Detecção de vírus
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III Curso de Atualização Microbiologia e Parasitologia no Contexto Atual VIROLOGIA GERAL Profa. Rita de Cássia Nasser Cubel Garcia Departamento de Microbiologia e Parasitologia Instituto Biomédico Universidade Federal Fluminense [email protected] Introdução ao estudo dos Vírus • 1884 Chamberland (filtração) • 1892 Iwanowski • 1898 Beijenrinck “Vírus do mosaico do tabaco” Filtrabilidade dos vírus: material filtrado continha um veneno dissolvido de poder extraordinário ou um agente descohecido tão pequeno que era capaz de atravessar os poros de um filtro que retinha bactérias Vírus = Latim: Veneno Características dos vírus: • Pequenos (20 a 250 nm de diâmetro) 1 micron Bactéria (Staphyllococcus aureus) m ↓ cm ↓ mm ↓ µm ↓ nm ↓ Ǻ 10-2m 10-3m 10-6m 10-9m 10-10m Microscopia eletrônica (ME) Coloração negativa: AMOSTRA + corante de alta densidade eletrônica (ácido fosfotungstico) grade de carbono microscópio o feixe de elétrons não penetra no corante, mas sim no material orgânico, que aparece claro sobre um fundo escuro. Microscópio eletrônico uic.igc.gulbenkian.pt www.sciencedaily.com Herpevírus Características dos vírus: • Parasitas Intracelulares Obrigatórios Métodos de 1933: isolamento de vírus Influenza suíno em ovo embrionado estudo dos vírus alittleaboutvirology.blogspot.com www.molvis.org Cultura de células: 1949: Enders et al. propagação de poliovírus em cultura primária de célula humana Características dos vírus: • Constituição básica: proteína + ácido nucleico podem ter enzimas lipídeos carboidratos Características dos vírus: • Possuem uma única espécie de ácido nucleico: DNA ou RNA Vírus DNA: DNA dupla fita linear Adenovírus DNA dupla fita circular Papilomavírus Herpesvíus Poxvírus DNA simples fita linear DNA simples fita circular Parvovírus Circovírus Características dos vírus: • Possuem uma única espécie de ácido nucleico: DNA ou RNA Vírus RNA: RNA simples fita linear polaridade (+) polaridade (-) polaridade (+) Picornavírus Paramixovírus Retrovírus Coronavírus Rabdovírus TR Flavivírus RNA simples fita segmentado RNA dupla fita segmentado polaridade (-) Ortomixovírus = transcriptase (RNA polimerase ) Rotavírus Capsídeo: Simetria icosaédria (cúbica) Icosaedro: 20 faces (cada face 1 triângulo equilátero) 12 vértices (cantos) pentons hexons www.web-books.com cada face 3 unidades idênticas 60 sub-unidades Base do Penton fibra Adenovírus www.web-books.com capsômeros Capsídeo: Simetria helicoidal www.erain.com Capsídeo: Simetria complexa Poxvírus www.elu.sgul.ac.uk www.poxvirus.org Bacteriófagos http://microbialuniverse.blogspot.com.br/2012/01/virology.html www.mansfield.ohio-state.edu Estrutura de um virion (partícula viral completa): Genoma DNA ou RNA NUCLEOCAPSÍDEO (todos) Capsídeo Proteínas ENVELOPE (alguns) Informação genética Infectividade Proteção do genoma União a receptores celulares Determinantes antigênicos Lipídeos Glicoproteínas virais União a receptores celulares Determinantes antigênicos Simetria do Capsídeo: Icosaédrico (cúbico) Helicoidal (espiral) Estrutura da partícula viral: Vírus não envelopado: genoma + capsídeo Vírus envelopado: genoma + capsídeo + envelope com glicoproteínas nucleocapsídeo Estabilidade da partícula viral: • Temperatura • pH • Solventes de lipídeos e detergentes vírus envelopados • Hipoclorito de sódio proteínas • Formaldeído proteínas • Luz UV genoma 1966 Comitê Internacional de Taxonomia Viral: Classificação dos vírus em famílias: Família: - viridae Sub – família: - virinae Gênero: - vírus Ác. Nucleico Simetria do capsídeo Envelope Tamanho Tipo Ac. Nucleico Família Virus DNA Icosaédrica Ausente 50nm fita dupla circular Papilomaviridae Papiloma Presente 100nm fita dupla linear Herpesviridae Herpes Ausente 20nm fita simples linear (+) Picornaviridae Poliomielite 80nm fita dupla segmentado Reoviridae Rotavirus Presente 40nm fita simples linear (+) Flaviviridae Dengue Febre amarela Presente 100nm Retroviridae HIV Presente 100nm fita simples (+) linear diplóide fita simples linear (+) Coronaviridae Coronavírus Rhabdoviridae Raiva Paramyxoviridae Sarampo Orthomyxoviridae Influenza RNA Icosaédrica Helicoidal 150nm 200nm 100nm fita simples linear (-) fia simples (-) segmentado Replicação Viral Fases da replicação viral: 1. Adsorção 6. Liberação 5. Maturação 2. Penetração 3. Desnudamento 4. Replicação http://encarta.msn.com/ 1. Adsorção União do vírus ao receptor celular Receptores: proteínas, carboidratos ou lipídeos na membrana celular Suscetibilidade celular presença de receptor Vírus não envelopado Vírus envelopado 2. Penetração Entrada do vírus na célula • Translocação: passagem direta da partícula viral através da membrana celular • Endocitose mediada por receptor: vírus envelopados vírus não envelopados • Fusão: somente para vírus envelopados 2. Penetração Endocitose mediada por receptor: vírus envelopados Após adsorção Membrana da célula forma uma vesícula ao redor do vírus Vesícula funde com endosoma vírus no endosoma Fusão do envelope do vírus com membrana do endosoma Nucleocapsídeo viral no citoplasma www.rsc.org 2. Penetração Endocitose mediada por receptor: vírus não envelopados Após adsorção Membrana da célula forma uma vesícula ao redor do vírus Vesícula funde com endosoma vírus no endosoma Desestruturação do capsídeo viral Genoma viral no citoplasma microbiologybytes.wordpress.com 2. Penetração Fusão do envelope do vírus com a membrana celular: somente para vírus envelopados Após adsorção Fusão direta do envelope do vírus com a membrana celular Nucleocapsídeo viral no citoplasma pathmicro.med.sc.edu 3. Desnudamento ou Decapsidação Refere-se a separação física das proteínas do capsídeo e genoma viral. Após o desnudamento o genoma viral fica livre no citoplasma ou núcleo da célula para o processo de replicação viral. http://www-micro.msb.le.ac.uk/109/structure.html 4. Replicação • Formação de novas cópias do genoma viral • Síntese das proteínas virais: enzimas associadas ao genoma proteínas de capsídeo glicoproteínas de envelope Vírus RNA Adsorção Decapsidação Replicação Síntese de prot Montagem Penetração núcleo Liberação citoplasma Vírus DNA Adsorção Penetração Síntese de prot Decapsidação Replicação Montagem Liberação núcleo citoplasma 4. Replicação Genoma viral Transcrição dos genes precoces RNAm early Proteínas fase precoce (early): proteínas não estruturais - param a síntese de ácido nucleico e proteínas celulares - regulam a expressão do genoma viral - enzimas requeridas para a replicação do genoma viral Replicação do genoma Transcrição dos genes tardios RNAm late Proteínas fase tardia (late) proteínas estruturais 4. Replicação: de acordo com o tipo de ácido nucléico os vírus utilizam diferentes estratégias para assegurar a replicação do genoma e a síntese de proteínas virais, confome o esquema abaixo: transcrição intermediário replicativo A partir da fita RNA (-) com transcriptase associada atua como T = transcripase (RNA polimerase RNA dependente) TR = transcriptase reversa (sintetiza DNA a partir de genoma RNA – retrovírus) fita RNA (-) com transcriptase associada formação do provirus varuncnmicro.blogspot.com - 5. Maturação ou Montagem Proteínas estruturais se associam espontaneamente capsômeros capsídeo viral onde o ácido nucleico é inserido 6. Liberação Vírus não envelopados: Lise da célula Vírus envelopados: Brotamento envelope da membrana celular Exocitose envelope de membranas internas 6. Liberação de vírus não envelopados: Lise Celular Flores, E.F. Virologia Veterinária, 2007 6. Liberação de vírus envelopados: Brotamento Vírus adquire o envelope da membrana celular com as glicoproteínas virais inseridas glicoproteínas na membrana Proteínas se associam ao genoma viral Transporte das glicoproteínas para a membrana Golgi Síntese das proteínas não glicosiladas ribosomas livres no citoplasma Síntese das glicoproteínas ribosomas associados ao RER 1. Adsorção 2. Penetração glicoproteínas Proteínas estruturais proteínas (2) Brotamento proteínas (1) RNAm 5. Maturação ou Montagem Proteínas não estruturais (enzimas) Nucleocapsídeo Genoma viral 3.Decapsidação Duplicação do genoma 4. Replicação 6. Liberação Lise celular Ação dos antivirais Vírus Influenza HIV Patogenia das Viroses Resposta do Hospedeiro às Infecções Virais Patogenia das viroses Patogenia: mecanismos pelos quais os vírus induzem doença no hospedeiro Penetração Disseminação Replicação Lesão Doença Características do vírus: Virulência Dose Características do hospedeiro: Genética Idade Estado nutricional Estado hormonal Estado imunológico Portas de entrada: Pele picada de artrópode dengue inoculação por seringas retrovírus mordedura de animal raiva www.prints-online.com Portas de entrada: Mucosas Trato respiratório Trato gastrointestinal www.nursingunlimited.com Adaptado de Monreno-Espinosa et al. Semin Pediatr Infect Dis 2004: 15(4): 37-245. Portas de entrada: Mucosas Trato genital Transmissão vertical: in utero Vírus pode causar: Infecção localizada Infecção disseminada Viremia cc cc • Limitada à proximidade do sítio de penetração e replicação primária • Não faz viremia Transporte no sangue: vírus livre ou associado à célula Neuronal Contágio Aquisição Local de replicação primário Local de replicação secundário Respiratórios Entéricos Herpes Papiloma Replicação no local primário contágio Tecido-alvo aquisição Disseminação neuronal Sistema nervoso central Cérebro VIREMIA primária Replicação no SRE baço, fígado, medula óssea Pulmões Vetor artrópode Arbovírus Órgãos VIREMIA HIV secundária HBV Pele Glândulas Etc. Reposta do hospedeiro Interferon Defesas locais não imunes Período de incubação Anticorpos resposta imune mediada por células Sintomas específicos Período prodrômico (sintomas inespecíficos) Mecanismos de resistência do hospedeiro: Inespecíficos: barreiras físico-químicas Interferons Específicos: Resposta Imune Flores, E.F. Virologia Veterinária, 2007 Resposta imune Inata (natural ou inespecífica) Componentes: Interferon tipo 1 (IFN-I) Sistema complemento Células: - Células dendríticas (DCs) - Macrófagos - Células NK (natural killer) Mecanismo de ação dos Interferons e Estado de resistência antiviral: inibição da síntese proteica degradação de mRNA Células Natural Killer (NK): Sistema Complemento C5b associado ao vírus pode iniciar uma nova sequência de reações que resulta na participação de outros componentes do complemento e na formação do complexo de ataque à membrana (MAC) MAC cria poros no envelope lipídico lise do vírus ou de células infectadas - Reconhecem a baixa expressão de MHC I em células infectadas - atividade citotóxica: liberam grânulos que contém perforinas e granzimas, que induzem a apoptose da célula alvoc Mecanismos efetores da imunidade inata: IFN-1 1) Célula infectada por vírus 2) produção de IFN-1 3) IFN-1 atua sobre as células vizinhas estado antiviral 4) IFN-1 estimula células NK 5) IFN-1 estimula células dendríticas 6) IFN-1 estimula Linf Tc 7) IFN-1 estimula atividade fagocítica dos macrófagos 8) Ativação do complemento 9) Complemento ativam Macrófagos 10) e 11) Complemento opsoniza vírus facilitando a fagocitose 12) Complemento Lise de Vírus envelopado Células dendríticas (DC): Dcs sao células mononucleares que estão nos tecidos periféricos (pele, TGI e Trato capturam, dirigem-se secundários respiratorio) fagocitam a onde linfócitos B e T. onde antigenos órgãos e linfoides apresentam para Resposta imune Adaptativa Componentes: Células T: Linfócitos T auxiliares Linfócitos T citotóxicos (CD4+) Th1 / Th2 (CD8+) Linfócitos B Resposta imune Adaptativa Linfócito B Th = linfócito T auxiliar Th Th ativado Linfócito T citotóxico plasmócito lise de célula infectada anticorpos IgG Resposta Imune humoral no controle das infecções virais Anticorpos neutralizantes Resposta Imune humoral no controle das infecções virais (c) Lise do vírus pela ativação do complemento (d) (b) www.nature.com (c) Fagocitose: pela ativação do complemento Anticorpos importantes no controle da infecção viral: • IgM: marcador de infecção aguda diagnóstico de infecção congênita • IgG: imunidade à reinfecção resposta vacinal • IgA: imunidade de mucosa (trato respiratório, trato gastrointestinal) www.panbio.com.au Tipos de Infecção Tipo de infecção Replicação do vírus Transmissão Resposta Imune Sintomas Manifestação da infecção Exemplo Aguda sim sim sim sim doença Influenza (gripe) Sub-clínica sim sim sim não assintomática Febre aftosa (clinicamente aparente) (inaparente) Tipos de infecção persistente: Tipo de infecção Replicação do vírus Transmissão Resposta Imune Sintomas sim sim sim sim Persistente Exemplo ou não resposta imune não elimina o vírus do organismo Latente não não sim não resposta imune não impede Recorrência sim sim sim sim a latência Retrovírus Herpesvírus Replicação viral transmissão 1ª infecção Recorrência Recorrência Infecção Latente Latência Latência Latência Infecção congênita: mãe soronegativa na época da infecção Depende da época da gestação em que ocorre a infecção www.respig.com Diagnóstico laboratorial das viroses Por que e quando solicitar o exame laboratorial de uma virose? Confirmação do diagnóstico clínico infecções com sinais clínicos confundíveis: gastrenterites; Necessidade de confirmação de uma infecção devido às sérias implicações que a mesma pode ter para o paciente: AIDS, hepatites, rubéola gestacional; Na seleção de doadores de sangue: hepatites B e C, AIDS. Quando o tratamento é possível: infecções herpéticas, AIDS e hepatite C; Durante surtos epidêmicos adoção de medidas profiláticas adequadas (vacinação, combate a vetores, etc.). Ex: febre amarela, ( dengue, sarampo, raiva, entre outras; Na avaliação da imunidade artificialmente induzida após vacinação: pesquisa de anticorpos da classe IgG; Na busca de um agente etiológico de uma dada doença, seja ela nova ou não. Ex: Coronavírus da SARS, Influenza (gripe). Diagnóstico Laboratorial das Viroses Métodos diretos: Detecção do vírus na amostra clínica Métodos clássicos (isolamento viral) Métodos rápidos Métodos indiretos: Detecção de anticorpos no soro do paciente Detecção do vírus na amostra clínica O que coletar ? Amostras clínicas do paciente: depende do tropismo do vírus suspeito e da fase da doença - Doença localizada no trato respiratório - Doença localizada no trato genital - Doença localizada no trato gastrointestinal - Doença localizada na pele Amostras ambientais Alimentos Amostra clínica para detecção do vírus Infecção respiratória: aspirado de nasofaringe http://ptxiv.blogspot.com/2009/10/shouldcolor-of-nasal-discharge-dictate.html Infecção entérica: Fezes Amostra clínica para detecção do vírus Infecção na pele: - Suabe (Líquido das vesículas) - Papilomas (verrugas) http://www.dermatologia.net/novo/base/ doencas/herpeslabial.shtml Verruga vulgar Herpes labial Infecção no trato genital - Suabes genitais - Tecidos, placenta, fetos abortados www.colegiosaofrancisco.com.br Herpes genital www.dermatologia.net www.stanford.edu Amostra clínica para detecção do vírus Infecção no SNC: cérebro Raiva: morcego Doença sistêmica: tecidos afetados (depende dos sinais clínicos, fase da doença) Morte do paciente: qualquer tecido Coleta e envio do material para o laboratório Todo material deve ser acompanhado de uma FICHA contendo: • Identificação do paciente: nome idade dados clínicos: dias de doença, sinais clínicos histórico de vacinas (nome da vacina, data de vacinação) • Data da coleta da amostra clínica Virologia Ambiental Matrizes ambientais: Água de consumo humano (Mineral), Água de reuso (águas residuárias), Água de recreação (lagoas, rios, piscinas, praias) Água de lastro; Águas subterrâneas; Lodo e sedimentos; Superfícies Vírus em alimentos Diagnóstico Laboratorial das Viroses Métodos diretos: Detecção do vírus: Métodos clássicos: Isolamento do vírus Métodos rápidos INOCULAÇÃO EM OVOS EMBRIONADOS Embrião em desenvolvimento: ideal para multiplicação de vírus Requisitos - Livres de contaminação - Viabilidade - Idade ideal Utilizados para: Isolamento de vírus Diagnóstico Produção de vacinas Vantagem: Obtenção do agente viável (vírus infeccioso) Vias de inoculação em ovos embrionados Membrana corioalantoide: Herpesvírus, Poxvírus Cavidade amniótica Cavidade alantoide: Influenza Vírus da Doença de Newcastle Saco da gema classes.midlandstech.edu OVOS EMBRIONADOS Inoculação na cavidade alantoide Isolamento vírus aviários: Influenza Vírus da Doença de Newcastle Propagação de vírus Influenza humano Preparação de vacinas OVOS EMBRIONADOS Inoculação na cavidade alantoide Vírus Influenza HA Reação de hemaglutinação (HA): http://www.springerlink.com/content/4786735395530u38/fulltext.pdf Reação de inibição da hemaglutinação (HI): Identificação do vírus isolado OVOS EMBRIONADOS Inoculação na membrana corioalantoide Isolamento e que propagação de vírus produzem lesões – pocks - nesta membrana (poxvírus e herpesvírus) Focos esbranquiçados pocks www.anicon.eu OVOS EMBRIONADOS Produção de vacinas www.vaccinews.net http://www.rnceus.com/flu/vaccine.html Cultura de células (CC) Cultura de células é o termo utilizado para se referir às células quando estas estão sendo cultivadas in vitro . As cultura de células podem ser utilizadas para : isolamento e identificação do agente confirmação do diagnóstico clínico preparo de massa viral vacinas Vantagem: Obtenção do agente viável (vírus infeccioso) CULTIVO CELULAR Cultura de células primárias - estabelecidas diretamente a partir do tecido fresco - baixa resistência a repiques morrem após 2 ou 3 passagens MEM + Soro Estufa 37°C Passagem das células Linhagem de células Diploide Contínua Linhagem diploide Linhagem contínua Origem Células de cultura primária que resistiram ao repique Tumores ou tecido normal (diplóide) transformado in vitro. Cariótipo Diploide Aneuploide (n, 3n, 4n, etc) Vantagens Isolamento e propagação de vírus Propagam indefinidamente in vitro perderam a inibição de contato Preparo de vacinas Muito utilizadas no isolamento de vírus para diagnóstico, pois podem ser mantidas no laboratório através de repiques sucessivos Desvantagens Resistem 50 passagens Contaminação com vírus adventícios Contaminação com vírus adventícios Microscópio invertido fibroblastos Células epitelióides Processamento do material para inoculação em Cultura de células (CC) Amostra clínica tratamento com antibiótico + antimicótico Maceração, homogeneização, centrifugação inoculação em CC Replicação viral em cultura de células Monitoramento Observação da CC ao microscópio observar efeito citopático(CPE) Efeito citopático: alterações morfológicas que ocorrem na célula devido a replicação viral picnose nuclear: células pequenas, arredondadas e soltas do tapete Ex. picornavírus formação de sincícios: células gigantes, multinucleadas Ex. Vírus respiratório sincicial, herpesvírus Formação de Corpúsculos de Inclusão: Corpúsculo de Negri (raiva) Vírus Influenza em CC Efeito citopático ??? Detecção e identificação de vírus em CC: técnicas imunológicas Reação de Imunofluorescência (IF) Métodos diretos de diagnóstico: Detecção do vírus Amostra clínica Métodos rápidos Métodos clássicos Inoculação Ovos embrionados Cultura de células Detecção de vírus Métodos rápidos Microscopia eletrônica (ME) Reações Imunológicas: Imunofluorescência (IF) Ensaio Imunoenzimático (EIE) Imunoperoxidase (IP) Detecção do genoma viral: Reação de hibridização Reação em cadeia pela polimerase (PCR) Métodos rápidos: Observação da partícula viral Microscopia eletrônica (ME) Observa a morfologia do vírus Alta concentração de vírus : 106 – 108 partículas virais/ml Amostras para diagnóstico: - cutâneas: líquido vesicular (herpesvírus) verrugas (papilomavírus) - material fecal (rotavírus ) www.Virology.net/Big-Virology/BVRNAreo.html Imunomicroscopia: amostra clínica + soro imune coloração negativa Reação de Imunofluorescência (IF): detecção de vírus Detecção de Ag virais no interior das células: - aspirado de nasofaringe - Corpúsculos de Negri Raiva Marcador da reação Ag – Ac é um corante fluorescente (isotiocianato de fluoresceína , rodamina). Célula infectada por vírus respiratório Anticorpo marcado Teste positivo para vírus da raiva Ensaio Imunoenzimático (EIE) Vantagens: alta sensibilidade, reagentes estáveis, manual ou automatizada Detecção de Ag virais: rotavírus, astrovírus Princípio básico: imobilização de um dos reagentes em uma fase sólida (p.ex. poliestireno), enquanto que o outro reagente é ligado a uma enzima Marcador da reação Ag-Ac é uma enzima (peroxidase, fosfatase alcalina). Leitura se baseia no desenvolvimento de cor: A degradação do substrato cromogênico pela enzima dá origem a produtos solúveis coloridos (leitura da D.O. em espectrofotômetro) Pode testar um grande número de amostras Ensaio Imunoenzimático (EIE): detecção de vírus Ac de captura Ac de captura Amostra clínica Amostra clínica Ag viral Ac de captura Ac de captura Anticorpo marcado com enzima conjugado Substrato Desenvolvimento de cor positivo Anticorpo marcado com enzima conjugado Substrato Ausência de cor negativo Ensaio Imunoenzimático (EIE): detecção de vírus Leitor de microplaca: ELISA quantitativo cut – off = Média das D.O. dos controles negativos X 2.1 Amostras com DO > cut-off positivas Amostras com DO < cut-off negativas Imunoperoxidase (IP): detecção de vírus Detecção de Ag virais em tecidos ou células Ac específico marcado com uma enzima (peroxidase) desenvolvimento de cor Preparações permanentes observa ao microscópio ótico. Detecção de vírus Métodos rápidos Detecção do genoma viral: Reação em cadeia pela polimerase (PCR) Reação da Polimerase em Cadeia: detecção de vírus Polymerase Chain Reaction (PCR) Método para produzir cópias de um segmento de DNA específico PCR amplifica uma seqüência alvo Polimerização é feita por uma DNA polimerase termoestável (Taq polimerase) São utilizados dois “primers” (iniciadores), que delimitam o segmento amplificado Triagem X Tipagem Sensibilidade : 10 cópias de genoma Reação da Polimerase em Cadeia (PCR): detecção de vírus Reagentes da PCR DNA polimerase DNA molde Primer Sense Primer Antisense Extração prévia do DNA Reação no Termociclador: PCR: ciclos 1º ciclo 2º ciclo Reação da Polimerase em Cadeia (PCR): detecção de vírus 3 passos na reação que são repetidos de 30 a 40 vezes CICLOS 1o passo desnaturação: 94oC por 30 seg Reação da Polimerase em Cadeia (PCR): detecção de vírus 2o passo anelamento dos primers 55oC Primer sense: se liga a fita antisense Primer Antisense: se liga a fita sense Reação da Polimerase em Cadeia (PCR): detecção de vírus 3o passo extensão a 72oC: temperatura ótima para Taq polimerase Incorporação de 35 a 100 nucleotídeos por segundo Como ambas as fitas são copiadas durante a PCR, há um aumento exponencial do número de cópias do gene. Por exemplo: se há 1 cópia do gene antes da reação iniciar, após o 1o cliclo serão 2 cópias, após 2 ciclos serão 4 cópias, 3 ciclos serão 8 cópias e assim por diante. Reação da Polimerase em Cadeia (PCR): detecção de vírus http://palmer-dna-technology-wikis.wikispaces.com/Leah+Vander+Vorst Reação da Polimerase em Cadeia (PCR): detecção de vírus ? ? ? ? ? Reação da Polimerase em Cadeia (PCR): detecção de vírus Eletroforese em gel de agarose: visualização do produto da PCR Reação da Polimerase em Cadeia (PCR): detecção de vírus Visualização das bandas no gel Coloração com brometo de etídio O brometo de etídio é um intercalante de DNA Marcador de PM Produtos da reação Reação da Polimerase em Cadeia (PCR): detecção de vírus Para vírus de genoma RNA: PCR precedida pela transcrição reversa (RT-PCR) Realização da reação de transcrição reversa: Transcriptase Reversa http://wiki.biomine.skelleftea.se/biomine/molecular/index_07.htm Reação da Polimerase em Cadeia (PCR): detecção de vírus PCR em tempo real (PCR quantitativo - qPCR) Detecção viral Diagnóstico Quantificação viral Monitoramento da resposta anti-viral Prognóstico Comparação PCR convencional Permite o sequenciamento genético da amostra amplificada Necessita de técnicas de revelação: eletroforese Detecção e quantificação (no. de cópias) da amostra PCR em tempo real sim não sim não não sim PCR em tempo real (qPCR) – TaqMan Sonda complementar ao segmento do produto da PCR, localizada entre os iniciadores da reação Avalia o momento de aparecimento do sinal, e não quanto sinal é gerado após um dado número de ciclos. A fluorescência é proporcional à quantidade do produto da PCR www.iba-lifesciences.com PCR em tempo real (qPCR) – TaqMan SEQÜENCIAMENTO DE DNA Molécula de DNA Informação Seqüência nucleotídica Definição: processo que determina a ordem dos nucleotídeos (A, C, T e G) na seqüência do DNA utilizado como molde. blog.cca.ufscar.br Análise filogenética As sequencias são comparadas entre si e com protótipos de acordo com as modificações entre os nucleotídeos (substituições, deleções e inserções) GenBank www.ncbi.nlm.nih.gov BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) www.blast.ncbi.nlm.nih.gov Análise dos dados e Construção da árvore Programa MEGA 5.1 Métodos diretos de diagnóstico: Detecção do vírus Partícula viral: Amostra clínica Microscopia eletrônica (ME) Antígeno viral: Métodos rápidos Detecção do (a) - Ensaio Imunoenzimático (EIE) -Imunofluorescência (IFA) - Imunoperoxidase (IPX) Genoma viral: Métodos clássicos - PCR convencional - PCR em tempo real (qPCR) Inoculação Ovos embrionados Cultura de células Métodos indiretos Detecção de Anticorpos no soro do paciente Sorologia: Utilização freqüente porque muitas vezes o isolamento viral é difícil Confirmar laboratorialmente uma enfermidade causada por vírus Estudar epidemiologicamente o comportamento de uma virose na comunidade Determinação de imunidade (p.ex. resposta vacinal) Identificar o vírus isolado em cultura Métodos indiretos: Detecção de Ac no soro Diagnóstico de infecção recente: Detecção de IgM específica Conversão sorológica: soro de fase aguda soro de fase convalescente Observar um aumento, de pelo menos 4 vezes, no título de anticorpos do soro de fase convalescente em relação ao soro de fase aguda Detecção de anticorpos no soro do paciente Coleta de sangue soro http://www.topnews.in/blood-samples-yield-clues-helpfight-cancers-2239442 http://www.sciencephoto.com/media/274242/view Métodos indiretos: Detecção de Ac no soro Reações Imunológicas: Imunofluorescência (IF) Ensaio Imunoenzimático (EIE) Imunodifusão em gel de agarose (AGID) Western Blot Reações de precipitação (meio gelatinoso) Imunodifusão (ID) Diagnóstico de Anemia Infecciosa Equina Agar Gel Immunodiffusion (AGID) ou Teste de Coggins (detecção de Ac no soro do animal) Soro em teste Ag Linha de precipitação tamanho dos agregados é maior que diâmetro dos poros Reação de Imunofluorescência (IF): detecção de Ac Conjugado Soro do paciente Antígeno Soro (+) Soro (-) Ensaio Imunoenzimático (EIE): detecção de Ac Sensibilização da placa: Ag Amostra clínica: soro conjugado: anti-Ig marcada com enzima Western Blot : pesquisa de Ac Lisado de proteínas Eletroforese em gel de poliacrilamida Transferência para membrana Antígenos imobilizados em membranas detectados por anticorpos específicos Santos et al. Introdução a virologia humana, 2008 Diagnóstico laboratorial das viroses Amostra clínica Amostra clínica depende dos sinais clínicos soro Métodos diretos: Detecção do vírus Rápidos Clássicos Métodos indiretos Reações imunológicas Partícula viral: Microscopia eletrônica (ME) Isolamento viral Imunofluorescência (IF) Antígeno viral: Ensaio Imunoenzimático - Ensaio Imunoenzimático (EIE) (EIE) -Imunofluorescência (IFA) - Imunoperoxidase (IPX) Genoma viral: - PCR Cultura de células Ovos embrionados Imunodifusão em gel de agarose (AGID) Western Blot Controle e Prevenção das Viroses Controle e Prevenção das Viroses Medidas higiênicas e sanitárias: Hepatite A Controle de Vetores: Febre Amarela, Dengue Mudança de estilo de vida: HIV, HBV, HCV Quarentena Vacinas 1798: Edward Jenner virus vivo atenuado derivado do cowpox virus vaccinia VACINA latim VACCA 1885: Pasteur virus rábico “vírus fixo” inoculado em medula espinhal de coelho medula dessecadas menino ferido por um cão raivoso 1950s: Culturas de células desenvolvimento de vacinas atenuadas e inativadas Atualmente: tecnologia de DNA recombinante Tipos de vacinas virais Vacinas não replicativas: não contêm o agente viável - vírus inteiro (inativadas) - sub-unidades - proteínas recombinantes Vacinas replicativas: contêm o vírus viável - vírus heterólogos - Atenuadas Vacinas não replicativas: Vírus inteiro inativado: Agentes químicos ou físicos para destruir a infectividade, mas não a imunogenicidade. Inativantes mais comuns : formaldeído 37% -propiolactona raiva etileno-iminas febre aftosa Sub – unidades (Ex. Influenza) Vacina Vacina recombinante HBsAg + Vetor de expressão DNA recombinante Transfecção e cultivo celular Purificação protéica Inoculação Vacinas replicativas: Vacinas de vírus heterólogo: - vacina de Jenner Vacinas de vírus atenuados: - atenuação do vírus por adaptação a um hospedeiro diferente do habitual Cultura de células e/ou Ovos embrionados - atenuação do vírus por seleção de mutantes sensíveis à temperatura (ts) vírus respiratórios - manipulação genética Replicação do vírus vacinal no organismo Flores, E. Virologia Veterinária, 2ª. Ed, 2012 Sim Não Obrigada ! [email protected] Dúvidas ?
