrição, "compreende", "compreendendo", "contendo" e "tendo" e similar podem ter o significado dado a eles na lei de Patente U.S. e podem significar "inclui", "incluindo" e similar; "consistindo es30 sencialmente em" ou "consiste essencialmente em" da mesma maneira tem
o significado dado na lei de Patente U.S. e o termo é aberto, permitindo a
presença de mais do que aquilo que é mencionado contanto que as caracte-
11
rísticas básicas ou novas daquilo que é citado não sejam mudadas pela presença de mais o que é citado, mas exclui modalidades da técnica anterior.
Conforme aqui usado, .o termo "operavelmente ligado" significa
que os componentes descritos estão em relação permitindo que eles funcio5 nem em sua maneira pretendida.
Um "antígeno" é uma substância que é reconhecida pelo sistema imune e induz uma resposta imune. Um termo similar usado neste contexto é "imunógeno".
É então um objeto da presente invenção prover composições e
10 métodos para tratamento e profilaxia de infecção com FMDV. É também um
objeto prover um meio para tratar ou prevenir a doença febre aftosa.
Em um aspecto, a presente invenção refere-se a um vetor de
avipox recombinante modificado expressando pelo menos uma seqüência de
ácido nucléico codificando um ou mais antígenos de FMDV. O vetor virai de
15 acordo com a presente invenção é vantajosamente um vírus avipox, tal como vírus do epitelioma contagioso e vírus da varíola dos canários e, mais
particularmente, ALVAC ou TROVAC. O vetor recombinante modificado
compreende uma seqüência de ácido nucléico heteróloga, que codifica uma
proteína antigênica, por exemplo, derivada de ORFs de FMDV que são codi20 ficadas pelas regiões P1 (compreendendo VP1, VP2, VP3, VP4 e 2A), 2B
e/ou 3C.
Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se a um vírus
avipox recombinante modificado que inclui, em uma região não-essencial do
genoma do vírus, pelo menos uma seqüência de ácido nucléico heteróloga
25 que codifica um ou mais antígenos de FMDV, tal como produtos de gene do
gene P1 (compreendendo VP1, VP2, VP3, VP4, 2A), 2B e/ou- 3C.
Em ainda um aspecto adicional, a presente invenção refere-se a
métodos de elicitação de uma resposta imune para FMDV em um indivíduo
compreendendo administrar o vetor avipox recombinante da presente inven30 ção. A presente invenção refere-se também a métodos de elicitação de uma
resposta imune a FMDV em um indivíduo compreendendo administrar o vírus avipox recombinante da presente invenção. Vantajosamente, o vírus avi-
12
pox é selecionado do grupo consistindo em vCP2186, vCP2181, vCP2176 e
vFP2215.
O vírus usado de acordo com a presente invenção é vantajosamente um poxvírus, particularmente um vírus avipox, tal como vírus do epite5 lioma contagioso ou vírus da varíola dos canários. TROVAC refere-se a um
vírus do epitelioma contagioso atenuado que era um isolato clonado de placa derivado da linhagem de vacina FP1 de vírus do epitelioma contagioso
que é licenciada para vacinação de pintinhos de 1 dia de vida. ALVAC é um
vetor à base de vírus da varíola dos canários atenuado que era um derivado
10 clonado de placa da vacina de vírus da varíola dos canários licenciada, Kanapox (Tartaglia e outros, 1992). Vírus recombinantes baseados em ALVAC
expressando imunógenos extrínsecos foram também demonstrados ser eficazes como vetores de vacina (Tartaglia e outros, 1993, a,b). Em culturas de
célula humana, a replicação do vírus da varíola dos canários é abortada logo
15 no início do ciclo de replicação viral antes da síntese de DNA virai. Não obstante, quando construído para expressar imunógenos extrínsecos, expressão e processamento autênticos são observados in vitro em células de mamífero e inoculação em várias espécies de mamífero induz respostas imunes
de anticorpo e celulares ao imunógeno extrínseco e provê proteção contra
20 provocação com o patógeno cognato (Taylor e outros, 1992; Taylor e outros,
1991).
ALVAC e TROVAC foram também reconhecidos como únicos
dentre os vírus avipox pelo fato de que o National Institute of Health ("NIH";
U.S. Public Health Service), Recombinant DNA Advisory Committeee, que
25 edita orientações para a detenção física de material genético tal como vírus
e vetores, isto é, orientações para procedimentos de segurança para o uso
de tais vírus e vetores, que são baseadas na patogenicidade do vírus ou vetor particular, permitiu uma redução no nível de detenção física: de BSL2 a
BSL1. Nenhum outro vírus avipox tem um nível de detenção física de BSL1.
30 Mesmo a linhagem Copenhagen de vírus vaccinia - - a vacina da varíola comum -- tem um nível de detenção física maior; a saber, BSL2. Deste modo,
a técnica reconheceu que ALVAC e TROVAC têm uma patogenicidade me-
13
nor do que outros vírus avipox.
Vantajosamente, o vetor de vírus avipox é um ALVAC ou um
vírus da varíola dos canários (linhagem da vacina Rentschler), que foi atenuado através de 200 ou mais passagens nos fibroblastos de embrião de
5 galinha, após o que uma semente master dele foi submetida a quatro purificações de placa sucessivas sob ágar, a partir do que um clone foi amplificado através de cinco passagens adicionais. O vetor do vírus avipox pode ser
também um vírus do epitelioma contagioso, ou um vírus do epitelioma contagioso atenuado tal como TROVAC.
10
A invenção refere-se ainda ao produto de expressão do vírus
avipox recombinante da invenção e seus usos, tal como para formar composições antigênicas, imunológicas ou de vacina para tratamento, prevenção,
diagnóstico ou teste; e a DNA do vírus avipox recombinante que são úteis na
construção de sondas de DNA e iniciadores de PCR.
15
Em um aspecto, a presente invenção refere-se a vírus avipox
recombinante contendo pelo menos urna seqüência de ácido nucléico expressando um ou mais antígenos de FMDV, vantajosamente em uma região
não-essencial do genoma do vírus avipox. O vírus avipox pode ser um vírus
do epitelioma contagioso, especialmente um vírus do epitelioma contagioso
20 atenuado tal como TROVAC, ou vírus da varíola dos canários, especialmente um vírus da varíola dos canários atenuado, tal como ALVAC.
De acordo com a presente invenção, o vírus avipox recombinante e os vetores virais de avipox expressam pelo menos uma seqüência de
ácido nucléico codificando um ou mais antígenos de FMDV. Em particular,
25 qualquer um ou todos os genes ou estruturas de leitura aberta (ORFs) codificando os antígenos de FMDV podem ser isolados, caracterizados e inseridos em recombinantes de ALVAC. O vírus avipox recombinante resultante é
usado para infectar um animal. A expressão no animal de antígenos de
FMDV resulta em uma resposta imune no animal a FMDV. Deste modo, o
30 vírus avipox recombinante da presente invenção pode ser usado em uma
composição ou vacina imunológica para prover um meio para induzir uma
resposta imune, que pode, mas não precisa ser, protetora. As técnicas de
14
biologia molecular usadas são descritas por Sambrook e outros, (1989).
A invenção também compreende antígenos de FMDV que podem ser aplicados como um plasmídeo ou vetor de DNA nu, ou vacina de
DNA ou composições imunológicas ou imunogênicas compreendendo molé5 cuias de ácido nucléico codificando e expressando in vivo um antígeno(s) de
FMDV.
O antígeno de FMDV de interesse pode ser obtido de FMDV ou
pode ser obtido a partir da expressão recombinante in vitro e/ou in vivo de
gene(s) de FMDV ou suas porções. O antígeno de FMDV de interesse pode
10 também ser provido usando seqüências de FMDV sintéticas. O antígeno de
FMDV de interesse pode ser, mas não está limitado a: Lb, Lab, P1-2A (compreendendo VP1, VP2, VP3, VP4 e 2A); P2 (compreendendo 2B e 2C) e P3
(compreendendo 3A, 3B, VPg, 3C e 3D) ou suas porções. Em uma modalidade vantajosa, os antígenos de FMDV são P1 e C3. Em uma modalidade
15 particularmente preferida, os antígenos de FMDV são P1-2A ou P1-2A, 2B.
Referência é feita aqui ao Pedido de Patente U.S. No. de Série 10/327.481,
que se refere ao isolamento de seqüências de genoma de FMDV, cujos conteúdos são aqui incorporados a título de referência.
Regiões não-essenciais foram definidas na técnica (Johnson e
20 outros (1993) Virology 196:381-401) para vírus vaccinia. Esses locais, também referidos aqui como "locais de inserção", são descritos nas Patentes
U.S. Nos. 6.340.462 e 5.756.103 para ALVAC, cujos conteúdos são aqui
incorporados a título de referência, e incluem, mas não estão limitados a,
timidina cinase (TK), hemaglutinina (HA), M2L, C6 e outros locais. Em uma
25 modalidade, onde vírus da varíola dos canários for usado, o local de inserção é C6. Em uma outra modalidade, onde vírus do epitelioma contagioso
for usado, o local de inserção é F8.
A inserção de seqüências de ácido nucléico codificando antígenos de FMDV pode ser facilitada pela recombinação homóloga, onde a se30 qüência de FMDV de interesse é flanqueada por seqüências correspondendo a estruturas de leitura aberta virais de avipox imediatamente adjacentes
ao local de inserção (daqui em diante referidas como "seqüências de flan-
15
queamento" ou "seqüências de inserção"). Recombinação homóloga é facilitada pelo reconhecimento de seqüências de flanqueamento homólogas, que
promove integração das seqüências de FMDV no local de inserção de interesse. A título de exemplo, a inserção de seqüências de FMDV no local C6
5 requer a presença de ORFs C6L e C6R em qualquer lado da seqüência de
ácido nucléico codificando o antígeno de FMDV de interesse no vetor virai.
Deste modo, vantajosamente os locais de inserção são C6 e as seqüências
de flanqueamento compreendem C6L e C6R. Onde o local de inserção for
F8 for usado, as seqüências de flanqueamento compreendem F8L e F8R.
10 Os vetores virais recombinantes da invenção expressando antígenos de FMDV podem ser replicados ou produzidos em células ou linhagens de célula, ou in vivo ou em um hospedeiro ou indivíduo. Uma modalidade alternativa consiste em replicação do vetor em células permissivas para replicação do vetor.
15
Deve ser notado que os vírus avipox podem apenas produtivamente replicar em ou ser passados em espécies de aves ou linhagens de
célula de ave tal como, por exemplo, fibroblastos embriônicos de galinha ou
QT35. Os vírus avipox recombinantes coletados de células hospedeiro de
ave, quando inoculados em um vertebrado não-ave, tal como um mamífero,
20 de uma maneira análoga à inoculação de mamíferos pelo vírus vaccinia,
sem replicação produtiva do vírus avipox. Apesar da falha do vírus avipox
em replicar produtivamente em tal vertebrado não-ave inoculado, expressão
suficiente do vírus acontece de modo que o animal inoculado responde imunologicamente aos determinantes antigênicos do vírus avipox recombinante
25 e também aos determinantes antigênicos codificados em genes exógenos a
ele. Deste modo, em uma modalidade vantajosa, quando vírus avipox ou
vetores virais são usados, fibroblastos embriônicos de galinha ou QT35 são
preferidos como as células permissivas para replicação de vetor virai.
Os vetores virais recombinantes ou vírus recombinantes podem
30 conter promotores que são operavelmente ligados ao antígenos de FMDV da
presente invenção. O promotor é vantajosamente de origem poxviral e vantajosamente promotores iniciais, iniciais-últimos, que podem ser, em particu-
16
lar, o promotor P11 K do vírus vaccinia, promotor de poxviral I3L, promotor de
poxviral 42K, promotor de poxviral H6, promotor de poxviral Pi, P28K do vírus vaccinia, P160K ATI do vírus da vacínia. Em particular, a seqüência dirigindo a transcrição inicial de um promotor inicial-último pode ser usada ao
5 invés do promotor de comprimento completo (Moss, B. (1990) Am. Rev. Bio-
chem. 59:661-688; Mars, M. e outros (1987) J. Mol. Biol. 198:619-631; Davison, A. e outros (1989) J. Mol. Biol. 210:749-769; Vassef, A. (1987) Nucl.
Acid. Res. 15:1427-1443). O promotor é vantajosamente um promotor fraco.
Os termos "promotor forte" e "promotor fraco" são conhecidos na técnica e
10 são definidos pela freqüência relativa de iniciação de transcrição (vezes por
minuto) no promotor.
A invenção também provê promotores poxvirais que são mutados. Os presentes inventores verificaram que a expressão de certos antígenos de FMDV não é possível a partir de promotores poxvirais fortes. Sem ser
15 limitado pela teoria, acredita-se que níveis altos de expressão de antígenos
de FMDV potencialmente tóxicos possam precludir formação de recombinantes poxvirais estáveis. Deste modo, a presente invenção também compreende o uso de um promotor poxviral mutado, tal como, por exemplo, um promotor H6 mutado, de modo que os níveis de expressão dos antígenos de
20 FMDV são diminuídos comparado com os níveis de expressão dos antígenos de FMDV sob um promotor do tipo selvagem (Davison, A. e outros,
(1989) J. Mol. Biol. 210:749-769). O promotor H6 mutado da presente invenção pode ser considerado um promotor fraco.
O promotor H6 mutado ensinado aqui contém uma mutação por
25 ponto. A invenção pode também empregar promotores outros que não H6,
que contêm mutações por ponto que reduzem sua freqüência de iniciação de
transcrição comparado com o promotor do tipo selvagem. Ainda, outros tipos
de promotores mutados são adequados para uso na presente invenção. Por
exemplo, o pedido U.S. No. 10/679/520 incorporado aqui a título de referên30 cia descreve uma forma truncada do promotor H6 (vide também Davison, A.
e outros (1989) J. Mol. Biol. 210:749-769; Taylor J. e outros, Vaccine, 1988,
6, 504-508; Guo, P. e outros, J. Virol., 1989, 63, 4189-4198; Perkus, M. e
17
outros, J. Virol., 1989, 63, 3829-3836).
A presente invenção refere-se também a um método de produção de um vetor de avipox recombinante compreendendo antígenos de
FMDV compreendendo as etapas de linearização de um plasmídeo doador
5 com uma endonuclease de restrição, onde o plasmídeo doador compreende
locais de clivagem de endonuclease de restrição ou um local de clonagem
múltiplo, e ligação de pelo menos uma seqüência de ácido nucléico compreendendo (i) uma seqüência de ácido nucléico codificando um ou mais antígeno(s)de FMDV, (ii) uma seqüência de promotor virai e (iii) seqüências de
10 inserção flanqueando (i) e (ii) que têm locais de clivagem de endonuclease
de restrição complementares para o plasmídeo doador em antígenos de
FMDV, deste modo produzindo o vetor de avipox recombinante. Vantajosamente, o método compreende ainda as etapas de introdução do vetor em
uma célula permissiva para replicação do vetor, e isolamento do vetor a par15
tir da célula.
Por definição, um vetor de expressão de plasmídeo doador (ou
plasmídeo doador) inclui uma unidade de transcrição de DNA compreendendo uma seqüência de polinucleotídeo contendo o cDNA a ser expresso e os
elementos necessários para sua expressão in vivo. O plasmídeo doador po-
20 de também incluir um sinal de terminação inicial poxviral no terminal 3' do
gene estrangeiro (Moss, B. (1990) Ann. Ver. Biochem., 59:661-688). A forma
do plasmídeo circular, superenrolada ou não-enrolado é preferida. A forma
linear também está no escopo da presente invenção.
Métodos para fabricação e/ou uso de vetores (ou recombinan25 tes) para expressão e usos de produtos de expresso e produtos deles (tal
como, anticorpos) podem ser através dos ou análogos aos métodos descritos nos documentos citados aqui e documentos referidos ou citados aqui em
documento citados aqui. Vide, por exemplo, Sambrook e outros, Molecular
Cloning (1999). A invenção inclui também o uso dos vetores de avipox ex-
30 pressando antígenos de FMDV no local de pesquisa. Os vetores de avipox
recombinantes e os vírus avipox recombinantes podem ser usados para
transfectar ou infectar células ou linhagens celulares de interesse para estu-
18
do, por exemplo, respostas celulares a antígenos de FMDV, ou cursos de
transdução de sinal mediados por antígenos de FMDV.
No local de pesquisa, é muitas vezes vantajoso produzir vetores
ou vírus recombinantes que compreendam genes repórter que possam ser
5 detectados facilmente através de ensaios e técnicas de laboratório. Genes
repórter são bem conhecidos na técnica e podem compreender genes de resistência a antibiótico tal como, mas não limitado a, ampicilina, neomicina,
zeocina, canamicina, bleomicina, higromicina, cloranfenicol, dentre outros.
Os genes repórter podem também compreender proteína fluorescente verde,
10
o gene lacZ (que codifica (3-galactosidase), luciferase e P-glucuronidase.
A invenção refere-se também a um método de elicitação de uma
resposta imune contra a doença febre aftosa em um indivíduo compreendendo administrar os vetores de avipox ou vírus avipox recombinantes de
acordo com a presente invenção ao indivíduo. O indivíduo pode ser qualquer
15 animal que possa ser infectado com FMDV, em particular espécies bovinas,
ovinas, porcinas ou caprinas. Métodos de administração e dosagem são definidos aqui.
Os vetores e vírus avipox recombinantes expressando antígenos
de FMDV ou um seu produto de expressão, composições imunológicas, an20 tigênicas ou de vacina ou composições terapêuticas, podem ser administrados através de via parenteral (intradermal, intramuscular ou subcutânea). Tal
administração permite uma resposta imune sistêmica ou respostas humorais
ou mediadas por célula.
Conforme aqui usado, os termos "composições imunogênica" e
25 "composição imunológica" e "composição imunogênica ou imunológica"
compreendem qualquer composição que elicite uma resposta imune contra o
antígenos de FDMV alvo; por exemplo, após administração da injeção ao
animal, elicita uma resposta imune contra o antígeno de FMDV alvo. Os termos "composição de vacina" e "vacina" e "composição de vacina" compre30 endem qualquer composição que induza uma resposta imune protetora contra o antígeno de FMDV ou que proteja com eficácia contra o antígeno após
administração ou injeção no animal. A invenção compreende também veto-
19
res virais de avipox recombinantes administrados como vetores ou vacina de
DNA de plasmídeo.
Mais geralmente, os vetores virais de avipox recombinantes e os
vírus avipox recombinantes da invenção expressando antígenos de FMDV,
5 composições de FMDV do vírus avipox antigênicas, imunogênicas, imunológicas ou de vacina ou composições terapêuticas, podem ser preparados de
acordo com técnicas padrão bem conhecidas daqueles de habilidade na técnica farmacêutica ou veterinária. Tais composições podem ser administradas
em dosagens e através de técnicas bem conhecidas daqueles versados na
10 técnica médica ou veterinária levando em consideração fatores tal como a
idade, sexo, peso, espécie e condição do paciente particular e a via de administração.
As composições podem ser administradas sozinhas ou podem
ser co-administradas ou seqüencialmente administradas com composições,
15 por exemplo, com "outras" composições imunológicas, antigênicas ou de
vacina ou terapêuticas deste modo provendo composições multivalentes ou
"coquetel" ou combinando composições da invenção e métodos para seu
emprego. Novamente, os ingredientes e a maneira (seqüencial ou coadministração) de administração, bem como as dosagens, podem ser de20 terminados levando em consideração fatores tal como a idade, sexo, peso,
espécie e condição do indivíduo particular e a via de administração. Com
relação a isto, referência é feita à Patente U.S. No. 5.843.456, incorporada
aqui a título de referência, e direcionada a composições de raiva e composições de combinação e seus usos.
25
Exemplos de composições da invenção incluem preparações
líquidas para orifício ou mucosa, por exemplo, administração oral, nasal, vaginal, perorai, intragástrica, etc, tal como suspensões, soluções, sprays, xaropes ou elixires; e preparações para administração parenteral, subcutânea,
intradermal, intramuscular ou intravenosa (por exemplo, administração inje-
30 tável) tal como suspensões ou emulsões estéreis. Em tais composições, o
vírus avipox recombinante e os vetores virais de avipox recombinante podem
estar em mistura com um veículo, diluente ou excipiente adequado tal como
20
água, solução salina fisiológica, glicose ou similar. As composições podem
ser também liofilizadas. As composições podem conter substâncias auxiliares, tal como agentes umectantes ou emulsificantes, agente de tamponamento de pH, adjuvantes, aditivos de aumento de geleificação ou viscosida5 de, preservativos, agentes aromatizantes, corantes e similar, dependendo da
via de administração e da preparação desejada. Textos padrão, tal como
"REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCE", 17a edição, 1985, incorporado aqui a título de referência, podem ser consultados para preparar preparações adequadas, sem experimentação indevida.
Composições em formas para várias vias de administração são
10
pretendidas pela invenção. E, novamente, a dosagem e a via de administração eficazes são determinadas através de fatores conhecidos, tal como idade, sexo, peso, condição e natureza do animal, bem como LD50 e outros
procedimentos de avaliação que são conhecidos e não requerem experimen15 tação indevida. As dosagens de cada agente ativo podem ser como nos documentos aqui citados (ou documentos referidos ou citados nos documentos
aqui citados) e/ou podem variar de um a algumas centenas ou milhares de
microgramas, por exemplo, 1 gg a 1 mg, para uma composição de vacina
imunogênica, imunológica ou de vacina; e 10 4 a 10 10 TCID50 vantajosamen20 te 106 a 108 TCID50 para uma composição imunogênica, imunológica ou de
vacina.
Recombinantes ou vetores podem ser administrados em uma
quantidade adequada para se obter expressão in vivo correspondendo às
dosagens descritas aqui e/ou nos documentos aqui citados. Por exemplo,
25 faixas adequadas para suspensões virais podem ser determinadas empiricamente. O vetor ou recombinante virai na invenção pode ser administrado a
um animal ou infectado ou transfectado em células em uma quantidade de
cerca de pelo menos 103 pfu; mais vantajosamente cerca de 10 4 pfu a cerca
de 10 10 pfu, por exemplo, cerca de 10 5 pfu a cerca de 10 9 pfu, por exemplo,
30 cerca de 10 6 pfu a cerca de 108 pfu, com dosagens geralmente variando de
a partir de cerca de 106 a cerca de 10 10, vantajosamente cerca de 10 8
7 pfu por dose de 2 ml. E, se mais de pfu/dosevantjmcrde10
21
um produto de gene for expresso por mais de um recombinante, cada recombinante pode ser administrado nessas quantidades; ou cada recombinante pode ser administrado de modo que haja, em combinação, uma soma
de_recombinantes compreendendo essas quantidades.
5
Em composições de vetor ou plasmídeo empregadas na invenção, as dosagens podem ser conforme descrito em documentos citados aqui
ou conforme aqui descrito ou como em documentos referidos ou citados em
documentos aqui citados. Vantajosamente, a dosagem deve ser uma quantidade suficiente de plasmídeo para elicitar uma resposta análoga a composi-
10 ções onde o(s) antígenos(s) de FMDV estão diretamente presentes; ou ter
análogos de expressão para dosagens em tais composições; ou ter análogos de expressão para expressão obtida in vivo através de composições
recombinantes. Por exemplo, onde vacinas de DNA são administradas,
quantidades adequadas de cada DNA de plasmídeo em composições de
15 plasmídeo podem ser 1 pg a 2 mg, vantajosamente 50 gg a 1 mg. Os documentos citados aqui (ou documentos citados ou referidos nos documentos
aqui citados) com relação aos vetores de plasmídeo de DNA podem ser
consultados pelo versado na técnica para averiguar outras dosagens adequadas para composições de vetor de plasmídeo de DNA da invenção, sem
20 experimentação indevida.
No entanto, a dosagem da(s) composição(ões), concentrações
dos componentes nela e momento de administração da(s) composição(ões),
que elicitam uma resposta imunológica adequada, podem ser determinados
através de métodos tal como através de titrações de anticorpo de soros, por
25 exemplo, através de ELISA e/ou análise de ensaio de soroneutralização.
Tais determinações não requerem experimentação indevida a partir do conhecimento do versado na técnica, da presente descrição e dos documentos
aqui citados. E o momento para administrações seqüenciais pode ser da
mesma maneira averiguado com métodos que podem ser averiguados atra30 vés da presente descrição, e do conhecimento na técnica, sem experimentação indevida.
As composições imunogênicas ou imunológicas compreendidas
22
pela presente invenção podem também conter um adjuvante. Adjuvantes
particularmente adequados para uso na prática da presente invenção são (1)
polímeros de ácido acrílico ou metacrílico, polímeros derivados de anidrido
maléico e alquenila, (2) seqüências de imunoestimulação (ISS), tal como
5 seqüências de oligodesoxirribonucleotídeo tendo uma ou mais unidades
CpG não-metiladas (Klinman, D.M. e outros, Proc. Natl. Acad. Sci., USA,
1996, 93, 2879-2883; WO 98/16247), (3) uma emulsão óleo em água, tal
como a emulsão SPT descrita em p 147 de "Vaccine Design, The Subunit
and Adjuvant Approach" publicado por M. Powell, M. Newman, Plenum
10 Press, 1995 e a emulsão MF59 descrita na p 183 do mesmo trabalho, (4)
lipídeos catiônicos contendo um sal de amônio quaternário, (5) citocinas, (6)
hidróxido de alumínio ou fosfato de alumínio ou (7) outros adjuvantes discutidos em qualquer documento citado e incorporado a título de referência no
presente pedido ou (8) quaisquer combinações ou misturas deles. As vaci15 nas de DNA ou composições imunogênicas ou imunológicas compreendidas
pela presente invenção podem ser formuladas com um lipossoma, na presença ou ausência de um adjuvante conforme acima descrito.
Outros adjuvantes adequados incluem fMLP (N-formil-metionilleucil-fenilalanina; Patente U.S. No. 6.017.537) e/ou polímero de ácido acríli20 co ou ácido metacrílico e/ou um copolímero de anidrido maléico de derivado
de alquenila. Os polímeros de ácido acrílico ou ácido metacrílico podem ser
ligados com cruzamento, por exemplo, com polialquenil éteres de açúcares
de poliálcoois. Esses compostos são conhecidos sob o termo "carbômero"
(Pharmeuropa, Vol. 8, No. 2, Junho, 1996). Uma pessoa versada na técnica
25 pode também se referir à Patente U.S. No. 2.909.462 (incorporada aqui a
título de referência), que discute tais polímeros de acrílico ligados com cruzamento com um composto poliidroxilado contendo pelo menos 3 grupos
hidroxila: em uma modalidade, um composto poliidroxilado não contém mais
do que 8 grupos hidroxila; em uma outra modalidade, os átomos de hidrogê30 nio de pelo menos 3 hidroxilas são substituídos com radicais alifáticos insaturados contendo pelo menos 2 átomos de carbono; em outras modalidades,
radicais contendo de a partir de cerca de 2 a cerca de 4 átomos de carbono,
23
por exemplo, vinilas, alilas e outros grupos etilenicamente insaturados. Os
radicais insaturados podem conter outros substituintes, tal como metila. Os
produtos vendidos sob o nome Carbopol ® (Noveon, Inc., Ohio, USA) são
particularmente adequados para uso como um adjuvante. Eles são ligados
5 com cruzamento com uma alil sucrose ou com alilpentaeritritol, como para as
quais, menção é feita aos produtos Carbopol ® 974P, 934P e 971 P.
Como para os copolímeros de anidrido maléico e de derivado
alquenila, menção é feita aos produtos EMA® (Monsanto), que são copolímeros de anidrido maléico e de etileno, que podem ser lineares ou ligados com
10 cruzamento, por exemplo, ligados com cruzamento com divinil éter. Também, referência pode ser feita a J. Fields e outros, Nature, 186:778-780,
1960 (incorporado aqui a título de referência).
Com relação à estrutura, os polímeros de ácido acrílico ou metacrílico e EMA são vantajosamente formados através de unidades básicas
15 tendo a fórmula que segue:
Ri i
i
-
/
--C-tCH2+-C-ECH4---xi
1
COOH
COOH
onde:
R1 e R2, que podem ser iguais ou diferentes, representam H ou
CH3
x = O ou 1, vantajosamente x = 1
20 -
y = 1 ou 2, com x + y = 2.
Para EMA, x=0ey=2e para carbômeros x = y = 1.
Esses polímeros são solúveis em água ou solução salina fisiológica (20 g/I de NaCI) e o pH pode ser ajustado para 7,3 a 7,4, por exemplo,
através de soda (NaOH), para prover a solução adjuvante onde o(s) ve25 tor(es) de expressão podem ser incorporados. A concentração de polímero
na composição de vacina final pode variar entre 0,01 e 1,5% p/v, vantajosamente 0,05 a 1% p/v e vantajosamente 0,1 a 0,4% p/v.
Os lipídeos catiônicos contendo um sal de amônio quaternário
que são vantajosos mas não exclusivamente adequados para plasmídeos
24
são vantajosamente aqueles tendo a fórmula que segue:
CH3
+
R7-0-0t---CH-CHFN-RT- X
ORA
CH3
onde R1 é um radical alifático de cadeia reta saturado ou insaturado tendo
12 a 18 átomos de carbono, R2 é um outro radical alifático contendo 2 ou 3
átomos de carbono e X é um grupo amina ou hidroxila.
5
Dentre esses lipídeos catiônicos, preferência é dada a DMRIE
(N-(2-hidroxietil)-N,N-dimetil-2,3-bis(tetradecilóxi)-1-propano
amônio;
W096/34109), vantajosamente associado com um lipídeo neutro, vantajosamente DOPE (dioleoil-fosfatidil-etanol amina; Behr, J.P., 1994, Bioconju-
gate Chemistry, 5, 382-389), para formar DMRIE-DOPE.
10
Vantajosamente, a mistura de plasmídeo com o adjuvante é formada extemporaneamente ou contemporaneamente com administração da
preparação ou um pouco antes da administração da preparação; por exemplo, um pouco antes ou antes da administração, da mistura de plasmídeoadjuvante ser formada, vantajosamente de modo a dar tempo suficiente an-
15 tes da administração para a mistura formar um complexo, por exemplo, entre
cerca de 10 e cerca de 60 minutos antes da administração, tal como aproximadamente 30 minutos antes da administração.
Quando DOPE está presente, a razão molar de DMRIE:DOPE é
vantajosamente cerca de 95: cerca de 5 a cerca de 5:cerca de 95, mais van20 tajosamente cerca de 1:cerca de 1, por exemplo, 1:1.
A razão em peso de adjuvante:plasmídeo DMRIE ou DMRIEDOPE pode estar entre cerca de 50:cerca de 1 e cerca de 1:cerca de 10, tal
como cerca de 10:cerca de 1 e cerca de 1:cerca de 5 e vantajosamente cerca de 1:cerca de 1 e cerca de 1:cerca de 2, por exemplo, 1:1 e 1:2.
25 Uma vacina recombinante ou composições imunogênica ou imunológica pode ser também formulada na forma de uma emulsão óleo-emágua. A emulsão óleo-em-água pode ser baseada, por exemplo, em óleo de
parafina líquida leve (tipo Farmacopéia Européia); óleo de isoprenóide tal
como esqualano, esqualeno, EICOSANE ® ou tetratetracontana; óleo resul-
25
tante da oligomerização de alceno(s), por exemplo, isobuteno ou deceno;
ésteres de ácidos ou de álcoois contendo um grupo alquila linear, tal como
óleos de planta, oleato de etila, di(caprilato/caprato) de propileno glicol, gliceril tri(caprilato/caprato) ou propileno glicol dioleato; ésteres de ácidos graxos
5 ramificados ou álcoois, por exemplo, ésteres do ácido isoesteárico. O óleo é
vantajosamente usado em combinação com emulsificantes para formar a
emulsão. Os emulsificantes podem ser tensoativos não-iônicos, tal como
ésteres de sorbitano, manida (por exemplo, oleato de anidromanitol), glicerol, poliglicerol, propileno glicol, e ácido oleio:), isoesteárico, ricinoléico ou
10 hidroxiesteárico, que são opcionalmente etoxilados e blocos de copolímero
de polioxipropileno-polioxietileno, tal como os produtos Pluronic ®, por exemplo, L121. O adjuvante pode ser uma mistura de emulsificante(s), agente de
formação de micela e óleo, tal como aquela que é disponível sob o nome
Provax® (IDEC Pharmaceuticals, San Diego, CA).
15
O termo "inicial-reforço" refere-se às administrações sucessivas
de dois tipos diferentes de vacina ou composições imunogênicas ou imunológicas tendo pelo menos um antígeno em comum. A administração inicial
(inicialização) é a administração de um primeiro tipo de vacina ou composição imunogênica ou imunológica e pode compreender uma, duas ou mais
20 administrações. A administração de reforço é a administração de um segundo tipo de vacina ou composição imunogênica ou imunológica e pode compreender uma, duas ou mais administrações, e, por exemplo, pode compreender ou consistir essencialmente em administrações anuais.
Deste modo, a invenção compreende método de imunização ou
25 vacinação inicial-reforço de um animal contra pelo menos um antígeno de
FMDV compreendendo administrar ao animal uma vacina ou composição
imunológica ou imunogênica de DNA de inicialização compreendendo molécula(s) de ácido nucléico codificando e expressando in vivo um antígeno(s)
de FMDV, e em seguida administração de uma composição de reforço que
30 compreende o antígeno de FMDV expresso pela vacina ou composição imunogênica ou imunológica de DNA, ou um vetor recombinante ou modificado,
por exemplo, vírus, tal como um vírus avipox (tal como ALVAC, vírus da va-
26
ríola dos canários, TROVAC ou vírus do epitelioma contagioso) que contém
e expressa em uma célula hospedeiro animal uma seqüência de nucleotídeo
codificando o antígeno de FMDV expresso pela vacina ou composição imunogênica ou imunológica de DNA. A vacina ou composição imunogênica ou
5 imunológica de reforço pode ser igual ou diferente da vacina ou composição
imunogênica ou imunológica de inicialização.
Por exemplo, a vacina ou composição imunogênica ou imunológica de reforço pode ser vantajosamente o antígeno de FMDV expresso pela
vacina de DNA (ou composição imunogênica ou imunológica) e/ou vetor de
10 avipox recombinante ou modificado, por exemplo, vírus, vacina ou composição imunogênica ou imunológica. Um vetor recombinante ou modificado é
vantajosamente um vetor de expressão in vivo, tal como uma bactéria, levedura, vírus modificado ou recombinante, por exemplo, vírus avipox, compreendendo molécula(s) de ácido nucléico codificado e expressando in vivo o(s)
15 antígeno(s) de FMDV expressos pela vacina de DNA ou composição imunogênica ou imunológica. O reforço é vantajosamente realizado com uma vacina ou composição imunogênica ou imunológica inativada, ou com uma vacina ou composição imunogênica ou imunológica compreendendo um vetor
viral vivo recombinante, tal como um vírus avipox recombinante, que com20 preende molécula(s) de ácido nucléico codificando e expressando in vivo
o(s) antígeno(s) do antígeno de FMDV expressos pela vacina ou composição imunogênica ou imunológica de DNA. Deste modo, é vantajoso que o
reforço compreenda ou o antígeno expresso pela vacina de DNA ou composição imunogênica ou imunológica ou expresse in vivo o mesmo antígeno de
25 FMDV expresso pela vacina ou composição imunogênica ou imunológica de
DNA. Vantajosamente, o reforço compreende o vírus avipox recombinante
expressando os antígenos de FMDV aqui descritos.
Alternativamente, o método de imunização ou vacinação inicialreforço pode compreender administrar ao animal uma vacina de inicialização
30 compreendendo os vírus avipox recombinantes da presente invenção e reforço em seguida com a vacina de DNA.
O plasmídeo de DNA, ou vetor de avipox recombinante expres-
27
sando uma ou mais das seqüências de ácido nucléico codificando pelo menos um antígeno de FMDV, por exemplo, vetor de acordo com esta descrição, pode ser preservado e/ou conservado e armazenado ou em forma líquida, por volta de 5 ° C, ou em forma liofilizada ou seca com congelamento, na
5 presença de um estabilizador. A secagem com congelamento pode ser de
acordo com procedimentos de secagem com congelamento padrão bem conhecidos. Os estabilizadores farmaceuticamente aceitáveis podem ser SPGA (sacarose fosfato glutamato albumina; Bovarnik e outros, J. Bacteriology,
59:509, 1950), carboidratos (por exemplo, sorbitol, manitol, lactose, sacaro10 se, glicose, dextrano, trealose), glutamato de sódio (Tsevetkov, T. e outros,
Cryobiology 20(3):318-23, 1983; lsraeli, E. e outros, Cryobiology 30(5):519-
23, 1993), proteínas tal como peptona, albumina ou caseína, agentes contendo proteína tal como leite desnatado (Mills, C.K. e outros, Cryobiology
25(2):148-52, 1988; Wolff, E. e outros, Cryobiology 27(5):569-75, 1990) e
15 tampões (por exemplo, tampão de fosfato, tampão de fosfato de metal alcalino). Um adjuvante e/ou um veículo ou excipiente pode ser usado para tornar solúveis as preparações secas com congelamento.
A invenção será agora descrita mais por meio dos Exemplos
não-limitantes que seguem, dados a título de ilustração.
20 EXEMPLOS
Exemplo 1: Construção de um plasmídeo doador de P1+3C de FMDV de
H6p de pC5 para introdução de genes de FMDV nos locais C5 de ALVAC
O plasmídeo pAd5-A24 foi usado como o plasmídeo doador para
gerar o adenovírus Ad5A24 recombinante. Ele é um plasmídeo de —39 kb
25 contendo a linhagem A24 de genes P1 e a linhagem Al2 de protease 3C.
Várias deleções do genoma de FMDV foram feitas por razões de segurança
e são indicadas na Figura 1.
O plasmídeo pAd5-A24 foi digerido com EcoRI e Xbal e o fragmento de —3,4 kb contendo os genes de FMDV foi inserido em pUC8 com
30 locais BglIl e Xbal adicionados ao local de clonagem múltiplo). O plasmídeo
de FMDV pUC de 6 kb (chamado pHM-1119-1) foi usado como a fonte dos
genes de FMDV em todos os construtos futuros.
28
O promotor de H6 (H6p) é um promotor inicial/último derivado do
gene H6 de vaccinia (Perkus, M.E. e outros, (1989) J. Virol., 63:3829-3836),
que é chamado o gene H5 na linhagem de vaccinia Copenhagen. O H6p é
um promotor forte que tem sido usado extensivamente em recombinantes de
5 avipox para expressão do gene estrangeiro.
O plasmideo pHM-1119-1 foi usado como o molde para amplificação de PCR com os iniciadores 11277.SL e 11282.SL. Esses iniciadores
introduziram a extremidade 3' do promotor de H6 de vaccinia, bem como
sinais de parada de tradução e transcrição, e locais de restrição Xbal e Ba10
mHI para clonagem. As seqüências de iniciador são mostradas na Figura 2.
O produto de PCR de 3,4 kb foi clonado no pCR2.1 para gerar o plasmídeo
pHM-1151-4, pCR2.1 de H6p de FMDV.
O plasmídeo pCXL-148-2 é um plasmideo de inserção de ALVAC para os locais C5, que contém o promotor de H6 do vírus vaccinia. O
15 fragmento Nrul-Xbal de 3,4 kb de pHM-1151-4 foi inserido em pCXL-148-2
para gerar P1+3C de FMDV de H6p de pC5 (pHM-1175-1). A construção de
pHM-1175-1 é ilustrada na Figura 3 e a seqüência do cassete do gene de
FMDV de H6p de C5 é mostrada na Figura 4.
Apesar das múltiplas tentativas, quaisquer recombinantes de
20 ALVAC foram gerados a partir de P1+3C de FMDV de H6p de pC5, pHM1175-1.
Exemplo 2. Construção de um plasmídeo doador de P1+3C de FMDV de
H6p de pF8 para introdução de genes de FMDV no local F8 de vírus do epitelioma contagioso
25
O plasmídeo pSL-6427-2-1 (H6p de pF8) é um plasmídeo de
inserção de vírus do epitelioma contagioso, que contém o promotor de H6 do
vírus vaccinia. O fragmento Nrul-BamH de 3,4 kb de pHM-1151-4 (FMDV de
H6p de pCR2.1; vide Exemplo 1) foi inserido no pSL-6427-2-1, gerando o
vetor pHM-1180-11 (P1+3C de FMDV de H6p de pF8). A construção do
30 pHM-1180-11 é ilustrada na Figura 5 e a seqüência do cassete do gene de
FMDV de H6p de F8 é mostrada na Figura 6.
Apesar de tentativas múltiplas, quaisquer recombinantes de ví-
29
rus do epitelioma contagioso puderam ser gerados a partir de P1+3C de
FMDV de H6p de pF8, pHM-1180-1.
Exemplo 3: Construção de um promotor-menos plasmídeo de inserção de
P1+3C de FMDV de pC6
A falha em gerar recombinantes de avipox expressando genes
5
de FMDV poderia ser devido ao uso do promotor de H6 do vírus vaccinia
forte nos plasmídeos de P1+3C de FMDV de H6p de pC5 e P1+3C de FMDV
de H6p de pF8 descritos nos Exemplos 1 e 2. Ainda, o plasmídeo doador de
ALVAC resulta na inserção de cassetes de gene nos dois locais C5. Para
10 ALVAC, promotores virais diferentes e o local de inserção C6 único foram
usados.
O plasmídeo pHM-1119-1 (FMDV de pUC, vide Exemplo 1) foi
usado como o molde para amplificação de PCR de um fragmento 3' de
FMDV, com iniciadores 11280.SL e 11352.CXL. O fragmento de PCR de
15 —900 pb contém a extremidade 3' de FMDV do local Xhol e introduz paradas
de tradução e transcrição e um local de clonagem Pstl. Os iniciadores são
ilustrados na Figura 7. O fragmento de PCR foi clonado no pCR2.1, gerando
o plasmídeo pHM-12400-2, pCR2.1 3'-FMDV.
O plasmídeo pC6L é um plasmídeo de inserção de ALVAC para
20 o local C6 de ALVAC único. O fragmento de 5'-FMDV EcoR1-Xhol de —2,6 kb
de pHM-1119-1 foi inserido no pC6L, gerando o plasmídeo pCXL-1008-1, 5'FMDV de pC6. O fragmento Xhol-Pstl de —900 pb de pHM-1240-2 foi inserido no pCXL-1008-1, gerando pCXL-1013-2, FMDV de pC6. A construção do
FMDV de pC6 é ilustrada na Figura 8.
25 Exemplo 4: Construção de um plasmídeo doador de P1+3C de FMDV de
H6p de pC6 para inserção no cassete do gene de FMDV no local de C6 único de ALVAC
O plasmídeo pSL-6407-7 é um plasmídeo de inserção de H6p de
pC6 para o local C6 de ALVAC, que contém o promotor de H6 do vírus vac30 cinia. O promotor de H6 está na orientação oposta aos braços C6. O fragmento de 5'-FMDV Nrul-Xhol de —2,5 kb de pHM-1151-4 (FMDV de pCR2.1,
vide Exemplo 1) foi inserido no pSL-6407-7, gerando 5'-FMDV de H6p de
30
pC6, pCXL-1008-3. O fragmento de 3'-FMDV Xhol de —900 pb de pHM1240-2 (3'-FMDV de pCR2.1, vide Exemplo 3) foi inserido no pCXL-1008-3,
gerando P1+3C de FMDV de H6p de pC6, pCXL-1013-4. A construção de
P1 +3C de FMDV de H6p de pC6 é ilustrada na Figura 9 e a seqüência do
5 cassete do gene de FMDV de H6p de C6 é mostrada na Figura 10.
Apesar das múltiplas tentativas, recombinantes de ALVAC não
puderam ser gerados usando o plasmídeo doador de P1 +3C de FMDV de
H6p de pC6, sugerindo que a inserção em um único local com um promotor
forte não era possível.
10 Exemplo 5: Construção de um plasmídeo doador de P1+3C de FMDV de
H6p* de pC6 para inserção do cassete do gene de FMDV no local C6 único
de ALVAC
Com base nos estudos com o promotor inicial do vírus vaccinia
de 7,5 K (Davison, A.J. e Moss, B. (1989) J. Moi. Biol. 210:749-769), uma
15 mutação por ponto foi introduzida na região de promotor inicial de H6 do vírus vaccinia, gerando um promotor de H6 mutante, H6p*. As seqüências de
H6p inicial/último do tipo selvagem e H6p* inicial mutante são mostradas na
Figura 11.
O plasmídeo pHM-1119-1 (FMDV de pUC, vide Exemplo 1) foi
20 usado como o molde para amplificar através de PCR o fragmento 5'-FMDV
de H6p*, com iniciadores 11353.CXL e 11358.CXL. O fragmento de —1,2 kb
continha o genes de H6p* e 5'-FMDV para um local Ndel único. O fragmento
foi clonado no pCR2.1, gerando o plasmídeo pHM-1249-1-3. Este clone não
tinha um nucleotídeo em VP4, então mutagênese direcionada ao local foi
25 realizada com os iniciadores 11410.HM e 11411.HM para reparar o erro de
PCR. O clone pHM-1260-2, 5'-FMDV de H6p* de pCR2.1, foi confirmado
através de análise de seqüência. A Figura 12A descreve os iniciadores de
amplificação de PCR e a Figura 12B descreve os iniciadores de mutagênese.
30
O fragmento 5'-FMDV de H6p* EcoRI-Ndel de —1,2 kb de pHM1260-2 foi inserido no pCXL-1013-2 (P1+3C de FMDV de pC6, vide Exemplo
3) gerando o plasmídeo pHM-1273-1, P1+3C de FMDV de H6p* de pC6. A
31
construção de P1+3C de FMDV de H6p* de pC6 é ilustrada na Figura 13 e a
seqüência do cassete do gene de FMDV de H6p* de C6 é mostrada na Figura 14.
Para gerar um recombinante de ALVAC, fibroblastos embriôni5 cos de galinha primários (CEF) foram transfectados com plasmídeo doador
pHM-1273-1 linearizado com Sapl, na presença de reagente FuGENE-6 ®
(Rache).Asélutrnfcadomsubeqünt ifcadsom
ALVAC como vírus de resgate em um MOI de 10 e após 24 horas, as células
transfectadas-infectadas foram colhidas, sonificadas e usadas para avalia10 ção de vírus recombinante. As placas recombinantes foram avaliadas com
base no método de hibridização de levantamento de placa usando uma sonda específica de FMDV de 1,7 kb marcada com peroxidase de rábano silvestre (HRP) de acordo com o protocolo do fabricante (Amersham). Recombinantes de ALVAC foram gerados e chamados vCP2176.
15
Exemplo 6: Construção de um plasmídeo doador de P1+3C de FMDV de
I3Lp de pC6 para introdução dos genes de FMDV no local C6 único de ALVAC
O promotor de I3L inicial/intermediário (13Lp) do vírus vaccinia
(Schmitt, J.F. e Stunnenberg, H.G. (1988) J. Virol. 62:1889-1897) foi anteri20 ormente usado em recombinantes de avipox.
O plasmídeo pCXL 1-4 é gB de EHV-1 de pC5 de H6p (-TM)/ gD
.
de EHV-1 de 42 Kp (-TM)/ gC de EHV-1 de I3Lp (-TM), um plasmídeo doador usado para introduzir os genes gB, gC e gD de EHV-1 em ALVAC (descrito na Patente U.S. No. 5.756.103). Cada gene utiliza um promotor virai
25 diferente, então pCXL-1-4 foi usado como o molde para amplificar através de
PCR o promotor de I3L. Os iniciadores 11407.CXL e 11423.CXL foram usados para amplificar um fragmento de 75 pb contendo o promotor de 13L e a
extremidade 5' dos genes de FMDV. Os iniciadores de PCR são descritos na
Figura 15A.
30
Um fragmento de PCR de 648 pb, que contém uma sobreposição de 20 pb com o fragmento de I3Lp de 75 pb, foi amplificado usando os
iniciadores 11425.CXL e 11407.CXL, com pHM-1119-1 (FMDV de pUC, vide
32
Exemplo 1) como molde. Este fragmento continha os genes de 5'-FMDV até
o local Kpnl único. Os iniciadores de PCR são descritos na Figura 15B.
Os dois fragmentos de PCR foram misturados em uma razão
molar 1:1 e amplificados através de PCR usando os iniciadores 11423.CXL e
5 11407.CXL. O fragmento de 703 pb resultante foi clonado no pCR2.1, gerando pCXL-1068-1 (5'-FMDV de I3Lp de pCR2.1).
O fragmento de 5'-FMDV de I3Lp EcoRI-Kpnl de —700 pb de
pCXL-1068-1 foi inserido no pHM-1119-1 gerando pCXL-1072-2 (P1+3C de
FMDV de I3Lp de pUC).
O fragmento de 5'-FMDV de I3Lp EcoRI-Ndel de —1,2 kb de pC-
10
XL-1072-2 foi inserido no pCXL-1013-2 (P1+3C de FMDV de pC6). A construção de P1+3C de FMDV de I3Lp de pC6 é ilustrada na Figura 16 e a seqüência do cassete de gene de FMDV de I3Lp de C6 é mostrada na Figura
17.
Para gerar um recombinante de ALVAC, CEFs primários foram
15
transfectados com 20 lig de plasmídeo doador linearizado com Sapl pCXL1079-1 usando o reagente FuGENE-6 ® (Roche). As células transfectadas
foram subseqüentemente infectadas com ALVAC como vírus de resgate em
um MOI de 10 e após 24 horas, as células transfectadas-infectadas foram
20 colhidas, sonificadas e usadas para avaliação de vírus recombinante. As
placas recombinantes foram avaliadas com base no método de hibridização
de levantamento de placa usando uma sonda específica de FMDV de 1,7 kb
marcada com peroxidase de rábano silvestre (HRP) de acordo com o protocolo do fabricante (Amersham). Após quatro rodadas seqüenciais de purifi25 cação de placa, os recombinantes chamados vCP2181.4.1.1.1 e
vCP2181.5.1.1.1 foram gerados e confirmados através de hibridização como
100% positivos para a inserção de FMDV e 100% negativos para ORF de
C6.
Placas únicas foram selecionadas da 4a rodada de purificação
30 de placa e expandidas para se obter estoques amplificados P1 (1 x frasco
T25por irmã), P2 (1 x frasco T75 por irmã) e P3 (garrafas cilíndricas por irmã) dos recombinantes vCP2181. As células infectadas de garrafas cilíndri-
33
cas foram colhidas e concentradas para produzir estoque de vírus. O concentrado virai foi reconfirmado através de hibridização de estimulações de
placa com as sondas específicas de FMDV e C6. DNA virai que foi preparado na inserção correta do cassete do gene de FMDV no local. C6 de ALVAC
5 foi confirmado através de análises Southern blot e de seqüência. Ensaios de
imunoblot e imunoplaca foram realizados usando anticorpos específicos conforme descrito no Exemplo 7 (vide Figura 30).
Exemplo 7: Construção de um plasmídeo doador de P1+3C de FMDV de 42
Dp de pC6 para a introdução dos genes de FMDV no local C6 único de AL10 VAC
Um promotor de 42K (42 Kp) derivado do gene AMV091 (homólogo A23R do vírus vaccinia) do poxvírus de inseto Amsacta moorei (Baw. den, AL. e outros, (2000) Virology 274:120-139) foi usado anteriormente em
recombinantes de avipox (Patente U.S. No. 5.756.103).
15
O plasmídeo pCXL-1-4 é gb de EHV-1 de H6p de pC5 (-TM); gD
de EHV-1 de 42 Kp (-TM)/gC de EHV-1 de I3Lp, um plasmídeo doador usado para introduzir os genes gB, gC e gD de EHV-1 em ALVAC (vide Exemplo 6). Cada gene usa um promotor virai diferente, então pCXL-1-4 foi usado
como o molde para amplificar através de PCR o promotor de 42K. Os inicia-
20 dores 11426.CXL e 11427.CXL foram usados para amplificar um fragmento
de 48 pb contendo o promotor de 42K e a extremidade 5' dos genes de
FMDV. Os iniciadores de PCR são descritos na Figura 18A.
Um fragmento de PCR de 647 pb, que contém uma sobreposição de 20 pb com o fragmento de 42 Kp de 48 pb, foi amplificado usando os
25 iniciadores 11428.CXL e 11407.CXL, com pHM-1119-1 (FMDV de pUC, vide
Exemplo 1) como um molde. Este fragmento contém os genes de 5'-FMDF
até o local Kpnl único. Os iniciadores de PCR são descritos na Figura 18B.
Os dois fragmentos de PCR foram misturados em uma razão
molar de 1:1 e amplificados através de PCR usando os iniciadores
30 11426.CXL e 11407.CXL. O fragmento de 676 pb resultante foi clonado no
pCR2.1, gerando pCXL-1080-2-2 (5'-FMDV de 42 Kp de pCR2.1).
O fragmento de 5'-FMDV de 42 Kp EcoRI-Kpnl de 676 pb de
34
pCXL-1080-2-2 foi inserido no pHM-1119-1, gerando pCXL-1089-1 (P1+3C
de FMDV de 42 Kp de pUC).
O fragmento de 5'-FMDV de 42 Kp EcoRI-Ndel de —1,2 kb de
pCXL-1089-1 foi inserido em pCXL-1013-2 (P1+3C de FMDV de pC6, vide
5 Exemplo 3), gerando pCXL-1095-1 (P1+3C de FMDV de 42 Kp de pC6). A
construção de P1+3C de FMDV de 42 Kp de pC6 é ilustrada na Figura 19 e
a seqüência do cassete de gene de FMDV de 42 Kp de C6 é mostrada na
Figura 20.
Para gerar um recombinante de ALVAC, CEFs primários foram
10 transfectados com 20 µg de plasmídeo doador linearizado com Sapl pCXL1095-1, usando reagente FuGENE-6 ® (Roche). As células transfectadas foram subseqüentemente infectadas com ALVAC como vírus de resgate em
um MOI de 10 e após 29 horas, as células transfectadas-infectadas foram
colhidas, sonificadas e usadas para avaliação de vírus recombinante. As
15 placas recombinantes foram avaliadas com base no método de hibridização
de estimulação de placa usando a sonda específica de FMDV de 1,7 kb
marcada com peroxidase de rábano silvestre (HRP) de acordo com o protocolo do fabricante (Amersham). Após quatro rodadas seqüenciais de purificação de placa, o recombinante chamado vCP2186.6.2.1.1 foi gerado e con20 firmado através de hibridização como 100% positivo para a inserção de
FMDV e 100% negativo para ORF de C6.
Placas únicas foram selecionadas da 4 a rodada de purificação
de placa e expandidas para se obter estoques amplificados P1 (1 x frasco
T25), P2 (1 x frasco T75) e P3 (8 x garrafas cilíndricas. As células infectadas
25 de garrafas cilíndricas foram colhidas e concentradas para produzir estoque
de vírus. O concentrado virai foi reconfirmado através de realização de hibridização de estimulações de placa com as sondas específicas de FMDV e C6
para confirmar 100% de pureza genética. DNA virai foi extraído e análises de
Southern blotting e de seqüência confirmaram a inserção correta do Cassete
30 do gene de FMDV.
Para análise de expressão, CEFs foram infectados em um MOI
de 10 com vCP2181 (P1+3C de FMDV de I3Lp de C6 de ALVAC; vide E-
35
xemplo 6) ou vCP2186 (P1+3C de FMDV de 42Kp de C6 de ALVAC) e cresceram a 37° C, na presença de CO2 a 5% por 24 horas. O sobrenadante foi
colhido e clarificado e a monocamada da célula foi ressuspensa em PBS, e
então peletizada. Os peletes foram ressuspensos em água, e então tampão
5 de amostra de SDS PAGE foi adicionado aos sobrenadantes. As amostras
de proteína foram separadas em um gel de SDS PAGE a 10%, então eletrotransferidas para uma membrana de náilon. A membrana foi bloqueada e
então testada com anti-soro VP1, VP2 e VP3 anti-FMDV de coelho. Análise
de anticorpo e colorimétrica secundária revelou que ambos recombinantes
10 expressaram proteínas específicas de tamanhos de acordo com VPO, VP1 e
VP3 em ambos peletes e sobrenadantes. Esses dados são ilustrados na Figura 30.
Exemplo 8: Construção de um plasmídeo doador de P1+3C de FMDV de 7,5
Kp de pC6 para a introdução dos genes de FMDV no local C6 único de AL15 VAC
O promotor inicial de 7,5K (7,5 Kp) de vírus vaccinia (Davison,
A.J. e Moss, B., (1989) J. Mol. Biol., 210:749-769) tinha sido anteriormente
usado em recombinantes de avipox.
O plasmídeo pHM-1119-1 (FMDV de pUC, vide Exemplo 1) foi
20 usado como o molde para amplificação através de PCR do promotor de 7,5
K e dos genes de FMDV, até o local Ndel único. Os iniciadores 11357.CXL e
11358.CXL foram usados para amplificar um fragmento de 5'-FMDV de 7,5
Kp de 1214 pb, que foi clonado em pCR2.1, gerando pHM-1249-5-3. Os iniciadores de amplificação de PCR são descritos na Figura 21A.
25
Análise de seqüência revelou três deleções de par de base em
pHM-1249-5-3. Os iniciadores de oligonucleotídeo 11429.HM e 11430.HM
foram feitos para reintroduzir os nucleotídeos que faltavam através de mutagênese direcionada ao local. Os iniciadores de mutagênese são descritos na
Figura 21B. Os clones resultantes continham 2 dos 3 nucleotídeos reintrodu-
30 zidos, então o clone pHM-1267-4 foi submetido a uma rodada adicional de
mutagênese direcionada ao local com iniciadores 11445.HM e 11446.HM.
Os iniciadores de mutagênese são descritos na Figura 21C. O clone pHM-
36
1299-2 (5'-FMDV de 7,5 Kp de pCR2.1) foi confirmado ser correto através de
análise de seqüência.
O fragmento EcoRI-Ndel de ~1,2 kb de pHM-1299-2 foi inserido
no pCXL-1013-2 (FMDV de pC6, vide Exemplo 3), gerando o plasmídeo
5 pHM-1310-4 (P1+3C de FMDV de 7,5 Kp de pC6). A construção de pHM1310-4 é ilustrada na Figura 22 e a seqüência do cassete do gene de FMDV
de 7,5 Kp de C6 é mostrada na Figura 23.
VCP2189 recombinante de ALVAC foi obtido após duas rodadas
de avaliação, mas não pôde ser purificado/amplificado e foi perdido, suge10
rindo que ele era instável e/ou tóxico.
Exemplo 9: Construção de plasmídeo doador de P1+3C de FMDV de Pip de
pC6 para inserção dos genes de FMDV no local C6 único de ALVAC
O promotor inicial de Pi (Pip) do vírus vaccinia (Wachsman, M. e
outros (1987), J. Infect. Dis., 155:1188-1197) tinha sido anteriormente usado
15 em recombinantes de avipox. Ele tem 81 nucleotídeos de comprimento e é
imaginado ser um promotor relativamente fraco.
O plasmídeo pHM-119-1 (FMDV de pUC, vide Exemplo 1) foi
usado como um molde para amplificar através de PCR o fragmento de 5'FMDV de Pip, com iniciadores 11356.CXL e 11358.CXL (Figura 24A). O
20 fragmento amplificado foi clonado em pCR2.1 e vários clones foram avaliados através de análise de seqüência. O clone com os menos erros de PCR
(pHM-1249-4-4, 5'-FMDV de Pip5* de pCR2.1) não tinha 28 nucleotídeos
aleatoriamente em toda a região de promotor de Pi, incluindo o local de clonagem de EcoRi.
25
Os oligonucleotídeos 11395.CXL e 11399.CXL (Figura 24B) foram usados para montar o promotor de Pi correto. O Pip foi amplificado através de PCR com os iniciadores 11400.CXL e 11401.CXL (Figura 24C) e clonados em pCR2.1 para gerar pHM-1263-1 (Pip de pCR2.1). O plasmídeo
pHM-1263-1 foi usado como um molde para amplificar através de PCR um
30 fragmento de 5'-FMDV de Pip de 97 pb, usando os iniciadores 11402.CXL e
1140.CXL (Figura 24D). Este fragmento contém local de clonagem EcoRI, o
Pip de comprimento completo e 10 pb de FMDV.
37
Usando pHM-1249-4-4 como molde, um fragmento de 648 pb foi
amplificado através de PCR usando iniciadores 11406.CXL e 11407.CXL
(Figura 24E). Este fragmento contém 10 pb da extremidade 3' de Pip e os
genes de 5'-FMDV até um local Kpnl único.
5
Quantidades equimolares dos fragmentos de PCR de 5'-FMDV
de Pip de 97 pb e 5'-FMDV de 3'-Pip de 648 pb foram misturadas e amplificadas usando iniciadores 11402.CXL e 11407.CXL. O fragmento de 5'FMDV de Pip de 745 pb (EcoRI-Kpnl) foi clonado em pCR2.1 para gerar
pHM-1268-1 (5'-FMDV de Pip de pCR2.1, EcoRI-Kpnl). O fragmento EcoRl-
10
Kpnl de pHM-1268-1 foi inserido em pHM-1119-1, gerando pHM-1277-6
(FMDV de Pip de pUC).
O fragmento de 5'-FMDV de Pip EcoRI-Ndel de 1252 pb de
pHM-1277-6 foi inserido no plasmídeo pCXL-1013-2 (P1+3C de FMDV de
pC6, vide Exemplo 3), gerando o plasmídeo pHM-1284-25 (P1+3C de FMDV
15 de Pip de pC6). A construção de P1 +3C de FMDV de Pip de pC6 é ilustrada
na Figura 25 e a seqüência do cassete de gene de FMDV de Pip de C6 é
mostrada na Figura 26.
Recombinante de ALVAC vCP2184 foi obtido após duas rodadas
de purificação, mas foi perdido na terceira rodada de avaliação/amplificação,
20 sugerindo que ele era tóxico e/ou instável.
Exemplo 10: Construção de um plasmídeo doador de P1+3C de FMDV de
H6p* de pF8 para inserção do cassete do gene de FMDV no local único F8
de vírus do epitelioma contagioso
O plasmídeo pHM-1260-2 (5'-FMDV de H6p* de pCR2.1 (Nde);
25 vide Exemplo 5) foi usado como o molde para amplificar através de PCR um
fragmento de 5'-FMDV de H6p*, com iniciadores 11506.HM e 11279.SL. O
iniciador 11506.HM foi feito para introduzir um local Hind Ill em frente ao
H6p* e o iniciador 11279.SL foi feito para amplificar os genes de FMDV até o
local Kpnl único no gene VP2. O fragmento de —700 pb foi clonado em p30 CR2.1, gerando pHM-1341-7 (Kpnl de 5'-FMDV de H6p* de pCR2.1), que foi
confirmado como correto através de análise de seqüência. A Figura 27 descreve os iniciadores de PCR.
38
O plasmídeo pHM-1180-11 é P1+3C de FMDV de H6p de pF8,
contendo o promotor de H6 do tipo selvagem (vide Exemplo 2 e Figura 5). O
plasmídeo pSL-6427-1-1 (MCS de pF8) é um plasmídeo de menos promotor
usado para inserção do local F8 do vírus do epitelioma contagioso. O frag5 mento de 5'-FMDV de H6p* Hind111-Kpril de 0,7 kB de pHM-1341-7 e o fragmento de 3'-FMDV Ppnl-BamH1 de 2,7 kb de pHM-1180-11 foram ligados ao
plasmídeo pSL-6427-1 que tinha sido digerido com HindlIl e BamHI, gerando
pHM-1354-I (P1+3C de FMDV de H6p* de pF8). A construção de pHM-13541 é ilustrada na Figura 28 e a seqüência do cassete do gene de P1+3C de
10 FMDV de H6p* de F8 é mostrada na Figura 29.
Para gerar um recombinante de vírus do epitelioma contagioso,
CEFs primários foram transfectados com pHM-1354-1 linearizado com Notl,
na presença de reagente Fugene-6 ® (Roche). As células transfectadas foram
subseqüentemente infectadas com vírus do epitelioma contagioso como vi15 rus de resgate em MOI de 10 e após 51 horas, as células transfectadasinfectadas foram colhidas, sonificadas e usadas para avaliação de vírus recombinante. Placas recombinantes foram avaliadas com base no método de
hibridização de estimulação de placa usando uma sonda específica de
FMDV de 1,7 kb com peroxidase de rábano silvestre (HRP) de acordo com o
20 protocolo do fabricante (No. de Cat. Amersham RPN3001). Após cinco rodadas seqüenciais de purificação de placa, um recombinante de vírus do epitelioma contagioso chamado vFP2215.1.3.1.1.1 foi gerado e confirmado através de hibridização como 100% positivo para a inserção de FMDV e 100%
negativo para ORF de F8.
25
Placas únicas foram selecionadas da 5a rodada de purificação
de placa e expandidas para se obter estoques P1 (1 x frasco T25), P2 (2 x
frasco T75) e P3 (10 x garrafas cilíndricas) para amplificar vFP2215. As células infectadas das garrafas cilíndricas foram colhidas e concentradas para
produzir estoque de vírus. O concentrado virai foi reconfirmado através de
30 hibridização das estimulações de placa com as sondas específicas de FMDV
e F8. DNA virai foi preparado e a inserção correta do cassete de gene de
FMDV no local F8 de vírus do epitelioma contagioso foi confirmada através
39
de análises Southem blot e de seqüência.
Exemplo 11: Preparação e purificação de plasmídeos
Para a preparação dos plasmídeos pretendidos para a vacinação de animais, qualquer técnica pode ser usada que torne possível se obter
5 uma suspensão de plasmídeos purificados predominantemente em uma
forma superenrolada. Essas técnicas são bem conhecidas das pessoas de
habilidade na técnica. Pode ser mencionada em particular a técnica de lise
alcalina seguido por duas ultracentrifugações sucessivas em um gradiente
de cloreto de césio na presença de brometo de etídio conforme descrito em
10 J. Sambrook e outros (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Edição,
Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nova York, 1989). Referência pode ser também feita aos Pedidos de Patente PCT WO 95/21250 e
PCT WO 96/02658, que descrevem métodos para produção, em uma escala
industrial, de plasmídeos que podem ser usados para vacinação. Para os
15 propósitos de fabricação de vacinas (vide Exemplo 11), os plasmídeos purificados são ressuspensos de modo a se obter soluções em uma concentração alta (>2 mg/ml), que são compatíveis com armazenamento. Para fazer
isso, os plasrnídeos são ressuspensos ou um água ultrapura ou no tampão
de TE (Tris-HCI a 10 mM; EDTA a 1 mM, pH 8,0).
20 Exemplo 12: Fabricação da vacina associada
Os vários plasmídeos necessários para a fabricação de uma vacina associada são misturados começando com suas soluções concentradas
(Exemplo 10). As misturas são preparadas de modo que a concentração final de cada plasmídeo corresponda à dose eficaz de cada plasmídeo. As
25 soluções, que podem ser usadas para ajustar a concentração final da vacina, podem ser ou uma solução de NaCI a 0,9M ou tampão de PBS.
Formulações específicas tal como lipossomas ou lipídeos catiônicos podem ser também usadas para a fabricação das vacinas.
Exemplo 13: Vacinação de animais
30
Os animais são vacinados com doses de 100 pg, 250 lig ou 500
gg por plasmídeo. As injeções são realizadas com uma agulha através da
via intramuscular ou no nível dos músculo do glúteo ou no nível dos múscu-
40
los do pescoço. As doses de vacina são administradas em volumes entre 1 e
5 ml.
Tendo então descrito em detalhes modalidades preferidas da
presente invenção, deve ser compreendido que a invenção definida pelas
5 reivindicações apensas não deve ser limitada aos detalhes particulares mostrados na descrição acima uma vez que muitas variações aparentes da
mesma são possíveis sem se afastar do espírito ou escopo da presente invenção.
REIVINDICAÇÕES
1. Vetor de avipox recombinante compreendendo pelo menos
uma molécula de ácido nucléico de acordo com um ou mais do(s) antígeno(s) do vírus da febre aftosa (FMDV).
5
2. Vetor de avipox de acordo com a reivindicação 1, onde o avipox é ALVAC.
3. Vetor de avipox de acordo com a reivindicação 1, onde o avipox é vírus do epitelioma contagioso.
4. Vetor de avipox de acordo com a reivindicação 1, onde o antí-
10 geno é selecionado do grupo consistindo em VP1, VP2, VP3, VP4, 2A, 2B e
3C de FMDV.
5. Vetor de avipox de acordo com a reivindicação 1, onde a molécula de ácido nucléico codificando um ou mais do(s) antígeno(s) do vírus
da doença da febre aftosa (FMDV) é um cDNA codificando a região P1
15 FMDV e um cDNA codificando a protease 3C de FMDV.
6. Vetor de avipox de acordo com a reivindicação 1, onde o(s)
antígeno(s) de FMDV é/são operavelmente ligado(s) a uma seqüência de
promotor.
7. Vetor de avipox de acordo com a reivindicação 6, onde a se20 qüência de promotor é um promotor fraco.
8. Vetor de avipox de acordo com a reivindicação 6, onde a seqüência de promotor é selecionada do grupo consistindo em promotor de
vacínia H6, promotor de vacínia I3L, promotor de poxviral 42K, promotor de
vacínia 7,5K e promotor de vacínia Pi.
25
9. Vetor de avipox de acordo com a reivindicação 7, onde o promotor é o promotor de vacínia H6, que é mutado de modo que os níveis de
expressão do(s) antígeno(s) de FMDV são diminuídos comparado com os
níveis de expressão de antígeno(s) de FMDV sob um promotor de vacínia do
tipo selvagem H6.
30
10. Vetor de avipox de acordo com a reivindicação 1, onde o vetor compreende um local de inserção C6, e onde as seqüências de flanqueamento do local de inserção C6 promovem recombinação homóloga dos an-
2
tígenos de FMDV com o local de inserção C6.
11. Vetor de avipox de acordo com a reivindicação 10, onde as
seqüências de flanqueamento compreendem estruturas de leitura aberta
C6L e C6R de avipox.
5
12. Vetor de avipox de acordo com a reivindicação 1, onde o vetor compreende um local de inserção F8, e onde as seqüências de flanqueamento do local de inserção F8 promovem recombinação homóloga dos antígenos de FMDV com o local de inserção F8.
13. Vetor de avipox de acordo com a reivindicação 12, onde as
10 seqüências de flanqueamento compreendem estruturas de leitura aberta F8L
e F8R de avipox.
14. Vírus avipox recombinante compreendendo pelo menos uma
molécula de ácido nucléico codificando um ou mais antígeno(s) do vírus da
doença da febre aftosa (FMDV).
15. Vírus avipox de acordo com a reivindicação 14, onde o vírus
15
avipox é ALVAC.
16. Vírus avipox de acordo com a reivindicação 14, onde o vírus
avipox é vírus do epitelioma contagioso.
17. Vírus avipox de acordo com a reivindicação 14, onde o antí20 geho é selecionado do grupo consistindo em VP1, VP2, VP3, VP4, 2A, 2B e
3C de FMDV.
18. Vetor de avipox de acordo com a reivindicação 14, onde a
molécula de ácido nucléico codificando um ou mais do(s) antígeno(s) do vírus da doença da febre aftosa (FMDV) é um cDNA codificando a região
25 P1do FMDV e um cDNA codificando a protease 3C de FMDV.
19. Vírus avipox de acordo com a reivindicação 14, onde o(s)
antígeno(s) de FMDV é/são operavelmente ligado(s) a uma seqüência de
promotor.
20. Vetor de avipox de acordo com a reivindicação 19, onde a
30 seqüência de promotor é um promotor fraco.
21. Vetor de avipox de acordo com a reivindicação 19, onde a
seqüência de promotor é selecionada do grupo consistindo em promotor de
3
vacínia H6, promotor de vacínia I3L, promotor de poxviral 42K, promotor de
vacínia 7,5K e promotor de vacínia Pi.
22. Vírus avipox de acordo com a reivindicação 20, onde o promotor é o promotor de vacínia H6, que é mutado de modo que os níveis de
5 expressão do(s) antígeno(s) de FMDV são diminuídos comparado com os
níveis de expressão de antígeno(s) de FMDV sob um promotor de vacínia do
tipo selvagem H6.
23. Vírus avipox de acordo com a reivindicação 14, onde o vetor
compreende um local de inserção C6, e onde as seqüências de flanquea10 mento do local de inserção C6 promovem recombinação homóloga dos antígenos de FMDV com o local de inserção C6.
24. Vírus avipox de acordo com a reivindicação 14, onde as seqüências de flanqueamento compreendem estruturas de leitura aberta C6L e
C6R de avipox.
15
25. Vírus avipox de acordo com a reivindicação 14, onde o vetor
compreende um local de inserção F8, e onde as seqüências de flanqueamento do local de inserção F8 promovem recombinação homóloga dos antígenos de FMDV com o local de inserção F8.
26. Vetor de avipox como definido na reivindicação 25, onde as
20 seqüências de flanqueamento compreendem estruturas de leitura aberta F8L
e F8R de avipox.
27. Vírus avipox recombinante, onde o vírus avipox é selecionado do grupo consistindo em vCP2186, vCP2181, vCP2176 e vFP2215.
28. Método de elicitação de uma resposta imune para FMDV em
25 um indivíduo compreendendo administrar o vetor como definido na reivindicação 1 ao indivíduo.
29. Método de elicitação de uma resposta imune a FMDV em um
indivíduo compreendendo administrar o vírus como definido na reivindicação
14, ao indivíduo.
30
30. Método de elicitação de uma resposta imune a FMDV em um
indivíduo compreendendo administrar o vírus como definido na reivindicação
27, ao indivíduo.
4
31. Método de produção de um vetor de avipox recombinante
compreendendo pelo menos uma molécula de ácido nucléico codificando um
ou mais do(s) antígeno(s) do vírus da doença da febre aftosa (FMDV) compreendendo as etapas de:
(a) linearização de um plasmídeo doador com uma endonuclea-
5
se de restrição, onde o plasmídeo doador compreende locais de clivagem de
endonuclease de restrição ou um local de clonagem múltiplo; e
(b) ligação de pelo menos uma molécula de ácido nucléico compreendendo
(i) uma seqüência de ácido nucléico codificando um ou mais an-
10
tígeno(s) de FMDV,
(ii) uma seqüência de promotor virai, e
(iii) seqüências de interseção flanqueando (i) e (ii) que têm locais
de clivagem de endonuclease de restrição complementares para o plasmí15 deo doador em antígenos de FMDV,
deste modo produzindo o vetor de avipox recombinante.
32. Método de acordo com a reivindicação 31, compreendendo
ainda as etapas de:
(c) introdução do vetor em uma célula permissiva para replica20 ção do vetor; e
(d) isolamento do vetor a partir da célula.
33. Método de acordo com a reivindicação 31, onde o avipox é
ALVAC.
34. Método de acordo com a reivindicação 31, onde o avipox é
25 vírus do epitelioma contagioso.
35. Método de acordo com a reivindicação 31, onde o antígeno
compreende pelo menos um VP1, VP2, VP3, VP4, 2A, 2B e 3C de FMDV.
36. Método acordo com a reivindicação 31, onde a seqüência de
ácido nucléico codificando um ou mais antígeno(s) de FMDV é um cDNA
30 codificando a região P1 de FMDV e um cDNA codificando a protease 3C de
FMDV.
37. Método de acordo com a reivindicação 31, onde a seqüência
5
de promotor é selecionada do grupo consistindo em promotor de vacínia H6,
promotor de vacínia I3L, promotor de poxviral 42K, promotor de vacínia 7,5K
e promotor de vacínia Pi.
38. Método de acordo com a reivindicação 37, onde o promotor
5 é o promotor de vacínia H6, que é mutado de modo que os níveis de expressão do(s) antígeno(s) de FMDV são diminuídos comparado com os níveis de
expressão de antígeno(s) de FMDV sob um promotor de vacínia do tipo selvagem H6.
39. Método de acordo com a reivindicação 31, onde o vetor
10 compreende um local de inserção C6, e onde as seqüências de flanqueamento do local de inserção C6 promovem recombinação homóloga dos antígenos de FMDV com o local de inserção C6.
40. Método de acordo com a reivindicação 39, onde as seqüências de flanqueamento compreendem estruturas de leitura aberta C6L e C6R
15 de avipox.
41. Método de acordo com a reivindicação 31, onde o vetor
compreende um local de inserção F8, e onde as seqüências de flanqueamento do local de inserção F8 promovem recombinação homóloga dos antígenos de FMDV com o local de inserção F8.
42. Método de acordo com a reivindicação 41, onde as seqüên-
20
cias de flanqueamento compreendem estruturas de leitura aberta F8L e F8R
de avipox.
43. Método de acordo com a reivindicação 31, onde o vetor
compreende ainda um gene repórter.
44. Método de acordo com a reivindicação 43, onde o gene re-
25
pórter é selecionado do grupo consistindo em gene de resistência à neomicina, gene de resistência à ampicilina, lacZ (0-galactosidase), luciferase e
proteína fluorescente verde (GFP).
45. Método de acordo com a reivindicação 32, onde a célula
30 permissiva para crescimento do vetor é um fibroblasto embriônico de galinha.
Genoma de FMDV
5'UTR
LVP4VP2 VP3 VP1 2A 2B
maixozo~
;s2;sst4st:ssustO.
Deletado em pAd5-A24
p de A24
VP2
3D
W5t652.~Nt
Deletado empAd5-A24
VP3
pAd5-A24
VP1
KOZ2Z~ZZ2M22M2Z2~2~
P1 de A24
Fig. 1
3sUTR
3A3B 3C
R;sszsuss.sszt:,
Genes de FMDV em
VP4
2C
2A
Deletado empAc15-A24
H6p
11277.SL
FMDV A24
Nru I
M G A G Q S S P
5 1 TA1TCGCG*ATCCGTTAAGTTTGTATCGTAATGGGAGCTGGGCAATCCAGCCCA
PMDV Al2
VDPEPQHE*
*
T5NT
Bania I
GTTGACCCTGAACCACAACACGAGTAGTAATTTTTCTA GGATCC
11222.SL 3' CAACTGGGACTTGGTGTTGTGCTCATCATiAEWGATCTCCTAGG
Zba l.
Fig. 2
N)
en
CD
3/50
BamHt (17)
. .
EcoR1 (5475)
VP4
VP2
AmpR
VP3
VP1
A242A
A24 2B
Al2 3B .
Al2 3C
EcoR1
(5475)
BamH1
(27136)
Hindll (400)
Xhat (405)
BgIll (410)
'Pstl (418)
Sall (420)
BamH1 (426)
Xmal (431)
EcoRI (436)
pUC8 Bc111/Xba I
•
EcoR I/Xba
Ndel (185) •Xbal (405)
Al2 3C
EcoRV (758)
"242)
U4ani530)
A24 2A
VP1
EcoR1(3798
EcoR1 i"c",
Xhol (7311) Nrul (22)
3 -H6p
Xbal (7299)
V134
VP2
LanR
VP3
VP3
VP4VP2
Amplificação de
,
Kpnl (3158)Ndel (2623 ) PCR com 11277. SL
com 11282. SL
pUC FMDV P1+3C
7338 bp
AmpR
VP1
A24 2A
Xmal (2304)
A24In2 de junção
Notl (237)
Hindi!, (359)
BamHI (3485)
Al2 3C AX1h2o13(82592)
EcoRI (3454)
BamHI (3442) Xbal (3436)
pCR2.1 116p FINDV P1+3C
5R
AmpR
4879 bp
~WH (2475 5L
BamHI (1811)
6p
Nru1 (1980)
EcoRV (1984)
AmpR
Kpnl (2010)
Xmal (2030) Xhol (2012)
pC5 H6p XbaI (2018)
Fig. 3
C5L
Xmal (5208
Xbal (5196)
Al2 3C
Al2 3B
Xhol (4352)
A24/Al2 de junção
Noti (39)
C5R
BamHl (1613)
H6p
Nrol (1782)
P4
VP2
Kpnl (2444)
VP3
VP1
Xmal (4064)
29
A 2A
A24 A24
pC5 H6p FMDV P1+3C
4/50
CSR
1 TGAATGTTAA ATGTTATACT TTGGATGAAG CTATAAATAT GCATTGGAAA AATAATCCAT
61 TTAAAGAAAG GATTCAAA221 CIACAAAACC TAAGCGATAA TATGTTAAC2' AAGCTTATTC
ACAAATAACT
TTAACG2iCGC TTTAAA2ATA. CACAAATAAA C.ATAATTTTT GTATAACCTA
121
AA21ACATAAA AATAATAAAA GGAAATGTAA TATCGTAA2'T .ATT2TACTCA GGAATGGGGT
181
291 TAAATATTTA TATCACGTGT ATATCTATAC TGTTATCGTA 2ACTCTTTAC AAT2ACTATT
ACGAAIATGC AAGAGATAAT AAGATTACGT ATTTAAGAGA ATCTTGTCAT G.ATAATTGGG
301
TACGACATAG TGAVIAATGC 221TTTCGCAT CGTTACATAA AGTCAGTTGG AAAGATGGAT
361
TTGACAGATG TAACT2AATA GGTGCAAAAA TGTTAAATAA CAGCA.TTCTA TCGMAGATA
422.
GGATACCAGT TATATTATA.0 AAAAATCACT GGTTGGATAA AACAGATTCT GCAA2ATTCG
481
GAATTTGTAA .ACTATGACZA TAAAAAGCCA TTTATCTCAA
541 • TAAAAGATGA .AGATTACTGC
CGACATCGTG T.AAT2'CTTCC ATGTTTTATG 221202'GTTTC AGMATTATG
601
APATTACTAT
AAACTTITTG TATACTTATA TTCCGTAAAC TATATTAATC ATGIAGAAAA 2rIAAAAAGTA
661
TAGAAGCTGT 2'CACGAGCGG
rivnicAnait CAACZAAATT ATACSITTCAA GATGGCTTAC
721
781 ATATACGTCT G2'GAGGCTAT CATGGATAAT GACAATGCAT CTCTAAAT.AG GTTTTTGGAC
AATGGATTCG ACCCZAACAC GGAATATGGT ACTCTACAA2' CTCCTCTTGA AATGGCTGTA
841
ATGTTCAAGA ATACCGAGGC TATAAAAATC TTGATGAGGT ATGGAGCTAA .ACCTGOLGTT
901
961
ACTGAATGCA CAACTTCTTG TCTGCATGAT GCGGTGTTGA GAGACGACTA CAAAATAGTG
.AAAGATCTGT TGAAGAATAA CTATGTAAAC AATGTTCTTT ACAGCGGAGG CaTTACTCCT
1021
..z1A2'TTGGTTA AACTTCTATT GGCTCATTCG
1081 TTGTGTTTGO CAGCTTACCT TAACAAAGTT
GCGGATGTAG ATATTTCAAA CACGGATCGG TTAACTCCTC TACATATAGC CG2.A2'CAAAT
1141
.AAAAAITTAA CAATGGTTAA
Acriermav .411ACUAGGTG CTGATACTGA C.T2GUTGGAT
1201
AACATGGGAC GracarcaTT AATGATCGCT GTACAATCTG GAAATATTGA AATATGT.AGC
1261
ACAMAM% AAAAAAATAA .AATGTCCAGA
ACTGGGAAAA. ATTGATCTTG CCAGCTGTAA
2.321
TTCATGGTAG AAAAGAAGTO CTCAGGCTAC TTTTCAACAA AGGAGCAGAT GTAAACTACA
1381
2.441
TC2TTGAAAG AAATGGAAAA TCATATACTG 2T2TGGAATT GATTAAAGAA AGTTACTCTG
.AGACACAAAA GAGGTAGCTG AAGTGGTACT CTCAAAGGTA CGTGACTAAT
TAGCTATAAA
1501
1561 AAGGATCCGG GTT.AATTAAT TAGTCATC.AG GCAGGGCGAG AACGAGACTA TCTGCTC.GTT
H6p
1621 AATTAATTAG AGCTTCTTTA TTCTATA.CTT .AAAAAGTGAA. AATAAATACA AAGGTTCTTG
1681 AGGGTTGTGT TAAATTGAAA GCGAGAAATA ATCATAAATT ATTTCATT.AT CGCGATATCC
A24 VP4
G'AGQ SSP ATG SQNQ
1741 GTTAAGTTTG TATCGTAATG GGAGCTGGGC AATCCAGCCC AGCAACCGGC 2'CGCAG.AACC
..SGM TGS X IBS Y TM QQT QMSM
AGTCTGGCAA CACTGGCAGC ATAATCAACA ACTACTACAT GCAACAGTAC CAGAACTCCA
1801
.,DTQ LGD MAIS CGS MEG S T D
T•
.
TGGACACACA G2TGGGAGAC AATGCCATCA GTGGAGGCTC CAACGAGGGC TCCACGGACA
..T ST HTT N T QN EDF; F
s K
DAS S
• 1921
C.AACTTCAAC .ACACACAACC 21ACACTCAAA ACAATGACTG GTTCTCGAAG CTCGCCAGTT
A24 VP2
GA 1 L
ADK It TE ET TL
—AP 2' G.L.C"
1981
CAGCTTTTAC CGGTCTGTTC GGTGCACTGC
TCGCCGACAA GAAGACAGAG GAAACGACAC
T S T
TQS 3
..LED R I L TTRN GET
2041 TTCTTGAGGA CCGCATCCTC .ACC.ACCCGCA ACGGGCACAC CAÇCTCGACG ACC.CAA.TCGA
' . .V GV TFIG Y S TE EDH VAG PNT
2101 GTGTGGGTGT CACACACGGG TACTCCACAG AGGAGGACCA CGTTGCTGGG CCCAACACAT
..G L E TRV V Q A E RPY KEY LPDW
2161 CGGGCCTGGA GACGCGAGTG GTGCAGGCAG AGAGATTCTA. CAAAAAGTAC TTGTTTGACT
..T TD KAF GELE ELE LPS DEHG
GGACAACGGP, CAAGGCATTT GGACACCTGG .AAAAGCTGGA GCTCCCGTCC GACCACCACG
2221
..VFG ELV D
S Y
A YMR ITGE DVENT
2281 GTGTCTTTGG ACACTTGGTG GACTCGTACG CCTATATGAG AAATGGCTGG GATGTTGAGG
_3
AV GNQ FEGG CLL VANI VPEW
2341 TGTCCGCTGT TGGCAACCAG TTCAACGGCG GGTGCCTCCT GGTGGCCATG GTACCTGAAT
1861
Fig. 4A
5/50
..wEr
DTR EXYQ
LTL FPH'QPIS
2401 GGAJUXUATT TGACACACGG GAGAAAMACC AACTCACCCT TTTCCCGCAC CAGTTTATTA
..PRT NMT A H I. T VP - Y LGV NRYD
GCCCCAGAAC TAACATGACT
GCCCACATCA CGGTCCCCTA CCTTGGTGTGAACAGGTATG
PwTn
VVS PLTV
..QYX
KUK
2521 A2CAGTACAA GAAGCATAAG CCCTGGACAT TGGTTGTCATGGTCGTOTCG CCACTTACGG
SAA QIKV YAN IAP TYVH
..NNT
2581 TCAACAACAC TAGTGCGGCA CAAATCAAGG TCTACGCCAA CATAGCTCCG ACCTATGTTC
A24 VP3
..VAG ELP
SKEG Z F P VAC ADGY
2641 ACGTGGCCGG TGAACTCCCC TOGAAAGAGG GGATTTTCCC GGTTGCATGT GCGGACGGTT
..GGLVTT DPKT ADP AYG
KVYN
ACGGAGGATT GGTGACGACA GACCCGAAGA CAGCTGACCC TGCTTATGGC AAGGIWTACA
2701
..PPR TNY PGRF TN1 ZDVASAC
2461
vvm
2761
ACCCGCCMAG GACTÁACTAC CCTGGGCGCT TCACCAACCT GTTGGACGMG GCCGAAGCGT
..9TF LCF 'D D.GRHPYV TTR TDDT
2821
GTCCCACTTT ccTcrwrrr GACGACGGGAAACCGTACGT CACCACGCGGACGGATGACA
..R11 A K F
A A R H MS NTY1
CCCGACTTTT GGCCAAGTTT GACCTTTCCC TTGCCGCAAA ACAMTGTCCAACACATACC
..SGX AQY.YTQY .S GT IRÁ R
•F M F
2881
2941
3001
3061
3121
3181.
3241
WGTCAGGGATTGCTCAGMACT.ACACACAGTACTCTGGCACCATCAATTTGCATTTCATGT
PGVE
..TOS TDS KARY MVA YIP
TTACAGGTMC CACTGATTCA AAGGCCCGAT ACATGGTGGC
CCTGGOGTGG
rpP
DTP SRAA MCX SAS WDTG
AGACACCACC GGACACACCT GAAAGGGCTG CCCACTGCAT TCACGCTGAA TGGGACACTG
..ZNS KFT FSX-P YVS AAD YA.YT
GACTAAACTC CAAATTCACT TTCTCAATCC CGTACGTATC CGCCGCGGAT TACGCGTACA
..ASD TAS TINV QGW VCX
YQXT
CAGOOTCTGA CACGGCAGAA
Acaamaaam TACAGGGATG GGTCTGCATC TACCAAATTA
-.MGR A.EN DTIV VSV. S A G K.DFE
CACACGGGAA GGCTGAAAAT GACACCTTGG TCGMGTCGGT TAGCGCCGGCAAAGACTTTG
cracarmaa
=.4 A24 VP1
3301
3361
..IRI PID PRQQ
T'TA TGE
SADP
AGTTGCGCCT CCCGATTGAC
CCCCGCCAGGAISACCACCGC TACCGOGGAA TCAGCAGACC
..VTT TVE N Y G G ETQ I Q R RENT
CGTCACCACA
CGGTCACCAC CACCGTGGAG AACTACGGCG GTGAGACACAAATCCAGAGA
..D/G
FIM
DRFVKIQ
SLS
PTEV
CGGACATTGG TTTCATCATG GACAGATTTG TGAAGATCCAAAGCTTGAGC CCAACACATG
..IDL MQA HQHG LVG.ALL'RAA T
34E1 TCATTGACCT CATGCAGGCT CACCAACACG GTCTGGTGGG TGCCTTGCTG CGTGCAGCCA
EIVV
RUEGML
TWVP
..YYF SDL
3421
3541 CGTACTACTT TTCTGACCTG GAAATTOTTG TACGGCACGAAGGCAATCTG ACCTGGGTGC
PES A L L N TSN PTA YNKA
..NGA
3601 CCAACGGCGC CCCTGAATCA GCCCTGTTGA ACACC.AGCAA CCCCACTGCC TACAACAAGG
..PFT RLA MPYT APH R V L ATVY
GCAACAGTGT
3661 CACCATTCAC GAGACTCGCT CTCCCCTACA CTGCGCCGCA CCGTGTGCTG
..NGT SXY AVGG SOR RGD MOS4
3721 ACAACGGGAC GAGTAAGTAT GCTGTGGGTG GTTCAGGCAG AAGAGGCGAC A2GGGGTCTC
..AAR V V K Q L P A SPN YG - A IXAD
3781 TCGCGGCGCG AGTCGTGAAA CAGCTTCCTG CTTCATTTAA CTACGGTGCAATCAAGGCCG
ELL VRMK RAE LYC
PRPL
3841 .ACGCCATCCA CGAACTTCTC GTGCGCATGAAACGGGCCGA GCTCTACTGC CCCAGACCGC
APA. K
..LAI EVS SQDR HKQ XI I
3901 TGTTGGCAAT AOAGGTGTCT TCGCAAGACA GGCACAAGCAAAAGATCATT GCACCAGCAA
-.4. 2B
.t...7.A24 2A
ZIKZ
AGD VSS SPOP
NFD
..QL£
3961
Acmccwrcr GAATTTTGAC CTGCTCAAGT TGGCCGGAGA CGTTGAGTCCAACCCCGGGC
Fig. 4B
6/50
V D T INQM
..PPF ADV ESNF
S K L
4021 CATTCTTCTT TGCTGACGTT AGGTCAAACT TTTCAAA.GTT GGTAGACACA ATCAACCAGA
..QED MS T KRGP
D F N
ELV S A P S
4081 TGCAGGAGGA CATGTCCACA AAACACGGGC CCGACTTCAA CCGGTTGGTG TCCGC.ATTTG
—ELA TGV E AIE
T G L
D E A E P W T
AGGAATTGGC CP.CTGGAGTT AAAGCTATCA GGACCGGTCT CGACGAGGCC AAACCCTGGT
4141
..KL / ELL 8 R L 3 CMA AVA AR SE
4201 ACAAGCTTAT CAAACTCCTA AGCCGCCTGT CGTGCATGGC cGCTGTGGCA GCACGGTCCA
IA24/Al2 junatior0 Al2 38
..DPV LVA IMLA DTG LER QRPL
4261 AGGACCCAGT CCTTGTGGCC ATCATGC'TGe CCGACACCGG IICTCGAGJCGT CAGAGACCTC
..ZVS .AK.L pQQB GpY AGP LESO
TGAAAGTGAG AGCTAAGCTC CCACAGMGG AAGGAcCTTA CGCTGGCCCG TTGGAGAGAC
4321
..KPL K V K AKAP VVK E G 2
. 1•EG22
GTGAAA GcAAAAGCGC CGGTCGTCAA GGAAGGAccT TACGAGGGAc
4381
AGAAACCGCT GAAA
Al2 3C
..VEK P V A
.LKVK AKN ZIV TEsa
4441 CGGTGAAGAA GCCTGTCGCT TTGAAAGTGA AAGCTAAGAA =ATA=
AC2~TG
..APP TDL QKMV
hl G N
TKP VEL I
4501 GTGCCCCACC GACCGACTTG C.AAAGATGG TCATGGGCAA CACAAAGCCT GTTGAGCTCA
TV AICC A TG VFG TAYL
4561 TCCTTGACGG GAAGACAGTA GCCATCTGTT GTGCTACTGG AGTGTTTGGC .ACTGCTTACC
..VPR H L F
AEKY DEI MLD GR AM
4621 TCGTGCCTCG TCATCTTTTC GCAGAG?AGT ATGACAAGAT CATGCTGGA2' GGCAGAGCCA
..TDS D Y R VFEP E IK VICG QDML
4681 TGA.C.AGACAG TGACTACAGA GTGTTTGAGT TTGAGATTAA AGTAAAAGGA CAGGACATGC
_SOA A L M V LER G N R VRD I TER
4743. TCTC.AGACGC TGCGCTCATG GTGCTCCACC GTGGGAACCG C.GTGAGAGAT ATCACGAAAC
TPV
v G v
.PRD T AR.MKK G
VNIIA
48 01 ACTTTCGTGA TACASCAAGA ATGAAGAAAG GCACCCCCGT CGTCGGTGTG GTCAACAACG
..DVG ELI
FsGE
ALT TKD IVVC
4861
CCGAGGTTGG GAGAcTGATT
TTCTCTOGTG AGGCCCTCAC CTACAAGGAT ATTGTAGTGT
„H DG D TM P G L F ATE AAT KAGY
4 921 GC.ATGGACGG AGACACCATG CCTGGCCTCT TTGCCTACAA AGCCGCCACC AA.GGCAGGCT
..CGG AVL A.KDG A.DT FIV
GTHS
AcTGTGGAGG AGCCGTTCTC GCCAAGGACG GGGCCGAC,AC TTTCATCGTC GGCACTCACT
4981
.. A G G
N O V G Y C S C V S E S E LLEM .
5042.CGA TG ACTG CATGCA
..KAR V D P E PQR E**
52.01 TGAAGGCACA CGTTGACCCT GAACC,ACAAC ACGAGTAGTA ATTTTTCTAG AATCGATCCC
C..5L
5161 GGGITTTTAT GACTAGTTAA TCACGGCCGC TTATAAAGAT CTAAAATGCA TAATTTcTAA
5221
ATAATGAAAA AAAGTACATC ATGAGCAACG CGTTAGTATA =AMAM GAGATTAACC
5281
CTCTATACCG TTCTATGITT ATTGATTCAG ATGATGTTTT AGAAAAGAAA OTISITTGAAT
5341 A2'GAAAACTT TAATGAAGAT GAAGATGACG ACGATGATTA TTGOTGTAAA TCTGTZTTAG
5401
ATGAAGAAGA TGAcGcGCTA AAGTATACTA TGGTTACAAA GTATAAGTCT ATAcTaCTAA
5461
TGGCGACTTG TGcAAGAAGG TATAGTATAG TGAAAATGTT GTTAGATOLT GATTATGAAA
5522.
AACcAAA2zA ATCAGATCCA TATCTAAAGG TATcTCCTTT GCACATAATT
TCATCTTTTC
5581
CTAG2TTAGA ATAC
Fig. 4C
7/50
(3ámH1 (17)
EcoR1_(5475)
EcoR1
(5475)
HIndll (400)
Xhal (405)
BgIll (410)
Pstl (418)
Sali (420)
VP2
VP3
2A
AU 2B
Al2 3B
BamHI (426)
'Anal (431)
EcoRI (436)
(27136)
pUC8 Ba! II/Xba 1
EcoR laba I
Ndel (185) Xbal (405)
Al2 3C
EcoRV (758)
g1111242)
UW530)
A24 2A
VP1
VP3
VP4VP2
Kpnl (3158)Ndel (2623)
EcoR1 ( )
-6- Nrul (22)
3416p
Xhol (7311)
Xbal (7299
VP4
VP2
P3
Amplificação de
PCR com 11277. SL
pUC FMDII P1+3C com 11282. SL
VP1
A24 2A
)(mal (2304)
A24 28
.
AmpR
de junção
AmpR
BamHI (3485) A24/Al2
Xhol (2592)
EcoRI (3454)
Al2 3C
Al2 38
BamHI (3442) Xbal (3436)
pCR2.1 H6p FMDVP1+3C
Xbal (981)
Xbal (1279)
F8R
EcoRI 11784)
)(mal (2101)
Notl (3728)
m11122267)
aI ( 296)
-^"."--"---- ■.
F8L
gi(cat508)
BamHI (2314)
BOI (2772)
Xhol (2320)
pF8 H6p
AmpR
FOR
EcoRI (1784)
Xmal (2101)
H6p
Nrul (2267)
VP4
VP2
vp3pn1 (2929)
Notl (7101)
F8L
Xhol (5693)
BamHI (
Al2 3C
Al2 3B Xhol
Fig. 5
Nrul/Bamif
VP1
A24 2A
Xmal (4549)
A24
Al2
de jun4ão
A24 26
pF8 H6p FMDV P1+3C
8/50
FOR
GACCCT2'2'AC AAGAATAAAA GUIAGAAACAA CTGTGAAATA GTTZATAAAT GTAATTCGRA
1
TGCAGAAAAC GATAATATAT TTTGGTATGA GARATCZAAA GGAGACA221G TITG2SITAGA
61
=amam
CA2'GCGCTCT 2'CCGATGAGA TATTCGATGC 11•2.1VTAATG TATCMZTAG
121
TGCCTATCAT GA2'GATGATA TATATCTACA AATAGTGTTA TATTATTCTA ATAATCAAAA
181
TGITATATCT TATATTACGA AAAATAAATA CGTTAAGTAT AT.AAGAAATA. AAACTAGAGA
241
CGATATTCAT AAAGSMAAAA
TATTAGCTCT AGAAGACTTT ACAACGGAAG AAATA2'ATTG
901
361 VTGGATTAGT AATATAMAC .AGCGTAGCTG C,ACGGITITG ATCATITTCC AACAATATAA
ACCAATGAAG GAGGACGACT CATCAAACAT AAATAACATT CACGGAAAAT ATTCAGTATC
421
AGAZTTATCA CAAGATGATT ATGTTA22'GA A2'GTAT.AGAC GGATCTTITG ATTCGATCAA
481
GT.AT'AGAGAT ATAAAGGTTA TAATAATGJ1A GAATAACGGT T.ACGTTAA2'T GTAGTAAATT
541
.ATGTAAAATG CGGAATAAAT ACTTITCTA.G ATGGTTGCGT C.:2
.1".L.CTACTT CTAAAGC:ATT
601
661 .ATTAGACZATT TACAATAATA AGTCAGTAGA TAATGCMIT GTTAAAGTCT ATGGTAAAGG
TAAGAAACTT ATTATAACAG GATTTTATCT
CAAACAAAAT ATGATACGTT ATGrfATTGA.
721
GTGGATAGGG GATGATTTTA
CAAACGATA2' ATACAAAATG ATTAATTTCT .ATAATGCGrE
781
841 ATTCGGTAAC GATGAATTAA .AAATAGTArc CTGTGAAAAC ACTCTATGCC CGTITA.TAGA
ACTTGG2'.AGA TGCTATTATG GTAAAAAA2'G TAAGZSITATA CACGGAGATC AATGTGATAT
901
961 CTGTGGTCTA TATATACTAC ACCCTACCGA TATTAACCAA CGAGTTICTC ACAAG.AAAAC
1021
TTGITTAGTA GATAGAGATT CT2'TGATTGI" GTTTAAAAGA AGTACCAGTA AAAAGTGTGG
CAY2ATGCATA. GAAGAAATAA ACAAAAAACA TATTTCCGAA C.AGTAT2TTG GAATTCTCCC
1081
1141
AAGTTOTAAA CATATT2TT2' GCCTATCATG TATAAGACGT TGGGCAGAIS1 CTACCAGAAA
1201 TACIGATACT GAAAA254.CGT GTCC2'GAA2'G TAGAATAGTT TTTCCITTCA TAATACCC.AG
TAGGTATTGG ATAGATAATA AATATGATAA AAAAATATTA MATAATAGAT ATAAGAAAAT
1261.
GATTI'TTACA .AAAATACCT.A TAAGAACAAT AAAAATATAA TTACATTTAC GGAAAA2'AGC
1321
TGGTTTTAGT ITACCAACTT AGAGTAATTA TCATATTGAA TCTATATTGC
TAATTAGCTA
1381
1441 ATAAAAACCC GGGTTAATTA. ATT.AGTCATC AGGCAGGGCG AGAACGAC,AC TATCTGCTCG
H6p
1501 TTAATTAATT AGAGCTTCTT TATTCTATAC TTAAAAAGTG AAAATAAATA CAAAGGTTCT
1561 TGAGGGTTGT GTTAAATTGA AAGCGAGAAA. TAATCATAAA TTATTTCATT .A.TCGCGATA.T
FhIDV VP4
M GAG Q 5 S PAT G SQN•
1621 CCGTTAAGTT TGTATCGTAA TGGGAGCTGG GCAATCCZAGC CCAGCAACCG GC2'COGAGAA
Mc2( I' QNS. QS G NTG.S
rrry Nrir
CCAGTCTGGC AACACTGGCA GCATAILTCAA CAACTACTAC ATGCAACAGT ACCAGAACTC
1681
r D
. MDT Q Z G D N A I SGG SNRG 9
CATGGACACA CAGTTGGGAG ACAATGCCAT •AG2'GGAGGC TCCAACGAGG GCTCCACGGA
1741.
IND WrSIC •nas•
T T NTQ
. TTS THT
CACAACTTCA ACACACACAA CCAACACTCA AAACAATGAC TGGTTCTCGA AGCTCGCCAG
1601.
VP2
LAD K K TE E T T. S A F TGLF G AL
AAGAAGACAG AGGAAACGAC
1661.
TTCAGCITT2' ACCGGTCTGT TCGGTGCM.CT GCTCGCCGAC
.LLE DRID T TR NG/I T T 8 T TQS•
1921 ACTTCTTGAG GACCGCATCC TCACCACCCG CAACGGGCAC ACCACCTC.GA. CGACCCAATC
.SVG V TETO TET EED WV.A.G PNT•
1981. GAGTGTGGGT GTCACACACG GGTACTCCAC AGAGGAGGAC CACGTTGCTG GGCCCAACAC
E TRV ITQA.
E R F
YICKY L FD•
. S G L
2041 ATCGGGCCTG GAGACGCGAG TGGTGC.AGGC AGAGAGA.TTC TACAAAAAGT ACTTGTTTGA.
.WT T DKAP G II L EKL E L PS DEZ210/ CTGGACAACG GACPAGGCAT TTGGACACCT GGAAAAGCTG GAGCTCCCGT CCGACCACCA
Ayld RNGW DVE•
GHL V D Sy
. G V F
2161 CGGTGTCTTT GGACACTTGG TGGACTCGTA. CGCCTATATG AGAAATGGCT GGGATGTTGA
.17 S A VONQ FNG GCL LV A 14 V P E•
GGTGTCCGCT GTTGGCAACC AGTTCAA.CGG CGGGTGCCTC CTGGTGGCCA TGGTACCTGA
2221
Fig. 6A
9/50
. fiNKE FDTR EKY'QLT LFP2 QFI.
2281 ATGGAAGGAATTTGACACAC GGGW~TA CCAACTCACC •CTTTTCCCGC ACCAGTTTAT
. SPE TIILMT AR I 'T V P Y L G. V NET .2341 TAGCCCCAGAACTAACATGA CTGCCCACAT CACGGTCCCC TACCTTGGTG TGAACAGGTA
.DQY KKFIK PWT LVV,MV.VS P L T
2401 TGATCAGTAC MGAAGCATAAGCCCTGGAC ATTGGTTGTC ATGGTCGTGT CGCCACTTAC
. VNN. T S'AA Q I K V Y A N/AP T . YV2461 GGTCAACAAC ACTAGTGCGG CACAAA2'CAA GGTCTACGCCAACATAGCTC CGACCTATGT
=0. VP3
SKE
G Y.F PV'AC ADG
. HVA GELE,
2521. TCACGTGGCC GGTGAACTCCCCT=U~GGGGATTTTC CCGGTTGCAT GTGCGGACGG
. rGG ZVT.T DPK.TAD P'AYG.KVYTTACGGAGGA TTGGTGACGA CAGACCCGAA GACAGCTGAC CCTGCTTATG GCAAGGTGTA
2561
. NPP RTATT POR'FTN IZDV A.EACAACCCGCCTAGGACTAACTACCCTGGGCG ÇTTCACCAAC CTGTTGGACG TGGCCGAAGC
2641
rzcr D DO1CPY VTTR TD-D•
. CPT
=ema= TTCCTCTGCT TTGACGACGG GAAACCGTAC GTCACCACGC
2701
aucralosa
A K F
D
.8 L.A A
K H '.M S
. T R.z Z
mr7cacgcmcwr TTGGCCAAGT TTGACCTTTC CCTTGCCGCA AAACATATGT - CCAACACATA
2761
Z.SG MAQ'Y YTQ YSO
TruzHrif•
CCTGTCAGGGATTOCTC7IGTACTACACACA.GZACTCTGGCACCATCAATTTGCATTTCAT
2821
. V AYIP
PG'ir
.YT.G STDS KAR 1•24
2881
GTTTACAGGT TCCACTGATT CAAAGGCCCGATACATUGTG GCCTACATCC CACCTGGGGT
.ETP PDTp E
. RA.AMC THAR FIDT•
GGAGACACCA CCGGACACACCTGAAAGGGC TGCCCACTGCATTCACGCTGAATGGGACAC
2941
. - G Z N . S K F T F 8 1 P 7 . V. .S. A 'A D
A . Y
3001 - TGGACTAAAC TCCAAATTCA CMTTCTCAAT CCCGTACGTA TCCGCCGCGGATTACGCGTA
.TAS 'DTAE T.TN VQG. NVCX YQX•
- TGGGTCMCA Tcmcgmuur
3061
CACAGCGTCT GACACEGCAG AAACAATCAA.CGTACAGGGA
.•TIIG
3121
. E . Z12
3181
K
A
E
N
DTZ
VV.S
VSAG
K.D . 7•
TAWICACGGGAAGGCTGAAA ATGACACCTT GGTCGTGTOG GTMAGCGCCG GCAAAGACTT.
ZPID.PR.Q
VP1
QTT
ATGE
SAD-
TGAGTTGCGC CTCCCGATTGACCCCCGCCAGCACWCACC
GCTACCOGGG AATCAGCAGA
.PVT T.TVE
N Y G
GET Q I Q R 1122•
3241 CCCGGTCACC.ACCACCGTGGAGAACTACGG CGGTGAGACA CAAATCCAGA GACGTCACCA
. TDI G . 10 1M DEVP•VK'I QSLS P.T 2 3301 . CACGGACATTGGTTTCATCA TOGACAGATT TGTGAAGATC. CAAAGCTTGA GCCCAACACA
.V/.D LMQA
Q . 2 . GLVEAA3361 TGTCATTGAC CTCATGCAGG CTCACCAACA CGGTCTGGTG GGTGCCTTGC TGCGTGCAPC
.TYY
VS'DL
EIVVRE
EGNM
TWV3421 CACGAACTTC TTTTCTGACC TGGAAATTGT TGTACGGCAC GAAGGCAATC TGACCTGGGT
. PNG APES A L L. N.TS N'PTA YNK
3481 GCCCAACGGC GCCCCTGAAN CAGCCCTGTT GAACACCAGC AACCCCACTG CCTACAACAA
.APE
TELA
LPY
TAP
HEVM.AVV•
3541 • GGCACCATTCACGAGACTCG CTCTCCCCTA CACTGCGCCG CACCGTGTGC TGGCAACAGT
YNG T — SKY: AVG. GSG RRGD MGS-
3601 GTACAACGGG ACGAGTAAGTATGCTGTGGG TGGTTCAGGC AGAAGAGGCG ACATGGGGTC
RVITK Q L P ASP'NYGA 11(.14.AR
3661 TCTCGCGGCG CGAGTCGTGA.AAC.AGCTTCC TGCTTCATTT AACTACGGTG CAATCAAGGC
H. E L. L
V. Et 14.. K R. A
E- 1.—Y sC .P R P •
..•1D A I
.
'CGACGCCATC CACGAACTTC TCGTGCGCAT GAAACGGGCC GAGCTCMACT GCCCCAGACC
.LLA IEVS SQD R E K QKII APA•
3781 GCTGTTMGCAATAGAGGTGT CTTCGCALGA. CAGGCACAAG CAAAAGATCA TTGCACCAGC
3721
Fig. 68
10/50
.KQA
A24 2A
L N F D ZLIC L A G DVES NPG-
AAAGCAGCTT CTGAATTTTG ACCTGCTCAA GTTGGCCGGA GACGTTGAGT CCRACCCCGG
A24 213
R S N F S K L V.D.T INQ.PPF PADV
3901 GCCATTCTTC TTTGCTGACG TTAGGTCAAA CTTTTCAAAG TTGGTAGACA CAATCAACCA
.M - QE
D.MST.EFIG PDF
NRLV SA'F•
3961 GATGCAGGAG GACATGTCCA CAAAACACGG GCCCGACTTC AACCGGTTGG TGTCCGCATT
.EEL A T G V KAT
RTGI.DE A.KP.W •
4021 TGAGGAATTG GCCACTGGAG TTAAAGCTAT CAGGACCGGTCTCGACGAGG CCAAACCCTG
•.yxn IKLL S R L SCMAAV.A .ARS4081 GTACAAGCTT ATCAAACTCC TAAGCCGCCT GTCGTGGATG GCCGCTGTGG CAGCACGGTC
1A24/Al2 junctiorè› Al2 3211
•
VLVA IML ADT
GLER'QRP•
4141 CAAGGACCCA GTCCTTGTGG CCATCATGCT GGCCGACACC WACTCGA4C'GTCAGAGACC
3841
.4201
R .
. .LEV
P.QQ'SGPYAG•P L.ER
TC2''GAAAGTG AGAG
CTAAGC.TCCCACAGCA. GGAAGGACCT TACGCTGGCC CGTTGGAGAG
, QEP
z.x .trx A K A PTIVEE G. E' Y' E 'G •
4261
ACAGAAACCG CTGAAAGTGA AAGCAAAAGC CCCGGTOWICALAGGAAGGAC CTTACGAGGG
3C
7K KP VA ZECV
.K.AK 111 L ± V T. E S•
ACCGGTGAAGAAGCCTGTCG CTTTGAAAGT GAAAGCMAAG AACTTGATAG TCACTGAGAG
, GAP
•P T DL
QEM
GU
HTKP V.S - 1, •
4381 TGGTGCCCCA CCGACCGACT TGCAAAAGAT GGTCATGGGC AAÇACAAAGC CMGTTGAGC r.
. I LD G'KTV AIC C A T GVP. q. .T . A. Y •
4441 CATCCTTGAC GGGAAGACAG TAGCCATCTGTTGTGCTACT GGAGTGTTTG GCACTGCTTA
4321
■
GRA•
AEIC YDK
I.ML'D
4501 CCTCGTGCCT CGTCATCTTT TCGCAGAGLA GTATGACAAGATCATGCTGG ACGOCAGAGC •
VPE.PEI KVKG' TDM .. MTDSD'YR
4561 CATGAGAGAC AGTGACTACA GAGTGTTTGA GTTTGAGATT AAAGTAAAAG GACAGGACAT
VLH-R.GN RVRD ITK•
. 1.8D'AALM
4621
GCTCTCAGAC GCTGCGCTCA MGGTGCTCCA CCGTGGGAAC CGCGTGAGAG ATATCACGAA
.0E-R
, DTAR
MICK
GTP
VVGV'VliN
4681 ACACTTTCGT GATACAGCAA GAATGAAGAAAGGCACCCCC GTCGTCGGTG'TGGTCAACLA
A D V G E L. / .p S. G
SAL TI.*K.D IVV•
TGmhar
4741
CGCCGACGTT GGGAGACTGA
TTTTCTCTGG TGAGGCCCTC ACCTACAAGG
AYAT
.CM.D .GDT• M P.GL PAY K A A T K.A G
GTGCATGGAC GGAGACACCA
TGCCTGGCCT CTTTGCCTAC AAAGCCOCCACCAAGGCAGG
4801
Tryv . GTE•
.YCG GAVL AK . D.GAD
4861
CTACTGTOGA.GGAGCCGTTC TCGCCAAGGA CGGGGCCGAC ACTTTCATCG TCGGCACTCA
. S A G GNG .17
GYC'SCV SRSM . L . LR4921 CTCCGCAGGA GGCAATGGAG TTGGATACTG CTCATGCGTT TCCAGGTCCA TGCTTCTCAG
.MKA H.VDP EPQ HE
4981 AATGAAGGCA CACGTTGACC. CTGAACCACA. ACACGAGTAG TAATTTTTCT AGAGGATCCC
•
F8Z
maacaxmdr
5041. TCGAGTTTTT ATTGACTAGT TAATCATAAG ATAAATAATA WACAGCAWTG
CATCCGTTAT ACGGGGAATA ATATTACCATACAGTATT.AT TAAAWWWICT TACGAAGAAT
5101
ATAGATCGGWATTTATCGTTAGTTTATTTTACATTTATMAATTAAACATGTCTACTATTA
5161
CCTGTTATGG AAATGACAAA TTTAGTTATA TAATTTATGA TAAAATTAWATAATAATAA
5221
5281
TGAAATCAAA . TAATTATGTAAATGCÉACTAGATTATGTGAATTACGAGGAAGAAAGTTTA
5341
CGAACTGGAA AAAATTAAGT GAATCTAAAA TATTAGTCGA TAAWGZRAAAAAAATRAATG
ATALAACMAA CCAGTTAAAA ACGGATATGA TTATATACGT TAAGGATATT GATCATAAAG
5401
5461
5521
5581
GAAGAGATACTTGCGGTTACTATGTACACCAAGATCTGGTArcr2~TCAAATTGGA
T.ATCTCCGTT ATTCGCCGTT AAGGTAAATA AAATTATTAA CTATTATATA TGTAATGAAT
ATGAT.AT'ACG ACTTAGCGAA ATGGAATCTG ATATGAC.AGA AGTAATAGAT GTAGTTGATA
Fig. 6C
11/50
.AAT'ZAGTAGG AIZGATACAAT GATGAAATAG CAGAAATAAT ATATTTGTTT AATAAATTTA
TAGAAAAATA TATTGCTAAC ATATCGTTAT CAACTGAATT ATCTAGTATA TTAAATAATT
TTATAAATTT TAATAAAAAA T.ACAATAACG ACATAAAAGA TATISIAATCT TTAATTCTTG
ATCTGAAAAA. CACATCTATA .AAACTAGATA AAAAGT2'ATT CGATAAAGAT AATAATGAAT
CGAACGATGA .AAAATTGGAA ACAGAAGTTG ATAAGCTAA.T TTTTTTCATC TAAATAGTAT
TATTTTATTG AAGTACGAAG TTTTACGTTA GATAAATAAT AAAGGTCGAT TTTTATTTTG
TTAAATATCA AATATGTCAT TATCTGATAA AGATACAAAA ACACACGGTG ATTATCAACC
ATCTAACGAA CAGATATTAC AAAAAAT.ACG TCGGACTATG GAAAACGAAG CTGATAGCCT
CAATAGAAGA AGCATTAAAG .AAATTGTTGT AGATGTTATG AAGAATTGGG ATCATCCTCT
6181 CAACGAAGAA .ATAGATAAAG TTCTAAACTG GAAAAATGAT ACATTAAAC'G A.TTTAGATCA
TCTAA.ATACA GATGATAATA TTAAGGAAAT CA-TACAATG2' C2'GATT.AGAG AATTTGCGTT
6241
plAAAAGATc AATTCTATTA TGT.ATAGTTA TGCTATGGTA AAACTCAATT CAGAT.AACGA
6301
AACATTGAAA GATAAAATTA AGGATTATTT TATAGAAACT ATTCTT.AAAG ACAAACGTGG
6361
TTATAAACAA .AAGCCATTAC CC
6421
5641
5701
5761
5821
5881
5941
6001
6061
6121
.
Fig. 6D
12/50
Al2 3B
D T G L ERQR
11280 . SL 5' CGACACCGGT1CTCGAGICGTCAGAG
Xho I = A24/Al2
A24 2B
De junção
V DP E PQHB**T5NT
GTTGACCCTGAACCACAACACGAGTAGTAATTTTTCTGCAG
11352 . CXL 3' CAACTGGGACTIGGTGTTGTGCTCATCATTAAAAAFG—
ACGTC1
Ps t I
Fig. 7
13/50
AmpR
Kpnl (655) '
Xbal (963)
anal IMP6r)
BamHI (1182)
C6R
EcoR1 (1837)
hol (1843)
Nd (8531
1
•
Xma1 (1855)
C6L
Ndel (185) Xbal (405)
Al2 3C
Xhol (1242)
12 3B
A24.213
Anal (1530)
A24 2A
VP1
ECORI
(3798)
VP3
VP4VP2
Kpnl (3158)Ndel (2623)
pl.IC FMDV P1+3C
Amplificação de
PCR com 11277. SL
e 11282. SL
EcoR1 (284)
Xhol (317)
Al2 3B
EcoRI/Xho 1
y
Al2 3C
Kpnl (665)
BamHJ (1182)
C6R
Bg111 (1293) AmpR
EcoR1 (1837)
VP4
~ai (4405)
Pstl (4403
Xhol (4393)A24 28
Pstt (1166)
EcoR1 (1181)
Pstl (1190)
Xhol (1214)
KanR
Xmal (4105)
A24 2AVP1VP3
pC6 5'-FMDV
Xho 1/Pst 1
Kpnl (7857)
AmpR
Fig. 8
Pstl (2357)
pCR2.1 3'-FMDV
Notl (4987)
C6L
Xmal (4589)
Pstl (4587).
Al2 3C
EcoRV (4226)
Xbal (308)
bal 1521)
C6R
EçoR1 (1182)
P4
vp2
n1(1830)
N del (2359)
VP3
VP1
A24 2A
Xmal (3450)
A24 2B
Xhol(3738)
Al2 3B
pC6 FMDV P1+3C
14/50
EcoR1 (6)
Xhol (7311)
Xbal (7299)
Kpn) (655)
KanR
VP3
HindlIl (1004)
BamHI (1182)
C6R
Notl (2386)
C6L
VP1
A.24 2A
Xmal (2304)
A24 2B
A24/Al2 junction
Al2 3C hol (2592)
AmpR
H6p
rul (1941)
coRV (1945)
EcoRI (1970)
Xhol (1976)
Pstl (1986)
Xmal (1988)
Nrul (22)
W-H6pVP4
VP2
Barntil (3485)
EcoRI (3454)
BamHI (3442) Xbal (3436)Al2 38
pCR2.1 H6p FMDV 131+3C
pC6 H6p
Eco R1J284)
xho7)
l (31
Al2 3B
Kpril (655)
c
Beam HI (1182)
C6R
116P Nnui (1941)AmpR
EcoRV(1945)
VP4
Xmal (4523)
Pstl (4521)
Al2 3C
Pst1 (1166)
EcoRI (1181)
Pstl (1190)
Xhol (1214)
VP2
Kpnl (2603)
Xh°1 (45" )A24 28
VP1
Xmal (4223)A24 2A
3VP
Pstl (2357)
KanR
pCR2.1 3 .-FMDV
PC6 H6/3 5'-FMDV
Xho I/Pst I
v Kpnl (7975)
BamHI (527)
C6R 6p
nul (1941)
EcoRV (1290)
P4
VP2
pnl (1948)
Notl (5105)
C6L
Xmal (4707)
Pstl (47051
Al2 3C
EcoRV (4344)
Fig. 9
VP3
VP1
A24 2A
Xmal (3568)
A24 2B
Xhol_(38.56)
Al2 3B
pC6 116)) FMDV 121+3C
15/50
1 TTCATAAATA CZAGTTTGAT TAAACTTAAG TTGTTCTAAA GTTCT2TCCT CCGAAGGTAT
61 AGAACAAAO2'ATTTCTTC151 CATCÓTTACTATTTATTGCA GCTTTTAACA GCCTATCACG
xamcnErnrrimaAnsw TAGAACGTTT TAGTTCTAAA GTTAAAATAT TAGACATAAT
121
TGGCATATTG CVTATTCCTT GCATAGTTGA GWCTGTWAT CGTTTCAGTA TATCACTGAT
181
TAATGTACTA CTGTMATGAT GAAATATAGA ATCGATATTO
GTTTTGTEAT
241
301
ACTAAGTCTA OATTTTAAAT CTTCTAGMAA MATGCTAITTJULTATAAAAG CTTCCACGTT
361
Trarmaxam nummcca marmwraGc macmac~ TGATTATCTT CTTTCATATC
rwmaGamaa GATAGACTATmummaywniATTAGTAGAA AATACTTCTG GCCATACATC
421
GTMAAATZTT TTTGTTGTTG TTAGAMATAA TATTALATAT CTAGLGGATC CTATTATTTG
481
TGGTAAAATG TTTATAGAGT AAAATGATCT
GOCTATTAAA CAMAGGCCAG TWACCATAGA
541
ecarmAncr
601
ATGCTGCTTC CCGTWACAGT GTTTTACCAT AACCATAGAT CTGCCTGMAT TGTTGATACA
661
721
781
841
901
961
.1021
1081
TATAACAGCT GTAAATCCTA AAAAATTCCTATCATAATTA TWAATATTAG GTAATTCATT
TCCATGTGAA AGATAGACM ATTTTATATC CTITACCTCCAAATAATTAT TTACATCTCT
TAAACLAWCW=22AATAT CATTAACTGG TATTTTATAA TATCCAGAAA GGTTTGAAGG
GGTTGATGGA ATAAGTCTAT TAACATCGTTAAGTAAATTA TTAATATCAT GAATCTTTAT
TATATTATAC CCATAAGTTAAATTTATATT TACTTTCTCA TCATCTGACT TAGTTAGTTT
GTAATAAGGT GTGTCTWIAAAAATTAAAAG GTAATTCGTT GAATGAAGCT GTATTTGCTG
TATCATTfiCT ATCTAATTTSP GGAGATTMAG CAGMACTTAC TTCATTAGAA GAAGAATCTG
CCAGTTCCTOTCTATTACTGATATTTCGTT~TATTATATGATTTATA TTTTACTTTT
C6R 4=
= H6p
TCAATAAAAA GAATTGTTCT TTATTCTATA
TCAAMATATATACIVATTTGACTAGTTAA
1141
1201 CTTAAAAAGT GAAAATAAAT ACAAAGGTTC TTGAGGGTTG TGTTAAATTG AAAGCGAGAA
VP4
MGAG
1261 ATAATCATAAATTATTTCATTATCGCGATATCCGTTAAGT TTGTATCOTA ATGGGAGCTO
..Q88 PAT GSQN
Q S G lirTG
GGCAATCCAGCCCAGCAACCGGCMGCAGAACCAGTOTGGCAACACTGGCAGCATAILICA
Mg.(2 YQRS MDT QX,G DR A. 1
..NYY
ACAACTACTA CATGCAACLG TACCAGAACT CCATGGACACACAGZIgUGGA GACAATGCCA
1381
TTS THT .
Gsrp
S G G
SNS
TNTQ
TCAGTGGAGGCTCCAACGAG GGCTCCACGGACACAACTTCAACACACACA ACCAACACTC
1441
NNT) WYS ICZAS SAN TGL YGAL
GWTCAGCTTT TACCGGTCTG 21VGGTGCAC
1501
AAAACAATGA cmcmcsrmAAGcrwcta
VP2
.
KKT EETT L L E DRI LTTR
GAGGAAACGA CACTTCTIGA GGACCGCATC CTCACCACCC
TGCTCGCCGA CAAGAAGACA
1561
..NGH TTS TTQS SVG VTH GYST
ACGACCCAAT CGAGTGTGGG TGTCACACAC GGGTACTCCA
1621
GCAACGGGCA•CACCACCTCG
SOL
ETR VVQ A.
..SED HVA GPNT
CATCGGGCCT GGAGACGCGA GTGGTGCAGG
1681 CAGWAAGGA CCACGTTGCT GGGCCCAACA
1321
..ERP
YKK
YLPD
WTT
DICA
POHL
1741 CAGAGAGATT CTACAAAAAG TACTWGTTTG ACTGGACAAC GGACAAGGCA TTTGGACACC
-EXT.
EtP
SDHH
GVP
GHL
VADSY
1801 TGGAAAAGCT GGAGCTCCCG TCCGACCACC ACGGTGTCTT TGGACACTTG GTGGACTCGT
QFNO
WR N G WDVE VSAVGN
1861. ACGCCTATAT GAGAAATGGC TGGGATGTTG AGGTOTCCGC TGTTGGCAAC CAGTTCAACG
..GCL LVA MVPE WX.E FDT FIM
1921 GCGGGTGCCT CCTGGTGGCC ATGGTACCTG AATGGAAGGAATTTGACACA CGGGAGAAAT
TRM
TAHI
..QLT LEP HW S P R
1981 ACCAACTCAC CCTTTTCCCG CACCAGTTZA TTAGCCCCAG AACT.AACATGACTGCCCACA
.TVP Y.L.G .VNRY DQY KKH
K2 - 11 T
2041 TCACGGTCCC CTACCTTGGT GTGAACAGGT ATGATCAGTA CAAGAAGCAT AAGCCCTGGA
..LVV MVV SPIAT
VNN
TSA AQIK
2101 CATTGGTTGT CATGGTCGTG TCGCCACTTA CGGTCAACAA CACTAGTGCG GCACAAATCA
Fig. 10A
16/50
..VY A N IA P2'7V IIVA GEL 13 S K E
2161 AGGTCTACGC CAACATAGCT CCGACCTATG TTCACGTGGC CGGTGAACTC CCCTCGAAAG
VP3
..GTF PVA CA.DG Y G G
.PVT
TDPE•
AGGGGAT ITTT CCCGGTTGCA TG2'GCGGACG GrTACGGAGG ATTGGTGACG. ACAGACCCGA
2221
PAY
. GEVY NP.P.R TN.YP GR
AGACAGCTGA CCCTGCTT.AT GGCAAGGTG2' AMACCCGCC TAGGACTAAC TACCCTGGGC•
..FTN .ZZD VARA CPT F
.t _C E'DDG'
2341 GCTTCACCAA •CCTG2TGGAC G2GGCCGAAG CGTGTCCCAC TTTCCTCTGC TTTGACGACG
..RPY V
2'. 2'
R T . DD TRZ'..LAN FDLS
GGAAACCGTA CGTCACCACG CGGACGGATO ACACCCGACT TT'ÉGGCCAAG TTT'GACCrl'T
.
2401
...LAA
.1c a 24 ÉN? Y ZSG XAQ YYTQ
CCC2'TGCCGC AAAACATATG TC.CAAC..A CA2' ACCTGTCAGG GATTGCTCAG TACTACACAC
2461
..Y S G T I N Z A FM FT G STD SE•-AR"
2281
.
2521
AGTACTCTGG CACCATCAAT
TraCATITCA TGTTTACAGG TTCCACTGAT TCAAAGGCCC
. Y M V A Y I P • .1 2' .•G V• E 2' P• P D
'P E• R A
2581
GATACATGGT GGCCZACAT'C CCACCTGGGG TGGAGACACC ACCGGACACA. CCTWIAAGG.G • •
• A kl •C
R A E
G L N S
is.r 2 F S • I
W. D 2
CTGCCCACTG CA2'TCACGCT G4TGGGACA CTGGAC'TAAA
CTCCAAATTC A.CTTTCTÇAA •
. . P Y V S A A DYA Y TA'S D
2'. . A E 2' E 1.7
TCCCGTACGT ,A.TCCGCCGCG GATTACGCGT ACACAGCGTC TGAC.ACC,GCA GA21ACAA2'01
•
2641
2701
•
VQG
WVC I TOE THG RAZ IfDTL
.ACGTACAGGG ATGGGTCTGC ATCTACCAAA TTACACACGG GAAGG CT GAA AATGACACCT
:.1r V S - V SA G E.D FHE Is:R Z1 3 I. DP R Q.
TGGTCGTGTC GGT2'AGCGCC GGCAAAGACT TTGAGTTGCG
carccc~ GACCCCCGCC
2821
VP1
• ENY-G••
. .QT T ATG
E SAD PV T .T T-V
2881
AGCAGACCAC CGCTACCGGG GAATCAGCAG ACCCGGTCAC CACCACCGTG GAGAACTACG .
...•GE T'
QIQ.RREH
TD/ . .GE`•/ .
2941 GCGGTGAGAC ACAAATCCAG AGACGT'CACC ACACGGACAT TGGTTTCATC ATGGACAGAT
2761
_. V K I QSD S P.TE.V TO L M Q AN.Q11
3001 TTGTGAAGAT • CCAAAGCTTG AGCCCAACAC ATGTCATTGA. CCTCA.TGCAG GCTCACCAAC
...CL V G A L
L. R A A T77 FSD L E IV
3061, ACGGTCTGGT GGGTGCCTTG CTGCGTGCAG CCACGTACTA CTTTTCTGAC CTGGAAATTG
PNG APE.. • S .A
.. V R H E G. 14 1 T W V
• I.
AA„ TCAGCCCTGT
3121 TTGTACGGCA CGAAGGCAAT CTGACCTGGG TGCCCAACGG CGCCCCTG
NPT A TEK APE .TRZ
31.81 TGAACACCAG CAACCCCACT GCCTACAACA AGGCACCATT CACGAGAÇTC GC'ECTCCCCT
TEG
..T A E' ER V.LA T V
.'
A V G
3241 ACACTGCGCC GCACCGTGTG CTGGCAACAG TGTACAACGG GACGAGTAAG TATGCTGTGG
. G S G
3301
GTGGTTCAGG
•RRG DMGS L AA R•VV KQLP
CAGAAGAGGC GACATGGGGT CTCTCGCGGC GCGAGTCGTG AAACAGCTTC
..AS E 14 70 AIK A DAI FIEL 1...V.R. M
3361 CTGCTTCATT TAACTAMGT GCAATCAAGG CCGACGCC,AT CCACGAACTT CTCGTGCGCA
..KR • A•ELY CP FLP L L A IEV S S Q . 1)
3421
TGAAACGGGC CGAGCTCT.AC TGCCCCAGAC CGCTGTTGGC AATAGAGGTG TCTTCGCAAG •
A24 2A
QK I I AP A' K QZ
.LITF D•Z.DE
3481 ACAGGCACAA GCAAAAGATC .AT TGCACCAG CAAAGCAGC2' TCTGAATTTT GACC2'GCTCA
A24 28
.
.A G D V E ESPG
P E E "F A D. V R S
3541
GGCCATTCTT CTTTGCTGAC GTTAGGTCAA
AGTTGGCCGG AGACGTTGAG TCCAACC.CCG
..F 8 E L VD T INQ MQE DMS T K H G
3601 ACTTTTCAAA GTTGGTAGAC ACAATC-AACC AGATGCAGGA GGACATGTCC ACAAAACACG
Fig. 10E3
17/50
..PDF.11 R L VSAFEEL A TO
VICAI
3661 GGCCCGACTT CAACCGG'TTG GTGICC.GCA T TTGAGGAATT GGCCACTGGA GTTAAAGCTA
..R T G LDE
AKPW
Y K L IEL L S R L
3721 TCAGGACCGG TCTCGACGAG GCCAAACCCT GGTACAAGCT
TATCAAACTC CTAAGCCGCC
S C M
•A A V
A ARS K.D
P. V L•V A'I M L
TGTCGTGCAT GGCCGCTOTG
GCAGCACGGT CCAAGGACCC AGTCCTTGTG GCCATCATGC
1A24/Al2 jUnCtioni
A3.2 3B
. . A D T G
E RQRP ZN' V RAK .ZPQQ
3841
TGGCCGACAC CGGliCTCGAGI•CGTCAGAMIC CTCTGAAAGT GAGAGCIS1AG CTCCCACAGC
..EGP .Y AG P.LER Q
K P Z E V
3901
AGGAAGGACC TTACGCTGGC CCGTTGGAGA GACAGAAACC GCTqAAAGTG AAAGCAAAAG
.FCEG P YEG PVIC KP•V AZEI?*
3961 CCCCGGTCGT CAAGGAAGGA CCTTACGAGG GACCGGTGAA GAAGCCTGTC GCTTTGAAAG
A.1.2 3C
KAK N L 1 V TES
. G' A P P T D LQ1414
TGAAAGCTAA GAACTTGATA GTCACTGAGA GTGGTGCCCC ACCGACCGAC TTGCAAAAGA
4021
..VMG N TE
P.V•ED /.L D' G ET V . A.IC
4081 TGGTCATGGG CAACACAAAG CCTGTTGAGC TCATCCTTGA CGGGAAGACA GTAGCC.ATCT
•..CAT GVF•GTAY•LVP
1 2 H I.
F..AEK
4141 GTTGTGCTAC TGOAGTGTTT GGCACTGCTT ACCTCGTGCC TCGTCATCTT TTCGCAGAGA
..YDIC / 14 L D G . RA 14 Tb SDY RVP'E
4201 AGTATGACAA GATCATGCTG GATGGCAG,A.G CCATGACAGA CAGTGACTAC AGAGTGTTTG
..FEZ.KVK •GQ•D.14 L S.D AAL•14VL'11
4261 AGTTTGAGAT TAAAGTAAAA GGACAGGACA TGCTCTCAGA CGCTGCGCTC ATGGTGCTCC
..a G N•• R V R D 1 T.K . 11 F . R D TA R - 14 K K
4321. ACCGTGGGAA CCRCGTGAGA. GATATCACGA. AACACTTTCG TGATACAGCA AGAATGAAGA
..GTP V . VG VVN•N ADV
•G a L
I•F•S G
4381. AAGGCACCCC CGTCGTCGGT GTGGTCAACA ACGCCGACGT TGGGAGACTG ATTTTCTCTG
..EA.L TYK.DIVV C'ED ODTMPGL
4441 GTGAGGCCCT C.ACCTACAAG GATATTGTAG TGTGCATGGA. CGGAGACACC" ATGCCTGGCC
..FAY KA•A TK,AG .1. C•G GAV LAKD
4501 TCTTTGCCTA . C.AAAGCCGCC. ACCAAGGCAG GCTACTGTGG AGGAGCCGTT CTCGCCAA.G
G
..áAD T•F I VOTE
SAG GNG
VG•YC
4561 ACGGGGCCGA CACTTTCATC GTCGGCACTC ACTCCGCAGG ArÁCAATGGA•GTTGGATACT
3781
..S C'V S
R S
MLLR MICA 11 V D P•E.PQ
4621 GCTCATGCGT TTCCAGGTCC ATGCTTCTPA: GAATOAAGGC ACACGTTGAC CCTGAACCAC
.. H E '*
4681 AACACGAGTA OTAATTTTTC TGCAGCCCOG GTTTTTATAG CTAA.TTAGTC ATTTTTTCGT
4741. AAGTAAG2212 1 TXTTATTTAA. TACTRTTTAT TGTACTTATG TTAAATATAA CTGATGATAA
4802.
CAAMITCCAT TATGT.ATTAT TTATAACTar AATTTCTTTA GCGTAGTTAG A.TGTC~ •
TCTCTCAAAT ACATCGGCTA TCTTTTTAGT G.AGATTTTGA TCT.ATGCAGT TGAAACTTAT
4861
4921
GAACGCGTGA TGATTAAAAT.' GTGAACCGTC CAAATTTGCA GTCATINIT.AT GAGCGTATCT
4981
ATISITVISICT ATCATCATCT 2TGAGITTATT AATATCATCT ACTZTAGAAT TGATAGGAAA
Gacrrrar.,Ar
5041
271TGAZLTACC TTTGTAGTAA TATCTATACT ATCTACACCT AACTCATTAA
5101.
AG . ,
.
CR,
Fig. 10C
H6p TTCTTTATTCTATACTTAAAZIAGTGRAAATAAATACAAAGGTTCTTGA.
116p* TTCTTTATTCTATACTTAAAAAGTGÊNAATAAATACAAAGGTTCTTG
H6p
GGGTTGTGITAZIATTGAMGCGAGAAATAATCATAAATTATTTCATTATCGCGATATCCGTTAAGTTTGTATCGTA
H6p =
Promotor H6 tipo selvagem precoce/tardio
H6p* =
Promotor H6 precoce com uma única mutação no nucleotídeo
Fig. 11
=>11124
M G
11353.CXL 5' dAATTCTTCTTTATTCTATACTTAAAAAGTECAAATAAATACAAAGGMTCTTGATGOGAG
Eco RI => H6p*
L A A R•11 24 S
CTTGCCGCAAAACATATGTCCA
11358.CXL 3' GAACGOCGTTTTGTATACAGGT
Nde I
Fig. 12A
H6p* VP4
M G A G Q S S
11410.UM 5' CTTGATGGGAGCTGG CANTCCAGC
11411.HM 3' -GAACTACCCTCGAC GTTAGGTCG
Fig. 12B
20/50
AmpR
Kpnt (245) BamHl (253)
EcoRI (284)
EcoRI (296)
mutant H6p
missing nt
VP2
Kpnl (984)
Ndel (185) Xbal (405)
Al2 3C
PCR ampiify
EcoRV (758) with 1353.CXL
and 11358.CXL
gI91242)
teani530)
VP3
Ndel (1513)
AmpR
coRI (1528)
Xhol (1561)
A24 2A
VP1
EcoR1
(3798)
VP3
VP4VP2
Kpnl (3158)Ndel (2623)
pUC FMDV P1+3C)
•
KanR
nt
Mutagênese direcionada ao local
com 11410MM/11441-HM
AmpR
Kpnl (7857)
BamHl (527)
6ER
coRI (1182)
P4
VP2
Kpnl (1830)
Ndel (2359)
VP3
VP1
•
Kpnl (245) BamHl (253)
EcoRI (284)
EcoRI (296)
Mutanten6D
VP4
'
VP2
Kpnl (985)
VP3
Ndel (1514)
EcoRI (1529)
Xhol (1562)
AmpR
C6L
)(mal j4589
m
A2a41_(23480)
A
Al2 3C
A24 2B
EcoRV (4226
A 2 3B Xhol (3738)
pCR2.1 H6p* 5=FMDV)
pC6 FMDV P1+3C
Kpnl (59)
AmpR
coRI 11241)
Mutante H6p
P4
VP2
Kpnl (1930)
Ndel (2459)
Notl (5087)
C 6L
VP3
Xmal (46 89 )
Pstl (4687
VP1
A24 2A
Al2 3
EcoRV (4326)
Xmal (3550)
Al2 3B A24 2B
Xhol (3838)
pC6 H6p* FMDV P1+3C
Fig. 13
.
21/50
2. TTCATAAA251 CZIAGTTTGAT 22kAACTTAAG TTGTTCTAAA GTTC2
(TTC.CT CCGAAGGTAT
AGAACAAAGT ATTTCTTCTA CATCCTTACT
ATITATTGCA GCTTITAACA GCCTATCACG
121 TATCCTATT2' ITAGT:ATTGG TAGAACGTTT TAGTTCTAAA GT221AAATAT TAGACATAAT
61
181 TGGCATATTG CTTATTCCT'T GCATAGTTGA GTCTGTAGAT CGTTTCAGTA. TATCACTGAT
TAATGTACTA CTGTTATGA2' GAAAT21TAGA ATCGikTATTG, GCATTTAACT OTTTTGTTAT
241
301. ACTAAGTCTA GATITTAAAT CTTCTAGTAA TATGCT.ATTT AAT2ITAAAAG CTTCCACGTT
TTTGTATACA TTTCTTTCCA TA.TTAGTAGC TACZACTAAA TGATTATCTT CTTTCATATC
361
TTGTAGAT.A21 GATAGACTAT CTTTATCTTT ATTAGTAGAA AATACTTCTG
GCCATACATC
421
GTTAAArnir TTTGTTGTTG TTAGÁTTAZZA
TATTAAATAT CTAGAGGATC CTAT'TATT2'G
481
541 . TGGTSAAATG TTTATAGAGT AAAATGATCT GGCTATTAAA CATAGGCCAG TTACCATAGA
ATGCTGCTTC CCGTTACAGT GTTTTACCZA2' AACCATAGAT CTGCCTGTAT TGTTGATACA
601
661 TATAACNIGC2' GTAAATCCTA AAAAATTCCT ATCATAATTA 2
12'AATATTAG. GTAATTUATT
TZACATCTCT
721 . TCCATGTGAA. AGATAGACTA ATTXTATATC CTTTACCTCC ~amar
TAAACAATCT ATTTTAATA.T CATT.AACTGG TATTTTATAA TATCCAGAAA GGTTTGAAGG
781
841 GGTTGATGGA .ATAAGTCZAT TAACATCGTT 4AGTAAATTA TT.AATATCAT GAATCTITAT
TATATTATAC CCATAAGTTA AATTTAISITT TACTTTCTCA TCATCTGACT TAGTTAGTTT
901
961 GT.AATAAGGT GTGTCTGAAA AAATTAAAAG GT.AATTCGTT GAATGAAGCT GTATTTGCTG
1021
TATCATTTTT ATCTAATTTT GGAGATTTAG• CAGTACTTAC TTCATTAGAA GAAGAAT'CTG
CCAGTTCCTG TCTATTACTG ATATTTCGTT TCATTATTAT ATGATTTATA
ITTTACT2TT
1081
•
1141
C612
.
TCAATTATAT ATACTCATT
= 146p* : •
•GACTAGTTAA .TCAATAAAAA. GAATTCTTCT TT.ATTCTATA
vÉ4
IfGA GQ•S• BPA
CTTAAAAAGT GCAAATÁAAT
ACAAAGG
- TTC TTGATGGGAG. CTGGGCTIAT'C CAGcantaaa
TGSQ. NQS GNT GST X NN'Y YM
•Q
1261
ACCGGCTCGC AGAACCAGTC TGGCSACAC2' GGLZIGCTIZAA TCAACAACTA CTACATGCAA
Q rQN SMD TQX GDNA ..T SG GS.N
1321
caGrAcmaa. ACTCCAT'GGA CACACAOTTG GGAGACAA.TG CCATCAG'TVG AGGCTCCAAC
N GS.-T D T T 3 TH•TTITT QNN DATE'
GAGGGCTCCA CGGACACAAC TTCAACACAC ACAACCAACA CTCOAAACAA TGACTGGTTC
1381
VP2
D•KK
8IC.DA SSA .r•TG LFGA ZLA
CACT'GCTCGC CGACAAGAAG
1441
TCGAAGCTCG CCAGTTCAGC rrrTAccwr CTGTTCGGTG
E.D•R.
XL T T
. 1214.G
11.TT
1501 ACAGAGGAAA CGACACTTCT TGAGGACCGC ATCCTCACCA CCCGCAACGG GCACACCA.CC
S T TQ S 3 V•GVT.HGYS TEE•DHV
1561 TCGACGACCC AATCGAGTGT GGGTGTCACA CACGGGTACT CCACAGAGGA GGACCACGTT
A G•P N
T •8 G
L E •T. R V .V Q A ••E R . •F Y• K•
1621 GCTGGGCCCA ACACATCGGG CCTGGAGACG CGAGTGGTGC AGGCAGAGAG ATTCTACAAA
K YLP DWT TDK A E G H LEK LEL
1681 AAGTACTTGT TTGACTáGAC AACGGACAAG GCATTTGGAC ACCTGGAAAA GCTGGAGCTC
P SDHHGV D'GH.• ',YDS YAY MEN
1741 CCGTCCGACC ACCACGGTGT C'ITTGGACAC TTGGTGGACT CGTACGCCTA TATGAGAAAT
SQFN GGC
G EDV E V S
VON
1801
GGCTGGGATG TTGAGGTGTC CGCTGTTGGC AACCAGTTCA ACGGCGGGTG CCTCCTGGTG
T R E K Y,Q.L T L P
AHVE ZW. K . .EFD
1861
GCCATGGTAC CTGAATGGAA GGAATTTGAC ACACGGGAGA AATACCAACT CACCCTTTTC
EQF. ISP R TN MTAH I TV PYL .
1921 CCGCACCAGT TTATTAGCCC CAGAACTAAC ATGACTGCCC ACATCACGGT CCCCTACCTT
YDQ YKK IIK
,GVNEt
TP WTLV VM•V
1981 ., GOTGTGAACA. GGTATGATCA GTACAAGAAG CATAAGCCCT GGACATTGGT TGTCATGGTC
N T S
AAQI KV Y ANI
✓ SPL TVN
2041
GTGTCGCCAC. TTACGOTCAA. CAACACTAGT GCGGCACAAA TC.AAGGTCT_A CGCC.AACATA
1201
VP3
2101
• AP TI VEV.AGE LPSK E G I FPV
GCTCCGACCT ATGTTCACGT GGCCGGTGAA CTCCCCTCGA AAGAGGGGAT TTTCCCGGTT •
Fig. 14A
22/50
2161
2221
ACAD GYG G
L V TTDP KTA DPA
GCATGTGOWACGGTTACGGAGGATTGGTGACGACIGACC CGAAGACAGC TGACCCTOCT
YGKV YNP PRT NYPGRFT
gz.z
TATGGCAAGGTGTACAACCC GCCSNIGGACTAACTACCCTG MCGCTTMW2CMACCTGTTG
.D.VAS ACP TrI CFDDGEp
rVT
2281
GACGTGGCCG AAGCGTGTCC CACTTTCCTC TGCTTTGACGACGGGA~GlaCGTCACC
2341
TRWD.DTR ZZA KFDL SLA'AK
ACGCGGACGGATGACICCCGACTTITGGCCAAGTTTGACCTTTCCCIWGCCGCAAAAMT
MSOT
2401
' 2521
Y'IS
GXA
Qr.TT
Q
Y
S
N.
GTZ
ATGTCCAACA Cii.VWVTG=AGGGATTGCT CAGTACTACA CACAGTACTC TGGCACCATC
'11MHF MFT GST DSK . A . R Y'M
VA.Y *
AATTTOCUTTCATSTTTACAGGTTCCACT GATTCAAAGG
ccannicALT .GarGaccmác 2461
• WPPG VET'PPD TPER'AANC.X.. H
ATCCCACCTGGGGTGGAGAC.ACCACCGGACACACCTGAAAGGGCTGCCCA.CTGCATTCZC
A
E
W
D
TO-L
N'SKFT'YS
2- ..pr.vsA
2581
GCTGAATGGGACACTGGACTAAACTCCAAA TTCACTTTCT•CAATCCCGTA CUWATCCGCC.
A D.YA•rT - A SDT ASTI N'VQ GWV
2641
GCGGATTACG CGTAPICAGC GTCTGACACG GCAGAAACAATCAACGTACA GGGATGGGTC
CIT'Q ITH•G
KA
END.T "LV.V' , S 'V S
2701
TGCJITCTACCAAATTACACA CGGGAAGGCT GMAATGACA CCTTGGTCGT GTCGOTTAGC
.
=>VP1
ike Kb FEL R LP
(2C7T . T AT
GCCGGC21AAGACTTTGAGTTGCGCCTCCCGATTGACCCCCGCCAGMAGACCACCOCTACC
2761 •
G E8A . D-P V*TTT VENY G.GÉ T.Q I
2821 GGGSAATCAG CAGACCCGGT CACCACCACC. GTGGAGAACT ACGGCGGTGA GACACAAATC
Q RREHTD .
/*G.F I M•DRF.V KIQW. .
2891 CAGAGAeGTC ACCACACGGA CATTGGTTTCATCATGGACA GATTPWTGAAGWWWW7C
L . 8PT * HVI
DLM
Q
A.
H
Q
NOL
. V .- G . A.
2941 TTGAGCCCAA CACATGTCAT TGACCTCATG CAGGCTCACC AACACGGTCT GGTGGGTGCC•
•
LRAAT. Y Y F S DLEI VVRE.-2. G
3001 TTGCTGCGTG CAGCCACGTA. CTACTTTTCT GACCTGGAKA TTGTTGTACG GCACGAAGGC
LNT•SN P .
N L T54 V P W.GAP ESAL .
3061 AATCTGACCT GGGTGCCCAA CGGCGCCCCT•GAATCAGCCC TGTTGAACAC'CAGCAACCCC
T. ÁTN KAP
. FTR LALPYYTA. P
.3121 ACTGCCTACAACAAGGCACC ATTCACGAGA CTCGCTCTCC CCTACACTGC GCCGCACCOT
✓ LATVYN GT' E KY.AV .
G.0.8
G.R R.
3181 GTGCTGGCAA CAGTGTACAACGGGACGAGTAAGTATGCTG TGGGTGGTTC AGGCAGAAGA.
G
DMG
SLA
ARV
VKQL
PA.S
ÉN.
Y
3241
GGCGACÁTGG GGTCTCTCGC GGCGCGAGTC GTGAAACAGC TTCCTGCTTC ATTTAACTAC
A. D . A . z H E LLvE Iã R it• A. E I.
G A x ic
3301 GGTGCAATCA.AGGCCGACGC CATCCACGAA CTTCTCGTGC GCATGAAACG GGCCGAGCTC
Y C P R PLLjk IS VESQ DRS KQK.
3361 TACTGCCCCA GACCGCTGTT GGCRATAGAG GTGTCTTCGCAAGAUAGGCA. CAAGCAAAAG
A24 2A
/ IAP A.KQ
LLN FDLZ K.LA .GDV
3421 ATCATTGCAC CAGCAAAWAdéT
rivaaar TTTGACCMWC WCAAGTTGGC CGGAGACGTT.
A24 2B' *
S SNP
GPF F . FA
DVRE
NF• 'S
KLV
3481
GAGTCCAACC CCCTGGCCATT CTTCTTTGCT GACGTTAGGT CAAACTTTTC AAAGTTGGTA
D TIN . Q . MWEDM STKR GPD
PNR,
GACACAA.TCAACCAGATGCA GGAGGACATG TCCACAAAAC ACGGGCCCGACTTCAACCGG.
L VSA FEB L.AT GVKA IRT GLD
3601 TTGGTGTCCG CATTTGAGGA ATTGGCCACT GGAGTTAAAG CMATCAGGAC CGGTCTCGAC
LLSR LEC MAA
E AKP WYK LIK
.3541.
3661
.
GAGGCCAAAC CCTGGTACAA GCTUATCAAA CTCCTAAGCC GCCTGTCGTG CATGGCCGCT
Fig. 14B
23/50
IA24/Al2 Junção
✓ AAR SKD PVL V A . I14 L A'D T G L
3721 GTGGCAGC.AC GGTCCAAGGA CCCAGTCCTT GTGGCCATCA. TGCTGGCCGA CACCGGTP---"A
Al2 3.0
E EQ12.1, Z K VILA K Z.PQ
P Y A
Q E G
3781 (ICGTCAG.A GitCCTCTGAA AGTGAGAGcT AAGCTCCCAC AGCAGGAAGG .ACCITACGCT •
.• GP L E SQK P1K VKAK APV VKE
GGCCCGTTGG AG2IGACAGAA ACCGCTGAAA GTGAAAGCAA AAGCCCCGGT CGTCAAGGAA
G P YE
GP V ICKP• Vali:C VI(
A
KEY,
GGACCTTACG AGGGACCGGT GAAGAAGCCT GTCGC1TT GA AAGTGAAAGC TAAGAACTTG
3901
Al2 3C
'T V TE S GA •PP T DLQK 14 VM GNT
3961 ANSIGTCACTG .AGAGTGGTGC CCCACCGACC GACTTGCAAA AGATGGTCAT GGGCAACACA .
E P•VE L IL , DGK TVA•I CCA TGV
4021 AAGCCTGTMG 2kGCTCATCCT TGACGGGAAG ACAGTAGCCA TCTGTTGTGC TACTGGAGTG
YGT.A YLV P-RR LPAR. K YD KIM
4081 TTTGGCACTG cTTACCTCGT GCCTCGTCAT. CTTTTCGCAG AGAAGTATGA CAAGATCATG
L DGRAMT D 8 D YRVE' .RFE•IKV
'4141 CTGGATGGCA GA.GCCATGAC AGACAGTGAC TACAGAGTGT TTGAGTTTGA GATTAAAGTA
K GQD MLS D . A.A L. M V L H R G 14•RV•
4201 AAAGGACAGG AC.ATGCTCTC AGACGCTGCG CTCATGGTGC TCCACCGTGG GAACCGCGTG
RDI T •Kli .P R D T Alt•MK•KGT P•V V
4261 AGAGATATCA CGAAACACTT TCGTGATACA GCAAGAATGA AGAAAGGCAC CCCCGTCGTC
G V V N 14.A•D V•GR LIPS GE A L T
4321 GOTOTGGTCA .ACAACGCCGA CGTTGGGAGA CTGATTTTCT CTGGTGAGGC CCTCACCTAC
K•D/ V VC•14 • D G D
THP•G•.1..PA. YK•A•
4381 AAGGATATTG TAGTGTGCAT GGACGGAGAC ACC.A.
TGCCTÓ GCCTCTTTGC C'TAC.AAAGCC
ATK A GY C G•G"A V•LAK D G A
D•T E
T.ACTG TGGAGG.AGCC GTTCTCGCCA AGGACGGGGC C.GACACTTTC
4441 GCCACCAAGG CAGGC
GVGY CSC VR.R
•
VGT
14 SÃ
G G N
4501 ATCGTCGGCA, CTCACTCCGC AGGAGGCAAT GGAGTTGGAT ACTGCTCATG CGTTTCCAGG
E **
6 . 14 L.L REIK AR V•DPE P Q
T GACCCTGAAC CACAACACGA GTAGTAATTT
4561 TCCATGCTTC. TCAGAATGAA GGCACACGT
4621 TTCTGCAGCC CGGGTTTTTA T.AGCTAATTA GTCATTTTTT CGTAAGTAAG TATTTTTATT
4681
T.AATACTTVZ TATTGT.ACTT ATGTTAAATA MAACTGATGA TAACAAAATC CATTATGTAT
4741
TATT=AAC TGTAATTTCT TTAGCGTAGT TAGATGTCCA ATCTCTCTCA AATACATCGG
4801 C2'A.TCTTTTT AGTGAGATTT TGATCTATGC AGTTGAAACT TATGAACGCG TGATGATVIA
Aasurd.AAcc GTCCAAATTT GCAGTCATTA. TATGAGCGTA l'CTATTATCT ACTATCATCA•
4861 •
4921 TCITTGAG2'2' ATTAATATCA TCTAerwaAG •AATTGATAGG AAATATGAAT ACCITTGTAG
4981
TAATATCTA2' ACTATC221C.A CCT.AACT'CAT TAAGACTTTT GATAG
. C6Z
• 3841
Fig. 14C
24/50
EcoRI => I3Lp
11423.CXL 5' GAATTCTGAGATAAAGTGAAAATATAT 3'
VP4 •
I3Lp.
•
M G. A
ACAATTATTTAGGTTTAA.TCATGGGAGCTG . •
11424 . CXL 3' TGTTAATAAATCCAAATTAGTACCCTCGAC . 5"
Fig. 15A
I3Lp
M G A .G Q S
11425.CXL'5' AGGTTTAATCATGGGAGCTGGGCAATCCA
VP2
CLLVAMV P
TGCCTCCTGGTGGCCATGGTACC
11407.= 3' ACGGAGGACCACCGGTACCATGG 5'
Epn I
Fig. 15B
3'
25/50
AmpR
Ndel (185) Xbal (405)
Al2 3C
EcoRV (758)
AmpR
C5 Xmal (434)
Kpnl ¡585 )
gC(-TIVI)
I3Lp
Xbal (1853).
2)111242)
6033 bp
Nott
(7578)
C5R
10230 bp
42Kp
EcoR1(3798)
pnl (2948)
9B(- TM)
Amplificação
Amplificação
de PCR VP4VP2
VP3
PCR com .11407.CXLKpn i (3158)Ndl (2623)
com
e 11424.CXL e 11425.CXL
•
i i42
H6p
g wriv0
EcoRI EcoRV
(5243)
(4632)
tittn530)
A24 2A
VP1
pUC FMDV P1+3C
75bp131.
pC5 HO EHV-1 aEl (-TM) 42Kp •
EHV-1 pl) (-TM) 13Lp EHV-1 aC (-TM)
.*"...;48bp 5'..FP.113V
Amplificação de PCR com
11407.CXL/711423.CXL
703bp 13Lp 5*-FM13V
c0104)
VP4
VOnl ( (815)
823)
EcoRI
amHi (554)
Kpnl (870)
AmpR
EcoR Iffpn
EcoRt (414)
I3Lp
pCR2.1 13Lp 5=FMDV
Kpnl I
h
3857•BamHI (527)
P4
VP2
6R
AmpR
Amp
EcoRI (1182)
Kpnl (1115)
P4
6086 bp
VP3
VP2
Kpnl (1830)
Xbal (3860)
dei (2359)
VP3
P1
Al2 3C
VP1 C6L
A24 2A
A24 2A
EcoRV (3511)
Xmal 4589
...........
..
Xmal (2735)
Xmal (3450)
Alz 3C
A24 28
A24
28
Al2
3B
Xhol
(3023)
EcoRV (4226
EcoR I/Ndel
A 2 38 Xhol (3738)
pUC 13Lp FMDV P1+3C
pC6 FMDV P1+3C
Kpnl (7910) Ir BamFil (527)
C6%coRI (1182)
AmpR
13Lp
VP4
VP2
•
Kpnl (1883)
Notl (5040)
C6L
Xmal (4642)
Psil (4640)
VP3
VP1
A24 2A
Al2 38
Fig. 16 •
A
)CT1129503)
EcoRV(4279)
Xhol (3791)
pC6 13Lp FMDV P1+3C
26/50
1 TTCATAAATA CAAGTTTGAT TAAACTTAAG TTGTTCTAAA GTTCTTTCCT
commAsunur
AGAAC21AAGT ATTTCTIVTA CATCCTTACTATTTATTGCA
~maca GCCTATCACG
TATCCTATTT TTAGTATTGG TAGAACGTTT TAGTTCTAAA GTTAAAATAT
gar.agmmaar
TGGCATATTG CTMATTCCTT GCATAGTTGA GTCTGTAGAT CGTTTCAGTA TATCACTGAT
TAATGTACMA CTGTTATGATGAAATATAGA ATCGAMATTG
GATTTTAAAT GTTTTGTTAT
ACTAAGTCTA GATTTTAAAT CTTCTAGTAA TATGCTATTT AATATAAAAG
crmmaogrr
WTTGWATACA TTTCUTTCCA TATTAGTAGC TACTACTAAA
rassmrcwr CTTTCATATC
TMGMAGATAA.GATAGACTAT CTTTATCTTTATTAGTAGAA AATACTTCTG GCCATACATC •
"yuan' TTTGl iTGTTG TTAGATATAA TATTAAATAT CTAGAGGATC
comarrrc
TGGTAAAATG TTTATAGAGTAAAATGATCT GGCMATTAAACATAGGCCAG TWACCATAGA
ATGCTGCTTC CCGTTACAGT OTTT2SICCATAACCATAGAT CMGCCMGMAT TGTTGATACA
661 TATAACAGCT GMAAATCCTA AAAAATTCCTATCATAATTA
TTAkTATTAG GTAATTCATT.
61
121
'181
241
301
361
421
481
541
601
-TCCATGTGAA AGATAGACTA. ArETTATATC CITTACCTCC AAATAATTAT TTACATCTCT
721
781 TAAACAATCTATTTTAATAT•CATACTGGrAwzawAraa TATCCAGAAAGGTTTGAAGG
841
GG2TGATGGA.ATAAGICTATTAACATCGTTAAGTAAATTA
MATAM:1T GAATCTTMAT
901
MATATTATAC CCATAAGTTA AATITATATT TACTrICIVA TCATCTGACT TAGTTAGTTT
961 GTAATAAGGT GTGTCTGAAA AAATTAAAAG GTAATTCGTT GAATGAAGCT GWATTTGCTG •
1021
TATCATrfrrArCrAATTZT GGAGATTTAG CAGTACTSUC TTCATZAGAAGAAGAATCTG
.
CCAGTTCCTG TCTATTACTG ATATTTCGTT TCATTATTAT'ATGATTTATA TITTACTWTT
1081
•
C6N 4= -
=> I3Lp
GACTAGTTAA TCAATAAAAA GAATTCTGAG ATAAAGTGAA
VP4
•
A. G . Q .
•
bl"G
1201 AATATATATC ATTATATTAC AAAGTACAAT TATTTAGGTT TAATCATGGGrAGCTGGGCAA
5 . 912 .21 T G S Q N Q SGNIT G S I 1NN"
1261 TCCAGCCCAG CAACCGGCTC GCAGAACCAG WCTGGCAACA CTGGCAGC.A.T..4ATCAACILAC
QYQ
NSI1/4T . D - TQZ• G:DM AIS
TY24Q
1141 . TCAATTATATATACMATTT
1321
1301
1441
MACTACRTGC
GGSN
AACAGTACCA
SGS
GAACTCCATG GACACACAGT TGGGAGACAA TGCCATCAGT
TDT TSTif .TT.N
GGAGGCTCCA ACGAGGGCTC CACGGACACA ACTTCAACAC ACACAACCAA CACTCAAAAC
SK.L . ASS
A.FrG
N D W F
AATGACTGGT'TCTCGAAGCT CGCCAGTTCA GCTTTMACCG GTCTGTOCGG TGCACTGCMC
=? VP2
ADICK'.TEE TTL
LEDR. 'ILT TRil
•
:1501 GCCGACAAGA AGACAGAGGA AACGACACTT.CTTGAGGACC GCATCCTCAC CACCCGCAAC
G H T T. .8 T .T
V G V T. H . G .Y S T E
Q S 8
1561 GGGCACACCA CCTCGACGAC CCAATCGAGT GTGGGTGTCA CACACGGGTA CTCCACAGAG
2.DHV A G P NTS GL.ET . 11V.V - Q'AE.
GCAGGCAGAG
1621 GAGGACCACG TTGCTGGGCC CAACACATCG GGCCTGGAGA. CGCGAGTGGT
AFG
HL- E
K F - YK KYL PDN TTDK
AGATTCTACAAAAAGTACTT GTTTGACTGG ACAACGGACA AGGCATTTGG ACACCTGGAA
1681
LvD
SY A K DEL PSD H R G V'FGH
1741 AAGCTGGAGC TCCCGTCCGA CCACCACGGT GTCTTTGGAC ACTTGGTGGA CTCGTACGCC
GWD VEV SAVG NQY-KG" G
YM RT
TGMTGAGGING TCCGCTGTTG GCAACCAGTT CAACGGCGGG
• L801
TATAIGAGAAATGGCTGGGA
CLLV'AMV PEW KEPD TREKY Q
GAAATACCAA
L861. TGCCTCCTGG TGGCCATGGT ACCTGAATGGAAGGAATTTG ACACACGGGA
rzs PRTNSTA - 8IT
.MTM.F PHQ
L921 CTCACCCTTT TCCCGCACCA GTTTATTAGC CCCAGAACTA ACATGACTGC CCACATCACG
QYKK HK.P W T L
✓ P Y L OVN R Y D
GTCCCCTACC TTGGTGTGAA CAGGTATGAT CAGTACAAGA AGCATAAGCC.CTGGACATTG
1981
✓ VMV V S P L-TV NNT'S AAQ IKV
!041 GTTGTCATGG TCGTGTCGCC ACTMACGOTC.AACAACACTA GTGCGGCACAAATCAAGGTC
Fig. 17A
•
27/50
VP3=,
YANT APT-YVH . VA'OE LP'S.KEG
2101 TACGCCAACA TAGCTCCGAC CTATGTTCAC GTGGCCGGTG AACTCCCCTC GAAAGAGGGG
TFPV ACA DGY GG.GV TTD PK T
ATTTTOCCGG TTGCATGMGC GGACGGTTAC GGAGGATTGG TGACGACAGA CCCGAAGACA
2161
ADPA'YGX VYM PPRT N Y P
Gstr
2221
2281
2341
2401
2461
2521
, 2581
GCTGACCCTG CTTAVGGCAA GGTGTACAAC CCGCCTAGGA CTAACTACCC TGGGCGCTTC
TMLI DVA Z A
. 0 PTPZ CPD DG K
ACCAACCTGT TGGACGTGGC CGAAGCGTGT
cocam= TCTGCTTTGA CGACGGGAAA
PYVT'TRT DDr RIZ. A
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xrD
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TCAGGGATTG CTCAGVACMA CACACAGTAC
SGTI•NZH F'MY'TGST DOR'
ARY
TCTGGCACCA TCAATTTGCA TTTCATGTTTACAGGTTCCA CTGATTCAAA GGCCCGATAC
'MVAY TPP G V E TPPD TPZ RAA
ATUGTGOCCTACATCCCACC TGGGGTGGAG ACACCACCGGACACACCTGA AAGGGCTGCC •
HCXH AZW DTG.LMSR
rxr sx 10 .
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GGACACTGGA CTAAACTCCA AATTCACTrT mamam=
A D Y
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xacórAmccG CCGCGGATTA.CGCGrACACA•GCGTCTGACA CGGCAGAAACAATCAAMTA
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- TSV
CAGGGAMSGO xemsuarcXa CCAAATTACA CACGGGAAGG CTGAAAATGA CACCTTOGTC
Drs IRZP X.D P'RQQ
✓ SVS A G K
GTGTCGGTMA GCGCCGGCAA AGACTTTGAG TTGCGCCTCC CGATVC~C CCGCCAGCAG
Y V S A
2641
2701
2761
•
VP1 '
T T A T G: E' S A .D P V T T T 'V E N Y G .0
2821 ACCACCGCTA CCGGGGAATC AGCAGACCCG GICACCACCA'CCOTGGAGAA CTACGGCGGT
G * P IMD
Tury
QRR HHT.D
2881 GAGACACAAATCCAGAGACG TCACCACACG GACATTGGTT TCATCATGGA'CAGATTTGTG
ICIQS L.SP THV. IDL M Q'AH QHG
.2941 AAGATCCAAA GCTTGAGCCC AACACATGTC ATTGACCTCA TWAGGCTCACCAACACGGT .
L ,VGA LLR* P,AT Y7.28D.I4E IV. V
3001 ' CTGGTGGGTG.CCTTGCTGCG TGCAGCCACG TACTACTITT CTGACCTGGA. AATTGTTGTA
R REG NLTMV.P NGAP ESA LLN
3061 CGGCACGAAG GCAATCTGAC CTGGGTGCCC . AACGGCGCCC CTGAATCAGC CCTGTTGAAC
T .8 •NP TAY.NKA PFT.R LAL PYT
3121 . ACCAGCAACC CCACTGCCTA CAACAAGGCA.CCATTCACGA-GACTCGCTCT CCCCTACACT.
YVY NGT.S K-YA.VGG
APHR
GCGCCGCACC GTGTGCTGGC AACAGTGTAC AACGGGACGA GTAAGTATGC TGTGGGTGGT
3181
S G R R
AAR;V VX - Q L P A
GDM G.SL
3241 TCAGGCAGAAGAGGCGACAT GGGGTCTCTC GCGGCGCGAG TCGTGAAACA0CTTCCTGCT
S PNY GAI - KAD AIHE I* 18.V R*MK
3301 TCATTTAACT ACGGTGCAAT CAAGGCCGACGCCATCCACGAACTTCTCGT GCGCATGAAA
3' ' 'QD. R
RAEL*TCP RPL*L AZE
3361 • CGGGCCGAGC TCTACTGCCC
CAGACCGCTG TTGOCAA274AGGTGTCTTC GCAAGACAGG •
A24 2A
FDL ZN I
CACAAGCAAAAGATCATTGCACCAGCAAAGCAGCTTcTGAATTTTGACCTGCTCAAGTTG
H 'K Q K
3421
IIA•PA. *K
QIIN
=> A24 28
rior . 15, .D'VR 'S M F .
TTCTTCTTTG CTGACGTTAG GTCAAACTTT
SKLV DTI NQM . QEDM STK HGP
TCAAAGTTGG TAGACACAAT
CAACCAGATG CAGGAGGACA TGTCCACAAA ACACGGGCCC
i.GDV ,
3481
3541
E.S•N
POP
GCCGGAGACG TTGAGTCCAA CCCCGGGCCA
Fig. 17B
.
28/50
DFNR LVS AFE E L A T G V K
3601 GACTTCAACC GGTTGGTGTC CGCATTTGAG GAATTGOCCA CTGGAGTTAA AGCTATCAGG
TGLD EAK. PWY KL I 1C L L S
Rn.s
3661 ACCGGTCTCG ACGAGGCCAA .ACCCTGGTAC AAGCTTATCA .AACTCCuAAG CCGCCTGTCG
CMAA VAA
REX D P V L VAT. ML A
3722. • TGCATGGCCG CTGTGGCAGC ACGGTCCAAG GACCCAGTCC TTGTGGCCAT CATOCTGGCC
N24/Al2 junctioA
Al2 3B
R Q R P
1.
K V R A 1C.LP Q Q E
3781 GACACCGOTrC TCGAG1CGTCA GAGAcc:TcsrG AAAGTGAGAG .CTAAGCTCCC ACAGCAGGAA
D T G L
E
.GP Y A GPI, ERQ K P L K VK.A KAP
3841 • GGACCTTACG CTGGCCCGTT GGAGAGACAG AAACCGCTGA .AAGTGAAAGC AAAAGCCCCG
VVNE GPI' E G P V-KKP V AL "KV••K
GTCGTCAAGG AAGGACCTTA CGAGGGACCG GTGAAGAAGC CTGTCGC2'2IT GAAAGTGAAA
3901
Al2 3C
AK.111 IV T
ESG
AP PT D.LQ X , MV.
3961
GCTAAGAACT TGATAGTCAC TGAGAGTGGT GCCCCACCGA'
CCGACTTGCA AAA.GATGGTC
141 G N T •
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. T.VA ICC .
4021 ATGGGCAACA CAAAGCCTGT TGAGCTCATC CTTGACGGGA AGACAGTAGC CATCTGTTGT.
A T GV• EGT AYL VP R11 Lr A E'KY
4081 GCTACTGGAG TGTTTGGCAC TGCTTACCTC GTGCCTCGTC .ATCTTTTCGC AGAGAAGTAT •
D K I M L D G RAM T D SD Y.R V• FE E'
4141 GACAAGATCA TGCTGGATGG CAGAGCCATG ACAGACAGTO ACTACAGAGT GTTT1GAGTTT.
E I K V•KGQ .
DHL.SD AA. L•MV LER ,
4201 GAGATAAG TAAAAGGACA GGACATGCTC TCAGA.CGCTG CGCTCATGGT GCTCCACCGT •
G.NR
V RD I• TKE FRD T AR .M.•K K G •
4261. GGGAACCGCG TGAGAGATAT CACGAAACAC TTTCGTGATA CAGCAAGAAT GAAGAAAGGC
T.P - V.V G V V N./TAD V G•E'L Ti*
S G. E
4321 ACCCCCGTCG TCGGTGTGGT CAACAACGCC GACGTTGGGA GACTGATTTT CTCTGGTGAG
A•L TY KDI- VVC MDGD 'THE, GL•7•
4381 . GCCCTCACCT ACAA.GGATAT TGTAGTGTGC ATGGACGGAG ACACCATGCC TGGCCTCTTT
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4442. GCCTACAAAG CCGCC.ACCAA GGCA.GGCTAC TGTGGAGGAG CCGTTCTCGC CAAGGACGGG
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4501 GCCGACACTT TCATCGTCGG CACTCACTCC GCAGGAGGCA ATGGAGTTGG
ATACTGCTCA.
C V
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KA.EV DP E•P-QK
4561 TGCGTTTCCA GGTCCATGCT TCTCAGAATG AAGGCACACG TTGACCCTGA ACCACAACAC
•
• E*
4621
4682.
GAGTAGTAAT TTTTCTGCAG CCCGGGTTTT TATAGCTAAT TAGTCATr1T TTCGTAAGTA •
AGTATTTZTA
TTTATTGTAC TTATOTTAAA TATAACTGAT GATAACAAAA
4741 TCCATTATGT ATTATTTATÁ ACTGTAATTT CTTTAGCGT.A GTTAGATGTC CAATCTCTCT
4801
CAAATACATC GGCTATCTTT TTAGTGAGAT TTTGATC2AT GCAGTTGAAA CTTATGAACG
4861.
CGTGATGATT AAAATGTGA.A. CCGTCCAAAT TTGC.AGTCAT TATATGAGC.G TATCTATTAT
AGAATTGATA GGAAATATGA
4921
CMACTATCAT CATCTITGAG TTA.TVIATAT C.ATCTACTIT
ATACCTTTGT AGTAATATCT ATACZATCTA. CACCTAACTC ATT.AAGACTfi TTGATAG
4981
~mem
C6R
Fig.17C
29/50
Ecoa I=> 42Kp
11426.CXL 5' GLATTCTCAAAATTGRAAATATAT 3'
VP4
, -42Kp
•
3.1* G A
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11427.= 3' TATATATTAATGTTATAMTTTACCCTCGAC 5'
Fig. 18A
VP4
42RpMGAGQ
g
11428:CEL. 5' CAATATAAAATGGGAGCTOGGCAATCCA
y202
cLpvAm.vr
TGCCTCCTGGTGGCCATGGTACC
11407.CXL 3' ACGGAGGACCACCGGTACCATGG 5'
Epn I •
Fig. 1813
3'
30/50
AmpR
C5L
Xmal (434)
Kpng (585)
9C(TM)
Ndet (185) Xbat (405)
Al2 3C
E
EcoRV
(758)
AmpR
241 (1853)
NotI
(7578)
1 02 30 bn
C5R
191242)
Kpnl
2948)
gB(-131)
A24 2A
VPI
Amplificação
de PCR
42157
6p
g Lt(-TIVI
EcoRi (5243) EcoRV
(4632)
saffi 530)
EcoR1
. (3798)
AmplifiCação
e
VI;3
VP4
com
l_ni Ndel2623
CXL VP mp
(
)
e 11427.CXL com -11407.e 11428.CXL
(3158)
..
PCS 116P ENV-1 a91'-7M142Kp
EM1-1 00 (-774)13Lp ENV-1 0C (-774)
pUC FMDV"Fic
75bp I3Lp
648bp 5'-FMDV
i
i
.
Amplificação de PCR com
11407.CX1/11426.CXL .
676bp 42Kp 5'-FMDV
Kpnl (39)
BamHI (47)
EcoR t/78)
Eco /V(90764)
42
VP4
EcoR I/Kpn
EcoRl (772)
Moi (805)
AmpR
KanR
Kpnl
AmpR
EcoR1 (208)
pCR2.1 42Kp 51 FMCW
(78")BamHI (527)
GER
coRI (1182)
P4
VP2
Kpnl (1830)
Ndel (2359)
-
AmpR
anso hn
Ndel (3849)
%1:1
VP2
Kpnl (882)
Ndel
(1411)
VP3
A2X9i
---------------- Al2 3C
Anal (2502)
VE3
C6L
A24
A24 28
EcoRV (3278)
Xmal f4589
Xmall3450)
Al2 3C
Al2 313Xh°1 (2790)
A24 2
Kpnl (1883)
EcoRV (4226
BamHl (527) pUC 42Kp FMDV
--1A 2 3B Xhol (3738)
COR
pC6 FMDV P1+3C
EcoRI (1182)
2Kp
P4
•
VP2
Kpnl (1856)
Nati (5013)
Fig. 19
C6L
VP1
Xmai (4615)
A24 RA
Al2 3C
Xmal (3476)
EcoRV (4252) A24 2B
Xho1/3764)
Al2
pC6 42Kp FMDV P1+3C
31/50
TTGTTC25921A. GTTCTTTCCT CCGAAGGZAT
TTCATAAATA ÇAAGTTTGAT TAAACTTAAG
1
63.
AGAACAAAGT ATTTCTTCT.A CATCCTTACT
ATTTA2TSCA GCTTMAACA GCCTATCACG
TATCCTATTT TTAGTATTGG TAGAACG2V1 1 TAGTTCMAAA GTTAAAATAT TAGACATAAT
121.
TGGCAZILTTG CT2SIITTCCTT
181.
GC.21223GTTGA GTCTGTAGAT CGTTIVAGTA TATOICTGAT
TAATGTACTA CTGTTATGAT GAAAMATAGA ATCGATATTG GCATTTAACT
GTTTTGTMAT
241
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301
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361
TTGTAGATAA GATAGACTAT CTTTATC2TT ATTAGTAGAA AATACTTCTG GCCATACATC
421
481
GTTAAATTTT TTTGTTGTTG .TTAGATATAA TATTAAATAT CTAGAGGATC CTATTATTTG
541
TGG2'AAAATG TTTATWAGT AAAATGATCT GGCTATTAAA CATAGGCCAG TTACCATAGA •
ATGCTGCTTC CCGTTACAGT
GrEurTACCAT AACCA-221GA,T CTGCCTGMT TGTTGATACA
601
TATAACAGCT GTAAATCCTA AAAAA.TTCCT ATC21251A2'TA T22kAMATTAG GTAATTCATT
661
721 • TCCATGTGAA. AG.ATAOACTA ATTTZATATC C2TTACCTCC AAATAATTAT
781
TAAãACUIATCT ATTTTAATAT
CATTAACTGG TATTTTATAA TATCCAGAAA GG2TTGWIGG
641
GGT2'GATGGA A2'AAGTCTAT TAACATCGTT AAGTAAATTA
TTAATATCAT allATCTITTAT
TATATTATAC CCATAAGTTA AATTMATATT TACTTTCTCA TCATCTGACT TAGTTAGTTT
901
961 GTAATAAGGT GTGTCTGAAA AAAT221AAAG GTAATTCGTT GAATGAAGCT GTATTTGCTG
1023.
TATCATTTTT ATCTAATT2'T GGAGATTTAG .CAGTACT2'.AC TTCATTAGAA GAAGAATCTG
1081
CCAGTTCCTG TC1212'TACTG .A.TATTTCGTT TCATTATZAT .ATGATTTAT4 TTTTACTTTT
•
C611
42Kp •
•
•
TCAATTATAT ATAC2'r..2kTTT • GACTAGTTAA •TCAA.TAAAAA GAA.TTCTCAA .AATTGAAAAT
1141
VP 4
T. G. .S
.
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1201 A.TA.TAATTAC AATATAAAAT OGGAGCTGGG CAATCCAGCC Cs4GCAACCGG 'CTCGCAGAAC
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. 24 QQY QNS
CAGTCTGGCA ACAC2'GGCAG
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1261
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LOD.N•AI GGGS
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241,• 2' Q •
ATGGAC4CAC AGTTGGGAGA CAATOCCATC AGTGGAGGCT CCAACGAGGG CTCCACGGAC
1321
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AT TQ.14•11 D W 2ë S 1< Z A S
7'
' 1381
ACAACTTCAA CACACACAAC CAACACTCAA AACAATGACT GGTTCTCGAA GCTCGCCAGT
VP 2
G .L
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S. A F 2"
1441
TCAGCTTTTA CCGGTCTGTT CGGTGCACTG
CTCGCCGACA AGAAGACAGA GGAAACGACA
L L E D R I L T T • • R N G 11 T T S .T T. Q 5
1501 CTTCTTGAGG ACCGCATCCT CACCACCCGC AACGGGCACA CCACCTCGAC GACCCAATCG
T11 G 2' S T.EEDE•VA.G•P.N T•
5•VGV
1561
AGTGTGGGTG TCACACACGG GTACTCCACA GAGGAGGACC ACGTTGCTGG GCCCAACACA.
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1621 TCGGGCCTGG AGACGCGAGT GGTGCAGGCA • GAGAGATTCT ACAAAAAGTA CTTGTTTGAC
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1681 TGGACAACGG ACAAGGCATT TGGACACCTG GAAAAGCTGG AGCTCCCGTC CGACCACCAC
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1741 GGTGTCTTTG GACACTTGGT GGACTCGTAC GCCTATATGA GAAATGGCTG GGATGTTGAG
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1921 AGCCCCAGAA CTAACATGAC TGCCCACATC ACGGTCCCCT ACCTTGGTGT GAACAGGTAT
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Fig. 20A
32/50
VP3
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2101
YGGZ VTT'DPIC TADP
2161 TACGGAGGAT TGGTGACGAC AGACCCGAAG ACAGCTGACC CTGCTTATGG CAAGGTGTAC
NPPR TNY . PGR
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. TTCACCAACC TGTTGGACGT GGCCGAAGCG
2221
1,CY
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TGTCCCACTT Tcmcmcm TGACGACGGGAAACC,GTACG TCACCACGCG GACGGATGAC
2281
TRZZ AKF Dr.S Z'AAK
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1NL . RFM
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2401
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•
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2461
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2521
2581
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3181 .TACAACGGGA CGAGTAAGTATGCTGTGOGT GGTTCAGGCA GAAGAGGCGA CATGGGGTCT
2761
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3241 CTCGCGGCGC GAGTCGTGAAACAGCTTCCT GCTTCATTTA.ACTACGGTGC AATCAAGGCC.
D A111 ELL-VR14 K R A E LYC P-R
3301 GACGCCATCC ACGAACTTCT CGTGCGCATG AAACGGGCCG AGCTCTACTG CCCCAGACCG
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•L L A
CTGTMGWAA TAGAGGTGTC TTCGCAAGAC AGGCACAAGC AAAAGATCAT TGCACCAGCA
3361
.= A24 2A
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1ÇQZZ
3421
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3541
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Fig. 20B
33/50
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L.ER QRP
3721' AAGGACCCAG TCCTTGTGGC CATCATGCTG GCCGACACCG GlICTCGAGCG TCAGAGACCT
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- AGP 1.SR
3601
. 3781 CTGAAAGTGA GAGCTAAGCT . CCCACAGUAG GAAGGACCTTACGCTGGCCC GTTGGAGAGA
Y•2 G
Q XPL .KVH.A1CA P VV•K EGP
3841 CAGAAACCGC TGAAWTGAA AGCAAAAGCC CCGGTCGTCA AGGAAGGACC TTACGAGGGA
3C
•3901.
PVA
LEVRA . EN L'IV
S
- TCGCTTTGAAAGTGAAAGCTAAGAACTTGAMAGTCACTGAGAGT
CáGGTGAAGAAÓCCTG
.GAPP TDLQEM•VMGN T K P VEZ,
GGTGCCCCAC CGACCGACTT GCAAAAGATG GTCATGGGCA ACACAAAGCC , TGTTGAGCTC
ILDG . KTV AI.C:CATG
V.FG
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4021 AMCCTTGACG GGAAGACAGT AGCCATCTGTMGTGCTACTG GAGTGTTTGG CACTGCTTAC
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4081
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4141
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4201 CTCTCAGACG CTGCGCTCAT GGTGCTCCAC CGTOGGAACC GCGTGAGWA TATCACGAAA
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• 4261: CACTTMCGTG ATACAGCAAG AATGAAGAAA GGCACCCCCG TCGTCGGTGT GGTCAACAAC
A .DVG.RMI FSG.EATJT YKD - I. V
• 4321 GCÇGAÇGTTG GGAGACTGAT TTTCTCTGGT GAGGCCCTCACCTACAAGGA TATTGTAGTG
D T M. P•GS•FAYK AAM K A G
CMD , G
4381 TGCATGGACG GAGACACCAT GCCTGGCCTC TTTGCCTACA AAGCCGCCACCAAGGCAGGC
Y CGG AVL AKD GADT FIV GTH
4441 TACTGTGGAG -GAGCCGTTCT CGCCAAGGAC GGGGCCGACA CTTTCATCGT CGGCACTCAC
S A G G DT.OV G Y C S.CVS
R' 6.•M L L. R
4501
TCCGCAGGAG GCAATGGAGT TGGATACTGC
TCATGCGTTT CCAGGTCCAT GCTTCTCAGA
VDP EPHQ112*
14KA . 11
4561 ATGAAGGCAC ACGTMGACCC TGAACCAÇAA CACGAGTAGT AAMTTTTCTG CAGCCCGGGT
4621
TTTTATAGCT AATTAGTCAT . TTTTTCGTAA GTAAGMATTTTTATTMAATA crnaTATrG
TAC2TATGTTAAATATAACTGATGATAACAAAATCCATTATGTATTATTTATAACTGTAA
4681
GTCCAATCTC TCTCALWACATCGGCTATC TTTTTAGTGA
. 4741 TTTCTTTAGC GTAGTTAGAT
4801
GATTTTGATC TATGCAGTTG AAACTTATGA ACGCGTGATG ATTAAAATGT GAACCGTCCA .
4861
AmInmum.carmaxamA Gcomocrar TATCTACTAT CATCATCTTT GAGTMATTAA
4921
TATCATCMAC.TTMAGAATTGATAGGAAATA TGAATACCTT
TGTAGTAATA TCZATACTAT
4981
CTACACCTAA CTCATMAAGA CTTTTGATAG .
. 3961
.
C6L 4=
Fig. 20C
34/50
7.5Kp
VP9
EcoR I
MGA . GQS SP
11357. CXL 5' GAATTCAAAAGTAGAAAATATATTCTAATTTATTGCACGGATGGGAGCTGGGC4IATCCAGCCCA
.
.VP3
.
LAAICHMS
CTTGCCGCAAAACATATGTCCA
11358.CXL 3' GAACGGCGTTTTGTATACAGGT
Nde I
Fig. 21A
7.5Kp
= VP4
MGAGQSS
GGAGCTGGeE TCCA
11429. SM 5' Cl TTTATTGC2CG
11430.HM 3' AG TAAATAACGTGCC CCTÇGAC we TAGGTC 5'
Fig. 21B
7.5Kp
=> VP4
11445.HM 5' GAAAATATATTC M•TTTATTGCACGGA
11446.HM 3' CTTTTATATAA •UTAAATAACGTGCCT 5'
Fig. 21C
BamH1(253)
Ndel (185) bal (405)
cnR1 (284)
Kpnl
Al2 3C
245)
EcoR1 (296)
Mutagênese
Amp
EcoRV (758)
PCR error
local
n isana.oHm
Rbeee.skid)ireccoironiaid
PCR arnplify
12 3B
Xhol (1242) with 11357.CXL
Pit ti error
e 11430.11M
A24 2B
and 11358.4t.
VP2
Xmal (1
pn1(969)
A24 2A630)
AmpR
VP1
Ndel
(1498)
AmpR
EcoR1 (3798)
VP3
_
EcoR1 (1513)
V4
Ndel (2623)
Xhol (1546)
KanR
V 2 Kpnl (3158)
KanR
pUC FMDV P1+3C
AmpR
. pC6 FMDV P1+3C
C6L
Xmal (4589
Al2 3C
EcoRV (42
6R
E coRI (1182)
4
AmpR
VP2
Kpnl (1930)
Ndel (2359)
3
A24
VP2
A24a11
3450)
2B
A 2 3B Xhol (3738)
BamH1 (253)
coR1(284)
Kpnl (245)
EcoRi (296)
7.5Kp
CAN& 7.5Kr.
VP4
VP2
Kpnl (971)
Ndel (1500)
EcoR1 (1515)
Xhol (1548)
V Mutagênese
direcionada ao local
com 11445.HW1146.HM
.
'
w
P24
Ui
Kpn1 (972)
pCR2.1 7.5Kp 5'-PMDV
CD
Ndel (1501)
EcoRI (1516) 01
Xhol (1549)
KanR
EcoR [Mei
Kpnl (72 Bani 1(599)
C6ERcoR1 (1254)
7.5Kp
Fig. 22
EcoRi (296)
pCR2.1 7,5Kn* 5*-PMDV
oCR2.1 7.5Kp 5‘FiViDi/com 3 PCR errors
Kpnt (7857) BamH1 (527)
aggRa4)
KP
:int (1930)
Notl (5087)
dei (2459)
C8
Xmal (4689)
VP1 P3
PatI (4887)
X432540)
A 12 3
A24 2B
EcoRV (4326)
Xho (3838)
pC6 7.5Ko PMDV P1+3C
36/50
1 TTCATAAA.TA CAAGTTTGAT T.AAACTTAAG TTGTTCTAAA GITCT2TCCT CCG.AAGGTAT
61 AGAACAAAGT A.TTTCTIVTA CATCCTTACT ATTTATTGCA GCTTTTAACA GCCTATCACG
TATCCTATTT TTAGTATTGG TAGAACGTTT TAGTTCTAAA GTT.AAAATAT TAGACATAAT
121
TGGCATATTG CTTATTCCTT • GCATAGTTGA GTCTGTAGAT CG1TTCAGTA TATCACTGAT
181
TAATGTACI'A CTGrEATGAT GAAATATAGA ATCGATATTG GCATTTAACT GTTTTGITAT
241
'ACTAAGTCTA GATTTTAAAT CTTCTAGTAA T.ATGCT.AT2'T AATATAAAAG CTTCCACGTT
301
TTTGTATACA TTTCTTTCCA TATTAGTAGC TACTACTAAA. TGATTATCTT CT'TTCATATC
361
TTGTAGATAA GATAGACTAT CTTT.ATCT2T ATTAGTAGAA. AATACTTCTG GCCATACATC
. 421.
GTTAAATITT TTTGTTGTTG TTAGATATAA TATTAAAT.AT CTAGAGGATC CTATTATTTG
481
TGGTAAAATG - TTTAZIGAGT AAAATGA2'CT GGCT.ATTAAA CA.TAGGCCAG TTACCAT.AGA.
541
ATGCTGCTTC CCGTTACAGT GTTTTACCAT AACCATAGAT CTGCCTGTAT TGTTGA2'ACA
601
661 TATAACAGCT GTAAATCCTA .AAAAATTCCT ATCATAATTA TTAATATTAG .GTAATTCATT
TCCATGTGAA AGATAGACTA ATTTTATATC CTTTACCTCC
AAA.TAATTAT TTACATCTCT
721
• 781 TAAACAATCT ATTTTAATAT CATTAACTGG TATTTTATAA TATCCAGAAA GGITTGAAGG
TTAATATC21T GAATCTTTAT
841 • GGTTGATGGA ATAAGTCTAT.TAACATCGTT AAGTAAATTA
901 • TATATTATAC CCATAAGTTA AATTTATATT TAPTTTCTCA. TCA2'CTGACT TAG.TTAGTTT
961
GTAATAAGGT GTGTCTGAAA AAATTAAAAG GTAATTCGTT GAATGAAGCT GTA.T2'TGCTG
1021 • TATCCTATTT ATCTAATTTT GGAGATTTAG CAGTACTTAC TTCATTA.GAA GAAWV1TCTG
CCAGTTCCTG TCTATTACIV ATATTTCGTT TCATTATT.AT ATGATTTATA
1081
TTTTACTTTT•
C6R G
7 . 51(P.
TCAATTATAT .AT.ACTCATTT GACTAGTTAA TCAATAAAAA GAATTCAAAA GTAGAAAATA •
• 1141
•
VP4
M G A G. QS .3 P A T G S Q
1201 T.ATTCTAATT TATTGCACGG • ATGGGAGCTG GGCAATCC.AG CCCAGCAACC GGCTCGCAGA
S G 21 . 2'G•SIIN-NY Y. MQQ Y.QNS•
1261
ACCAGTCTGG C.21ACACTGGC: AGCATAATCA. ACAACTACTA -CATGCAÁCAG TACCAGAACT
.
..MD•T
SGG
1321
CCATGGACA.0 ACAGTTGGGA GACAATGC.CA TCAGTGGAGG "CTCCAACGAG GGCTCCACGG
... 2' T S.
r X T T N.T Q NEN • WZ• A S
1381
ACACAACTTC AACACACACA ACCA.ACACTC AAAACAATGA CTGGTTCTCG AAGCTCGCCA
VP2
A F
T G L F G A L
ZAD K K T E E T•T
1441.
GTTCAGCTTT TACCGGTCTG TTCGGVGCAC TGCTCGCCGA
CAAGAAGACA.. GAGGAAACGA
• .• L D. E -D R I• L T • T R
14 G' H • T T S
T - Q. S . .
•1501 • CACTTCTTGA GGACCGCATC CTCACCACCC GCAACGGGCA CAC
. CACCTCGA.CGACCCAAT
..S VG - V TH
GY.•$•T
E-ED
H V-A G-PN-_T
15. 61
CGAGTGTGGG TGTCACA.CLAC 'GGGTAC TCCA CAGAGGAGGA CCA.0GTTGCT GGGCCCAACA
. S • G L
E• 14.;1? • •Y K.
E T R
-V.
Q A
_Y .1, • E D
1621 CATCGGGCCT GGAGACGCGA. GTGGTGCAGG .CAGAGAGATT CTACAAAAAG TACTTGTTTG.
GEL EXT.' E L P -S.D 11H
..W T•T DA
ACTGGACAAC GGACAAGGCA TTTGGACACC TGGAAAAGCT GGAGCTCCCG TCCGACCACC
1681
. G V P
GEL VDS Y AYM RNGW.DVE
1741
ACGGTGTCTT TGGACACTTG GTGGACTCGT ACGCCTATAT GAGAAATGGC TGGGATGTTG
. .V.S A
V GN
QPN G.GCL
L V• A. 1.1 'V .P: E..
CCTGGTGGCC ATGGTACCTG
" 1801
AGGTGTCCGC TGTTGGCAAC CAGTTCAACG GCGGGTGCCT
..WK.E••FD T
RE.K Y
QL T
L F P •11 Q•E'•/
1861. AATGGAAGGA ATTTGACACA CGGGAGAAAT ACCAACTCAC CCTTTTCCCG CACCAGTTTA
TN M T•AHI T-VP YL G
. . S P R
VNR Y
1921
TTAGCCCCAG AACTAACATG ACTGCCCACA TCACGGTCCC CTACCTTGGT GTGAACAGGT •
..DQY K K 14•KPW T LV • V /4 V V S P L T
1981 ATGATCAGTA CAAGAAGC.AT AAGCCCTGGA CATTGGTTGT CATGGTCGTG TCGCCACTTA
..V 14 N T S A A.QIK V Y A •NI.A . P T Y V
CGGTCAACAA CACTAGTGCG GCACAAATCA .AGGTCTACGC CAACATAGCT CC.GACCTATG
2041
Fig. 23A
37/50
VP3
,.BVAGH I. P 8 . 1( E
GIF P VA C A D G
TTCACGTGGC CGGTGAACTC CCCTCGAAAG AGGGGATTTT CCCGGTTGCA TGTGCGGACG
2101
..YGG ZVT T DPIC 2AD P
A Y G/CP?
GTTACGGAGG ATTGGTGACG ACAGACCCGA AGACAGCTGA CCCTGCT221T GGCAAGGTGT
2161
RTN Y P G R F TN.LZD VAZA
ACAACCCGCC T.AGGACTAAC TACCCTGGGC GCTTCACCAA CCTGTTGGAC GTGGCCGAAG
2221
—CP
FLC FDDG
KP Y V 21 2'
RTDD
CGTGTCCCAC TTTCCTCTGC TTTGACGACG GGAAACCGTA C.GTCACCACG CGGACGGATG
2281
..TRZ LAR' FDZS Z A A KE.14 SNT
r
ACACCCGACT TTTGGCCAAG TTTGACC2'2'T CCCTTGCCGC AAAACATATG TCCAACACAT
2391
YTQ
..ZSG IAQ Y
73G T•IN
-xErm
ACCTGTCAGG GATTGCTCAG TACTAcAcAc AGTACTcwo cAce.ATcAAT TrGc.ATT2rA
2401
S.TD
SKAR Y 24 V A'Y I PP GV
2461
TGTITACAGG TTCCACTGAT TCAAAGGCCC GATÁCATGGT GC;CCTACATC CCACCIVGGG
...ETP PDT
AAH
ANC IMA ENDT'
TGGACACACC ACCGGACACA CCT"IGGG CTGCCCACTG CATTCACGCT GAATGGGACA
2521
..GLE SEF
Trsz pry S A A D•Y
CTGGACTAAA CTCCAAATTC
ACTTTCTCAA TCCCGTACGT ATCCGCCGCG GATTACGCGT
2581
—TAS DTA'STIN VQG AVC IIQT
2641 . ACACAGCGTC TGACACGGCA GAAACAATCA ACGTACAGGG ATGGGTCTGC ATCTACCAAA
..THG RAZ NDTZ V V•SVSA GICDF
2701 TTACACACCia GAAGGC2'GAA AA2'GACACCT TGGTCGTGTC GGTTAGCGCC GGCAAAGACT
VPI
ESAD
...ELR ZP I DPRQ QTT AT G
2761. TTGAGTTGCG CCTCCCGATT GACCCCCGCC AGCAGACCAC
CGCTACCGGG GAATCAGCAG
..PV.T
T.2 V .5 1 ■TY G
GE T Q I Q RRHH
2821 .ACCCGGTCAC CACCACCGTG GAGAACTACG GCGGTGAGAC ACAAATCCAG AGACGTCÀCC
..TDI•GF I 1.1 DRF VIC/'QS 1. SP TR
2881 ACACGGACAT TGGTTTCATC ATGGACAGAT TTGTGAAGAT CCAAAGCT'TG AGCCCAACAC
..VID L14 Q AHQH GLV GAZ L HAA
2941 ATGTCATTGA. CCTCATGCAG GCTCACCAAC ACGGTCTGGT GGGTGCCTTG CTGCGTGCAG
..TY X
LEINT V RH E GN LTWV
PSD
3001 CCACGTACTA CTTTTCTGAC CTGGAAATTG TTGTA.CGGCA CGAAGGCAAT CTGACCTGGG
..P . N.G A P E S ALIA N T • S
NP T ATN.K.
3061TGC.A CTGA. TGAC ACTG
,..APP T AL ALPY T AP FIAV LATV
3121 • AGGCAÇCATT C.ACGAGACTC GCTCTCCCCT ACACTGCGCC GCACCGTGTG CTGGCAACAG
..YNG T SE )1 A.VG GS G R..9 G DbIGS
3181 TGTACAACGG GACGAGTAAG TATGCTGTGG GTGGTTCAGG CAGAAGAGGC GACATGGGGT
..LAA R.VV E Q L P AS'Z' NY G ATEA
3241 ÓTCTCGCGGC GCGAGTCGTG AAACAGCTTC CTGCTTCATT TAACTACGGT GCAATCAAGG
..DA I HEL 1,VR M KR•A EL Y CPRP
.
3301 CCGACGCCA.T CCACGAACTT CTCGTGCGCA TGAAACGGGC CGAGCTCTAC TGCCCCAGAC
IEV S SQD ARK QK I I ARA
..LL A
3361 CGCTGTTGGC AATAGAGGTG TCTTCGCAAG ACAGGCACAA GC.AAAAGATC ATTGCACCAG
..KQZ
A24 2A
LEP D.L'LK ZAG DVE SEPG
3421 CAAAGCAGCT TCTGAATTTT GACCTGCTCA AGTTGGCCGG .AGACGTTGAG TCCAACCCCG
.A A24 213
..PFP- PAD V ASN•P SK LVD TINQ
3481. GGCCATTCTT CTTTGCTGAC GTTAGGTCAA ACTTTTCAAA. GTTGGTAGAC ACAATCAACC
_TKHG PDF NRL VSAP
..MQED M S
.
Fig. 23B
38/50
AGATGCAGGA GGACMGTCC ACAAAACAC.G GGCCCGACTT C.AACMGTTG GTGTCCGCAT •
..zEr.. ATO V K.AI R T G . LDE A•K P W
3601 TTGAGGAATT GGCCACTGGA GTTAAAGCTA TCA.GGACCGG TCTCGACGAG GCCAAA.CáCT
...YKL IKL ',SRL 5 CM
AA.'V AA.RS•
3661 GGTACAAGCT TATCAAACTC CTAAGCCGCC TGTCGTGCAT GGCCGCTGTG GCAGCACGGT
A.12 3B
1A24/Al2 junction(
.X-DP V L V
AIML .AD T
G L E R Q • R P
3721 CCAAGGACCC AGTCCTTGTG GCCATCATGC TGGCCGACAC CGGTtCTCGAGi CGTC11.GAGAC •
ZPQQ EGP Y.AG
Y. X V ri • 1 K
CTCTGAAAGT GAGAGCTAAG CTCCCACAGCWGAAGGACC TTACGCTGGC CCGTTGGAGA
3781
..QKP L'ICV ICARA'PVV K E
G.'13 .YE.G
GACAGAAACC GCTGAAAGTG AAAGCAAAAG CCCCGGTCGT CAAGGAAGGA CCTTACGAGG
3841
...'PVIC
1CPV
AL XV
X.A.E
VTES
GACCGGTGAA GAAGCCTGTC GCTTTGAAAG TGAAAGCTAA GAACTTGATA • GTCACTGAGA
"3901
. .GAP P T D L Q K M VMG•11 T X•PV'EL
3961 GTGGTGCCCC ACCGACCGAC TTGCAAAAGA TGGTCATGGG CAACACAAAO CCTGTTGAGC
.. 1 L.D •G'K T VA 1 C C.A•T GVF GTAY
4021 TCATCCTTGA CGGGAAGACA GT.AGCCATCT GTTGTGCTAC TGGAGTGTTT GGCACTGCTT
..L V P
Run
PAEIC Y'D.X T ML 13•.GR A
4081 ACCTCGTGCC TCGTCATCTT TTCGCAGAGA AGTATGACAA GATCAT'GCTG GATGGCÁGAG
..14"TD SDY R VFE FE I • K VICG-QDM
CCATGACAGA CAGTGACTAC AGAGTGTTTG AGTTTGAGAT TAAAGTAAAA.
GGAÇAGGACA •
9141
..L S D A A• L MVLI1
R. V R D. 1 TX
R G N
4201 TGCTCTCAGA CGCTGCGCTC ATGGTGGTCC ACCGTGGGAA CCGCGTGAGA GATATCACGA
V VG 'VVW1T•
.
F R D - T A RMICX G T P
4261 AACACTTTCG TGATAC.AGCA. AGAATGAAGA AAGGCACCCC CGTCGTCGGT GTGGTCAACA
..A D•V*G R L I F •S•O E A L .T 1 X •D I V' V.
4321 ACGCCGACGT TGGGAGACTG ATTTTCTCTG GTGAGGCCCT CACCTACAAG GATATTGTAG
-..CMD..GD T M.P G X. FAYICA.-A TECA. G
4381 TGTGC.ATGGA CGGAGACACC ATGCCTGGCC TCTTTGCCTA CAAAGCCGCC ACCAAGGCAG
T F I
V G T•11 ..1 CG GAV'LA XD GAD
41GCTA - GCT• AGC ATCG AT
V G Y C SCV . S . R 5 • 14 L L R
—.5 AG
G 1,7 G
4501 ACTCCGCAGG AGGCAATGGA GTTGGATACT GCTCATGCGT TTC.CAGGTCC ATGCTTCTCA
E E
..1.1 K A . EIVD PE PQ
4561 GAA.TG.AAGGC ACACGTTGAC CCTGAACCAC AACACGAGTA GTAATTTTTC TGCAGCCCGG
4621 GTTTTTATÁG CTAATTAGTC ATT22'rzcar AAGZ'AAGTAT TTTTATTTAA TAcivranzzAr
4681. TOTACTTATG TTAAATATAA CTGATGATAA CAAAATCCAT -TATGTATTAT TTATAACTGT
AA.TTTOTTTA GCGTAGTTAG ATGTCCAATC TCTCTCAAAT ACATCGGCTA TCTITTTAGT
4741
GAGATTTZ'GA TCT.ATOCAGT TGAAACTT.AT GAACGCGTGA TGATTAAAAT GTGAACCGTC
4801
4861 CAAATTTGCA OTCATTATAT GAGCGTATCT ATTATCTACT A2'CATCATCT TTGAGTTATT
AAT.ATCATCT ACTOTAGAA2' TGATAGG.AAA TATGAATACC TrTGTAGTAA TATCMATACT
4921
GacrisrraaT AG
4981
.ATCTACACCT AACTCATTAA
C6L
3541
■2
.
.
Fig. 23C
Primers para amplificar através de PCR um fragmento de 5'-FMDV de 1260 bp (EcoR I-Ndel)
Eco El
D1p
q VP4
MGAGOSSP
11356 Mn
GAUTCACTGTAAAMTAGMACTATAIMATATAATACTWACCTTGGEAGUEGGTACTCG'IGATIZATTTTAXTGTTAAACTTGATGGGAGCMGGCAATCCAGCCC/1
• TGACATETTTATCZITGATAMTAGTATATTATCACATCCAACCATCATCCCATGAGCACTAA'ITAAINATMCANITTGAACTACCCICGACCCGITAGGI'CGGGT
Z ã A IC H 14 5
5' CrTGCCGMASGTOCA
11358 . CXT., 3' GAACGGCGTTT1t3TATACIAGGT
Nde
11395.CXL
z
Primers para montar o promotor de Pi
5' ACTCTINAAAMGAAACTATAATCP.TA 3'
5' TAATAGTGTAGOTTECTAETAGGET.AC 3'
11396.CXL
5' TCGTGATTAATTWATTGTTAAACT TC 3'
11397.=
11399.cxL
3' TGACATTTETATCTTTGATATTAGTATAMATCACATCCA. 5'
11398.0mm
3' ACCATCATCCC.ATGAGCACTINATTAAPLATAACAATTTGAAC
Primers para amplificar através de PCR o promotor de PI
11400.ext
5' .ACTGTAAAMTAGMACTATAAT
11401.cm,
3' ACTAATTAMATAACAATTTGAAC 5'
Pip
FXDv
GAATTCACTGTAAAAATAGAAACTATAATCAMMEAGTGTAGGPTGETAWACÁZTACTCGTGATTAATTTEATTGTTAAACETGAZGGGAGCTGMCAATCCAGCC.CA
TGAcATTTETATCV88GATATTA022CATTATCACMCCAACCMCATCCCATGAGCACTAATUAAATAACAATTTGAACTACCCTCGACCCGTTAGGICGGGT
11402
5' GAACIVACTGTAMAA~CTAT
11403.cxx.
3' TANIATAACAATTIZRACCACCCTCGAC 5'
Primers para amplificar através de PCR um fragmento de 5'-FMDV de 3' - Pip de 648 pIS
11406.c.XL
5' GETAAACTTGATCGGAGCTGGGCAATCC 3'
C LLVADIV P VP2
TGCCMCCTOGIGGCCATGGTACC
11407 . CM, 3' ACCGAGGACCACCEGTACCATEG 5'
Epn
Fig. 24
Amplificação de PCR com
AmpR
Kpni (245)
Ndel (185) Xbal (405)
Al2 3C
EcoRV (758)
(253)
coRI 12E41 Pip
AmpR
A24 2A
V121
KanR .
pCR2.1 Plo* 5'.FAIIPV .
VP3
VP4VP2
Kpnl (3158)Ndel (2623) •
EcoR1 (284)
VP4
X1)311'1(995)
51-VP3
Ndel (1524)
EcoR1 0539)
Xhol (1572)
Xbal (1584)
AmpR
.
Amplificaçao atraves
o md ei im3os an .t acgxe;
* g 7IV:: ) d e P Cc R
ma
EcoR1(3798
Minn! (235)
Mutante
PEORI (383)
hol (4i6)Amplificação através
cceoPmciRi4coeim.coxnLtagem
..4....___
KanR
. pCR2.1 PiP
R Lcom
acti
ão.mod4e0P7.Ccx
upoiiefica
Airn
.
cR
xicom
P.C
ã:oiC4e03
j
ca:u
A
tim4poi2ific
•
EcoRliKpn 1
ispni (7857)Batum (527)
Amp
VP4
.
COR
VP2
Plp
EcoR1 (1182)
• EcoR1 (5386)
P4
64abp 31-Pip W-FMOV
Kpn1 (1)
Ndel (530)
VP3
Ca
VPV133
Al2 3C
EcoRV (4226
A24 2A
mat13450)
A24 2ti EcoR uNde i
A 2 3B Xho1 (3'738) x 1
pC6 FMDV P1+3C •
Kpn1 25
Amp
.
Notl (50871
Xmat (4689)
Al2 3C
EcoRV (4326)
pi .
VP4
eril(1
2 019)
X11 o 119O9)
v, Ai W113
pUC Pin FMDV
Mizral l M3654)
R( (1207)
Vp42
Sapi (5376)
• Bam1-11 (253)
Kpni 24,5)
EcoR1 (284)
EcoRl(z96)
Ndel (2968)""allar'+ 6)
C6R
AmpR
11402.=11407.CXL
AZ4 2A.
Xmal (1621)
A24 213
Kpni (1830)
Ndel (2359)
Mui (4589
.
vel •
VP2
971,P PID W-FIVII)V
Amplificação através de PCR de mistura equimolar com
•
EcoR1 0027)
Xhol (1060) -
AmpR
KanR
pCR2,1 Pip 5WMCV (Eco R i-Knni)
Pip
Kpnt (1930)
V133
Hind111 (2997)
VP1
A24 zA
Xmal (3550)
n1 739)
Al2 3B xhoi (3838)
pC6 Pia P14113V P1+3C
Hg. 25
O
'C'. 11
CD
41/50
1 TTCATRAATA CAAGITTGAT TAAACTTAAG TTGITCTAAA GTTCTTTCCT CCGAAGGTAT
AMACMAGTAITTCMTCZACATCCITACTATITATTGCAGCTITMAW-AGCCMATCACG
TATCCTATTT TMAGTATTGG MAGAACGTIT MAGTTMAA
GTMAAAATAT MAGACATAAT
121
61
TGGCATATTG CTMATTOCTT GCATAGTTGA GTCTGTAGAT CGTTTCAGMA
181
Tarawmawr
MAATGTACTA CTGITATGAT GAAATATAGA ATCGATATTG.GCATTTAACT GITTTGTTAT
241
ACMAGTCTR GATTTTAAAT =MAGMA TATGCTATTTAATNTAAAAG CTTCCACGTT
301
ITTGMATACA TTTCTTTCCA TATTAGMAGC TACTACTAAA
~mu= CTTTCAMATC
361
TTGMAGATAA GATAGACTAT CITTATCTITAaTAGMAGAA AATACTTCMG GCCATACATC
421
GTMAAATTXT ITTGTTGTTG TMAGAMATAA'MATTAAATAT CMAGAGGATC CMATTAITTG
481
TGOTAAAATG TTTATAGAGT AAAATGATCT GGCTATTAAA CATAGGCCAG TTACCATAGA
541
ATSCTGCTTCCCGTTACAGTGTITTACCATAACCAIWIATCTGCCTGTATTGTTGATACA
601
661 TATAACAGCT GMAAATCCTAAAAAATTCCTATCATAATTA TMAATATTAG GTAATTCATT
.iccumma AGATAGACTA ATTITATATC CTTTACCTCCAAATAATMT TTACATCTCT
721
781 'TAAAC.AATCT ATTITAATAT CATTAACTGG TAITTTATAA TATCCAGAAA GGTITGAAGG
841
GGITGATGGA ATAAGTCZAT TAACATCGTT AAGTAAATTA
mamar= GAATCTTMAT
TAMATTAT.AC CCATAAGTTA
901
AAMTTATATT TACTTTCTCA TCATCTGACT TAGITAGTIT
961
GTAATAAGGT GTGTCTGAAA ~2~2~ •GTAATTCGTT GAATGAAGCT GTATTZGCTG
TATCATTTIT .ATCTAATITT GGAGATTTAG CAGTACTTAC TTCATTAGAA. GAAGAATCTG
3.021
CCAGITCCVG TCTATTACTG ATAITTCGTT TCATTATTAT ATG.ATTISITA TITTACITTT
1081
• C6R O= .
=o. Pip
1141 •TCAAMMA2 2'ATAC2CATTT GACTAGTTAA TCAATAAAAA GAATTCACTG TAAAAATAGA .
ATATAATAGT GMAGGTTGGT AGMAGGGTAC TCGOMUTAA WTTTATTGTT 120ACT
VP4
_• .
1261
fri.GAGQ 5 8 P AT"G.S . QNQ SON •
AAACTTGAM.GGAGCMGGGCAATCCAGCCCAGCAACCGGC.TCGCAGAACCAOTCTGGCAA
I . 1•117. Y.Ykf
A2.21..pmska PrQ 6
.WG8
1321
CACT4roCAGCATAATCAÂCAACTACTACAT GCAACAGMAC CAGAACTCCA TGGACACACA
..8GD
MAIS
GGS'
kiNG .
S-TDT
TST
1441
GTTGGGAGAC AATGCCATCA GTGGAGGCTC CAACGAGGGC TCCACGOACA CAACTTCAAC
.HTT N T Q N NDW 78R ZAS6
ArT
ACACACAACCAACACMCAAAACAATGACTG GTTCTCGJAG CTCGCCAGTT CAGCTTTTAC
1501
VP2
GALL ADN KTE ETTI, LED•
CGGTCTOTTC GGTGCACTGC TCGCMAMAGAAGACAGAG GAAACGACACTTCTTGAGGA
1381
. G'LP
. RXL TTRN - GH*T - T8T T(23.5 VG‘r
1561 CCGCATCCTCACCACCCGCA.ACGGGCACAC.CACCTC.GACGACCCAA.TCGAGTGTGGGiGT
VAG*PNTS GLE•
. THG YSTE .
EDH
1621 , CACPCACGGG TACTCCACAG AGGAGGACÇAC.GTTGCTGGG CCCAACACAM CGGGCCTGGA'
K Y.•1. PD W
. T R V VQ•AE R •s.
T TP•
1681
GACGCGAGTG OTGCAGGCAG
AGAGATTCTA CAAAAAGTAC TTGTTTGACT GGACAACGGA
4P8'8H:RG VFG•
- KAP G.ELE XLE
1741 CAAGGCATTT GGACACCTGG AAAAGCTGGA GCTCCCGTCC GACCACCACG GTGTCTTTGG
3) 8IA
YMR NGW D'VEV SAV•
- 1414 V.
1801 ACACTTGGTG GACTCGTACG CCTATATGAG AAATGGCTGG GAMGTTGAGG TOTCCGCTGT
OLL VA. 24 VPEW XEF•
PEGO
• G.NQ
1961 TGGCAACCAG TTCAACGGCG GGTGCCTCCT GGTGGCCATG GTACCTGAAT GGAAGGAATT •
- DIR EK- YQ - LTS PPH.QP1 8.PRT•
1921' TGACACACGG GAGAAAMACC AACTCACCCT TTMCCCGCAC CAGTTTATTA GCCCCAGAAC
.N24T AH1T. VPY 1.0V NRYP QYR•
1981 MAACATOACT GCCCACATCA CGGTCCCCTA CCTTGGTOTGAACAGGMATG ATCAGTACAA
PW-TL -
VVI4'VV'S 'PLTV NN'T•
2041 GAAGCATAAG CCCTGGACAT TGGTTGTCAT GGTCGTGTCG CCACTTACGO TCAACAACAC
QIX17 XXX IAl2 TYVH VAG•
2101
TAGTGCGGCA CAAATCAAGG TCTACGCCAA CAMAGCTCCG ACCTATGTTC ACGTGGCCGG
Fig. 26A
42/50
VP3
. ELP SKE G X7P V.AC ADGY
. GG.L
-216TGACT C
TCGAAAGAGG GGATTTTCCC GGTTGCATGT GCGGACGGTT ACGGAGGATT
. V 2' 2'
DPI< 2' A D P A Y G R
V Y •N P P. R •
GGTGACGACA GACCCGAAGA CAGCTGACCC TGCTTATGGC AAGGTGTACA ACCCGCCTAG
2221
zpv AR A'C PT
. TNY PGRF TEZ
GACTAACTAC CCTGGGCGCT TCACCAACCT GTTGGACGTG GCCGAAGCGT G2'CCCACTTT
2283.
DDGIC PYV T T . R TDDT RZZ•
. zcr
CCTC2'GC2T2' GACGACGGGA AACCGTACGT CACCACGCGG ACGGATGAW1 .CCCGACTTT2'
2341
.
. A X F D L S-Z A'A K Fi M S-. NT YZ S.GI;
2401GCAT CG.ACT ACTG A
.
.AQY Y TQY S G 2' INL RF1‘2.7 T G S
.2461 • TGCTCAGTAC T.ACACACAGT .ACTCTGGCAC CATCAATTTG CATTTCATGT 2TACAGGT2'C
.TDS
1CAR Y M V A . Y IP P•GVE'.T•PP•
CACTGATTCA AAGGCCCGAT ACATGGTGGC CTACATCCCA CCTGGGGTGG -AGACACCACC
2521
.DTP ZRAA HCZ.HAE TODT.G 21 1 VS2581 GGACACACCT GAAAGGGCTG C:CCACTGCAT TCACGCTGAA VGGGACACTG. GACTAAACTC
. 1CFT . r.s.rz, • 11 V S AAD YAY T A.SDCAAATTCACT TTCTCAATCC CGTACGT.ATC CGCCGCGGAT TACGCGTACA
CAGCGTCTG4.
2641
r C2 I •2' .0 G IC
.T A E T I N V Q• G W V C 'I
CACGGCAGAA ACAATCAACG TACAGGGATG GGTCTGCATC T.ACCAAAT221 W1CACGGGAA
2701
Ezérá zRz.
—A E 11T.DT.EV VSV.SAG
2761 GGCTGAAAAT GACACCTTGG TCGTGTCGGT TAGCGCCGGC .AAAGACTTTG AGTTGCGCCT
VP3. •
P R Q Q. T TA TGE.S A.,DP.V To•T•
• 2 1 D
CGGTCACCAC
CCCGATTGRC CCCCGCCAGC AGACCACCGC TACCGGGGAA TCAGCAGACC
2821
T V E NYGG.E T Q /QR R SH•T D I*G-•
GTGAGACACA AATCCAGAGA CGTCACCACA CGGACATTGG
2881
CACCGTGGAG AACTACGGCG
PTHV I 1) .1. •
. F I .M D. R PV K I Q
S L S
2941 TTTCATCATG GACAGATTTG TGAAGA—TCCA AAGCTTGAGC CCAACACATG TCATTGACCT
Y Y F••
.MQA H Q H •G L VO A L L RA.AT
3001 CATGCAGGCT. CACCAACACG GTCTGGTGGG TGCCTTGCTG CGTGCAGCCA CGTACTACTT
. SDL E IV•V R HE G111a T WVP N GA3061 TTCTGACCTG GAAATTGTTG TACGGCACGA AGGCAATCTG ACCTGGGTGC CCAACGGCGC
. 2 E S •PáLL•11 T SN P T A YNKA.PF.T.•
3121 CCCTGAATCA GCCCTOTTGAACACCAGCAA CCCCACTGCC TACAACAAGG CACCATTCAC•
.RL A L P Y T A P H R•VI, A T
3281 GAGACTCGCT CTCCCCTACA CTGCGCCGCA CCGTGTGCTG •GCAACAGTGT ACAACGGGAC
. SKY• A V GO S GR 12 GD M•G•S•L.A.AR-.
3241GAT CG2TACG ATG C G
. VVK QLPA• SFR YGA IK-AD A THCTACGGTGCA ATCAAGGCCG ACGCCATCCA
AGTCGTGAAA CAGCTTCCTG CTTCATTTAA.
3301
. ELI. VRMK RAZ L Y C P R P L L A 1 •
3361 CGAACTTCTC GTGCGCATGAAACGGGCCGA GCTCTACTGC CCCAGACCGC TGTTGGCAAT'
Q L L. EVS S Q D R HKQ ET I AP A K
3421 AGAGGTGTCT TCGCAAGACA GGCACAAGCA AAAGATCATT GCACCAGCAA. AGCAGCTWCT
2B
_R F D ZZEL AGD VSS EPG 1 1 222CATTCTTCTT
GAATTTTGAC COGCTCAAGT TGGCCGGAGA CGTTGAGTCC AACCCCGGGC
3481.
.ADV R SEP S K L VD T INQM •QED3541 TGCTGACGTT AGGTCAAACT TTTC.AAAGTT GGTAGACACA. ATCAACCAGA TGCAGGAGGA
SAFE ELA.MS T KHGP DPN RI, V
Fig.. 26B
43/50
3601 CATGTCCACA AAACACGGGC CCGACTTCAA CCGGTTGGTG TCCGCATTTG AGGAATTGGC
.T G V KAIR TGL DEA ICPWY KLI
3662. CACTGGAGTT AAAGCTATCA GGACCGGTCT CGACGAGGCC AAACCCTGOT ACAAGCTTAT
SRI.SCMA AVA A R S K DPV3721 CAAACTCCTA .AGCCGCCTGT CGTGCATGGC CGCTGTGGCA ,GCACGGTCCA AGGACCCAGT
N24/Al2 _ Junção
3B
.I.V A IML A
DTG
LER QRPZ KYR.
3782. CCTTGTGGCC ATCATGCTGG CCGACACCGG TICTCGASCG2' CAGAGACCTC TGAAAGTGAG
. ANZ PQQE GPY AGI> LERQ NPL•
3941 AGCTAAGC2'C CC4C2IGCAGG AAGOICCTTA CGCTGGCCCG TTGGAG.AGAC .AGAAACCGCT
VK AKAP VVIC EGP
yzap
•
VEK•
GAAAGTGAAA GCAAAAGCCC CGGTCGTCAA GGAAGGACCT TACGAGGGAC CGGTGAAGLIA
3902.
.PVA ZICVK AXE L XV TESG
A P P •
GCCTGTCGC2' TTGAAAGTGA AA.GCTAAGAA CTTGATAGTC ACTGAGAGTG
• 3961
GTGCCCCACC
. TD L QKMV• MGE•TICP
VEL I LDG• 4021 GACCGACTTG CAAAAGATGG TCATOGGC.AA CACAAAGCCT GTTGAGCTCA TCCTTGACGG
.K TV AICC A TG• VFG TAYL VPR.
4081 GAAGACAGTA. GCCATCTGTT GTGcTACTGG• AGTGTTTGGc AcTGCTTACc TCGTGC
CTCG
. E•L F AEICy DKI ELD GR AM TDS•
4141 TCATCTTTTC GCAGAGAAGT ATGACAAGAT CATGCTGGAT GGCAGAGCCA 2)GACAGACAG
• DYR VFEF KIN
V IC G
QDMI. S D A
4201 TGACTACAGA GTGTTTGAGT TTGAGA.TTAA AGTAAAAGGA. CAGGACATGC TCTCAGACGC
—ALE VLIIR
G N R
VRD I TK R FRO•
4261 TGCGCTCATG GTGCTCCACC GTGGGAACCG CMGAGAGAT ATCACGAAAC ACTTTCGTGA
. TAR MKIC G TPV VGV VENA DVG•
4321 TACAGCAAGA ATGAAGAAAG GCACCCCCGT CGTCGGTGTG GTCAACAACG CCGACGTTGG
.RLI FSGE
A L. T
YKD TVVC MDG•
4381 GAGACTGATT TTCTCTGGTG AGGCCCTCAC CTACAAGGAT ATTGTAGTGT GCATGGACGG
K AG Y
C G G.
. D . TM P G L F ATE AAT
4441 AGACACCATG CCTGGCCTCT TTGCCTACAA AGCCGCCACC AAGGCAGGCT ACTGTGGAGG
▪ A V L
A'ECD
A D T FIV G TE S A G G
• 4501 AGCCGTTCTC GCCAAGGACG GGGCCGACAC TTTCATCGTC GGCACTCACT CCGCAGGAGG
.N•GV GYCS CvS RSId LLRM KATI4561 CAATGGAGTT GGATACTGCT CATGCGTTTC CAGGTCCATG CTTCTCAGAA TGAAGGCACA
.VDP EPQR
CGTTGACCCT GAACCACAAC ACGAGTAGTA
ATTTTTCTGC AGCCCGGGTT TTTATAGCTA
4621
4681 ATTAGTCATr TTTTCGTAAG TAAGTATTTT TATTTAA221.C' Trrxr.A.2aUT ACTTATGTTA
AATATAACTG ATGA2'AACAA AATCCATTAT GTATT.ATTTA TAACTGTAAT TTCTTTAGCG
4741
ATTTTGA2'CT
4801 TAGTTAGATG TCCAATCTCT CTCAAATACA TCCGCTATCT TTTTAGTGAG
ATGCAGTTGA. AACTTATGAA CGCGTGA2'GA TT.AAAATGTG AACC.G2'CCAA ATTIGCAGTC
4861
4921 .ATTATATGAG CGTATCTATT ATCT.ACTATC ATCATCT2TO AGTTATTAAT ATCATCZACT
TTAGAATTGA TAGGAAATAT GAATACCTTT GTAGMAATAT CTATACTATC TACACCTAAC
4981
TCATTAAGAC TTTTGATAG
5041
Cai
•
Figa 26C
44/50
Hind III
H6p*
11506. EM 5' NAGCTTITTCTTTATTCTATACTTAAAAAG
VAMVPEW K
5' GGTGGCCATGGTACCTGANTIMGAW VP2
11279.SL 3' CCACCGGTAIMATGGIÁCTTACCTTC
Rpn I
Fig. 27
HInd111 236 " ni ali% (253) *
Kpnl 245 (3 InHIC21)
.
VutteH6p
Amplificação de PCR ..
4
AmpR
•
KanR
VI32
Pril (985 )
com11508.111V1
e IIMSL
9fininelp
P2 5' 1(985)
-7
A
;;;;—...........4,,,,rivR
VP3
gf1gai14) Topo dano •
X1101(1562)
pCR2.1 H6p* 5'..FMCV ffilde
KanR
8R
H6p
VP4
VP2
F8L
GamH1 (5687
pni (2929)
Al2 3C
P3
Al2 36
vpiHind111 (3996)
Mina (4738
A24 2 A24 2A
pCR2.1 H6p* 61-FNIDV (KPrg)
pF8 H8p PAIDV (P1+3C)
Kpn119arn141
AmpR
1(981)
Xbal (1279)
F8R
Hind111(8arn141
EcoRV (1611 )
EcoR1 (1784)
Xmal (2101)
Na (3 " F8L
EcoRV (2606) BgiS
n
1?"fi
4)
Al2 3C
VP3
Al2 32124 21M ".%
pF8 H6p* FIL4DV (P1+3C)
pF8
Fig. 28
46/50
.FOR
1 GACCcITTAC AAGAAT21AAA GAAGAAACAA CTGTGAAATA GTTTATAAAT GTAATTCGTA
61
TGCAGAAAAC GATAATATA2' TTTOGTATGA GAAATCTAAA GGAG2101.2V1G T2TGTATAGA
CATGCGCTCT TCCGATGAGA TATTCGATGC TTTTCTAATG 121TCS1TATAG CTACZAGAT.A
121
181 TGCCIVITCAT GATGATGATA TATATCTACA AATAGMTTA TATTATTCT.A ATAATCAAAA
TGTTATATCT TATATTACGA AAAATAAATA CGTVIAGT.A.T A.TAAGAAATA. AAACTAGAGA
241
CGATATTCA1' AAAGTAAAAA
TATTAGCTCT AGAAGACTTT .A.CAACGGAAG ..AAA.TATA.TTG
301
TTGGATTAGT AATATATAAC AGCGTAGCTG CACOGTZTTG ATCATTTTC-C
AACAATATAA
361
421 AC'CAATGAAG GAGGACGACT CATCAAACAT 21AATA.ACA2'T C.ACGGAAAAT ATTCAGTATC
481 AG•ITTATCA CAAGA.2`GATT ATGTT42'TGA ATGTATAGAC GGATCTTTTG ATTCGATCAA
541 GTA.MGAGAT A1'AAAGGTTA TAATAATGAA GAATAACGGT TACGTTAATT GMAGMAATT
601
ATGAGAAATG CGGAATAAAT ACTTTTCTAG ATGGTTGCGT CiTTCTACTT CTAAAGCAT2'
661 ATTAGACATT TACAATAA.TA AGTCAGTAGA TAATGCTATT GTTAAAGTCT ATGGTAAAGG
721
TAAGAAACTT ATTATAACAG GATTTTATCT CAAACAAAAT ATGATACGTT ATGTTATTGA
781
GTGGATAGGG GATGATTTT.A CAAACGAT.AT ATACAAAATG ATTAATTTCT ÃTAATGCGTT
ATTC.GOISIAC' GATGAATTAA AAA.TAGTATC CTGTGAAAAC ACTCTATGCC CGTTTATAGA
841
ACTTGGTAGA TGCTATTATG GTAAAAAATG TAAGTATATA' CACGGAGATC .AA.TGTGATAT
901
CTGTGGTCTA 2'ÁTATACTAC ACCCTACCGA T.ATTAACCAA CGAGTTTCTC
ACAAGAAAAC
961
1021
TTGTTTAGTA GATAGAGATT CTTTGATTG2' GTTTAAAAGA .AGTACCAGTA AAAAGTGTGG
áliATTCZY:CC
CATATGCATA GAAGAAATAA ACAAAAAACA TATTTCCGAA CAG2'21TT1TG
• 1081
1141 AAGTTGTAAA CATATTTTTT GCCTATCATG TATAAGACGT TOGGCAGATA CTACMGAAA
1201 TACAGATACT. GAAAAT.ACGT GTCCTGAATG TAGAATAGTT TTTCCTTTCA ZAA.TAC'CCAO
1261 TAGGTATTGO .ATAGATAATA ~MATAI& AAAAATATTA TATAATAGAT ATAAGAAAA1'
1321
GAATTTGACA AAAATACCTA VIAMIACAAT .AAAAATATAA TTACATTTAC GGAAAATAGC
TGGTTTTAGT TTACCAACTT AGAGTAATTA TCATATTGAA TCTATATTGC TAATTAGCTA
1381
116p*
•
1441 ATAAAAACCC GGGTCGCGAA AGCTTTTCTT TATTCTATAC TTAAAAAGTG CAAATAAATA
A24 VP4 .
• •
14 G A.G Q S'S P A T. G•S
N Q - S.
1501 C.AAAGGTTCT TGATGGGAGC TGGGCAATCC AGCCCAGCAA CCGGCTCGCA GAACCAGTCT
ONTG ST Z NN'Y'Y 14 Q Q Y Q N SI M D
-AGTACCAG.AA CTCCATGGAC
1561 GGCAACACTG GCAGCA1'AAT CAACAACTAC TACATGCAAC
TQL G DN.A T.'SG G S N E. G S l' DT 1'
ACACAGTTGG GAGACAATGC CATWIGTGGA. GGCTCCAACG AGGOCTCCAC GGACACAACT
1621
LASOSA
Q M N DWY B
T N 1'
s T Ti
1681 TCAACACACA CA.ACCAAC.AC ITZIAAACLIAT GACTGGTTCT CGRAGCTCGC CAGTTCAGCT
= A24 VP2
3'
F G A 1, .L A
1) K K T E E "T T
GACAAGAAGA CAGAGGAAAC GACACTTCTT
TTTACCOGIV TGTTCGGTGC ACTGCTCGCC
1741
E DR I LT T R N G E I' TS T T 'Q 5 S
rex,
1801 GAGGACCáCA TCCTCACC.AC CCGCAACGGG CACACC.ACCT CGACGACCCA ATCGAGTGTG
OPN TSG
G VT H G Y 5 TEE DWVA
1861 GGTGTCACAC ACGGGTACTC CACAGAGGAG GACCACGTTG CTGGGCCCAA CACATCGGGC
L E TR . VVQ A.ER FYKK YLF DW I
1921 CTGGAGACGC . GAGTGGTGCA GGCAGAr3AGA TTCTACAAAA. AGTACTTGTT TGACTGGACA.
DEUIGV
T•DK A IP GR tEK LELP
1981 • ACGGACAAGG CATTTGGACA CCTGGAAAAG CTGGAGCTCC .CMCCGACCA. CCACGGTGIC
FGHI, VDS y AY MRNG WDV EVS
2041.
TTTGGACACT TGGTGGACTC GTACGCCTAT ATGAGAAATG GCTGGGATGT TGAGGTGTCC
AVON QFN GGC LLVA. MVP ENE(
2101 GCTGTTGGCA AcahárivAA CGGCGGGTGC CTCCTGGTGG CCATGGTACC TGAATGGAAG
EF•D.T REX Y Q L TLFP SQF
2161 GAATTTGACA CACGGGAGAA ATACCAACTC ACCCTTTTCC CGCACCAGTT TATTAGCCCC
VNR . YDQ
R TNM TAS I TV PYL G
Fig. 29A
47/50
2221 AGAACTAACA TGACTGCCCA CATCACGGTC CCCTACCTTG GTGTGAACAG GTATGATCAG
YKREI
K PW TLV VMVV S P L T VN
2281 TACAAGAAGC ATAAGCCCTG GACATTGGTT GTCATGGTCG TGTCGCCACT TACGGTCAAC
NT S A A Q I K VY ANIA P T Y VH V
2341 .AACACT.AGTG CGGCACAAAT CAAGGTCTAC GCCAACATAG CTCCGACCTA. TGTTCACGTG
A24 VP3
AGE L P•SIS
EGI F P VA,CAD G Y G
2401 GCCGGTGAAC TCCCCTCGAA AGAGGGGATT TTCCCGGTTG CATGTGCGGA CGGTTACGGA
V
G LVT
T DP KVA DP AY GIC V
Ir H P
GGATTGGTGA CGACAGACCC GlIAGACAGCT GACCCTGCTT ATGGCAAGGT GTACAACCCG
2461
ZZD VAE A C P
P RZIT YPG
2521
2581
• 2641
2701
2761
2821
2881
2941
3001
CCTAGGACTA ACTACCCTGG GCGCTTCACC AACCTGTTGG ACGTGGCCGA. AGCGTGTCCC
• TFLC .EDD GEE'
Y V 2 2
R
2 13 DTR
ACTTTCCTCT GCTTTGACGA CGGGAAACCG 22ICGTCACCA CGCGGACGGA TGACACCCGA
ZZAZ F D L S
zr A AREM SN
T Y .D
CTTTTGGCCUI AGTTTGACCT TTCCCTTGCC GCAAAACA251 TGTCCAACAC ATACCTGTCA
G r A Q YYT Q Y S GT IN ZOA"
M .F 2'
GGGATTGCTC AGTACTACAC ACAGTACTCT GGCACCATCA ATTTGCATTT CATGTTTACA
G STD SISA RYM VA Y I PP G V E
2'
GGTTCCACTG AT2'CAAAGGC CCGATACATG GTGGCC2:ACA TCCCACCTGG GGTGGAGAC:A
P
PD 2'
PER AAH C I H A EWD TGL
TGCATI'CACG CTMATGGGA CACTGGAC271
CCACCGGACA CMCCTGAAAG
irSZP TE'S 7PY VS.AA D
Y A Y 2' A
AACTCCAAAT TCACTTTCTC ATCCACGAAC GT.ATCCGCCG CGGATTACGC GTACACAGCG
,ETI.NVQ GWVC I Y Q I TE
TCTGACACGG CAGAAACAAT CAACGTACAG GGATGGGTCT GCATCTACCA AATTACACAC
G E A E HDT I.VV 3 VSA GZD FEZ
GGGAAGGCTG AAAATGACAC C2TGGTCGTG TCGGTTAGCG CCGOCZAAGA CTTTGAGTTG
&GarGcccac
spra
A24 VP1
TATG ES A DP V
RZI 2 7 DPR• QQT
AGACCCGGTC
3061
CGCCTCCCGA TTGA.CCCCCG CCAGCACACC ACCGCT23CCG GGGAATCAGC
T T TV ENY GGE TQIQ RRE1 H TD
3121 ACCACCACCG TGGAGAACTA CGGCGGTGAG AC.ACAAATCC AGAGACGTCA. CC.ACACGGAC
I Q S L SP 2 HVI
IGPI MER
3181 ATTGGTTTCA TCATGGACAG ATTTGTGAAG ATCCAAAGCT TGAGCCCAAC A.CATGTC.ATT
D LMQ AHQ EGL V GAL ZR A A I' Y
3241 GACCTCATGC AGGCTCACCA ACACGGTCTO GTGGGTGCCT TGCTGCGTGC AGCCACGTA.0
L TW VPN
FIE GN
▪
PSD LEI VVR
3301 TACTTTTCTG ACCTGGAAAT TGTTGTACGG CACGAAGGCA ATCTGACCTG GGTGCCCAAC
CAPE SAL LN T SNP . T AYN K AP
3361 GGCGCCCCTG AATCAGCCCT GTTGAACACC AGCAACCCCA CTGCCTACAA CAAGGCACCA
•
TRL ALE, Y T A PHRV LA T V Y
r v x
3421 TTCACGAGAC TCGCTCTCCC CTACACTGCG CCGCACCGTG TGCTGGCAAC AGTGTACAAC
GRR G DMG S L A
G T SE YAV
GGS
GCGAC,ATGGG GTCTCTCGCG
3481
GGGACGAGTA AGTATOCTGI GGGTGGITCA. GGCAGAAGAG
ARVV KQL P AS PNYG A I K AD A
GGCCGACGCC
3541 GCGCGAGTCG TGAAACAGCT TCCTGCTTCA. TTTAACTACG GTGCAATCAA.
IREM LVR MICE AELY CPR PLL
3601. ATCCACGAAC TTCTCGTGCG C.ATGAAACGG GCCGAGCTCT ACTGCCCCAG ACCGCTGTTG
DEE KQKI IAP AKQ
A I E V S SQ
3661 GCAAT.AGAGG TGTCTTC.GCA AGACAGGCAC AAGCAAAAGA TCATTGCACC AGCAAAGCAG
A24 2B
A24 2A
P F
ZLNE D L L XL A GDVE SITP G
3721
CGOGCCATTC
CTTCTGAATT TTG.ACCTGCT CAAGTTGGCC GGAGACGTTG AGTCCAACCC
FF AD VRS NF S KL V D T IN QMQ
Fig. 29B
48/50
3781 TTCTTTGCTG ACGTTAGGTC .AAACTTTTCA AAGTTGGTAG ACACAATCAA. CCAGATGCAG
E OMS TK H G PD FERI, VS A FEE
3841 GAGGACATGT CCACAAAACA. CGGGCCCGAC TTCAA.CCGGT TGGTGTCCGC ATTTGAGGAA
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É24/Al2
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Fig. 30
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RESUMO
Patente de Invenção: "RECOMBINANTES DE AVIPDX EXPRESSANDO
GENES DO VÍRUS DA DOENCA FEBRE AFTOSA".
A presente invenção refere-se a vetores poxvirais modificados e
5 a métodos de fabricação e uso dos mesmos. Em particular, a invenção refere-se a avipox recombinante que expressa produtos de gene do vírus da doença febre aftosa (FMDV) e a composições ou vacinas que elicitam resposta
imune direcionada aos produtos de gene de FMDV e que podem conferir
imunidade protetora contra infecção por FMDV.-