1 ministério da educação universidade federal de goiás

1
MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO
UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
INSTITUTO DE PATOLOGIA TROPICAL E
SAÚDE PÚBLICA
ADRIANO AUGUSTO PECLAT DE PAULA
DETECÇÃO E GENOTIPAGEM DE PAPILOMAVIRUS HUMANO E
IMUNOEXPRESSÃO DE COX-2 E VEGF-C EM PORTADORES DE
CARCINOMA PENIANO
Orientadora: Profa. Dra. Megmar A. dos Santos Carneiro
Co-Orientador: Prof. Dr. Joaquim Caetano de Almeida Netto
Goiânia-GO, 2011
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
INSTITUTO DE PATOLOGIA TROPICAL E SAÚDE PÚBLICA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM
MEDICINA TROPICAL
ADRIANO AUGUSTO PECLAT DE PAULA
DETECÇÃO E GENOTIPAGEM DE PAPILOMAVIRUS HUMANO E
IMUNOEXPRESSÃO DE COX-2 E VEGF-C EM CARCINOMA PENIANO
Orientadora: Profa. Dra. Megmar A. dos Santos Carneiro
Co-Orientador: Prof. Dr. Joaquim Caetano de Almeida Netto
Tese de Doutorado submetida ao PPGMT/UFG como
requisito parcial para obtenção do Grau de Doutor em
Medicina Tropical e Saúde Pública, na área de
concentração em Doenças Infecto-Parasitárias.
Este trabalho foi desenvolvido com apoio financeiro da Fundação de Apoio à Pesquisa
no Estado de Goiás (FAPEG edital N 02-2008).
3
Goiânia-GO, 2011
AGRADECIMENTOS
A Deus, porque sem Ele nada é possível ou sustentável.
À minha esposa e filhos, Lucimeli Cristina R. S. de Paula, Leonardo e Bruno Sardinha
de Paula, pelo apoio, paciência, compreensão e amor incondicional. Vocês me ensinam
a viver.
Aos meus pais, Carlos Inácio de Paula (meu herói) e Cirila Tereza M. Peclat de Paula
(minha guerreira). Pela tolerância, orgulho, amizade, amor e imensurável força de
vontade. Amo vocês.
Às minhas irmãs, Luciana Peclat de Paula Correia e Sônia Helena Peclat de Paula,
cunhados, Lussandra Eni R. Sardinha, Luter Cleber R. Sardinha, Luis Otávio Álvares
Correia, pelo incentivo, cumplicidade, carinho e apoio à minha família. E aos meus
sogros, Manoel Sardinha Sobrinho (em Memória) e Ivanilde dos Anjos Rodrigues
Sardinha (minha segunda mãe) pelo carinho, amor e suporte a minha família, apoio e
incentivo inigualáveis. Aos meus sobrinhos Marina, Otávio e Gustavo pelos bons
momentos de descontração.
Ao meu Orientador, Prof. Dr. Joaquim Caetano de Almeida Netto (cientista incansável)
e Co-orientadora, Profa. Dra. Megmar Aparecida dos Santos Carneiro (“Miss
Simpatia”), pela confiança, apoio, amizade e dedicação. Meus “Mestres”: Aprendi com
vocês que a simplicidade e atitude revelam a grandeza da personalidade e da sabedoria.
Aos meus amigos e colegas de departamento, Adriano Rodrigo L. Maltez, Antônio G.
Franqueiro, Antônio G. Teles e Nilson P. Pinto, pela compreensão da minha ausência,
pelo suporte técnico-científico e pelo estímulo incessante.
Ao Serviço de Anatomia-Patológica do Hospital Araújo Jorge, na pessoa do Dr. Élbio
Candido de Paula, figura que bem representa seu Serviço pela seriedade, engajamento,
solicitude e profissionalismo. Às Dras. Eliane Duarte Motta e Rita de Cássia G. Alencar
pelo exaustivo trabalho da imunoistoquímica e anátomo patologia, por todo tempo
dispensado no raciocínio, na delicadeza e precisão necessárias para a interpretação dos
dados. Seu apoio e empenho foram essenciais para a realização deste trabalho. Menção
especial à querida Profa. Dra. Vera A. Saddi, amiga incansável, professora nata e
exemplo de dedicação. Aos funcionários deste serviço, nas pessoas de Thelma Lima
Silva, Marilene Alves Rocha, Artur, Júnior e Joelma pelo profissionalismo, boa
vontade, simpatia e eficiência dispensadas. Também agradeço aos colegas da
imunoistoquímica, Gustavo Nogueira Caixeta e Rosana Correa da Silva pelo empenho,
eficácia e dedicação e aos técnicos de patologia, Eterno Ribeiro da Silva e Karla, minha
admiração pela maestria no preparo dos blocos, laminas e tubos para análise genética do
material.
4
Ao Dr. Paulo Moacir Campolli pela amizade, companheirismo, pela dedicação
incansável ao ensino, pelos desafios científicos que empreita e nos faz evoluir.
Aos meus compadres, Alexandre João Meneghini e Carina Bullamah Meneghini, e
minha afilhada Lia. Também ao amigo Antonio G. Franqueiro. Amizade é raro e quase
tudo na vida. Agradeço o estímulo, momentos agradáveis, consideração e apoio à minha
família.
Às minhas fiéis “escudeiras”, Shirley Pereira da Silva, Patrícia Nunes Luiz e Magda da
Silveira Costa, pelo carinho, compreensão, organização e amizade.
Aos professores da Pós-Graduação em Medicina Tropical pelos conhecimentos,
paciência, profissionalismo e incentivo.
Ao Prof. Dr. Aparecido Divino da Cruz pela amizade, entusiasmo, apoio e confiança.
A José Clementino de Oliveira Neto e Kariny Vieira Soares, por toda ajuda, eficiência,
simpatia e dedicação ao IPTSP.
Ao Registro de Câncer de Base Populacional de Goiânia, nas pessoas da Profa. Dra.
Maria Paula Curado e do biólogo e Mestre Edésio Martins, pela disposição, prontidão,
eficiência e amizade, além de todo serviço prestado ao estado de Goiás, ao Brasil e ao
mundo.
Aos Drs. Wilmar José Manoel e Rubens José Pereira pela amizade, apoio, disposição,
pelo exemplo científico e contribuição à Medicina de Goiás.
Aos Professores da Banca de Qualificação, Dr.Adriano Moraes Arantes, Dra.Vera
Aparecida Saddi e Dra.Sheila Araujo Teles, cujas críticas, observações e ajuda muito
contribuíram para o aperfeiçoamento da edição final desta Tese.
Aos alunos de Biomedicina da PUC-Goiás, Brhuna Carla Rodrigues da Cunha e Caio
Bruno Quinta de Souza Leal pelo esforço, dedicação, paciência e amor à futura
profissão. O engajamento no laboratório foi de suma importância para a obtenção dos
dados referentes ao HPV.
5
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS
ACCG
Associação de Combate ao Câncer em Goiás
AINH
Anti-inflamatórios não-hormonais
BHD
Gene de Birt Hogg Dube
CEC
Carcinoma Espinocelular
Cm
Centímetros
CP
Carcinoma Peniano
COX-2
Ciclooxigenase-2
DMV
Densidade Microvascular
EGF
Epidermal Growth Factor (do inglês, Fator de Crescimento Epidérmico)
EUA
Estados Unidos da América
FLK-1
Fetal Liver Kinase-1 (do inglês, Quinase Hepática Fetal-1)
GAPDH
Gene Gliceraldeído-3-Fosfato Desidrogenase
HAJ
Hospital Araújo Jorge
HE
Hematoxilina-Eosina
HER-2
Human Epidermal growth factor Receptor 2 (do inglês, Receptor 2 de
fator de crescimento epidérmico humano)
HGF
Hepatocyte Growth Factor (do inglês, Fator de Crescimento ligado ao
Hepatócito)
HPV
Human Papilloma Virus (Papilomavírus Humano)
IC
Intervalo de Confiança
IL
Interleucina
INF
Interferon
IARC
International Agency of Research on Cancer (do inglês,
Agência Internacional de Pesquisa de Câncer)
6
MAB
Monoclonal antibodie (do inglês, anticorpo monoclonal)
MMP
Matriz metalo-proteinase
NIP
Neoplasia Intra-Epitelial do Pênis
NK
Linfócitos Natural-Killers
PAAF
Punção Aspirativa por Agulha Fina
PCNA
Proliferative Cell Nuclear Antigen (do inglês, Antígeno
Nuclear de Proliferação Nuclear)
PCR
Polymerase Chain Reaction (do inglês, Reação Em
Cadeia da Polimerase)
PDGF
Platelet Derived Growth Factor (do inglês, Fator de Crescimento
Derivado de Plaquetas)
PECAM-1
Platelet Endothelial Cell Adhesion-1 Molecule (do inglês,
Molécula Celular 1 de Adesão Plaquetária)
PGF
Placentary Growth Factor (do inglês, Fator de Cresciemtno Placentário)
PGs
Prostaglandinas
PGE2
Prostaglandina E2
RT-PCR
Reverse transcriptase Polymerase Chain Reaction (do inglês, Reação Em
Cadeia da Polimerase por Transcriptase Reversa)
SD
Standard deviation (do inglês, Desvio Padrão)
SCCP
Squamous Cell Carcinoma of the Penis (do
inglês,Carcinoma Espino-Celular do Pênis)
SEER
Surveillance, Epidemiology and End Results (do inglês,
Resultados Finais de Seguimento e Epidemiologia)
SPSS
Statistical Package for Social Sciences software
(do inglês, Programa de Pacote Estatístico para Ciências Sociais)
7
SUS
Sistema Único de Saúde
TAM
Tumour-associated macrophages (do inglês, Macrófagos Associados a
Tumor)
TSP-1
Trombospondina-1
TNF
Fator de Necrose Tumoral
TXA2
Tromboxano A2
UICC
International Union Against Cancer (do inglês, União
Internacional Contra o Câncer)
VEGF-A
Vascular Endothelium Growth Factor-A (do inglês, Fator A de
Crescimento do Endotélio Vascular)
VEGF-C
Vascular Endothelium Growth Factor-C (do inglês, Fator C de
Crescimento do Endotélio Vascular)
VEGF-D
Vascular Endothelium Growth Factor-D (do inglês, Fator D de
Crescimento do Endotélio Vascular)
VEGFR
Vascular Endothelium Growth Factor Receptor (do inglês, Receptor de
Fator de Crescimento do Endotélio Vascular)
VHL
Gene Von Hippel-Lindau
“X”
Não avaliável
8
ÍNDICE
Agradecimentos.....................................................................................................
03
Lista de abreviaturas, siglas e símbolos.................................................................
05
Índice.....................................................................................................................
08
Lista de Figuras, Tabelas e Quadros......................................................................
11
Resumo...................................................................................................................
12
Abstract..................................................................................................................
13
Apresentação..........................................................................................................
14
I Introdução............................................................................................................
15
1. O Carcinoma Peniano........................................................................................
15
1.1 Epidemiologia do Carcinoma Peniano.............................................................
15
1.2 História Natural do CP ....................................................................................
16
1.3 Estadiamento...................................................................................................
17
1.4 Tratamento do CP e Morbidade.......................................................................
17
2- O Papilomavirus Humano..................................................................................
19
2.1 Classificação e Biologia...................................................................................
19
2.2 Epidemiologia e Curso Clínico da Infecção....................................................
21
2.3 Diagnóstico de Infecção por HPV....................................................................
22
2.3.1 Técnicas Laboratoriais de Diagnóstico e Genotipagem de HPV.................
23
2.4 Prevenção e Controle de Infecção por HPV....................................................
25
2.5 Epidemiologia do HPV em Carcinoma Peniano..............................................
27
2.6 O HPV Como Preditor de Metástase Inguinal e de Sobrevida........................
29
3. Ciclooxigenase-2 e Câncer.................................................................................
31
4. VEGF e Câncer..................................................................................................
33
5. A Importância de COX-2 e VEGF-C Como Alvos de Novas Terapêuticas do
Câncer....................................................................................................................
5.1 Terapia Anti-COX-2........................................................................................
36
36
5.2 Terapia Anti-VEGF-C e VEGF-R...................................................................
37
9
6. Justificativa........................................................................................................
38
7. Objetivos...........................................................................................................
39
8- Material e Métodos...........................................................................................
40
8.1 População do Estudo.......................................................................................
40
8.2 Critérios de Exclusão.......................................................................................
40
8.3 Extração de DNA.............................................................................................
40
8.4 Detecção de DNA Humano .............................................................................
41
8.5 Detecção e Genotipagem de HPV....................................................................
42
8.6 Análise Imunoistoquímica ..........................................................................
43
8.7 Seguimento e Análise Estatística.....................................................................
45
9. Resultados da Detecção e Genotipagem de HPV..............................................
46
II ARTIGO 1
Carcinoma Peniano e Papilomavírus Humano (HPV): Artigo de Revisão ...........
49
Introdução...............................................................................................................
49
Metodologia..............................................................................................................
49
Caracterização viral..................................................................................................
49
Patogêneses viral......................................................................................................
50
HPV e imunidade do hospedeiro..............................................................................
52
HPV e carcinoma peniano........................................................................................
53
Conclusão.................................................................................................................
56
Referências...............................................................................................................
57
III ARTIGO 2
The Impact of Imunnoexpression of COX-2 and VEGF-C on the Prognosis of
Penile Carcinoma
60
Abstract....................................................................................................................
60
Introduction................................................................................................................
61
Materials and Methods.............................................................................................
62
Imunnohistochemical analysis.................................................................................
62
10
Follow-up and statistical analysis..............................................................................
63
Results.....................................................................................................................
63
Discussion................................................................................................................
69
Conclusions..............................................................................................................
71
References................................................................................................................
72
Conclusões Gerais....................................................................................................
75
Referências ..............................................................................................................
76
Autorização para uso de figuras...............................................................................
99
ANEXO I Carta de Aceite do Artigo 2...............................................................
100
11
LISTA DE FIGURAS, TABELAS e QUADROS
Figura 1- Mecanismo de angiogênese tumoral.................................................... 32
Figura 2- Relação entre HPV, fatores moleculares e angiogênese...................... 35
Figura 3- Gel de Poliacrilamida 8%. PCR para HPV18...................................... 43
Tabela I- Prevalência de DNA-HPV em pacientes com CP em diferentes
países no período de 1995 a 2010. ...................................................................... 28
Tabela II- Prevalência de DNA-HPV em pacientes com CP no Brasil no
período de 1998 a 2008...................................................................................... 29
Tabela III- Relação do HPV e risco de metástase inguinal e de óbito por
câncer................................................................................................................... 30
Tabela IV- Frequência dos fatores clínicos e terapêuticos de acordo com a
positividade de HPV em pacientes com CP........................................................ 46
Tabela V- Frequência dos fatores clínicos e terapêuticos de acordo com os
tipos de HPV........................................................................................................ 47
Artigo 1
Figura 1- Genoma do HPV .................................................................................
49
Tabela I-Função dos genes do HPV ...................................................................
50
Tabela II- Classificação dos HPVs quanto à categoria de risco oncogênico....... 51
Tabela III-Autores, ano de publicação, método de detecção do HPV, número
de pacientes envolvidos e taxas de positividade ................................................. 55
Artigo 2
Figure 1- IHC for COX-2(left) in 200x and VEGF-C (right) in 400x
magnification, both with a staining of 80% of the tumor cells.........................
64
Figure 2- ROC curves of VEGF-C IHC staining for prediciton of groin
metastasis...........................................................................................................
65
Figura 3- Curva ROC de VEGF-C para predição de metástase inguinal............
66
Table I- Uni and multivariate analysis of clinical and histological variables
according to IHC for COX-2........................................................................
67
Table II- Uni and multivariate analysis of clinical and histological variables
according to IHC for VEGF-C........................................................................
68
12
Table III- Distribution of variables according to the occurrence of groin
69
metasasis and SCS.....................................................................................
RESUMO
O carcinoma peniano (CP) é uma doença grave, comum em países em desenvolvimento,
que acomete homens com perfil econômico e cultural desfavoráveis. O presente estudo
teve como objetivos avaliar a expressão da imunomarcação de COX-2 e VEGF-C no
risco de metástase e óbito câncer-específico de pacientes com CP, bem como detectar e
genotipar o papilomavírus humano (HPV) tipos 16 e 18 nessa população. Um total de
127 pacientes com CP tratados no serviço de Uro-Oncologia do Hospital Araujo Jorge
(Goiânia-GO), no período de Janeiro de 2001 a Julho de 2008, foram incluídos. As
amostras foram submetidas à detecção e genotipagem de HPV pela reação em cadeia da
polimerase (PCR) com iniciadores tipo-especificos. Para análise da imumohistoquimica
(IHQ) empregou-se o método da imunoperoxidase com anticorpos policlonal e
monoclonal, respectivamente, para detecção das proteínas VEGF-C e COX-2. A
positividade de COX-2 e VEGF-C na IHQ não alterou o risco de metástase inguinal,
embora a imunomarcação para COX-2 tenha se associado a variáveis histológicas de
valor prognóstico já conhecido. A imunomarcação para VEGF-C se associou à pior
curva de sobrevida câncer-específica em três anos (p=0,02). O grau tumoral (p=0,03) e
o estágio de Jackson >II (p<0,01) se mostraram bons preditores de doença inguinal, em
análise multivariada. A presença de metástase regional foi fator independente para óbito
por CP (p<0,01; OR=6.8; IC95% 1.6-27.7), bem como o estágio de Jackson >II
(p=0,01; OR=4.5;IC95% 1.4-14.5). Os resultados da reação em cadeia de polimerase
(PCR) mostraram que a prevalência da infecção pelo HPV em portadores de CP de
Goiânia-Go foi de 43,3%. O HPV 16 foi o mais prevalente (50,9%), seguido pelo HPV
18 (25,5%). Entre as variáveis histológicas, apenas a presença de coilocitose (p=0,03) se
associou ao HPV na análise multivariada. Após a genotipagem, o HPV 16 manteve
associação com coilocitose (p=0,04). Nenhuma outra variável histopatológica se
associou ao HPV 16 ou 18. A presença do HPV não alterou o risco de metástase
inguinal, embora o HPV 18 tenha sido fator independente de óbito por CP em regressão
logística (p<0,01). Os achados desta coorte evidenciam que a expressão de VEGF-C e
COX-2 e a detecção de HPV podem auxiliar na identificação de portadores de CP com
pior prognóstico. Estes dados devem ser validados em séries com maior número de
pacientes e através de estudos com emprego de drogas anti-angiogênicas.
13
ABSTRACT
Penile carcinoma is a serious and comumon disease among developing countries, which
affects men with low economical and cultural profile. The present paper aimed to
evaluate the expression of the immunostaining for COX-2 e VEGF-C on the risk of
metastasis and specific cancer survival, in patients with penile cancer (PC), as well to
detect and genotype the presence of human papillomavirus (HPV) among them. Onehundred and twenty-seven patients, treated by the Uro-Oncology Department of the
Araujo Jorge Hospital between January 2001 and July 2008, were enrolled. All the
samples underwent detection and genotyping of HPV16 and 18, through Polymerase
Chain Reaction (PCR), with type-specific primers. The immunoperoxidase method with
antibodies for VEGF-C and COX-2 protein was used in immunehistochemistry (IHC).
The positivity for COX-2 or VEGF-C showed no impact on the risk of groin disease,
although
COX-2
was
statistical
associated
to
several
histological
known
prognosticators. The staining for VEGF-C resulted in a worse specific-cancer three-year
survival curve (p=0.02). Jakcson stage >II (p<0.01) and high tumor histological grade
(p=0.03) were good predictors of groin metastasis in multivariate analysis. Inguinal
disease was an independent predictor of PC death (p<0.01; OR=6.8; IC95% 1.6-27.7),
as well Jackson stage> II (p=0.01; OR=4.5; IC95% 1.4-14.5). The results of Polymerase
Chain Reaction (PCR) showed a 43.3% of HPV prevalence. HPV 16 was the most
prevalent (50.9%), followed by HPV 18 (25.5%), in agreement with international and
regional data. The only histological variable associated to HPV was the presence of
koylocitosis (p=0.03). No other histopathological variable was associated to HPV. After
genotyping, the HPV16 sustained the association with koylocitosis (p=0.04). The
presence of HPV did not alter the risk of groin metastasis, though HPV 18 was proven
to be an independent predictor of PC death in logistic regression analysis (p<0.01). The
results of the present cohort suggest that immunohistochemical analysis of COX-2 and
VEGF-C and detection/genotyping HPV may help to identify PC patients with
unfavorable prognosis. These data must be validated in multi-institutional, larger,
prospective series and through studies employing anti-angiogenic agents.
14
APRESENTAÇÃO
Esta tese de doutorado, apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Medicina Tropical do Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública/UFG, encontra-se
estruturada na forma de artigos científicos.
O artigo de revisão (ARTIGO 1), abrange os aspectos relacionados à
caracterização do papilomavirus humano (HPV), oncogênese viral, alterações
imunológicas induzidas pelo HPV e o papel do HPV no carcinoma peniano (CP). Este
artigo foi publicado na Revista Brasileira de Oncologia Clínica [ISSN 1806-6054],
Vol.6, No16, pgs 7-11, 2009.
O segundo artigo (ARTIGO 2- em anexo) foi elaborado em razão da carência de
fatores acurados de risco para identificar metástases inguinais ocultas em portadores de
carcinoma peniano (CP) operado. Tal situação gera cirurgias inguinais às vezes
“desnecessárias” e com potencial de grave morbidade associado a este procedimento. O
CP é uma doença que acomete, preferencialmente, paciente menos favorecido e sem
poder econômico para tratamentos dispendiosos. Esta característica talvez justifique a
falta de investimentos em novos fármacos por parte da indústria farmacêutica. Desta
forma, observamos uma tendência em se utilizar tratamentos já consolidados para
carcinoma espinocelular (CEC) de outras topografias (cabeça e pescoço, cérvice
uterina) na tentativa de se obter resultados semelhantes. Estando a medicina na era de
drogas alvo-dirigidas, também identificamos uma real necessidade de selecionar
pacientes com potencial de resposta a novas modalidades terapêuticas, ora representadas
por inibidores de ciclooxigenase-2 (COX-2) e/ou de fator C de crescimento de endotélio
vascular (VEGF-C). Assim, o artigo “Impacto da Imunoexpressão de COX-2 e VEGFC no Prognóstico do Carcinoma Peniano” se refere a uma coorte prospectiva que
analisa pacientes com CP, tratados em um único centro de referência (Hospital Araújo
Jorge da Associação de Combate ao Câncer em Goiás) na região Centro-Oeste do
Brasil. O objetivo desse artigo é determinar o impacto da imunoexpressão de COX-2 e
VEGF-C, bem como, dos fatores histopatológicos convencionais no prognóstico destes
pacientes. Este artigo foi submetido e aceito (em anexo) pelo The Journal of Urology.
A investigação da prevalência e genotipagem do papilomavírus humano (HPV)
no CP foi conduzida devido à escassez de dados regionais, somada às incertezas
15
prognósticas ainda pendentes na literatura. Os resultados serão usados para elaboração
de um terceiro artigo, a ser enviado ao periódico Cancer.
I-INTRODUÇÃO
1- O CARCINOMA PENIANO (CP)
1.1 EPIDEMIOLOGIA DO CP
O câncer de pênis é uma doença rara em países industrializados, porém ainda
considerado um grave problema de saúde pública nos países em ascensão econômica
((McDougal,1994; Parkin,2002; de Paula et al.,2005; Micali et al.,2006; BarnholtzSloan et al.,2007; Bleeker et al.,2009). O Instituto Nacional do Câncer estimou mais de
4600 casos no Brasil em 2009, sendo a região Nordeste a mais prevalente (INCA,2010).
Segundo dados não publicados do Registro de Câncer de Base Populacional de GoiâniaGO, referentes ao período de 2000 a 2008, a incidência anual de CP em Goiás variou de
0,87 a 2,03 casos novos/100.000 homens. A Sociedade Brasileira de Urologia realizou
um estudo epidemiológico em 2007, utilizando questionários médicos, e estimou que a
maioria dos casos de CP ocorreu no estado de São Paulo (24%), seguido do Ceará
(12%), Maranhão (10%) e Rio de Janeiro (9%) (Carvalho,2007).
A origem do CP é multi-fatorial e ainda desconhecida. O principal fator de risco
para CP é a higiêne precária, às vezes corroborada pela presença de fimose na vida
adulta (Srinivas Khan,1985; Dillner et al.,2000b; Daling et al.,2005; McDougal,2005;
Bleeker et al.,2009). Pois a fimose pode favorecer a persistência de infecções
bacterianas (Mycobacterium esmegmatis) e virais (HPV) na genitália masculina (Daling
et al. 2005).
As lesões precursoras do carcinoma peniano invasor são a neoplasia
intraepitelial do pênis (NIP), a balanite xerótica obliterante, o líquem escleroso, o
carcinoma in situ representado pela doença de Bowen e pela eritroplasia de Queyrat e
condiloma peniano gigante (Doença de Buschke-Lowenstein) (de Paula et al.,2005;
Micali et al.,2006; Bleeker et al.,2009).
O tipo histológico mais comum do CP é o escamoso, também denominado
escamocelular ou espinocelular (CEC). A segunda histologia mais frequente é
representada pelo
carcinoma verruciforme.
Existem
variantes
do
CEC,
de
comportamento biológico diverso, com diferente etiologia e associação com HPV
(Rubin et al.,2001; Cubilla et al.,2004; Micali et al.,2006). Os subtipos histológicos do
16
CEC de pênis são: 1-Usual; 2-Inespecífico; 3-Basalóide; 4-Queratinizado; 5- Nãoqueratinizado; 6-Misto; 7-Sarcomatóide; 8-Adenoescamoso (Cubilla et al.,2001). Existe
grande confusão ao se reportar as variantes do carcinoma verruciforme. Em 1948,
Ackerman, utilizando um modelo de cavidade oral, descreveu quatro variantes deste
tumor,
o
verrucoso,
papilar,
condiloma-verrucoso
e
condiloma
gigante
(Ackerman,1948). Dos CECs, a variante basalóide é a mais agressiva e a mais
freqüentemente associada ao HPV 16. O carcinoma verruciforme é mais indolente e
associado ao HPV em cerca de 58% dos casos (Miralles-Guri, 2009).
1.2 HISTÓRIA NATURAL E FATORES DE RISCO DE METÁSTASES
No CP a principal via de disseminação é a via linfática, como a maioria das
neoplasias epiteliais (Culkin Beer,2003; Naumann et al.,2005; Bolenz et al.,2009). O
aparecimento de metástases linfáticas para região inguinal ocorre em até dois anos do
surgimento da lesão peniana (Ornellas et al.,1991; Ravi,1993b; Lopes et al.,1996;
Kroon et al.,2005b). Os principais fatores preditivos de metástase inguinal oculta são: o
grau tumoral (grau III), o tamanho do tumor (>T2) e a presença de embolização
angiolinfática (Lopes et al.,1996; Slaton et al.,2001; Solsona et al.,2001; Ficarra et
al.,2002; Lont et al.,2003; Ficarra et al.,2005; Kroon et al.,2005b; Naumann et al.,2005).
Na vigência dos três fatores, o risco de metástase inguinal oculta é maior que 50% e a
cirurgia inguinal pré-emptiva (profilática) deve ser oferecida ao paciente.
Em
contrapartida, no paciente com linfonodo inguinal suspeito (aumentado de volume), o
índice de falso positivo é de aproximadamente 50% (McDougal et al.,1986; Ornellas et
al.,1991; Lopes et al.,1996; Pizzocaro et al.,1997; Sanchez-Ortiz Pettaway,2003).
Ficarra et al. em 2006 apresentaram um nomograma com predição do risco de
metástase inguinal de 87%. Este sistema utiliza a regressão logística para verificar o
risco estimado de aparecimento de metástase inguinal, cruzando as características
anátomo-patológicas do tumor primário, e a combinação destas (Ficarra et al.,2006).
Várias pesquisas relacionando as alterações de genes supressores (p53, pRb, p16), de
antígeno de proliferação nuclear (PCNA), Ki-67, BAX, Bcl-2, MDM2, trombospondina,
telomerase, caspases, VEGF e ciclooxigenase-2 foram realizadas, com resultados
diversos, na tentativa de se identificar outros fatores preditivos de metástase inguinal
oculta (Alves et al.,2001; Eschwege et al.,2001; Gaffney et al.,2001; Gil,2002; Martins
et al.,2002a; Martins et al.,2002b; Ferreux et al.,2003; Ouban et al.,2003; Golijanin et
al.,2004; Saeed et al.,2005; Guimaraes et al.,2007; Heideman et al.,2007; Guerrero et
17
al.,2008; Scheiner et al.,2008; Yanagawa et al.,2008; Muneer et al.,2009; Novais,2009).
O papel da coilocitose como preditor de metástase inguinal também foi avaliado por
alguns autores, com resultados controversos (Lopes et al.,1996; Gil et al.,2001; de Paula
et al.,2007; Ornellas et al.,2008b). A maioria destes estudos são retrospectivos, com
pequeno número de pacientes e com baixo nível de evidência científica. Em resumo, até
o presente momento, a caracterização anátomo-patológica do tumor primário continua
sendo a mais relevante para se indicar a cirurgia inguinal.
O desenvolvimento de metástases hematogênicas é raro e pode ocorrer para
pulmões, fígado, cérebro e ossos. O principal fator de risco de metástase à distância é a
presença de metástases inguinais, o que também é fator independente de sobrevida
câncer-específica (Lopes et al.,2000; Culkin Beer,2003).
1.3 ESTADIAMENTO
O estadiamento do CP é de difícil aplicação clínica, uma vez que o atual sistema
proposto pela American Joint Commitee on Cancer (AJCC), conhecido como TNM, só
é possível após a cirurgia. Ou seja, o TNM é um estadiamento patológico e não clínico
(AJCC,2002; Wiley &Sons,2002). O único estadiamento clínico aplicável ao CP é o
proposto por Jackson (Jackson,1966), em que se classifica a doença em estágios de 0 a
IV, sendo: 0-Carcinoma verrucoso não-invasivo; I-Tumor restrito a glande ou prepúcio,
sem metástase inguinal; II- Tumor invade corpos cavernosos/esponjoso, sem metástase
inguinal; III- Metástase inguinal ressecável; IV- Metástase inguinal irressecável.
Devido às limitações do estadiamento TNM, incluindo-se falhas no prognóstico
dos pacientes, alguns autores apresentaram propostas de mudança ou complementação
do sistema atual. McDougal em 1995 propos o uso do grau tumoral e da profundidade
de invasão da lesão como elementos a serem usados em um novo estadiamento
(McDougal,1995).
Esta
proposta também
foi
recomendada por
Cologna e
colaboradores, em um estudo brasileiro (Cologna et al.,2001). Apesar das tentativas de
mudança do estadiamento, o TNM e o estadio de Jackson continuam sendo os mais
usados para o CP.
1.4 TRATAMENTO DO CP E MORBIDADE
O tratamento do CP consiste na cirurgia da lesão primária (pênis) e das regiões
inguinais. A operação do pênis (tratamento local) pode variar da excisão ampla do
18
tumor, penectomia parcial ou total e até a emasculação (ressecção do pênis, testículos e
bolsa testicular) (de Paula et al.,2005).
A linfadenectomia inguinal (tratamento regional) é indicada na presença clínica
de metástase ou com base no risco de metástase inguinal oculta.
A extensão do
procedimento inguinal pode variar da simples dissecção do linfonodo sentinela até o
esvaziamento radical inguinal bilateral (Lont et al.,2003). A dissecção do linfonodo
sentinela consiste na identificação e estudo histológico do primeiro linfonodo da via
linfática em questão. Embora seja um procedimento de menor porte, este procedimento
não é custeado pelo Sistema Único de Saúde (SUS). Quando o achado do linfonodo
sentinela é positivo para metástase, o esvaziamento inguinal radical torna-se imperativo.
Apesar dos carcinomas escamosos, em geral, responderem a radio e
quimioterapia, não há dados na literatura que suportem o emprego adjuvante
(complementar) destes tratamentos no CP (Culkin Beer,2003), ou seja, mesmo diante de
fatores de risco para metástase inguinal, após o tratamento da lesão primária, não há
indicação de adjuvância. Da mesma forma, não há benefício em sobrevida câncerespecífica ao se usar radio e/ou quimioterapia após a linfadenectomia inguinal. A
indicação de quimioterapia paliativa se faz na doença metastática à distância e como
neo-adjuvância de casos inicialmente irressecáveis (Bermejo et al.,2007; Pagliaro et
al.,2010). Este panorama levou vários autores a buscar meios mais eficazes de se
identificar a presença de metástase inguinal oculta, assim justificando a indicação da
linfadenectomia. Três fatores colaboram com a execução de cirurgias inguinais
“desnecessárias”: 1-A falta de tratamento adjuvante eficaz; 2-Baixo nível sócioeconômico e cultural dos pacientes; 3-Carência de fatores prognósticos acurados para
prever metástases inguinais subclínicas.
A cirurgia inguinal tem elevada morbidade e os pacientes podem evoluir com
linfedema crônico de membros inferiores e genitália, erisipelas de repetição, infecção de
ferida operatória com eventual ruptura de vasos inguinais e risco de óbito (Ravi,1993a;
Bevan-Thomas et al.,2002; Bouchot et al.,2004; Nelson et al.,2004; Kroon et al.,2005c;
Pompeo,2005). Quanto maior o procedimento, maior o risco de morbidade subseqüente.
Na tentativa de se reduzir a morbidade da linfadenectomia, Tobias-Machado e
colaboradores chegaram a propor a realização do procedimento por via endoscópica, na
tentativa de se reduzir os índices de infecção e necrose de ferida operatória (TobiasMachado et al.,2007).
19
No tocante a sobrevida, o mais relevante fator prognóstico é a presença e a
extensão (número de linfonodos comprometidos) da metástase inguinal (Lopes et
al.,1996; Srinivas Lynch,1997; Lopes et al.,2000; Bissada et al.,2003; Sanchez-Ortiz
Pettaway,2003; Pompeo,2005; Kattan et al.,2006; Lont et al.,2007). Enquanto mais de
80% dos pacientes sem metástase inguinal sobrevivem, apenas 20% daqueles com mais
de uma metástase inguinal se curam com a linfadenectomia (Ornellas et al.,1991;
Hegarty et al.,2006; Scheiner et al.,2008). Parece haver vantagem de sobrevida para os
pacientes submetidos à cirurgia inguinal profilática (metástase inguinal oculta), quando
os compara aos tratados com cirurgias terapêuticas (linfonodos metastáticos palpáveis)
(Ornellas et al.,1991; Ravi,1993b; Izawa et al.,2005; Kroon et al.,2005a; Kroon et
al.,2005b; McDougal,2005; Ornellas,2008; Ornellas et al.,2008a). Entretanto, este
benefício é sugerido por séries retrospectivas, pois não há, até o momento, nenhum
estudo prospectivo ou randomizado correlacionando sobrevida com o momento da
realização da linfadenectomia inguinal. A linfadenectomia inguinal profilática,
denominada pré-emptiva, parece estar relacionada à melhor taxa de sobrevida, quando
comparada à cirurgia inguinal de resgate ou terapêutica (Lont et al.,2003; Micali et
al.,2004; Pompeo,2005). Alguns estudos atribuem uma melhor sobrevida câncerespecífica (SCE) à linfadenectomia inguinal, entretanto o suposto benefício se deve à
inclusão de pacientes com estádio patológico pN0 (Ornellas et al.,1991; Lopes et
al.,1996; Lont et al.,2003; Kroon et al.,2005a). Para a análise coerente da mortalidade
câncer específica deve-se comparar os pacientes com metástase inguinal no espécime
cirúrgico, submetidos à linfadencectomia inguinal pré-emptiva ou à linfadenectomia
inguinal terapêutica precoce. Assim, é possível estabelecer se realmente o benefício na
SCE se mantém ao indicar o esvaziamento inguinal na fase subclínica. Ainda caberia
refletir se a melhor SCE na cirurgia pré-emptiva justificaria a morbidade aplicada aos
pacientes operados e com estágio pN0. Outros autores, em séries maiores, não
encontraram diferença na SCE em relação ao esvaziamento inguinal positivo precoce ou
tardio (Ravi,1993b; Ornellas et al.,2008a).
É imperativo que se identifique melhores fatores preditivos de metástase
inguinal oculta, reservando-se a linfadenectomia inguinal precoce apenas para quando
devidamente justificada.
2- PAPILOMAVIRUS HUMANO
20
2.1- CLASSIFICAÇÃO E BIOLOGIA
O Papilomavírus Humano (HPV) é um vírus DNA com diâmetro de 55nm, não
envelopado, classificado na família Papillomaviridae (ICTV, 2009), que infecta pele e
mucosas de humanos. O genoma é constituído por uma molécula de DNA de fita dupla,
circular, com cerca de oito mil pares de base e possui nove regiões de leitura aberta
(ORFs - Open Reading Frames), que compreendem três regiões principais: precoce ou
Early (E), que codifica as proteínas não estruturais (E1, E2, E4, E5, E6 e E7); a região
tardia ou late (L) responsável pela síntese das proteínas do capsídeo L1 e L2 e a região
regulatória ou Long Control Region (LCR) que contém a origem de replicação e sítios
de ligação para fatores de transcrição virais e celulares (Hebner Laimins,2006; Munoz
et al.,2006; Ghittoni et al.,2010). O gene estrutural tardio L1 codifica proteínas maiores
e é gênero-específico, enquanto o gene L2 codifica proteínas menores e é tipoespecífico (Tyring,2000).
Os HPV podem ser classificados em vários tipos de acordo com alguns critérios,
por exemplo, seu tropismo, potencial oncogênico e classificação filogenética com base
na homologia de suas seqüências de DNA (de Villiers et al.,2004; Bernard et al.,2010).
Atualmente mais de 100 tipos já foram identificados, sendo que cerca de 40 estão
relacionados às infecções ano-genitais (Munoz et al.,2003; de Villiers et al.,2004; Smith
et al.,2007; Smith et al.,2009).
Em 2004, o HPV foi classificado em 16 gêneros
distintos, sendo sua nomenclatura representada por letras do alfabeto Grego, de “alfa” a
“pi”. Em 2009, vinte e nove gêneros de HPVs já haviam sido descritos, havendo a
necessidade de se acrescentar o prefixo “dyo” antes da letra grega correspondente, para
se contemplar os “excedentes”. Os HPVs humanos foram distribuídos em cinco gêneros
(Alpha, Beta, Gama, Mu e Nu), sendo os HPV 6, 11, 16 e 18 pertencentes ao gênero
Alphapapillomavirus (de Villiers et al.,2004; Frazer et al.,2006; Bernard et al.,2010).
Os demais HPVs humanos de interesse clínico se encontram inseridos nos gêneros
Beta- e Gammapapillomavirus. Para se classificar um HPV como um novo genótipo é
necessário que a sequência da proteína estrutural da região L1 difere entre si num
percentual de 10%, enquanto subtipos de 10 a 2% e, as variantes menos de 2% (de
Villiers et al.,2004; Bernard et al.,2010).
Em relação ao risco oncogênico, os HPVs pertencentes ao gênero
alphapapillomavirus podem ser classificados em grupos de baixo e alto risco
oncogênico (Walboomers et al.,1999; Silva,2003; Souto et al.,2005; Smith et al.,2007).
21
HPV considerados de baixo risco oncogênico, associados aos condilomas acuminados,
são representados principalmente pelos tipos 6, 11, 40, 42, 43, 54, 61,70, 72, 81. Já os
de alto risco oncogênico, por estarem frequentemente associados às lesões precursoras
de câncer, às neoplasias invasoras e aos tumores anogenitais, são representados pelos
tipos 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59,68, 73 e 82 (Munoz et al.,2003; de
Villiers et al.,2004; Frazer et al.,2006; Bleeker et al.,2009).
2.2 EPIDEMIOLOGIA E CURSO CLÍNICO DA INFECÇÃO
Estima-se que 75% da população feminina foi ou será infectada pelo HPV
durante a vida, sendo esta infecção a mais comum doença sexualmente transmissível
(DST) do mundo (Weinstock et al.,2004).
Apesar das infecções pelo HPV serem muito frequentes, a maioria dos pacientes
acometidos consegue clarear ou debelar a infecção através da ação do sistema
imunológico, sem nenhum desenvolvimento de doença, num período médio de dois
anos (Frazer et al.,2006; Moscicki et al.,2006). Por outro lado, alguns pacientes
desenvolvem infecção persistente, situação que pode induzir à proliferação celular
epitelial indefinida, podendo, sob ação de co-fatores, levar ao desenvolvimento de
neoplasias e câncer (Frazer et al.,2006).
O HPV depende da maquinaria celular do hospedeiro para se multiplicar. As
micro-fissuras genitais causadas pelo coito permitem o acesso do HPV às células da
camada basal de pele ou mucosas (Souto et al.,2005). A característica de replicação
contínua das células da camada basal para formar células do epitélio colunar (mucosas)
ou estratificado (pele) favorece a proliferação do HPV. Após a entrada do vírus na
célula, pode ocorrer a integração de seu material genético no DNA celular, dando início
à produção das proteínas virais precoces. Em alguns casos, o HPV pode manter um
baixo número de cópias de seu genoma, sob a forma epissomal, nas células da camada
proliferativa basal. Nestas situações, nota-se um baixo nível de expressão dos genes E1,
E2, E6, E7, porém ainda suficiente para a manutenção genômica do vírus. Por outro
lado, quando ocorre a integração viral, as proteínas codificadas pelos genes E1 e E2
iniciam o processo de replicação do DNA do HPV. O gene E3 não é expresso em
humanos. Os genes E4 e E5 estão ligados à maturação viral e provavelmente à formação
de proteínas de membrana com atividade transformadora fraca. A proteína do gene E4
leva ao colapso da rede de citoqueratina, epigeneticamente representada pela alteração
perinuclear típica do HPV, chamada de coilocitose. Os genes E6 e E7 codificam
22
proteínas que interferem no funcionamento adequado das vias de supressão tumoral dos
genes supressores de tumor p53 e do retinoblastoma (Rb), respectivamente (Fehrmann
Laimins,2003; Kanodia et al.,2007). Posteriormente as proteínas codificadas por genes
virais tardios L1 e L2 formam o nucleocapsídeo viral. O ciclo de replicação dura cerca
de três semanas entre a infecção e a liberação de novos vírus, que é o tempo que um
queratinócito leva para se diferenciar e descamar. Este processo não gera citólise ou
inflamação, o que dificulta a ativação do sistema imunológico do hospedeiro. A
infecção pelo HPV ocorre exclusivamente em ambiente intracelular, exigindo que sua
presença seja reconhecida por células apresentadoras de antígeno (APC) do epitélio,
denominadas células de Langerhans. Cabe às células dendríticas do estroma, ativar a
imunidade celular (células T), após terem sido estimuladas por partículas virais do HPV
(Stanley et al.,2007).
2.3 DIAGNÓSTICO DE INFECÇÃO POR HPV
A infecção por HPV nem sempre é detectável clinicamente. Alguns pacientes
podem apresentar pequenas áreas de vermelhidão do epitélio, enquanto outros
desenvolvem verrugas na pele e/ou em mucosas (Cubilla et al.,2004; Krustrup et
al.,2009).
A proteína viral codificada pelo gene E4 leva ao colapso da rede de
citoqueratina, representada pelo halo claro perinuclear, chamado de coilocitose. Na
histologia, este achado é frequentemente interpretado como decorrente de ação do HPV
(de Paula et al.,2007; Ornellas et al.,2008b; Krustrup et al.,2009). O HPV não cresce em
culturas celulares e o diagnóstico sorológico é impreciso, por ser difícil distinguir entre
infecção recente, presente ou passada. O diagnóstico molecular do HPV pode ser
realizado por várias técnicas, sendo importante também a determinação dos genótipos
virais (genotipagem).
As diferentes taxas de prevalência de HPV reportadas podem ser influenciadas
por fatores como: coleta da amostra, tipo do espécime clínico a ser examinados
(citologia ou biópsia), maneira e tempo de armazenamento deste material (suspensão,
esfregaço, criopreservação, parafinização) e, finalmente, à escolha da técnica
laboratorial a ser empregada. Todos estes fatores podem influenciar na extração do
DNA. A análise da integridade do material genético deve ser atestada por amplificação
de genes constitutivos como beta-globina ou de gliceraldeíno 3-fosfato desidrogenase
(GAPDH), antes de se partir para a detecção do DNA-HPV.
23
2.3.1 TÉCNICAS LABORATORIAIS DE DIAGNÓSTICO E GENOTIPAGEM DE
HPV
Hibridização in situ
Através da hibridização de pequenos segmentos de RNA ou DNA esta técnica é
capaz de identificar o DNA do HPV em células. A hibidização in situ é complementar à
citologia e utiliza vários probes (sondas) com seqüências já conhecidas para hibridizar,
especificamente, com o DNA-HPV intracelular. Sua sensibilidade é de cerca de 70%,
devido à presença de pequenas quantidades do DNA viral em cada célula, ficando
aquém da reação em cadeia da polimerase (PCR) (Birner et al.,2001). Com uma
especificidade de 63%, para genotipagem ainda é necessário o uso de múltiplas sondas
tipo-específicos (Molijn et al.,2005).
Hibridização por Southern Blotting
O DNA da amostra é digerido por meio de enzimas de restrição e os fragmentos
gerados são separados por eletroforese em um gel de agarose. Os fragmentos de DNA
são visualizados depois de corados com brometo de etídio. Utilizando-se solução salina,
estes fragmentos são então transferidos para uma membrana de nitrocelulose ou náilon
por capilaridade (Stamey et al.,2003). Apesar de trabalhosa e inadequada para detecções
amplas, esta técnica possui alta sensibilidade e especificidade (Molijn et al.,2005).
Captura híbrida
Técnica automatizada de marcação em laboratório, que utiliza um método de
amplificação de sinal não-radioativo, tendo como base híbridos de DNA-HPV que se
ligam a probes de RNA tipo-específicos. Estes híbridos são colocados em microtubos,
onde recebem anticorpos monoclonais em um substrato quimioluminescente, que os
identificam. A leitura semi-quantitativa é então feita para determinar a quantidade de
DNA-HPV presente (Bozzetti et al.,2000). As limitações deste método são: 1-A
existência de coquetéis para diagnóstico de HPVs de alto ou baixo risco não permite
distinguir qual ou quais tipos de HPV estão presentes; 2-Sensibilidade reduzida devido
ao limite de detecção de 5000 equivalentes genômicos; 3-Risco de reação cruzada entre
coquetel de HPV de alto e baixo risco (Castle et al.,2004).
24
Captura Híbrida 2
Apresenta sensibilidade superior a hibridização in situ e similar a técnica de PCR,
ambas acima de 97% (Molijn et al.,2005; Stillman et al.,2009). Existem dois kits já
aprovados para uso nos Estados Unidos, sendo o Hybrid Capture Tube e o Hybrid
Capture 2, ambos detectam 13 tipos de HPV de alto risco (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51,
52, 56, 58, 59 e 68).
Reação em cadeia da polimerase (PCR)
Para melhorar a sensibilidade diagnóstica, outras técnicas, envolvendo
multiplicação do material genético viral, foram desenvolvidas. Entre estas, a reação em
cadeia da polimerase (PCR) foi a mais difundida. A PCR amplifica o número de cópias
do DNA-HPV, antes da adição de anticorpos marcados (corados) para se identificar
oligonucleotídeos iniciadores (primers) de uma sequência genética específica. A PCR
pode identificar um ou mais HPVs, dependendo do(s) primer(s) em questão.
PCR tipo específica
Utiliza apenas um tipo de sonda e, assim, amplifica apenas um genótipo de HPV.
Trata-se de técnica trabalhosa, dispendiosa, e cada primer usado necessita ser validado.
PCR de largo espectro
Existem basicamente 3 tipos de sondas para PCRs de detecção de HPVs de largo
espectro: 1-O primeiro emprega 2 primers sendo um no sentido senso e outro antisenso, tendo como alvo uma região genômica conservada, em baixa temperatura de
anelamento (Ex: GP5+/GP6+); 2-PCR c/ primers semelhantes ao primeiro tipo, porém
contendo degenerações, o que não exige baixa temperatura de anelamento (Ex:
My09/11); 3-PCR com vários primers senso e anti-senso, todos com o mesmo alvo do
genoma viral (Ex: PGMY e SPF10) (Molijn et al.,2005). Os resultados das PCRs
dependem do tamanho do fragmento alvo a ser amplificado (quanto menor o fragmento,
mais fácil a amplificação), uma vez em que os espécimes parafinados tendem a fornecer
DNA degradado.
PCR em tempo real
A PCR em tempo real também pode ser usada, tanto para a detecção e
genotipagem do HPV, quanto para a determinação, em tempo real, do número de cópias
de híbridos de DNA presentes na amostra. A necessidade de se usar uma mistura de
sondas e iniciadores gera dificuldades na sua padronização.
PCR por transcriptase reversa (RT-PCR)
25
Também é possível buscar por RNA viral ao se empregar a transcriptase reversa
na fase que antecede a amplificação da PCR. Esta técnica, denominada RT-PCR,
permite avaliar a expressão dos oncogenes do HPV. Teoricamente, quanto maior a
expressão de E6/E7, maior a gravidade da lesão (Lamarcq et al.,2002). Esta técnica
permite a avaliação da integração do material genético viral nas células do hospedeiro,
ao se estabelecer a relação entre as proteínas virais E2 e E6/E7.
Hibridização reversa em pontos
A tecnologia de hibridização reversa possibilita a genotipagem de múltiplos tipos
de HPV ao mesmo tempo. O line probe assay (LiPA) utiliza uma tira de membrana
contendo várias sondas imobilizadas como linhas paralelas. Outras variantes são o Line
Blot Assay (LBA) e o Linear Array (LA) (Gravitt et al.,2003; Molijn et al.,2005). Este
último pode identificar mais de 35 tipos de HPV ao mesmo tempo, embora exija
material a fresco ou criopreservado (Siriaunkgul et al.,2008).
A hibridização reversa permite hibridizar, simultaneamente, um produto da
PCR (em fase líquida) com múltiplos oligonucleotídeos iniciadores biotinilados em fase
sólida. Após a hibridação, faz-se a leitura da tira de membrana, através da observação
de uma linha corada por um conjugado de estreptavidina e um substrato, correspondente
à seqüência em questão. Esta tecnologia possibilita a detecção de múltiplos tipos de
HPV com elevada precisão e em uma etapa única (Gravitt et al.,2003; Molijn et
al.,2005).
2.4 PREVENÇÃO E CONTROLE DE INFECÇÃO POR HPV
O papilomavírus humano causa uma das infecções sexualmente transmissíveis
mais comuns em todo o mundo.
A exposição ao HPV, tipicamente produz uma
infecção que pode evoluir para um processo clinicamente aparente, como verrugas
genitais e lesões cervicais do trato genital inferior. Embora a maioria das infecções por
este vírus é transitória, resolvendo espontaneamente dentro de dois anos, algumas
envolvendo HPV de alto risco persistem e são considerados precursores do câncer
cervical (Giraldo et al.,2008; Juckett Hartman-Adams,2010). O homem é um
reservatório natural do vírus, contudo, o papel carcinogênico do HPV na população
masculina é menos relevante para a maioria dos tumores. Já na mulher, o HPV é um
carcinógeno essencial para o desenvolvimento do câncer de colo uterino, embora
também possa causar grandes transtornos através de lesões benignas como as verrugas
26
genitais (Cogliano et al.,2005). O impacto do diagnóstico de HPV extrapola o âmbito
clínico, podendo resultar em trauma psíquico, por ser uma doença sexualmente
transmissível, podendo promover interferências em relacionamentos conjugais presentes
e futuros (Harper,2004).
A prevenção primária contra o HPV deve envolver programas de orientação à
comunidade, como: incentivo ao uso de preservativos e hábitos de higiene, redução do
número de parceiros sexuais e de vacinação em massa de populações alvo (Svare et
al.,2002). O uso de preservativos parece não alterar o risco de infecção por HPV, mas
reduz o risco de desenvolver a doença (Manhart Koutsky,2002). Alguns estudos
sugerem que não há benefício em vacinar homens contra HPV, embora países como
Itália, Austrália e o Reino Unido a incluíram no calendário vacinal (Kim et al.,2007;
Stanley,2007; Kim Goldie,2009). A população com maior recomendação é a feminina
de 9 a 26 anos, antes de iniciar a atividade sexual (Stanley,2007). A vacinação contra o
HPV seria o meio mais eficaz de previnir lesões pré-malígnas e o câncer cervical
(Harper,2004; Villa et al.,2005). Atualmente o mercado dispõe duas vacinas
profiláticas, uma bivalente contra os HPVs 16 e 18, e a outra, quadrivalente, contra estes
acrescidos do 6 e 11 (Harper,2004; Villa et al.,2005; Stanley,2007; Chang et al.,2009).
A sustentação da resposta biológica é em torno de 90 a 100%, para os tipos citados,
além de haver evidências de proteção cruzada para outros tipos (Garland et al.,2007;
Joura et al.,2007; Ault et al.,2011). Os títulos de anticorpos encontrados em populações
vacinais também são muito superiores aos títulos da infecção natural pelo HPV (Harper
et al.,2006). Todavia, todos os resultados vacinais publicados são referentes à proteção
de lesões de colo de útero e vagina, incluindo a prevenção de verrugais genitais.
O tratamento das lesões benignas associadas ao HPV pode envolver a ressecção
cirúrgica ou a ablação por laser, crioterapia ou eletrocautério. As terapias adjuvantes,
que visam reduzir o risco de recorrência da doença, são ancoradas em imunomodulação
(interferon alfa-2a e imidazoquinolinas), em agentes antiproliferativos (podofilina, 5Fluorouracil, bleomicina), em terapia fotodinâmica ou no uso de anti-virais (aciclovir,
ribavirina, cidofuvir) (Snoeck,2006).
Apesar do elevado índice de prevalência de HPVs de alto risco entre pessoas
sexualmente ativas, poucas pessoas desenvolvem doenças anogenitais malígnas ou prémalígnas (Frazer et al.,2006). A maioria das infecções por HPVs é eliminada, via
sistema imunológico, por um processo denominado clareamento. Apenas as infecções
persistentes parecem aumentar o risco de desenvolvimento de tumores.
27
2.5 EPIDEMIOLOGIA DO HPV EM CARCINOMA PENIANO
O HPV está associado ao desenvolvimento de vários tipos de câncer de cabeça e
pescoço, anal, vulvar e colo uterino ((Moore et al.,2001; Mork et al.,2001; Bjorge et
al.,2002; Rabelo-Santos et al.,2003; Boccardo,2004; Parkin Bray,2006; Bosch et
al.,2009). A relação entre câncer cervical e a infecção por HPV do tipo oncogênico já
esta bem estabelecida, através de técnicas de biologia molecular, em que se consegue
detectar DNA do HPV em 92,9% a 99,7% dos espécimes invasivos analisados
(Walboomers et al.,1999; Munoz et al.,2003; Bosch et al.,2008). Por outro lado, a
analogia do CP com o câncer de colo é frequente, porém equivocada. Apesar de ambos
apresentarem a histologia epitelial escamosa, enquanto a prevalência de HPV no câncer
cervical é aproximadamente 100%, no CP ela fica em torno de 50% (Walboomers et
al.,1999; Dillner et al.,2000b; Moore et al.,2001; Castellsague et al.,2002; Munoz et
al.,2003; Backes et al.,2009; Miralles-Guri,2009). Apenas um estudo analisando 216
pacientes com CP, utilizando PCR em tempo real, mostrou uma prevalência mais
elevada de DNA-HPV (83%). Apesar disso, os autores não encontraram relação
prognóstica com a presença viral (Kirrander et al.,2010). A melhor analogia de
comportamento biológico e relacionado ao HPV se faz entre o CP e o câncer de vulva
(Iwasawa et al.,1997; Rubin et al.,2001).
Até o momento existem quatro revisões literárias sobre prevalência de HPV em
indivíduos com carcinoma peniano. De acordo com estas revisões, no período de 1966 a
2008, a prevalência média de HPV em CP invasor variou de 30 a 50% (Dillner et
al.,2000a; Carvalho et al.,2007; Backes et al.,2009; Miralles-Guri,2009). Segundo uma
meta-análise sobre associação de HPV com CP em que foram selecionados 39 artigos, a
detecção de DNA-HPV, realizada pela técnica de PCR, exibe prevalência em torno de
57%, sendo o HPV 16 o mais comum (88.4%) (Carvalho,2010). De acordo com os
dados da meta-análise há uma relação significativa entre HPV 16 e câncer de pênis. A
correlação de HPV com o CP depende do tipo histológico e do nível de invasão. O
carcinoma basalóide, a neoplasia intraepitelial do pênis (NIP) e o carcinoma in situ
podem estar associados ao HPV de alto risco em 80-100% dos casos (Malek et al.,1993;
Rubin et al.,2001; Heideman et al.,2007; Miralles-Guri,2009; Cubilla et al.,2010). Já o
28
carcinoma verrucoso se associa aos HPVs 6 em 11 (baixo risco) em mais de 70% dos
casos (Cubilla et al.,2001; Cubilla et al.,2004; Lallemand et al.,2005; Bleeker et
al.,2009).
A importância do HPV na gênese do câncer de pênis não está ainda bem
estabelecida, sendo o percentual de detecção do vírus em carcinoma invasor, de 30 a
60%, segundo vários autores (Tabela I). A prevalência do HPV em homens sadios varia
de 8 a 30% (Giuliano et al.,2008). Supostamente este número é ainda maior e crescente,
se considerarmos o potencial de transmissão viral e a mudança global de
comportamento humano, favorecendo a promiscuidade sexual.
Tabela I- Prevalência de DNA-HPV em pacientes com CP em diferentes países no
período de 1995 a 2010.
Autores
Ano
País/Região
n
HPV(%)
HPV 16
Gregoire et al
1995
EUA/Paraguai
117
22.2
88.5
Picconi et al
2000
Argentina
38
71
81
Rubin et al
2001
EUA/Paraguai
142
42.2
63.3
Zhang et al
2001
China
19
10
---
Ferreux et al
2003
Holanda
53
38
75
Daling et al
2005
EUA
94
79.8
69.2
Semba et al
2006
Tailandia
65
81.5
1.8
Lont et al
2006
Holanda
171
29
76
Heideman et al
2007
Holanda
83
55
52
Pascual et al
2007
Espanha
65
77.5
84.2
Torsenello et al
2008
Itália
41
46.3
94.7
Prowse et al
2008
Inglaterra
26
54
42.3
Krustrup et al
2009
Dinamarca
116
52
91
Kirrander et al
2010
Suécia
216
82.9
63
Cubilla et al
2010
Paraguai
202
32
71.8
No Brasil, os estudos realizados em paciente com CP verificaram uma
prevalência de HPV variando de 30% a 72% (Tabela II).
29
Tabela II- Prevalência de DNA-HPV em pacientes com CP no Brasil no período de
1998 a 2008.
Autores
Ano
Região
n
HPV(%)
HPV 16
Levi et al
1998
SP
84
56
57.1
Gil et al
2001
SP
55
30.9
58.8
Bezerra et al
2001
SP
82
30.5
52
Neves et al
2002
DF
59
40.6
100
Scheiner et al
2008
RJ
80
72.5
20.6
Mendanha Sousa
2008
GO
29
34.5
100
Em Goiânia-GO existem dois estudos sobre a prevalência de DNA- HPV em
homens. Silva Reis conduziu uma investigação em 100 homens sem evidência clínica
de infecção e verificou uma positividade de 23% de DNA-HPV nesses pacientes sendo
que 73,9% tinham HPV 16 e 18 (Reis,2005). Mendanha Sousa encontrou 34,5% de
prevalência de DNA-HPV em 29 casos de carcinoma peniano, utilizando amostras criopreservadas.. Neste estudo, 100% das amostras positivas para HPV eram HPV 16 e 60%
das amostras evidenciaram co-infecção com outros tipos (Mendanha Sousa,2008).
2.6 O HPV COMO PREDITOR DE METÁSTASE INGUINAL E DE
SOBREVIDA
Vários artigos têm mostrado a relação da infecção pelo HPV e CP, sendo este
vírus considerado um cofator no processo da oncogênese desta neoplasia (Rubin et
al.,2001; Ferreux et al.,2003; Scheiner et al.,2008). Por outro lado, a influência da
infecção pelo HPV no risco de metástase inguinal e na sobrevida dos pacientes ainda
não foi bem elucidado. Existem poucos estudos abordando o tema, com métodos
diversos de detecção viral, sendo todos retrospectivos. A Tabela III mostra alguns
destes estudos, e há controvérsia entre os resultados. Alguns autores sugerem que a
simples presença de HPV não teria relevância prognostica, porém o HPV 16 estaria
associado a um elevado risco de metástase inguinal e de óbito por CP (McCance et al.
30
1986; Levi et al. 1998; Bezerra et al. 2001; Rubin et al. 2001; Moore et al. 2001; Lont et
al. 2006; Heideman et al. 2007; Yanagawa et al. 2008; Scheiner et al. 2008).
Tabela III- Relação do HPV e risco de metástase inguinal e de óbito por câncer.
Autores
Método
n/ % de HPV
Risco N+
SCE
Gil et al, 2001
PCR
55/30,9
----
Pior*
Gregoire et al, 1995
PCR
117/22,2
Inalterado
Inalterada
Bezerra et al, 2001
PCR
82/30,5
Inalterado
Inalterada
Scheiner et al, 2008
PCR
80/72,5
Inalterado
Inalterada
Lont et al, 2006
PCR
171/29**
Inalterado
Melhor
Wiener et al, 1992
PCR
29/31
Inalterado
Inalterada
Kirrander et al, 2010
PCR
216/82,9
Inalterado
Inalterada
SCE- sobrevida câncer específica; *Apenas para HPV 16; ** HPV de alto risco; Risco N+= risco de
metástase inguinal oculta
A explicação para a não concordância entre os estudos se deve a diversidade dos
métodos de detecção viral e ao desenho (retrospectivo) dos estudos. Gil e colaboradores,
em uma coorte retrospectiva envolvendo 55 pacientes com CP, observaram que a
presença do HPV 16 aumentou mais de sete vezes o risco de óbito em pacientes com
essa neoplasia CP (Gil et al.,2001). A presença de um halo claro peri-nuclear é uma
alteração morfológica denominada de coilocitose que pode indicar infecção por HPV
em cerca de 60% das vezes (Backes et al.,2009). Três estudos avaliaram a presença da
coilocitose em pacientes com CP. Ornellas e colaboradores, estudando 196 pacientes,
verificaram a presença dessa alteração em 40,8% e, foi associada ao menor risco de
metástase inguinal e morte por câncer nesses indivíduos (Ornellas et al.,1994). Lopes e
colaboradores em outra série com 145 pacientes com CP, encontraram 44,8% de
coilocitose em uma população semelhante, porém sem impacto prognóstico (Lopes et
al. 1996). Em outra investigação, conduzida em 144 pacientes, essa alteração foi
verificada em 63% dos portadores de CP, também sem impacto no risco de metástase ou
morte por CP (de Paula et al.,2007).
Apenas dois estudos usando técnica molecular avaliaram associação entre a
presença de DNA-HPV e prognóstico em CP. O primeiro estudo, de Bezerra e
colaboradores, envolveu 82 pacientes e a presença do vírus não alterou o prognóstico
31
(Bezerra et al.,2001). Na outra investigação, com 171 portadores de CP, Lont e
colaboradores notaram que a presença de HPV de alto risco conferia melhor sobrevida
câncer-específica. Os autores não observaram impacto da presença de HPV no risco de
metástase inguinal e também não souberam explicar a vantagem de sobrevida observada
entre os pacientes infectados pelo vírus (Lont et al.,2006).
3 CICLOOXIGENASE-2 E CÂNCER
Desde 1863 Virchow elaborou a hipótese de que o câncer se originava em áreas
de inflamação crônica (Balkwill Mantovani,2001). Sabe-se que cerca de 15% dos
cânceres são originados por agentes infecciosos que promovem inflamação crônica
(Kuper et al.,2000). Geralmente o processo inflamatório reparador é auto-limitado pela
produção de citocinas antiinflamatórias na fase final de reparação. A carcinogênese
gerada pelo processo inflamatório crônico (Eschwege et al.,2001) é complexa e envolve
a participação de outros inibidores da apoptose e de angiogênese como citocinas,
interleucinas e fator de necrose tumoral. Os macrófagos associados a tumor (TAM),
depois de ativados pela IL-2, destroem células neoplásicas mas também produzem
vários fatores de crescimento angiogênicos e linfangiogênicos, além de citocinas e
proteases (Brigati et al.,2002). As células tumorais, contribuídas por TAM, produzem
IL-10 que inibe o processo antitumoral mediado por linfócitos T. Os TAMs também
produzem fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF) dos tipos VEGF-C,
VEGF-D e receptores deste fator (VEGFR) do tipo VEGFR-3, que potencializam a
proliferação
de
vasos
sanguíneos
e
linfáticos
(Schoppmann
et
al.,2002).
Resumidamente, os fosfolípides de membrana são convertidos em ácido aracdônico por
ação de fosfolipase A2. O ácido aracdônico, por ação de ciclooxigenase (Frazer et.al,
2006) 1 e 2, é convertido em prostaglandina. A PGE2 estimula a produção de VEGF e,
conseqüentemente, da angiogênese. A PGE2 também ativa fibroblastos estromais, que
produzem fator de crescimento de hepatócitos, estimulando o aumento da COX-2
(Fosslien,2001). A Figura 1 representa o mecanismo de angiogênese induzida pelo
câncer.
As ciclooxigenases (COXs) são enzimas regulatórias da família das
mieloperoxidases que tem como produto primário as prostaglandinas (PGs). As PGs são
mediadores fisiológicos e patofisiológicos de entidades como febre, dor, inflamação,
trombose, vasomotilidade e função renal. As PGs promovem a angiogênese, que é um
dos fenômenos necessários para o crescimento tumoral e para o desenvolvimento de
32
metástases (Suh,2000). A prostaglandina E2 (PGE2) induz a produção de VEGF e a
expressão de metaloproteinases, além de suprimir a imunidade celular e humoral
(Eschwege et al.,2001; Sheng et al.,2001). A COX-1 é encontrada em vários tecidos,
mas a COX-2 nunca é expressa em condições normais.
O gene que regula a produção da COX-2 está localizado no cromossomo 1
(1q25.2-25.3), cuja transcrição é ativada por meio de várias situações como inflamação,
infecção e câncer. O controle da transcrição ocorre por metilação e mecanismos póstranscripcionais. Vários oncogenes e fatores de crescimento podem induzir expressão de
COX-2. As COXs são abundantemente encontradas no retículo endoplasmático e
núcleo. A COX-2 está envolvida na oncogênese através da estimulação da proliferação
celular, angiogênese, redução da apoptose e interferência imunológica (inibe gênese de
linfócitos T e da atividade citotóxica dos linfócitos natural killers (NK) (Fosslien,2000).
A COX-2 também induz a produção de metaloproteinases e de moléculas de adesão,
contribuindo assim para o processo de metastatização (Price et al.,1997; John
Tuszynski,2001). A COX-2 encontra-se hiper-expressa em tumores de mama, cólon,
rim, colo uterino e pulmão (Fosslien,2000; Tomozawa et al.,2000; Gaffney et al.,2001;
Slaton et al.,2001; Sun et al.,2002; Tang et al.,2002), sendo às vezes considerada como
fator de mau prognóstico (Madaan et al.,2000; Tomozawa et al.,2000; Gaffney et
al.,2001).
Melatonina
Hipóxia
Angiogênese
Tumoral
Figura 1- Mecanismo de angiogênese tumoral. (Com permissão da Annals of Clinical &
Laboratory Science; Fosslein et al 2001)
33
A proteína p53 inibe a expressão de COX-2, mas estimula a expressão de
trombospondina-1 (TSP-1) (Cinatl et al.,1999). Existe apenas um trabalho publicado
sobre COX-2 e carcinoma peniano. Em 2003, Golijanin e colaboradores estudaram sete
casos de CP no Memorial Sloan-Kettering de Nova Iorque. Os autores observaram que
COX-2 e PGE-2 encontravam-se hiperexpressas em 100% dos casos de carcinoma
invasor do pênis e pouco expressas em amostras de tecido peniano normal e carcinoma
in situ. Os autores sugeriram a realização de estudos que avaliem a ação de antiinflamatórios não hormonais (AINH) neste tipo de câncer (Golijanin et al.,2004).
4 VEGF E CÂNCER
Desde meados de 1970 se descobriu que os tumores maiores que 2 mm de
diâmetro dependem da proliferação de novos vasos sanguíneos para progredir (Folkman
et al.,1971). O processo carcinogênico leva à proliferação de capilares no estroma
tumoral, a partir de células endoteliais do hospedeiro, mantendo assim a oxigenação e
nutrição tecidual adequadas,. Este processo, denomindo angiogênese, é induzido pela
expressão de VEGF e de seus receptores (Li et al. 2001). O
processo
angiogênico
também envolve a vasodilatação, o aumento da permeabilidade vascular, a degradação
da membrana basal por metaloproteinases, a redução da adesão celular pela ativação do
plasminogênio, a formação de cordões endoteliais e o recrutamento de células
paraendoteliais (Hoeben et al.,2004; Roy et al.,2006).
O fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF) constitui um grupo de
glicoproteínas composto pelos fatores VEGF-A, B, C, D, E e F, além do fator de
crescimento placentário (PGF). Todos eles possuem homologia em uma parte estrutural
chamada de domínio. O VEGF-A, também chamado apenas de VEGF, é o mais
compreendido. O gene que codifica esta família de proteínas está localizado no
cromossomo 6 (6p12) (Wei et al.,1996). A transcrição deste gene é influenciada por
citocinas e outros fatores de crescimento como o fator ligado ao endotélio (EGF), fator
derivado de plaquetas (PDGF), fator de necrose tumoral (TNF-alfa), fator ligado ao
hepatócito (HGF) e a interleucina-1 (IL-1) (Wissmann Detmar,2006). Nas células
endoteliais o VEGF se liga a receptores de membrana, do tipo tirosina-quinase,
induzindo à angiogênese. Existem diferentes receptores de VEGF, cada um ativando
vias diversas de sinalização intracelular, sendo: VEGFR-1 (Flt-1), VEGF-2 (fetal liver
34
kinase-1, Flk-1 ou KDR) e VEGFR-3 (Flt-4). Os receptores 1 e 2 estão,
preferencialmente, nas células endoteliais vasculares e o VEGFR-3 no endotélio
vascular linfático. O VEGFR-3 é específico para o VEGF-C e D. O VEGF-A também
pode induzir a linfangiogênese ligando-se no VEGFR-2. Alguns estudos mostram
correlação entre a expressão de VEGF-C e D com maior risco de metástases
linfonodais, sendo estes marcadores frequentemente encontrados em células tumorais
(Su et al.,2007; Ke-liang,2008; Bolenz et al.,2009). Outros estudos também associam o
aumento de VEGF a um pior prognóstico no câncer gástrico, de cólon e reto, de mama,
ginecológico, renal e de próstata (Maeda et al.,1996; Gasparini,2000; Lee et al.,2000; Su
et al.,2007; Bolenz et al.,2009).
Alguns estudos utilizaram a densidade microvascular (DMV) para avaliar a
angiogênese e encontraram correlação com progressão tumoral e maior risco de
metástases (Maeda et al.,1996; Vermeulen et al.,2002). A imunoistoquímica (IHQ) é
capaz de identificar “áreas quentes” (hot-spots) que são regiões de microcirculação não
identificáveis à microscopia convencional. Alguns anticorpos utilizados são o antiCD31, anti-CD34, anti-CD105 e anti-fator VIII (Vermeulen et al.,2002). Apesar de
atrativo, o método de avaliação de DMV é controverso por falta de concordância entre
avaliadores, também contribuído por diferentes padrões de marcação de acordo com o
anticorpo utilizado. A redução da subjetividade pode ser obtida através da imagenética,
em que as imagens digitalizadas são avaliadas por softwares de computador (Tarta et
al.,2004). Alguns estudos não encontraram correlação de DMV com pior prognóstico
oncológico (Tanigawa et al.,1997; Kido et al.,2001).
O processo oncogênico interrompe o equilíbrio entre fatores angiogênicos e antiangiogênicos que equalizam a expressão de VEGF, resultando em aumento da
angiogênese. A TSP-1 inibe a expressão de VEGF, sendo, portanto, anti-angiogênica. A
proteína p53 selvagem estimula a TSP-1 exercendo controle negativo da angiogênese.
Os HPVs 16 e 18 parecem estar associados à maior angiogênese em portadoras de
câncer de colo uterino (Nair et al.,1999). A Figura 2 mostra a relação entre a proteína
E6 de HPV de alto risco e alguns fatores moleculares.
35
Proteína
E6 do
HPV
ANGIOGÊNESE
Proteólise
AINH
APOPTOSE
Ácido Aracdônico
Figura 2- Relação entre HPV, fatores moleculares e angiogênese. (Com permissão da
Annals of Clinical & Laboratory Science; Fosslein et al 2001)
A proteína E6 do HPV estimula o gene do VEGF através da inativação da p53, o
que leva um aumento do COX-2 e, conseqüentemente, deixa de estimular a TSP-1.
(Lopez-Ocejo et al.,2000; Tang et al.,2007). A alta expressão de COX-2, VEGF e
metaloproteinase e a baixa expressão de TSP-1 estão associadas com a alta densidade
microvascular tumoral (DMT), que é um fator de mau prognóstico em tumores
malignos (Maeda et al.,1996; Lee et al.,2000; Seo et al.,2000). Em um estudo de 2002,
Martins e colaboradores avaliaram a imunoexpressão de VEGF em 47 pacientes com
CP e não acharam associação entre VEGF com grau e tamanho tumoral ou com
desenvolvimento de metástase inguinal (Martins et al.,2002b). Em outra investigação
em 44 pacientes com CP na China, também não foi observada associação entre grau e
tamanho tumoral e VEGF, porém houve correlação entre VEGF e metástase inguinal
(Ke-liang,2008). Até o momento, desconhecemos algum estudo que avalie o VEGF e a
COX-2 em conjunto no carcinoma peniano.
36
5
A IMPORTÂNCIA DE COX-2 E VEGF-C COMO ALVOS DE NOVAS
TERAPÊUTICAS DO CÂNCER
5.1 Terapia anti-COX-2
O processo inflamatório é frequentemente associado ao câncer e é tido como
componente crítico para a progressão tumoral. As moléculas sinalizadoras do sistema
imune inato (selectinas, citocinas) parecem ser essenciais para a invasão tumoral e para
o desenvolvimento de metástases. Nos tumores o processo inflamatório é perpetualizado
devido à presença de fatores indutores da carcinogênese ou devido à falha dos
mecanismos inibidores da resposta inflamatória. Logo, em qualquer destas situações, o
processo inflamatório representa um alvo terapêutico interessante no tratamento
oncológico (Coussens Werb,2002). A COX-2 é possui um papel prognóstico já
estabelecido em vários tumores, mas pode também ser importante tanto na prevenção
como no tratamento de alguns tipos de câncer. As maiores evidências do papel
antitumoral dos anti-inflamatórios não-hormonais (AINH) advêm de largos estudos
envolvendo usuários crônicos de ácido acetil salicílico (AAS), também conhecido como
aspirina. Os dados mostram uma proteção de cerca de 50% na ocorrência de câncer de
cólon, além de potencial de prevenção contra câncer de esôfago, pulmão e estômago
(Baron Sandler,2000; Madaan et al.,2000; Friis et al.,2006; Grau et al.,2009).
A COX-2 é inibida por AINH, seletivos ou não. Os AINH inibem a COX-1 e
COX-2, mas há inibidores seletivos de COX-2. A aspirina não é seletiva para COX e
também inibe a inflamação induzida por plaquetas através da redução da produção de
PGs, endoperóxidos e tromboxano A2 (Coussens Werb,2002). Mecanismos não ligados
a COX, porém envolvidos na inflamação, também podem inibidos com o uso de AINH.
São eles: a)Indução da apoptose por liberação do citocromo C das mitocôndrias (e
conseqüente ativação das caspases 3 e 9); b)Inibição do fator alfa de necrose tumoral;
c)Inibição de matriz metalo-proteinases (MMP), reduzindo a angiogênese, a migração
de células inflamatórias e ações antiapoptóticas (Coussens Werb,2002).
Há poucos dados que suportem o uso de AINH no tratamento do câncer (Fu et
al.,2004; Sarkar et al.,2007), embora o uso concomitante a agentes quimioterápicos ou
anti-angiogênicos mereça ser avaliado.
37
5.2 Terapia anti-VEGF e anti-VEGF-R
O Projeto Genoma, iniciado em 1989 nos Estados Unidos, identificou mais de
90% do DNA humano. Com isso, foi possível o isolamento de vários genes, permitindo
o melhor entendimento do processo carcinogênico. As informações sobre genes como
receptor 2 de fator de crescimento epidérmico humano (HER-2), Von Hippel-Lindau
(VHL), Birt-Hogg-Dube (BHD), foram usadas para o desenvolvimento de anticorpos
monoclonais (Monoclonal antibodies-MABs) e inibidores de receptores de membrana
do tipo tirosina quinase (NIBs), que mudaram as bases do tratamento oncológico do
câncer de mama, colo-retal, rim e de leucemia no início deste século (Bross et al.,2001;
Ng Cunningham,2004; Harris et al.,2007; Escudier et al.,2008). Estas drogas inibem a
angiogênese, reduzindo a progressão tumoral e, consequentemente, o risco de
metástases à distância. O bloqueio angiogênico pode ser feito diretamente no VEGF, em
seus receptores (VEGF-R) ou através de ambos. Teoricamente, a terapia
antiangiogênica é superior à quimioterapia por atingir células endoteliais geneticamente
estáveis e por ser menos tóxica (drogas alvo-dirigidas). O uso do bevacizumab, que
bloqueia o VEGF, já se mostrou eficaz contra o carcinoma renal metastático (Spiess
Fishman; Kassouf et al.,2007). Atualmente investiga-se o sunitinib, erlotinib, sorefenib,
everolimus, axitinib, pozapanib e tenserolimus como terapias adjuvantes para pacientes
de alto risco de falha sistêmica (Vira et al.,2007; Linehan et al.,2010). Resultados
promissores usando-se erlotinib em associação com quimioterapia para tratamento de
carcinoma escamoso de cabeça e pescoço já foram observados (Cohen et al.,2009).
Como o CP é representado, em sua maioria, por carcinoma escamoso, é possível que
resultados semelhantes possam ser obtidos através de protocolos semelhantes. O uso de
anticorpos monoclonais associado a radio ou quimioterapia, visa um efeito superior ao
obtido com monoterapia, e deve ser melhor avaliado (Arap et al.,1998; Cunningham et
al.,2004; Escudier et al.,2007).
Até o momento não houve nenhum estudo usando-se inibidores de angiogênese
ou de COX-2 no tratamento do CP.
38
6- JUSTIFICATIVA
O carcinoma peniano é uma doença rara, que acomete pacientes com baixo nível
sócio-econômico e cultural, porém ainda considerada um grave problema de saúde
pública. A falta de higiene, contribuída pela persistência de fimose na vida adulta,
promove um ambiente adequado para a carcinogênese deste tumor.
O perfil
epidemiológico do CP não desperta interesse econômico da indústria farmacêutica para
o desenvolvimento de novos fármacos, também corroborado pelo baixo índice de
investigações sobre o tema.
O maior problema do portador de CP, além da lesão primária, é a doença
metastática inguinal, que exige a realização de cirurgias mutilantes na tentativa de se
controlar a enfermidade. Para o médico, o desafio está em selecionar bem o paciente a
ser submetido à linfadenectomia inguinal. A falta de preditores precisos que
identifiquem metástase inguinal clinicamente oculta determina a indicação de um
grande número de cirurgias inguinais desnecessárias, podendo resultar em alta
morbidade para o paciente.
A busca pelo marcador ideal resultou em investigações abordando agentes
biológicos como o papilomavírus humano (HPV), oncogenes (BAX, Bcl-2, Ki-67),
genes supressores (p53, p16, Rb) e promotores de neoangiogênese (VEGF, COX).
A importância do HPV no CP se deve ao modelo representado pelo câncer de
colo uterino, em que este vírus é necessário para a promoção e progressão tumoral.
Como o HPV também se associa a outros carcinomas (cabeça e pescoço, vulva, anogenital), sua investigação no CP pode resultar em avanços no entendimento da
carcinogênese, do prognóstico e tratamento, além de propiciar novas ações
epidemiológicas (vacinas).
O interesse por COX-2 e VEGF-C extrapola a pesquisa de novos preditores de
metástase inguinal no CP, pela existência de drogas que inibem estes agentes
neoangiogênicos e que poderiam representar novas terapêuticas na adjuvância e
neoadjuvância da doença avançada.
39
7- OBJETIVOS
OBJETIVOS GERAIS
Avaliar a expressão de COX-2 e VEGF-C em carcinoma peniano e seu valor
prognóstico e estimar a prevalência e genotipagem de HPV 16 e 18 em portadores desta
neoplasia em Goiânia-GO.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Determinar a prevalência e tipos de HPV na população estudada.
Avaliar a expressão de COX-2 e VEGF-C em relação à metástase inguinal e
sobrevida câncer-específica dos pacientes.
Avaliar a caracterização histopatológica do tumor primário e sua influência no
risco de metástase inguinal e óbito por CP.
Analisar a associação entre os imunomarcadores e as variáveis clínicas e
histopatológicas da lesão primária.
40
8- MATERIAL E MÉTODOS
8.1 POPULAÇÃO DO ESTUDO
Estudo de coorte prospectiva envolvendo pacientes portadores de carcinoma de
pênis (CP) tratados no serviço de Uro-Oncologia do Hospital Araújo Jorge (HAJ) da
Associação de Combate ao Câncer em Goiás (ACCG), no período de janeiro de 2001 a
julho de 2008. Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital
Araújo Jorge (protocolo No 007/2008).
A partir de janeiro de 2001, coletou-se, prospectivamente, dados clínicos e
histopatológicos de todos os pacientes com diagnóstico de CP adimitidos no serviço de
Uro-Oncologia. Um total de 148 pacientes foi tratado pelo serviço de Uro-Oncologia no
período estabelecido. Vinte e um pacientes foram excluídos, sendo quatro por ausência
de bloco de parafina do tumor primário disponível para análise e os demais por terem
recebido tratamento prévio fora do HAJ. Cento e vinte e sete casos obedeciam aos
critérios de inclusão.
Os desfechos de interesse eram a presença ou desenvolvimento de metástase
inguinal e o óbito por CP. Os casos que evoluíram a óbito por complicações de
tratamento ou outra causa, na vigência de CP incurável, foram considerados como óbito
câncer-específico. Para cálculo de sobrevida consideramos a data da cirurgia do tumor
primário (pênis) como inicial. A censura foi aplicada na data da última consulta aos
pacientes vivos e aos mortos por causa não-oncológica e sem CP em atividade.
O tratamento local foi excisão ampla, penectomia parcial ou total ou
emasculação, dependendo da extensão da lesão primária. A linfadenectomia empregada
variou da dissecção do linfonodo sentinela, esvaziamento inguinal profilático bilateral,
terapêutico uni ou bilateral ou linfadenectomia higiênica. O estadiamento clínico usado
foi o proposto por Jackson e o patológico pelo TNM 2002.
8.2 CRITÉRIOS DE EXCLUSÃO
Os pacientes cujo prontuário e/ou blocos de parafina do tumor primário não
foram encontrados, bem como aqueles submetidos à quimioterapia neoadjuvante e/ou
cirurgia do pênis fora do HAJ foram excluídos.
41
8.3 EXTRAÇÃO DE DNA
A partir dos blocos de parafina contendo os fragmentos do tecido (previamente
fixados em formalina), os espécimes (0,5 a 2,0 mg de tecido) eram transferidos para
microtubos de centrífuga e submetidos à desparafinização. Após três lavagens
sucessivas em 500 µl de xileno, por 15 minutos cada, a 55°C, procedia-se a
centrifugação a 14.500 rpm por 3 minutos, descartando-se o sobrenadante. Após a
desparafinização, o xileno era retirado por meio de três banhos em etanol absoluto, por
15 minutos cada, a 55°C, e nova centrifugação a 14.500 rpm por 3 minutos. Do material
resultante, as amostras eram submetidas à purificação de DNA para posterior
amplificação do gene GAPDH e detecção de HPV. Para a extração de DNA, foi
utilizado o kit comercial de purificação do DNA genômico Wizard® (Promega
Corporation, EUA), seguindo-se as instruções do fabricante.
8.4 DETECÇÃO DE DNA HUMANO
O DNA extraído foi submetido à reação de PCR, utilizando-se os
oligonucleotídeos iniciadores específicos para o gene GAPDH (gene constitutivo
humano), que amplificam um fragmento de aproximadamente 90 pb (pares de base). A
amplificação do GAPDH é necessária para assegurar a qualidade do DNA extraído e a
ausência de inibidores inespecíficos da reação de PCR. Para não haver contaminação da
PCR, esta era realizada em câmara de fluxo previamente limpa com álcool a 70% e
irradiada com luz ultravioleta por 30 minutos. Todos os reagentes da PCR eram
rapidamente centrifugados e homogeneizados no vórtex, sendo previamente
descongelados sobre o gelo picado. Um controle negativo da reação contendo todos os
componentes, exceto o DNA, era incluído em toda amplificação. Como controle
positivo utilizou-se DNA humano extraído do sangue. As reações de PCR para
amplificação de GAPDH foram realizadas num volume final de 25 µl, utilizando um
termociclador (PE 2400, Perkin Elmer), em mistura contendo 2,0 mM MgCl2, 1,25
unidades de Taq DNA polimerase (Invitrogen), 200 µM de cada desoxinucleotídeotrifosfato (dATP, dCTP, dGTP, e dTTP), 100 pmol de cada primer (GAPDH P1 (f) : 5' TGGACTCCACGACGTACTCAG
-
3'
e
GAPDH
P2
(f)
:
5'
-
TTGTCATCAATGGAAATCCCATCA - 3') e 25 ng de DNA em tampão 1 vez
concentrado (Taq DNA Polimerase Buffer - Invitrogen). O protocolo de ciclagem
utilizado incluía uma etapa inicial de desnaturação de 5 minutos a 94ºC, seguida de 35
42
ciclos com 30 segundos de desnaturação a 94 ºC, 1 minuto de anelamento a 59 ºC, 1
minuto de extensão a 72 ºC, com um ciclo final de 7 minutos de extensão a 72 ºC. Os
produtos obtidos pelas reações de PCR, com aproximadamente 90 pares de bases, foram
analisados em gel de poliacrilamida a 8%
8.5 DETECÇÃO E GENOTIPAGEM DO HPV
Para detecção do genoma do HPV, foi utilizada a técnica convencional de PCR
com primers consensuais GP5+ e GP6+. Todas as amostras negativas para a presença
do HPV foram testadas três vezes. Como descrito anteriormente, todos os reagentes da
PCR foram rapidamente centrifugados e homogeneizados no vórtex, sendo previamente
descongelados sobre o gelo picado. Um controle negativo da reação contendo todos os
componentes, exceto o DNA, foi incluído em todas as amplificações. Como controle
positivo utilizou-se uma amostra positiva de HPV, previamente testada e DNA extraído
da linhagem celular HeLa.
As reações de PCR para amplificação de um fragmento da região L1 de vários
HPV de alto risco foram realizadas num volume final de 25 µl, utilizando um
termociclador (PE 2400, Perkin Elmer), em mistura contendo 2,0 mM MgCl2, 1,25
unidades de Taq DNA polimerase (Invitrogen), 200 µM de cada desoxinucleotídeotrifosfato (dATP, dCTP, dGTP, e dTTP), 100 pmol de cada primer (GP5+ : 5' TTTGTTACTGTGGTAGATACTAC
-
3'
e
GP6+
:5'
-
CTTATACTAAATGTCAAATAAAAAG - 3') e 25 ng de DNA em tampão 1 vez
concentrado (Taq DNA Polimerase Buffer - Invitrogen). O protocolo de ciclagem
utilizado incluía uma etapa inicial de desnaturação de 4 minutos a 94ºC, seguida de 40
ciclos de 1 minuto de desnaturação a 94 ºC, 1 minuto de anelamento a 40 ºC, 1 minuto
de extensão a 72 ºC, com um ciclo final de 7 minutos de extensão a 72 ºC. Os produtos
obtidos pelas reações de PCR para detecção do DNA de HPV, com aproximadamente
140 pares de bases, foram analisados em gel de poliacrilamida a 8%.
As reações de PCR usadas para genotipagem de HPV 16 e HPV 18 também
foram realizadas num volume final de 25 µl, contendo uma mistura de 1,5mM MgCl2,
1,25
unidades
de
Taq
DNA
polimerase
(Invitrogen),
200
µM
de
cada
desoxinucleotídeo-trifosfato (dATP, dCTP, dGTP, e dTTP), 100 pmol de cada primer
(HPV-18 P1 : 5' - ATGGCGCGCTTTGAGGATCCAAC - 3' e HPV-18 P2 : 5' CTAAGTTTTTCTGCTGGATTCAACG
-
3';
HPV-16
P1
:
5'-
43
TCAAAAGCCACTGTGTCCTGA
-
3'
e
HPV-16
P2
:
5'-
CGTGTTCTTGATGATCTGCAA -3') e 25 ng de DNA em tampão uma vez
concentrado (Taq DNA Polimerase Buffer - Invitrogen). O protocolo de ciclagem
utilizado incluía uma etapa inicial de desnaturação de 5 minutos a 95ºC, seguida de 40
ciclos de 1 minuto de desnaturação a 95 ºC, 1 minuto de anelamento a 64 ºC p/ HPV-18
ou 1 minuto de anelamento a 62 ºC p/ HPV-16, 1 minuto de extensão a 72 ºC, com um
ciclo final de 7 minutos de extensão a 72 ºC. Como controle positivo utilizou-se uma
amostra de carcinoma escamoso cervical, positiva para o HPV 16 e outra positiva para o
HPV 18, ambas previamente testadas. Os produtos obtidos pelas reações de PCR para
detecção do DNA de HPV-16, com aproximadamente 120 pares de bases, e do HPV-18,
com aproximadamente 390 pares de bases (Figura 3), foram analisados em gel de
poliacrilamida a 8%, corados com nitrato de prata.
Amostras testadas para o HPV-16
1
300 pb
2
3
4
5
Amostras testadas para o HPV-18
6
1
2
3
4
5
400 pb
300 pb
200 pb
200 pb
100 pb
100 pb
Figura 3 - Eletroforese em gel de poliacrilamida 8%, corado com nitrato de prata, mostrando
produtos de amplificação com cerca de 390 pares de bases obtidos por ensaios de PCR com a
utilização de oligonucleotídeos iniciadores para a região E6 dos HPVs 16 e 18. Canaleta 1,
amostra (-) e canaletas 2, 3, 4 e 5, amostras (+).
44
8.6 ANÁLISE
Na análise imunoistoquímica (IHQ) empregou-se o método da imunoperoxidase
associada a polímeros (Kit comercial MACH4 – Universal HRP-Polymer kit BioCare). A imunodetecção da proteína VEGF-C foi realizada com anticorpo policlonal
(Rabbit anti-VEGF-C polyclonal antibody, Invitrogen) e da COX-2 com anticorpo
monoclonal COX229 (Mouse anti-COX-2, clone: COX229, Invitrogen). Os cortes,
montados em lâminas sinalizadas, foram desparafinizados e desidratados, em
temperatura controlada, segundo o protocolo da técnica. Em seguida, foram submetidos
à recuperação antigênica pelo calor, em panela de pressão, durante 5 minutos,
utilizando-se o citrato 0,01M, pH 6,0. Após a recuperação antigênica, as lâminas foram
mantidas à temperatura ambiente, para resfriamento, por cerca de 1 hora. O bloqueio da
peroxidase endógena foi feito em peróxido de hidrogênio 3%, durante 10 minutos, e em
seguida, as lâminas foram lavadas com tampão fosfato (PBS) por 5 minutos. Após o
bloqueio, as lâminas foram incubadas a 4°C, durante a noite, com o anticorpo policlonal
anti-VEGF-C, diluído (1:600), e anticorpo monoclonal anti-COX-2, diluído (1:800), em
solução de PBS contendo 1% de albumina bovina. Após a incubação com o anticorpo
primário, as lâminas foram submetidas a lavagem por três
vezes em PBS, por 5
minutos, e incubadas durante 1 hora com o anticorpo secundário, conjugado com o
polímero ligado à peroxidase . Depois de uma nova lavagem com PBS, por 5 minutos, a
reação foi revelada com tetra-hidroclorato de 3-3’diaminobenzidina, por 5 minutos, e as
lâminas levemente contracoradas com hematoxilina. Em seguida, as lâminas foram
desidratadas e montadas com lamínula.
A leitura da imunomarcação foi feita por duas patologistas, de modo
independente. Cada patologista identificou a área tumoral mais bem corada pelo
anticorpo em questão, que variou de 3-5 mm de diâmetro, em um aumento óptico de 40
vezes, utilizando-se um microscópio Nikon Eclipse E200. Nesta área, fez-se a análise de
oito a doze campos, considerando-se a percentagem de células coradas pelo anticorpo
para a determinação do índice de positividade. Para a leitura, considerou-se apenas as
áreas epiteliais tumorais contendo células de coloração citoplasmática granular ou
difusa, desprezando-se as marcações estromais, bem como a pigmentação melânica da
camada basal. Um avaliador independente identificou os casos divergentes em que uma
das leituras era igual a zero, encaminhando-os para re-análise conjunta pelas
patologitas, obtendo-se uma graduação consensual.
Devido às dificuldades em se estabelecer o diagnóstico de imunomarcação
45
positiva, procedeu-se à confecção e análise de curvas ROC (Receiver Operating
Characteristic) dos índices de COX-2 e VEGF-C em relação à presença de metástase e
morte por CP, obtendo-se assim, os valores de corte (cut-offs) para cada marcador.
Foi realizada uma análise de concordância entre as leituras das patologistas,
considerando-se divergentes os casos que não obedeceram os critérios de positividade ,
conforme os cut-off estabelecidos. Para isso, considerou-se a leitura inicial de cada
patologista.
8.7 SEGUIMENTO E ANÁLISE ESTATÍSTICA
O seguimento consistiu em exame físico e radiológico (ultra-som e tomografia
pélvica) trimestral no primeiro ano, a cada quatro meses no segundo ano e, a cada
semestre subsequentemente. A comparação de variáveis contínuas entre os grupos foi
feita através do Teste T Student. Os testes de Qui-quadrado e exato de Fisher foram
empregados na análise univariada. Para as taxas de sobrevida foram utilizadas tabelas
de vida conforme descrito por Kaplan-Meier (Kaplan,1958), comparadas pelo teste de
Log-Rank. Para o cálculo de sobrevida câncer-específica utiliza o desfecho óbito por
CP. A censura foi aplicada na data da última visita médica ou quando ocorria o óbito
por outra causa. Na análise multivariada foi utilizada Regressão Logística com correção
de Bonferroni, considerando-se p<0.05 como significante para todos os testes. As
curvas ROC foram usadas para encontrar o ponto de corte (cut-off) de positividade para
COX-2 e VEGF-C, em relação à metástase inguinal e morte por CP. O cut-off foi
determinado pela melhor sensibilidade e especificidade.
®
O software Windows
Statistical Package for Social Sciences versão 13.0 (SPSS , Chicago, Ill) foi utilizado
para a análise estatística.
46
9- RESULTADOS DA DETECÇÃO E GENOTIPAGEM DE HPV
Todos os cento e vinte e sete casos analisados mostraram positividade na PCR
para o gene GAPDH, atestando a boa qualidade de material genético (DNA) obtido.
Cinquenta e cinco pacientes (43,3%) apresentaram resultados positivos para a detecção
do DNA-HPV, utilizando os oligonucleotídeos iniciadores GP5+/GP6+. A genotipagem
dos casos positivos foi realizada com oligonucleotídeos iniciadores específicos para o
HPV 16 e HPV 18. Vinte e oito casos (50,9%) foram positivos para detecção de HPV
16 e quatorze casos positivos para o HPV 18 (25,5%), sendo que em seis pacientes
(10,9%), foi detectada co-infecção por estes genotipos. Outros 19 casos (34,5%)
apresentaram PCR positiva para DNA de HPV não 16 e não 18.
A utilização de oligonucleotídeos iniciadores para detecção de HPVs 16 e 18 foi
adotada por se tratar dos genotipos mais prevalentes no carcinoma peniano e também
por estarem inseridos no grupo de HPVs de alto risco oncogênico. A prevalência de
HPV nesta amostra (43,3%) se mostrou concordante com os dados nacionais e
internacionais (Neves et al.,2002; Tornesello et al.,2008b), bem como a presença mais
comum do HPV 16 (50,9%), seguida pelo 18 (25,4%). Em um quarto dos casos não foi
possível identificar qual o genotipo presente. A metodologia empregada também não
permite a avaliação de infecção múltipla.
Como a relevância prognóstica do HPV no CP ainda é controversa (Bezerra et
al.,2001; Lont et al.,2006), foi realizada a análise entre a positividade do DNA viral e as
características histológicas, dados clínicos e epidemiológicos dos pacientes. Os achados
encontram-se dispostos nas Tabelas IV e V.
47
Tabela IV- Frequência dos fatores clínicos de acordo com a presença de DNA-HPV em
pacientes com CP.
HPV
Variável
Idade (anos)
> 59
< 59
Estágio de Jackson
0/I/II
III/IV
Grau tumoral
Baixo
Alto
Coilocitose
Presente
Ausente
Infiltrado inflamatório
Fraco
Forte
Nível de Infiltração
Superficial (Ta, T1)
Profunda (T2-T4)
Invasão angiolinfática
Presente
Ausente
Metástase inguinal
Sim
Não
SCE
Óbitos
Vivos
Pos/Total
%
26/68
29/59
38.2
49.2
p
pΩ
0.21*
0.20
0.81**
43/98
12/29
43.8
41.3
27/57
28/70
47.4
40
34/65
21/62
52.3
33.9
0.40*
0.03*
0.03
0.50*
16/41
39/86
39
45.3
30/63
25/64
47.6
39.1
10/29
45/98
34.5
45.9
0.33*
0.27*
0.35*
20/52
35/75
38.5
46.7
8/24
47/103
33.3
45.6
0.27*
Pos/Total= No de pacientes com PCR positiva/ No total ; * Qui-Quadrado; Teste de Fisher **; SCE-Sobrevida
câncer-específica; p= valor de p; pΩ= valor de p em Regressão logística.
Entre as variáveis histológicas, apenas a coilocitose se associou a presença de
DNA-HPV, inclusive em regressão logística (p=0,04; OR=2,1; IC95% 1,1-4,6). Não se
observou qualquer associação entre a positividade de DNA de HPV e o risco de
metástase inguinal ou óbito por CP. Ornellas e colaboradores encontraram que a
ausência de coilocitose seria fator independente para óbito por CP (Ornellas et
al.,2008b), o que não foi confirmado na presente análise (dado não apresentado). Em
outra investigação, de Paula e colaboradores também não observaram impacto
prognóstico em relação à presença de coilocitose (de Paula et al.,2007).
48
Tabela V- Frequência dos fatores clínicos de acordo com os tipos de HPV.
Tipos HPV
Variável
HPV 16
+/-
Idade (anos)
> 59
< 59
Estágio de Jackson
0/I/II
III/IV
Grau tumoral
Baixo
Alto
Coilocitose
Presente
Ausente
Infiltrado inflamatório
Fraco
Forte
Nível de Infiltração
Superficial (Ta, T1)
Profunda (T2-T4)
Invasão angiolinfática
Presente
Ausente
Metástase inguinal
Sim
Não
SCE
Óbitos
Vivos
p/ p Ω
HPV 18
+/-
0.67*/0.65
14/54
14/45
0.39*/0.19
9/59
5/54
0.67**/-24/74
4/25
0.70**/-10/88
5/25
0.50*/-17/53
11/46
0.87*/-8/62
6/51
0.04*/0.04
19/46
9/53
0.10**/0.09
10/55
4/58
0.77*/--
0.66*/-10/31
18/68
9/77
5/36
0.63*/--
15/48
13/51
0.97*/-7/57
7/56
0.75*/-7/22
21/77
0.89**/-3/26
11/87
0.83*/-11/41
17/58
0.87*/-6/46
8/67
0.48**/-4/20
24/79
p/ p Ω
<0.01*/<0.01
7/17
7/96
* Qui-Quadrado; Teste de Fisher **; +/- No de pacientes com PCR positiva/negativa; SCE-Sobrevida câncerespecífica; p= valor de p; pΩ= valor de p em Regressão logística.
A colilocitose manteve associação ao HPV16 (p=0,04) e mostrou tendência de
associação ao HPV18 (p=0,09), em regressão logística. A positividade para o HPV 18
foi preditor independente de óbito por CP (p<0,01). A literatura vigente é controversa.
Dois autores relataram que os HPVs de alto risco estariam associados a um menor risco
de metástase inguinal e óbito por CP (Lont et al. 2006; Yanagawa et al. 2008). Outros
não encontraram relação entre a presença do HPV (independente do tipo) e prognóstico
(Bezerra et al.,2001; Scheiner et al.,2008).
49
ARTIGO 1
Carcinoma peniano e papilomavírus humano (HPV): Artigo de Revisão
Adriano Augusto Peclat de Paula1; Megmar Aparecida dos Santos Carneiro2; Joaquim
Caetano de Almeida Netto2.
1-Hospital Araújo Jorge da Associação de Combate ao Câncer em Goiás; MSc.
2-Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública da Universidade Federal de Goiás;
PhD.
Publicado na Revista Brasileira de Oncologia Clínica [ISSN 1806-6054], Vol.6, No16,
pgs 7-11, em 2009.
Introdução:
O papel dos vírus no desenvolvimento de tumores foi primeiramente
aventado por Borrel em 1903, entretanto, só em 1964, Epstein, Anchong e Barr
demonstraram o primeiro vírus a gerar tumor em humanos (vírus Epstein-Barr) em
células de linfoma de Burkitt (Borrel,1903). Strauss et al, usando microscopia eletrônica
em 1949, visualizou partículas virais em verrugas. Logo depois, em 1954, Barret et al,
confirmou a transmissão sexual de condilomas (Barret,1954). Em 1995 o IARC
(Agência Internacional de Pesquisa sobre Câncer) passou a reconhecer os papilomavírus
(HPVs) 16 e 18 como carcinógenos humanos, principalmente em se tratando de câncer
de colo uterino, porém também de câncer anal, câncer do pênis, vulva, laringe e escroto
((IARC)). Hoje se estima que cerca de 15% dos tumores humanos sejam relacionados a
vírus (Parkin Muir,1992). A presente revisão objetiva evidenciar atualizações referentes
à caracterização do HPV, sua oncogênese, epidemiologia e considerações referentes ao
carcinoma peniano.
Metodologia:
Foi realizada uma busca de artigos no PubMed, MedLine e Lilacs usando-se
unitermos normatizados pelo Mesh para HPV e carcinoma peniano, estabelecendo-se
limites para estudos publicados de 1997 a 2008, de língua portuguesa ou inglesa e
envolvendo apenas seres humanos.
Caracterização viral
Os HPVs eram previamente pertencentes à família Papovaviridae e desde 2006
a nova taxonomia os classifica na família Papillomaviridae, dividindo as mais de 150
50
espécies de papilomavírus em 16 gêneros (Frazer et al.,2006). A maioria dos HPVs que
causam doenças em humanos são dos gêneros alfa, beta ou gama papilomavírus. As
espécies 7,9 e 10 contêm os HPVs 6, 11, 16 e 18 (Boccardo Villa,2007). O HPV é um
vírus pequeno (aproximadamente 55 nanômetros), desnudo, de nucleocapsídeo com
simetria icosaédrica, DNA de fita dupla e genoma circular com cerca de 8000 pares de
bases nitrogenadas (Hebner Laimins,2006). O nucleocapsídeo é formado por 72
capsômeros. Seu genoma possui 9 regiões de leitura aberta (ORFs, do inglês, Open
Reading Frames), funcionalmente divididos em 3 regiões (precoce, tardia e longa região
de controle). Os genes da região precoce (Early) são responsáveis por codificar
proteínas ligadas à transcrição e replicação viral e os genes da região tardia (Late) são
responsáveis pela produção de proteínas estruturais do nucleocapsídeo. O gene
estrutural tardio L1 codifica proteínas maiores e é gênero-específico, enquanto o gene
L2 codifica proteínas menores e é tipo-específico (Tyring,2000). A longa região de
controle (LCR), também denominada de região de controle superior (Upstream
Regulatory Region), influencia na transcrição e replicação viral. A Figura 1 representa o
genoma do HPV.
Figura 1- Genoma do HPV
Patogênese viral
Apesar das infecções pelo HPV serem muito freqüentes, a maioria dos pacientes
acometidos consegue clarear ou debelar a infecção através da ação do sistema
imunológico, sem nenhum desenvolvimento de doença (Frazer et al.,2006). Por outro
lado, uma pequena parcela de pacientes retém cronicamente os vírus, situação que pode
induzir à proliferação celular epitelial indefinida, podendo, sob ação de co-fatores, levar
51
ao desenvolvimento de câncer. O HPV, como qualquer outro vírus, depende da
maquinaria celular do hospedeiro para se multiplicar. A infecção pelo HPV na genitália
exige acesso às células da camada basal de pele ou mucosas, geralmente ocasionado
através de micro-fissuras geradas durante o coito (Souto,2005). A característica de
replicação contínua das células da camada basal para formar células do epitélio colunar
(mucosas) ou estratificado (pele) favorece a proliferação do HPV. Após a entrada do
vírus na célula, ocorre a integração de seu material genético no DNA celular, dando
início à produção de proteínas virais precoces (Early). As proteínas codificadas pelos
genes E1 e E2 controlam a replicação do DNA viral. O gene E3 não é expresso em
humanos. Os genes E4 e E5 estão ligados à maturação viral e provavelmente à proteínas
de membrana com atividade transformadora fraca. A proteína do gene E4 leva ao
colapso da rede de citoqueratina, epigeneticamente representada pela alteração
perinuclear típica do HPV, chamada de coilocitose. Os genes E6 e E7 codificam
proteínas que interferem no funcionamento adequado das vias de supressão tumoral dos
genes supressores de tumor p53 e do retinoblastoma (Rb), respectivamente (Fehrmann
Laimins,2003; Kanodia et al.,2007). Posteriormente as proteínas codificadas por genes
virais tardios (Late) L1 e L2 formam o nucleocapsídeo viral. Uma breve descrição da
função de cada gene viral está disposta na Tabela I.
Tabela I-Função dos genes do HPV
Gene
E1
E2
E4
E5
E6
E7
Função
Replicação viral
Transcrição e Replicação viral
Maturação viral e alteração de matriz intracelular (coilocitose)
Provável codificação de proteína de membrana
Transformação celular por inibição da via do p53
Transformação celular por inibição da via do Rb
A proteína p53 é um fator de transcrição que leva a parada do ciclo celular em
G1 através da indução do gene p21. O gene p21 codifica um inibidor do complexo
quinase ciclina D-dependente. A falta de inibição deste complexo permite uma maior
fosforilação do produto do gene Rb, que em sua forma natural hipofosforilada, é ávido
pelo fator de transcrição E2F. A proteína Rb fosforilada libera mais fator E2F, ativando
assim o ciclo celular. A proteína E6 aumenta a degradação da proteína p53, via
ubiquitina-ligase celular, simulando o efeito gerado pela mutação do gene p53
52
(Elenbaas et al.,2001). A proteína E6 por si só não imortaliza queratinócitos, entretanto,
os HPVs de alto risco, através da ativação da telomerase, aumentam a degradação da
p53, criando assim um mecanismo potencial de imortalização celular. Este mecanismo
também é dependente da proteína E7. A proteína E7, diante de forte fator promotor, é
capaz de imortalizar queratinócitos. Na falta de fatores promotores, ou seja, diante do
controle viral normal, a proteína E7 depende da proteína E6 para gerar imortalização
celular. A proteína E7 tem afinidade pela proteína Rb hipofosforilada, liberando assim o
fator de transcrição E2F, levando a progressão do ciclo celular. A proteína E7 do HPV
16 também pode causar duplicação de centrômeros e levar à aneuploidia e instabilidade
genômica, contribuindo assim com o processo de oncogênese (Halbert et al.,1991). A
desregulação do ciclo celular e alterações dos mecanismos de reparo celular geradas
pelo HPV são indutoras da carcinogênese, porém, por si só, não são suficientes para o
processo de malignização.
O HPV é classificado, em relação ao seu potencial oncogênico, em alto e baixo
risco, conforme evidenciado na Tabela II.
Tabela II. Classificação dos HPVs quanto a categoria de risco oncogênico
Risco
Tipo viral HPV
Oncogênico
Inespecífico ou
indeterminado
30, 34, 53, 57, 62, 64, 67 e 69.
Baixo risco
6, 11, 26, 40, 42, 43, 44, 54, 61, 70, 72, 73 e 81.
Alto Risco
16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 55, 56, 58, 59, 66 68 e
82.
HPV e imunidade do hospedeiro
A infecção pelo HPV pode ser completamente debelada pelo sistema
imunológico celular do hospedeiro, processo chamado de clareamento. Outras vezes o
HPV pode gerar um estado infeccioso crônico, caracterizado por proliferação celular
contínua, com eventual efeito promotor de vários cânceres, a exemplo o de colo uterino.
Fica então clara a necessidade de outros fatores promotores e progressores da
oncogênese além do HPV, ora exemplificados por alterações genéticas herdadas, por
co-infecções, tabagismo, presença de fimose e, talvez o mais importante, déficit no
53
sistema imunológico celular do hospedeiro. Prova incontestável da importância do
sistema imune celular no controle da infecção e da carcinogênese pelo HPV é a alta
prevalência de verrugas intratáveis e de câncer de colo de útero, de cabeça e pescoço e
de região ano-genital em indivíduos imunossuprimidos (Kreuter et al.,2008; Tornesello
et al.,2008a). Já existe evidência científica de menor resposta mediada por linfócito T
citotóxico às proteínas E6/E7 entre mulheres portadoras de HPV 16 e com neoplasia
intra-epitelial do colo (NIC) quando comparada à mulheres com HPV 16 sem NIC.
Sabe-se que linfócitos T helper (LTH) aumentam os níveis de interleucina 2 (IL-2) e
estimulam a produção de imunoglobulina G (IgG). A persistência de infecção pelo HPV
parece aumentar os níveis de IgG contra partículas da proteína estrutural maior L1 do
nucleocapsídeo mediante uma maior estimulação através de LTH, embora nem sempre
conferindo maior probabilidade de clareamento da infecção. Esta é a base das vacinas
atualmente empregadas no combate à infecção pelo HPV, ou seja, as vacinas são
compostas por monômeros de proteína L1, agrupadas em pentâmeros e denominadas
capsômeros. Cada 72 capsômeros formam partículas semelhantes ao vírus (VLP),
desprovidas de material genético e que induzem à formação de anticorpos que se ligam
à periferia do HPV e evitam a adsorção viral. Deve-se ressaltar que as VLPs são
sorotipos específicas, exigindo assim a criação de vacinas polivalentes para determinar
proteção imunológica aos diversos HPVs de alto risco (Hakim et al.,2007).
HPV e carcinoma peniano
É inquestionável o papel oncogênico do HPV no câncer de colo uterino,
entretanto, apesar de não raramente ser encontrado em pacientes com carcinoma
peniano (CP), sua importância na carcinogênese desta neoplasia ainda é incerta.
Devemos ressaltar que a mera detecção do DNA do HPV no paciente com CP
não garante sua participação no processo oncogênico. Para se obter maior evidência da
ação viral na carcinogênese do CP é necessário comprovar a presença do vírus e da
mutação de genes com subseqüente inativação de proteínas supressoras de tumores,
neste caso, p53 e/ou pRb, que supostamente seriam resultantes do processo patogênico
deste vírus.
Vários autores investigaram, através de várias técnicas, a presença de HPV em
pacientes com CP. As publicações abrangem estudos de prevalência, de genotipagem,
coortes retrospectivas ou prospectivas e de associação com prognóstico e sobrevida. A
maioria dos estudos são coortes retrospectivas, cuja avaliação da presença viral foi
54
realizada em material tumoral parafinado e armazenado por longo período, o que pode
influenciar negativamente na real detecção do vírus. O material biológico inadequado e
as diferentes técnicas usadas (exemplo: simples observação de coilocitose, detecção de
material genético viral por southern blot, hibridização in situ, sequenciamento genético
e mais comumente a amplificação por reação de cadeia de polimerase (PCR)) para
detectar o HPV podem explicar a grande diferença de prevalência viral entre os diversos
estudos (Smeets et al.,2007). Mesmo se usando uma mesma técnica, diferenças em
iniciadores ou primers e na metodologia e experiência do profissional que manipula o
material biológico também pode influenciar nos índices de detecção de DNA viral. A
identificação na microscopia convencional, de um halo grande e claro peri-nuclear, é
chamada de coilocitose e se associa com a real presença do HPV em até 70%. De Paula
e colaboradores, em uma coorte retrospectiva de 1994 a 2005, encontraram coilocitose
em 63,2% de 144 pacientes com CP, porém sem associação com metástase inguinal ou
sobrevida (de Paula et al.,2007). Gil e colaboradores, em outra coorte retrospectiva de
1979 a 1995, envolvendo 55 pacientes com CP, encontraram DNA de HPV, usando-se
PCR, em 30% dos pacientes e com coilocitose presente em 70,5% dos pacientes com
PCR positiva para HPV (Gil et al.,2001). Neste estudo a presença do HPV tipo 16 se
associou com maior risco de óbito por CP. Lopes e colaboradores, em outra coorte
retrospectiva referente a 145 pacientes com CP, entre 1953 e 1985, também
encontraram 44,8% de coilocitose, contudo sem impacto negativo na sobrevida ou no
aparecimento de metástases inguinais (Lopes et al.,1996). Gregoire e colaboradores
analisaram retrospectivamente 117 portadores de CP, através de PCR, e encontraram
22,2% de HPV, sendo que nos tumores com diferenciação basalóide a detecção de HPV
foi de 75% contra apenas 11,1% de HPV em carcinomas escamosos (CEC) típico
(Gregoire et al.,1995). Bezerra e colaboradores detectaram 30,5% de PCR positivas para
DNA de HPV entre 82 pacientes com carcinoma peniano, porém sem impacto
prognóstico (Bezerra et al.,2001). Rubin e colaboradores, em uma coorte retrospectiva
multicêntrica, com mais de 20 anos, envolvendo 142 portadores de CP, usaram uma
PCR de largo espectro de detecção de HPV e encontraram 42,2% de positividade
(Rubin et al.,2001). O HPV 16 foi o mais encontrado (60%) e os tipos histológicos que
mais se associaram ao HPV foram o basalóide (80%) e o CEC com diferenciação
verrucosa (100%), sugerindo que a analogia do CP seria com o câncer de vulva e não
com o câncer de colo uterino. Os autores também avaliaram a presença de HPV em
espécimes penianos de displasia, sendo que a positividade para HPV nesta circunstância
55
foi de 90%, sugerindo que o CP teria no mínimo 2 vias oncogênicas, sendo apenas uma
relacionada ao HPV. A via relacionada ao HPV teria como lesões precursoras o
carcinoma in situ, a displasia ou verrugas genitais e resultaria no surgimento do CP do
tipo basalóide ou do CEC com diferenciação verrucosa (Rubin et al.,2001). Estes dados
foram corroborados por Gross e Pfister em 2004, afirmando que os CECs basalóides e
com diferenciação verrucosa (que não é o carcinoma verrucoso) estariam associados ao
HPV em 80 a 100% dos casos (Gross Pfister,2004). Já o CEC típico e o carcinoma
verrucoso estariam associados ao HPV em apenas 30 a 35% dos casos (Gross
Pfister,2004). Zhang e colaboradores compararam a detecção de HPV, através de
imunoistoquímica, entre portadores de condiloma e carcinoma peniano. Os autores
encontraram 100% de positividade de HPV entre 21 condilomas estudados e apenas
10% entre 19 carcinomas. Entretanto os autores encontraram hiper-expressão de p53 em
63% dos casos de carcinomas versus apenas 24% nos condilomas, sugerindo assim a
ação carcinógena do HPV (Zhang et al.,2001). Em uma coorte retrospectiva brasileira,
Neves e colaboradores detectaram 40,6% de amostras parafinadas positivas para DNA
de HPV usando-se PCR em 59 pacientes obtidos no período de 1994 a 1999. O HPV 16
também foi o mais prevalente, estando presente em 91,6% das amostras (NEVES,2002).
No ano de 2003, Ouban e colaboradores aventaram a hipótese da participação do HPV
na gênese do carcinoma verrucoso (Ouban et al.,2003). Nesta pequena série de apenas
14 casos sendo 7 carcinomas verrucosos e 7 CECs convencionais, os autores
observaram diferença estatística sendo maior o índice de expressão imunoistoquímica
para o Mdm2 nos carcinomas verrucosos que no restante. Já a expressão
imunoistoquímica para p53 foi o contrário, porém mantendo diferença estatística.
Ferreux e colaboradores avaliaram espécimes parafinados de 53 carcinomas penianos e,
usando PCR para detecção de HPV, encontraram 38% de positividade viral (Ferreux et
al.,2003). Os autores também encontraram forte marcação imunoistoquímica para p16
entre os pacientes com positividade para HPVs de alto risco, reforçando a hipótese de
que estes vírus têm propriedade de interferir na via do gene do retinoblastoma
(p16/Ciclina D/Rb). Mais recentemente, Tornesello e colaboradores publicaram os
resultados da análise de DNA de HPV por PCR entre 41 biópsias de carcinomas
penianos na Itália. Os achados evidenciaram positividade para HPV em 46,3%, sendo
que o HPV 16 estava presente em 94,7% das amostras positivas (Tornesello et
al.,2008b). A Tabela III resume os achados dos trabalhos citados, bem como a
metodologia e o material estudado.
56
Tabela III-Autores, ano de publicação, método de detecção do HPV, número de
pacientes envolvidos e taxas de positividade. Arrumar a tabela
Autores
Ano
Método
n
% de
detecção de HPV
De Paula et al
2007
Coilocitose
Gil et al
2001
Coilocitose
PCR
Lopes et al
1996
Coilocitose
145
44.8
Gregoire et al
1995
PCR
117
22.2
Rubin et al
2001
PCR
142
42.2
Bezerra et al
2001
PCR
82
30.5
Zhang et al
2001
IHQ
19
10
Neves et al
2003
PCR
59
40.6
Torsenello et al
2008
PCR
41
46.3
Ferreux et al
2003
PCR
53
38
144
55
55
63.2
21.8
30.9
Conclusão
O carcinoma peniano parece estar associado ao HPV, não com a mesma
importância em que ocorre no câncer de colo de útero, mas em proporções semelhantes
a que ocorre no câncer de vulva. Em algumas situações como nos condilomas, nas
displasias, na neoplasia intra-epitelial do pênis, no carcinoma in situ e no carcinoma
basalóide, o HPV tem um papel oncogênico essencial, caracterizando-o como
carcinógeno humano, tal qual no colo de útero. Por outro lado, no carcinoma escamoso
convencional o HPV provavelmente exerce um papel de co-fator, sendo assim
necessária a participação de outros fatores indutores, promotores e progressores. A
diversidade de técnicas empregadas na detecção de DNA viral (PCR, Southern blot,
hibridização in situ, imunoistoquímica), bem como as condições e o tempo de
preservação de espécimes de carcinoma peniano (material parafinado) certamente
influenciam nos resultados obtidos. Enfim, não há dúvidas da importância deste vírus
também no carcinoma peniano, entretanto ainda é necessário estabelecer sua
57
prevalência e seu real papel carcinógeno e prognóstico através de estudos
multicêntricos, prospectivos e, preferencialmente, com material crio-preservado.
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60
Article 2
The Impact of Immunoexpression of COX-2 and VEGF-C on the
Prognosis of Penile Carcinoma.
De Paula, Adriano Augusto Peclat1; Motta, Eliane Duarte3; Alencar, Rita de Cassia3;
Saddi, Vera Aparecida4 ;Rosana Correa da Silva3; Gustavo Nogueira Caixeta3; Almeida
Netto, Joaquim Caetano2; Carneiro, Megmar Aparecida dos Santos2.
1-Onco-Urology Department of Araujo Jorge Hospital from the Associaçao de Combate
ao Cancer em Goias, Brazil; MD, MSc.
2-Institute of Tropical Pathology and Public Health of the Federal University of Goias,
Brazil; PhD.
3-Pathology Department of Araujo Jorge Hospital from the Associaçao de Combate ao
Cancer em Goias, Brazil; MD.
4-Genetics Department of the Pontificius Catholic University of Goias, Brazil; PhD.
Correspondent author (e-mail: [email protected])
Abstract:
Objective: To assess the influence of cyclooxygenase-2 (COX-2) and vascular
endothelium growth factor-C (VEGF-C) immunoexpression on groin metastasis and
cancer survival and their association with histological variables in patients with penile
carcinoma (PC).
Materials and methods: The histological and COX-2/VEGF-C immunohistochemical
(IHC) profiles of patients with PC treated at a single institution between 2001 and 2008
were evaluated. Univariate and multivariate analyses were performed to determine the
impact of histological and IHC markers on the risk of inguinal metastasis and cancer
survival of these patients. A survival analysis of the relevant variables was also
conducted.
Results: One hundred twenty-seven patients were enrolled, 76 with positive
immunoexpression for COX-2 and 30 positive for VEGF-C. Univariate analysis
identified an association between VEGF-C immunoexpression and groin metastasis and
certain histological variables. Logistic regression showed that high tumor grade,
Jackson stage, and VEGF-C immunoexpression were independent predictors of inguinal
metastasis. Cancer survival was only influenced by advanced Jackson stage and groin
metastasis.
61
Conclusions: The findings of this cohort study suggest that the expression of VEGF-C
may help to identify patients with an unfavorable clinical course of PC. COX-2 did not
alter the risk of groin metastasis or cancer death. The presence of inguinal disease and
advanced Jackson stage were independent prognostic factors for worse cancer survival.
Key words: penile carcinoma; prognosis; treatment; COX-2; VEGF-C.
INTRODUCTION
Penile carcinoma (PC) is a poorly studied disease with a low prevalence in
developed countries. It is, however, frequently associated with high morbidity due to the
course of the disease or its treatment.1, 2 In developing countries, such as Brazil and
India or Paraguay and Uganda, PC still represents a serious health problem, accounting
for nearly 10% of cancers in men.3 There are a relatively small number of published
studies regarding PC, none of which are randomized trials. As a result, there is a fragile
scientific evidence for addressing critical issues with the disease.
The risk of inguinal metastasis can be determined by the histopathological
analysis of the primary lesion. Histological characterization is subjective and
pathologist-dependent, which may lead to a biased interpretation with variable degree of
agreement between physicians.4 Both penile histopathology and the patient’s
socioeconomic profile should be considered before performing a pre-emptive groin
dissection, since surveillance programs have shown low treatment adherence by patients
with a low socioeconomic status. The major challenge in the treatment of PC is
performing a pre-emptive lymphadenectomy in patients at high risk of occult metastatic
disease. Some papers, despite little scientific evidence, have associated delayed groin
dissection with worse survival when compared to a pre-emptive procedure.5, 6 It has,
however, been reported that inguinal dissection is associated to high morbidity
represented by wound infection, suture dehiscence, and chronic lymphedema of the
scrotum and inferior limbs.7, 8
It is necessary to more accurate identify predictors of occult inguinal disease. In
this context, the objective of this present study was to evaluate the impact of 2
molecular factors involved in angiogenesis on outcomes of PC.
62
MATERIALS AND METHODS
A prospective cohort study enrolling patients with PC was conducted at a single
institution in Goiania, Goias, Brazil. All patients with a histological diagnosis of
squamous cell PC admitted in the Uro-Oncology Department between January 2001 and
July 2008 were included. The number of patients needed for a power of 80%
(considering a 20% difference between groups) was 202. The expected recruitment rate
was 25 patients/year, requiring 8 years to include all cases. Patients whose medical
records and/or paraffin wax-embedded tissue blocks were not available, as well patients
who underwent previous surgery or chemotherapy, were excluded. The study was
approved by the Institution Ethics Committee (protocol # 007/2008). All patients gave
informed consent.
A pathologist determined the grade and size of the tumor and the presence of
koilocytosis, lymphovascular invasion, inflammatory tumor infiltrate, or inguinal node
metastasis. An immunohistochemical (IHC) analysis for cyclooxygenase-2 (COX-2)
and endothelial vascular growth factor-C (VEGF-C) expression was also performed.
The TNM staging system of the American Joint Committee on Cancer (AJCC) 2002
was also used. The Broders’ system was used for histological grading. All
epidemiological data and outcomes (inguinal metastasis and cancer-related death) were
tested for association with both histological and IHC profiles.
Radical inguinal node dissection was conducted in patients with enlarged
inguinal nodes, in those with clinical stage N0 cancer in the presence of unfavorable
histological factors, or when adequate follow-up (due to low treatment adherence) was
not possible. No superficial or modified inguinal lymphadenectomies were performed.
Patients with extranodal disease underwent adjuvant radiotherapy (60Gy with a 1.8 Gy
daily fraction to the involved inguinal regions). Chemotherapy for patients with
metastatic disease (clinical stage IV) consisted of infusional 5-fluorouracil and cisplatin.
Immunohistochemical Analysis
A 3-mm section was taken from all the paraffin blocks, and the slides were
stained for immunohistochemistry with a polymer-associated immunoperoxidase
method using a commercial kit (MACH4, Universal HRP-Polymer kit, BioCare).
Polyclonal (Rabbit anti-VEGF-C polyclonal antibody 1:600, Invitrogen) and
monoclonal antibodies (Mouse anti-COX-2 1:800, clone COX229, Invitrogen) were
used for the detection of VEGF-C and COX-2, respectively. Incubation with the
63
antibody was performed overnight. The antigenic recovery was performed under wet
heating and the endogenous peroxidase was blocked with 3% hydrogen peroxide.
The IHC study was independently validated by a second pathologist, and all the
divergent cases were discussed for a consensus diagnosis. The evaluation was done
using the best stained tumor area of the primary tumor, considered as the percentage of
marked cells in a 3- to 5- mm high-power area (400x) under light microscopy. The area
comprised 8 to 12 fields and only epithelial tumor cells presenting granular or diffuse
cytoplasmic staining of the employed antibody were appreciated. Estromal and basal
melanin staining were not considered.
The cut-off values for a positive staining status were established by the analysis
of receiver operating characteristics (ROC) curves of IHC grading based on the
presence of groin metastasis and cancer-related death for each marker.
Follow-up and statistical analysis
The follow-up was done by physical and radiological examinations (chest x-ray
and pelvic computed tomography [CT]) 4 times during the first year, every 4 months in
the second year, and twice a year thereafter for 3 years. For qualitative variables in
univariate analysis, chi-square or Fisher’s exact test were used. The student t-test was
used to compare means between 2 groups. Clinical status, outcome, and date of
patients’ last information were used for Kaplan Meier curves, compared with log-rank
test. All living patient or dead of non-cancer condition were censored. Multivariate
study was carried out by logistic regression. For all tests a p values <0.05 was
considered significant. The software Windows Statistical Package for Social Sciences
version 13.0 (SPSS®, Chicago, Illinois) was used for statistical analysis.
RESULTS
In 2006 the local government changed the method of referring patients to the
city of Goiania, causing a decrease in the recruitment rate. Therefore, we recruited
patients until 2008, although this compromised the power of the study.
One hundred forty-eight patients with PC were treated during the study period.
Twenty-one patients were not eligible; 4 because the paraffin blocks were not found and
the remaining 17 because of previous treatment at another institution. A total of 127
patients were included.
The mean age of the patients was 59.3 years (range, 24 to 101 years; SD 15.27).
Phimosis was present in 85% (108) of patients. Primary treatments for lesion included
local excision (7.9%), partial penectomy (80.3%), total penectomy (7.9%), and
64
emasculation (3.9%). Fifty-five (43.3%) patients underwent inguinal lymphadenectomy;
8 bilateral prophylactic (pre-emptive), 19 unilateral therapeutic, 20 bilateral therapeutic,
5 hygienic, and 3 sentinel lymph node dissection (data not shown).
Based on the Jackson classification system, 63 patients had stage I cancer, 35
patients had stage II, 24 patients had stage III, and 5 patients had stage IV cancer.
Pathologically-diagnosed groin metastases were seen in 40.9% of patients. Fifty-seven
patients showed low grade tumors (Broders’ grade I), another 57 patients were
diagnosed as grade II, and only 13 patients as grade III. Pathological classifications
were: pTa 3.9%, pT1 35.4%, pT2 21.3%, pT3 34.6%, and pT4 2.4%. Three patients,
despite previous biopsy of invasive tumor, only had carcinoma in situ. Vascular
invasion was observed in 28.8% of patients; severe inflammatory tumor infiltrate was
seen in 86.
The mean (SD) immunostaining scores were 28.2% (25.8) for COX-2 and 8.9%
(17.1) for VEGF-C. For the 52 patients with inguinal metastatic disease, the mean (SD)
expression for COX-2 was 34.1% (27.7) and for VEGF-C was 12.9% (SD20.8). Patients
with no metastatic disease had mean (SD) values of 24.1% (23.8) and 6.1% (13.4) for
COX-2 and VEGF-C, respectively. The cut-off values for positive results obtained by
ROC curves analysis were 15% for COX-2 and 20% for VEGF-C. The distribution of
patients according to IHC status and clinical-pathological profile are given in Tables I
and II. Figure 1 shows the IHC staining for COX-2 and VEGF-C, and Figure 2 shows
the ROC curves for inguinal metastasis according to VEGF-C.
Figure 1- IHC for COX-2 (left) in 200x and VEGF-C (right) in 400x magnification,
both with a staining of 80% of the tumor cells.
Positive COX-2 staining (>15%) was observed in 76 (59.8%) patients. For
VEGF-C, the positive cut-off value was >20% and was seen in 30 (23.6%) patients.
65
VEGF-C
1
100
Sensitivity
80
60
40
Sensibility : 25.0
Specificity : 90.7
Cutoff : >20
20
0
0
20 40 60 80 100
100-Specificity
Figure 2- ROC curves of VEGF-C IHC staining for prediction of groin metastasis.
A positive COX-2 IHC status was associated with severe inflammatory tumor
infiltrate (p=0.03), high histological tumor grade (p<0.01), a deep level of tumor
invasion (p<0.01), and lymphovascular invasion (p=0.04) by univariate analysis. After
multivariate analysis, positive COX-2 staining remained significantly associated with
high histological tumor grade and a deep level of tumor invasion.
66
Table I- Uni and multivariate analysis of clinical and histological variables according to
IHC for COX-2.
Variable
COX-2
Positive
Negative
n (%)
n (%)
p value
n Total
Age (years)
> 59
< 59
40 (58.8) 28 (41.2)
36 (61)
23 (39)
68
59
Jackson stage
0/I/II
III/IV
56 (58.3) 40 (41.7)
20 (54.5) 11 (35.5)
96
31
Koilocytosis
Present
Absent
38 (58.5)
38 (61.3)
27 (41.5)
24 (38.7)
65
62
Histological tumor grade
Low
High
23 (40.4)
53 (75.7)
34 (59.6)
17 (24.3)
57
70
Inflammatory tumor infiltrate
Low
19 (46.3)
Severe
57 (66.3)
22 (53.7)
29 (33.7)
41
86
Level of tumor invasion
Superficial (pTa,T1)
Deep
(pT2-T4)
29 (46)
47 (73.4)
34 (54)
17 (26.6)
63
64
Lymphovascular invasion
Present
Absent
22 (75.9)
54 (55.1)
7 (24.1)
44 (44.9)
29
98
SCS
Death
Alive
16 (66.7)
60 (59.8)
8 (33.3)
43 (40.2)
24
103
Univariate
Multivariate¥
0.80**
--
0.54*
--
0.74**
--
<0.01**
<0.01
0.03**
0.12
<0.01**
<0.01
0.04**
0.97
0.44**
--
.
n= # of patients; * Fisher test; ** Chi-square test; COX-2 positive= >15%; SCS- Specific-cancer survival;
Logistic regression.
¥
Positive staining for VEGF-C was associated with a worse survival (p=0.02)
with evidence of a trend for high histological tumor grade (p=0.06) based on univariate
analysis. The association between positive VEGF-C staining and these variables were
not significant after multivariate analysis (Table II).
67
Table II- Uni and multivariate analysis of clinical and histological variables according
to IHC for VEGF-C.
Variable
VEGF-C
Positive
Negative
n (%)
n (%)
p value
Age (years)
> 59
< 59
16 (23.5)
14 (23.7)
52 (76.5)
45 (76.3)
68
59
Jackson stage
0/I/II
III/IV
19 (19.8) 77 (80.2)
11 (35.5) 20 (64.5)
96
31
Koilocytosis
Present
Absent
18 (27.7)
12 (19.4)
47 (72.3)
50 (80.6)
65
62
Grau tumoral
Low
High
9 (15.8)
21 (30)
48 (84.2)
49 (70)
57
70
Inflammatory tumor infiltrate
Low
8 (19.5)
Severe
22 (25.6)
33 (80.5)
64 (74.4)
41
86
Level of tumor invasion
Superficial (pTa,T1)
Deep
(pT2-T4)
13 (20.6)
17 (26.6)
50 (79.4)
47 (73.4)
63
64
Lymphovascular invasion
Present
Absent
8 (27.6)
22 (22.4)
21 (72.4)
76 (77.6)
29
98
SCS
Death
Alive
10 (41.7)
20 (19.4)
14 (58.3)
83 (80.6)
24
103
Univariate
Multivariate¥
.
n Total
0.97**
--
0.07*
--
0.26**
--
0.06**
0.18
0.45**
--
0.43**
--
0.56**
--
0.02**
0.11
n= # of patients; * Fisher test; ** Chi-square test; COX-2 positive= >15%; SCS- Specific cancer-survival;
¥
Logistic regression.
The evaluation of the outcomes and their association to the variables of interest
as well the survival analysis are given in Table III.
Jackson classification stages III/IV (p<0.01), high histological tumor grade
(p<0.01), a deep tumor level of invasion (p<0.01), lymphovascular invasion (p<0.01),
and severe tumor inflammatory infiltrate (p=0.02) were associated with a higher rate of
groin metastasis by univariate analysis (Table III). Logistic regression revealed that
Jackson stages III/IV (p=0.01) and high histological tumor grade (p=0.03) were
independent predictors of inguinal disease. Variables significantly associated with groin
metastasis, as well a positive IHC status for VEGF-C by univariate analysis showed
worse cancer survival Kaplan Meier curves using log rank test.
68
Table III- Distribution of variables according to the occurrence of groin metastasis and
SCS.
Inguinal Metastais
Present
Absent
n (%)
n (%)
Variable
Age (years)
> 59
< 59
26 (38.2)
26 (44.1)
42 (61.8)
33 (55.9)
Jackson stage
0/I/II
III/IV
26 (27.1)
26 (83.9)
70 (72.9)
5 (16.1)
Histological tumor grade
Low (I)
13 (22.8)
High (II/III)
39 (55.7)
44 (77.2)
31 (44.3)
Koilocytosis
Present
Absent
23 (35.4)
29 (46.8)
42 (64.6)
33 (53.2)
Level of tumor invasion
Superficial (pTa,T1)
17 (27)
Deep
(pT2-T4)
35 (54.7)
46 (73)
29 (45.3)
Lymphovasc. invasion
Present
Absent
11 (37.9)
64 (65.3)
Specific-Cancer Survival
p value
%Alive
p value
Univariate Multivariate£
3 years Log-Rank Multivariate£
0.50*
36 (47.4)
16 (31.4)
40 (52.6)
35 (68.6)
VEGF-C IHC status
Positive (>20%)
Negative
16 (53.3)
36 (37.1)
14 (46.7)
61 (62.9)
0.01
0.03
<0.01
0.14
--
0.77
--
0.22
0.03
0.76
0.04
0.85
0.03
0.31
0.34
--
0.02
0.28
87.3
75
<0.01*
COX-2 IHC status
Positive (>15)
Negative
<0.01
80
82.3
<0.01*
30 (73.2)
45 (52.3)
<0.01
93
83.2
0.19*
11 (26.8)
41 (47.7)
--
91.7
48.4
<0.01*
Inflammatory tumor
infiltrate
Low
Severe
0.90
83.8
78
<0.01*
18 (62.1)
34 (34.7)
--
0.38
72.4
83.7
0.02*
0.58
92.7
75.6
0.07*
-78.9
84.3
0.11*
-66.7
85.6
* Chi-square test; £ Logistic regression.
Multivariate analysis for SCS identified Jackson stages III/IV (p=0.01; odds
ratio [OR] 4.5, 95% confidence interval [CI] 1.4-14.5) and the presence of groin
metastasis (p<0.01; OR 6.8, 95% CI 1.6-27.7) as independent risk factors for this
outcome (data not shown).
The mean and median follow-up were 29.7 and 25 months, respectively. Only 5
patients developed distant metastasis. Twenty-four patients (18.8%) died of PC, 8
showed pulmonary and/or bone metastasis. Most of them died of infection, vascular
rupture or multiple organ failure. The IHC mean (SD) gradings for COX-2 and VEGFC
for these patients were 31.4% (28.1) and 14.5% (18.4), respectively (data not shown).
Figure 3 illustrates the SCS curves for 3 years according to VEGF-C expression.
69
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