Andressa Salvadori Schafer

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA
CENTRO DE CIÊNCIAS RURAIS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA VETERINÁRIA
RESPOSTA IMUNE DE CORDEIROS INFECTADOS
EXPERIMENTALMENTE COM Haemonchus contortus
E TRATADOS COM ASSOCIAÇÃO DE ZINCO E
COBRE INJETÁVEIS
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
Andressa Salvadori Schafer
Santa Maria, RS, Brasil
2014
RESPOSTA IMUNE DE CORDEIROS INFECTADOS
EXPERIMENTALMENTE COM Haemonchus contortus e
TRATADOS COM ASSOCIAÇÃO DE ZINCO e COBRE
INJETÁVEIS
Andressa Salvadori Schafer
Dissertação apresentada ao Curso de Mestrado do Programa de Pós-graduação
em Medicina Veterinária, Área de Concentração em Clínica Médica da
Universidade Federal de Santa Maria (UFSM, RS) como requisito parcial para
obtenção do grau de Mestre em Medicina Veterinária.
Orientador: Profa. Sonia Terezinha dos Anjos Lopes.
Santa Maria, RS, Brasil
2014
Universidade Federal de Santa Maria
Centro de Ciências Rurais
Programa de Pós-graduação em Medicina Veterinária
A Comissão Examinadora, abaixo assinada,
Aprova a Dissertação de Mestrado
Resposta imune de cordeiros infectados experimentalmente com
Haemonchus contortus e tratados com associação de zinco e cobre injetáveis
elaborado por
Andressa Salvadori Schafer
como requisito parcial para a obtenção do grau de
Mestre em Medicina Veterinária
COMISSÃO EXAMINADORA:
----------------------------------------------------Sonia Terezinha dos Anjos Lopes, Dra. (UFSM)
(Presidente/orientadora)
----------------------------------------------------Alfredo Quites Antoniazzi, Dr. (UFSM)
----------------------------------------------------Marcelo Beltrão Molento, PhD. (UFPR)
A minha mãe Lucia por estar sempre ao meu lado em
todos os momentos da minha vida, TE AMO.
AGRADECIMENTOS
À Deus pelo dom da vida e aos meus companheiros Santo Expedito e São Pio.
À minha família maravilhosa Mãe Lucia, Luciano, Vadson, João Pedro, Virginia, Verônica,
Dna Neuza pelo apoio durante toda essa jornada, amo vocês incondicionalmente.
À minha madrinha e amiga Adriana, sem o seu incentivo eu não teria chegado aqui.
À Universidade Federal de Santa Maria, pela oportunidade de realizar a pós-graduação.
À minha orientadora, professora Sonia Lopes por me estender a mão, pela oportunidade e
confiança.
À professora Marta pelo convívio. Devo muito do meu crescimento e amadurecimento a ti.
Ao professor Marcelo Molento pelas valiosas sugestões e por ser o responsável pela minha
paixão à parasitologia e a pesquisa.
À Dna Rosa, técnica do laboratório de parasitologia da UFPR, nunca vou esquecer a paciência
e carinho que teve comigo.
À Maria que a gente tanto incomoda, mas esta sempre disposta a nos ajudar.
À minha colega e amiga Adelina por ser incansável em me explicar metodologias utilizadas
no experimento e pela inestimável colaboração em todo o mestrado, e também aos demais pós
graduandos Zé, Pivoto, Fillipo e Cunha.
Às irmãs que o mestrado me presenteou Tica, Raqueli, Marília e Grazi sempre juntas nas
horas boas e difíceis.
A todo o grupo Santa Lucia: Paraná, Bruna, Gugu, Dario, Fer e Tica pelas horas de lazer até
as horas de treinar a apresentação.
Aos professores Alfredo Antoniazzi e Marcelo Cecim pelo apoio no decorrer desses dois
anos.
Aos queridos estagiários da Clínica de Ruminantes Gabi, Viví, Mateus, Cristiano, Rô,
Marcus, Carpes, Douglas, Carol, Rafa, Josi, Guida, Bernardo e Alessandra minha eterna
gratidão por não medirem esforços para que esse projeto fosse desenvolvido.
À Fernandinha que nos deixou tão cedo a nossa eterna saudade e carinho.
Às minha amigas da vida inteira, Marrí, Marianinha, Nádia e Bárbara pelos desabafos e
incentivo.
Às minha amigas de Curitiba Fer e Dani pelo, apoio desde o meu estágio curricular até os dias
de hoje.
Mestrando: Andressa Salvadori Schafer
Título: Resposta imune de cordeiros infectados experimentalmente com Haemonchus
contortus e tratados com associação de zinco e cobre injetáveis
RESUMO. Na ovinocultura, um dos maiores problemas enfrentados é a verminose. Dentre os
helmintos gastrintestinais que afetam ovinos no Brasil, a espécie Haemonchus contortus é a
mais prevalente e patogênica. Estudos vêm sendo realizados visando o desenvolvimento de
meios alternativos para reduzir o uso de anti-helmínticos e dentre eles, destaca-se o uso de
minerais. O presente estudo teve como objetivo avaliar a resposta imune de cordeiros
experimentalmente infectados com Haemonchus contortus (H. contortus) e tratados com um
composto de zinco (Zn) e cobre (Cu) injetável. Foram utilizados vinte e um animais cruza das
raças corriedale e texel, machos, de oito meses de idade, com peso médio de 17 kg. Os
animais foram divididos em três grupos, GC: (grupo controle), composto por animais
saudáveis; GI: (grupo infectado com H. contortus); GIT: (grupo infectado com H. contortus e
tratado, por via subcutânea, com 1.5mg/kg de zinco e 0,45 mg /kg de cobre nos dias 10 (D10)
e 45 (D45) pós infecção (PI). Animais do GI e GIT foram infectados com 15.000 larvas de H.
contortus. As amostras de sangue foram coletadas nos dias D0, D14, D28, D42, D56 e D70
PI, para determinar as concentrações séricas de interleucinas (IL) - IL1, IL4 e IL6, do
interferom gama (INFγ), do fator de necrose tumoral alfa (TNFα) e das imunoglobulinas (Ig) IgA, IgE, IgG e IgM. A infecção parasitária foi monitorada por contagem de ovos por grama
de fezes (OPG) nos mesmos intervalos da coleta de sangue. Ao término do experimento 5
animais de cada grupo foram submetidos a eutanásia para quantificação da carga parasitária e
para determinar as concentrações de Zn e Cu hepática. Foi observado um aumento
significativo na OPG somente no dia 14 para GI e GIT. Entre os D14 a D42 houve aumento
significativo das citocinas e imunoglobulinas nos GI e GIT quando comparados aos animais
do GC. Após o D52, GI mostrou níveis de interleucinas e imunoglobulinas menores que GIT.
Em relação às concentrações de Zn e Cu hepático verificou-se que a infecção causou uma
depleção destes minerais no fígado, no entanto, a suplementação não preveniu este efeito.
Baseado nestes achados pode-se concluir que a administração de dose de Zn e Cu
incrementou a resposta imune em ovinos infectados com H. contortus e apresenta um
potencial efeito benéfico como terapia complementar no combate a este parasito.
Orientador Principal: Sonia Terezinha dos Anjos Lopes
Palavras chave: H. contortus, minerais, ovinos, haemonchose, imunologia.
Número de páginas da dissertação: 52
Membros da banca
Alfredo Quites Antoniazzi
Marcelo Beltrão Molento
Data da defesa da dissertação: 28 de fevereiro de 2014
Student: Andressa Salvadori Schafer
Title: Immune response of lambs experimentally infected with Haemonchus contortus and
treated with a combination of zinc and copper injectables
ABSTRACT. In the sheep industry, one of the biggest problems faced is the worms; among
gastrointestinal helminths affecting sheep in Brazil, Haemonchus contortus species is most
prevalent and pathogenic. Studies have been conducted to develop alternative to reduce the
use of anthelmintics media and among them we highlight the use of minerals. The present
study aimed to evaluate the immune response of lambs experimentally infected
with Haemonchus contortus (H. contortus) and treated with an injectable compound of zinc
(Zn) and copper (Cu). Twenty four Corriedale and Texel lambs, male, eight months old,
weighing 17 kg, were used as our experimental model. The animals were divided into three
groups, as follows: GC: (control group), composed by healthy animals; GI: (group infected
withH.contortus); GIT: (group infected with H. contortus and treated). Animals of GIT were
treated subcutaneously with 1.5mg/kg of Zn and 0.45 mg/kg of Cu on days 10 (D10) and 45
(D45) post-infection (PI). Animals of GI and GIT were orally infected with 15,000 larvae
of H. contortus. Blood was drawn, from all the animals, on days 10, 24, 38, 52, 66 and 80 p.i.
in order to evaluate the serum concentrations of interleukins (IL1, IL4 and IL6), interferongamma (INFγ), tumor necrosis factor (TNFα) and immunoglobulins (IgA, IgE, IgG and IgM).
The parasitic infection was monitored through counting of eggs per gram of feces (EPG), at
the same intervals of blood drawing. At the end of the experiment 5 animals from each group
were euthanized for quantification of parasite load and to determine the concentrations of Zn
and Cu liver. A significant increase in OPG only on day 14 for GI and GIT was observed.
Between D14 to D42 significant increase of cytokines and immunoglobulins in GI and GIT
compared to animals of the GC. After D52, GI showed levels of interleukins and
immunoglobulins smaller than GIT. Regarding the concentrations of Zn and Cu liver was
found that the infection caused a depletion in the liver of these minerals, however,
supplementation did not prevent this effect. Based on these findings we can conclude that the
administration of a dose of Zn and Cu increased the immune response in infected sheep with
H. contortus response, and presents a potential beneficial effect as adjunct therapy to combat
this parasite.
Adviser: Sonia Terezinha dos Anjos Lopes
Keywords: H. contortus, minerals, sheep, haemonchose, immunology.
Number of pages of the Dissertation: 52
Examining board
Alfredo Quites Antoniazzi
Marcelo Beltrão Molento
Date of Defense: february 28th
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1Figura 2Figura 3-
Figura 4-
Sinais clínicos de hemonchose. A) Edema submandibular; B) Mucosa
ocular pálida.............................................................................................12
Ciclo de vida do parasito Haemonchus contortus.....................................13
Técnica McMaster, desenvolvida por GORDON e WHITLOCK (1939).
A) Câmera de McMaster; B) Visualização em microscópio para
contagem de ovos por gramas de fezes; C) ovos strongylida...................14
Os mecanismos envolvidos na reação de auto cura contra helmintos
intestinais. Em essência, o animal monta uma resposta alérgica aos
antígenos da saliva dos nematódeos aderidos. Essa resposta inflamatória
aguda faz com que o verme se solte da parede e seja eliminado nas
fezes............................................................................................18
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO............................................................................................................. 11
2. REVISÃO DE LITERATURA.................................................................................... 16
2.1. Resposta Imune frente ao parasita............................................................................... 16
2.2. Zinco e Cobre.............................................................................................................. 19
3. ARTIGO 1 - Resposta imune de cordeiros infectados experimentalmente
com Haemonchus contortus e tratados com associação de zinco e cobre
injetáveis ........................................................................................................................... 22
Abstract............................................................................................................................... 23
Introdution........................................................................................................................... 24
Material and Methods.......................................................................................................... 25
Results................................................................................................................................. 28
Discussion........................................................................................................................... 30
References.......................................................................................................................... 37
CONSIDERAÇÕES FINAIS....................................................................................... 47
REFERÊNCIAS............................................................................................................ 48
11
1. INTRODUÇÃO
A ovinocultura brasileira passou nos últimos anos por uma série de mudanças de
paradigmas culturais, focando cada vez mais em manejos eficientes, aumentando a
lucratividade da criação. Prova disso, é a evolução do rebanho ovino brasileiro, o qual no ano
de 2010 contava com 16,8 milhões de cabeças aumentando para 17,3 milhões de animais no
ano de 2011. O Rio Grande do Sul representa 32,57 % do rebanho nacional, tornando-se o
estado com maior número de animais (IBGE, 2011).
A redução do índice de produtividade do rebanho ovino no país, em sua maioria, pode
ser associada às infecções parasitárias, principalmente decorrente do nematódeo
gastrintestinal da espécie Haemonchus contortus, devido à sua alta patogenicidade e
prevalência no país (AMARANTE et al., 2009).
Dentre os helmintos gastrintestinais que afetam ovinos e caprinos no Brasil, a espécie
Haemonchus contortus (Figura 1) é a mais prevalente e patogênica (AMARANTE, 2001).
Este nematóide pertence ao Filo Nemathelminthes, Classe Nematoda, Ordem Strongylida,
Superfamília Trichostrongyloidea, Família Trichostrongylidae, Gênero Haemonchus com
várias espécies, mas a principal é a espécie Haemonchus contortus (VIEIRA, 1989).
Este parasito do abomaso é essencialmente hematófago, ou seja, durante a sua vida
parasitária, alimenta-se de sangue do hospedeiro e, como consequência, os animais portadores
de carga parasitária elevada podem apresentar edema submandibular (Figura 1.A) pela
hipoproteinemia, anemia acentuada (Figura 1.B) e elevada taxa de mortalidade
(AMARANTE, 2001).
O ciclo de vida do Haemonchus contortus tem duas fases. A primeira é de vida livre,
ocorre nas pastagens, sendo caracterizada pelo desenvolvimento de um ovo embrionado até a
fase de larva infectante (L3). A segunda se dá no hospedeiro após a ingestão da L3 dando
prosseguimento ao desenvolvimento larval até a fase adulta (LE JAMBRE, 1983). Na fase de
vida parasitária, os aspectos relativos à genética, nutrição, estados fisiológicos, manejo do
rebanho, taxa de lotação, regime de criação e aspectos relativos ao bem-estar animal repercute
no desenvolvimento dos nematódeos (VIEIRA et al, 2002).
12
A
B
FIGURA 1. Sinais clínicos de hemonchose. A) Edema submandibular B) Mucosa ocular pálida.
Fonte: Marcelo Beltrão Molento
A fase de vida livre consiste na eclosão dos ovos, eliminados junto às fezes e no
desenvolvimento da larva até o estágio infectante (terceiro estágio, L3); este desenvolvimento
compreende uma série de etapas e processos, que sofre influência constante das condições
climáticas e do microclima da pastagem (O’CONNOR et al., 2006). Em adição, a ocorrência
de chuvas estimulam o desenvolvimento e a migração das L3 presentes nas fezes para a planta
forrageira, e consequentemente, a contaminação dos animais durante o hábito de pastejo
(ROCHA et al., 2008; SILVA et al., 2008). Após a ingestão, junto à pastagem, as L3 sofrem
duas mudas no trato gastrintestinal do hospedeiro, para larva de quarto estágio (L4) e larva de
quinto estágio (L5), forma adulta, e se diferenciam em machos e fêmeas. Os parasitas adultos
(L5) são encontrados preferencialmente parasitando o abomaso e, após a cópula, uma fêmea
do parasita Haemonchus spp. libera junto às fezes aproximadamente 5000 ovos/dia (LE
JAMBRE, 1983) (Figura 2).
A elevada patogenicidade do gênero Haemonchus leva a um decréscimo no
desempenho produtivo e/ou reprodutivo dos animais, anemia e, em casos extremos, pode
levar o hospedeiro a óbito. As principais categorias acometidas pelo parasita são os animais
jovens e as fêmeas no período do periparto, devido a menor eficiência de sua reposta
imunológica (ROCHA et al.,2004).
As espécies de Haemonchus spp. diferem morfologicamente entre si, as L3 de H.
contortus e Haemonchus placei são identificadas a partir da distância entre a extremidade
posterior da larva e o final da cauda da bainha (Fig. 1): os valores médios são de 73,6 (± 0.53)
μm em H. contortus e 99,2 (± 0.7) μm em H. placei (SANTIAGO, 1968).
13
A prevalência de H. contortus em ovinos, assim como a ocorrência de infecções
mistas por H. contortus e H. placei foram relatadas em diversos estudos, quando os ovinos
compartilham pastagens com outros ruminantes. Na África ocidental, em pastagens
comumente compartilhadas por dromedários, ovinos, caprinos e zebuínos, 56% do total de
exemplares de H. placei foram encontrados em ovinos e somente 10% em bovinos zebuínos.
Porém, os principais hospedeiros de H. contortus foram os pequenos ruminantes (JACQUIET
et al., 1998).
FIGURA 2. Ciclo de vida do parasito Haemonchus contortus.
Fonte: pubs.ext.vt.edu.
A infecção de animais pelos helmintos que vivem no trato gastrintestinal é usualmente
diagnosticada in vivo, através de técnicas laboratoriais com o uso da microscopia óptica
(Figura 3). A técnica McMaster (Figura 3.A), desenvolvida por GORDON e WHITLOCK
(1939) (Figura 3.B) foi originalmente testada e descrita para contagem de ovos de helmintos
gastrintestinais de ovinos (Figura 3.C), sendo mais utilizada para avaliações quantitativas do
número de ovos por grama de fezes.
14
A
B
C
FIGURA 3. A) Técnica McMaster, desenvolvida por GORDON e WHITLOCK (1939) Câmera de McMaster;
B) Visualização em microscópio para contagem de ovos por gramas de fezes; C) ovos strongylida.
O controle de verminose em ovinos é realizado quase que exclusivamente com o uso
de anti-helmínticos. No entanto, devido à falta de conhecimentos no que se refere à biologia e
à epidemiologia dos parasitos, a maioria dos produtores não fornecem vermífugos
adequadamente aos seus rebanhos. Na maioria das vezes, a administração de anti-helmínticos
é realizada sem base técnica, visando apenas atender a um programa fixo de controle e/ou
quando o rebanho é manejado, para adoção de outras práticas de manejo. Consequentemente,
tem sido observada uma crescente redução na eficácia dos vermífugos (MOLENTO et al.,
2004), O crescimento da resistência ocorre, portanto, em escala mundial, tanto no número de
espécies de parasitos afetados como na variedade de princípios ativos envolvidos
(ZACHARIAS, 2004).
O nível de resistência em uma raça/rebanho é analisado através dos resultados de OPG,
devido sua comprovada correlação positiva com o valor da carga parasitária. A tolerância, por
outro lado, apóia-se nos valores de VG (análise funcional apenas para parasitas hematófagos) e na
comparação de resultados produtivos (ganho de peso ou produção de lã) entre animais infectados
e não infectados (BAKER et al., 2003). Ainda, na Nova Zelândia, utiliza-se o registro do número
de vezes que o animal foi submetido há tratamentos anti-helmínticos na seleção para tolerância.
Resultados demonstram que a tolerância é expressa mais cedo, aos 2 meses de idade, enquanto a
resistência apenas aos 4-5 meses (BAKER et al., 2003).
As características genéticas que conferem resistência são traduzidas em diferentes
modificações bioquímicas e moleculares que determinam a diminuição do efeito da droga
contra o parasito, isso ocorre em menos de 5% de uma população normal susceptível, assim o
anti-helmíntico, quando utilizado pela primeira vez, apresenta eficácia elevada, no entanto, o
uso frequente do mesmo princípio ativo aumenta a população de indivíduos resistentes e,
consequentemente, reduz a eficácia do produto (MOTTIER; LANUSSE, 2001).
15
Estudos vêm sendo realizados visando ao desenvolvimento de meios alternativos para
reduzir o uso de anti-helmínticos no controle da gastroenterite verminótica, dentre eles,
rotação de pastagens, uso de plantas que diminuem a sobrevivência das larvas, tratamento
seletivo, fungos nematófagos, vacinas, sistemas de criação de piso ripado, seleção de raças
resistentes e o emprego de minerais. Nesse sentido os minerais tem sido foco de pesquisas por
exercer estímulo ao sistema imune de ovinos. Resultados demonstraram que esses elementos,
quando em deficiência, afetam negativamente as habilidades dos animais em desenvolver
competência imune frente à Haemoncose (LEAL et al., 2010; SOLI et al., 2010). Nesse
sentido, Busca-se o uso de minerais como “drogas de performance”, que aplicados de maneira
estratégica, permitam plena expressão do potencial imune, eritropoiético e produtivo do
animal frente ao desafio da hemoncose com o intuito de aumentar as defesas imunitárias dos
ovinos frente aos parasitas.
16
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. Resposta imune frente ao parasita
A resposta imune tem papel fundamental na defesa contra agentes infecciosos e se
constitui no principal impedimento para a ocorrência de infecções disseminadas
habitualmente associadas com alto índice de mortalidade. O sistema imunológico é um dos
sistemas mais importantes do organismo animal, pois compreendem todos os mecanismos
pelos quais o organismo se defende de invasores externos. Para que o organismo animal esteja
realmente protegido contra estes microrganismos, é necessário que tenhamos um sistema
imunológico atuando de maneira eficiente e efetiva (JANEWAY, 2001).
A defesa inata esta presente desde o nascimento, não é específica e pode responder aos
diferentes agentes da mesma forma sem produzir células de memória. Compreende barreiras
estruturais (pele e membrana de mucosas) e fisiológicas (pH e níveis de oxigênio). Em adição,
células fagocitárias e outros leucócitos, como as células natural killer (NK), estão envolvidos
diretamente na fagocitose, pinocitose, morte celular e resposta inflamatória. Tais processos
não são influenciados pelo contato prévio com o agente infeccioso e formam a primeira linha
de defesa do organismo, retardando o processo da infecção, as células mais importantes na
resposta imune inata são neutrófilos e macrófagos a qual produzem citocinas, proteínas
sinalizadoras que recrutam outras células inflamatórias durante o desencadeamento da
resposta inflamatória (DELCENSERIE et al., 2008).
A defesa imune adquirida atua por um maior período que a inata a apresenta
especificidade e memória. Essa defesa fornece uma proteção mais efetiva contra patógenos
por sua habilidade de memorizar e reconhecer expressivo número de antígenos. É composta
por células de memória B e T. As células B contribuem para a resposta imune por meio de
secreção de anticorpos ou imunoglobulinas que são subdivididas em quatro classes: IgA, IgE,
IgM e IgG (imunidade humoral) e as células T, na imunidade mediada por células (KLAUS et
al., 2003).
O sistema complemento é o principal mediador humoral do processo inflamatório
junto aos anticorpos. Está constituído por um conjunto de proteínas, tanto solúveis no plasma
como expressas na membrana celular, e é ativado por diversos mecanismos por duas vias, a
17
clássica e a alternativa, cada uma delas é desencadeada por fatores diferentes, sendo o início
da ativação diferente para cada uma, mas que convergem em uma via comum (ITURRY,
2001).
As infecções helmínticas e a resposta imunológica, correspondente do hospedeiro, são
produtos de uma prolongada relação co-evolucionária entre o hospedeiro e o parasito
(ANTHONY et al., 2007). Ao parasito é vantajoso ludibriar o hospedeiro induzindo-o a
desenvolver uma resposta imune ineficiente, buscando um nicho adequado para maturação e
propagação, sem matar ou prejudicar o hospedeiro. Reciprocamente, o hospedeiro tem por
ideal gerar uma resposta imune eficaz para expulsar o parasito, minimizar seus efeitos
nocivos, enquanto não sacrifica sua capacidade de elaborar resposta contra outros patógenos
(ANTHONY et al., 2007)
Após o parasito se alojar na mucosa do hospedeiro, um mecanismo efetivo inicial
importante no controle da carga parasitária, e nos fenômenos de autocura, é a inflamação da
mucosa (WAKELIN, 1978). A inflamação é desencadeada quando o organismo percebe que
está sendo atacado, desta maneira, utiliza-se de células sentinelas, como por exemplo,
mastócitos, macrófagos e as células dendríticas que são ativadas quando padrões moleculares
associados a patógenos (PAMPs) ou alarminas se ligam a seus receptores. Em resposta eles
sintetizam e secretam citocinas e outras moléculas, a qual desencadeia a inflamação, enquanto
inicia a ativação da imunidade adquirida (TIZARD, 2013).
Após as infecções por helmintos, o número de eosinófilos pode aumentar no sangue e
tecidos, sua liberação da medula óssea é estimulada por citocinas. As citocinas e quimiocinas
são produzidas pelos linfócitos T helper 2 (Th2) e mastócitos. Os eosinófilos são atraídos aos
locais de desgranulação dos mastócitos, e ativados, aumentando a sua habilidade para destruir
os parasitos (BALIC et al., 2000). Estudos in vitro demonstraram a importância dos
eosinófilos no combate aos parasitos e, em muitos casos, os eosinófilos agem mais
efetivamente contra os estágios larvais, necessitando da cooperação dos anticorpos, e/ou
sistema complemento, para a maior eficácia (MEEUSEN; BALIC, 2000). In vivo os
eosinófilos foram capazes de danificar e, provavelmente, matar as L3 de H. contortus em
ovinos infectados experimentalmente. Contudo, a presença dos eosinófilos no tecido, por si
só, não é suficiente e depende da interação com outros fatores microambientais, como a ação
de mastócitos intra epiteliais e da IL4 (BALIC et al., 2006).
As citocinas são glicoproteínas que podem atuar como mediadoras intercelulares de
muitos processos biológicos, como inflamação, fibrose, reparação, angiogênese, regulação da
hematopoiese, controle de proliferação e diferenciação celular e ativação da resposta imune
18
celular e humoral (FELLDMANN, 2008). Possuem papel essencial na formação dos sinais
locais ou sistêmicos da inflamação, sendo produzidas e liberadas por vários tipos de células
em resposta a estímulos desencadeados por agentes infecciosos ou em resposta a outras
citocinas (COTRAN et al., 2000; ROITT et al., 2003).
As citocinas que ativam as células inflamatórias estimulam a produção de interferomgama (IFNα), uma citocina ativadora de macrófagos. Essas células uma vez ativadas passam a
produzir citocinas pró-inflamatórias (ABBAS et al., 2012).
A resposta imunológica contra agentes infecciosos é representada pela resposta celular
e humoral, com grande produção de anticorpos. Os anticorpos ou imunoglobulinas são
glicoproteínas produzidas por linfócitos B em resposta à estimulação antigênica (BUSH,
2004). Os anticorpos secretados realizam várias funções efetoras, como neutralização de
antígenos, ativação de complemento, fagocitose e destruição de microorganismos (ABBAS et
al., 2012) (Figura 4.).
Figura 4: Os mecanismos envolvidos na reação de auto cura contra helmintos intestinais. Em essência, o animal
monta uma resposta alérgica aos antígenos da saliva dos nematódeos aderidos. Essa resposta inflamatória aguda
faz com que o verme se solte da parede e seja eliminado nas fezes.
Fonte: Tizard, 2008.
O principal isotipo de imunoglobulina no sangue e nos fluidos extracelulares é a IgG,
que exerce papel principal nos mecanismos de defesa mediado por anticorpos (TIZARD,
2013). A IgG também atua na neutralização de toxinas, imobilização de bactérias,
sensibilização para as células natural killer (NK), ativação do complemento e opsonização. A
19
IgM é a principal classe da Ig produzida durante uma resposta imune primária, é capaz de
ativar o complemento de maneira mais eficaz, o que contribui para o controle mais eficiente
de uma infecção (MOLINARO et al., 2009).
A IgA é a principal Ig presente em secreções externas, tendo como função principal
impedir a aderência de antígenos a superfícies corpóreas. Por fim, a classe de IgE liga-se a
receptores nos mastócitos e basófilos, promovendo a reação inflamatória, através da liberação
de mediadores químicos como histamina e fatores quimioatraentes. Além disso, podem estar
envolvida em processos alérgicos e na eliminação de helmintos, quando sensibilizam
eosinófilos (TIZARD, 2013).
Durante o hábito hematófago os parasitas abomasais podem lesionar a mucosa e, ao
reparar a lesão, o organismo utiliza as proteínas da dieta, que usualmente seriam destinadas
para a manutenção, desenvolvimento e reprodução do animal. Além desses fatores, a proteína
da dieta pode ser desviada para contribuir com a resposta imune, pois muitos componentes do
sistema imunológico, as imunoglobulinas, citocinas e proteases liberadas pelos mastócitos
celulares são proteínas in natura (HOUDIJK et al., 2005).
A resposta imune eficiente, contra infecções helmínticas, gera um custo ao
metabolismo do animal. Estima-se que a manutenção da imunidade contra nematódeos
gastrintestinais em ovinos implica em perdas de 15% na produtividade (GREER, 2008).
2.2. Zinco e Cobre
O zinco atua como integrante da estrutura de metalo-enzimas, e o cobre funciona
como ativador de processos enzimáticos (TOKARNIA, 2000). O zinco faz parte de um
grande número de enzimas e ainda atua como cofator de outras. Sua deficiência em
ruminantes causa redução no crescimento, na ingestão de alimentos e na conversão alimentar,
além de causar ou exacerbar problemas ósseos e reduzir a imunidade. Em condições de alto
estresse, há prioridade do zinco para o sistema imunológico, a fim de fortalecer o mecanismo
de defesa. Desse modo, a síntese de queratina, proteína integrante da pele e dos pêlos, tem
menor prioridade, e podem ocorrer alopecia e paraqueratose (PEIXOTO et al., 1994).
No sistema imunológico o zinco desempenha papel fundamental, pelo fato de as
células do sistema imune apresentarem altas taxas de proliferação, e este mineral estar
envolvido na tradução, transporte e replicação do DNA. O zinco pode, ainda, afetar o
20
processo de fagocitose dos macrófagos e neutrófilos, interferir na lise celular mediada por
células natural killer e ação citolítica das células T. A influência direta do zinco no sistema
imune acontece devido a este elemento estimular a atividade de enzimas envolvidas no
processo
de
mitose,
como
a
DNA
e
a
RNA
polimerase,
timidina
quinase,
desoxiribonucleotidol terminal transferase e ornitina descarboxilase (SENA., 2005).
A enzima metalotioneína representa a maior reserva de zinco no organismo animal e
está presente em consideráveis concentrações no fígado, rins, pâncreas e intestino, apesar do
Zn estar distribuído em diversos tecidos, há considerável dificuldade em mobilizar
rapidamente essas reservas em casos de deficiência, além disso, o zinco não tem órgão
especifico para ser estocado em ruminantes (McDOWELL, 2003).
Quando a deficiência de zinco se estabelece, ocorre atrofia do timo, principal órgão
do sistema imune, com perda da função normal das células T (resposta celular) e diminuição
das células B (resposta humoral), que pode ser demonstrada pela depressão na produção de
imunoglobulinas G e M (HAMBIDGE et al., 1996).
O cobre é um microelemento ou elemento traço e é fundamental na regulação de
muitos processos vitais, tais como crescimento e diferenciação celular, respiração celular,
melanina, colágeno, elastina e síntese de hemoglobina (SHARMA, 2005).
Em ruminantes, o cobre juntamente com outros minerais, podem se combinar no
rúmen para formar complexos triplos não absorvíveis denominados cupro-tiomolibdatos (CuTMs). O efeito fisiológico importante dos Cu-TMs está na restrição da disponibilidade de Cu
para a síntese de ceruloplasmina, a qual é responsável por carreiar esse mineral para tecidos
específicos do organismo (VÁSQUEZ, 2001). Sua deficiência esta ligada a redução na
produção de hemoglobina, da formação dos ossos, da pigmentação do pêlo e da lã e também
no funcionamento do coração e sistema nervoso central (SILVA; BARUSELLI, 2001).
Quando se tem uma deficiência de cobre, os linfócitos T e B, neutrófilos e macrófagos
reduzem a sua função, ocorrendo uma redução das células protetoras como os anticorpos e,
consequentemente, em uma redução na resposta imunológica específica e inespecífica. Com
isso estão, tem-se um animal com sistema imunológico debilitado e susceptível ao ataque de
microorganismos (BABIOR et al., 1973). O cobre é proveniente dos alimentos e apresenta
pequena disponibilidade, ao redor de 4%, e está intimamente ligado à forma química a qual se
encontra e sua solubilidade (ORTOLANI, 2002).
Pesquisadores da Nova Zelândia relataram que a administração oral de 4,1 gramas de
partículas de óxido de cobre de liberação lenta (COWP) para ovinos, acarreta uma redução
significativa no número de parasitas recuperados na necropsia, com uma redução de 96% para
21
Haemonchus contortus e 56% para Ostertagia circumcincta (SOLI, 2010). A necessidade de
uma adequada suplementação de micro elementos segue um importante papel fundamental no
organismo animal, mediante regulação de funções e auxílio no adequado funcionamento do
sistema imune (UNDERWOOD; SUTTLE, 1999). Animais deficientes em Cu e Zn mostram
reduzida capacidade fagocitária. Fato associado à diminuição da disponibilidade da enzima
Cu/Zn SOD requerida pelos macrófagos e neutrófilos (BATISTA, 2009).
A resposta imune produzida pelo hospedeiro após o contato com o parasita é
complexa, vários fatores estão relacionados para uma resposta imunológica eficiente frente ao
Haemonchus contortus, como por exemplo, genética, categoria do animal, nutrição e fatores
intrínsecos do hospedeiro (SANTOS, 2013). Medidas corretas de manejo e suplementação
mineral podem contribuir para a resposta mais eficiente do hospedeiro frente ao parasita.
22
3. ARTIGO1
Immune response of lambs experimentally infected with Haemonchus contortus and
parenterally treated with a combination of zinc and copper
Andressa S. Schafera*, Marta L. R. Lealb, Marcelo B. Molentoc, Adelina R. Airesb,
Marta M.M.F. Duarted, Fabiano B. Carvalhof, Alexandre A. Tonina, Lucas Schmidte,
Erico Florese, Raqueli T. Françaa, Thirssa H. Grandog, Gabriela A. Szinwelskib, Alfredo
Q. Antoniazzib, Sonia T.A. Lopesa
a
Laboratório de Análises Clínicas Veterinárias, Departamento de Clínica de Pequenos Animais, Hospital
Veterinário Universitário, Universidade Federal de Santa Maria (UFSM), Rio Grande do Sul, Brazil.
b
Laboratório de Endocrinologia e Metabologia Animal, Departamento de Clínica de Grandes Animais, Hospital
Veterinário Universitário, Universidade Federal de Santa Maria (UFSM), Rio Grande do Sul, Brazil.
c
Laboratório de Doenças Parasitárias da Universidade Federal do Paraná (UFPR), Paraná, Brazil.
d
e
Universidade Luterana do Brasil (ULBRA), Santa Maria, Rio Grande do Sul, Brazil.
Laboratório de Química Industrial e Alimentar Universidade Federal de Santa Maria (UFSM), Rio Grande do
Sul, Brazil
f
Setor de Bioquímica e Estresse Oxidativo do Laboratório de Terapia Celular, HospitalVeterinário, Universidade
Federal de Santa Maria (UFSM), Rio Grande do Sul, Brazil.
g
Laboratório de Parasitologia Veterinária da Universidade Federal de Santa Maria (UFSM), Santa Maria, Rio
Grande do Sul, Brazil.
*Corresponding author at: Laboratório de Análises Clínicas Veterinárias, Departamento de Clínica dePequenos
Animais, Hospital Veterinário Universitário, Universidade Federal de Santa Maria (UFSM), Avenida
Roraima 1000, CEP 97105-900, Santa Maria, Rio Grande do Sul, Brazil. Tel.: (+55) 55 9994 9003 Fax:
(+55) 3220 -8814
E-mail: [email protected] (A.S. Schafer).
1
Artigo de acordo com as normas do periódico Veterinary Parasitology
23
ABSTRACT
The present study evaluated the immune response of lambs experimentally infected
with Haemonchus contortus (H. contortus) and treated with zinc (Zn) and copper (Cu)
associated. Twenty-one (21) lambs were divided into three groups: CG (control group), IG
(infected group – infection performed with 15,000 larvae of H. contortus/group) and GIT
(group infected and treated subcutaneously with 1.5mg/kg of Zn and 0.45mg/kg of Cu on the
days 10 and 45 post-infection [PI]). Blood samples were drawn on days 0, 14, 28, 42, 56 and
70 PI in order to determine the serum concentrations of IL1, IL4 and IL6, INFγ, TNF-α and
IgA, IgE, IgG and IgM. The parasitic infection was monitored by the counting of eggs per
gram of feces (EPG) on the same intervals of blood sampling. At the end of the experiment
the animals were euthanatized and the parasite load was quantified, as well as the
concentrations Zn and Cu liver were assessed. It was observed a significant increase in EPG
only on day 14 PI for IG and IGT. Between D14 to D42 there was a significant increase of
cytokine and immunoglobulin levels in IG and GIT, when compared with the animals of CG.
After D52, the IG showed serum level of interleukins and immunoglobulins smaller than GIT.
Regarding the liver concentrations of Zn and Cu, it was observed that the infection led to a
depletion of these minerals; therefore, the supplementation did not prevent this effect. Based
on these findings, it is possible to conclude that the administration of Zn and Cu was able to
increase the immune response in lambs experimentally infected with H. contortus, presenting
a potential benefic effect as an adjunct therapy to combat this parasite.
Palavras chaves: H. contortus; sheep; lambs; minerals; immunology.
24
1. Introduction
The gastrointestinal parasite Haemonchus contortus is the major cause of production
losses in small ruminants in tropical and temperate climates (Bambou et al., 2009). This
gastrointestinal nematode is highly prevalent in several regions of Brazil (Fernandes et al.,
2004). It has parasitic activity on the abomasum mucosa, usually causing spoliation due its
hematophagous behavior. This spoliation can lead to severe anemia, weight loss and high
mortality (Amarante, 2001). In highly parasitized animals the anemia is usually severe, may
leading to the animal death, characterizing a hyperacute infection. In case of the disease
coursing with the chronic phase, these signals previously mentioned are intensified, often
accompanied by a severe submandibular and ventral swelling, mainly due to the
hypoalbuminemia (Cavalcanti et al., 2009; Fonseca et al., 2011).
H. contortus induces the innate and adaptive immune responses, which are essential
for the clearance of this nematode of the host (Meeusen et al., 2005). Cytokines are part of the
innate immune response, presenting an essential role in the formation of local or systemic
inflammation signs. They are produced and released by many cell types, usually in response
to a stimuli often caused by infectious agents, or in response to other cytokines (Cotranet al.,
2000; Roitt et al., 2003). The antibodies, or immunoglobulins, are produced by B
lymphocytes in response to antigenic stimulation, and they act in the adaptive immune
response (Bush, 2004). Thus, the determination of cytokine and immunoglobulin
concentrations is essential for assessing the host immune response, especially in infections
caused by gastrointestinal nematodes (Colditz, 2008).
Due to the high mortality rates, drastic productivity reduction, high treatment costs, as
well as the great parasite resistance against most of the drugs currently in use (Molento et al.,
2009), many studies have been conducted seeking for other alternatives in order to reduce the
frequent and indiscriminate use of anthelmintic drugs, especially with utilization of elements
25
that can boost the host immune response to cope the infection. One of these alternatives
includes administration of minerals (Soli et al., 2010). In this sence, Zinc (Zn) is a mineral
that plays an important role in the animal organism, since it is an essential component of more
than 300 enzymes (Spears and Weiss, 2008). A Zn deficiency is associated with the reduction
in phagocytosis, lymphocyte population, as well as causing spleen and thymus atrophy
(Borges and Paschoal, 2012).
Likewise, the role of copper (Cu) in animal organism is also associated with the
activity of some important enzymes (Herdt and Hoff, 2011). This mineral takes part of
antioxidant mechanisms, as well as in the modulation of the inflammatory response, as part of
the acute phase proteins in infections, or even in stress conditions (Gaetke and Chow, 2003).
Cu is critical in the regulation of many vital processes, such as cell growth and differentiation,
cellular respiration, formation of melanin, collagen and elastin, as well as it participates in the
hemoglobin synthesis (Sharma, 2005).
Some researchers have shown that the use of copper and other minerals, as nutritional
supplements, can help controlling the parasites (Nicolodi et al., 2010; Fausto, 2011); however,
there is still lacks of studies using combination of minerals in attempt to provide better
conditions to face the severe parasitism caused by H. contortus. Thus, this study aimed to
evaluate the effects of parenteral administration of Zn associated with Cu, in the innate and
adaptive immune responses of lambs experimentally infected with H. contortus, by the
determination of serum cytokines (IL1, IL4 and IL6, INFγ and TNF-α) and immunoglobulins
(IgA, IgE, IgG and IgM).
2. Material and Methods
2.1. Experimental design
26
Twenty-one crossbred (Texel and Corriedale) male lambs, eight months old, and
weighing in average 17 kg, were housed in collective pens. During the adaptation to the diet
and experimental environment (20 days), all the animals were treated with monepantel-base
anthelmintic (ZOLVIX®). After this adaptation period, the lambs were separated into three
distinct pens, randomly divided into three groups of seven animals each. Control Group (CG)
was composed by uninfected animals, while in the Infected Group (IG) the animals were
infected with H. contortus larvae, as well as the Group Infected and treated (GIT) that was
also infected with H. contortus; however GIT received additionally a parenteral treatment
with zinc and copper. The experimental protocol was approved by the Comitê de Ética no Uso
de Animais (CEUA) of Universidade Federal de Santa Maria, registration number 012/2011.
2.2. Experimental infection
All lambs were certified as negative the parasite before the experimental period. The
infection was carried out with three doses of 5000 infective larvae (L3) of H. contortus,
administered orally within an interval of three days between doses, totaling 15,000 larvae per
animal. The first day of the experimental infections was considered as the day 0 (D0). The H.
contortus larvae were obtained from coproculture, through the method described by
O'Sullivan and Roberts (1950). The coproculture material was obtained from a donor lamb,
experimentally infected with a monospecific culture.
2.3. Diet
The animals were fed with a diet containing 11% protein, composed of ryegrass hay
(Lolium multiflorum) and commercial ration (Supra®). On day 30 PI, the diet was changed in
order to increase the total protein to 13%. This change was performed because the intensity of
the clinical symptoms exhibited by the animals infected with H. contortus. The hematocrit of
27
some animals was recorder as 12% (normal: 27-45%). Each animal was fed with 1 kg of dry
matter/day and water ad libitum.
2.4. Treatment
The treatment was performed with Suplenut® (Biogenesis-Bagó, Buenos Aires,
Argentina), according to the specifications and characteristics of the product, or 1.5mg of Zn
EDTA/kg/BW, associated with 0.45mg of Cu EDTA/kg/BW. Volumetrically, 0.033
mL/kg/BW of the compound was subcutaneously injected in the animals, on days 10 (D10)
and 45 (D45) PI.
2.5. Sampling
Blood samples were drawn by jugular puncture, using vacuum tubes without anticoagulant, on days 0 (D0), 14 (D14), 28 (D28), 42 (D42) 56 (D56) and 70 (D70) PI. In order
to obtain serum samples, the material was centrifuged, divided into three polypropylene tubes
(for 1.5 ml), and stored at -80 ° C. At the same experimental periods, fecal samples were
collected (directly from the rectum) to perform the counting of eggs per gram of feces (EPG),
by the method of McMaster (Coles et al., 2006). Immediately after the last sampling
collection, five animals from each group were euthanized (protocol: 10 mg acepromazine 2%,
intravenous [IV]; 2g of thiopental sodium [IV] and 100 mL of potassium chloride intravenous
[IV]), in order to determine the parasite load (Ueno and Gill, 1998). Fragments of liver tissue
were also collected to assessment of zinc and copper concentrations.
2.6. Evaluated parameters
2.6.1. Serum Cytokines
28
Serum cytokines (IL-1, IL4, IL6, TNFα and INFγ were quantified by ELISA, using
commercial kits (Bioscience, San Diego, EUA).
2.7. Serum immunoglobulins
Serum immunoglobulin (IgG, IgM, IgA and IgE) were determined by standard
nephelometry, using commercial kits (Dade Behring Diagnostic, Marburg, Germany), and
following the manufacturer's instructions. The commercial kits used in cytokines and
immunoglobulins were previously standardized for sheep.
2.8. Determination of hepatic concentrations of Zn and Cu
Concentrations of Cu and Zn were determined by optical emission spectrometry with
inductively coupled plasma (ICP-OES), in a PerkinElmer spectrometer (Optima 4300 DV).
2.9. Statistical analysis
Concentrations of cytokines, immunoglobulins, zinc and copper were subjected to
one-way analysis of variance (ANOVA), followed by post hoc Student Newman Keuls test.
Data of parasitic load and EPG were submitted to Kruskal Wallis test, a variation of the nonparametric one-way ANOVA, followed by the post hoc Tukey test. The significance level was
considered as 5% (P <0.05). Interleukins, immunoglobulins, zinc and copper were shown as
means and standard deviation. EPG and parasite load are expressed as median +/- interquartile
range. Statistical analyzes were performed with the statistical software Graphpad Prism 5.0.
3. Results
3.1. Cytokines
29
Figure 1 shows the serum levels of IL-1 (A), IL-4 (B), IL-6 (C), TNF-α (D) and INF-y
(E) throughout the 70 days of the experiment. It represents the animals infected with H.
contortus (IG), and infected and treated with zinc and copper (GIT), on days 10 (1st dose) and
45 (2nd dose). It was possible to observe a significant increase in the levels of IL-1 (P<0.001),
IL-4(P<0.001), IL-6 (P<0.001), TNF-α (P<0.001) and IFN-y (P<0.001) in IG, when compared
with CG from the 14th to the 70th day PI. Furthermore, GIT group showed a significant
increase in serum levels of IL-1 (P<0.001), IL-6 (P<0.001), TNF-α (P<0.001) and IFN-y
(P<0.001), on days 28 and 42, when compared with IG. IL-4 of GIT showed a significant
increase on days 14, 28 and 42, regarding to IG (P<0.001). In addition to these findings, it
was also possible to observe that, on days 56 and 70 PI, the levels of IL-1 (P<0.001), IL-4
(P<0.001), IL-6 (P<0.001), TNF-α (P<0.05) and IFN-y (P<0.001) were significantly lower in
GIT, when compared with IG.
3.2. Immunoglobulins
Figure 2 shows the serum levels of IgM (A), IgG (B), IgA (C) and IgE (D) during 70
days of the experiment. It represents the animals infected with H. contortus (IG), and infected
and treated with zinc and copper (GIT), on days 10 (1st dose) and 45 (2nd dose). It was
observed a significant increase in serum levels of IgM (P<0.001), IgG (P<0.001) and IgA
(P<0.001) from the 14th to the 70th day in IG. IgE levels were significantly different for GI
from the 42nd day on (P<0.001). Regarding the IgM levels, GIT showed a significant increase,
when compared with IG on days14 (P<0.001) and 28 (P<0.001) PI. However, no significant
reduction in IgM levels was observed on days 56 and 70 PI. Comparing to IG, GIT showed a
significant increase in IgG levels only on day 28 (P<0.001) PI, and a significant reduction on
days 56 and 70 PI (P<0.001). IgA levels were higher in the GIT, when compared to GI (days
14 and 28 PI) (P<0.001). However, GIT showed a significant IgA reduction on days 56 and
30
70 PI (P<0.001). It was possible to observe, also, that in the IG occurred a significant IgE
increase from day 42 on, when compared with CG (P<0.001). GIT significantly increased its
IgE levels on days 14, 28 and 42 PI, in relation to CG and IG (P<0.001). However, the same
GIT showed a significant reduction in this IgE levels on days 56 (P<0.05) and 70 (P<0.001)
PI, when compared with IG.
3.3. Parasitic load and hepatic zinc and cooper
Figure 3 shows the number of parasites (A), zinc (B) and copper (C) levels in IG and
GIT on day 70 PI. It was noticed that the IG showed a significant increase in the number of
parasites, in relation to the CG (P<0.05); however the GIT did not show significant
difference, when compared with IG. It was also observed that IG showed a significant Cu
(P<0.05) and Zn (P<0.05) reduction, when compared with the control group. No significant
differences for hepatic Zn and Cu, between IG and GIT, were observed.
Table 1 shows the EPG in animals infected with H. contortus (and treated) at the end
of the treatment (70th day). IG showed a significant EPG increase only on 14 day when
compared with the control group (P<0.05). No significant differences, between IG and GIT,
were observed.
3.4. Macroscopic analysis of the abomasum
It was observed the presence of H. contortus in the abomasal mucosa of IG and GIT
lambs. Macroscopic examination showed erythematous areas. Animals of GIT visually
showed a lower parasite load, but statistically it had no differences (Figure 4).
4. Discussion
The present study was designed in order to assess the effect of treatment with a zinc
31
and copper compound on inflammatory markers and parasitic load, using as experimental
model lambs, which were experimentally infected with Haemonchus contortus. It was
observed that the experimental infection triggered an increase in the production and secretion
of pro-inflammatory cytokines, as well as in anti-inflammatory immunoglobulins. This
pattern remained during the 70 experimental days. Furthermore, a different behavior in the
levels of interleukins and immunoglobulins were observed, for each administration of Zn and
Cu. The experimental infection was able to reduce the hepatic levels of Cu and Zn; however,
no significant decrease was observed for the parasitic load in response to this treatment.
When a deficiency of Zn and Cu occurs, lymphocytes T and B, macrophages, and
neutrophils reduce their function, and consequently a reduction of protective cells is
generated. Together, low levels of antibodies lead to a reduced immune response, leaving the
organism susceptible to attack by microorganisms (Babior et al., 1973). In our study, initially,
it was observed that the first administration of Zn/Cu promoted a greater production of
interleukins and immunoglobulins, while the second administration allowed to the animals a
more positive response against the parasite, by reducing the content of these inflammatory
markers. According to Oliveira et al. (2011), cytokines are necessary mediators to drive the
local inflammatory response to the infection and injury locations, allowing a proper healing.
However, the exacerbated and persistent production of pro-inflammatory cytokines, may
contribute to aggravate the organ damage, might leading to multiple organ failure and death.
The increase in serum cytokines was observed from the 14th day, lasting until the end
of experiment, with a gradual increase in their serum levels. Cytokine production usually
occurs due to the immune stimulation, here triggered by the presence of H. contortus in the
abomasum. The first administration of Zn/Cu was unable to oppose the cytokine increase
production, induced by the infection. The cytokines remained in high levels, and in some
periods, their production was even higher in GIT than in IG. Peixoto et al. (1994) reported
32
that under conditions of high stress, there was priority of Zn for the immune system, in order
to strengthen the defense mechanisms. Cu and Zn have an excellent protective effect on the
synergism of the immune response (Zi et al., 2009).
It was also observed an increase in pro-inflammatory cytokines (IL-1, IL-6, TNF-α
and INF-y) and anti-inflammatory (IL-4) from day 14 PI on. During severe infections, a
portion of the IL-1 circulates in the bloodstream, and when in combination with TNF-α, it is
in charge of the clinical manifestation, may causing fever, lethargy, loss of appetite and so on
(Abbas, 2012), clinical signs observed in some animals of this experiment. The second Zn/Cu
dose reduced TNF-α, which possibly drove the animals to a faster recovery, as well as to a
reduction of the clinical manifestations. IL-4 induces the differentiation of B-lymphocytes to
produce IgE and IgG, such important immunoglobulins in allergic and anti-helminth
responses, acting on activated macrophages, reducing the effects of IL-1, TNF-α and IL-6, by
inhibiting the production of free radicals (Oliveira, 2011).
According to Balic (2000), the protective immune response against gastrointestinal
nematodes, depends on the ability of the immune system in recognize the parasite as an
antigen, and then, develops a protective Th2 response. Most of the extracellular parasites
induce this type of response (Miller and Horohov, 2006), which is related to the production of
immunoglobulins. IgM reached its peak on day 42 PI. It is the most important
immunoglobulin produced during the primary immune response, being able of activating the
complement effectively, which contributes to efficient infection control (Molinaro et al.,
2009). From day 42 PI, its levels decrease gradually, demonstrating that the acute phase of
infection with Haemonchus contortus is reached in about 40 days after the "contact" with the
parasite. Administration of Zn/Cu did not significantly reduce the levels of IgM in infected
animals. However, the most pronounced effects of this treatment were observed regarding to
IgG behavior, since from day 56 PI, it was observed a severe reduction in IgG levels GIT,
33
when compared with IG. IgG peak was reached on day 70 PI. It is well known that this
immunoglobulin acts on different nematode infection, in inducing the production (in
abomasum and intestine) of extra antibodies, especially against some carbohydrates present in
the larval surface of various strongyles (Bugiro Jr et al., 2008).
The same effect was observed for serum IgA and IgE, since they were reduced in
response to the treatment, on days 56 and 70 PI. These findings may be related to the second
dose administration, that might resulted in the opposite effect of Zn/Cu compound on the
production of cytokines and immunoglobulins in GIT. These ones were in smaller levels in
relation to the IG. The second administration showed a positive inflammatory response effect,
helping on the controlling of inflammation.
Regarding to IgA, it was increased from the 14th day until the end of the experiment.
IgA main function is to prevent the adhesion of antigens to body surfaces, being present on
mucous membranes (Tizard, 2013). It is also related to reduced fertility in some
gastrointestinal nematodes (Balic et al., 2000; Martínez-Valladares et al., 2005; Tizard, 2013).
In a study conducted by Gómez-Muñoz et al. (1999), the authors observed that animals
challenged with H. contortus and treated with selenium and vitamin E, did not show
difference in IgA levels in serum, differing of our data. IgA variations are possibly related to
the infecting dose, as described by Cuquerella et al. (1994).
Treatment with Zn/Cu compound increased the production of IgE from day 14 PI;
however, the infection by itself stimulated an increased production of IgE on day 42 PI. The
presence Zn/Cu facilitated a immune response modulated by the production of IgE. It is
possible that this early increase may help to face the parasitic infection via eosinophils. It has
been reported that Zn/Cu nanoparticles, in vitro and in vivo, are able of recruiting an
IgE/eosinophil response on lung (Cho et al., 2012). These findings may explain the treatment
effect, increasing IgE levels in GIT, even before the IG. IgE binds to receptors on mast cells
34
and basophils, promoting an inflammatory reaction through the release of chemical mediators,
such as histamine and chemo attractant factors, besides its effects on modulation of
hypersensitivity reactions (type 1), playing an important immunity role against helminths
(Shaw et al., 1998). According to Scott. (2000), a Zn deficiency reduces the concentration of
IgE and IgG in rats infected with gastrointestinal nematodes; thus, the increase in the levels of
these immunoglobulins in supplemented animals, might was a result of a better mineral
supply (Zn), initially.
Haemonchus contortus infection induced an increased EPG, confirming our
experimental infection. IG and GIT showed EPG variation during the experimental period,
while the CG remained EPG negative until the end of the experiment. This data reflects all the
control measures performed throughout the 70-day experiment, in which numerous measures
were taken in order to prevent re-infections. Regarding to the high variability in EPG in
infected animals, it is highly possible that such results occurred due to the high parasite load
of some animals. It has been reported that EPG count can be of low analytical sensitivity
when assessing the infection rate of animals, since in cases of high parasitic load, a reduced
excretion might occur, and consequently, reducing the number eggs in stool. (Levecke et al.,
2011). It was observed a significant increase on this parameter only from day 14, and
possibly, after this period, there was a high parasite load, leading to a decreased eggs
excretion. It is noteworthy that after infection the animals showed characteristics clinical
signs, such as apparent mucosal pallor, as well as a marked hematocrit reduction (data not
shown).
The experimental infection significantly increased the number of abomasum parasites
in IG and GIT, when compared with CG. Even without significant difference, GIT animals
demonstrated reduction indexes of 54.75% in adult parasites, when compared with the IG. It
occurred, possibly, due to the protective effect of Zn/Cu compound. However, some studies
35
have shown that Zn and Cu are able to reduce the parasitic load, as described by Soli et al.
(2010), using oral administration of 4.1 grams of Cu particles of slow release (COWP) in
sheep. This procedure provided a significant reduction in the number of parasites recovered at
autopsy, with a reduction of 96% and 56% to Haemonchus contortus and Ostertagia
circumcincta, respectively.
According to Ranjan et al. (2005), Cu is deposited in the liver and mobilized to the
circulation only when there is an infectious process. In our study, it was observed that the
infection caused Zn/Cu depletion in the liver; a situation not prevented by the Zn/Cu
supplementation offered in our study. Cu is a trace element critical in the regulation of many
vital processes, such as cell growth and differentiation, cellular respiration, synthesis of
melanin, collagen, elastin and hemoglobin (Sharma, 2005). Zn is part of a large number of
enzymes, also acting as a cofactor other enzymes. Its deficiency in ruminants causes reduction
in growth, reduction in feed intake and feed conversion, immunity problems, besides its
action causing or exacerbating bone problems (Peixoto et al., 1994).
Fausto et al. (2011) observed an antioxidant effect in lambs infected with
gastrointestinal nematodes and supplemented with Se and Cu parenterally, resulting in a
greater weight gain, and significant reduction in parasite burden; however in this study the
parasite burden was lower than in our experiment. Cu nanoparticles have been used in rats
with acute lung infection causing deleterious effects, such as a decreased immune response
followed by an increased risk of developing pulmonary emboli, even at lower doses (Ham et
al., 2011). Another study, performed with ruminants, in order to evaluate the effects of oral
and injectable Zn, showed that supplementation with this mineral can lead to an increase in
fertility, production of heavier animals, as well as a reduced incidence of intra-mammary
inflammation (Smith and Akinbamijo, 2000).
36
According to Gadacha et al. (2009), Cu, as well as most metals can act as an
antioxidant, but in certain circunstances, it can also act as pro-oxidant. This condition may be
related to the dose, frequency of administration, environmental factors and interaction with
other compounds. In patients, on peritoneal dialysis, it was observed an increase in the Cu/Zn
levels. This condition led to a malnutrition condition, oxidative stress and inflammation, with
consequent reduction in the immune response (Guo et al., 2011).
In this study, it was observed a reduction of cytokines and immunoglobulins,
especially from the second application of Zn/Cu, demonstrating an immunomodulation on the
immune system. Considering the fact that an increased and persistent production of
inflammatory cytokines can lead to a pathological process, instead of only assist to face this
parasitic disease, this immunomodulation might helped avoiding the worsening of the clinical
signs in infected animals, especially in GIT.
Analyzing our results, it is possible to assume that on day 45 PI, when the second dose
of Zn/Cu was administered; there was still a significant concentration of available Cu in liver.
In sheep supplemented with different sources of Zn, it was detected plasma concentrations of
this mineral until the 56th day PI. (Vilela et al., 2011). According to Guo et al. (2011) almost
all the Zn is sequestered at the inflammation site, and, therefore, just a small concentration is
left as "liver deposit" in this situation. Plasma levels of Cu in rats were detected during 40
days after its oral administration (Pocino et al., 1991). By the other hand, Cu stays in the
blood bound to ceruloplasmin, being available participate in redox reactions (Ranjan et al.,
2005).
Thus, the second administration of Zn/Cu was probably able of enhancing the immune
response against infection by the parasite, while the first parenteral application did not
provide protective effect. Therefore, the supplementary dose of Zn plus Cu, in lambs
37
experimentally infected with H. contortus, could be recommended as a complementary
therapy, in order to provide better conditions to the animal cope this parasitic disease.
Acknowledgement
This research was supported by the Fundação de Amparo a Pesquisa do Rio Grande do Sul (Fapergs).
We greatly appreciate the great contribution of Professor Marcelo Cecim
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42
Table 1. Fecal egg counts - eggs per gram (EPG) - of lambs experimentally infected with
Haemonchus contortus and treated with a commercial compound of Zinc* (Zn) and Copper*
(Cu)*.
Day 0
GC
GI
GT
Statistical
Analysis
Day 14
Day 28
Day 42
Day 56
Day 70
0.00
0.00
a
0.00
0.00
0.00
0.00
(0-0)
(0-0)
(0-0)
(0-0)
(0-0)
(0-0)
0.00
1288
b
6863
6163
6563
2350
(0-0)
(75-2100)
(4325-6125)
(2225-5700)
(1075-3950)
(25-5400)
0.00
4825b
5875
6163
10060
315
(0-0)
(2800-4650)
(1450-3725)
(2225-5700)
(1000-4175)
(1125-4700)
P>0.05
P<0.05
P>0.05
P>0.05
P>0.05
P>0.05
* Zn and Cu doses were 1.5mg/kg and0.45 mg/kg, respectively. Treatment was performed on
days 10 and 45 PI. Different letters represent statistical differences between CG (control
group), IG (group infected with Haemonchus contortus) and GIT (infected with H. contortus
and treated). Nonparametric Kruskal-Wallis test followed by post hoc Dunn `s (P<0.05). Data
were expressed as median (minimum-maximum). Letters represent significant difference
comparing CG, IG and GIT. n=5.
43
Figure 1: Serum levels of IL-1 (A), IL-4 (B), IL-6 (C) TNF-α (D) and IFN-γ (E) of lambs
experimentally infected with Haemonchus contortus and treated with a commercial
compound (Zinc [1.5mg/kg] and Copper [0.45 mg/kg]) on days 10 and 45 PI. Arrows indicate
the time of compound administration. Different letters represent statistical difference among
the CG (control group), IG (group infected with Haemonchus contortus) and GIT (infected
with Haemonchus contortus and treated). One-way ANOVA followed by SNK test (P<0.05),
with results expressed or mean +/- SEM (n = 7).
44
Figure 2: Serum levels of IgM (A), IgG (B), IgA (C) IgE (D) of lambs experimentally
infected with Haemonchus contortus and treated with a commercial compound (Zinc
[1.5mg/kg] and Copper [0.45 mg/kg]) on days 10 and 45 PI. Arrows indicate the time of
compound administration. Different letters represent statistical difference among the CG
(control group), IG (group infected with Haemonchus contortus) and GIT (infected with
Haemonchus contortus and treated). One-way ANOVA followed by SNK test (P<0.05), with
results expressed or mean +/- SEM (n = 7).
45
Figure 3: Number of parasites in abomasum (A), hepatic zinc content (B), and hepatic copper
content (C) of lambs experimentally infected with Haemonchus contortus and treated with a
commercial compound (Zinc [1.5mg/kg] and Copper [0.45 mg/kg]) on days 10 and 45 PI.
Arrows indicate the time of compound administration. Different letters represent statistical
difference among the CG (control group), IG (group infected with Haemonchus contortus)
and GIT (infected with Haemonchus contortus and treated). One-way ANOVA followed by
SNK test (P<0.05), with results expressed or mean +/- SEM (n = 5).
46
Figure 4: Macroscopic view of lamb's abomasum at the end of the experiment. (A):
Abomasum of one animal of the CG (control group - uninfected). Note the absence of
Haemonchus contortus; (B): Abomasum of one animal of the IG (groupd infected with
Haemonchus contortus). Note the high parasite load; and (C): Abomasum of one animal of
GIT (group infected with Haemonchus contortus and treated with a commercial compound
(Zinc [1.5mg/kg] and Copper [0.45 mg / kg] on days 10 and 45 post infection. Note the lower
parasitic load, when compared with IG.
47
CONSIDERAÇÕES FINAIS
O principal desafio de produtores de ovinos atualmente está em controlar o parasito
Haemonchus contortus visando assim diminuir os prejuízos econômicos da propriedade.
O emprego de minerais vem sendo estudado na ovinocultura como drogas de
performance incrementando assim a resposta imune do hospedeiro frente ao parasita.
O presente estudo demonstrou que em cordeiros experimentalmente infectados com
Haemonchus contortus e tratados com um composto de zinco e cobre injetável possivelmente
teve um efeito protetor, assim estimulando uma melhor resposta imune contra a infecção pelo
parasito, demonstrando ser uma alternativa de suplementação mineral.
48
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