- Secretaria de Estado da Saúde de São Paulo

Pedro Carnieli Junior
CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DO VÍRUS DA RAIVA ISOLADOS DE
BOVINOS E EQÜÍNOS NO PERÍODO DE 1997-2002 EM ÁREA
EPIDÊMICA DO ESTADO DE SÃO PAULO, BRASIL
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Ciências da Coordenadoria do Controle de Doenças da
Secretaria de Estado de Saúde, para a obtenção do Título
de Doutor em Ciências
Área de concentração: Pesquisas Laboratoriais em Saúde Pública
Orientador: Profa. Dra. Maria do Carmo Sampaio Tavares Timenetsky
São Paulo
2009
Pedro Carnieli Junior
CARACTERIZAÇÃO GENÉTICA DO VÍRUS DA RAIVA ISOLADOS DE
BOVINOS E EQÜÍNOS NO PERÍODO DE 1997-2002 EM ÁREA
EPIDÊMICA DO ESTADO DE SÃO PAULO, BRASIL
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Ciências da Coordenadoria do Controle de Doenças da
Secretaria de Estado de Saúde, para a obtenção do Título
de Doutor em Ciências
Área de concentração: Pesquisas Laboratoriais em Saúde Pública
Orientador: Profa. Dra. Maria do Carmo Sampaio Tavares Timenetsky
São Paulo
2009
Folha de Avaliação
Nome do autor: Carnieli Jr, Pedro
Título: Caracterização genética do vírus da raiva isolados de bovinos e
eqüínos no período de 1997-2002 em uma área epidêmica do Estado de
São Paulo, Brasil
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da
Coordenadoria do Controle de Doenças da Secretaria de Estado de Saúde,
para a obtenção do Título de Doutor em Ciências
Data: 19 de dezembro de 2009
Banca Examinadora
Profa. Dra. Maria do Carmo Sampaio Tavares Timenetsky (Orientador)
Prof. Dr. Luis Fernando de Macedo Brígido – PPG – CCD (Memória)
Prof. Dr. Edson Durigon – USP
Profa. Dra. Silvana Regina Favoretto – IP – USP
rof. Dr. Fumio Homa Ito – USP (Memória)
DEDICATÓRIA
_____________________________________________________________
Aos meus pais Pedro e Leontina (in memoriam)
Às minhas filhas Candida e Carolina e às minhas netas Sofia
e Alice
À minha orientadora Profa. Dra. Maria do Carmo Sampaio Tavares
Timenetsky
Agradecimentos
Agradeço ao Intituto Pasteur, em nome da sua Diretora Neide Yumie
Takaoka, por oferecer todas as condições necessárias para o
desenvolvimento desta Tese.
Aos colegas Profa. Dra. Juliana Galera Castilho, Willian de Oliveira Fahl e
Nazle Mendonça Collaço Véras pela participação no desenvolvimento deste
trabalho.
Aos colegas Pesquisadores da Biologia Molecular Carla Isabel Macedo,
Rafael de Novaes Oliveira, Ekaterina Durymanova Ono e Keila Iamamoto
Nogi.
Agradeço ao Prof. Dr. Murilo Gomes por ceder diversas imagens utilizadas
neste trabalho.
Ao Prof. Dr. Wilson Uieda e ao Dr. João José de Freitas Ferrari por cederem
imagens fotográficas relacionadas ao Desmodus rotundus.
Ao Dr. Nilton Fidalgo Perez por permitir utilizar dados epidemiológicos
gerados durante sua Dissertação de Mestrado.
À Pesquisadora Científica Karin Corrêa Scheffer Ferreira pela orientação na
dissertação referente ao Desmodus rotundus.
À Pesquisadora Graciane Maria Medeiros Caporale por disponibilizar a
imagem comprobatória do peso molecular da Nucleoproteína.
A todos os funcionários do Instituto Pasteur, que de forma direta ou indireta
me auxiliaram.
Aos Professores do Programa de Pós-Graduação que participaram da minha
formação científica.
Resumo
A história biogeográfica da raiva pode ser reconstruída utilizando dados
moleculares. Este trabalho descreve a caracterização do Vírus da Raiva
(RABV) que circula na população do morcego hematófago Desmodus
rotundus em uma área epidêmica do Estado de São Paulo e que é
transmitido para herbívoros de interesse econômico como, por exemplo, os
bovinos e eqüínos. Os genes N e G dos vírus foram seqüenciados e as
árvores filogenéticas geradas são topologicamente concordantes. Três
agrupamentos filogenéticos (clusters) foram identificados na área epidêmica
e foram designados como RD1, RD2 e RD3. Os resultados mostram que a
origem dos clusters RD1 e RD2 são diferentes e que a epidemia da área
RD3 é o resultado da expansão da área RD2. As seqüências genéticas dos
dois genes analisados neste estudo foram comparadas entre si e com
seqüências obtidas no GenBank apresentando alta identidade (> 98%),
mantidas no tempo e espaço. Os resultados sugerem que as linhagens do
RABV que circulam em D. rotundus na costa atlântica da América do Sul são
altamente conservadas.
Palavras-chave:
Lyssavirus;
Vírus
Epidemiologia molecular; Filogenia.
da
raiva;
Quirópteros;
Bovinos;
Abstract
The biogeographical history of rabies can be reconstructed using molecular
data. This work describes the genetic characterization of the Rabies virus
lineages that circulates in the Desmodus rotundus (vampire bat) population in
an epidemic area and is transmitted to herbivorous livestock. The N and G
genes of this virus were sequenced, and the phylogenetic trees generated
were topologically concordant. Three genetic clusters were identified in the
epidemic area and were designated RD1, RD2 and RD3. The results show
that the origins of the epidemic in areas RD1 and RD2 were different and that
the epizootic in area RD3 was the result of expansion of that in area RD2.
The two genes analyzed are conserved, and their identities, which are
greater than 98%, were maintained over time and space. The genetic
sequences in this study were compared with others retrieved from GenBank,
and the high identity of the N and G genes was also shown to be maintained
over time and space. The results suggest that the D. rotundus lineages of the
Rabies virus from the Atlantic coast of South America are highly conserved.
Key words: Lyssavirus; Rabies Virus; Chiropters; Bovines; Molecular
epidemiology; Phylogeny.
Abreviaturas e Símbolos
A= adenina
aa= amino ácido
AcN= anticorpo neutralizante
AgV= variante antigênica
CD44= glicoproteína de superfície celular, envolvida com a interação entre
as células e sua migração
CD99= glicoproteína de superfície celular, envolvida com a migração de
leucócitos, transporte de proteínas através de membranas, interação com o
citoesqueleto, entre outros
CG= Complexo de Golgi
C-terminal= região carboxi-terminal das proteínas
Da= Dalton
ERA= amostras fixa Evelyn-Rokitnicki-Albelseth
ECTO= ectodominio extra-celular de G
ED= endodominio intra-celular de G
G= glicoproteína G
G= guanosina
Gs= forma solúvel de G
HEP-Flury= amostras fixa High Egg Passage-Flury
ICTV= International Committee on Taxonomy of Viruses
kDa= quilo Dalton
L= proteína RNA polimerase RNA dependente L
Le= promotor líder (”leader”)
M= proteína matriz M
MAb= anticorpo monoclonal
mRNA= RNA mensageiro
N= nucleoproteína N
nAChR= receptor nicotínico de acetilcolina
NCAM= molécula de adesão de neurônios
nm= nanômetro
nt= nucleotídeo(s)
N-terminal= região amino-terminal das proteínas
OPAS/OMS= Organização Panamericana de Saúde/Organização Mundial
de Saúde
ORF= “open reading frame”
P= fosfoproteína P
p75NTR= receptor de neurotrofina de baixa afinidade
pH= potencial hidrogeniônico
poli (U)= códon de parada (sitio de poliadenilação)
PV= Pasteur Virus
RABV= Vírus da Raiva
RE= retículo endoplasmático
RNA-Le= RNA líder
RNP= ribonucleocapsídeo
SNC= Sistema Nervoso Central
SP= peptídeo sinal de G
SVS/MS= Secretaria de Vigilância em Saúde, do Ministério da Saúde do
Brasil
Tc= Linfócitos T cititóxicos CD8+
Th= Linfócitos T auxiliares CD4+
TM= domínio trans-membrana de G
Tr= promotor “trailer”
U= uracila
VSV= Vírus da Estomatite Vesicular
WHO= World Health Organization
Lista de Tabelas
01
Espécies reconhecidas e espécies propostas do Gênero Lyssavirus,
Família Rhabdoviridae. (Childs e Real, 2007)..................................... 31
02
Número de casos de raiva, por espécie animal na Europa no
período 1990-2008. O número de casos de raiva em raposas e
raccoon-dog são mostrados separadamente, mas pertencem ao
grupo de silvestres Fonte: Rabies Bulletin Europe............................. 62
Número de casos de raiva em cães e gatos na Europa. 1990-2003.
Fonte: Rabies Bulletin Europe..........................................
63
03
04
Número de casos de raiva em alguns países europeus com
diferentes “status” de vigilância epidemiológica (1977-2008). Fonte:
Rabies Bulletin Europe........................................................................ 63
05
Histórico dos últimos 10 anos mostrando o número de casos de
raiva
humana
por
país
da
América
Latina.
Fonte:
http://sirvera.panaftosa.org.br.............................................................. 69
06
Histórico dos últimos 10 anos mostrando os casos de raiva em
animais e sua distribuição. Fonte: http://sirvera.panaftosa.org.br....... 69
07
Histórico dos últimos 10 anos mostrando os casos de raiva em
bovinos. Fonte: http://sirvera.panaftosa.org.br.................................... 70
08
Número de casos de raiva por espécie no Brasil no ano de 2009.
Dados parciais até 23 de julho. Fonte: SVS/MS.................................. 81
09
Ocorrência de raiva em herbívoros, confirmação pela rede de
laboratórios de diagnóstico do Estado de São Paulo. Fonte: Peres,
2009..................................................................................................... 97
10
Número de morcegos Desmodus rotundus capturados e tratados
com Warfarina e refúgios trabalhados no Estado de São Paulo,
1997–2007. Fonte: Peres, 2009......................................................... 99
11
Número de herbívoros existentes e herbívoros vacinados, na área
de vacinação obrigatória da raiva, no Estado de São Paulo, 2001–
2006. Fonte: Peres, 2009.................................................................... 100
12
Números de casos de raiva no Estado de São Paulo em relação aos
mapas Kernel da Figuras 29 e 30, no período 1997-2003. Fonte:
Gomes, 2008....................................................................................... 106
13
Amostras de RABV AgVG3 utilizadas para o estudo do gene N. A
Tabela mostra o número de acesso do GenBank das amostras, ano
e cidade do isolamento, o número de registro do Instituto Pasteur,
as espécies nas quais o vírus foi isolado e os Subclados ou Grupos
a que pertencem.................................................................................. 110
14
Amostras de RABV AgVG3 utilizadas para o estudo do gene G. A
Tabela mostra o número de acesso do GenBank das amostras, ano
e cidade do isolamento, o número de registro do Instituto Pasteur,
as espécies nas quais o vírus foi isolado e os Subclados ou Grupos
a que pertencem.................................................................................. 113
15
Número de herbívoros positivos para a raiva nas áreas RD1, RD2 e
RD3 e o total de herbívoros positivos no Estado de São Paulo no
período de 1996-2003; B- Distribuição cronológica de bovinos e
eqüinos positivos para a raiva das áreas RD1, RD2 e RD3 que
tiveram o gene N tipificado no estudo; C- Distribuição cronológica
de bovinos e eqüinos positivos para a raiva das áreas RD1, RD2 e
RD3 que tiveram o gene G tipificado no estudo. Fonte: Comissão
Estadual
de
Controle
da
Raiva
(www.pasteur.saude.sp.gov.br/coordenacao/coordenacao)............... 117
16
Números de acesso do GenBank de seqüências utilizadas para
gerar a seqüência consenso do gene N RABV AgV3 (A) e para o
gene G (B) e, também, utilizadas nas análises filogenéticas. A
Tabela mostra as espécies das quais o RABV foi isolado, o Estado
de origem, o ano de isolamento e as referências bibliográficas
relacionadas às seqüências................................................................ 118
17
Nomenclatura, abreviatura, símbolos e polaridade dos 20
aminoácidos traduzidos a partir do código genético. Fonte: Lodish et
al. (2005).............................................................................................. 135
Lista de Figuras
01
Esquema da composição estrutural do Vírus da Raiva. Fonte:
www.sciencephoto.com.br............................................................. 33
02
Micrografias do RABV corados negativamente. A- x70000, Bx40000 e C- x200000, respectivamente e aproximadamente....... 34
03
Representação esquemática da organização genômica das
amostras fixas PV e ERA do RABV proposto por Tordo et al.
(1986) (acima) e a representação esquemática da organização
genômica da amostras fixa HEP-Flury (abaixo) do RABV
proposto por Morimoto, Ohkubo, Kawai, (1989), mostrando a
integração da região não-codificante G-L dentro do gene que
codifica para a glicoproteína do vírus. Fonte: Morimoto, Ohkubo,
Kawai, (1989)................................................................................ 37
04
Reação de imunofluorescência positiva para a pesquisa do
antígeno rábico em impressões de tecido nervoso de animal
infectado. Observar Corpúsculos de Negri (estruturas circulares)
Fonte: Instituto Pasteur (www.pasteur.saude.sp.gov.br)............... 45
05
Micrografia eletrônica corada negativamente de Corpúsculo de
Negri (estrutura central circular). Observar partículas do RABV
ao redor do Corpúsculo de Negri. X64000. Fonte:
www.news.bbc/diseases/img/rabies.............................................. 46
06
Representação esquemática do ciclo de replicação do vírus da
raiva, evidenciando-se os processos de ligação, entrada,
replicação, maturação e saída de novas partículas virais
infectantes. Fonte: Piere (2003).................................................... 48
07
Eletroforese em gel de poliacrilamida mostrando o peso
molecular da nucleoproteína N do RABV. PM= peso molecular,
MC= meio de cultura, LC= lisado celular e RNPs=
nucleoproteína N com 57KDa. Imagem cedida por Caporale,
GMM.............................................................................................. 49
08
Mapa da Europa mostrando os 703 casos de raiva em bovinos
nos diferentes países no ano de 2008. Os casos de raiva são
indicados por pontos vermelhos. Fonte: Rabies Bulletin
Europe........................................................................................... 64
09
Mapa da Europa mostrando os 5106 casos de raiva em raposas
(Vulpes vulpes) nos diferentes países no ano de 2008. Os casos
de raiva são indicados por pontos vermelhos. Fonte: Rabies
Bulletin Europe............................................................................. 64
10
Distribuição de casos de raiva nas Américas, 2006. Fonte:
http://sirvera.panaftosa.org.br........................................................ 70
11
Casos de raiva em cães no Brasil no ano de 2008. Fonte:
SVS/MS......................................................................................... 74
12
Casos de raiva em bovinos no Brasil no ano de 2008. Fonte:
SVS/MS......................................................................................... 75
13
Casos de raiva em equinos no Brasil no ano de 2008. Fonte:
SVS/MS......................................................................................... 75
14
Casos em animais e humanos no Brasil, 2008. Fonte: SVS/MS..
15
Série histórica de casos de raiva em humanos por Estados do
Brasil, 1986-2008. Fonte: SVS/MS ............................................... 78
16
Série histórica de animais transmissores de casos de raiva
humana no Brasil, 1986-2007. Fonte: SVS/MS............................. 79
17
Imagens de diferentes fenótipos de Desmodus rotundus. As
duas imagens superiores mostram a pelagem castanha, comum
e, abaixo, alaranjada e albina, raras. Fotos: W. Uieda.................. 86
18
Imagens de abrigos artificiais de Desmodus rotundus. Fotos:
J.J. Ferrari..................................................................................... 89
19
Imagens de abrigo artificial (mina abandonada) de Desmodus
rotundus e outros morcegos. Foto: J.J. Ferrari............................. 90
20
Imagem de cavalo sendo atacado pelo Desmodus rotundus.
Observar morcego e ferimento causado pela espoliação no
pescoço do cavalo. Foto: J.J. Ferrari............................................ 91
21
Detalhe da Figura 20 (cavalo sendo atacado pelo Desmodus
rotundus). Observar morcego e ferimento causado pela
espoliação no pescoço do cavalo. Foto: J.J. Ferrari..................... 92
22
Mapa mostrando os Departamentos de Saúde do Estado de
São Paulo. Fonte: www.saude.sp.gov.br/content/geral................. 97
77
23
Mapa do Estado de São Paulo (SP), Sudeste, Brasil, e as áreas
epidêmicas RD1, RD2 e RD3. A localização da capital do
Estado, cidade de São Paulo, e a região endêmica estão
indicadas no mapa. A localização do Estado de São Paulo é
mostrada em cinza no mapa do Brasil no canto direito da
Figura. Os Estados brasileiros Mato Grosso (MT) e Mato Grosso
do Sul (MS), da região Centro-Oeste, Estado de Tocantins (TO),
na região Norte, além de Minas Gerais (MG) e Rio de Janeiro
(RJ), os quais como São Paulo, situam-se na região Sudeste,
são também mostrados na Figura. Abaixo, o mapa do Brasil
mostrando o relevo do país e ao lado, o Estado de São Paulo
mostrando seu relevo em maiores detalhes. Fonte: Miranda
(2009)............................................................................................ 98
24
Gráficos e tabelas com os números de bovinos e eqüinos
positivos para a raiva no Estado de São Paulo (imagem
superior), como também nas áreas RD1, RD2 e RD3 (imagem
inferior)
Fonte:
(www.pasteur.saude.sp.gov.br/coordenacao/coordenacao)......... 100
25
Aspectos do relevo do Estado de São Paulo (imagem superior)
e divisão geomorfológica paulista (imagem inferior). Imagens
geradas a partir de dados provenientes do SRTM (“Shuttle
Radar Topography Mission”). Fonte: Gomes, 2008...................... 102
26
Pluviosidade média anual do Estado de São Paulo (imagem
superior) e temperatura média anual do Estado de São Paulo
(imagem inferior). Imagens geradas a partir de dados
provenientes do SRTM (“Shuttle Radar Topography Mission”).
Fonte: Gomes, 2008...................................................................... 103
27
Mapa parcial da América do Sul mostrando seu relevo.
Observar a área destacada com um retângulo em preto que
delimita, aproximadamente, a área da epidemia 1997-2002
estudada. Fonte: www.geografiaparatodos.com.br....................... 104
28
Posicionamento dos principais rios e represas existentes nas
áreas RD1, RD2 e RD3. Fonte: Gomes, 2008.............................. 104
29
Mapas Kernel para cada ano da série histórica 1992-2003
sobrepostos à divisão geomorfológica paulista. Os “valores
“baixos e altos” são relativos ao número de casos de raiva
diagnosticados no ano analisado. Fonte: Gomes, 2008............... 105
30
Função Kernel elaborado com a somatória dos diagnósticos
laboratorialmente positivos de raiva bovina (1992-2003) nas
áreas RD1, RD2 e RD3. O epicentro da Figura, em vermelho, se
refere à área RD2 analisada neste trabalho. Os valores relativos
“baixos e altos” referem-se ao número de casos de raiva
diagnosticados no período 1992-2003. Fonte: Gomes, 2008....... 106
31
Função Kernel da cobertura vegetal das áreas RD1, RD2 e RD3
no ano de 1997. Observar os dois focos de raiva (círculos
brancos e pretos) na área RD1. Comparar com a Figura 29, ano
de 1997 Fonte: Gomes, 2008........................................................ 107
32
Transições (x s) e transversões (∆ v) versus gráfico de
divergência das seqüências genéticas do Gene G da
glicoproteina (A) e do Gene N da nucleoproteína (B)................... 121
33
Árvore filogenética do gene N do RABV, gerada pelo método de
Distância Neighbor-joining (NJ), incluindo seqüências de
referência AgV3 RABV e linhagens do gene N AgV3 RABV
isoladas de bovinos do Estado de São Paulo, Brasil. A
seqüência de referência Duvenhage foi utilizada como outgroup.
Os números próximos aos nós dos ramos da árvore filogenética
representam os valores de bootstrap. As linhagens numeradas
são descritas na Tabela 13........................................................... 123
34
Árvore filogenética do gene N do RABV AgV3 gerada pelo
método de Distância Neighbor-joining (NJ), incluindo
seqüências do Estado do Rio de Janeiro, Vale do Paraíba (SP)
e linhagens representativas da epidemia 1997-2002. Os
números próximos aos nós dos ramos da árvore filogenética
representam os valores de bootstrap............................................ 126
35
Árvore filogenética do gene N do RABV AgV3 gerada pelo
método de Distância Neighbor-joining (NJ), incluindo
seqüências de linhagens representativas da epidemia 19972002 (caixa alta) e dos anos de 2007 e 2008 (caixa baixa)
isoladas na mesma área epizoótica. Os números próximos aos
nós dos ramos da árvore filogenética representam os valores de
bootstrap........................................................................................ 127
36
Árvore filogenética do gene G do RABV, gerada pelo método de
Distância Neighbor-joining (NJ), incluindo seqüências de
referência AgV3 RABV e linhagens do gene G AgV3 RABV
isoladas de bovinos do Estado de São Paulo, Brasil. A
seqüência de referência Duvenhage foi utilizada como outgroup.
Os números próximos aos nós dos ramos da árvore filogenética
representam os valores de bootstrap............................................ 128
37
Média da distância genética entre as linhagens RABV AgV3
isoladas de bovinos no Estado de São Paulo (diversidade intrapopulação) e entre estas linhagens e a amostra fixa PV como
também entre o Consenso Brasileiro AgV3 (divergência intrapopulação) baseado no gene N da nucleoproteína. B.
Diversidade do gene N entre as linhagens RABV AgV3 isoladas
em bovinos no Estado de São Paulo entre 1997 a 2001. C.
Divergência do gene N entre as linhagens do RABV AgV3
isoladas no Estado de São Paulo entre 1997 a 2001 e a
linhagem da amostra fixa PV e entre as linhagens do Consenso
Brasileiro RABV AgV3................................................................... 130
38
A. Média da distância genética entre as linhagens RABV AgV3
isoladas de bovinos no Estado de São Paulo (diversidade intrapopulação) e entre estas linhagens e a amostra fixa PV como
também entre o Consenso Brasileiro AgV3 (divergência intrapopulação) baseado no gene G da glicoproteina. B. Diversidade
do gene G entre as linhagens RABV AgV3 isoladas em bovinos
no Estado de São Paulo entre 1997 a 2001. C. Divergência do
gene G entre as linhagens do RABV AgV3 isoladas no Estado
de São Paulo entre 1997 a 2001 e a linhagem da amostra fixa
PV e entre as linhagens do Consenso Brasileiro RABV
AgV3.............................................................................................. 131
39
Entropia do gene N (acima) e da nucleoproteína N (abaixo). H=
Grau de entropia (incerteza) e x= número de seqüências
analisadas..................................................................................... 136
40
Entropia do gene G (acima) e da glicoproteína G (abaixo). H=
Grau de entropia (incerteza) e x= número de seqüências
analisadas..................................................................................... 137
41
Comparação das seqüências de amino ácidos alinhados e
deduzidos a partir das seqüências genéticas do gene da N da
nucleoproteína das linhagens do RABV AgV3 estudada. Os
amino ácidos das colunas em tom cinza são aqueles
encontrados em todas as linhagens e, portanto, são assinaturas
genéticas. A seqüência Consenso BR está em vermelho. O
nome das seqüências da área RD1 é mostrado em cor verde e
os amino ácidos que caracterizam estas seqüências, as
assinaturas da área RD1, estão circundados também em verde.
A numeração da primeira linha da figura se refere ao número da
posição do amino ácido em relação à amostra fixa Pasteur
Virus.............................................................................................. 195
42
Comparação das seqüências de amino ácidos alinhados e
deduzidos a partir das seqüências genéticas do gene da
Glicoproteína G das linhagens do RABV AgV3 estudadas. Os
amino ácidos das colunas em tom cinza são aqueles
encontrados em todas as linhagens e, portanto, são assinaturas
genéticas. A seqüência Consenso BR está em vermelho. A
numeração da primeira linha da figura se refere ao número da
posição do amino ácido em relação à amostra fixa Pasteur
Virus.............................................................................................. 198
Índice
1.Introdução.........................................................................................
25
1.1.A Raiva............................................................................................
25
1.2.História da Raiva.............................................................................
25
1.3.Classificação do RABV.................................................................... 29
1.4.O RABV..........................................................................................
32
1.4.1.Morfologia do RABV.....................................................................
32
1.4.2.Organização genômica do RABV................................................. 34
1.4.3.Transcrição e Tradução do RABV................................................ 37
1.4.3.1.Os transcritos mRNA do RABV.................................................
38
1.4.4.Replicação do RABV...................................................................
39
1.4.5.Variação genotípica do RABV.....................................................
40
1.4.6.O ciclo de infecção do RABV......................................................
42
1.4.6.1.Morfogênese e gemação do RABV...........................................
44
1.4.7.As proteínas e os genes do RABV...............................................
47
1.4.7.1.A Nucleoproteína N...................................................................
47
1.4.7.2.O gene N...................................................................................
50
1.4.7.3.A Glicoproteína G......................................................................
50
1.4.7.4.O gene G...................................................................................
53
1.4.7.5.A Fosfoproteína P.....................................................................
53
1.4.7.6.Proteína matriz M......................................................................
54
1.4.7.7.RNA polimerase-RNA-dependente L........................................
55
1.4.8.O RABV e a patogenia da raiva..................................................
57
1.5.A Epidemiologia da Raiva...............................................................
59
1.5.1.A raiva na na África......................................................................
59
1.5.2.A raiva na Ásia.............................................................................
60
1.5.3.A raiva na Europa.........................................................................
60
1.5.4.A raiva na América do Norte........................................................
65
1.5.5.A raiva na América Central e do Sul............................................
67
1.5.5.1.As variantes antigênicas e genéticas do RABV na América
Latina espanhola...................................................................................
72
1.5.6.A raiva no Brasil...........................................................................
74
1.5.6.1.As variantes antigênicas e genéticas do RABV no Brasil.........
82
1.5.7.O Desmodus rotundus e a raiva em bovinos...............................
85
1.5.7.1.A biologia do Desmodus rotundus............................................. 85
1.5.8.A dinâmica da raiva em bovinos................................................... 93
1.5.9.A epidemia de raiva 1997-2002 no Estado de São Paulo............ 95
2.Objetivos...........................................................................................
108
3.Material e Métodos..........................................................................
109
3.1.Amostras........................................................................................
109
3.2.Transcrição reversa seguida da Reação em cadeia pela
polimerase (RT-PCR) e Seqüenciamento do DNA...............................
112
3.3.Análise filogenética.........................................................................
114
3.4.Seqüências de consenso...............................................................
115
3.5.Análise de Distância Genética........................................................
116
3.6.Análise de polimorfismos................................................................
116
3.7.Entropia dos genes N e G e das proteínas N e G..........................
116
4.Resultados.......................................................................................
120
4.1. RT-PCR e Seqüênciamento...........................................................
120
4.2. Análise Filogenética.......................................................................
120
4.3.Análise de Distância Genética........................................................
129
4.4.Análise do Polimorfismo dos genes N e G.....................................
129
4.5.Análise das Regiões com Atividade Biológica da Nucleoproteína
N e da Glicoproteína G..........................................................................
133
4.6.Entropia dos genes N e G e das proteínas N e G..........................
135
5.Discussão.......................................................................................... 138
6.Conclusões....................................................................................
160
Referências.......................................................................................
161
Anexos...............................................................................................
188
Seqüências putativas da nucleoproteína N e da glicoproteína G do
RABV..................................................................................................... 188
Protocolos das Reações de Material e Métodos...................................
199
1.Introdução
1.1.A Raiva
A raiva é uma doença infecciosa aguda e progressiva do sistema
nervoso central (SNC) de mamíferos, causada pelo Vírus da Raiva (RABV).
O vírus é presente na saliva de animais infectados e, assim, a transmissão
ocorre, em geral, através de mordedura (Acha e Szyfres, 2003).
A doença é um grave problema de saúde pública, apesar de ser uma
doença que pode ser prevenida por meio de vacina (Briggs e Hanlon, 2007).
A Organização Mundial da Saúde (OMS), estima a morte de 55.000 pessoas
por ano, principalmente na Ásia e na África, onde se calcula haver,
aproximadamente, 31000 casos/ano e 24000 casos/ano, respectivamente
(WHO, 2005). A raiva é a décima primeira causa de morte humana entre as
doenças infecciosas (WHO, 2000). A doença mata mais pessoas que febre
amarela, dengue e encefalite japonesa, pois uma pessoa morre de raiva a
cada 15 minutos e, no mesmo intervalo de tempo, outras 300 são expostas
ao vírus (Rupprecht, Hanlon, Hemachuda, 2002).
A importância da raiva para a saúde pública não se limita apenas ao
número de casos, mas também pela alta letalidade, que alcança 100% dos
enfermos. Também é necessário considerar o caráter econômico da doença
(WHO, 2005), pois aproximadamente dez milhões de pessoas/ano são
submetidas à profilaxia pós-exposição (Plotkin, 2000; Rupprecht, Hanlon,
Hemachuda, 2002).
Além dos problemas anteriormente citados, é necessário o contínuo
desenvolvimento de procedimentos diagnósticos e análises epidemiológicas.
Em humanos, doenças infecciosas como tétano, malária cerebral, doenças
causadas por rickettsias, febre tifóide e outras não infecciosas, como a
síndrome de Guillain-Barré, intoxicação por produtos químicos e
encefalomielite alérgica vacinal, se confundem com a raiva (Hemachudha,
Laothamatas, Ruprecht, 2002). Em animais de interesse econômico, como o
gado, as meningoencefalites, principalmente virais, como a pseudo-raiva, a
rinotraqueíte infecciosa e a febre catarral maligna, também são confundidas
clinicamente com a raiva (Heuschele, 1987).
1.2.História da Raiva
A raiva é bem documentada, pois é uma das doenças mais antigas
conhecidas pelo homem. Foi sempre motivo de temor para a população
devido às peculiaridades de sua transmissão, das manifestações clínicas no
25
doente e o curso invariavelmente fatal, comprovando-se tal fato na extensa e
interessante história da raiva registrada na literatura (Steele e Fernandez,
1991).
A palavra raiva deriva do latim “Rabies”, e significa “fúria e delírio”. Do
sânscrito a palavra “Rabhas” significa “loucura e demência” (Steele e
Fernandez, 1991). Os gregos a chamavam de “Lyssa” ou “Lyta”, que
também significam loucura (Wilkinson, 2002).
No código de “Eshnunna”, escrito cerca de 2.000 anos a.C. na
Mesopotâmia, foram registrados os primeiros relatos de morte humana
devido a mordeduras por cães raivosos (Wilkinson, 2002). Era considerada
por povos Assírios, Egípcios e Caldeus como uma doença de origem
religiosa, enquanto que Chineses e Hindus acreditavam que o desequilíbrio
entre os quatro elementos que constituíam o corpo humano favorecia o
aparecimento da doença (Barata, 1985).
Há várias citações sobre a doença na mitologia grega e nela
encontramos os deuses Aristeu, que era invocado na proteção contra este
mal e Artemis, que era cultuado como a divindade com poderes para sua
cura (Barata, 1985).
Homero, em A Ilíada, relacionava problemas da saúde humana e
canina com o aparecimento da estrela “Sirius”, a estrela do cão na
constelação de “Orion”, que surge no firmamento da região do Mediterrâneo
no mês de Agosto. Ainda hoje persiste a crença popular que relaciona o mês
de Agosto como o “mês do cachorro louco” (Schneider e Santos-Burgoa,
1994).
Demócritus, em 500 a.C., foi o primeiro a descrever o quadro clínico
da raiva canina e Aristóteles, no século IV a.C., escreveu no livro História
Natural dos Animais que os cães com raiva ficavam irritados e os animais
mordidos por aqueles cães também adquiriam raiva. Aristóteles, no entanto,
acreditava que o ser humano não era acometido pela raiva animal. O filósofo
Plínio não concordava com esta afirmação e dizia que a raiva animal
também poderia ser transmitida aos humanos (Villasenõr, 1974; Baer, 2007).
Vários autores da antigüidade, como Xenofontes, Virgílio, Horácio e
Ovídio, relataram em suas obras aspectos sobre a raiva, como a importância
do cão na transmissão da doença ao homem, e a infectividade da saliva dos
cães raivosos. Naquela época, acreditava-se que havia um “veneno”, em
latim “virus”, na saliva dos animais com raiva que era o responsável pela
doença (Wilkinson, 2002).
Celsius, no século I d.C., estudou vários aspectos da raiva,
enfatizando a importância da saliva dos animais com raiva na transmissão
26
da doença ao homem. Considerou que outros animais como gatos,
macacos, além do cão, poderiam transmitir a doença. Quanto aos cuidados
com os ferimentos causados por animais com raiva, recomendava o uso de
ventosas para a sucção do veneno inoculado e, posteriormente, a
cauterização das feridas com substâncias cáusticas corrosivas ou ferro em
brasa. Celsius explicava ainda que (para combater a hidrofobia) ”quando a
doença aparece, o único remédio é colocar o doente inesperadamente
dentro de um tanque, fazendo com que ele possa beber água,
desaparecendo ao mesmo tempo a sede e o medo da água”. Estes
procedimentos foram usados até o fim do século XIX (Dean, Baer,
Thompson, 1963).
Só no ano de 900 d.C. a raiva silvestre foi descrita na Europa, quando
um urso com raiva saiu de um bosque, perto do porto de Lyon, na França, e
atacou vinte lenhadores que tentaram matá-lo a pauladas. Em conseqüência
das mordeduras seis lenhadores desenvolveram raiva e foram mortos por
sufocamento, que era um dos procedimentos com que “piedosamente” se
resolviam os casos de raiva humana naquela época (Bravo, 1978).
A primeira grande epidemia descrita da doença data de 1271, quando
lobos com raiva invadiram cidades e vilarejos da França, atacando o
rebanho e as pessoas. Sabe-se que 30 pessoas morreram devido aos
ataques. Em 1500, a Espanha foi assolada pela raiva canina. Em 1604,
espalha-se por Paris e por toda a Europa Central. Na Inglaterra, o
reconhecimento da doença se deu em 1735 (Wilkinson, 2002) e no século
XIX, a doença volta a ganhar grandes proporções na Europa, principalmente
na França, Inglaterra e Alemanha (Baer, Belli, Fishbein, 1990).
Nas Américas, a primeira referencia feita a raiva foi escrita em 1514
pelo capitão Fernandez de Oviedo, durante a conquista espanhola da
península mexicana de Yucatan. Fernandez de Oviedo relacionou a raiva
com a morte de vários soldados, após estes serem mordidos por morcegos
(primeira e única descrição da raiva transmitida por morcegos até o século
XX) e, ao mesmo tempo, ficou intrigado pelo desconhecimento dos nativos
em relação à doença em cães, comum no Velho Mundo (Baer, 2007).
Apesar dos conhecimentos sobre a raiva se avolumarem, crenças
supersticiosas e mágicas eram mantidas para explicá-la. Isto favoreceu a
adoção de condutas exóticas e sem nenhum embasamento científico, e que
muitas vezes submetiam o doente a um sofrimento adicional inútil. Estes
fatos levaram a comunidade científica do século XVII a posicionar-se frente a
esta situação, e em declaração feita a 10 de junho de 1671, em reunião na
Sorbonne, foram condenadas todas as práticas supersticiosas para o
tratamento da raiva (Steele e Fernandez, 1991).
27
Em 1804, na Alemanha, Zinke fez a primeira abordagem científica,
inoculando saliva de cães com raiva em cães sadios, induzindo-os a contrair
a raiva. Zinke pincelou saliva de um animal com raiva na pata ferida de outro
cachorro e observou que, após 17 dias, em média, começaram os sintomas
da doença e, no vigésimo dia o animal tinha a raiva de forma aparente. Nos
seus ensinamentos sobre a doença, Zinke alertou para o cuidado de não ser
contaminado pela saliva de pessoas com raiva, como também ao tocar com
as mãos desprotegidas objetos que estiveram em contacto com a boca dos
doentes (Baer et al., 1990).
Galtier, em 1879, inoculando extrato de tecido nervoso de coelhos
com raiva em cabras e carneiros, visando induzir proteção imunológica em
animais de laboratório, exerceu influência sobre Louis Pasteur nas suas
pesquisas com a raiva (Wilkinson, 2002).
Em 1881, Pasteur publica seu primeiro estudo sobre a raiva,
concluindo que “o sistema nervoso central, especialmente o bulbo, é
particularmente ativo no desenvolvimento da doença”. Provou, ainda, que a
fonte da doença não era somente a saliva, pois reproduziu a doença em
animais através de injeções de material coletado do SNC e fluido espinhal.
Posteriormente, Pasteur e col. cultivaram o vírus, inoculando-o
sucessivamente em animais, observando que o período de incubação, antes
variável, encurtava e se estabilizava. Esta nova amostra viral, obtida
experimentalmente, foi chamada de “atenuada”. Desta adaptação do vírus
da raiva originou-se o vírus “fixo”, cuja virulência é constante e reprodutível
para a espécie na qual foi adaptado, ao contrário do vírus “de rua”, isolado
de animais infectados naturalmente (Baer, 2007).
Pasteur, em 1884, utilizando medulas de coelhos, inoculadas com
vírus “fixos” e dessecadas com potassa (NaOH) a 22 °C, inoculou durante
nove dias, intracerebralmente, o macerado deste material em cães, e estes
não adquiriram raiva. Posteriormente, observou que animais inoculados
diariamente com este material, por via subcutânea, também se tornavam
imunes. A partir dessas observações Pasteur produziu a primeira vacina
para a raiva (Baer, 2007).
Pasteur e col. tinham todos os resultados muitos bem estabelecidos e
favoráveis para começar a testar as vacinas em humanos, mas Pasteur
declara, em carta escrita ao então Imperador brasileiro Dom Pedro II, datada
de 22 de setembro de 1884, “Nada ousei até aqui no homem, apesar de
minha confiança nos resultados e das numerosas oportunidades que tive
depois de meu último comunicado à Academia de Ciências. Mas, apesar de
ter múltiplos exemplos de profilaxia de raiva em cães, parece que minha
mão tremeria quando fosse passá-la à espécie humana”. Mais adiante, na
28
mesma carta, Pasteur faz uma insinuação de que “se fosse imperador de um
grande país (no caso o Brasil), obrigaria condenados à morte a serem alvo
de experimentação das vacinas”. Em troca, se a vacina funcionasse, o
condenado ganharia a liberdade. Dom Pedro II, muito elegantemente e em
carta resposta a Pasteur, negou a proposta do amigo, dizendo que, no
Brasil, a pena de morte nunca chegava a se concretizar e que nenhum
condenado arriscaria entrar em um experimento que pudesse o levar a
morte. E diz, ainda, que se Pasteur quisesse, poderia vir ao Brasil para
realizar pesquisas com vacinação da febre amarela, que era um problema
muito maior no país (Vieira e Hossne, 1998).
Nesse tempo, chega até Pasteur o garoto Joseph Meister, de nove
anos, que havia sido mordido severamente por um cachorro com raiva. O
menino foi examinado por médicos que consideraram inevitável o
aparecimento da doença. Motivado pelas suplicas da mãe de Joseph,
Pasteur decidiu usar o método que havia sido um sucesso em cachorros no
tratamento do garoto. Assim foi feito e, após 60 horas dos ferimentos, foi
inoculado na criança metade do volume de uma seringa de medula de um
coelho infectado com o RABV, preservado por 15 dias. Após essa primeira
injeção, seguiram-se mais 13 inoculações diárias, e a doença não se
manifestou (Wilkinson, 2002).
Em 1886, Pasteur registrou os resultados do tratamento de mais 350
casos, conseguindo estabelecer a profilaxia da raiva, faltando apenas um
centro para a vacinação contra a doença (Wilkinson, 2002).
A Academia de Ciências de Paris propõe uma comissão para
executar a proposta de Pasteur e, assim, foi criado o primeiro Instituto
Pasteur na França. Dez anos depois havia vários Institutos Pasteur por todo
o mundo, se responsabilizando pela pesquisa e tratamento da raiva. No final
de 1886, mais de 2000 pessoas estavam sendo tratadas e a mortalidade da
doença diminuía (Wilkinson, 2002). A partir de então teve início uma nova
etapa na história da raiva, tornando viável e seguro o tratamento de
indivíduos expostos ao RABV.
1.3.Classificação do RABV
O RABV, como outros vírus da Ordem Mononegavirales (Fauquet et
al., 2007), possuem genoma constituído de RNA fita simples, nãosegmentado e com sentido negativo (-ssRNA). Outros representantes desta
Ordem de vírus são, por exemplo, os vírus Ebola (Filoviridade) e os vírus do
sarampo (Paramyxoviridae).
29
O RABV pertence à Família Rhabdoviridade, uma das quatro Famílias
da Ordem Mononegavirales. A família Rhabdoviridae (do grego “rhabdos”,
que significa “roda”) possui cinco Gêneros:
1. Cytorhabdovirus: infectam plantas e são transmitidos por artrópodes.
2. Nucleorhabdovirus: infectam plantas.
3. Vesiculovirus: infectam mamíferos, peixes e insetos.
4. Ephemerovirus: infectam mamíferos e são transmitidos por insetos
hematófagos.
5. Lyssavirus: infectam mamíferos.
O RABV pertence ao Gênero Lyssavirus, que possui sete espécies,
também designadas por Genótipos. A Tabela 01 sumariza as espécies
reconhecidas e as espécies propostas do Gênero Lyssavirus.
O RABV é o vírus protótipo do Gênero Lyssavirus, designado como
genótipo 1 e é o único do Gênero que causa a raiva. Os genótipos 2 até 7
são chamados de vírus aparentados ao RABV (“rabies-like”) (Fauquet et al.,
2007). Os genótipos 2 até 7 apresentam sintomatologia clínica semelhante e
algumas vezes indistinguível da raiva clássica e, por isto, todos os membros
do Gênero Lyssavirus são atualmente citados como causadores de
lissaviroses (Hanlon et al., 2005).
A classificação inicial do Gênero Lyssavirus utilizava o termo sorotipo,
devido às suas características antigênicas, identificadas por meio de estudos
de reações cruzadas com soros. Em 1994, especialistas em raiva
propuseram a denominação de "genótipos" em substituição aos "sorotipos",
até então utilizados para designar os diferentes membros do gênero
Lyssavirus (Gould et al., 2005). Portanto os genótipos 1 a 4 podem também
ser designados por sorotipos 1 a 4, respectivamente.
Badrane et al. (2001a), estudando a homologia genética dos sete
membros do Gênero Lyssavirus os agrupou em dois grupos distintos. O
primeiro grupo, designado por Filogrupo I, é composto pelos genótipos 1, 4,
5, 6 e 7, enquanto que o Filogrupo II, é composto pelos genótipos 2 e 3.
Novos Lyssavirus, isolados recentemente na Rússia e Ásia Central,
ainda estão em estudo, mas muitos estudiosos já os consideram novas
espécies do Gênero (Kusmin et al., 2003; Kusmin et al., 2008).
30
Tabela 01: Espécies reconhecidas e espécies propostas do Gênero
Lyssavirus, Família Rhabdoviridae. (Childs e Real, 2007).
Espécie
Sorotipo/Genótipo/
Abreviação ICTV a
Espécies relacionadas
na manutenção
Mortes
Distribuição
humanas
Referência
anual
Mundial, com exceção da
Rabies Virus (ST 1/GT 1)
Cães, carnívoros silvestres,
Austrália, Antarctica e países
RABV
morcegos
designados como “rabies-free”
~55000
Shope, 1982
(Japão e os da Grã-Bretanha)
Morcegos -
Lagos bat (ST 2/GT 2) LBV
Megachiroptera; Eidolon
África: República Africana,
helvum, Micropterus
Etiópia, Nigéria, Senegal,
pusillus, Epomophourus
África do Sul
Não descrito
1958.
wahlbergi
Shrew - Insectivora;
Mokola (ST 3/GT 3) MOKV
Crocidura spp; Rodentia;
Lopyhromys sikapusi
Bougler e
Porterfield,
África: Cameron Central,
República Africana, Etiópia,
Nigéria, África do Sul,
Ocasional
Shope et al.,
1970.
Zimbábue
Morcegos Duvenhage (ST 4/G 4)
DUVV
Microchiroptera;
Miniopterus schreibersii,
Nycteris gambiensis, N.
África: África do Sul, Guiné,
Zimbábue
Meredith,
Ocasional
Rossouw e Van
Pragg.,1971.
hebaica
European bat Lyssavirus 1
(GT 5) EBLV- 1
Morcegos Microchiroptera; Myotis
Morcegos - Microhiroptera;
(GT 6) EBLV-2
Eptesicus serotinus
(GT 7) ABLV
Aravan virus b ARAV
Khujand vírus b KHUV
Irkut virus b IRKV
Ocasional
Europa
Ocasional
dasycneme, M. daubentonii
European bat Lyssavirus 2
Australian bat Lyssavirus
Europa
Morcegos -
Austrália, 1996; possivelmente
Megachiroptera; Pteropus
e ocasionalmente Sudeste do
alecto, P. scapulatus
continente asiático
Morcegos - Microhiroptera;
Myotis blythi
Morcegos - Microhiroptera;
Myotis mystacinus
Morcegos -Microhiroptera;
Murina leucogaster
West Caucasian bat virus b
Morcegos - Microhiroptera;
WCBV
Miniopterus schreibersi
Ocasional
Quirquistão, 1991
Não descrito
Tajiquistão, 2001
Não descrito
Sibéria Oriental, 2002
Não descrito
Montanhas do Cáucaso, 2003
Não descrito
Bourhy, Kissi
eTordo, 1993.
Bourhy, Kissi e
Tordo, 1993.
Speare et al.,
1997.
Arai et al., 2003.
Kuzmin et al.,
2003.
Kuzmin et al.,
2003.
Botvinkin, 2003.
a- ICTV=International Committee on Taxonomy of Viruses (Fauquet et al., 2007). b- Novos Lyssavirus ainda não classificados
(WHO, 2004).
31
1.4.O RABV
1.4.1.Morfologia do RABV
O RABV é baciliforme, com 100 a 250 nanômetros (nm) de
comprimento e 75 nm de diâmetro, em média, com uma extremidade
semicircular e a outra plana (Sokol, 1975). Possui envoltório externo
(envelope) formado por lipídios da célula hospedeira, com espículas de 5 a
10 nm de comprimento, cerca de 3 nm de espessura, distanciadas em 5 nm,
formadas por trímeros da glicoproteína G (G) (Gaudin et al., 1992). Madore
e England (1977) calcularam haver 450 espículas de G triméricas por virion
(partícula viral). No envelope também são encontradas algumas proteínas da
célula hospedeira, como por exemplo, calnexin, proteínas do citoesqueleto e
os receptores glicoprotéicos CD44 e CD99 (Gupta et al., 2000). A
constituição do envelope é semelhante ao da membrana celular da célula
infectada pelo vírus e, normalmente, são detectados fosfolipídios, lipídeos
neutros e gligolípideos (Wunner, 1991). Abaixo do envelope encontra-se
uma camada matriz formada por proteínas matriz M (M), que une o envelope
do vírus à ribonucleoproteína (RNP) interna. A RNP é helicoidal, possuindo
30 a 35 giros, com 50 nm de espessura por 170 nm de comprimento, em
média, e é composta pelo RNA genômico de fita simples, sentido negativo,
não segmentado, associado às proteínas RNA polimerase RNA dependente
L, fosfoproteína P, nucleoproteína N, além de proteínas M. Formando a RNP
há, aproximadamente, 1800 moléculas de N, 950 de P e 30 a 60 L. Devido a
presença de L a transcrição e a replicação são autônomas e independentes
da célula hospedeira (Wunner, 2002; Van Regenmortel et al., 2000) (Figura
1, Figura 2).
O peso seco do virion é composto por 67–74 % de proteínas; 2-3 %
de RNA; 3 % de carboidratos e 15-25 % de lipídios, sendo que deste
percentual 55-60 % é fosfolipídio e 35-40 % glicolipídio. O RABV tem peso
molecular entre 500 a 700 x 106 Da, densidade em CsCl de 1,19 a
1,20 g/cm3 e densidade em sucrose de 1,17 a 1,19 g/cm3. A infectividade do
vírus é estável entre pH 5,0 e pH 10,0 e é rapidamente inativado a 50°C; por
irradiação ultravioleta ou raio-X; exposição a solventes lipídicos ou agentes
oxidantes (Gaudin et al., 1992).
32
Envelope
Ribonucleocapsídeo
Legenda
Figura 1: Esquema da composição estrutural do Vírus da Raiva.
Fonte: www.sciencephoto.com.br.
33
A
Fonte: www.utmb.edu/images/Rabies_virus.jpg
B
Fonte: www.ncbi.nlm.nih.gov/Rabies_virus_fox.jpe
C
Fonte: www.cdc.gov/kidsrabies/images/rabvir1.gif
Figura 2: Micrografias do RABV corados negativamente. A- x70000,
B- x40000 e C- x200000, respectivamente e aproximadamente.
1.4.2.Organização genômica do RABV
O genoma do RABV, na amostra fixa Pasteur Virus (PV), contém
11932 nucleotídeos (nt). O RNA genômico é linear e policistrônico, com
sentido negativo, codificando do extremo 3’ (região amino-terminal) para 5’
(carboxi-terminal), com o final 5’ trifosfatado e não poliadenilado. Possui
34
cinco genes dispostos nesta ordem: gene da nucleoproteína N (1350 nt),
gene da fosfoproteína P (M1ou NS) (891 nt), gene da proteína matriz M (M2)
(606 nt), gene da glicoproteína G (1572 nt) e gene da RNA polimerase RNA
dependente L (6426 nt). Possui 5 ORF (“open reading frame”),
transcrevendo as proteínas estruturais com as mesmas designações dos
seus respectivos genes (Tordo et al., 1986).
Um promotor multifuncional, designado por ”leader” (Le), que atua de
forma “cis-acting” (inserido e atuando no genoma), para polimerização, é
reconhecido pela transcriptase (somente L) ou pelo complexo polimerase (L
mais P). O promotor Le se situa na extremidade 3’ e transcreve um pequeno
mRNA, o RNA líder (RNA-Le), não traduzido, com 58 nt de comprimento,
correspondente ao trecho de nt do extremo 3’ do genoma precedendo o
gene N. O RNA-Le não é poli (U), ou seja, poliadenilado, e indiretamente,
controla a mudança (“switch”) da transcrição para a replicação do genoma
do vírus. A mudança do modo de transcrição para replicação pode estar
associado à capsidização destes RNA-Le por N (Yang et al., 1998, 1999).
Além destas funções, o RNA-Le parece funcionar como um
sinalizador para que a N se ligue ao RNA genômico (Yang et al., 1998). Há
evidências que os aa 298 a 352 de N, região altamente conservada, parece
ser o sitio de ligação para a região compreendida entre os nt 20 a 30 do
RNA-Le (Kouznetzoff, Buckle e Tordo, 1998).
No extremo 5', no final do genoma, há uma seqüência de 69 nt,
designado por “trailer” (Tr), que é o promotor para a síntese do antigenoma,
de sentido positivo, necessário para a replicação do genoma com sentido
negativo (Tordo e Kouknetzoff, 1993; Conzelmann e Schnell, 1994; Whelan
e Wertz, 1999).
As regiões Le e Tr são ricas em resíduos uracila (U) e adenina (A)
entre os nt 7 a 40, em todos os Lyssavirus. As áreas entre os nt 10 e 20 das
regiões Le e Tr, possuem uma perfeita complementaridade quando
comparadas, indicando ser uma área com iguais funções durante a
transcrição e replicação (Tordo e Kouknetzoff, 1993). Essas áreas podem
corresponder ao sinal de reconhecimento do complexo polimerase L na
transcrição e na replicação. Também existe uma perfeita complementaridade
entre os 11 primeiros nt das extremidades 3’ e 5’. Esta complementaridade é
encontrada em todos os vírus RNA não segmentados de sentido negativo e
pode representar a conservação de sinais entre o genoma e o antigenoma,
sinalização esta fundamental para a replicação (Tordo, 1996). Como o
extremo 3’ do genoma possui um promotor para a acomodação de L, o
antigenoma também necessita o ter para a replicação (Finke e Conzelmann,
35
1997). Assim, a conservação das extremidades 3' e 5', do genoma (e
antigenoma) são fundamentais para a transcrição e replicação (Wunner,
2002).
Os sinais genômicos internos de início e parada da transcrição do
RABV flanqueiam os genes. São compostos por nove nt de uma seqüência
de consenso entre os Rhabdoviridae (Tordo, 1996). No final de cada gene
há uma seqüência poli (U) (códon de parada) que poliadenila as regiões
finais dos mRNA, de sentido positivo. Nos genes M e G de algumas
amostras do RABV há códons de terminação alternativa, pois existem dois
códons de parada em cada um dos genes (Tordo e Poch, 1988).
As seqüências intergênicas do genoma variam em composição e
tamanho e, em alguns casos, a região 5’ do mRNA transcrito se sobrepõe à
região 3’ do gene seguinte. A região entre os genes N e P tem os nt GA; a
região entre os genes P e M tem GUCCG; a região entre os genes M e G
tem GAUAA e a região intergênica entre os genes G e L [chamada psi (Ψ)
ou G-L] tem, em média, 423 nt (Tordo, 1996; Finke, Cox e Conzelmann,
2000).
A região intergênica G-L, a mais extensa, possui 423 nt na amostra
fixa PV (Tordo et al., 1986). Esta região é um dos alvos para o estudo da
evolução molecular do RABV, pois é susceptível a mutações, mesmo
quando livre de pressões seletivas e, assim, é pouco conservada
(Sacramento, Bourhy e Tordo, 1991). Segundo Tordo et al. (1986), esta
região representa um gene remanescente, um pseudogene, uma vez que é
longa o suficiente para sintetizar um peptídeo e apresenta os sinais clássicos
de início e parada de transcrição do vírus. No entanto, até a presente data
não há registro de isolamento de nenhuma proteína derivada desta região.
Em outros Rhabdoviridae, como os Vesiculovirus, nesta região há um sexto
gene (Tordo, 1996).
Morimoto, Ohkubo e Kawai (1989), estudando as amostras fixas HEPFlury (High Egg Passage-Flury) e ERA (Evelyn-Rokitnicki-Albelseth),
encontraram uma organização genômica diferente na região G-L daquela
descrita por Tordo et al. (1986). Os autores demonstraram que a amostra
HEP-Flury não apresenta o sinal de parada de transcrição (poli A) entre a
extremidade 5’ do gene G e a 3’ da região não-codificante G-L,
considerando, portanto, que esta região esteja integrada ao gene G,
podendo ser transcrita como parte deste gene. Na amostra ERA, verificaram
a mesma organização genômica de PV sugerida por Tordo et al. (1986),
porém mostraram, através do isolamento de glicoproteínas de tamanhos
diferentes, que a transcrição do gene da glicoproteína pode terminar em dois
36
pontos distintos: na posição +10 a partir da extremidade 5’ do gene ou na
extremidade 5' da região G-L (sinal de poliadenilação).
Resumindo e em relação ao gene G, no genoma das amostras
vacinais PV e ERA, há dois sinais de poliadenilação (ou códon de parada),
enquanto que em outras amostras vacinais há somente um. O primeiro
códon de parada das amostras vacinais PV e ERA são localizados no final
do gene G, enquanto que o segundo se localiza no final da região
intergênica G-L (Figura 3).
Figura 3: Representação esquemática da organização genômica das
amostras fixas PV e ERA do RABV proposto por Tordo et al. (1986) (acima)
e a representação esquemática da organização genômica da amostras fixa
HEP-Flury (abaixo) do RABV proposto por Morimoto, Ohkubo, Kawai (1989),
mostrando a integração da região não-codificante G-L dentro do gene que
codifica para a glicoproteína do vírus. Fonte: Morimoto, Ohkubo, Kawai
(1989).
1.4.3.Transcrição e Tradução do RABV
A transcrição inicia-se pela extremidade 3’ do genoma e segue
formando os cinco tipos de mRNA com “cap” (adição de metil-guanosina) na
região 5’ e poliadenilados na região 3’. A transcrição é iniciada no momento
em que L reconhece o sinal “cis acting” Le. Primeiramente é transcrito o
RNA-Le, sem “cap” ou poliadenilado, relativo à região Le, que não é
traduzido. O transcrito Le interage com os promotores (“start codon”)
situados no início de cada gene, permitindo que a transcrição dos mesmos
ocorra. A interação de Le com os promotores é necessária para que L “se
apóie” em Le e inicie a transcrição (Yang et al., 1999).
37
1.4.3.1.Os transcritos mRNA do RABV
Os transcritos mRNA possuem sentido positivo e são
monocistrônicos. A seqüência invariável 3'-UUGU-5' do genoma (5'-AACA-3'
em cada transcrito complementar ao genoma) identifica o sinal de inicio da
transcrição (“start codon”). Durante a síntese dos mRNA nascentes L
adiciona ao nt final 5’ uma metilguanosina (5'-m7Gppp) (“cap”) (Testa,
Chanda, Banerjee, 1980). No RABV, a seqüência 3'-AC(U)7-8-5', na região
final 5' de cada gene (“upstream” em relação as seqüências intergênicas), é
a região-sinal de parada (códon de parada) para a poliadenilação dos mRNA
(5'-UGAAAAAAA-3' no final 3' de cada mRNA complementar). O último
mRNA é a ORF do gene G mais a seqüência intergênica G-L (em algumas
amostras, como discutido anteriormente). Quando L opera no modo de
transcrição, ao alcançar a região com 7 ou 8 uracilas no genoma, ela pára e,
repetidamente, copia esta área. Este processo gera a cauda poli-A (com
mais de 200 'A's) no final 3' do mRNA. O novo mRNA é liberado e a
transcriptase, após “saltar” a próxima região intergênica e reconhecer o
próximo “start codon” já ligado à Le, inicia a transcrição do mRNA do
próximo gene (Tordo e Kouknetzoff, 1993; Gould et al., 1998).
A produção dos cinco diferentes mRNA não é igual em número.
Ocorre um gradiente decrescente na produção dos mRNA (e das proteínas
traduzidas) nesta ordem: N > P > M > G > L. O que determina esta
molaridade decrescente dos produtos gênicos é a progressão seqüencial de
L. Nem todas L que transcreveram o gene anterior iniciam a transcrição do
próximo. O tamanho da região intergênica G-L (423 nt, em média) causa
uma grave diminuição na transcrição do gene L (Finke, Cox, Conzelmann,
2000). Portanto, a localização de um gene influencia diretamente sua taxa
de transcrição, indicando que o controle da expressão gênica está
relacionado com a localização do gene no genoma (Banerjee e Barik, 1992).
Pensa-se que L dissocia-se do genoma após a leitura de cada sinal
de parada, antes de reconhecer o próximo sinal de início do gene seguinte.
Como as regiões intergênicas, não transcritas, são muito curtas (dois ou
cinco nt e com exceção da região G-L), o grande complexo polimerase tem
dificuldade em unir-se ao próximo sinal de início. Este mecanismo explicaria
o grande número de produtos do primeiro gene e pouquíssimos do último
(1800 e 60 respectiva e aproximadamente) (Banerjee e Barik, 1992; Finke,
Cox, Conzelmann, 2000). Esta característica não é restrita ao RABV, pois
está presente em todos os representantes da Ordem Mononegavirales, onde
os genes das proteínas estruturais se posicionam na região 3`, enquanto o
gene da polimerase, necessária em pequenas concentrações, se encontra
na posição 5` (Tordo et al., 1992).
38
A tradução dos cinco mRNA (ver item 1.4.6. O ciclo de infecção do RABV)
inicia-se com o códon de iniciação AUG (metionina) na região 5' e termina
na posição 3', com os códons de parada: UAA ou UGA (Wunner, 2002).
1.4.4.Replicação do RABV
A replicação do genoma ocorre após a tradução, com a formação de
vários RNAs intermediários com sentido positivo, os antigenomas, que são
moldes para a síntese do RNA genômico de sentido negativo (Tordo, 1996;
Wunner et al., 2002).
Os antigenomas são sintetizados no sentido positivo e de modo
policistrônico, pois L deixa de reconhecer os sinais de início e parada dos
genes. Logo que o antigenoma e o genoma são produzidos eles são
recobertos (capsidados) por proteína N. Tanto o genoma quanto o
antigenoma, para serem funcionais, devem estar revestidos por proteína N
e, portanto, a replicação é dependente da síntese desta proteína (Banerjee e
Barik, 1992; Tordo e Kouknetzoff, 1993).
O início da síntese do antigenoma e, posteriormente, o genoma, é
produto de alguns eventos.
Inicialmente ocorre a cobertura dos RNA-Le pelas proteínas N recémproduzidas, inativando-as. Este fenômeno impede que L inicie a transcrição
dos mRNA monocistrônicos de cada um dos genes, pois a união de L aos
promotores de transcrição é dependente da presença de RNA-Le (Yang et
al., 1998, 1999).
Outro evento necessário para que ocorra a replicação do genoma do
RABV é a união de proteína N ao RNA genômico. Assim que N recém
produzida se une ao RNA genômico L não reconheçe os sinais de início e
parada, respeitados na transcrição. Enquanto a quantidade de proteína N
unida ao genoma for pequena, L reconhece os sinais de poliadenilação
(“stop códon”), se solta do RNA genômico e reconhece os sinais de início
dos genes seguintes, produzindo novos mRNA. Portanto, havendo
quantidade suficiente de N sobre o RNA genômico, os sinais internos não
são respeitados e a polimerase segue a leitura do genoma ininterruptamente
(Wertz, Davis e Patton, 1987; Banerjee e Barik, 1992).
Nas fases iniciais da infecção, como a presença de N ainda é
pequena, a replicação viral é praticamente inexistente, no entanto, após a
síntese de grandes quantidades de N, inicia-se a replicação do genoma do
RABV. Assim, N é a responsável pela mudança (“switch”) entre transcrição e
39
replicação (Tordo, 1996; Wertz, Davis, Patton, 1987; Banerjee e Barik,
1992). Como resultado, ocorre à transcrição do RNA genômico com sentido
positivo, o antigenoma, que servirá de molde para a produção do genoma
com sentido negativo do RABV (Wunner, 2007).
1.4.5.Variação genotípica do RABV
Como outros vírus RNA, o RABV apresenta pouca fidelidade durante
a replicação pela falta de reparo (“proofreading”) e correção dos erros após a
replicação. Isto ocorre porque L não tem atividade exonucleásica, que retira
nt adicionados incorretamente. Isto causa a incorporação de mutações e,
portanto, inicia a formação de distintos genomas de mesma origem que o
ambiente selecionará (Kissi et al., 1999).
Apesar deste aumento progressivo de variação genotípica, uma
linhagem do RABV pode evoluir e expressar mutações características que
determinam fenótipos que são expressos nas relações vírus-hospedeiro
(Morimoto et al., 1998).
As mutações no RABV ocorrem com freqüência média de 10-4 - 10-5/nt
por ciclo de replicação, alterando a freqüência genômica da população viral.
Assim, as novas linhagens do vírus que incorporam novas mutações, na
tentativa de se adaptarem, são selecionadas. Este fenômeno forma
subpopulações designadas como “quasispecies” (Tsimring, Levine, Kessler,
1996). As diferenças encontradas entre amostras de vírus de diversas
regiões, em diferentes momentos, podem ser analisadas através deste
modelo genético (Morimoto et al., 1998; Kissi et al., 1999).
O ambiente de um vírus RNA é fechado, porém possui componentes
que afetam sua adaptação. Áreas do citoplasma das células infectadas,
individualidade dos hospedeiros e o próprio ambiente ecológico habitado
pelo hospedeiro, modulam a resposta adaptativa dos vírus RNA (Domingo e
Holland, 1997).
Populações com altas taxas de mutações, como os vírus RNA,
possuem uma significante proporção de mutantes deletérios. Além disto,
mutações individuais podem ser perdidas por deriva genética e também por
estrangulamento populacional (“bottlenecks”), permitindo que características
de alta ou baixa adaptação ambiental possam se tornar prevalentes no
hospedeiro (Clarke et al., 1993).
A baixa taxa de mutação de um genoma diminui a possibilidade de
variações adaptativas selecionáveis (Muller, 1964). Em grandes populações,
40
como as de vírus, uma mutação benéfica pode ocorrer durante o
crescimento populacional. Assim, a probabilidade de características com
grande valor adaptativo ser transferida para um novo hospedeiro é alta
(Clarke et al., 1993).
A falta de diferenciação de variações ambientais induz competição
entre os componentes de uma dada população (Hardin, 1960), porém as
altas taxas de mutações dos vírus RNA podem causar coexistência de varias
linhagens geneticamente distintas. A coexistência é possível porque elas
utilizam o ambiente de forma diferente e em taxas diferentes, diretamente
proporcionais ao tamanho de cada linhagem (Miralles et al., 1999).
Nas linhagens de vírus, as mutações com alto valor adaptativo
tendem a se fixar no conjunto delas quando estão agrupadas. Os vírus se
adaptam pelo aparecimento e fixação de mutações com alto valor adaptativo
(Clarke et al., 1993). Esta situação tem limites. Havendo aumento na
adaptação das linhagens mais elas crescem, chegando a um ponto que o
ambiente cria resistência, como por exemplo, pela falta de matéria prima (nt
e aa), espaço, morte prematura da célula, ativação de sistemas SOS do
metabolismo celular, entre outros (Miralles et al., 1999).
A diversidade e abundância de nt e aa são fatores que afetam
sobremaneira a sobrevivência das linhagens dos vírus. Os sinais de início e
parada de transcrição são pontos conservados, onde as taxas de mutações
são pequenas. Alterações nestas áreas alteram a produção dos ácidos
nucléicos (e cosequentemente proteínas), fazendo com que ocorra a
abundância de certos nt ou aa e a falta de outros. A ocorrência de mutações
que favoreçam a replicação de uma linhagem de vírus, com seqüência
nucleotídica diferenciada, determina o maior uso de certos nt ou aa, levandoos à escassez, enquanto há a abundância de outros. Inserções sinônimas
podem produzir o mesmo efeito, como também a presença de partículas
defectivas (Bracho, Moya, Barrio, 1998).
O conceito de “quasispecies” (Eigen e Schuster, 1977) afirma que o
alvo da seleção ambiental não é um simples genótipo, mas um conjunto de
genótipos mutantes distribuídos ao redor do mais freqüente. Ou seja,
“quasispecies” é uma classe de mutantes dentro das probabilidades de
mutações. A classe de uma “quasispecies” que replicar mais rapidamente
será selecionada positivamente. Assim, a seqüência individual não é
selecionável e sim o conjunto de “quasispecies”.
Dentro do ponto de vista da genética de populações os vírus são
variadas populações mutantes dispersas, e não um conjunto proveniente de
uma seqüência selvagem original, como as “quasispecies” (Eigen, 1996).
41
Para a genética populacional, as populações de vírus possuem uma extrema
variabilidade genética. Estas populações são derivadas de “replicons”,
originados através de mutações, e selecionados de forma simples através de
adaptações ambientais. A genética de população não se baseia no indivíduo
ou nos conjuntos de indivíduos, e sim em um grupo semelhante com
variação genética (Miralles, Moya, Elena, 1997).
Os autores que moldaram o conceito “quasispecies” afirmam que a
genética de populações é uma boa teoria para populações de reprodução
sexuada, onde mutação é um evento raro e a seleção de genótipos é a
principal força atuante, gerando populações homogêneas, pois adiciona e
fixa possíveis variações neutras por deriva genética (Felsenstein, 1971;
Haigh, 1978).
Miralles, Moya, Elena (1997), analisando e comparando os dois
modelos de estudo, genética de população e “quasispecies”, concluem que
um pesquisador deve e pode optar pelo modelo o qual estiver mais
familiarizado, pois os resultados da análise, principalmente em relação aos
vírus RNA, serão os mesmos.
1.4.6.O ciclo de infecção do RABV
Os eventos no ciclo de replicação do RABV, na célula hospedeira, são
semelhantes aos de muitos outros vírus, ou seja: adsorção, penetração,
transcrição, tradução, replicação, maturação e liberação por brotamento
(gemação) (Fauquet et al., 2007). Todas as fases intracelulares ocorrem no
citoplasma celular, motivo pelo qual o genoma do vírus possui o gene L. No
que diz respeito aos genes estruturais do vírus estes apresentam diferentes
funções, de acordo com o estágio da infecção (Wunner, 2007).
O vírus liga-se a receptores celulares (proteínas de membrana) por
meio das espículas, formadas por trímeros da glicoproteína G encontradas
sobre a superfície do envelope do vírus (Lafon, 2005).
A adsorção não é dependente de temperatura, mas de pH, sendo o
pH 6,3 o mais favorável, pois este pH determina pequenas mudanças
conformacionais em G. As espículas, em pH ácido, mudam de conformação,
tornando-se mais compridas e irregulares. Esta mudança é reversível e, de
novo em pH 7, retomam a sua conformação original. Portanto, a
conformação de G é dependente de pH (Gaudin et al., 1995).
O reconhecimento dos receptores celulares depende da topografia
das espículas. O sítio antigênico III, que possui o aa arginina na posição
42
333, que determina a neurovirulência do RABV, é preservado na
configuração ácida (Gaudin et al., 1995).
Em relação ao neurotropismo, é provável que o vírus reconheça
receptores de membrana, como o receptor nicotínico de acetilcolina (nAChR)
encontrado nas junções neuromusculares, os prováveis locais de entrada do
vírus no Sistema Nervoso (SN) (Lentz et al., 1982). Lentz et al., (1984)
verificaram uma grande semelhança estrutural entre os aa 189 a 214 de G
com a neurotoxina extraída de serpentes venenosas, um forte ligante do
nAChR. Porém nem todas as células susceptíveis a infecção pelo RABV
possuem nAChR (Lafay et al., 1991). Há indícios que componentes das
membranas celulares com fosfolípidios e glicolípidios estimulam o
neurotropismo do RABV. Em neurônios e fibroblastos, componentes de
membrana como o ácido siálico e gangliosídeos, podem estar envolvidos
(Lentz et al., 1986). Outros dois receptores descritos como importantes para
a entrada do vírus na célula hospedeira são a molécula de adesão de
neurônios CD56 (“neural cell adhesion molecule”) (NCAM) (Thoulouze et al.,
1998) e o receptor de neurotrofina de baixa afinidade (“low-affinity
neurotrophin receptor”) (p75NTR) (Tuffereau et al., 1998).
Após o RABV se ligar ao receptor celular ocorre a invasão da célula
hospedeira, normalmente pela fusão do envelope com a membrana celular
(Superti, Derer, Tsiang, 1984). A penetração do vírus é dependente de
temperatura, sendo 37°C o ponto ótimo. A endocitose (pinocitose) é a
hipótese aceita para explicar a entrada do vírus na célula. Cada uma das
vesículas endocíticas incorpora vários (dois até cinco) virions (Tsiang, 1993;
Gaudin et al., 1993).
No interior da célula ocorre a decapdização do virion, ou seja, a
liberação da ribonucleoproteína (RNP) no citoplasma. O baixo pH interno do
vacúolo digestivo, formado pela união do endossomo mais lisossomo celular,
faz com que a membrana do vacúolo una-se à membrana do envelope do
vírus. Esta união membranosa aumenta a pressão interna do virion, ejetando
a RNP diretamente no citoplasma. Desta forma, o genoma não é lesado pelo
suco digestivo dos lisossomos e também pelas nucleases e proteases
celulares, pois são protegidos pelo próprio endossomo (Gosztonyi, 1994;
Wunner, 2007).
Uma vez a RNP livre no citoplasma, ela desespiraliza para que a
transcrição e a replicação possam ocorrer (Iseni et al., 1998). Nesta
situação, imediatamente se inicia a transcrição dos cinco mRNA, sua
tradução e, logo em seguida e concomitantemente, a replicação (Marsh e
Helenius, 1989; Whitt et al., 1991; Gaudin et al., 1992).
43
A transcrição é realizada pelo complexo polimerase, L mais a proteína
P que age como cofator. Este complexo age sobre os sinais de início (“start
códon”) produzindo os cinco mRNA monocistrônicos (Flamand e Delagneau,
1978). Em cada junção intergênica o complexo polimerase pausa e uma
estimada porcentagem deles (20% a 30%) se dissociam e,
conseqüentemente, há uma atenuação da transcrição em direção a região 5’
(“downstream”) (Finke, Cox, Conzelmann, 2000).
Todas as proteínas virais são transcritas e traduzidas
simultaneamente. As proteínas N, P, M e L são traduzidas nos ribossomos
livres do citoplasma, enquanto que G o é nos ribossomos ligados a
membrana do retículo endoplasmático rugoso (ergastoplasma) (RER)
(Gaudin et al., 1992).
Após a síntese de G, esta é transportada para o lúmen do RER, onde
é iniciado seu processamento. No interior do RER, pontes dissulfídicas são
adicionadas em G, além das dobras realizadas por enzimas e “chaperones”
celulares. Além disto, o monômero de G sofre modificações e é glicosilada.
Alguns dos seus aa asparagina são glicosilados pelo processo N-glycan
(oligossacarídeos ligados a cadeia lateral do aa asparagina). Em seguida, o
pós-processamento dos monômeros de G é finalizado no complexo de Golgi
(CG), onde G são agrupadas, três a três, formando os trímeros das
espículas do vírus. São as espículas que possuem atividade biológica
(Shakin-Eshleman et al., 1992; Whitt et al., 1991; Gaudin et al., 1992;
Gaudin, 1997a).
Após a transcrição das proteínas, principalmente N, a replicação se
torna o evento dominante (Finke e Conzelmann, 1997).
1.4.6.1.Morfogênese e gemação do RABV
Havendo suficiente número das cinco diferentes proteínas e, também,
RNA genômico, ocorre a montagem do vírus (morfogênese).
Concomitantemente à formação da RNP (a união de N, P e L ao RNA), as
proteínas M e G se deslocam em direção a membrana celular para que, em
seguida, ocorra a gemação do virion (Wunner, 2007). Estes eventos ocorrem
enquanto a célula se mantém metabolicamente competente. A morfogênese
viral está associada à formação de uma matriz intracitoplasmática,
conhecida como corpúsculos de Negri ou de inclusão, que antecede a
formação dos novos virions (Matsumoto, 1962). Lahaye et al. (2009)
obtiveram evidências que o corpúsculo de Negri pode ser o local de
replicação e transcrição do RABV (Figura 4 e Figura 5).
44
No citoplasma da célula infectada, as proteínas N e P recémformadas formam complexos homólogos (N-N ou P-P) ou heterólogos (N-P)
(Gigant et al., 2000). Em seguida, ocorre a associação de P com N, na
proporção de 2N para 1P. A razão 2N:1P é encontrada nos virions (Mavrakis
et al., 2003). Supõe-se que esta razão permita a capsidização específica dos
genomas dos vírus RNA negativos, e não de outros RNA celulares (Banerjee
e Barik, 1992). Liu et al. (2004), acreditam que P impede a fosforilação
imediata de N, determinando que esta se ligue mais fortemente ao RNA do
RABV, além de impedir a capsidização de RNA celular. A seguir ocorre a
capsidização do RNA, ou seja, a cobertura do genoma do RABV pelas
proteínas N e P e, conseqüentemente, a formação da RNP.
Figura 4: Reação de imunofluorescência positiva para a pesquisa de
antígeno rábico em impressões de tecido nervoso de animal infectado.
Observar corpúsculos de inclusão (estruturas circulares) Fonte: Instituto
Pasteur (www.pasteur.saude.sp.gov.br).
45
Figura 5: Micrografia eletrônica corada negativamente de Corpúsculo
de Negri (estrutura central circular). Observar partículas do RABV ao redor
do Corpúsculo de Negri. X64000. Fonte: www.news.bbc/diseases/img/rabies.
Pouco se conhece do modo pelo qual L se liga ao RNA. Do estudo de
outros vírus RNA negativos, acredita-se que P auxilie L a se ligar no RNA
(Buchholz et al., 1994). Estudos recentes com o RABV descrevem estruturas
em forma de anel que parecem definir as relações bioquímicas e biofísicas
para a montagem da RNP. Porém, a função dos aa ou dos “motifs” destes
anéis necessitam ser elucidados (Albertini et al., 2006).
Proteínas M são multifuncionais e seguem dois caminhos. Uma parte
se une a RNP, condensando-a, fazendo cessar a transcrição e replicação,
além de dar o formato característico do RABV (Finke, Mueller-Waldeck,
Conzelmann, 2003) e, também, inicia o “enovelamento” da RNP, conferindolhe o formato de “mola” que caracteriza a disposição helicoidal da RNP
(Batista, Franco, Roehe, 2007).
Outra parte se une a membrana da célula hospedeira, preparando-a
para a liberação dos virions. Outra função atribuída a M é a supressão de L
durante o processo de gemação do virion (Ito et al., 1996).
A proteína M é reconhecida tanto por G como também pelas proteínas
P e N. A presença de M na membrana celular desencadeia a migração da
RNP em direção as regiões da membrana onde se encontra G, e são nestas
regiões que ocorre a gemação do virion pelas vias normais de secreção
celular (Mebatsion, Weiland, Conzelmann, 1999).
46
Nos estágios finais da morfogênese a pressão exercida pela RNP,
nos locais onde G e M estão presentes, faz com que ocorra o revestimento
do virion pela membrana da célula hospedeira, formando desta forma o
envelope do RABV e, finalmente, liberando novas partículas infectantes
(Gaudin et al., 1993) (Figura 6).
Todas as atividades, diretas e indiretas, relacionadas anteriormente
tornam a proteína M de fundamental importância na morfogênese do vírus
(Wunner, 2002). Porém, G também tem um papel crítico na liberação e
biogênese do RABV. Primeiramente, esta proteína agrega-se em regiões
basolaterais da membrana celular, direcionada, provavelmente, por enzimas
presentes no citoesqueleto celular. O domínio citoplasmático de G, com
carga negativa, parece dirigir a reunião da RNP, revestida por M, à
membrana celular (Gaudin et al., 1992; Gaudin et al., 1993).
Durante o ciclo de vida do RABV no interior da célula ocorre a
inibição, mesmo que pequena, da síntese de RNA, DNA e proteínas
celulares. Os dois principais fatores destas inibições, provavelmente, são os
RNA-Le, formados no início da transcrição, e a proteína M do vírus, pois
ambos são encontrados no núcleo das células infectadas e, provavelmente,
devem ter alguma ação sobre a expressão gênica celular (Remenick, Kenny,
McGowan, 1988).
Após a saída dos virions das células hospedeiras, em direção aos
espaços intercelulares, eles podem infectar outras células vizinhas, mesmo
na presença de anticorpos neutralizantes (AcN). Porém, se a distância for
maior a presença de AcN inativa o virion, bloqueando sua união aos
receptores celulares (Dietzschold et al., 1985). In vivo e no SN o RABV é
infectante mesmo a distâncias consideráveis (Kucera et al., 1985).
1.4.7.As proteínas e os genes do RABV
1.4.7.1.A Nucleoproteína N
A nucleoproteína N possui 450 aa e é muito conservada durante o
processo evolutivo do RABV (Ertl et al., 1989). A conservação genética de N
ao longo do tempo ocorre, provavelmente, pelos seguintes fatos: interage
com o RNA capsidando-o; é a mais abundante proteína do capsídeo;
protege o genoma contra nucleases celulares; regula a replicação; modula a
transcrição e interage com a fosfoproteína P durante a replicação e tradução
(Wunner, 2002). A proteína N também é a mais conservada
47
antigenicamente, e por estas razões é a mais utilizada em diagnósticos e
estudos das relações evolutivas e epidemiológicas (Tordo e Kouknetzoff,
1993) (Figura 7).
Brotamento
Receptor
Viral
Fusão
Endocitose
Montagem do
capsideo
M, N e L
G
Fusão
Replicação
Transcrição
RNA Síntese de
glicoproteína
Núcleo
Citoplasma
Figura 6: Representação esquemática do ciclo de replicação do vírus
da raiva, evidenciando-se os processos de ligação, entrada, replicação,
maturação e saída de novas partículas virais infectantes. Fonte: Piere
(2003).
A interação da nucleoproteína N com o RNA genômico ocorre no
trecho compreendido entre os aa 298-352 (Kouznetzoff, Buckle, Tordo,
1998). Uma N é encontrada a cada nove nt do RNA (Iseni et al., 1998; Luo et
al., 2007). Acredita-se que após o genoma RNA do RABV ser capsidado por
N, este sofre alterações estruturais que permitem a fosforilação da sua
serina 389 (Kawai et al., 1999). Esta fosforilação de N é necessária para a
ação da polimerase L durante a transcrição e replicação (Wu et al., 2002),
como também para a interação de N com P na RNP (Toriumi e Kawai,
48
2004). A interação de P com N ocorre próximo a serina 389 fosforilada
(Albertini et al., 2006; Luo et al., 2007).
Há um grande interesse na função imunológica de N. Epítopos para
células B e T foram mapeados e encontrados nesta proteína em todos
Lyssavirus (Lafon e Wiktor, 1985; Ertl et al., 1989). Também possui três
epítopos antigênicos lineares no sítio antigênico I (aa 358-367) e mais três
epítopos antigênicos lineares no sitio IV (em duas regiões: aa 359-366 e aa
375-383) (Goto et al., 2000). Os epítopos encontrados entre os aa 359-366
fazem parte dos sítios antigênicos I e IV e refletem diferentes estados
conformacionais de N. Os epítopos encontrados entre os sítios I e IV
também são conservados em todos Lyssavirus. Epítopos dependentes de
conformação também formam os sítios antigênicos II e III (Goto et al., 2000;
Wunner, 2002).
A proteína N é o principal antígeno para células T auxiliares CD4+
(Th). Vários epítopos para células Th foram localizados entre os aa 404-418
(Ertl et al., 1989). Esta proteína não induz a produção de AcN, porém induz o
aumento da produção de AcN dirigidos à G (Fu et al., 1991). Os epítopos de
N são imunodominantes, pois após ser inoculada perifericamente em
diversas espécies animais, infectadas com amostras do RABV “de rua” e
selvagens, os protegeu (Dietzschold et al., 1987). Esta proteína é o antígeno
alvo das células Th em diferentes variantes antigênicas do RABV e, também,
entre os diferentes genótipos do gênero Lyssavirus (Lafon et al., 1992).
A nucleoproteína N, associada ao RNP, é considerada um superantígeno, pois potencializa a ativação periférica de linfócitos sanguíneos na
utilização de várias vacinas humanas. Também estimula a produção de
Eletroforese – concentração de nucleoproteínas (N)
células T Vβ8 CD4+ e liga-se a antígeno MHC classe II, expressos nas
superfícies das células (Lafon et al., 1992).
PM MC
LC RNPs
101Kda
56Kda
N
Figura 7: Eletroforese em gel de poliacrilamida mostrando o peso
molecular da nucleoproteína N do RABV. PM= peso molecular, MC= meio de
cultura, LC= lisado celular e RNPs= nucleoproteína N com 57KDa. Imagem
cedida por Caporale, GMM.
49
1.4.7.2.O gene N
O gene N possui 1350 nt na amostra vacinal PV e, apesar de ser
conservado, há uma relativa variação entre as amostras estudadas (Kuzmin
et al., 2005).
A escolha do gene N como alvo para amplificação através de RT-PCR
ocorre por dois aspectos principais: a) é a região gênica do RABV mais
conservada (Kissi, Tordo, Bourhy, 1995); b) o gene situa-se no extremo 3’ do
genoma, e assim sua transcrição é favorecida, pois ocorre perda de
eficiência da transcrição na direção 5’ do genoma (“downstream”) (Finke,
Cox, Conzelmann, 2000). Principalmente por estas razões o gene N é muito
utilizado nos estudos das relações filogenéticas do vírus (Kissi, Tordo,
Bourhy, 1995; Holmes et al., 2002).
Kissi, Tordo, Bourhy (1995) estudando o polimorfismo genético do
gene N, em amostras de RABV obtidas de vários continentes, demonstraram
que a região central do gene é conservada e seus extremos são pouco
conservados. Há baixa similaridade entre os nt 99-405 e 1080-1278. A
menor similaridade encontrada situa-se entre os nt 30-300, enquanto que há
grande similaridade entre os nt 500-900, ocorrendo maior similaridade entre
os nt 750-850. A porcentagem mínima de similaridade nucleotídica foi de
83.3% nt, e 92.2 % em relação aos aa que formam a proteína N, portanto
muitas mutações sinônimas são encontradas.
Provavelmente não há seleção dominante no gene N, e sim seleção
estabilizadora. Esta seleção atua estabilizando o fenótipo ótimo no ambiente,
mas pode ocorrer acúmulo de mutações neutras em populações de vírus
separadas geograficamente. Este fato pode ocasionar divergências
genotípicas, pois não há acúmulo de mutações não sinônimas (Holmes et
al., 2002).
1.4.7.3.A Glicoproteína G
A Glicoproteína G é a única proteína do RABV capaz de induzir a
formação e reagir com os AcN produzidos pelo hospedeiro do vírus. Esta
glicoproteína tem 524 aa, deduzidos da clonagem de genes G de várias
amostras do RABV, possuindo a mesma equivalência em nt no mRNA que a
traduz. Pós-processada no RER, G contém 505 aa, pois ocorre uma
clivagem retirando 19 aa da região N-terminal ainda no RER (Benmansour et
al., 1992). A função deste segmento de G, com 19 aa, é dirigir a proteína
50
recém-traduzida em direção ao RER para que possa ser processada. Este
fragmento de G recebe o nome de peptídeo sinal (SP) (Gaudin et al., 1992).
Pós-processada G é dividida em três regiões (domínios). O
ectodominio (ED), externo ao vírus e com 439 aa (1 a 439) da região Nterminal, o domínio transmembrana (TM), com 22 aa (440 a 461) e o
endodomínio (ENDO), com 44 aa (462 a 505) da região C-terminal e situado
no interior do vírus (Wunner, 2007).
Em células infectadas ocorre a produção de duas formas de G. Uma
delas é semelhante à encontrada no envelope do RABV (pós-processada),
que forma as espículas do vírus, com 505 aa. A outra, designada como a
forma solúvel de G (Gs), possui com 447 aa, referente ao domínio externo
ED e somente é encontrada no citoplasma celular. O gene G possui
terminação alternativa, determinando a formação de G com os dois
tamanhos descritos (Tordo, 1996).
O domínio TM é conservado, provavelmente por estar imerso no
envelope do vírus, formado pela membrana plasmática dos diferentes
hospedeiros. Esta conservação pode representar uma adaptação das
linhagens do RABV adquirida durante o processo evolutivo vírus/hospedeiro
(Wunner, 2007). O domínio TM é “ancorado” na membrana celular e no
envelope do vírus pelo segmento de aa 439 a 461 após a palmitilação de G
(Gaudin et al., 1992). O processo de palmitilação ocorre durante o
processamento de G no RER. Neste processo é adicionado um ácido
palmítico no aa cisteina 461, que determina a “ancoragem”, pois estabiliza o
domínio TM de G no envelope do vírus (Gaudin et al., 1991). O sítio de
palmitilação na cisteina 461 é conservado em todos Lyssavirus. Este sitio,
provavelmente, também influencia no processo de gemação, pois este sítio
também interage com a proteína matriz M (Wunner, 2007).
O domínio ENDO é o mais conservado, pois a identidade protéica
aferida em linhagens do RABV isoladas em diferentes continentes
permanece grande (Benmansour et al., 1992). A conservação deste domínio
é justificada pelo fato de ENDO estar no interior do virion e ser a área de G
responsável pela migração da RNP em direção a membrana celular,
direcionada pelo citoesqueleto celular (veja morfogênese) (Wunner, 2007).
O domínio extracelular ED de G é o menos conservado,
provavelmente pela pressão seletiva exercida pelo ambiente externo nesta
área do vírus. A região ED é a mais imunogênica, estimulando tanto
linfócitos B quanto linfócitos Th e T citotóxicos (Tc) (Dietzschold et al., 1990;
Kawai e Morimoto, 1994).
51
A glicosilação de G no RER ocorre pela adição de oligossacarídeos
no aa asparagina (N) no sequon (seqüência) NXS/T (S/T= serina ou
treonina), onde X é qualquer aa diferente de prolina (P). A glicosilação é
importante para a expressão e função de G, ou seja, determina suas
atividades biológicas, como, por exemplo, estabilidade e antigenicidade
(Shakin-Eshleman et al., 1992). Até o momento, três potenciais sítios de
glicosilação foram encontrados nas linhagens do RABV. Estes sítios estão
posicionados nos aa 26 (sequon NNS) (Carnieli et al., 2009), aa 37 (sequon
NLS) e aa 319 (sequon NKT) (Wunner, 2007).
O aa alanina (A) 319 é conservado em todos Lyssavirus e é essencial
para o correto e completo dobramento (“folding”) de G recém-processada,
necessário para o subseqüente transporte à superfície celular (Bourhy, Kissi,
Tordo, 1993; Wojczyk et al., 2005).
A região entre os aa 189-214 de G interage o com receptor celular
nAChR, o receptor celular preferencial do RABV em muitos tipos de células
(Tsiang et al., 1986), enquanto que a região entre os aa 318-352 é,
provavelmente, o sitio de ligação que reconhece e interage com o receptor
celular p75NTR em neurônios (Lanvegin e Tuffereau, 2002).
Acredita-se que o domínio protéico de G relacionado à interação da
membrana do endossomo com os lisossomos, no interior da célula infectada
e para que ocorra a ejeção da RNP do RABV no citoplasma, se situa entre
os aa 102 e 179 (Gaudin, 1997b; Kankanamge et al., 2003).
Apesar de não se saber o motivo, as cisteinas (C) de G são
conservadas no RABV, como também o é em todos os outros Lyssavirus
(Badrane e Tordo, 2001).
O aa arginina (R) ou lisina (K), na posição 333, desencadeiam a
neurovirulência do RABV, principalmente pelo fato de permitir que ocorra o
transporte das RNP através dos axônios e sinapses dos neurônios (Lafon,
2005).
Epítopos estimuladores de linfócitos B e T (Th e Tc) foram localizados
em G (Celis et al., 1988). Oito sítios antigênicos (I-VI, “a” e G1) foram
mapeados em ENDO. Os sítios antigênicos I, III, VI e “a” situam-se entre os
aa 231, 330-338, 264 e 342, respectivamente. O sitio II é descontínuo e
localizado entre os aa 34-42 e 198-200. Os sítios VI e G1 são lineares ou
conformacionais (Wunner, 2007).
52
Para uma melhor análise da glicoproteína G é necessário sua
cristalização, que até hoje é difícil, pela existência de dobras estruturais e
que são perdidas durante o processo de cristalização (Wunner, 2002).
É provável que as variações de aa nas proteínas G permitam
adaptações a novos hospedeiros e possibilitem a emergência de novos
Lyssavirus no ambiente (Badrane et al., 2001).
1.4.7.4.O gene G
O gene G é de grande interesse para os estudos filogenéticos do
RABV. Os principais motivos destes estudos são: importância na resposta
imunológica; relação entre hospedeiros suscetíveis e patogênese da raiva
(Badrane et al., 2001).
Foram detectadas regiões de elevada diversidade no gene G. As
regiões com elevada diversidade relacionam-se com o reconhecimento de
receptores neuronais e estimulação do sistema imune. Estas características
podem facilitar a disseminação do vírus dentro de uma mesma espécie ou,
ainda, entre espécies diferentes, o que pode alterar a epidemiologia da
infecção (Benmansour et al., 1992; Morimoto et al., 1998; Badrane e Tordo,
2001). A razão de substituições sinônimas e não sinônimas no gene G é
maior que 01, sugerindo seleção positiva neste gene (Badrane et al., 2001).
1.4.7.5.A Fosfoproteína P
A fosfoproteína P é formada por 297 aa, é multifuncional e é a menos
conservada entre as outras proteínas do RABV (Wu et al., 2007).
Existem duas formas de P, uma menor (37 kDa) e outra maior (40
kDa), devido a existência de dois códons de início (“start” códon) (AUG) em
“frame” no mRNA (Toriumi e Kawai, 2004). Esta proteína é fosforilada na
região N-terminal por quinases celulares, que podem ser encontradas nos
virions do RABV (Gupta et al., 2000).
Dois domínios protéicos de P interagem com N. Um encontrado na
região C-terminal (entre os aa 267 e 297) e, outro, na região N-terminal
(entre os aa 69 e 177) (Chenik et al., 1994). Depois que P se liga ao RNP
em formação (RNA mais N) ela auxilia a ligação de L ao RNP. A interação
de P com L ocorrem nos seus primeiros 19 aa (Chenik et al., 1998; Gerard et
al., 2009).
53
Interagindo com N, a proteína P regula a ação da polimerase L na
replicação e transcrição. É um “chaperone”, pois é uma proteína que age em
ligações não covalentes de outras moléculas durante a formação ou quebra
das suas estruturas, mas não está presente no substrato ao término da sua
ação. Atua sobre N recém sintetizadas, impedindo sua polimerização ou sua
união com RNA que não seja o do RABV (Mavrakis et al., 2003), como
também direciona a capsidização do RNA por N (Gigant et al., 2000).
Como subunidade de L, P tem um papel duplo, pois é um co-fator
não-catalítico, necessário para a transcrição dos genes e, também, para a
replicação do genoma, estabilizando L e posicionando o complexo
polimerase (L mais P) sobre o molde (“template”) RNA (Fu et al., 1994).
Outras interações que envolvem P estão relacionadas ao tropismo do
RABV, a propagação do vírus célula a célula e a inibição da resposta imune
inata que interfere ou cessa a replicação dos vírus (Wunner, 2007).
A proteína citoplasmática LC8 (“dynein light chain”), envolvida no
transporte intracelular de organelas, interage fortemente com o domínio de P
localizado entre os aa 138 e 172 (Raux, Flamand, Blondel, 2000; Gerard et
al., 2009). A proteína LC8 parece estar envolvida com o transporte do RABV
através dos neurônios, pois ela faz parte do complexo miosina V. Nos
neurônios do cérebro, o complexo miosina V é a estrutura que forma os
microtúbulos relacionados com o complexo actina das vesículas do RE
(Jacob et al., 2000). Assim, o transporte da RNP ao longo dos dendritos em
direção ao próximo neurônio, pode ser mediado pelo complexo P-dineina
LC8, transportando a RNP pelo sistema de microtúbulos da célula (Ceccaldi,
Gillet, Tsiang, 1989).
A proteína P também é responsável por inibir o fator de ativação IRF3, que é necessário para o início da resposta imune pelo interferon (IFN),
portanto, P é necessária para inibir a resposta do INF nas células infectadas
pelo RABV (Wunner, 2007).
1.4.7.6.Proteína matriz M
A proteína M é a menor do RABV e contém 202 aa (24 kDa)
(Conzelmann, Cox, Schneider, 1990). Há duas forma de M, uma menor, com
23 kDa (25-30% do total no virion) e outra maior, com 24 kDa (70-75% do
total nos virions) (Ameyama et al., 2003).
Aproximadamente 1200-1500 proteínas M se ligam ao RNP,
condensando-a e formando o arcabouço do virion. O tropismo da RNP pela
54
membrana celular é determinado por esta proteína, possibilitando sua
gemação (Mebatsion, Weiland, Conzelmann, 1999). Um “motif” rico em
prolina (PPPY ou PY) (P= prolina; Y= tirosina), localizado nos aa 35-38, na
região N-terminal altamente conservada, parece estar associado à gemação
(Harty et al., 1999, 2001). O “motif” PY é similar em outras proteínas
relacionadas à função de M em diferentes vírus (Wills et al., 1994). Apesar
da presença de M ligada na RNP ser responsável pela gemação do vírus, a
interação desta proteína com G, presente nas membranas celulares,
estimula fortemente o processo (Mebatsion, Weiland, Conzelmann, 1999).
1.4.7.7.RNA polimerase-RNA-dependente L
Na amostra vacinal PV, a polimerase L possui 2142 aa e o gene L
ocupa, aproximadamente, 54% do genoma do RABV (Wunner, 2007).
A polimerase L é o componente catalítico do complexo polimerase
que, juntamente com o cofator P, é responsável pela maioria das atividades
enzimáticas que ocorrem tanto na transcrição quanto na replicação do
genoma do RABV. Muitas das atividades deste complexo advêm de estudos
com o Vírus da Estomatite Vesicular (VSV), o vírus protótipo da Família
Rhabdoviridae. Além das atividades enzimáticas necessárias para a
transcrição e replicação, L é responsável pelas modificações cotranscricionais dos mRNA, como por exemplo: 5'-capping, metilação e 3'poliadenilação (Banerjee e Chattopadhyay, 1990).
Muitos pesquisadores dos vírus RNA com sentido negativo auxiliaram
a determinar áreas do gene L com o objetivo de localizar seqüencias
genéticas do gene responsáveis pelas atividades enzimáticas da polimerase
L (Tordo et al., 1986; Barik et al., 1990; Poch et al., 1990).
Uma das principais características de L é a existência de
agrupamentos de aa conservados em blocos ao longo da proteína e
nomeados com os números romanos I até VI (Poch et al., 1990). Nestes seis
blocos alguns aa formam domínios conservados, enquanto outros não o são
(Tordo e Poch, 1988; Banerjee e Chattopadhyay, 1990; Poch et al., 1990).
No bloco III, por exemplo, o domínio catalítico, entre os aa 530 e
1177, possui quatro “motifs” (A, B, C e D), e representa a região com o maior
grau de conservação (Tordo e Poch, 1988; Poch et al, 1989). Estes “motifs”,
que são considerados os módulos polimerase de L, mantém o mesmo
arranjo linear e localização nas RNA polimerase e nas DNA polimerase
(Barik et al., 1990; Delarue et al., 1990; Poch et al., 1990).
55
Entre as seqüências conservadas dos quatro “motifs” A, B, C e D, a
seqüência GDN (glicina, ácido aspártico e asparagina), no “motif” C, é muito
conservada em todos os vírus RNA com sentido negativo e não
segmentados, sugerindo ser uma função catalítica da atividade polimerase
(Poch et al., 1989). Não só a seqüência GDN, mas também alguns aa
específicos, “downstream” da seqüência GDN, são fundamentais pela
manutenção da atividade polimerase que polimeriza nt (Schnell e
Conzelmann, 1995).
Duas outras seqüências, entre os aa 754 a 778 e 1332 a 1351, na
polimerase L do VSV, foram definidos como sítios de consenso para a
ligação e utilização de Trifosfato de Adenosina (ATP), similar as encontradas
nas quinases celulares, isto é, as fosfotransferases, pois catalisam a
transferência de um grupo fosfato do ATP alterando moléculas orgânicas
(Barik et al., 1990; Canter, Jackson, Perrault, 1993). Três atividades
essenciais realizadas por L necessitam de utilização do ATP: 1- a atividade
transcricional requer ligação com o substrato ribonucleosídeo-trifosfato; 2poliadenilação e, 3- a atividade quinase para a fosforilação de P necessária
para a ativação da transcrição (Sánchez e Banergee, 1985; Banerjee e
Chattopadhyay, 1990).
Outras funções da polimerase L, que necessariamente devem existir,
incluem: mRNA “capping” (adição de 7-metilguanosina (m7G) no final 5’,
metilação (adição de grupo metila no RNA) e poliadenilação (formação da
cauda poli-A) (Schnell e Conzelmann, 1995).
Qanungo et al. (2004) propuseram uma nova abordagem para a
atividade da polimerase L durante a transcrição e a replicação. A RNA
polimerase L, segundo os autores, existe em duas configurações, uma
designada por replicase e a outra por transcriptase e ambas são complexos
multienzimáticos (holoenzimas). A replicase, relacionada à replicação, é
formada pelas proteínas L, P e N, enquanto que a transcriptase, relacionada
à transcrição, é formada pelas proteínas L, P e mais três moléculas
celulares. Estas moléculas são: “translation elongation factor 1α”, o
chaperone “heat-shock protein 60” e o “mRNA-cap guanylyltransferase”. A
transcriptase sintetiza os cinco mRNA “capped” e monocistrônicos,
transcritos a partir dos cinco genes do RABV. A replicase, por sua vez, inicia
a sua atividade no primeiro nt da região 3’ do genoma. A replicase e a
transcriptase reconhecem códons de iniciação (“start códon”) diferentes.
Enquanto a transcriptase reconhece a seqüência-sinal de consenso dos
Mononegavirales, para “cap”, inclusa no códon de iniciação, a replicase não
o reconhece (reconhece a seqüência de nt da extremidade 3’ do genoma).
Estas descobertas realizadas por Qanungo et al. (2004), abrem novas
56
perspectivas para a compreensão efetiva dos processos de transcrição e
replicação dos Mononegavirales, entre eles o RABV, até hoje pouco
compreendidas.
1.4.8.O RABV e a patogenia da raiva
Dietzschold et al. (2009), escreveram uma revisão sobre a patogenia da
raiva e a sintetizaram em cinco tópicos principais, que apresentamos a
seguir.
1. RAIVA E A BIOLOGIA DO RABV
a) A raiva é uma encefalomielite aguda causada pelo RABV.
b) O RABV pode infectar quase todos os mamíferos, inclusive o homem.
c) Cães, morcegos e carnívoros silvestres são os reservatórios naturais
do RABV.
d) O RABV é um vírus RNA de sentido negativo que pertence à família
Rhabdoviridae.
e) Neuroinvasividade, neurotropismo e neurovirulência são as principais
características do RABV.
f) O RABV é, normalmente, transmitido por mordidas de mamíferos em
um sitio periférico do SNC.
g) Após entrar em axônios terminais o vírus é transportado em direção
retrógrada ao SNC.
h) RABV de “rua” (selvagens) e outros adaptados a culturas celulares
(atenuados) diferem significativamente uns dos outros em relação a
sua capacidade de invadir o SNC.
i) Considerando que as linhagens de RABV adaptados às culturas
celulares têm (ou não) capacidade limitada de invadir o SNC a partir
de um local periférico, RABV de “rua” são altamente neuroinvasivos.
2. FATORES QUE DETERMINAM A VIRULÊNCIA DO RABV.
a) Os principais fatores que determinam a virulência do RABV são:
captação pela célula hospedeira, propagação célula-a-célula, sua taxa
de replicação e expressão de glicoproteína G.
57
b) A patogenicidade correlaciona diretamente com a cinética de
absorção e propagação do vírus, mas inversamente com a taxa de
replicação viral e do nível de expressão da glicoproteína G.
3. ELEMENTOS DO VÍRUS QUE CONTROLAM A PATOGENICIDADE
DE RABV.
a) A patogenicidade do RABV é uma característica multigênica,
envolvendo diferentes proteínas do RABV, além de outros elementos
celulares.
b) A glicoproteína G é o principal determinante da patogenia da raiva.
c) A glicoproteína G facilita a rápida entrada do vírus na célula e sua
rápida propagação trans-sináptica e, também, regula a taxa de
replicação do vírus em conjunto com outros elementos virais.
4. O PAPEL DA APOPTOSE NA PATOGENIA DA RAIVA.
a) A patogenicidade do RABV se correlaciona inversamente com a sua
capacidade de induzir apoptose neuronal.
b) Existe uma correlação direta entre o nível de expressão da
glicoproteína G com o da apoptose.
c) Em contraste com a patogenicidade de RABV atenuado, o vírus de
“rua” expressa níveis muito limitados da proteína G e não induzem
apoptose ou necrose.
5. O PAPEL DE FATORES DE INDUÇÃO DA CÉLULA HOSPEDEIRA
NA PATOGÊNESE DA RAIVA.
a) A infecção com uma linhagem não patogênica do RABV causa mais
fortemente a ativação das vias de síntese de fatores nucleares (NF)κB (fator nuclear kappa B) do que a infecção com RABV patogênicos.
b) O NF-κB é um fator de transcrição e é envolvido com a resposta
celular a estímulos e desempenha papel fundamental na regulação da
resposta imune.
c) A forte ativação de genes relacionados com as vias NF-κB
desencadeia uma forte resposta imune que, provavelmente, limita a
replicação de linhagens de RABV não patogênico no sítio primário de
infecção e, eventualmente, eliminam a infecção.
d) A fraca ativação de genes relacionados com as vias NF-κB pelas
linhagens patogênicas induz uma resposta imune mais fraca e,
conseqüentemente, pode permitir a propagação do vírus no SNC.
58
1.5.A Epidemiologia da Raiva
O RABV é mantido em diferentes ciclos epidemiológicos envolvendo
diversas espécies de mamíferos, principalmente das Ordens Carnivora e
Chiroptera. As espécies de hospedeiros do RABV são distribuídas
geograficamente de acordo com suas histórias naturais. Assim, as variantes
e linhagens do RABV circulam ao longo de um determinado território, o que
permite suas identificações, pois elas estão adaptadas e são mantidas pelas
diferentes espécies animais distribuídas regionalmente. Esta distribuição
pode ser alterada se ocorrer a transmissão do vírus de um hospedeiro
primário para um secundário (“spillover”) e, se esta nova população
infectada mantiver a infecção ao longo do tempo, a área de distribuição do
vírus é alterada, podendo ser ampliada (Childs e Real, 2007).
A partir do exposto acima é conveniente analisar a epidemiologia da
raiva regionalmente e, portanto, a seção Epidemiologia da Raiva deste
trabalho, está subdividida em relação às grandes regiões geográficas, isto é,
os continentes.
1.5.1.A raiva na África
O cão (Canis familiares) é o principal reservatório do RABV no
continente africano, é o responsável por milhares de casos de raiva humana
e um sério problema para os mamíferos silvestres. Em 2005, foram
confirmados 28823 casos de raiva humana; 17937 casos na área rural e
5886 casos na área urbana (WHO, 2005).
Além do imenso problema da raiva humana, os cães são
responsáveis pela transmissão do vírus aos animais silvestres. Um caso
extremo é a contaminação de canídeos raros, como o lobo etíope (Canis
simensis) e o cão-silvestre-africano (Lycaon pictus). A infecção nas
pequenas e raras populações destes animais atingiu tal ponto que se
acredita ser irreversível seu processo de extinção. Em algumas populações
de chacais (Canis adustus e C. mesomelas) e raposas (Otocyon megalotis)
o RABV típico de cão circula endemicamente (WHO, 2005). Além dos
canídeos silvestres africanos são relatados esporadicamente casos de raiva
em leões, leopardos, camelos, hipopótamos, girafas, primatas e muitas
outras espécies de mamíferos terrestres (Hanlon, Niezgoda, Rupprecht,
2007).
59
1.5.2.A raiva na Ásia
Como na África, o cão é o principal reservatório do RABV na Ásia,
com exceção da Rússia asiática, onde o principal reservatório do vírus é a
raposa vermelha. Pouco é conhecido de espécies silvestres com raiva neste
continente, mesmo que casos esporádicos sejam relatados. Entretanto, a
raiva humana transmitida por cães é o grande problema. Em 2005 foram
relatados 30828 casos, assim distribuídos: Índia com 19259 casos (1058 na
área urbana e 18201 na rural), China com 2581 casos (1324 na área urbana
e 1257 na rural) e nos outros países asiáticos 8988 (853 na área urbana e
8135 na rural) (WHO, 2005).
1.5.3.A raiva na Europa
A Europa possui uma excelente documentação histórica sobre a raiva.
Este histórico, inserido dentro da própria História do continente, demonstra
que o controle desta zoonose é diretamente ligado às condições políticas e
econômicas de uma região (WHO, 2005).
A raiva canina na Europa é conhecida desde a Antiguidade, mas por
volta de 1940, teve suas características epidemiológicas alteradas. Desde
esta época a raiva é mantida pela raposa vermelha (Vulpes vulpes), em
contraste com o início do século XX, quando os cães (Canis familiaris) eram
os principais transmissores do RABV. Portanto, ocorreu a mudança do ciclo
urbano, típico do início do século XX, para o ciclo silvestre, predominante até
hoje (Baer, 2007).
Em um período mais recente, outra população de hospedeiros
primários foi determinada, os “raccoon-dogs” (Nyctereutes procyonoides),
sendo hoje a segunda espécie em importância para a raiva no continente
europeu. Esta espécie foi introduzida na Europa a partir da Rússia Oriental,
no continente asiático, para a produção de casacos de pele (WHO, 2005).
Várias outras espécies de animais silvestres são diagnosticadas com
raiva no continente europeu; são casos esporádicos e sem importância
epidemiológica. Os casos, provavelmente, são infecções que ocorrem
durante o relacionamento ecológico presa-predador, principalmente
envolvendo raposas (Kusmin et al., 2004).
Na Europa, quatro espécies são reconhecidamente capazes de
manter seu próprio ciclo epidemiológico: a raposa vermelha, o cão, a raposa
ártica (Alopex lagopus) e os “raccoon-dogs”. Outra espécie silvestre que
gera preocupações em algumas áreas (como a Ucrânia) é o lobo (Canis
60
lupus), principalmente por já ter sido um eficiente vetor do RABV. Os casos
de raiva envolvendo esta espécie haviam diminuído, juntamente com os
cães, e agora alguns focos reapareceram (Bourhy et al., 1999).
A Turquia é o único país europeu onde o cão mantém o ciclo
epidemiológico local, pois raramente é diagnosticado raiva em animais
silvestres. Em uma região entre a Ucrânia e a Federação Russa são
encontrados cães e raposas com raiva, mas cada uma das espécies é
infectada com amostras de vírus típicas de suas espécies (Rabies Bulletin
Europe, 2009).
Existem poucos dados que certifiquem a raposa do ártico como
reservatório do RABV no continente europeu (diferentemente do Alasca).
Pesquisadores russos afirmam que ao norte da Federação Russa existem
focos de raiva mantidos por esta espécie (Botvinkin et al., 2006).
A análise filogenética do RABV que circula na Europa mostra que
existem distintos filogrupos do RABV associados a determinadas áreas
geográficas separadas por barreiras geográficas; os rios Vístula e Danúbio e
as montanhas da Boêmia e Cárpatos. Quatro áreas geográficas podem ser
observadas com distintos filogrupos do RABV e são designados por WE
(Europa Ocidental), CE (Europa Central), EE (Europa Oriental) e NEE (Norte
Oriental – Polônia, Estônia, Lituânia e Finlândia). Na região NEE é onde se
encontra o filogrupo mais divergente filogeneticamente e é característico das
raposas do ártico. O grande filogrupo Vulpes vulpes é encontrado nas quatro
áreas geográficas. Os filogrupos Vulpes vulpes e “raccoon-dog” são típicos
da área geográfica NEE (Kissi, Tordo, Bourhy, 1995; Bourhy et al., 1999;
Badrane et al., 2001).
Atualmente a estratégia para o controle da raiva, na grande maioria
dos países europeus, é a vacinação parenteral para cães e gatos e
vacinação oral de raposas por meio de iscas imunogênicas (um polímero de
extratos vegetais e animais revestindo uma cápsula com Glicoproteína).
Com este esquema vacinal a raiva canina e vulpina desapareceu da Europa
ocidental, com exceção da Turquia Européia e da região Europa Oriental
(Rabies Bulletin Europe, 2009).
A Tabela 2 sumariza a epidemiologia da raiva na Europa.
61
Tabela 2: Número de casos de raiva, por espécie animal na Europa
no período 1990-2008. O número de casos de raiva em raposas e raccoondog são mostrados separadamente, mas pertencem ao grupo de silvestres
Fonte: Rabies Bulletin Europe.
Raccoondogs
Total
12833
148
21049
27
10637
226
16505
2705
15
7318
302
11080
6976
2381
10
6197
290
9385
6644
2160
11
5966
183
8823
1995
5843
2274
16
5294
162
8140
1996
5379
2677
15
4814
181
8087
1997
3413
1626
18
3019
176
5082
1998
3901
2313
4
3380
264
6250
1999
4227
2318
5
3630
345
6592
2000
5837
2276
9
4896
622
8155
2001
6847
3537
12
5724
683
10435
2002
6052
3967
7
4795
874
10051
2003
7093
3952
6
5460
1163
11085
2004
3243
2150
13
2521
500
5453
2005
5806
3980
13
4379
1009
9831
2006
6174
3003
2
4352
1399
9215
2007
5230
4378
9
4537
364
9643
2008
5707
3953
14
5106
359
9707
Ano
Silvestres
Cães e gatos
Humanos Raposas
1990
15484
5503
22
1991
12269
4194
1992
8346
1993
1994
A primeira observação relevante na Tabela 2 é a relação animais
silvestres/domésticos, mostrando a importância do ciclo silvestre e da raiva
vulpina na Europa. É possível também observar o decréscimo da raiva
vulpina, a partir de 1990, quando o protocolo de imunização por meio de
iscas foi estabelecido. O aumento no número geral de casos de raiva
observado a partir de 2001 ocorreu devido à constante integração de vários
países do Leste Europeu na Comunidade Européia. A segunda observação
importante é o aumento de casos entre “raccoon-dogs”, a partir de 1990 e
até 2005 e, atualmente, os dados indicam que o número de casos está
estabilizado. Os casos envolvendo “raccoon-dogs” ocorrem, principalmente,
na Polônia e Estados Bálticos, e isto pode refletir a densidade populacional
da espécie nestas regiões.
Ainda hoje a raiva continua um problema de saúde pública e animal
em algumas regiões européias. A análise espacial de casos mostra
agrupamentos nos Estados Bálticos, Federação Russa, Estados Balcânicos
62
e Polônia. As diferenças encontradas dentro destas áreas refletem diferentes
“status” de estudo e de vigilância epidemiológica. A partir de 2005 a Europa
Oriental também adotou o uso de vacinação oral e, em um futuro próximo
será possível avaliar esta nova situação da região no controle da raiva
(Rabies Bulletin Europe, 2009).
Os casos de raiva em cães e gatos podem ser observados na Tabela
3.
Tabela 3: Número de casos de raiva em cães e gatos na Europa.
1990-2003. Fonte: Rabies Bulletin Europe.
Ano
1990
1991
1992
1993
1994
1995
1996
1997
1998
1999
2000
2001
2002
2003
2004
2005
2006
2007
2008
Cães
1282
1099
780
736
609
605
905
602
777
781
779
1012
1099
1437
739
1378
1105
1415
1694
Gatos
1182
847
622
593
572
589
593
419
577
519
593
1134
1037
1202
699
1230
950
1421
1343
Gado Ovinos/Caprinos
2014
2014
1348
1348
919
919
760
760
752
752
890
890
890
890
521
521
774
111
787
94
783
52
1211
89
1520
216
1098
90
592
54
1134
123
793
79
1304
129
703
100
Tabela 4: Número de casos de raiva em alguns países europeus com
diferentes “status” de vigilância epidemiológica (1977-2008). Fonte: Rabies
Bulletin Europe.
França
Alemanha
Polônia
Russia
Espanha
Itália
Hungria
Áustria
Turquia
Portugal
Estônia
1977
1668
6738
1287
6
97
736
3058
1205
0
0
1981
2341
7327
449
170
1
367
1002
779
2260
0
13
1986
2465
6830
1087
0
10
29
1264
1387
1266
0
1
1991
2166
3599
2287
1387
8
4
881
2460
428
0
209
1996
20
153
2526
1785
1
1
1357
14
125
0
99
2000
5
192
2211
1239
7
0
514
2
297
0
129
2008
3
1
26
3353
2
9
7
0
301
0
3
63
Figura 8: Mapa da Europa mostrando os 703 casos de raiva em
bovinos nos diferentes países no ano de 2008. Os casos de raiva são
indicados por pontos vermelhos. Fonte: Rabies Bulletin Europe.
Figura 9: Mapa da Europa mostrando os 5106 casos de raiva em
raposas (Vulpes vulpes) nos diferentes países no ano de 2008. Os casos de
raiva são indicados por pontos vermelhos. Fonte: Rabies Bulletin Europe.
64
1.5.4.A raiva na América do Norte
No Canadá, a raiva tem sido um problema persistente desde 1940,
quando surtos de raiva em raposas moveram-se do Sul do Ártico (Alasca)
para as províncias canadenses. A epidemia tornou-se estável na população
de raposas vermelhas (Vulpes vulpes) no Sul de Ontário. A raiva também se
estendeu do sul do Ártico para a população de coiotes (Canis latrans) em
Alberta e se fixou no Sul de Ontário. Poucos anos mais tarde, as províncias
das pradarias foram invadidas por uma epidemia em cangambás (Mephitis
mephitis) (Nadin-Davis, Casey, Wandeler, 1993).
Em 1999, o primeiro caso de raiva causado pela linhagem do RABV
associado a “raccoons” (Procyon lotor) foi diagnosticado em “raccoons” em
Ontário, na divisa com Nova York. No período de 2000 a 2003, 120 casos de
raiva foram diagnosticados nesta espécie animal (Nadin-Davis et al., 1999).
Recentemente e no mesmo país, os casos de animais silvestres com
raiva foram identificados com maior freqüência em cangambás (gêneros
Mephitis, Spilogale e Putorius) (40,6%) e morcegos (35,3%). No Canadá,
morcegos “big brown” (Eptesicus fuscus) é a espécie de morcego mais
comumente diagnosticada, seguindo-se várias espécies de Myotis, “silverhaired bat “ (Lasionycteris noctivagans) e membros do gênero Lasiurus,
especialmente L. cinereus e L. borealis (Nunan et al., 2002).
Poucos casos de raiva ocorrem em cães e gatos, pois são vacinados
periodicamente, mas centenas de casos em herbívoros de criação
(principalmente bovinos) são diagnosticados. Estes casos de raiva são em
sua maioria transmitidos pelos animais silvestres terrestres (Nunan et al.,
2002).
Nos Estados Unidos da América (EUA), atualmente, espécies
silvestres de animais são responsáveis por 93 % dos casos de raiva
diagnosticados neste país, enquanto que espécies domésticas foram
responsáveis por 7%. A maior parte destes casos domésticos ocorre em
bovinos, mas um número significante é diagnosticado em gatos (Krebs,
Wheeling, Childs, 2003).
A maioria dos casos de raiva relatados em animais silvestres nos EUA
ocorre em “raccoons” (Procyon lotor), cangambás (gêneros Mephitis,
Spilogale e Putorius), raposas (gêneros Vulpes, Urocyon e Alopex) e uma
diversidade de espécies de quirópteros, sobretudo insetívoros. Estes são
grupos de animais com distribuição e importância nacionais e são
65
considerados como hospedeiros primários de variantes específicas do RABV
(Krebs et al., 2003).
“Raccoons” e cangambás (skunks) são espécies sinantrópicas que
vêm merecendo destaque na epidemiologia da raiva nos EUA. Desde 1981,
uma epidemia de raiva em “raccoons” espalhou-se pelo leste dos EUA, com
um aumento concomitante da freqüência de raiva em cangambás. A raiva
em “raccoons” afeta todos os Estados costeiros do Leste, em uma área
estimada de um milhão de quilômetros quadrado. Em 2005 foram
diagnosticados mais de seis mil casos nestes animais. Já a raiva em
cangambás afeta uma área de mais de 3,5 milhões de quilômetros
quadrados e mais de mil casos/ano são diagnosticados (Rupprecht, Hanlon,
Hemachudha, 2002; Hanlon, Niezgoda, Rupprecht, 2007).
No Sul do Estado do Texas e em Porto Rico (país associado aos
EUA), coiotes (Canis latrans) e mangustos (Herpestes javanicus),
respectivamente, são espécies silvestres de carnívoros de importância na
manutenção regional da raiva. No Alasca, raposas vermelhas (Vulpes
vulpes) e raposas do ártico (Alopex lagopus) são espécies implicadas na
manutenção do RABV e, em menor grau, nos Estados de Nova York,
Vermont, New Hampshire e Maine (Krebs et al., 2003; Kelly e Sleeman,
2003).
Outros mamíferos carnívoros, ainda que menos encontrados como
positivos para a raiva nos EUA, podem ser fontes de infecção para cães e
gatos e humanos, como, por exemplo, lobos (Canis lupus), linces (Lynx
rufus) e coiotes (Canis latrans) (Kelly e Sleeman, 2003).
A raiva em quirópteros é largamente distribuída nos EUA, com casos
relatados nos 48 Estados contíguos e relacionados a 17,2% de todos os
casos de raiva em animais em 2001. Os morcegos “big brown bat”
(Eptesicus fuscus), foi a espécie mais freqüentemente detectada com o
RABV, com 47,1% dos casos, seguido por Tadarida brasiliensis (28,3%),
Lasiurus cinereus (5,5%), Lasiurus borealis (4,3%), Myotis lucifugus (3,7),
Lasionycteris noctivagans (3%), Myotis yumanenis (1,7%), Pipistrellus
hesperus (1,7%) e Pipistrellus subflavus (1,2%); espécies não identificadas
do gênero Myotis (3.0%) e outras espécies (< 3,5%) foram responsáveis
pelos casos restantes (Rupprecht, Hanlon, Hemachudha, 2002).
Através de análises filogenéticas aliadas à vigilância epidemiológica e
a um eficiente trabalho de zoologia, diversas linhagens do RABV puderam
ser associadas a espécies de animais silvestres e a regiões específicas. Por
exemplo, em relação ao morcego Epitesicus fuscus, há duas linhagens de
RABV exclusivas desta espécie, uma que ocorre em populações do
66
Sudoeste e outra em populações do Leste e do Norte dos EUA. Em
cangambás, são encontradas duas linhagens do RABV, uma associada aos
Estados do Centro-Norte e outra aos Estados do Centro-Sul (Rupprecht,
Hanlon, Hemachudha, 2002).
No México, a raiva humana foi reduzida na ultima década. Em 1960,
foram relatadas 60 mortes humanas envolvendo transmissão por cães,
contrastando com somente um caso em 2003. Essa redução é conseqüência
de um decréscimo significativo de raiva em cães, de 8706 casos em 1990
para 261 casos em 2003, resultado de uma massiva campanha de
vacinação em cães. Quanto aos casos de raiva em animais de criação a
situação é semelhante a do Brasil. Centenas de casos transmitidos pelo D.
rotundus são diagnosticados em bovinos e eqüinos (Mattos et al., 1999).
A raiva no México é caracterizada pelo envolvimento da vida
selvagem que mantém ciclos estáveis de transmissão em áreas geográficas
particulares. A maioria dos casos ocorre em cangambás (gêneros Spilogale
e Conepatus) e raposas (gênero Urocyon). Estes grupos de animais são
considerados hospedeiros primários do RABV. Uma variante antigênica, a
AgV7, foi isolada primeiramente no México de duas raposas cinzas (Urocyon
cineroargenteus), o reservatório natural dessa variante. Essa mesma
variante foi também isolada em linces (Felis rufus) e coiotes (Canis latrans).
Variantes isoladas de linces foram isoladas em raposas cinza do Arizona,
nos EUA, indicando uma ampla distribuição dessa variante (Vellasco-Villa et
al., 2005).
A análise de amostras de morcegos hematófagos D. rotundus mostra
que existem no mínimo duas variantes antigênicas, AgV3 e AgV11, na
população deste animal no México. Em relação aos morcegos frugívoros,
existem duas variantes do RABV, AgV4 e AgV9, estabelecidas na população
de Tadarida brasiliensis mexicana (Vellasco-Villa et al., 2002, 2006).
1.5.5.A raiva na América Central e do Sul
A epidemiologia da raiva nos países da América Latina é muito
semelhante. Segundo a Organização Pan-americana de Saúde/Organização
Mundial de Saúde (SIRVERA, 2009), ainda hoje, o cão é o principal
transmissor da raiva humana, mas pelo aumento do controle da raiva canina
os morcegos hematófagos D. rotundus estão se tornando o principal
transmissor (Scheneider et al., 2009). Além deste fato, D. rotundus é o
principal transmissor da raiva aos herbívoros (silvestres e de interesse
econômico), infectando milhares de animais anualmente.
67
A importância do D. rotundus na América Latina se deve ao fato deste
mamífero ser encontrado somente nesta região, do sul do México ao norte
da Argentina. Como a população de D. rotundus não é passível de uma
campanha de vacinação em massa, apesar de alguns estudos preliminares
se desenvolverem nesta direção (Sétien et al, 1998; Almeida et al., 2008),
esta importância epidemiológica, provavelmente, será mantida.
Atualmente, além do cão e de D. rotundus, um número cada vez
maior de morcegos insetívoros, de várias espécies, são diagnosticados com
raiva (Kotait et al., 2007), porém, atualmente não está totalmente
estabelecida a importância destas espécies na epidemiologia da raiva
humana e animal.
Quanto aos animais silvestres, na América Latina e com exceção dos
morcegos, somente após o atual estágio do controle da raiva canina é que
estão sendo definitivamente estudados (Carnieli et al., 2009).
A seguir são apresentadas e comentadas algumas tabelas obtidas a
partir do endereço eletrônico do Sistema Regional de Vigilância da Raiva
nas Américas (SIRVERA, 2009). Após a apresentação das tabelas é
apresentado um levantamento dos principais trabalhos relacionados aos
estudos das tipificações antigênicas e genéticas de isolados do RABV na
América Latina. Finalizando, dados da epidemiologia da raiva do Brasil e dos
estudos antigênicos e genéticos de isolados do país são também
apresentados.
Na Tabela 5 são apresentados os 517 casos de raiva humana no
continente americano, entre 1999-2008. Em 1999 ocorreram 71 casos e em
2008 quatro casos. Este decréscimo está diretamente ligado ao sucesso no
controle da raiva canina. O maior número de casos observados no Brasil, na
Tabela 5, é ligado a sua extensão territorial, número de habitantes e,
conseqüentemente, maior número de cães. Nos anos de 2004 e 2005, no
Brasil, ocorreram respectivamente 30 e 44 casos e no Peru, em 2007, 24
casos. Praticamente a totalidade destes casos foi transmitida por D.
rotundus em áreas da Região Amazônica, onde alguns agrupamentos
humanos são constantemente agredidos por estes morcegos.
A Tabela 6 apresenta o número de casos de raiva em animais
infectados pelo RABV e diagnosticados laboratorialmente nas Américas, no
período de 1999-2008. Os números referem-se às diferentes regiões
nomeadas pela OPAS/OMS e os países que as compõe estão descritos na
Tabela 7.
68
Tabela 5: Histórico dos últimos 10 anos mostrando o número de casos
de
raiva
humana
por
país
da
América
Latina.
Fonte:
http://sirvera.panaftosa.org.br
1999
2000
2001
2002
2003
2004
2005
2006
2007
2008
Bolívia
10
9
7
2
2
4
9
4
2
...
Colômbia
3
1
0
0
1
14
3
2
3
0
Equador
5
3
3
0
0
0
2
0
0
0
Peru
9
4
2
1
2
8
8
3
24
0
Venezuela
2
1
1
0
2
5
0
1
1
0
Paraguai
4
1
0
5
0
1
0
0
0
0
Brasil
25
26
22
10
17
30
44
9
1
1
El Salvador
0
1
4
6
5
3
1
2
2
1
Guatemala
2
6
1
0
0
0
1
1
1
2
Honduras
0
1
0
0
0
0
0
0
0
...
Nicaragua
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
Panamá
0
0
0
2
0
0
0
0
0
0
México
9
4
7
3
1
0
8
1
4
0
Cuba
0
1
0
0
1
0
0
1
0
0
Haiti
3
1
9
5
3
5
1
11
5
...
Porto Rico
0
0
0
0
1
0
...
...
...
...
Rep. Dominicana
0
0
0
2
1
1
0
1
0
0
Guiana
0
0
1
...
...
0
0
0
...
...
Canadá
0
1
0
0
1
0
0
0
...
...
Estados Unidos
0
5
1
3
2
8
1
3
...
...
´´´´ Sem informação
Tabela 6: Histórico dos últimos 10 anos mostrando os casos de raiva
em animais e sua distribuição. Fonte: http://sirvera.panaftosa.org.br
1999
2000
2001
2002
2003
2004
2005
2006
2007
2008
A. do Norte
7.492
7.949
7.779
8.223
7.414
7.090
6.664
7.169
0
0
Canadá
500
665
441
343
264
254
248
229
0
0
EUA
6.992
7.284
7.338
7.880
7.150
6.836
6.416
6.940
0
0
A. Latina
6.644
6.135
4.880
3.895
4.476
4.384
4.255
3.556
2.748
1.340
Am. Central
406
278
336
273
410
314
248
329
189
131
Área Andina
719
784
854
571
529
846
1.322
1.117
600
154
Brasil
4.059
3.910
2.830
2.233
2.530
2.354
1.638
1.367
1.255
596
Caribe Latino
374
331
299
315
270
240
120
146
157
245
Cone Sul
600
272
257
213
319
184
241
316
259
89
México
486
560
304
290
418
446
686
281
288
125
Caribe
35
88
46
5
1
76
1
0
0
0
Total
14.171
14.172
12.705
12.123
11.891
11.550
10.920
10.725
2.748
1.340
69
É importante comentar que a maioria absoluta dos casos apresentados
na Tabela 6 e relativos à América do Norte refere-se a animais silvestres. Os
números de casos apresentados pelo Brasil e México, em sua maioria
absoluta, são casos de cães infectados. Neste ponto é necessário alertar
que os dados contabilizados pela OPS/OMS e relativos à América Latina
possuem sub-notificações e, em relação a alguns países, são altas
(SIRVERA, 2009).
A Tabela 7 apresenta os casos de bovinos com raiva, diagnosticados e
notificados. Como esperado, estes animais são os mais acometidos pela
raiva devido ao seu maior número e, conseqüentemente, exposição ao
ataque de D. rotundus, com exceção da América do Norte.
Tabela 7: Histórico dos últimos 10 anos mostrando os casos de raiva
em bovinos. Fonte: http://sirvera.panaftosa.org.br.
1999
2000
2001
2002
2003
2004
2005
2006
2007
2008
América Latina
3225
3327
2322
1869
2465
2591
2012
1689
1549
727
Área Andina
140
169
197
251
247
249
255
294
270
125
Bolívia
41
36
35
59
80
55
44
60
26
...
Colômbia
0
22
54
47
63
65
82
95
84
82
Equador
20
14
22
16
7
10
17
5
22
21
Peru
49
97
86
110
86
102
106
127
120
4
Venezuela
30
0
0
19
11
17
6
7
18
18
Cone Sul
126
129
136
92
66
68
89
192
153
40
Argentina
31
32
25
13
3
12
10
136
51
...
Chile
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
Paraguai
95
97
111
79
63
56
79
56
76
14
Uruguai
0
0
0
0
0
0
0
0
26
26
Brasil
2628
2660
1759
1321
1816
1863
1127
961
864
433
América Central
209
79
72
41
49
37
52
58
33
30
Belice
6
0
1
...
2
6
6
1
...
...
Costa Rica
2
0
2
...
4
6
5
2
1
0
El Salvador
5
7
13
19
5
21
29
34
18
3
Guatemala
3
7
3
11
10
0
7
5
11
15
Honduras
6
3
9
0
0
1
1
0
0
...
Nicarágua
3
2
3
2
1
1
0
6
0
0
Panamá
184
60
41
9
27
2
4
10
3
12
México
108
271
148
154
275
363
479
181
227
94
Caribe Latino
14
19
10
10
12
11
10
3
2
5
Cuba
7
14
5
6
9
5
5
1
1
3
Haití
1
1
0
0
0
0
0
0
0
...
Porto Rico
0
1
2
1
0
2
...
...
...
...
República Dominicana
6
3
3
3
3
4
5
2
1
2
Caribe
34
88
46
5
1
76
1
0
0
0
Anguila
0
...
...
...
0
0
...
...
...
...
Antigua e Barbuda
0
...
...
...
0
0
...
...
...
...
Antilhas Holandesas
0
...
...
...
...
0
0
0
...
...
Aruba
0
...
0
...
...
0
0
0
...
...
70
Bahamas
...
...
...
...
0
...
...
...
...
...
Barbados
...
...
...
...
0
0
0
...
...
...
Dominica
...
...
...
...
0
0
0
...
...
...
Granada
...
...
...
...
0
0
0
0
...
...
Guadalupe
...
...
...
...
...
...
...
...
...
...
Guiana
30
49
45
...
...
76
0
0
...
...
Guiana Francesa
...
...
...
...
...
...
...
...
...
...
Ilhas Caiman
...
0
...
...
...
...
...
...
...
...
Ilhas Turks e Caicos
...
...
...
...
...
...
...
...
...
...
Ilhas Virgens
...
...
...
...
...
...
...
...
...
...
Jamaica
...
0
...
0
0
0
0
...
...
...
Martinica
...
...
...
...
...
...
...
...
...
...
Montserrat
0
...
...
...
0
0
0
...
...
...
Santa Lucia
...
...
...
...
0
0
0
...
...
...
S.Vicente e Granadinas
...
...
...
...
0
0
0
...
...
St. Kitts e Nevis
...
...
...
...
0
0
0
...
...
...
Suriname
...
15
0
5
0
0
0
0
...
...
Trinidad e Tobago
4
24
1
0
1
0
1
0
...
...
América do Norte
174
118
102
127
108
130
109
108
0
0
Bermuda
...
...
...
...
...
...
...
...
...
...
...
Canadá
39
36
22
12
10
15
16
26
...
Estados Unidos
135
82
80
115
98
115
93
82
...
...
Total
3433
3533
2470
2001
2574
2797
2122
1797
1549
727
Figura 10: Gráfico de distribuição de casos de raiva nas Américas,
2006. Fonte: http://sirvera.panaftosa.org.br.
A Figura 10 mostra graficamente a distribuição da raiva nas diferentes
regiões e relativos aos diferentes grupos de animais (silvestres, ADIE= de
importância econômica e de companhia) e resume o escrito anteriormente.
Este gráfico se refere aos dados de 2006, isto porque os dados relativos ao
ano de 2008 da América do Norte não foram disponibilizados para a
OPAS/OIE. Porém, comparando os gráficos de distribuição dos anos de
71
2006 e 2008 (não apresentado) é observado uma variação mínima no
aumento de casos de silvestres e um menor número de casos em animais
de companhia.
1.5.5.1.As variantes antigênicas e genéticas do RABV na América
Latina espanhola
Para dar inicio a esta seção é necessário esclarecer que, apesar do
termo “variante” ser utilizado indistintamente por vários autores para
tipificação antigênica e genética, aqui será utilizado o termo “variante”
exclusivamente para tipificação antigênica, enquanto que para tipificação
genética será usado o termo “linhagem”, que melhor caracteriza os
agrupamentos genéticos do RABV de uma mesma variante antigênica
(AgV), como expresso em Velasco-Villa et al. (2008).
Antes de se fazer uma análise das tipificações antigênicas e genéticas
realizadas na América Latina, também é necessário informar que as
tipificações antigênicas realizadas nas Américas se baseiam em um painel
de anticorpos monoclonais produzido pelo Center of Disease Control (CDC)
e distribuído pela OPAS/OMS. Quanto à tipificação genética, infelizmente,
não há regras seguidas pelos pesquisadores do RABV. O número de
nucleotídeos seqüenciados pode variar de uma centena a mais de um milhar
e, também, as áreas seqüenciadas são muito variáveis. Uma única
característica destes seqüenciamentos é que, felizmente, grande parte deles
utiliza como alvo o gene N do RABV.
Na Colômbia, a caracterização genética determinou oito linhagens, três
delas são associadas a cães e pertencem a variante antigênica AgV1. Outra
linhagem genética é composta pelas variantes antigênicas AgV3, associada
a D. rotundus. Duas linhagens genéticas são associadas a AgV4, típica do
morcego insetívoro colonial Tadarida brasiliensis. Duas outras linhagens
genéticas, composta por morcegos insetívoros solitários, não puderam ser
tipificadas pelo painel de MAbs distribuído pela OPAS/OMS, fato comum
entre morcegos insetívoros (Paez et al., 2007). Em relação aos canídeos
silvestres na Colômbia, Paez et al. (2005) tipificaram geneticamente e
antigenicamente raposas cinzas (Urocyon cinereoargentatus) como AgV2,
típica de cão.
Na Bolívia, a tipificação genética e antigênica do RABV identificou
quatro variantes antigênicas: AgV1 e 2, típicas de cão, e AgV3 e 5, típicas de
D. rotundus. A identificação genética foi concordante com a antigênica,
72
demonstrando haver três agrupamentos genéticos do RABV no país (Favi et
al., 2003).
No Chile, de Mattos et al. (2000), caracterizaram o morcego insetívoro
Tadarida brasiliensis como o hospedeiro do RABV mais importante na
epidemiologia da raiva no país. Em 1996, no mesmo país, ocorreu um caso
de raiva em humano, fato que não ocorria desde 1972. A análise desta
amostra humana caracterizou o RABV isolado como linhagem genética e
variante antigênica AgV4, de T. brasiliensis (Favi et al., 2002). Yung, Favi,
Fernándes (2002) tipificaram geneticamente e antigenicamente isolados do
RABV e identificaram as variantes AgV3 (D. rotundus), AgV4 (T. brasiliensis)
e AgV6, típica do morcego insetívoro Lasiurus cinereus. Neste estudo, as
tipificações genéticas e antigênicas foram concordantes. Recentemente,
Favi et al, (2008) fizeram um estudo retrospectivo com isolados do RABV,
também no Chile, e identificaram as variantes antigênicas AgV1, AgV3,
AgV4 e AgV6. Além de reconfirmarem a importância de T. brasiliensis na
epidemiologia da raiva no Chile também reconfirmaram que alguns isolados
não puderam ser tipificados com o painel de MAbs distribuído pela
OPAS/OMS.
Na Venezuela, de Mattos et al. (1996) identificaram antigenicamente as
variantes AgV1, 3 e 5. A tipificação genética destas variantes foi concordante
com as genéticas.
Delpietro et al. (1997), na Argentina, tipificaram isolados do RABV e
descreveram três variantes antigênicas, AgV2, 3 e 4, além de outras não
determinadas e pertencentes a morcegos insetívoros. No mesmo, país
Cisterna et al. (2005) tipificaram genética e antigenicamente isolados do
vírus e identificaram as variantes antigênicas AgV 2, 3, 4 e 6, concordantes
com a tipificação genética.
Finalizando o estudo das tipificações genéticas e antigênicas na
América Latina (com exceção do Brasil), é necessário escrever sobre a
variante do RABV isolada em mangustos (Herpestes auropunctatus),
encontrados em várias ilhas do Caribe, como por exemplo, Cuba e
República Dominicana. Estes animais foram importados da Índia, no início
do século XX, para o combate de cobras peçonhentas encontradas em
grande número nos canaviais destas ilhas. Além de causar sérios distúrbios
ambientais, devido à falta de predadores naturais, a população de
mangustos cresceu demasiadamente e mostrou ser altamente susceptível
ao RABV e, com o tempo, iniciou uma epidemia de raiva, com uma variante
típica, provavelmente, originada de “raccons”. Hoje, os mangustos são os
73
transmissores do RABV mais importante desta região americana (Blanton et
al., 2006).
1.5.6.A raiva no Brasil
Em 2004, o Brasil gastou US$28 milhões (dólares americanos) na
prevenção da raiva (Childs e Real, 2007). Este valor se refere aos gastos
com vacinas para humanos e cães e gatos, imunoglobulinas, diagnósticos
laboratoriais, treinamento de pessoal envolvido com a campanha anual de
vacinação de cães e gatos, médicos e veterinários.
A seguir, são apresentadas e comentadas algumas imagens e tabelas
da Secretaria de Vigilância em Saúde, do Ministério da Saúde do Brasil
(SVS/MS), que resumem a situação da raiva no Brasil. Posteriormente, são
apresentados dados relativos aos estudos antigênicos e genéticos dos
principais vetores e hospedeiros do RABV do Brasil.
Figura 11: Casos de raiva em cães no Brasil no ano de 2008. Fonte:
SVS/MS.
74
Figura 12: Casos de raiva em bovinos no Brasil no ano de 2008. Fonte:
SVS/MS.
Figura 13: Casos de raiva em equinos no Brasil no ano de 2008. Fonte:
SVS/MS.
Analisando a Figura 11 é observado que a raiva canina, hoje, é um
problema das Regiões Norte e Nordeste do Brasil, onde as campanhas
anuais de vacinação de cães e gatos não atingiram uma situação
75
satisfatória. O foco no Estado do Mato Grosso do Sul é de origem boliviana.
É importante salientar que as campanhas anuais de vacinação de cães e
gatos na Região Sul do Brasil, a partir da década de 1990, por decisões de
autoridades estaduais, não é realizada. Schneider et al. (1996), analisando
os casos de raiva canina no Brasil e no período 1980-1990, citam um
decréscimo de 90% de casos, determinados pela vacinação anual de cães e
gatos que, naquela década, atingiu mais de nove milhões de animais/ano.
Em 2007, a mesma campanha, que teve uma cobertura vacinal de 94% da
população estimada de cães e gatos, vacinou 23.256.155 de cães e gatos
(SVS/MS).
O decréscimo da raiva canina é uma grande conquista e para que se
possa compreender o fato alguns trabalhos são citados. da Silva et al.
(2004), analisaram 1984 amostras de cães do Noroeste do Estado de São
Paulo, no período 1993-1997, sendo que 351 foram diagnosticados
positivamente. Queiroz et al. (2009), descreveram a situação da raiva no
período de 1993-2007, também na região Noroeste do Estado de São Paulo,
onde foram diagnosticadas 10579 amostras de animais provenientes de 42
municípios. Do total, 4,9% (518) foram positivas para a raiva, assim
distribuídas: 67% cães (346), 16% bovinos (84) e 9% morcegos (50). Para
que se possa ter uma idéia da dimensão da campanha anual de vacinação
contra a raiva de cães e gatos do Brasil, a análise dos números publicados
por Andrade et al. (2008) também é esclarecedora. Os autores estimaram a
população canina na região de Araçatuba, no Noroeste do Estado de São
Paulo, para cada 10 habitantes, em 1,7 (ano de 1994); 2,0 (ano de 1999) e
1,8 (ano de 2004).
Da análise das Figuras 12 e 13 (Casos de raiva em bovinos no Brasil
no ano de 2008 e Casos de raiva em equinos no Brasil no ano de 2008) fica
nítido que a raiva em animais de importância econômica, transmitida pelo D.
rotundus, é disseminado por todo o Brasil. O pequeno número de casos na
Região Norte do país é diretamente relacionado à vigilância epidemiológica
nesta região, ainda de difícil acesso e baixa densidade demográfica.
A Figura 14, que mostra os Casos de raiva em humanos e animais no
Brasil, no ano de 2008, reafirma o escrito anteriormente, porém são
necessários dois comentários. O maior número de casos de raiva em
morcegos não-hematófagos, no Estado de São Paulo, se deve a vigilância
epidemiológica ativa em relação a estes animais no Estado. Quanto aos
casos de raiva em primatas e canídeos silvestres, exclusivamente na Região
Nordeste, será discutido em maiores detalhes no tópico relativo as
tipificações antigênicas e genéticas do RABV no Brasil.
76
77
78
79
Em relação aos casos de raiva em morcegos não-hematófagos no
Estado de São Paulo, três trabalhos citam dados que demonstram o
conhecimeto epidemiológico atual. Albas et al. (2005) descreveram o
diagnóstico do RABV efetuado em 4950 amostras animais, entre 1996 e
2003, na região oeste do Estado de São Paulo e, do total, 74 foram
positivas, 58 destas amostras (78.4%) são de morcegos não hematófagos e
16 (21.6%) de bovinos, animal costumeiramente infectado pelo D. rotundus.
Scheffer et al. (2007), que identificaram morfologicamente as espécies de
animais infectados pelo RABV, descreveram o resultado do diagnóstico de
4395 amostras de morcegos, no período de abril de 2002 a novembro de
2003, de diversas regiões do mesmo Estado, e a positividade alcançou 1,9%
(84 casos). Deste valor, não houve a descrição de casos em D. rotundus,
apesar de 10 Gêneros de morcegos serem descritos, predominantemente
insetívoros. Cunha et al. (2006), entre 1997 e 2002, diagnosticaram para a
raiva 7393 morcegos do norte e noroeste do Estado de São Paulo. Entre
todos, 1,3% foram positivos para a raiva, que também foram identificados
morfologicamente, constatando que os animais eram predominantemente
insetívoros, mas alguns frugívoros também o foram.
A análise da Figura 15 (Série histórica de casos de raiva em humanos
por Estado no Brasil, 1986-2008) permite que se afirme que, ano após ano,
a situação da raiva no Brasil tem melhorado. Quanto aos anos de 2004 e
2005, quando houve um aumento surpreendente nos casos de raiva
humana, é necessário esclerecer que os casos ocorreram em áreas da
Amazônia, nos Estados do Pará e Maranhão e foram transmitidos por D.
rotundus. Este tipo de surto, que ocorre esporádicamente, é basicamente
relacionado a deficiência dos serviços de saúde locais e fatores sócioculturais.
A Figura 16, que mostra a Série histórica de animais transmissores de
raiva humana no Brasil, 1986-2007, complementa a Tabela 15, comentada
anteriormente. Contudo, é notável o decréscimo no número de casos
relacionados a cães e gatos e aos casos onde o transmissor foi
indeterminado (ignorado). O decréscimo no números de “ignorados” se deve
basicamente a melhora da vigilância epidemiológica e a disponibilidade de
métodos moleculares para a identificação do vírus.
Para complementar a análise é apresentada a Tabela 8, que mostra o
número de casos de raiva por espécie no Brasil no ano de 2009 (dados
parciais até 23 de julho).
80
Para finalizar este tópico, sobre a epidemiologia da raiva no Brasil, é
fundamental citar alguns dados da Secretaria de Vigilância em Saúde, do
Ministério da Saúde do Brasil (SVS/MS).
Em 1998 foram diagnosticados 1746 casos em cães e em 2006, 67
casos. Esta redução é produto do Programa Nacional para o Controle da
Raiva em Cães e gatos. Entre 1986 e 2006, um total de 758 casos de raiva
humana foi diagnosticado. Os cães foram responsáveis por 524 destes
casos (69.1%), gatos por 30 (4%), morcegos por 130 (17.1%), primatas nãohumanos por 14 (1.9%) e canídeos silvestres por 13 (1.7%).
A efetiva vigilância epidemiológica relacionada a animais silvestres
aumentou por volta do ano de 2000, e hoje, se encontra em ascensão (Kotait
et al., 2007). Utilizando dados da Secretaria de Vigilância em Saúde do
Ministério da Saúde do Brasil (SVS/MS) é possível comprovar a plenitude da
vigilância epidemiológica dirigida aos animais silvestres. O número de
ataques de animais silvestres a humanos notificados em 1999 e 2005 foram,
respectivamente, 35 e 16334. Nos mesmos anos os morcegos foram
responsáveis, respectivamente, por 29 e 11811 ataques, primatas nãohumanos por 05 e 3360 e canídeos silvestres e outras espécies de menor
importância epidemiológica, como gambás e guaxinins, 01 e 1163 ataques,
respectivamente. É importante salientar que associada à vigilância
epidemiológica o esforço governamental direcionado a educação foi de
grande importância.
Tabela 8: Número de casos de raiva por espécie no Brasil no ano de
2009. Dados parciais até 23 de julho. Fonte: SVS/MS.
Espécie
Número de casos
Cão
Gato
Bovino
Eqüino
Morcego hematófago
Morcego não-hematófago
Primata não humano
Canídeos silvestres
Outros animais
Humano
Total no Brasil
6
1
362
40
12
61
0
5
9
1
497
81
1.5.6.1.As variantes antigênicas e linhagens genéticas do RABV no
Brasil
A primeira tipificação antigênica do RABV no Brasil foi publicada em
2001 (Favoretto et al., 2001) e é a única tipificação antigênica e genética de
isolados do RABV de primatas no mundo. Supõe-se que o reservatório desta
linhagem do RABV é o sagüi de tufo branco (Callithrix jacchus). Apesar de
poucos casos conhecidos e relatados, os isolados são todos da região
Nordeste do país, a maioria deles do Estado do Ceará. Esta variante
antigênica não possui relação com outros reservatórios e não havia sido
prevista durante a produção do painel de MAbs distribuído pela OPAS e, por
isto, não possui, ainda hoje, uma nomenclatura oficial estabelecida.
Favoretto et al., (2002) tipificaram 330 isolados do vírus de várias
espécies e foram estabelecidas as quatro variantes antigênicas circulantes
no Brasil: AgV2 (cão), AgV3 (D. rotundus), AgV4 (Tadarida brasiliensis) e
AgV6 (Lasiurus cinereus). Além destas quatro variantes, outra variante
antigênica, AgV5 (morcego hematófago da Venezuela), também foi
identificada, porém não é comumente encontrada no país. Além das quatro
variantes acima mencionadas, outros seis perfis antigênicos não
determinados foram descritos. Os herbívoros de interesse econômico
(bovinos, eqüinos, ovinos, etc.), foram tipificados como AgV3.
No oeste do Estado de São Paulo, foram tipificados antigenicamente
isolados do RABV de morcegos não hematófagos e foram detectadas,
circulando na população dos animais as variantes antigênicas AgV3 e AgV4,
típicas de D. rotundus e T. brasilensis, respectivamente (Albas et al., 2009).
Em Portel e Viseu, cidades do Estado do Pará, 21 pessoas morreram
de raiva em 2004. As amostras isoladas em humanos, coletadas após o
falecimento das vítimas, foram tipificadas antigenicamente e geneticamente
como AgV3, típica de D. rotundus (da Rosa et al., 2006).
Schaefer et al. (2005), utilizando um painel de MAbs produzidos no
Estado do Rio Grande do Sul e, portanto, não aquele distribuído pela OPAS
e regularmente utilizado nas Américas, tipificaram antigenicamente isolados
do RABV de várias espécies animais de várias regiões do Brasil. Os autores
descreveram dois agrupamentos principais, cães e D. rotundus, que foi
concordante com a tipificação genética também descrita no trabalho. Ao
analisar os morcegos insetívoros os autores descreveram “espécieespecificidade”, pois houve a formação de agrupamentos por espécie.
A caracterização genética do RABV no Brasil e em todos os outros
países, se faz, principalmente, pelo seqüenciamento do gene N, mas um
82
número expressivo de trabalhos analisaram o gene G e, secundariamente, a
região intergênica G-L. Quanto ao tamanho das seqüências geradas é
variável, alguns autores utilizam os genes inteiros, outros, pequenas regiões,
tanto da região amino-terminal como, também, da carboxi-terminal.
O primeiro trabalho publicado relacionado à tipificação genética do
RABV no Brasil foi o de Ito et al. (2001), onde os autores seqüenciaram 203
nt do gene N e determinaram as duas principais linhagens do vírus no país,
cães e D. rotundus. Os autores também descreveram que a identidade
genética dos isolados de cães utilizados no trabalho foi maior que 99%,
enquanto que em D. rotundus maior que 96,6%. A partir deste trabalho
pioneiro, a caracterização genética do RABV mostrou a real diversidade do
vírus no país e outros se seguiram, mas uma clara dicotomia foi
estabelecida, o estudo genético do RABV isolado em canídeos e em
morcegos, com exceção ao de Favoretto et al. (2001), discutido durante as
citações relacionadas as tipificações antigênicas, no qual os autores
descrevem o RABV isolado do primata sagüi de tufo branco (Callithrix
jacchus).
Quanto aos canídeos, os trabalhos de Carnieli et al. (2006, 2008,
2009), que estudaram toda a região codante dos genes N e G e parte da
região intergênica G-L do RABV, estabeleceram um novo biotipo
(reservatório) da raiva na região Nordeste do Brasil, o cachorro do mato
Cerdocyon thous. Os autores identificaram linhagens regionais do vírus que
circulam em C. thous e em cães e identificaram geneticamente o hospedeiro
pela análise de DNA mitocondrial. Além do citado anteriormente, os autores
sugeriram que as linhagens do RABV circulam entre C. thous e cães,
podendo ser transmitidas entre os dois animais sem perder suas identidades
genéticas, pois mantém as assinaturas genéticas (marcadores genéticos)
das linhagens do vírus, que são específicas para as duas espécies de
canídeos.
No mesmo contexto, os trabalhos de Bernardi et al. (2005), Sato et al.
(2006) e Kobayashi et al. (2007), que estudaram geneticamente o RABV de
várias espécies de animais das regiões Norte e Nordeste do Brasil, também
estudaram canídeos silvestres do Estado da Paraíba, porém os identificaram
como Pseudalopex vetulus (raposinha do campo).
Schaefer et al. (2005) e Favoretto et al. (2006), que também estudaram
geneticamente o RABV isolado de várias espécies de animais, citam o
canídeo silvestre C. thous como aquele encontrado na região Nordeste do
Brasil.
83
Dos trabalhos citados nos dois parágrafos anteriores e relacionados a
canídeos, suas análises de maneira global indicam que o RABV isolado de
canídeos possui uma identidade média divergente das linhagens de D.
rotundus, calculada em 10%. Porém, entre as linhagens do RABV isoladas
de canídeos há uma evidente regionalização. No caso dos cães, esta
divergência, provavelmente, é determinada pelo deslocamento humano e
seus cães e gatos (Carnieli et al., 2008).
A tipificação genética do RABV isolado de morcegos iniciada por Ito et
al. (2001) se diversificou para outras espécies de quirópteros, além do D.
rotundus. Kobayashi et al. (2005), analisando amostras do RABV isoladas de
espécies frugívoras, insetívoras e de D. rotundus, relataram linhagens
associadas a morcegos Artibeus spp (frugívoro), D. rotundus e morcegos
insetívoros, sugerindo haver linhagens espécies-específicas. Kobayashi et
al. (2007), continuando a pesquisa anterior, obteve uma linhagem associada
aos morcegos insetívoros do Gênero Lasiurus. Oliveira (2009), em estudo
com diferentes espécies de morcegos, relatou diferentes linhagens do RABV
associadas a diferentes espécies de morcegos insetívoros, sugerindo haver,
linhagens espécies-específicas e Gênero-específicas.
O estudo das linhagens do RABV que infectam os animais de interesse
econômico são, em sua maioria absoluta, transmitidas pelo D. rotundus.
Apesar do grande número de animais de interesse econômico infectados
pelo RABV ser diagnosticado é pequeno o número de D. rotundus
encontrados infectados. Por este motivo o estudo das linhagens do RABV
que circulam entre estes morcegos são estudadas indiretamente, isto é, pelo
uso de isolados do vírus de bovinos e eqüinos.
Romijn et al. (2003), analisando parcialmente o gene N do RABV
isolados de bovinos no Estado do Rio de Janeiro, obteve agrupamentos
regionais do vírus. Bordignon et al. (2005), no Estado de Santa Catarina e
também analisando parcialmente o gene N do RABV, obteve um
agrupamento de linhagens típicas do Estado de Santa Catarina. Sato et al.
(2006), analisando 599 nt do gene G de isolados do RABV de várias
espécies dos Estados do Maranhão, Pará e Tocantins, identificaram
linhagens do vírus associadas a canídeos e D.rotundus. Kobayashi et al.
(2006), analisando parcialmente o gene N do RABV isolados de bovinos, de
vários Estados das regiões Sudeste e Centro-Oeste, sugerem a existência
de linhagens regionais formadas pelo isolamento geográfico determinado por
montanhas e rios. Kobayashi et al. (2008), continuando o trabalho anterior,
agora com 593 isolados do RABV de um maior número de Estados e
seqüenciando 202 nt do gene N, descreveram 24 linhagens regionais do
vírus, originadas por isolamento geográfico.
84
1.5.7.O Desmodus rotundus e a raiva em bovinos
A raiva bovina é um problema econômico e de saúde pública e
veterinária. Germano et al. (1992), associa o aumento populacional de
bovinos, ao longo da história, com o aumento da população do transmissor
do RABV para esta espécie, o morcego hematófago Desmodus rotundus
(Figura 17). Sendo assim, o estudo deste morcego é de fundamental
importância para a compreensão da raiva em bovinos e, também, em outros
herbívoros da América Latina.
Carini (1911) foi o primeiro a associar a raiva em herbívoros aos
morcegos, pesquisando a morte de, aproximadamente, 5000 animais no
Estado de Santa Catarina. Além deste fato, é importante salientar que Carini
foi o primeiro a associar a raiva a morcegos e, por isto foi severamente
combatido em sua época. Carneiro e Freitas Lima (1927) descreveram a
mesma situação no Estado do Paraná, mas a aceitação de que os morcegos
são também transmissores da raiva somente ocorreu na década de 1930
com a publicação de estudos semelhantes aos de Carini, na Ilha de Trinidad
(Pawan, 1936).
1.5.7.1.A biologia do Desmodus rotundus
D. rotundus é um quiróptero excepcionalmente ágil e furtivo na
natureza e é considerado um dos morcegos mais evoluídos em relação ao
Sistema Nervoso (Bhatnagar, 2007).
A Ordem Chiroptera é dividida em duas subordens, Megachiroptera e
Microchiroptera. Entre os microquirópteros existem 17 famílias e, no Brasil,
existem nove famílias desta subordem. Os morcegos hematófagos, como o
D. rotundus, pertencem à família Phyllostomidae, subfamília Desmodontinae
da subordem Microchiroptera (Reis et al., 2007).
A subfamília Desmodontinae é composta por três espécies e possuem
o hábito alimentar hematófago (Gardner, 1977) Entre as três espécies de
hábito hematófago D. rotundus é a espécie de maior ocorrência e é muito
estudada por ser associada à transmissão do RABV aos herbívoros na
América Latina. Esta espécie alimenta-se preferencialmente de sangue de
mamíferos (Taddei, 1983). Diphylla ecaudata é considerada a segunda
espécie em importância, seguida por Diaemus youngi, e ambas possuem
preferência por sangue de aves (Uieda, 1992).
85
Figura 17: Imagens de diferentes fenótipos de Desmodus rotundus. As
duas imagens superiores mostram a pelagem castanha, comum e, abaixo,
alaranjada e albina, raras. Fotos: W. Uieda.
Como todas as espécies da subfamília Desmodontinae, D.rotundus não
possui cauda, apresenta redução do apêndice nasal e da dentição, com
incisivos e caninos extremamente afiados (Greenhall, 1988). Sua coloração,
geralmente, é pardo-ferruginoso na parte dorsal do corpo e cinza claro na
parte ventral. O comprimento total varia de 69 a 90 mm; antebraço de 52 a
63 mm. Seu peso varia entre 25 e 40 gramas, sendo que as fêmeas são
maiores que os machos (Greenhall, Joermann, Schmidt, 1983).
D. rotundus ocorrem desde Sonora, Nuevo León e Tamaulipas, no
México, Ilha Margarita, na Venezuela, Trinidad, Bolívia, norte do Chile,
Brasil, Paraguai, Uruguai até o norte da Argentina (Peracchi et al., 2006).
Esta espécie não tolera climas frios, não ocorrendo em locais que possuam
temperatura média inferior a 10ºC no mês mais frio do ano (Greenhall,
Joermann, Schmidt, 1983).
D. rotundus não hibernam, porém o consumo alimentar e a atividade
muscular aumentam quando ficam expostos a baixas temperaturas (Wimsatt
e Guerriere, 1962). Estes morcegos têm capacidade termo regulatória
imprevisível, quando a temperatura ambiental diminui, a temperatura
corporal é normalmente mantida entre 33 e 37ºC pelo aumento da atividade
motora. Se a temperatura corporal chegar a 20ºC os D. rotundus não são
capazes de se aquecerem novamente (Wimsatt e Guerriere, 1962). São
86
também muito sensíveis a altas temperaturas, pois quando expostos entre
37 e 38ºC podem morrer (Greenhall, Joermann, Schmidt, 1983).
D. rotundus são noctívagos, normalmente se abrigam em refúgios
escuros e úmidos (Taddei, 1983), vivem em colônias com aproximadamente
10 a 200 indivíduos, refugiando-se em locais de difícil acesso; utilizam
muitos tipos de abrigos e podem dividir esse espaço com outras espécies de
morcegos (Arellano-Sota, 1988; Greenhall, Joermann, Schmidt, 1983). Suas
colônias geralmente são pequenas, porém já foram registradas
aglomerações com até 2000 morcegos (Wilkinson, 1988). As colônias,
geralmente, ocorrem em regiões de serra com muitas cavernas, onde o
serviço de vigilância e controle da agricultura tem dificuldade de acesso aos
seus abrigos (Uieda, 1996).
Os abrigos são muito importantes para esses animais, pois são locais
onde passam a maior parte do seu ciclo de vida. Nesses locais ocorre
repouso, interações sociais e reprodutivas, de proteção contra predadores e
más condições ambientais, como chuva e vento (Uieda, 1996).
Há uma grande variedade de tipos de abrigos que são utilizados pelo
D. rotundus. Originalmente são encontrados, principalmente, em cavernas,
matacões (afloramento de grandes pedras), oco de árvores, entre outros de
origem natural. Todavia, abrigos artificiais como túneis, bueiros, casas
abandonadas, cisternas, minas abandonadas, entre outros, podem
perfeitamente albergar colônias (Gonçalves et al., 1996) (Figuras 18 e 19).
Como comumente encontrado em mamíferos gregários, os D. rotundus
apresentam uma estrutura social caracterizada por hierarquia de
dominância, baseada na formação de um harém, onde um macho dominante
protege um grupo de fêmeas e seus filhotes. O macho dominante fica no alto
do abrigo, rodeado pelas fêmeas, e os outros machos ficam em localizações
periféricas na própria colônia ou são expulsos dos abrigos quando atingem a
idade entre 12 e 18 meses. Os filhotes machos e solteiros podem
permanecer próximos do harém à espera de uma oportunidade para
ocuparem o posto de dominância ou sair à procura de outros locais para
constituir o seu próprio harém ou, ainda, formar agrupamentos de machos,
geralmente a uma distância mínima de 3 km daquela de onde nasceram
(Wilkinson, 1988; Bredt et al., 1998).
O tempo de gestação da espécie é de sete meses e os nascimentos,
em geral, estão concentrados na estação chuvosa (Lord, 1992). As fêmeas
possuem maior fidelidade aos abrigos e aos membros da colônia as quais
pertencem (Gomes, Uieda, Latorre, 2005). Tal fidelidade pode ser
exemplificada pelos comportamentos de limpeza mútua e regurgitação
87
recíproca de alimento entre as fêmeas e entre mães e filhotes (Wilkinson,
1988).
O macho dominante, além de possuir maior acesso às fêmeas, também
se alimenta em localidades mais próximas do abrigo, já os machos
periféricos percorrem grandes distâncias para se alimentarem, podendo
desta forma sobrepor a sua área de alimentação com as de outras colônias
(Wilkinson, 1988).
Os morcegos hematófagos, normalmente, se alimentam em uma área
de 5 a 8 km ao redor dos abrigos diurnos (Crespo et. al., 1961). Em
condições ambientais favoráveis, sua atividade alimentar pode se iniciar por
volta de uma a duas horas após o pôr-do-sol e terminar por volta de uma
hora antes do alvorecer (Uieda, 1992). No verão, contudo, foi verificado que
os morcegos deixam os abrigos após as 21 horas e no inverno após as 22
horas (Villa, 1966). Isto confirma que estes morcegos só saem para se
alimentar quando a escuridão é completa, podendo fazer um vôo preliminar
para checar a luz da lua (Crespo et. al., 1961).
Comportamentos agonísticos, inserção de novos indivíduos nas
colônias, limpeza mútua, troca de regurgitado, deslocamentos dos indivíduos
entre abrigos e reorganização de colônias podem ser considerados, entre
outros eventos, como a base da transmissão e da dinâmica da raiva entre
morcegos que, certamente, reflete na dinâmica da enfermidade em bovinos
(Lord, 1992; Gomes, Uieda, Latorre, 2005).
Geralmente, um conjunto de colônias é composto por uma colônia
principal, na qual está o maior número de indivíduos, e ao seu redor há as
denominadas colônias satélites e/ou agrupamentos de machos que ainda
não formaram seu harém (Wilkinson, 1988). Os morcegos desse conjunto de
abrigos/colônias transitam entre si segundo seus comportamentos de
interação, possibilitando que o RABV seja transmitido de forma intraespecífica e, conseqüentemente, aos bovinos atacados por morcegos
infectados (Wilkinson, 1988). Outros motivos podem incrementar o
deslocamento de morcegos entre abrigos, como a divisão do clima em
épocas chuvosas e secas, a inundação de abrigos e seca extrema (Taddei
et al., 1991). Segundo Flores-Crespo e Arellano-Sota (1991), a espécie D.
rotundus usualmente utiliza um território de ação de aproximadamente 10 a
20 km2.
88
Figura 18: Imagens de abrigos artificiais de Desmodus rotundus.
Fotos: J.J. Ferrari.
89
Figura 19: Imagens de abrigo artificial (mina abandonada) de
Desmodus rotundus e outros morcegos. Foto: J.J. Ferrari.
Estudos da atividade de morcegos hematófagos em currais indicam
que o período no qual os morcegos se alimentam, está relacionado à
ausência de luar (Crespo et. al., 1972).
Antes de se alimentar, D. rotundus faz um “vôo de reconhecimento” ao
redor do animal em locais abertos (Greenhall, Schmidit, López-Forment,
1971). Acredita-se que esses vôos sejam um comportamento de
ambientação, no qual os morcegos examinam e escolhem suas presas
(Sazima, 1978).
A aproximação do D. rotundus às suas presas pode ser feita de duas
maneiras: pouso direto no corpo da presa ou pelo chão (Uieda, 1996). A
reação dos animais à aproximação dos morcegos geralmente ocorre quando
estes pousam em seu corpo, movimentando a cabeça, cauda e a
musculatura da pele (Greenhall, Schmidit, López-Forment, 1971). Durante a
aproximação da presa, os D. rotundus ficam cautelosos a qualquer reação
da vítima. A qualquer sinal de perigo ele se afasta do local até que o perigo
cesse ou abandona este animal e sai à procura de outra presa mais
acessível (Uieda, 1996). Após a aproximação, os morcegos escolhem um
local apropriado para morder sua presa (Figuras 20 e 21). D. rotundus pode
gastar cerca de 40 minutos para escolher um local no corpo para morder
(Greenhall, 1972).
90
Figura 20: Cavalo sendo atacado pelo Desmodus rotundus. Observar
morcego e ferimento causado pela espoliação no pescoço do cavalo. Foto:
J.J. Ferrari.
91
Figura 21: Detalhe da Figura 20 (cavalo sendo atacado pelo
Desmodus rotundus). Observar morcego e ferimento causado pela
espoliação no pescoço do cavalo. Foto: J.J. Ferrari.
Ao alimentar-se, D. rotundus prefere extremidades do corpo, tais como
orelhas, pescoço, região anal, vulva, mamilos, focinho e cauda, entre outros.
A presa é perfurada com os dentes incisivos afiados deixando um ferimento
característico. Sua saliva possui enzimas que evitam a coagulação do
sangue e dois canais, um de cada lado da língua, lhes permitem sugar o
sangue (Greenhall, Joermann, Schmidt, 1983).
Um morcego pode ingerir entre 15 e 25 mL de sangue em uma presa e
um animal pode ser visitado por vários morcegos na mesma noite
(Constantine, 1979). O tempo necessário para a alimentação dos morcegos
hematófagos depende das reações da vítima durante a refeição, geralmente
D. rotundus gasta em torno de 30 minutos, podendo eventualmente chegar à
uma hora (Uieda, 1996).
Enquanto o morcego se alimenta foi observado eliminação de urina,
que pode ser uma forma de esvaziar mais rapidamente o estômago,
possibilitando maior consumo de alimento ou maior facilidade em alçar vôo
durante a alimentação, se for necessário (Uieda, 1996).
92
Após a alimentação o morcego hematófago pode usar um abrigo
noturno ou temporário que serve como local de descanso e ambientação.
Esses abrigos estão situados próximos às fontes de alimento e podem ser
casas de máquina, estábulo, paiol, porão ou mesmo vegetação próxima
(Sazima, 1978).
D. rotundus podem reabrir ferimentos feitos em noites anteriores, pois a
reabertura é feita em poucos minutos, o que diminui seu tempo a eventuais
riscos que podem ocorrer durante sua alimentação, como coices ou
mordidas (Greenhall, Joermann, Schmidt, 1983).
Pelo fato de ter o hábito alimentar exclusivamente hematófago, D.
rotundus é um potencial transmissor do vírus da raiva e os prejuízos
causados pela raiva em herbívoros transmitida por este morcego são
notáveis (Mayen, 2003).
Ainda, um aumento surpreendente no número de casos de raiva
humana, transmitidos por D. rotundus ocorreu no Brasil nesta última década.
Entre os anos de 2004 e 2005, dezenas de pessoas contraíram raiva
transmitida por estes animais na Região Amazônica brasileira (da Rosa et
al., 2006) e outros relatos similares de raiva humana na Região Amazônica
já haviam sido documentados (Warner et al., 1999). Na América Latina, do
ponto de vista epidemiológico, D. rotundus constituem o principal
reservatório silvestre do RABV, mas outros quirópteros não hematófagos
também têm papel na transmissão do vírus (Favi et al., 2002).
1.5.8.A dinâmica da raiva em bovinos
No Estado de São Paulo, na década de 1980, houve uma epidemia,
estudada por Taddei et al. (1991), que se propagou a uma velocidade média
de 20 km/mês pelas principais bacias hidrográficas paulistas, como as dos
rios Tietê, Ribeira, do Peixe, entre outras. Os mesmos pesquisadores
também sugerem que áreas montanhosas, com presença de floresta, alto
índice pluviométrico e com presença de criação bovina de subsistência,
possuem maior probabilidade de ocorrência da doença, pois estas
características ecológicas são apropriadas para o D. rotundus.
Taddei et al. (1991), no Estado de São Paulo, sugerem que o inverno
seco determina o deslocamento do D. rotundus para locais mais úmidos,
como ao longo de bacias hidrográficas, desencadeando surtos de raiva.
93
Lord (1988) sugere que as características ecológicas, topográficas e
geológicas de uma área determinam a distribuição dos abrigos de D.
rotundus e, conseqüentemente a epidemia de raiva nas diferentes regiões.
Gomes, Uieda e Latorre (2005) relacionam a existência de D. rotundus
com a sua fonte de alimento, o gado, fazendo com que as epidemias em
bovinos se propaguem difusamente e não ao longo de bacias hidrográficas,
como sugerido por Taddei et al. (1991).
Aspectos relacionados à raiva, ao D. rotundus, aos ecossistemas
pecuários e, também, aspectos relacionados ao clima, relevo e tipo de
manejo dos animais, devem ser considerados na análise da raiva bovina
(Gomes, 2008).
Delpietro, Marchevsky e Simonetti (1992), na Argentina, sugerem que
D. rotundus tem preferência por ecossistemas pecuários aos naturais. Desta
forma, o animal demonstra preferência ao alimento do que ao seu próprio
ambiente natural.
O Estado de São Paulo possui diferentes regiões em relação à criação
de bovinos. A região do Vale do Paraíba possui gado de corte, mas é
predominantemente leiteira; o Vale do Ribeira apresenta pecuária de
subsistência; nas regiões noroeste e norte, apesar de apresentarem gado de
corte e leite, o de corte é predominante; e o oeste paulista continua sendo a
principal área de produção de carne do Estado (Gomes, 2008). Esta
regionalização é importante de ser analisada, pois, em teoria, quanto maior
for a relação comercial homem-animal, como no oeste paulista, maiores
serão os cuidados profiláticos. Um dos motivos da presença da raiva em
bovinos em certas áreas é a deficiências de cuidados de controle e profilaxia
da raiva (Brass, 1994).
Taddei et al. (1991) consideram que as diferenças entre o leste e o
oeste da pecuária paulista favorecem o aumento da raiva na região leste,
que possui criação de gado de subsistência e de caráter familiar, além de
áreas montanhosas com trechos de floresta natural e índice pluviométrico
mais elevados que a região oeste.
Havendo aumento da população de morcegos há o aumento
concomitante de raiva entre eles e, assim, há aumento da probabilidade de
transmissão da doença aos bovinos. Devido ao constante deslocamento do
D. rotundus, as epidemias de raiva se caracterizam pelo seu deslocamento e
sazonalidade (Brass, 1994).
94
1.5.9.A epidemia de raiva 1997-2002 no Estado de São Paulo
Estima-se que milhares de casos de raiva ocorram anualmente em
bovinos e eqüinos no Brasil, apesar de não haver concordância quanto a
estes números. Em 2007, SIRVERA (2008) cita 1255 casos diagnosticados
laboratorialmente, enquanto que SVS/MS (2008) cita 905 casos.
O RABV transmitido por D. rotundus faz dos grandes rebanhos de
bovinos suas vítimas preferenciais. Os milhões de bovinos no Brasil,
calculados, aproximadamante, em 200 milhões (IBGE, 2008), passivamente
fazem parte do ciclo silvestre da raiva como hospedeiros terminais. Apesar
dos bovinos serem hospedeiros terminais, um caso de raiva humana
transmitida por bovino é documentado (Ferreira, 2007). Ainda, mesmo que
até o momento não haja documentação da transmissão do RABV entre
bovinos ou outros herbívoros de criação, esta possibilidade existe,
principalmente pelo contacto oral (saliva contaminada) entre mucosas, como
descrito em Kudus (Tragelaphus strepsiceros) na África (Mansfield et al.,
2006). Recentemente foi descrito o mesmo tipo de transmissão entre
cangambás (skunks) (www.rabiescontrol.net) (2009).
Se, o gado é a fonte de alimento preferencial para D. rotundus (Del
Pietro e Russo, 1996; Romijn et al., 2003) e permitem o aumento
populacional destes morcegos (Uieda , 1996), pode-se afirmar que, de forma
indireta, auxiliam a manutenção do RABV no ciclo silvestre. Os herbívoros
de criação, principalmente bovinos, desencadeando o aumento da
população de D. rotundus, permitem que o RABV circule no ciclo silvestre de
forma facilitada, possibilitando o início de epidemias.
É possível sugerir que os bovinos atuam como indicadores ecológicos
da raiva no meio silvestre, isto porque o número de D. rotundus identificados
com raiva é pequeno em relação ao número dos casos da doença
identificados entre herbívoros de criação. Em 2007, o Ministério da Saúde do
Brasil (SVS/MS) identificou 905 casos de raiva em bovinos, 104 em eqüinos
e somente 27 em D. rotundus.
No Brasil, Kotait et al. (2007) citam 36 espécies de morcegos nãohematófagos diagnosticados com raiva, principalmente insetívoros. No
período 2005-2007 o Laboratório do Instituto Pasteur do Estado de São
Paulo, Brasil, analisou 10472 morcegos e entre estes foram identificados
10123 não-hematófagos e 349 hematófagos. O RABV foi identificado em
173 morcegos não-hematófagos, enquanto que somente dois D. rotundus
foram identificados positivamente. A importância da raiva entre os
*
Dados cedidos pela Seção de Diagnóstico do Instituto Pasteur, São Paulo, Brasil.
95
herbívoros de criação transmitida pelos morcegos não-hematófagos ainda
hoje é desconhecida.
O Estado de São Paulo (SP) localiza-se na Região Sudeste do Brasil,
possui 248898 Km2, cerca de 2,91% do território brasileiro e possui mais de
40 milhões de habitantes. É o Estado do Brasil mais industrializado e é
responsável por aproximadamente 30% do seu PIB. Sua capital é São Paulo
e junto com as cidades periféricas formam uma metrópole, a Grande São
Paulo, com cerca de 18 milhões de habitantes (IBGE, 2008). O Estado
possui uma região endêmica de raiva bovina na sua região Leste, no Vale do
Paraíba (Taddei et al., 1991). Esta região endêmica em SP se estende pelos
Estados brasileiros de Minas Gerais (MG) e Rio de Janeiro (RJ), vizinhos de
SP.
Entre os anos de 1997 e 2002 houve uma epidemia de raiva no
Estado de São Paulo envolvendo bovinos e eqüinos (Tabela 9). Naquela
ocasião, o Estado era oficialmente dividido pela Secretaria de Saúde em 25
Diretorias Regionais (DIR). A epidemia foi inicialmente detectada na DIR-3
(Mogi das Cruzes), vizinha à região endêmica de São Paulo, posteriormente
notificada na DIR-12 (Campinas) e em seguida na DIR-20 (São João da Boa
Vista).
Devido à nova reestruturação da Secretaria de Saúde do Estado de
São Paulo (decreto DOE nº51433 de 28 de dezembro de 2006), as antigas
Diretorias Regionais de Saúde (DIR) foram substituídas pelos
Departamentos de Saúde. Assim sendo, as antigas DIR-3 (Mogi das
Cruzes), DIR-12 (Campinas) e DIR-20 (São João da Boa Vista) tem, hoje,
suas áreas de abrangência equivalentes aos Departamentos de Saúde I
(Grande São Paulo), VII (Campinas) e XIV (São João da Boa Vista),
respectivamente (Figura 22).
Deste ponto em diante as DIR 3, 12 e 20, citadas anteriormente,
serão designadas por RD1, RD2 e RD3, respectivamente, e a epidemia
estudada por “epidemia 1997-2002” (Figura 23).
96
Figura 22: Departamentos de Saúde do Estado de São Paulo. Fonte:
www.saude.sp.gov.br/content/geral_estrutura_regionais_de_saude.mmp.
Tabela 9: Ocorrência de raiva em herbívoros, confirmação pela rede
de laboratórios de diagnóstico do Estado de São Paulo. Fonte: Peres, 2009.
Espécie/Ano 1997
1998
1999
2000
2001
2002
2003
2004
2005
2006
2007
Total
Bovina
149
188
431
624
413
148
89
50
55
56
40
2.243
Bubalina
0
1
3
0
0
1
1
1
0
0
1
8
Eqüina
23
35
103
260
130
86
42
27
11
12
11
740
Muar
0
0
1
6
3
2
5
2
0
0
0
19
Asinina
1
0
1
1
0
3
1
0
0
0
0
7
Ovina
2
1
1
8
5
1
0
0
0
0
0
18
Caprina
1
0
2
0
1
0
1
1
0
0
0
6
Total
176
225
542
899
552
241
139
81
66
68
51
3041
97
N
Região 1
Região 2
Região 3
Região endêmica
MT
MS
TO
MG
RJ
São Paulo - Capital
470 Km
Figura 23: Mapa do Estado de São Paulo (SP), Sudeste, Brasil, e as
áreas epidêmicas RD1, RD2 e RD3. A localização da capital do Estado,
cidade de São Paulo, e a região endêmica estão indicadas no mapa. A
localização do Estado de São Paulo é mostrada em cinza no mapa do Brasil
no canto direito da Figura. Os Estados brasileiros Mato Grosso (MT) e Mato
Grosso do Sul (MS), da região Centro-Oeste, Estado de Tocantins (TO), na
região Norte, além de Minas Gerais (MG) e Rio de Janeiro (RJ), os quais
como São Paulo, situam-se na região Sudeste, são também mostrados na
Figura. Abaixo, o mapa do Brasil mostrando o relevo do país e ao lado, o
mapa do Estado de São Paulo e seu relevo em maiores detalhes. Fonte:
Miranda (2009).
Em 2002, os órgãos oficiais ligados à pecuária instituíram vacinação
obrigatória na área epidemica e endêmica, além de realizarem o controle
populacional de D. rotundus à base de Warfarina, já iniciado anteriormente,
fazendo cessar a epidemia (Tabelas 10 e 11). Detalhes deste controle,
além de abrangentes dados epidemiológicos relativos à raiva em
herbívoros no Estado de São Paulo no período de 1997-2007, são
98
encontrados em Peres (2009). É importante esclarecer que em todo o
Estado de São Paulo, como em todo o Brasil, casos de raiva em bovinos e
outros herbívoros de criação, foram diagnosticados antes e após os anos
da epidemia 1997-2002. Também é apresentada a Figura 24, gerada a
partir de dados da Comissão Estadual de Controle da Raiva, que mostram
o número total de bovinos e eqüinos positivos para a raiva no Estado de
São Paulo, no período de 1996 a 2003 e o número total de herbívoros
positivos para a raiva no Estado de São Paulo, no período de 1996 a 2003,
além dos números de animais positivos nas áreas RD1, RD2 e RD3.
Tabela 10: Número de morcegos Desmodus rotundus capturados e
tratados com Warfarina e refúgios trabalhados no Estado de São Paulo,
1997–2007. Fonte: Peres, 2009
Ano
Hematófagos capturados e
tratados com Warfarina
Refúgios trabalhados
1997
sem informação
sem informação
1998
sem informação
sem informação
1999
3.951
1.421
2000
5.217
892
2001
6.367
1.803
2002
16.071
2.438
2003
11.687
sem informação
2004
9.371
sem informação
2005
6.417
sem informação
2006
12.919
sem informação
2007
10.117
6.554
TOTAL
82.117
A epidemia 1997-2002 ocorreu em uma área montanhosa,
densamente povoada e com um índice econômico privilegiado dentro do
Brasil. As três áreas estudadas, áreas RD1, RD2 e RD3, possuem altitudes
médias entre 800 e 1600 metros, temperaturas médias anuais de 18°C,
pluviosidade média anual superior a 1300 mm e, portanto, com condições
ecológicas propícias para D. rotundus (Wilkinson, 1988). Atualmente, a
vegetação original do Estado encontra-se alterada, pois foi o maior produtor
de café durante os séculos XIX e XX. Poucas áreas da Mata Atlântica,
situada nas regiões serranas de difícil acesso, a leste do Estado,
encontram-se parcialmente conservadas, mas sujeitas a grande
especulação imobiliária. Partes das áreas epidemicas estudadas situam-se
nestas regiões serranas (Figuras 25, 26 e 27).
99
Tabela 11: Número de herbívoros existentes e herbívoros vacinados,
na área de vacinação obrigatória da raiva, no Estado de São Paulo, 2001–
2006. Fonte: Peres, 2009.
Ano
Herbívoros existentes
Herbívoros vacinados
2001
2.921.893
2.740.887
2002
3.214.133
3.090.793
2003
3.461.303
3.413.369
2004
3.625.938
3.568.119
2005
2.870.286
2.830.852
2006
2.944.762
2.915.819
1996
1997
1998
1999
2000
2002
2003
Bovino
78
149
189
434
623
148
90
Eqüino
12
24
35
106
238
92
48
Estado de São
Paulo
RD 1
RD 2
RD 3
1996
6
5
1
90
1997
82
5
6
173
1998
34
49
7
224
1999
31
349
56
540
2000
44
469
227
861
2001
19
259
277
625
2002
-
-
-
240
2003
-
-
-
138
Figura 24: Gráficos e tabelas com os números de bovinos e eqüinos
positivos para a raiva no Estado de São Paulo (imagem superior), como
também nas áreas RD1, RD2 e RD3 (imagem inferior) Fonte:
(www.pasteur.saude.sp.gov.br/coordenacao/coordenacao).
100
Atualmente, grande número de pesquisadores da raiva sugere que,
além da presença de montanhas, os rios e represas também são fatores que
determinam a diversificação genética do RABV (Carnieli et al., 2009). A
Figura 28 mostra a posição dos principais rios e represas das áreas RD1,
RD2 e RD3.
Outro trabalho recente, com metodologia inédita e dados
abrangentes, que estudou a raiva em bovinos no Estado de São Paulo, no
período entre 1992 e 2003, é o de Gomes (2008). O autor, utilizando uma
abordagem ecológica, estudou os padrões espaciais da raiva bovina e seus
determinantes, partindo da premissa que a paisagem físico-territorial e o
ambiente pecuário do Estado, que se transformam ao longo do tempo,
influenciam a expansão da raiva. O autor sugere que a análise dos tipos de
uso e classes de cobertura da terra permite a identificação de fatores
relacionados à epidemia e de sua progressão pelo território, no espaço e no
tempo. A epidemia ou as epidemias de raiva em herbívoros, segundo o
autor, progrediram principalmente pelos Vales do Paraíba e Ribeira, do
sentido da divisa de Minas Gerais até o eixo entre os municípios de São
Paulo e Campinas e depressão periférica (ver Figura 25).
As Figuras 29 e 30, cedidas gentilmente por Gomes, permitem uma
melhor caracterização e visualização da epidemia 1997-2002. Porém, para
que possamos interpretar corretamente estas figuras, se faz necessário
analisar os dados presentes na Tabela 12, que mostra os números de casos
de raiva no Estado de São Paulo em relação aos mapas Kernel da Figuras
29 e 30, no período 1997-2003. A Figura 31 mostra a função Kernel da
cobertura vegetal das áreas RD1, RD2 e RD3 no ano de 1997.
101
0m
2700 m
Divisão Geomorfológica
Planalto Atlântico e
Província Costeira
Depressão Periférica
Cuestas Basálticas
Planalto Ocidental
Figura 25: Aspectos do relevo do Estado de São Paulo (imagem
superior) e divisão geomorfológica paulista (imagem inferior). Imagens
geradas a partir de dados provenientes do SRTM (“Shuttle Radar
Topography Mission”). Fonte: Gomes, 2008.
102
1100 mm
11°C
3850 mm
25°C
Figura 26: Pluviosidade média anual do Estado de São Paulo
(imagem superior) e temperatura média anual do Estado de São Paulo
(imagem inferior). Imagens geradas a partir de dados provenientes do SRTM
(“Shuttle Radar Topography Mission”). Fonte: Gomes, 2008.
103
Figura 27: Mapa parcial da América do Sul mostrando seu relevo.
Observar a área destacada com um retângulo em preto que delimita,
aproximadamente, a área da epidemia 1997-2002 estudada. Fonte:
www.geografiaparatodos.com.br.
Figura 28: Posicionamento dos principais rios e represas existentes
nas áreas RD1, RD2 e RD3. Fonte: Gomes, 2008.
104
1997
1998
1999
2000
2001
2002
2003
Baixo
Alto
Figura 29: Mapas Kernel para cada ano da série histórica 1992-2003
sobrepostos à divisão geomorfológica paulista. Os “valores “baixos e altos”
são relativos ao número de casos de raiva diagnosticados no ano analisado.
Fonte: Gomes, 2008.
105
BAIXA
ALTA
Figura 30: Função Kernel elaborado com a somatória dos
diagnósticos laboratorialmente positivos de raiva bovina (1992-2003) nas
áreas RD1, RD2 e RD3. O epicentro da Figura, em vermelho, se refere à
área RD2 analisada neste trabalho. Os valores relativos “baixos e altos”
referem-se ao número de casos de raiva diagnosticados no período 19922003. Fonte: Gomes, 2008.
Tabela 12: Números de casos de raiva no Estado de São Paulo em
relação aos mapas Kernel da Figuras 29 e 30, no período 1997-2003. Fonte:
Gomes, 2008.
Ano
Nº de casos
Valor Baixo
Valor Médio
Valor Alto
(azul-verde)
(amarelo)
(laranja-vermelho)
1997
1 a 10
11 a 25
26 a 57
1998
1a5
6 a 15
15 a 25
1999
10 a 30
31 a 60
61 a 91
2000
1 a 30
31 a 50
51 a 84
2001
1 a 15
16 a 35
38 a 41
2002
1 a 10
11 a 25
26 a 29
2003
1a5
6 a 12
13 a 17
106
Vegetação rasteira
Floresta tropical
Reflorestamento
Corpos de água e rios de maior ordem
Urbana
Lavoura
Cana-de-açúcar
Outros
Figura 31: Função Kernel da cobertura vegetal das áreas RD1, RD2 e
RD3 no ano de 1997. Observar os dois focos de raiva (círculos brancos e
pretos) na área RD1. Comparar com a Figura 29, ano de 1997 Fonte:
Gomes, 2008.
107
2.Objetivos
1. Caracterizar geneticamente as linhagens AgV3 do RABV
isoladas durante a epidemia de raiva em bovinos e equinos de
1997-2002 no Estado de São Paulo, seqüenciando toda a
região codante do gene N e parcialmente o gene G.
2. Associar os dados filogenéticos a dados epidemiológicos.
3. Comparar a identidade genética entre as linhagens AgV3
tipificadas e, também, as comparar com linhagens AgV3 de
outras áreas geográficas do Brasil para sugerir um modelo de
expansão da epidemia 1997-2002.
108
3. Material e Métodos
3.1. Amostras
Para o estudo dos genes N da nucleoproteína N e G da glicoproteína
das linhagens do RABV, típicas de D. rotundus e designadas como Variante
3 (AgV3), isoladas de bovinos (Bos taurus) e eqüinos (Equus caballus)
durante a epidemia 1997-2002, um total de 144 amostras de cérebro
positivas para a raiva foram utilizadas (bovinos n= 130 e eqüinos n= 14).
Entre as 144 amostras de cérebro utilizadas para o estudo do gene N foram
utilizadas 62 delas para o estudo do gene G (bovinos n= 57 e eqüinos n= 5).
As amostras foram coletadas entre janeiro de 1997 e dezembro de 2001 na
área da epidemia 1997-2002, em diferentes cidades do Estado de São
Paulo, Brasil, (áreas RD1, RD2 e RD3) (Tabelas 13, 14 e 15). Como controle
positivo para as reações dos métodos utilizados foi utilizado a amostra fixa
do RABV CVS-31 (Challenger Virus Standard). Todas as amostras utilizadas
foram cedidas pelo Instituto Pasteur, São Paulo, Brasil, e, portanto, já
diagnosticadas positivamente para a raiva por imunofluorescência direta e
isolamento do vírus em camundongos albinos suiços inoculados
intracerebralmente. A identificação das amostras é a mesma utilizada pelo
Instituto Pasteur.
A escolha das amostras utilizadas foi realizada aleatoriamente em
grupos mensais para contemplar todos os meses dos anos da epidemia
estudada. Foi evitado o acúmulo de amostras de uma única cidade e, neste
caso, a amostra sorteada de uma cidade com número excessivo de
amostras não foi adicionada ao grupo sorteado e, em seguida, foi realizado
novo sorteio. Seqüências genéticas, de vários Estados brasileiros,
recuperadas do GenBank foram utilizadas para a comparação e avaliação
das seqüências genéticas geradas neste trabalho (Tabela 16). As
abreviações dos nomes dos Estados brasileiros e citados no texto se
referem aos estados de Goiás (GO) e Mato Grosso (MT), na Região CentroOeste do Brasil; Tocantins (TO) na região Norte; e os Estados de São Paulo
(SP), Minas Gerais (MG) e Rio de Janeiro (RJ) na Região Sudeste. Além das
seqüências apresentadas na Tabela 16 também foram utilizadas as
seqüências recuperadas do GenBank M13215 e DQ42212 referentes as
amostras fixas PV e CVS, respectivamente.
109
Tabela 13: Amostras de RABV AgVG3 utilizadas para o estudo do
gene N. A Tabela mostra o número de acesso do GenBank das amostras,
ano e cidade do isolamento, o número de registro do Instituto Pasteur, as
espécies nas quais o vírus foi isolado e os Subclados ou Grupos a que
pertencem descritos em Resultados..
N°
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
N° GeneBank
FJ649104
FJ649137
FJ649102
FJ649109
FJ649143
FJ649087
FJ649116
FJ649106
FJ649120
FJ649073
FJ649177
FJ649099
FJ649093
FJ649128
FJ649160
FJ649146
FJ649154
FJ649153
FJ649134
FJ649098
FJ649178
FJ649129
FJ649119
FJ649180
FJ649091
FJ649092
FJ649107
FJ649114
FJ649101
FJ649122
FJ649124
FJ649152
FJ649140
FJ649168
FJ649069
FJ649082
FJ649063
FJ649071
FJ649076
FJ649130
FJ649135
FJ649150
FJ649125
FJ649078
FJ649176
FJ649136
FJ649105
FJ649132
FJ649112
FJ649080
FJ649085
FJ649162
FJ649167
FJ649123
FJ649182
Ano
1999
2000
1999
2000
2000
1999
2000
2000
2000
1998
1999
1999
1999
2000
2001
2000
2000
2000
2000
1999
1999
2000
2000
2000
1999
1999
2000
2000
1999
2000
2000
2000
2000
2001
1998
1999
1998
1998
1999
2000
2000
2000
2000
1999
1998
2000
2000
2000
2000
1999
1999
2001
2001
2000
2000
Cidade
Bragança Paulista
Bragança Paulista
Vargem
Bragança Paulista
Pinhalzinho
Piracaia
Vargem
Bragança Paulista
Nazaré Paulista
Bragança Paulista
Vargem
Bragança Paulista
Socorro
Bragança Paulista
Morungaba
Bragança Paulista
Bragança Paulista
Bragança Paulista
Pinhalzinho
Joanópolis
Vargem
Bragança Paulista
Tuiuti
Vargem
Bragança Paulista
Piracaia
Bragança Paulista
Piracaia
Nazaré Paulista
Pedra Bela
Atibaia
Itatiba
Vargem
Valinhos
Joanópolis
Extrema
Cambuí
Joanópolis
Piracaia
Atibaia
Morungaba
Morungaba
Bom Jesus dos Perdões
Piracaia
Piracaia
Nazaré Paulista
Atibaia
Jarinu
Atibaia
Joanópolis
Joanópolis
Amparo
Campinas
Bom Jesus dos Perdões
Sta. Izabel
Amostra
IP5708
IP4545
IP5369
IP196
IP5151
IP3602
IP788
IP150
IP1292
IP5114
IP2787
IP4705
IP4067
IP2685
IP272
IP5347
IP6867
IP6866
IP3141
IP4680
IP5767
IP2731
IP1283
IP555
IP4023
IP4026
IP153
IP776
IP5367
IP1559
IP1958
IP6261
IP4631
IP5458
IP4307
IP2417
IP1495
IP4849
IP1328
IP2824
IP3251
IP6093
IP1959
IP1929
IP4568
IP3299
IP81
IP2983
IP568
IP2193
IP2566
IP1064
IP1501
IP1947
IP1333
Espécie
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Equino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Equino
Bovino
Bovino
Equino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Equino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Equino
Subclados e Grupos
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
110
56
57
58
59
60
61
62
63
64
65
66
67
68
69
70
71
72
73
74
75
76
77
78
79
80
81
82
83
84
85
86
87
88
89
90
91
92
93
94
95
96
97
98
99
100
101
102
103
104
105
106
107
108
109
110
111
112
113
114
115
116
117
118
119
FJ649147
FJ649170
FJ649108
FJ649117
FJ649149
FJ649175
FJ649088
FJ649142
FJ649084
FJ649138
FJ649095
FJ649077
FJ649083
FJ649089
FJ649094
FJ649097
FJ649131
FJ649179
FJ649113
FJ649111
FJ649121
FJ649183
FJ649164
FJ649067
FJ649096
FJ649141
FJ649103
FJ649133
FJ649118
FJ649126
FJ649068
FJ649156
FJ649159
FJ649172
FJ649100
FJ649166
FJ649157
FJ649165
FJ649161
FJ649186
FJ649144
FJ649171
FJ649127
FJ649158
FJ649169
FJ649181
FJ649163
FJ649185
FJ649148
FJ649145
FJ649155
FJ649151
FJ649081
FJ649090
FJ649115
FJ649110
FJ649049
FJ649047
FJ649055
FJ649086
FJ649174
FJ649056
FJ649173
FJ649053
2000
2001
2000
2000
2000
1998
1999
2000
1999
2000
1999
1999
1999
1999
1999
1999
2000
2000
2000
2000
2000
2000
2001
1998
1999
2000
1999
2000
2000
2000
1998
2000
2001
2001
1999
2001
2001
2001
2001
2001
2000
2001
2000
2001
2001
2000
2001
2001
2000
2000
2000
2000
1999
1999
2000
2000
1997
1997
1997
1999
1997
1997
1997
1997
Bragança Paulista
Espírito Sto. do Pinhal
Bueno Brandão
Bueno Brandão
Bueno Brandão
Socorro
Socorro
Lindóia
Águas de Lindóia
Socorro
Pedra Bela
Socorro
Socorro
Socorro
Socorro
Socorro
Lindóia
Monte Sião
Monte Sião
Pedra bela
Bueno Brandão
Vargem
Pedra Bela
Socorro
Pedra Bela
Monte Sião
Socorro
Monte Alegre do Sul
Socorro
Lindóia
Socorro
Caconde
Caconde
Mococa
Vargem
Jarinu
Itapira
Monte Sião
S. Sebastião da Grama
Itatiba
Pedra Bela
Atibaia
Amparo
Campinas
Itatiba
Vargem
Ibiraci
Itatiba
Pedra Bela
Caconde
Caconde
Tapiratiba
Caconde
Caconde
Caconde
S. Sebastião da Grama
Mogi das Cruzes
Salesópolis
Salesópolis
Arujá
Caçapava
Guararema
Biritiba Mirim
Mogi das cruzes
IP5402
IP7518
IP178
IP889
IP5572
IP4850
IP3780
IP4998
IP2552
IP4553
IP4124
IP1797
IP2541
IP3951
IP4114
IP4672
IP2885
IP210
IP756
IP312
IP1471
IP1948
IP1395
IP2956
IP4533
IP4812
IP5599
IP2986
IP1040
IP2617
IP3826
IP7018
IP159
IP7792
IP4750
IP1500
IP40
IP1433
IP910
IP4693
IP5285
IP7590
IP2626
IP142
IP7343
IP655
IP1195
IP1422
IP5475
IP5301
IP7016
IP6195
IP2394
IP3966
IP778
IP232
IP1284
IP719
IP3044
IP2690
IP870
IP3919
IP455
IP2439
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Equino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Equino
Bovino
Bovino
Bovino
Equino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Equino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Equino
Bovino
Equino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Equino
Bovino
Equino
Bovino
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
Grupo “Novas” RD2/RD3
Grupo “Novas” RD2/RD3
Grupo “Novas” RD2/RD3
Grupo “Novas” RD2/RD3
Grupo “Novas” RD2/RD3
Grupo “Novas” RD2/RD3
Grupo “Novas” RD2/RD3
Grupo “Novas” RD2/RD3
Grupo “Novas” RD2/RD3
Grupo “Novas” RD2/RD3
Grupo “Novas” RD2/RD3
Grupo “Novas” RD2/RD3
Grupo “Novas” RD2/RD3
Grupo “Novas” RD2/RD3
Grupo “Novas” RD2/RD3
Grupo “Novas” RD2/RD3
Grupo “Novas” RD2/RD3
Grupo “Novas” RD2/RD3
Grupo “Novas” RD2/RD3
Grupo “Novas” RD2/RD3
Grupo “Novas” RD2/RD3
Grupo “Novas” RD2/RD3
Grupo “Novas” RD2/RD3
Grupo “Novas” RD2/RD3
Grupo “Novas” RD2/RD3
RD1
RD1
RD1
RD1
RD1
RD1
RD1
RD1
111
120
121
122
123
124
125
126
127
128
129
130
131
132
133
134
135
136
137
138
139
140
141
142
143
144
FJ649045
FJ649048
FJ649052
FJ649057
FJ649070
FJ649061
FJ649058
FJ649184
FJ649139
FJ649051
FJ649054
FJ649060
FJ649050
FJ649062
FJ649064
FJ649043
FJ649044
FJ649065
FJ649079
FJ649059
FJ649075
FJ649074
FJ649046
FJ649066
FJ649072
1997
1997
1997
1997
1998
1998
1998
2000
2000
1997
1997
1998
1997
1998
1998
1997
1997
1998
1999
1998
1998
1998
1997
1998
1998
Salesópolis
Salesópolis
Santa Branca
Suzano
Salesópolis
Salesópolis
Suzano
Aruja
Aruja
Salesópolis
Salesópolis
Mogi das Cruzes
Salesópolis
Jaguariúna
Santa Izabel
Morungaba
Morungaba
Socorro
Socorro
Caconde
Cajuru
Pontal
Jaboticabal
Socorro
S. João Boa Vista
IP426
IP988
IP2166
IP4030
IP4375
IP815
IP144
IP2821
IP4597
IP2127
IP3011
IP366
IP1286
IP1192
IP2028
IP214
IP248
IP2119
IP1989
IP272
IP5331
IP5300
IP633
IP2478
IP4992
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Equino
Bovino
Bovino
Ovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
RD1
RD1
RD1
RD1
RD1
RD1
RD1
RD1
RD1
RD1
RD1
RD1
RD1
RD1
RD1
“Antigas”
“Antigas”
“Antigas”
“Antigas”
“Antigas”
“Antigas”
“Antigas”
“Antigas”
“Antigas”
“Antigas”
3.2. Transcrição reversa seguida da Reação em cadeia pela polimerase
(RT-PCR) e Seqüenciamento do DNA
O RNA total das amostras de cérebro foi extraído com Trizol®
(Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. O RT-PCR foi
realizado como descrito previamente por Carnieli, Ventura, Durigon (2006),
com pequenas modificações. Dois amplicons foram produzidos por RT-PCR
usando dois conjuntos de iniciadores (primers), um conjunto de primers para
o gene N [senso-21G (A T G T A A C A C C T C T A C A A T G) e antisenso304 (T T G A C G A A G A T C T T G C T C A T)] (Orciari et al., 2001) e
outro conjunto para o gene G [senso-GA (C G C T G C A T T T T R T C A R
A G T) e antisenso-GB (G G A G G G C A C C A T T T G G T M T C)] (Sato
et al., 2004). O amplicon produzido pelo par de primers 2IG/304, com 1393
nucleotídeos (nt) de extensão, corresponde ao trecho entre os nt 89 e 1482
do gene N do genoma da amostra fixa PV (Pasteur Virus). O amplicon
produzido pelo par de primers GA/GB, com 917 nt de extensão, corresponde
ao trecho entre os nt 3222 e 4139 do gene G do genoma da amostra fixa PV.
112
Tabela 14: Amostras de RABV AgVG3 utilizadas para o estudo do
gene G. A Tabela mostra o número de acesso do GenBank das amostras,
ano e cidade do isolamento, o número de registro do Instituto Pasteur, as
espécies nas quais o vírus foi isolado e os Subclados ou Grupos a que
pertencem descritos em Resultados.
N°
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
33
34
35
36
37
38
39
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
51
52
53
54
55
Nº GenBank
FJ648981
FJ648982
FJ648986
FJ648993
FJ648984
FJ649002
FJ648985
FJ649009
FJ649027
FJ649028
FJ649019
FJ649021
FJ649024
FJ649026
FJ649032
FJ649034
FJ648984
FJ648998
FJ649004
FJ649023
FJ649020
FJ649025
FJ649013
FJ649018
FJ649010
FJ649022
FJ649011
FJ649035
FJ649033
FJ649031
FJ649008
FJ649015
FJ649012
FJ648992
FJ648996
FJ648997
FJ649000
FJ649005
FJ649006
FJ648991
FJ648983
FJ649042
FJ649038
FJ649040
FJ649041
FJ649039
FJ649003
FJ649007
FJ649017
FJ649016
FJ649036
FJ649029
FJ649037
FJ649014
FJ649030
Ano
1997
1997
1998
1998
1998
1999
1998
2000
2000
2000
2000
2000
2000
2000
2001
2001
1998
1999
1999
2000
2000
2000
2000
2000
2000
2000
2000
2001
2001
2001
2000
2000
2000
1998
1998
1999
1999
1999
1999
1998
1997
2001
1998
2000
2000
1999
1999
1999
2000
2000
2001
2000
2001
2000
2000
Cidade
Salesópolis
Salesópolis
Salesópolis
Salesópolis
Suzano
Arujá
Mogi das Cruzes
Bragança Paulista
Bragança Paulista
Bragança Paulista
Bragança Paulista
Nazaré Paulista
Vargem
Bragança Paulista
Campinas
Amparo
Joanópolis
Piracaia
Joanópolis
Socorro
Pinhalzinho
Pedra Bela
Piracaia
Bom Jesus dos Perdões
Bragança Paulista
Bragança Paulista
Pedra Bela
Campinas
Morungaba
Itapira
Atibaia
Vargem
Monte Sião
Joanópolis
Bragança Paulista
Piracaia
Joanópolis
Piracaia
Pedra Bela
Socorro
Socorro
Itatiba
Piracaia
Monte Sião
Vargem
Vargem
Socorro
Nazaré Paulista
Bueno Brandão
Socorro
Espírito Sto. Pinhal
Caconde
Mococa
Caconde
Caconde
Amostra
IP719
IP988
IP815
IP4375
IP144
IP2690
IP366
IP153
IP5402
IP6867
IP2685
IP3299
IP4631
IP5347
IP142
IP1064
IP4849
IP1929
IP3960
IP4553
IP3141
IP5285
IP776
IP1947
IP196
IP4545
IP312
IP1501
IP272
IP40
IP81
IP788
IP756
IP4307
IP5114
IP1328
IP2193
IP4026
IP4533
IP3826
IP3044
IP4693
IP4568
IP210
IP555
IP5767
IP3951
IP5367
IP1471
IP1040
IP7518
IP7016
IP7792
IP778
IP7018
Espécie
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Equino
Equino
Equino
Equino
Equino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Subclados e Grupo
Subclado RD1
Subclado RD1
Subclado RD1
Subclado RD1
Subclado RD1
Subclado RD1
Subclado RD1
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD2
RD3
RD3
RD3
RD3
RD3
113
56
57
58
59
60
61
62
63
FJ649001
FJ648989
FJ648987
FJ648999
FJ648990
FJ648995
FJ648980
FJ648988
1999
1998
1998
1999
1998
1998
1997
1998
Caconde
Socorro
Taquaritinga
Socorro
Socorro
S. João da Boa Vista
Morungaba
Araçatuba
IP2394
IP2119
IP1192
IP1989
IP2478
IP4992
IP248
IP1411
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
Bovino
RD3
Subclado “Antigas”
Subclado “Antigas”
Subclado “Antigas”
Subclado “Antigas”
Subclado “Antigas”
Subclado “Antigas”
Subclado “Antigas”
Os dois amplicons N e G obtidos e amplificados separadamente por
RT-PCR foram purificados com GFX PCR DNA e Gel Band Purification Kit
(Amersham BiosciencesTM) e submetidos a reação de seqüenciamento
utilizando os conjuntos de primers senso e antisenso 2IG/304 e GA/GB,
sendo a seguir submetidos a reação de seqüenciamento utilizando BigDye
Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Amersham BiosciencesTM) de acordo
com as instruções do fabricante. O seqüenciamento foi realizado em
seqüenciador automatizado Applied Biosystems 3130 DNA automated
sequencer. Após a edição das seqüências dos genes N e G, uma seqüência
final com 1320 nt, correspondente aos amino ácidos (aa) 10 a 450 da
nucleoproteína N e, outra com 800 nt, correspondente aos 19 aa do
peptídeo-sinal e aa 01 a 269 da região N-terminal do endodomínio da
glicoproteina G do RABV, foram obtidos.
3.3. Análise filogenética
Foram analisadas, separadamente, duas regiões genômicas do RABV
isolado de bovinos e eqüinos: o gene N e o gene G. As seqüências do RABV
foram alinhadas juntamente com outras recuperadas do GenBank utilizando
o software Clustal W (Thompson et al., 1994). Posteriormente foram
editadas manualmente de acordo com suas respectivas regiões codantes e
utilizando o software BioEdit (Hall, 1999).
A taxa de saturação de substituição nucleotídica foi estimada
utilizando o software DAMBE (Xia and Xie, 2001), quantificando o número de
transições e transversões versus um gráfico de divergência, para avaliar o
sinal filogenético. Seqüências genéticas são ditas saturadas quando a
similaridade entre elas pode ser somente resultado de probabilidade e não
de homologia. Comparando o número de transições e transversões 

Transições são mutações nas quais uma pirimidina é trocada por outra pirimidina ou uma purina é
trocada por outra purina. Transversão são mutações nas quais uma pirimidina é trocada por uma purina ou viceversa.
114
versus a distância genética, para cada posição de nucleotídeos ao longo de
uma seqüência genética, as transições e transversões devem aumentar
linearmente com a distância genética, porém, as transições sempre devem
ser maiores que as transversões (Salemi and Vandamme, 2003).
A análise filogenética Neighbor-joining (NJ) foi realizada por meio do
software PAUP*4.0b10 (Swofford et al.,1996) utilizando o modelo de
substituição selecionado pelo software Modeltest 3.6 (Posada and Krandall,
1998). A confiabilidade das árvores filogenéticas NJ foi avaliada pela análise
de 1000 repetições de bootstrap. As árvores filogenéticas foram construídas
utilizando o software TreeView 1.4 (Page, 1996).
3.4. Seqüências de consenso
Foi gerada uma seqüência de consenso do gene N do RABV
utilizando linhagens genéticas RABV AgV3 do Brasil a partir de seqüências
recuperadas do GenBank e com os seguintes números de acesso
(accession number): AB083802, AB083803, AB083804, AB083805,
AB083806, AB083807, AB083808, AB083809, AB083810, AB083811,
AB083812, AB083813, AB083814, AB083815, AB083816, AB083817,
AB083818, AB117970, AB117971, AB117972, AB201803, AB201804,
AB201805, AB201810, AB201817, AB201819, AB201820, AB297633,
AB297634 e AB297636. As 30 linhagens do RABV AgV3 recuperadas do
GenBank para gerar a seqüência consenso do gene N foram isoladas em
herbívoros de criação (12 linhagens), D. rotundus (11 linhagens), morcegos
frugívoros (3 linhagens), morcegos insetívoros (duas linhagens) e duas em
espécies desconhecidas; nos Estados de São Paulo, Goiás, Mato Grosso,
Tocantins e Rio de Janeiro, no período de 1989 a 2001. Também foi gerada
uma seqüência de consenso do gene G do RABV utilizando linhagens
genéticas RABV AgV3 do Brasil a partir de seqüências recuperadas do
GenBank e com os seguintes números de acesso (accession number):
AB247423, AB247426, AB247427, AB247429, AB110663, AB110666,
AB110667, AB110668, AB110669, AB110662 e AB110664. As 11 linhagens
do RABV AgV3 recuperadas do Gen Bank para gerar a seqüência consenso
do gene G foram isoladas em bovinos (5 linhagens), D. rotundus (5
linhagens) e uma linhagem em eqüinos, nos Estados de São Paulo, Goiás,
Mato Grosso, Tocantins e Rio de Janeiro, no período de 1989 a 2001. As
seqüências consenso foram obtidas utilizando o software BioEdit (Hall, 1999)
e foram geradas incluindo o nt mais freqüente em cada posição das
seqüências que deram origem a seqüência consenso. O limiar de freqüência
para a inclusão de um dado nt em cada posição do genoma foi estipulado
115
em 51%. “Gaps” (lacunas) nas seqüências foram considerados como um
quinto tipo de nt.
3.5. Análise de Distância Genética
A Distância Genética das seqüências dos genes N e G aqui geradas,
das linhagens RABV AgV3, foram estimadas de forma global (análise global)
e por ano de isolamento (análise cronológica). A média da Distância
Genética de cada um dos grupos filogenéticos formados durante as análises
e, também, entre os grupos formados, além do desvio padrão das médias,
foram obtidos utilizando o software Mega versão 4.0 (Tamura et al., 2007).
As Distâncias Genéticas foram estimadas pelo modelo maximum composite
likelihood, incluindo o modelo de distribuição Gamma (α), de acordo com o
cálculo realizado pelo software Modeltest 3.06 (Posada and Krandall, 1998).
O desvio padrão das médias foi estimado utilizando 1000 repetições de
bootstrap.
3.6. Análise de polimorfismos
As seqüências de aa da nucleoproteína N e da glicoproteina G do
RABV AgV3, das linhagens aqui estudadas, foram deduzidas utilizando-se o
software BioEdit e a presença de polimorfismo foi avaliada de acordo com a
seqüência da amostra fixa PV e dos consensos brasileiros N e G.
3.7. Entropia dos genes N e G e das proteínas N e G
Foi utilizado o software BioEdit (Hall, 1999) para calcular a Entropia
(grau de incerteza) dos genes N e G e da nucleoproteína N e da
glicoproteína G para se obter a visão panorâmica das áreas conservadas e
não conservadas dos genes e proteínas deduzidos a partir das seqüências
genéticas estudadas.
116
Tabela 15: A- Número de herbívoros positivos para a raiva nas áreas
RD1, RD2 e RD3 e o total de herbívoros positivos no Estado de São Paulo
no período de 1996-2003; B- Distribuição cronológica de bovinos e eqüinos
positivos para a raiva das áreas RD1, RD2 e RD3 que tiveram o gene N
tipificado no estudo; C- Distribuição cronológica de bovinos e eqüinos
positivos para a raiva das áreas RD1, RD2 e RD3 que tiveram o gene G
tipificado no estudo. As amostras de Minas Gerais foram enviadas e
diagnosticadas no Instituto Pasteur e são provenientes de cidades vizinhas
das áreas RD2 e RD3. Fonte: Comissão Estadual de Controle da Raiva
(www.pasteur.saude.sp.gov.br/coordenacao/coordenacao).
A
Número total de
amostras positivas
1996
1997
1998
1999
2000
2001
2002
2003
RD 1
6
82
34
31
44
19
-
-
RD 2
5
5
49
349
469
259
-
-
RD 3
1
6
7
56
227
277
-
-
Est. de São Paulo
90
173
224
540
861
625
240
138
B
Área/ano
1997
1998
1999
2000
2001
Total
RD1
14
6
1
3
0
24
RD2
3
10
28
49
13
103
RD3
0
4
2
6
5
17
Total
Eqüinos= 14
Amostras de Minas Gerais= 10
17
20
31
58
18
144
Área/ano
1997
1998
1999
2000
2001
Total
RD1
3
4
0
0
0
7
RD2
1
7
10
22
6
46
RD3
0
3
1
3
2
9
Total
Eqüinos= 5
Amostras de Minas Gerais=3
4
14
11
25
8
62
C
117
Tabela 16: Números de acesso do GenBank de seqüências utilizadas
para gerar a seqüência consenso do gene N RABV AgV3 (A) e para o gene
G (B) e, também, utilizadas nas análises filogenéticas. A Tabela mostra as
espécies das quais o RABV foi isolado, o Estado de origem, o ano de
isolamento e as referências bibliográficas relacionadas às seqüências.
Nº GenBank
AB201802
AB201803
AB201804
AB201805
AB201806
AB201807
AB201808
AB201809
AB201810
AB201811
AB201812
AB201813
AB201814
AB201815
AB201816
AB201817
AB201818
AB201819
AB201820
AB083792
AB083793
AB083794
AB083795
AB083796
AB083797
AB083798
AB083799
AB083800
AB083801
AB083802
AB083803
AB083804
AB083805
AB083806
AB083807
AB083808
AB083809
AB083810
AB083811
AB083812
AB083813
AB083814
AB083815
A) – Seqüências gene N
Espécies
Origem
Ano
A. lituratus
SP
2002
D .rotundus
SP
2000
D. rotundus
SP
2000
D.rotundus
SP
2001
N. laticaudatus
SP
1998
N. laticaudatus
SP
1998
N. laticaudatus
SP
2001
E. auripendulus
SP
1998
E. auripendulus
SP
unknown
E. furinalis
SP
unknown
E. furinalis
SP
2001
E. furinalis
SP
2001
E. furinalis
SP
2002
M.molossus
SP
1999
M.molossus
SP
2002
E. auripendulus
SP
unknown
M. abrasus
SP
2000
Unknown
SP
2000
Unknown
GO
unknown
Cão
GO
1999
Felino
GO
1998
Felino
GO
1998
Humano
GO
1999
Cão
MG
1987
Cão
MG
1989
Cão
GO
1999
Bovino
MG
1999
Humano
GO
1999
Humano
GO
1999
Suíno
GO
1998
Bovino
GO
1999
Eqüino
GO
1999
Bovino
SP
1994
D. rotundus
SP
unknown
D. rotundus
SP
1998
Ovino
SP
1992
Bovino
TO
1998
Bovino
TO
1998
Bovino
TO
1999
D. rotundus
unknown
Bovino
MT
1999
Bovino
MT
1999
D. rotundus
unknown
Referências
Kobayashi et al., 2007
Kobayashi et al., 2007
Kobayashi et al., 2007
Kobayashi et al., 2007
Kobayashi et al., 2007
Kobayashi et al., 2007
Kobayashi et al., 2007
Kobayashi et al., 2007
Kobayashi et al., 2007
Kobayashi et al., 2007
Kobayashi et al., 2007
Kobayashi et al., 2007
Kobayashi et al., 2007
Kobayashi et al., 2007
Kobayashi et al., 2007
Kobayashi et al., 2007
Kobayashi et al., 2007
Kobayashi et al., 2007
Kobayashi et al., 2007
Kobayashi et al., 2007
Kobayashi et al., 2007
Kobayashi et al., 2007
Kobayashi et al., 2007
Kobayashi et al., 2007
Kobayashi et al., 2007
Kobayashi et al., 2007
Kobayashi et al., 2007
Ito M, 2003
Ito M, 2003
Ito M, 2003
Ito M, 2003
Ito M, 2003
Ito M, 2003
Ito M, 2003
Ito M, 2003
Ito M, 2003
Ito M, 2003
Ito M, 2003
Ito M, 2003
Ito M, 2003
Ito M, 2003
Ito M, 2003
Ito M, 2003
118
AB083816
AB083817
AB083818
AB117969
AB117970
AB117971
AB117972
AB297633
AB297634
AB297636
Nº GenBank
AB070449
AB110659
AB110662
AB110663
AB110664
AB110666
AB110667
AB110668
AB110669
AB247423
AB247426
AB247427
AB247429
D. rotundus
Bovino
Bovino
A. lituratus
A. lituratus
A. lituratus
A. planirostris
D. rotundus
D. rotundus
D. rotundus
SP
MT
SP
SP
SP
SP
RJ
RJ
SP
unknown
1989
1999
1998
1998
1998
1998
1998
1997
2000
B) – Seqüência gene G
Espécies
Origem
Ano
D.rotundus
unknown
Cão
SP
1989
Eqüino
GO
1998
Bovino
SP
1994
D.rotundus
SP
unknown
Bovino
TO
1999
Bovino
MT
1999
Bovino
SP
1989
Bovino
GO
1999
D.rotundus
SP
2001
D.rotundus
RJ
1998
D.rotundus
RJ
1997
D.rotundus
SP
2000
Ito M, 2003
Ito M, 2003
Ito M, 2003
Kobayashi et al., 2007
Kobayashi et al., 2007
Kobayashi et al., 2007
Kobayashi et al., 2007
Kobayashi et al., 2007
Kobayashi et al., 2007
Kobayashi et al., 2007
Referências
Kobayashi et al., 2007
Sato G, 2006
Sato G, 2006
Sato G, 2006
Sato G, 2006
Sato G, 2006
Sato G, 2006
Sato G, 2006
Sato G, 2006
Sato G, 2006
Sato G, 2006
Sato G, 2006
Sato G, 2006
119
4. Resultados
4.1. RT-PCR e Seqüenciamento Genético
Todas as amostras escolhidas para o estudo foram positivas pelo RTPCR. Quanto aos seqüenciamentos dos genes N e G do RABV todas as
amostras utilizadas puderam ser seqüenciadas.
4.2. Análise Filogenética
Foi observado que tanto transições como transversões aumentam de
acordo com a distância genética dos genes N e G do RABV e mesmo em
altos valores de distância genética, as transversões não superam as das
transições (Figura 32). Os resultados obtidos com o uso do software DAMBE
e utilizando o modelo de substituição F84 se fez lançando os valores de
transições e transversões versus distância genética e comparando o
alinhamento de nucleotídeos do conjunto de seqüências de cada um dos
dois genes. Portanto, o sinal filogenético das seqüências genéticas
estudadas é informativo em relação ao processo evolucionário que as gerou.
A árvore filogenética do gene N, gerada pelo método de Distância
Neighbor-joining (NJ), baseado no princípio de evolução mínima (Figura 33),
foi construída com o modelo de substituição GTR, incluindo o parâmetro de
distribuição Gamma e com sítios invariáveis, de acordo com o modelo de
substituição selecionado pelo software Modeltest 3.6. Nesta análise
filogenética, dois grandes agrupamentos de linhagens genéticas (Clusters)
foram observados, o Cluster Cão (AgV2) e Cluster Morcegos Brasileiros,
sendo que este último Cluster é subdividido em dois Clados: Clado D.
rotundus (AgV3) e Clado Morcegos Insetívoros (AgV4 e AgV6). O Clado D.
rotundus (AgV3), objeto deste estudo, pôde ser dividido em três Sub-clados.
Um deles é designado por Sub-clado RD1 (formado pelas linhagens da área
RD1), outro por Sub-clado “Antigas” (formado basicamente por linhagens
anteriores a 1998 e das áreas RD1 e RD2) e o terceiro por Sub-clado
RD2/RD3, formado por linhagens das áreas RD2 e RD1.
A
120
B
Figura 32: Transições (x s) e transversões (∆ v) versus gráfico de
divergência das seqüências genéticas do Gene G da glicoproteina (A) e do
Gene N da nucleoproteína (B).
O Sub-clado RD2/RD3, por sua vez, pôde ser dividido em dois
Grupos, Grupo RD2 e Grupo “Novas RD2/RD3”. O Grupo RD2 é formado
exclusivamente por linhagens da área RD2, enquanto que o Grupo “Novas
121
RD2/RD3” é formado por linhagens das áreas RD2 e RD3, porém todas elas
posteriores ao ano de 1999. Valores de bootstrap significativos (superiores a
70%) foram obtidos nesta árvore filogenética NJ do gene N. Seqüências de
nucleotídeo recuperadas do GenBank e de diferentes Regiões geográficas
brasileiras foram utilizadas como seqüências de referência (Tabela 16) e
uma seqüência do Lyssavirus Duvenhage (Genótipo 4) foi utilizada como
grupo externo (outgroup).
Em relação às linhagens do RABV AB201803 e AB201804,
recuperadas do GenBank e utilizadas como seqüências de referência, da
cidade Águas de Lindóia, situada na área RD2, segregaram no Clado D.
rotundus, no Grupo RD2. Posicionadas entre o Grupo “Novas RD2/RD3” e o
Sub-clado RD1 segregaram as linhagens AB083804 e AB083803 do Estado
de Goiás e a linhagem AB201802 (morcego frugívoro), de Dracena, cidade
de SP a oeste da área RD3, também recuperadas do GenBank e utilizadas
como seqüências de referência.
No Subclado RD1 encontramos linhagens dos Estados de Goiás,
Tocantins, Rio de Janeiro e de São Paulo. A identificação de seqüências de
linhagens de São Paulo, neste Subclado, não surpreende, pois são de
cidades da área endêmica do Estado de São Paulo, vizinhas à área RD1.
Quanto à identificação de seqüências de linhagens do Rio de Janeiro
também é compreensível, pois este Estado é vizinho a área endêmica
paulista, mas a presença de linhagens dos Estados de Goiás e Tocantins
surpreende, porém indica que as linhagens AgV3 do Brasil possuem grande
identidade entre si.
No Subclado “Antigas”, com exceção da linhagem AB083818 (Estado
de Goiás), todas as outras são de cidades do interior de São Paulo que não
fazem parte das áreas RD1, RD2 e RD3. Entre estas linhagens recuperadas
do GenBank encontramos algumas do Gênero Artibeus (morcego frugívoro),
indicando que este gênero é infectado pelo RABV AgV3 e, possivelmente,
transmitido por D. rotundus. Duas outras linhagens recuperadas do GenBank
(AB201810 e AB201817) são dos Gêneros Eumops e Molossus e, portanto,
indicam que morcegos insetívoros também podem ser infectados pelo RABV
AgV3 transmitido por D. rotundus.
122
Grupo
RD2
Sub-clado
RD2/RD3
Grupo
“Novas”
RD2/RD3
100
100
99
99
100
95
AB083815
AB201805
AB083817
AB117970
AB117972
AB117971
AB201819
AB083805
136135
AB117969
AB201810
AB201817
AB083818
137138
139
140141
142
143
73
144
AB083813
AB083814 AB201807
AB201811
100
AB201809
AB201812
AB201815
100
AB201816
100
AB201806
AB083792 AB201808
AB083801
AB083800
AB083802
AB083798
100
AB083799
EF152264
EF152263
EF152258
96
EF152260
EF152261
EF152247
EF152242
EF152236
EF152239 EF152236
CVS
PV
Clado
Desmodus
rotundus
Sub-clado
RD1
Sub-clado
“Antigas”
Clado Morcegos
Insetívoros
Cluster Cão
Duvenhage
0.1
123
Cluster Morcegos
0.1
1
2
3
4
5
6
7
8
9 10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20 21
22
23
24
25
26
27
28
29 30
31
32
33
34 35
36
37
3938
40
41
42
43
44
45
46
47
48
49
50
52 51
53
54
55
56
57
58
5960
61
62
6463
65
6667
68
69
70
71
72
73
74
75 76
77
78
79
80AB201803
AB201804
81
8382
84
85
86 87
88
8990
91
9293
94
95 96
9798
100
99
100
101
102
103
104
105
106
107
108109
110
111AB083804
AB083803
AB201802
113112
114115
116
117
118
119
120121
122
123
124
125
126
127
128 129
130
131 AB083806
AB083807
132AB297633
85
AB297634
134133
AB083808
AB083810
AB083811
AB201820
AB083812
AF070449AB083816
Figura 33: Árvore filogenética do gene N do RABV, gerada pelo
método de Distância Neighbor-joining (NJ), incluindo seqüências de
referência AgV3 RABV e linhagens do gene N AgV3 RABV isoladas de
bovinos do Estado de São Paulo, Brasil. A seqüência de referência
Duvenhage foi utilizada como outgroup. Os números próximos aos nós dos
ramos da árvore filogenética representam os valores de bootstrap. As
linhagens numeradas são descritas na Tabela 13.
Duas outras árvores filogenéticas do gene N utilizando linhagens do
RABV AgV3 foram geradas (Figuras 34 e 35).
Uma destas duas árvores filogenéticas é apresentada na Figura 34 e
foi construída utilizando seqüências com 513 nt de extensão e da região Nterminal do gene N do RABV, correspondente a região situada entre os nt
189 a 701 da amostra fixa PV Nesta árvore filogenética foram utilizas 48
linhagens representativas das áreas RD1, RD2 e RD3 e mais outras 63
linhagens. Entre estas 63 linhagens, 30 são da região endêmica e do Sul do
Estado de São Paulo e isoladas entre os anos de 1988 e 1999 e
recuperadas do GenBank (AF357285 a AF357316). As outras 33 linhagens,
do grupo de 63, também recuperadas do GenBank (DQ652193; DQ661008 a
DQ661018 e DQ835591 a DQ835611) são do Estado do Rio de Janeiro
(vizinho da área endêmica de São Paulo), isoladas de bovinos entre os anos
de 1999 e 2004.
Para gerar a árvore filogenética da Figura 34, foi utilizado o método
Neighbor-joining (NJ) para a reconstrução filogenética e utilizando o modelo
Maximum Composite Likelihood. Nesta árvore filogenética houve um
“mixing" entre as 63 linhagens recuperadas do GenBank, da área endêmica
e do Sul do Estado de São Paulo, do Estado do Rio de Janeiro, porém, 42
delas agruparam-se com as linhagens isoladas na área RD1, formando o
Clado RD1/RJ/Vale do Paraíba, enquanto que as 21 restantes agruparam-se
no Clado “Antigas” da área RD2. Este resultado permite sugerir duas
hipóteses. A primeira hipótese indica que a área RD1 pode ser uma área de
expansão da região endêmica de SP (Vale do Paraíba). A segunda hipótese
indica que as linhagens anteriores à epidemia 1997-2002 que circulavam em
todo o Estado de São Paulo, inclusive em sua área endêmica e no Estado
do Rio de Janeiro, possuíam grande identidade entre si e, posteriormente,
grande parte delas foi substituída pelas linhagens características da
epidemia 1997-2002 das áreas RD2 e RD3.
Para gerar a árvore filogenética apresentada na Figura 35 também foi
utilizado o método Neighbor-joining (NJ) para a reconstrução filogenética e o
124
modêlo Maximum Composite Likelihood e foi construída a partir de 70
linhagens representativas das aqui estudadas e outras 30 linhagens do ano
de 2007 e 2008 (gentilmente cedidas pela Pesquisadora Científica do
Instituto Pasteur, Carla Isabel Macedo). Entre estas 30 linhagens, quatro são
de cidades do Estado de Minas Gerais, enquanto que as 26 restantes são do
Estado de São Paulo, das áreas RD2, RD3 e, também, de outras áreas do
Estado de São Paulo. As 30 linhagens isoladas no ano de 2007 e 2008
possuem 800 nt de extensão da região N-terminal do gene N do RABV e
correspondente a região situada entre os nt 01 e 800 da amostra fixa PV. As
30 linhagens do gene N do RABV de 2007-2008 segregaram dentro do
Clado RD2/RD3, sugerindo que não houve mudança significativa nas
linhagens AgV3 isoladas de bovinos e transmitidas pelo D. rotundus após a
epidemia 1997-2002.
A árvore filogenética do gene G, gerada pelo método de Distância
Neighbor-joining (NJ), baseado no princípio de evolução mínima (Figura 36),
foi construída com o modelo de substituição TVM, incluindo o parâmetro de
distribuição Gamma com sítios invariáveis, de acordo com o modelo de
substituição selecionado pelo software Modeltest 3.6 (Posada and Krandall,
1998). Nesta árvore filogenética do gene G, dois Clados principais foram
observados, o Clado D. rotundus e o Clado Cão. O Clado D. rotundus é
semelhante ao Clado D. rotundus da árvore filogenética do gene N e pôde
ser subdivido em três Sub-clados: o Sub-clado “Antigas”, o Sub-clado RD1 e
o Sub-clado RD2/RD3.
No Sub-clado RD1 observa-se três linhagens recuperadas do
GenBank, AB110664, AB247426 e AB247427. A primeira delas é da área
endêmica de SP e as duas últimas do RJ, vizinho à área endêmica de SP.
No Sub-clado RD2 e RD3 observa-se um pequeno agrupamento RD3, com
tamanho relativo ao número de linhagens desta área utilizadas para a
construção da árvore filogenética do gene G (Tabela 14).
No Sub-clado “Antigas”, as linhagens recuperadas do GenBank são
do interior de SP, de áreas geográficas diferentes de RD1, RD2 e RD3 e
uma única exceção é encontrada, a linhagem AB110669, de Goiás.
Seqüências de nucleotídeos obtidas de diferentes regiões geográficas
brasileiras foram utilizadas como seqüências de referência (Tabela 16) e
como grupo externo (outgroup) foi utilizada o Genótipo 4 dos Lyssavirus, o
vírus Duvenhage.
125
99
DQ835595LVC67
98SALESOPOLIS815
B
AF357305B8
AF357288B12
98MOGIDASCRUZES366B
AF357294B18
DQ835610LVC156
DQ835591LVC53
97SALESOPOLIS2127B
AF357300B3
97MOGIDASCRUZES2439B
AF357316B1
DQ661015LVC46
DQ835594LVC62
AF357297B20
AF357289B13
DQ661018LVC149
DQ661013LVC39
AF357299B22
AF357301B4
DQ835603LVC131
DQ835604LVC135
DQ835592LVC57
DQ661008LVC06
AF357296B2
AF357291B15
AF357298B21
AF357295B19
DQ661016LVC47
97STABRANCA2166B
00ARUJA2821E
AF357313VB5
AF357304B7
97SALESOPOLIS1286B
AF357293B17
AF357302B5
Clado RD1/RJ/Vale do Paraíba
DQ835611LVC157
DQ835609LVC154
DQ835606LVC144
DQ835598LVC88
98STAIZABEL2028B
DQ835597LVC85
DQ661011LVC24
DQ661010LVC14
82
98SUZANO144B
99ARUJA2690B
DQ835605LVC139
DQ835602LVC116
AF357290B14
DQ661012LVC32
DQ652193LVC04
DQ661009LVC12
AF357303B6
98CACONDE272B
AF357306B9
64 98SOCORRO2478B
AF357287B11
AF357315VB7
AF357310VB2
DQ661017LVC51
98CAJURU5331B
DQ835600LVC100
DQ835601LVC113
DQ835607LVC145
AF357312VB4
97MORUNGABA214B
78
DQ835596LVC77
AF357314VB6
DQ835608LVC150
AF357309VB1
AF357286B10
AF357311VB3
DQ835599LVC92
00SSEBASTIAODAGRAMA232B
01JARINU1500B
01SSEBASTIAODAGRAMA910B
01ITAPIRA40B
01MONTESIAO1433B
00BUENOBRANDAO5572B
100
99VARGEM2787E
00ITATIBA6261B
01ESTOPINHAL7518B
00BRAGANCAPTA6866B
00BRAGANCAPTA150B
98PIRACAIA4568E
99JOANOPOLIS4680B
00PINHALZINHO3141B
01VALINHOS5458B
62 98CAMBUI1495B
98JOANOPOLIS4307B
99EXTREMA2417B
00CACONDE7018B
99CACONDE3966B
98SOCORRO3826B
01CAMPINAS142B
00MONTESIAO4812B
99AGUASDELINDOIAB
99SOCORRO1797B
01ITATIBA7343B
00MONTEALEGREDOSUL2986B
50 99PEDRABELA4533B
00AMPARO2626B
99SOCORRO5599B
00SOCORRO4553B
00BUENOBRANDAO1471B
0,005
00MONTESIAO210E
Clado “Antigas”
Clado RD2/RD3
Figura 34: Árvore filogenética do gene N do RABV AgV3 gerada pelo
método de Distância Neighbor-joining (NJ), incluindo seqüências do Estado
do Rio de Janeiro, Vale do Paraíba (SP) e linhagens representativas da
epidemia 1997-2002. Os números próximos aos nós dos ramos da árvore
filogenética representam os valores de bootstrap.
126
99
95
0.002
99VARGEM2787E
01VALINHOS5458B
00BRAGANCAPTA150B
00BJPERDOES1959B
99VARGEM5767E
98BRAGANCAPTA5114B
99PIRACAIA4026B
99JOANOPOLIS4680B
00ITATIBA6261B
98CAMBUI1495B
00BRAGANCAPTA6866B
00PINHALZINHO3141B
00BRAGANCAPTA6867B
99VARGEM5369B
98JOANOPOLIS4849B
00MORUNGABA3251B
00ATIBAIA81B
99BRAGANCAPTA4705B
99BRAGANCAPTA4023B
01MORUNGABA272B
98PIRACAIA4568E
99SOCORRO4067B
98JOANOPOLIS4307B
99JOANOPOLIS 3960B
99EXTREMA2417B
00BUENOBRANDAO5572B
00BUENOBRANDAO178B
08JoanopolisSP3357E
08ExtremaMG3500B
08SerraNegraSP11445B
07PedraBelaSP2957B
08LindoiaSP191B
08LindoiaSP1599B
07SocorroSP4548B
01ESTOPINHAL7518B
08PedregulhoSP180B
07ItirapuaSP831B
07PatrocinioPtaSP1594B
99VARGEM4750B
00CACONDE7018B
01JARINU1500B
01ITAPIRA40B
01MONTESIAO1433B
00AMPARO2626B
01ITATIBA7343B
01CAMPINAS142B
98SOCORRO3826B
00MONTESIAO4812B
99PEDRABELA4533B
00BUENOBRANDAO1471B
99SOCORRO1797B
84
99AGUASDELINDOIAB
99SOCORRO3951B
00MONTESIAO210E
00MONTEALEGREDOSUL2986B
99SOCORRO5599B
99SOCORRO3780B
00SOCORRO4553B
00VARGEM1948E
08VargemSP1696E
08PedraBelaSP3829E
8VargemSP4671B
8TresCoracoesMG1049B
8PiracaiaSP8163B
08VargemSP3395B
01SSEBASTIAODAGRAMA910B
08PiracaiaSP8164B
08SJBoaVistaSP10411B
08CacondeSP5037E
00CACONDE778B
99CACONDE3966B
99CACONDE2394B
08DivinolandiaSP10038B
08EspSPinhalSP5881B
90
08SSebGramaSP6049B
08SSebGramaSP5790E
08SSebGramaSP5045B
08AndradasMG3355B
07AndradasMG1139B
08BragancaPtaSP1038E
08SocorroSP8677B
00SSEBASTIAODAGRAMA232B
08SocorroSP1600B
08ExtremaMG366B
07ItapevaSP4756B
99SOCORRO1989B
97MORUNGABA214B
98CACONDE272B
98STAIZABEL2028B
97JABOTICABAL633B
98CAJURU5331B
98SOCORRO2478B
97SALESOPOLIS1286B
97STABRANCA2166B
98SUZANO144B
99
98SALESOPOLIS815B
97SUZANO4030B
66 00ARUJA2821E
97MOGIDASCRUZES2439B
97SALESOPOLIS2127B
98MOGIDASCRUZES366B
99ARUJA2690B
Clado RD2/RD3_2007_2008
Clado “Antigas”
Clado RD1
Figura 35: Árvore filogenética do gene N do RABV AgV3 gerada pelo
método de Distância Neighbor-joining (NJ), incluindo seqüências de
linhagens representativas da epidemia 1997-2002 (caixa alta) e dos anos de
2007 e 2008 (caixa baixa) isoladas na mesma área epizoótica. Os números
próximos aos nós dos ramos da árvore filogenética representam os valores
de bootstrap.
127
00BragancaPta153B
00Piracaia776B
99Piracaia1929B
00BragancaPta5402B
00BragancaPta6867B
00BragancaPta2685B
01Campinas142B
01Amparo1064B
00BragancaPta5347B
01Itatiba4693E
98Piracaia4568E
00Vargem4631B
00NazarePta3299B
99NazarePta5367B
00BJesusPerdoes1947B
01Morungaba272B
98Joanopolis4849B
99Joanopolis3960B
01Campinas1501B
00Vargem555E
00Vargem788B
98BragancaPta5114B
99Joanopolis2193B
99Piracaia4026B
99Vargem5767E
00Atibaia81B
99Piracaia1328B
98Joanopolis4307B
00BragancaPta196B
00BragancaPta4545B
00Pinhalzinho3141B
97Socorro3044B
99Socorro3951B
00BuenoBrandao1471B
00PedraBela5285B
01Itapira40B
00Socorro4553B
00Vargem1040B
00PedraBela312B
00MonteSiao756B
99PedraBela4533B
98Socorro3826B
01EspStoPinhal7518B
00MonteSiao210E
01Mococa7792B
AB110662
00Caconde7016B
00Caconde778B
00Caconde7018B
99Caconde2394B
98MogiDasCruzes366B
AB110664
98Suzano144B
97Salesopolis719B
97Salesopolis988B
98Salesopolis815B
98Salesopolis4375B
99Aruja2690B
AB247426
AB247427
98Socorro2478B
98SJoãoBoaVista4992B
98Socorro2119B
AB110666
AB110667
AB247423
AB247429
AB110663
AB110669
AB110668
97Morungaba248B
98Ara
ç atuba1411B
99Socorro1989B
98Taquaritinga1192B
Grupo
RD2
Subclado
RD2/RD3
Clado
Desmodus
rotundus
Grupo
RD3
71
80
79
Subclado
RD1
Subclado
“Antigas”
99
99
//
0.1
AB276310
AB276309
AB276308
AB276307
AB110659
AB276311
PV
Clado Cão
Duvenhage
Figura 36: Árvore filogenética do gene G do RABV, gerada pelo
método de Distância Neighbor-joining (NJ), incluindo seqüências de
referência AgV3 RABV e linhagens do gene G AgV3 RABV isoladas de
bovinos do Estado de São Paulo, Brasil. A seqüência de referência
Duvenhage foi utilizada como outgroup. Os números próximos aos nós dos
ramos da árvore filogenética representam os valores de bootstrap.
128
4.3. Análise de Distância Genética
Em relação ao gene N, o resultado dos cálculos de diversidade
genética das linhagens RABV AgV3 ( variabilidade intra-grupo) foi de 1,31%
± 0,18% (distância ± desvio padrão). A divergência genética entre as
linhagens AgV3 caracterizadas neste estudo e a linhagem da amostra fixa
PV (AgV2) foi 21,08% ± 2,14%, enquanto que a divergência entre as
linhagens analisadas neste trabalho e o Consenso RABV AgV3 brasileiro foi
1,85% ± 0,35%.
Analisando a diversidade genética das linhagens RABV AgV3 de
1997 a 2001, separadamente, foi observado que a diversidade intra-grupo
das linhagens isoladas em 1998 (1,75% ± 0,26%) foi, aproximadamente,
duas vezes maior que as descritas para os outros anos. Entretanto, a
divergência genética entre as linhagens investigadas neste estudo e a
linhagem da amostra fixa PV e o Consenso RABV AgV3 brasileiro
basicamente se manteve constante através dos anos, mesmo que um
pequeno aumento foi observado (Figura 37).
Em relação ao gene G, o resultado dos cálculos da diversidade
genética das linhagens RABV AgV3 (variabilidade intra-grupo) foi de 1,16%
± 0,21%. A divergência genética entre as linhagens AgV3 caracterizadas
neste estudo e a linhagem da amostra fixa PV (AgV2) foi 24,97% ± 3,71%
enquanto que a divergência entre as linhagens analisadas e o Consenso
RABV AgV3 brasileiro foi 1,43% ± 0,33% e ambos resultados foram
semelhantes aos descritos em relação ao gene N. Entretanto, foi observado
um decréscimo constante da diversidade genética de 1997 (1,96% ± 0,41%)
a 2000 (0,51 ± 0,14%); e um pequeno aumento de 2000 a 2001 (0,63% ±
0,18%). A divergência genética entre as linhagens investigadas neste estudo
e a linhagem da amostra fixa PV (AgV2) e o Consenso RABV AgV3
brasileiro se manteve basicamente constante através dos anos (Figura 38).
4.4. Análise do Polimorfismo dos genes N e G
Da tradução putativa das seqüências de nucleotídeos das linhagens
RABV AgV3 para amino ácidos foram encontrados os resultados descritos a
seguir (Figuras 39 e 40).
Dezesseis substituições de amino ácidos (aa) foram identificadas em
todas as linhagens do gene N AgV3 quando comparadas com a linhagem
PV e todas estas substituições também foram observadas no Consenso
129
25
A
Distância Genética (%)
20
15
Diversidade SD
10
1.31
0.18
5
Divergência
SD
21.08
2.14
1.85
0.35
0
PV
Diversidade
Consenso BR
Divergência
PV
Consenso BR
B
2.0
Distância Genética (%)
1.8
1.6
Diversidade
SD
1997
0.78
0.13
1998
1.75
0.26
1999
0.69
0.10
2000
0.51
0.08
2001
0.57
0.12
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
1997
1998
25
1999
PV
2000
2001
C
Consenso BR
PV
Distância Genética (%)
20
Consenso BR
15
1997
20.43
1.28
BR
10
1998
20.66
1.37
1999
21.19
1.97
2000
21.18
1.98
2001
21.61
2.26
5
0
1997
1998
1999
2000
2001
Figura 37: A. Média da distância genética entre as linhagens RABV
AgV3 isoladas de bovinos no Estado de São Paulo (diversidade intrapopulação) e entre estas linhagens e a amostra fixa PV como também entre
o Consenso Brasileiro AgV3 (divergência intra-população) baseado no gene
N da nucleoproteína. B. Diversidade do gene N entre as linhagens RABV
AgV3 isoladas em bovinos no Estado de São Paulo entre 1997 a 2001. C.
Divergência do gene N entre as linhagens do RABV AgV3 isoladas no
Estado de São Paulo entre 1997 a 2001 e a linhagem da amostra fixa PV e
entre as linhagens do Consenso Brasileiro RABV AgV3.
130
25
A
20
B
15
Diversidade
SD
1.16
0.21
10
5
(%)
Distância Genética (%)
30
0
PV
Diversidade
Consenso BR
Divergência
Divergência
SD
PV
24.97
3.71
Consenso BR
1.43
0.33
B
Distância Genética (%)
2.5
SD
1997
1.96
0.41
1998
1.65
0.31
1999
0.91
0.19
2000
0.51
0.14
2001
0.63
0.19
1.5
1.0
0.5
0
1997
1998
30
G Distância Genética (%)
Diversidade
2.0
1999
2000
PV
Consenso BR
2001
C
PV
25
20
15
10
Consenso BR
1997
25.97
1.68
1998
25.44
1.58
1999
24.79
1.42
2000
24.63
1.34
2001
24.96
1.34
5
0
1997
1998
1999
2000
2001
Figura 38: A. Média da distância genética entre as linhagens RABV
AgV3 isoladas de bovinos no Estado de São Paulo (diversidade intrapopulação) e entre estas linhagens e a amostra fixa PV como também entre
o Consenso Brasileiro AgV3 (divergência intra-população) baseado no gene
G da glicoproteina. B. Diversidade do gene G entre as linhagens RABV
AgV3 isoladas em bovinos no Estado de São Paulo entre 1997 a 2001. C.
Divergência do gene G entre as linhagens do RABV AgV3 isoladas no
Estado de São Paulo entre 1997 a 2001 e a linhagem da amostra fixa PV e
entre as linhagens do Consenso Brasileiro RABV AgV3.
131
Brasileiro RABV AgV3: C40S, V51G, C59G, S61N, V95L, E110D, K112R,
P135S, S157N, V179A, I257L, A332T, T377A, D378E, V379S, G397S e
I410M (observar Tabela 17 para determinar os símbolos de amino ácidos). A
substituição de aa N10H foi identificada em 97.22% das linhagens AgV3
analisadas neste estudo, mas não encontrada no Consenso RABV AgV3
brasileiro. Três substituições de aa em mais que 90% das linhagens
analisadas e também presentes no Consenso Brasileiro RABV AgV3: T84S
(98.61%), E110D (95.83%) e A143T (99.30%). A prevalência da substituição
N50H aumentou através dos anos, estando presente em 100% das
linhagens de 2001 e ausente nas linhagens de 1997. Entretanto, o oposto é
descrito para a substituição F80Y, a qual foi identificada em 82.33% das
linhagens de 1997 e ausente nas de 2001.
Em relação ao gene G vinte e uma substituições de aa foram
identificadas nas linhagens do RABV AgV3 analisadas quando comparadas
ao gene da linhagem da amostra fixa PV e todas elas também foram
observadas no Consenso Brasileiro RABV AgV3: P3L, V13I, F14S, P15S,
M75V, T109I, H132Q, V152I, R161K, N177K, S179L, V181I, A182T, N201E,
M206T, N213S, R215K, R218K, S223G, A261S e M262I. Três substituições
foram identificadas em mais que 80% das linhagens analisadas e também
presentes no Consenso Brasileiro RABV AgV3: F18L (93.65%), E224K
(87.30%) e E267D (88.89%). Finalizando, a prevalência da substituição
N266D aumentou através dos anos, estando presente em 35.71% das
linhagens de 1998 e 80% das linhagens de 2001.
Pelas análises e resultados mostrados acima se conclui que não
houve pressão seletiva positiva sobre as linhagens RABV AgV3 estudadas.
O padrão de substituição de aa ao longo dos genes N e G claramente
mostraram um excesso de substituições de nucleotídeos sinônimas (dS)
sobre as não sinônimas (dN) e, portanto ambos genes (N e G) encontravamse, no período analisado, sob as mesmas restrições seletivas.
Pela análise das 144 seqüências de amino ácidos da nucleoproteína
N das linhagens AgV3 aqui estudadas, foi identificado um sítio informativo
que caracteriza as linhagens isoladas na área RD1 daquelas isoladas nas
áreas RD2 e RD3, ou seja, enquanto na posição 80 há Tirosina nas
linhagens RD1 em todas as outras, inclusive no Consenso brasileiro, há
Fenilalanina. Também foi identificado um sítio informativo que caracteriza as
linhagens isoladas na área RD2 e RD3, pois na posição 50 das linhagens
RD2/RD3 há Histidina enquanto que nas linhagens RD1 e no Consenso
brasileiro há Asparagina (Figura 39). Porém, analisando as mesmas
seqüências na forma de nucleotídeos são observados 35 sítios informativos
que diferenciam as linhagens RD1 das RD2/RD3 e são eles e quando
132
comparadas ao gene da linhagem da amostra fixa PV: G98A, T104C,
T104C, T122C, C125T, A207C, A230G, A254C, G290A, A2997, C362T,
T374C, C491A, T518C, A554C, T570C, G605A, G624T, C717T, G725A,
A833G, G863A, C896T, C902T, T905C, C914T, G956T, G1142A, G1151A,
G1202A, T1250C, A1259G, A1307G e G1434A.
Quanto às seqüências da glicoproteína G e do gene G não foram
encontrados sítios informativos de amino ácidos ou nucleotídeos que
pudessem caracterizar as linhagens isoladas nas áreas RD1, RD2 e RD3.
4.5.Análise das Regiões com Atividade Biológica da Nucleoproteína N e
da Glicoproteína G
Para descrever as áreas com função biológica da nucleoproteína N e
da glicoproteína G e caracterizadas nas linhagens RABV AgV3 aqui
estudadas, foi escolhida a amostra fixa PV para comparação, isto porque a
grande maioria das vacinas produzidas no Brasil utilizam este vírus fixo. As
descrições abaixo, relacionadas às regiões com atividade biológica da
nucleoproteína N e da glicoproteína G são baseadas nas descrições das
duas proteínas apresentadas na Introdução desta Tese.
A área de interação da nucleoproteína N com o RNA do RABV é
localizada entre os aa 298 a 352. Nesta análise foi identificada a mutação
A332T, enquanto que em PV há Alanina (apolar) nas linhagens AgV3
estudadas há Treonina (polar).
O aa Serina, na posição 389 da Nucleoproteína N, que após sua
união com o RNA viral é fosforilada, é conservada nas linhagens deste
trabalho.
A Nucleoproteína N possui três epítopos antigênicos lineares no sítio
antigênico I (aa 358 a 367) e mais três epítopos antigênicos lineares no sitio
IV (aa 359 a 366 e aa 375 a 383). Em relação às áreas 358-367 e 359-366
elas são conservadas, porém na área 375-383 três mutações, em relação a
PV, foram identificadas. Enquanto que em PV encontramos os aa TDV
(Treonina, Ácido Aspártico e Valina), nas posições 377, 378 e 379, em
todas as linhagens analisadas foram identificados os aa AET (Alanina, Ácido
Glutâmico e Treonina). Além dos sítios antigênicos I e IV, vários epítopos
imunodominantes para células T auxiliares estão presentes e localizados
entre os aa 404 a 418 e nesta área encontramos a mutação I410M, isto é,
enquanto que em PV na posição 410 há Isoleucina, nas linhagens
analisadas há Metionina, ambos não-polares.
133
As linhagens analisadas da nucleoproteína são 100% conservadas
quanto aos resíduos carregados positivamente que interagem com os
grupos fosfatos das cavidades do RNA genômico do RABV e são
concordantes com a descrição de Luo et al. (2007).
A Glicoproteína G do RABV traduzida possui 524 aa e,
posteriormente, perde os 19 aa da região N-terminal durante seu
processamento. Estes primeiros 19 aa é o Peptídeo Sinal (SP); necessário
para o ingresso da Glicoproteína G pré-processada no Reticulo
Endoplasmático Rugoso. A Glicoproteína G processada, com 505 aa, é
dividida em três regiões: o Ectodomínio (ED) com 439 aa (1 a 439) na região
N-terminal, a região Transmembrana (TM) com 22 aa (440 a 461) e o
endodomínio (ENDO) com 44 aa (462 a 505) na região C-terminal. No
presente trabalho, após edição, foram obtidas seqüências da Glicoproteína
G processada, relativas aos primeiros 250 aa do Ecotodomínio (ED).
A glicosilação da Glicoproteína G, no CG, ocorre pela adição de
oligossacarídeos no resíduo Asparagina (N) no “sequon” NXS/T (S/T=
Serina ou Treonina), onde X é qualquer aa diferentes de Prolina (P). A
glicosilação é importante para a expressão e função da Glicoproteína G, ou
seja, para obter suas atividades biológicas, como, por exemplo, estabilidade
e antigenicidade. Um potencial sítio de glicosilação, o “sequon” NLS, na
posição 36-37-38, foi observado nas linhagens analisadas e, também,
encontradas na seqüência PV.
O primeiro estágio da internalização do RABV na célula hospedeira
ocorre quando a região semelhante à neurotoxina (neurotoxin-like region),
entre os aa 189 a 214, interage com o receptor celular nicotínico de
acetilcolina (nAChR) o qual é, provavelmente, o receptor preferencial do
RABV em muitos tipos de células. Quatro mutações foram encontradas em
todas as linhagens AgV3 estudadas e em relação a seqüência PV, N194S,
R196K, S204G e E205K.
Acredita-se que o domínio de fusão em baixo pH (low pH-induced
fusion domain) da Glicoproteína G se situa entre os aa 102 e 179. Este
domínio protéico da Glicoproteína G é relacionado à interação (fusão) com a
membrana do endossomo no interior da célula para que ocorra a ejeção da
ribonucleoproteína do RABV no citoplasma, desencadeando o ciclo de vida e
infecção do RABV. Foram identificadas em 100% das linhagens deste
trabalho sete mutações nesta área e em relação a PV: H113Q, V133I,
R147K, N158K, S160L, V162I e A182T.
A conservação das Cisteínas da Glicoproteína G dos Lyssavirus foi
confirmada nas seqüências de Glicoproteína G estudadas.
134
A análise das seqüências da Glicoproteína G mostrou os seguintes
resultados em relação a alguns sítios antigênicos e quando comparadas a
seqüência PV. O sitio antigênico I (amino acido 231) possui 100% de
identidade em relação a PV. Quanto ao sitio antigênico II [que é um sitio
descontinuo (amino ácidos 34 a 42 e 198 a 200)] temos a seguinte situação:
na área 34-42 foi identificada a mutação N37K em quatro linhagens das
áreas RD2 e RD3, enquanto na área do sitio antigênico II e entre os aa 198200 foi identificada a mutação R199K em todas as linhagens estudadas.
Nome
Abreviação Símbolo Polaridade
Glicina
Gly
G
Não polar
Alanina
Ala
A
Não polar
Leucina
Leu
L
Não polar
Valina
Val
V
Não polar
Isoleucina
Ile
I
Não polar
Prolina
Pro
P
Não polar
Fenilalanina
Phe
F
Não polar
Triptofano
Trp
W
Não polar
Metionina
Met
M
Não polar
Serina
Ser
S
Polar
Treonina
Thr
T
Polar
Cisteina
Cys
C
Polar
Tirosina
Tyr
Y
Polar
Asparagina
Asn
N
Polar
Glutamina
Gln
Q
Polar
Aspartato ou Ácido aspártico
Asp
D
Ácido (Polar)
Glutamato ou Ácido glutâmico
Glu
E
Ácido (Polar)
Arginina
Arg
R
Básico (Polar)
Lisina
Lys
K
Básico (Polar)
Histidina
His
H
Básico (Polar)
Tabela 17: Nomenclatura, abreviatura, símbolos e polaridade dos 20
aminoácidos traduzidos a partir do código genético. Fonte: Lodish et al.
(2005).
4.6. Entropia dos genes N e G e das proteínas N e G
As imagens das Figuras 41 e 42 foram geradas por meio do software
Bioedit e após o alinhamento das seqüências estudadas. As Figuras
permitem uma visão panorâmica dos resultados das Figuras 39 e 40, como
também possibilita identificar as áreas mais homogêneas (conservadas) e
heterogêneas (não conservadas) na composição de nucleotídeos dos genes
N e G, como também na composição de amino ácidos inferidos através do
seqüenciamento dos mesmos genes. As duas imagens foram geradas
utilizando dados de entropia (incerteza) dos alinhamentos das seqüências
135
genéticas. Quanto maior a variação de nucleotídeos ou aminoácidos em
uma das posições das seqüências alinhadas menor é a pressão seletiva e,
portanto, menos conservadas são estas áreas, pois o grau de entropia (Hx)
expressa a falta de conteúdo informativo em uma coluna do alinhamento,
onde o limite máximo total de incerteza é definido pelo número máximo de
caracteres diferentes encontrados na coluna.
A
Entropy (Hx) Plot
Alignment: C:\Documents and Settings\Usuário\Desktop\Gene N.bio
0,75
0,7
0,65
0,6
0,55
Entropy (Hx)
0,5
0,45
0,4
0,35
0,3
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
0
100
200
300
400
500
600
700
800
Alignment Position (residue number)
900
1.000
1.100
1.200
1.300
B
Entropy (Hx) Plot
Alignment: C:\Documents and Settings\Usuário\Desktop\Nucleoproteína N.bio
0,5
0,45
0,4
Entropy (Hx)
0,35
0,3
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
0
20
40
60
80
100
120
140
160 180 200 220 240 260 280
Alignment Position (residue number)
300
320
340
360
380
400
420
440
Figura 39: Entropia do gene N (A) e da nucleoproteína N (B). H= Grau
de entropia (incerteza) e x= número de seqüências analisadas.
136
A
Entropy (Hx) Plot
Alignment: C:\Documents and Settings\Usuário\Desktop\Gene G.bio
0,65
0,6
0,55
0,5
Entropy (Hx)
0,45
0,4
0,35
0,3
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
Alignment Position (residue number)
550
600
650
700
750
800
B
Entropy (Hx) Plot
Alignment: C:\Documents and Settings\Usuário\Desktop\Glicoproteína G.bio
0,65
0,6
0,55
0,5
Entropy (Hx)
0,45
0,4
0,35
0,3
0,25
0,2
0,15
0,1
0,05
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260
Alignment Position (residue number)
Figura 40: Entropia do gene G (A) e da glicoproteína G (B). H= Grau
de entropia (incerteza) e x= número de seqüências analisadas.
137
5. Discussão
A raiva é uma encefalite com 100% de letalidade, sem tratamento
específico, mas permite tratamento vacinal em regime de pré ou pósexposição. É uma zoonose cosmopolita que acomete o SNC dos
mamíferos e é considerada a 11ª causa de mortalidade humana entre as
doenças infecciosas (WHO, 2000). Na América Latina, a raiva continua a
ser um grave problema de saúde pública e veterinária, pois é responsável
pela morte de seres humanos e um grande número de animais.
Esta encefalite tem alto custo social e econômico e o controle de seu
agente causal, o Vírus da Raiva (RABV), pode ser realizado por meio de
intervenção em seu ciclo urbano pela vacinação em massa de animais de
estimação, como o cão, o principal transmissor da raiva humana. A
inoculação da saliva contaminada de um animal com raiva por mordidas, e
com raras exceções por arranhaduras e lambeduras, é a forma pela qual o
vírus se perpetua. Por aspectos ecológicos, sociais e econômicos a raiva
em algumas regiões geográficas é epidêmica. Aproximadamente metade
da população humana vive em áreas endêmicas da raiva (WHO, 2004),
como por exemplo, o Brasil.
Diversos programas governamentais têm demonstrado que a
prevalência de raiva humana tende a diminuir quando um eficiente
programa de controle da doença de cães e gatos é implementado (Briggs et
al., 1998), uma vez que a epidemiologia da raiva humana é geralmente
associada com os reservatórios regionais do RABV (Childs, 2002).
Além dos programas governamentais para a vacinação em massa de
cães e gatos associada à vigilância epidemiológica, também é necessária a
tipificação molecular do RABV para que a dinâmica da manutenção do
vírus na natureza seja conhecida e possibilite estabelecer suas relações filo
geográficas (WHO, 2004). A compreensão dos padrões da emergência das
doenças infecciosas necessita de um número considerável de seqüências
genéticas tipificadas, representativas de toda uma área geográfica
estudada (Smith, 2002) e isto foi realizado neste trabalho como um dos
objetivos propostos.
A tipificação molecular deve estar associada à análise geográfica da
região onde se deram os isolamentos do vírus (Real et al., 2005), isto
porque a emergência de doenças infecciosas é influenciada
simultaneamente por fatores genéticos e ecológicos (Grenfell et al., 2004).
Como a dinâmica de uma epidemia reflete-se nas subpopulações do vírus
da área epidêmica, a caracterização destas subpopulações permite
estabelecer vínculos espaciais e temporais entre elas (Real et al., 2005).
138
Neste trabalho foram identificadas subpopulações do RABV (Clados,
Subclados e Grupos filogenéticos), dentro de uma área geográfica (áreas
RD1, RD2 e RD3), analisando fatores ecológicos abióticos (relevo,
temperatura e pluviosidade) e cobertura vegetal, circunscritos em um
período de tempo determinado (1997-2002).
Atualmente, o número de casos de raiva em cães vem diminuindo
rapidamente no Brasil em virtude da instituição da campanha anual de
vacinação de cães e gatos. Como conseqüência do controle parcial da
raiva canina a raiva no ciclo silvestre adquiriu grande importância, como o
transmitido pelo D. rotundus, hoje o principal transmissor da raiva no país,
inclusive a raiva humana. Um dos objetivos realizados neste trabalho foi
estudar linhagens do RABV que circulam em populações de D. rotundus
demonstrando que, mesmo em uma área epidêmica, há diferentes
linhagens do vírus circulando.
No Brasil, a contínua expansão das áreas agrícolas promove o
contato do homem com os hospedeiros silvestres da raiva. Paralelamente
ao aumento deste contato, a conscientização adquirida através das
campanhas educativas associadas à raiva promoveu o aumento no número
de casos de raiva diagnosticados em animais silvestres, antes
subnotificados, como também o aumento no número de notificações de
agressões de animais silvestres a humanos (Carnieli et al., 2008).
Vetor ou espécie hospedeira são termos que designam espécies que
fazem parte do ciclo de uma doença numa determinada área geográfica
durante um período específico de tempo. O vetor necessita ser suscetível
ao vírus e capaz de transmiti-lo aos membros da mesma e ou outras
espécies. Espécies com essas características são capazes de sustentar os
seus ciclos epidemiológicos (Müller, 2000) e D. rotundus as possue.
Haydon et al. (2002) sugerem que patógenos (no presente caso o
RABV) infectando mais que uma espécie são encontrados em diferentes
populações animais e, algumas delas, podem ser reservatórios. Os
mesmos autores sugerem a seguinte definição para reservatório: uma (ou
mais de uma) população conectada, na qual o patógeno pode ser
permanentemente mantido e da qual a infecção é transmitida à populaçãoalvo. Assumindo esta definição, tanto o cão como D. rotundus, são
reservatórios no Brasil, o primeiro urbano e o segundo silvestre. Esta
situação se deve ao fato que a raiva é regularmente identificada nas duas
espécies, isto é, é persistente ao longo do tempo. A persistência de uma
infecção é contínua se ocorre em grandes populações (metapopulações)
139
(Bingham, 2005; Russel et al., 2006) e D. rotundus e cães pertencem a
distintas metapopulações.
Outra forma para definir o papel e a importância de D. rotundus na
epidemiologia da raiva, pela sua importância como transmissor e sua forma
eficaz de transmissão do RABV, é pensando na história evolutiva do RABV
no continente americano, mas há grande controvérsia em relação a esta
história (Badrane e Tordo, 2001; David et al., 2007; Davis, Bourhy, Holmes,
2006). Todavia, é impossível negar a interação ecológica de quirópteros
com outros potenciais hospedeiros do RABV, como canídeos, em séculos
passados. Não há motivo que possa excluir a possibilidade da existência da
raiva nas Américas em épocas pré-colombianas (Rupprechet, Hanlon,
Hemachuda, 2002). Assim, não é possível afirmar que o RABV foi
introduzido nas Américas na época da sua colonização e, dispersando-se,
infectou a população de, principalmente, canídeos, determinando que as
linhagens do RABV neste continente possuam origem européia, como é
concluído pela análise de dados epidemiológicos (David et al., 2007).
Porém, os mesmos autores afirmam que as linhagens genéticas atuais do
RABV que circulam entre morcegos hematófagos são as mais antigas do
ponto de vista filogenético e, provavelmente, são as ancestrais putativas de
todas as linhagens mundiais contemporâneas.
A descrição de fósseis de morcegos hematófagos como, por
exemplo, a espécie extinta Desmodus draculae, junto aos de canídeos em
alguns sítios arqueológicos (Guidon, 1984); o isolamento de somente o
genótipo 01 dos Lyssavirus nas Américas (Rupprechet, Hanlon,
Hemachuda, 2002); a presença de morcegos hematófagos, também,
somente na América Latina; a presença de fósseis de morcegos
hematófagos datados a partir do Período Pleistoceno somente nas
Américas (Arellano-Sota, 1988), além dos relatos históricos do século XVI
descrevendo morcegos como causadores de doenças semelhantes à raiva
(Wilkinson, 2002), são dados que permitem reivindicar a existência do
RABV no continente americano antes do século XVI e, desta forma, o
dissociar da origem européia.
A infecção causada pelo RABV de D. rotundus em outros animais, ou
seja, transmissão de vírus a partir de um reservatório para animais
susceptíveis (“spillover”), principalmente canídeos, pode ter ocorrido
repetidamente ao longo da História e ainda ocorre, por exemplo, “spillover”
de D. rotundus para carnívoros é calculado ter ocorrido entre 888 a 1459
anos atrás (Badrane e Tordo, 2001), ou seja, antes da descoberta das
Américas. Em contrapartida, David et al. (2007) acreditam que, no estágio
atual da virologia molecular, não é possível calcular datas de “spillover”.
140
Sato et al. (2004) comparando o gene G e o pseudogene G-L de
amostras do RABV isolados de carnívoros terrestres e morcegos
hematófagos relatam que é difícil fazer afirmações em relação à história
evolutiva do RABV através da comparação de isolados obtidos de
quirópteros e carnívoros do Brasil. Delpietro et al. (1997), na Argentina,
tipificaram antigenicamente o RABV em duas amostras de cachorro do
mato (Cerdocyon thous). Uma foi caracterizada como variante de cão e a
outra como variante de D. rotundus, demonstrando que o RABV pode ser
introduzido em uma população de canídeos silvestres via morcegos. Casos
de “spillover” entre espécies que exploram diferentes nichos ecológicos,
como canídeos e quirópteros, são relatados com freqüência nas Américas
(Velasco-Villa et al., 2006; Velasco-Villa et al., 2005).
A emergência da raiva epidêmica requer mudanças genéticas na
linhagem do vírus original para que esta se adapte ao novo hospedeiro
preferencial (Rupprechet, Hanlon, Hemachuda, 2002). O conceito de
quasiespécies aplicado aos vírus RNA e a ação de seleção ambiental
possibilitam que determinado genótipo selecionado se adapte a um novo
hospedeiro (Solé et al., 1999). A origem de epidemias de raiva pode
emergir inesperadamente e, ocasionalmente, uma espécie susceptível ao
RABV, que não mantêm um ciclo da raiva, pode transmitir a infecção a
outro integrante de sua população e, através do tempo e se as condições
forem favoráveis, estabelecer uma nova epidemia (Bingham, 2005).
Diante das circunstâncias citadas anteriormente, os atuais
reservatórios mundiais (biotipos) do RABV podem abrigar linhagens do
vírus com acentuada diversidade genética cujo ancestral é uma linhagem
pioneira que se estabeleceu em morcegos hematófagos. Sendo assim, esta
possibilidade aumenta a importância de análises de linhagens que circulam
atualmente em D. rotundus.
Somado ao fato da origem do RABV, Delpietro et al. (2009)
encontraram evidências que epidemias de raiva transmitidas pelo D.
rotundus são um risco potencial para os animais silvestres.
Os resultados apresentados neste estudo correlacionam a
divergência genotípica das linhagens do RABV, isoladas nas populações de
bovinos (população-alvo) durante a epidemia 1997-2002 no Estado de São
Paulo, com a distância geográfica existente entre os grupos regionais do
vírus e estabelece vínculos espaciais e temporais, como também
estabelece a dinâmica da circulação do vírus no reservatório (biotipo) da
raiva D. rotundus e na população-alvo.
141
A correlação entre a distância geográfica e a caracterização genética
das linhagens encontradas nas subpopulações de vírus (como as
encontradas em RD1, RD2 e RD3) permite a caracterização de uma
epidemia (Domingo, Webster, Holland, 1999).
A tendência que as linhagens do RABV possuem em se agrupar
geograficamente, provavelmente, está relacionada ao fato de que a
disseminação das linhagens do RABV está submetida à biologia do
hospedeiro, principalmente em relação à sua área de atuação e na
interação entre as diferentes populações dos hospedeiros (Nadin-Davis,
2007). O fato de D. rotundus ser colonial e se deslocar por áreas de
aproximadamente 20 Km2 (Flores-Crespo e Arellano-Sota, 1991) podem
explicar a origem e identidade das linhagens caracterizadas no estudo.
Este trabalho é o primeiro a estudar a raiva transmitida pelo D.
rotundus para bovinos e eqüinos durante uma epidemia por meio de
métodos moleculares associados a dados epidemiológicos. Os resultados
apresentados são de interesse para a Saúde Pública e Veterinária e podem
ser utilizados durante o planejamento do controle da doença, por
demonstrar a existência da alta identidade genética existente entre as
linhagens do RABV que circulam em D. rotundus.
As infecções de animais silvestres, como D. rotundus, com limitada
possibilidade de interferência, permite que estudos da doença sejam feitos,
como por exemplo, a reconstrução da historia biogeográfica da infecção a
partir de dados moleculares, e neste sentido, os vírus RNA, como o RABV,
são ótimos exemplos, principalmente por exibirem dinâmica evolutiva e
ecológica na mesma escala temporal (Biek et al., 2007). Neste trabalho é
sugerido um modelo da história biogeográfica da epidemia 1997-2002 e o
estabelecimento das relações filogenéticas do RABV na área estudada
permitiu esta reconstrução histórica.
Epidemias de raiva entre bovinos e eqüinos são conhecidas desde o
inicio do século XX no Brasil. Carini (1911) propôs pela primeira vez a
transmissão da raiva por morcegos observando, no Sul do Brasil, morcegos
atacando bovinos e eqüinos durante o dia. Nesta antiga epidemia
aproximadamente 4000 bovinos e 1000 eqüinos foram infectados pelo
RABV, em uma época na qual a população dos animais de criação era
muito menor que a atual.
Desde a época de Carini muitos estudos foram realizados, porém,
uma análise genética associada a dados epidemiológicos, ecológicos,
circunscrita a um espaço geográfico e em um determinado intervalo de
142
tempo com características únicas, como uma epidemia, não havia sido
realizada até o momento, como a apresentada neste estudo.
No Brasil, a população da espécie D. rotundus pode ser considerada
uma metapopulação, dada à extensão da sua área de abrangência. Como
uma metapopulação é o conjunto de várias populações de uma mesma
espécie em uma grande área e que mantém fluxo de indivíduos entre elas,
basta haver casos de infecção em uma destas populações para que ocorra
a persistência de uma infecção como a raiva, determinada, principalmente,
pelo fluxo migratório (Grenfell e Harwood, 1997; Russel et al., 2006). As
populações de D. rotundus, separadas em subpopulações, mantendo fluxo
migratório entre elas, formam uma metapopulação e este fato é o que pode
explicar a persistência da raiva nesta espécie, como também em outras
populações que possuam estes atributos (Bingham, 2005). Este fluxo
migratório pode ser uma possível explicação para a duração da epidemia
1997-2002, pois a manutenção e o tempo de transmissão de uma infecção
em uma população são freqüentemente instáveis, podendo após algum
tempo se extinguir, enquanto que em uma metapopulação a persistência de
uma infecção é continua (Bingham, 2005).
No Brasil, a epidemiologia molecular da raiva em morcegos sempre
atraiu atenção. Vários estudos foram realizados com estes reservatórios
silvestres do RABV, como por exemplo, Ito et al. (2001); Shoji et al. (2004);
Sato et al. (2004); Kobayashi et al. (2005); Bernardi et al. (2005) e
Kobayashi et al. (2006). Entretanto, nos estudos de epidemiologia
molecular da raiva em morcegos, quando há algum tipo de análise
geográfica dos isolados do RABV, que são designados somente pelo local
do isolamento, não se estabelece nenhum vínculo ecológico ou temporal,
como realizado neste estudo.
O estudo da epidemia 1997-2002 além de estabelecer a associação
regional do RABV com as características ambientais, estabeleu a dinâmica
temporal da epidemia por meio de dados epidemiológicos oficiais. Foi
determinado que os Subclados e Grupos filogenéticos do Clado Desmodus
rotundus, apresentados na Figura 33, estão situados nas áreas RD1, RD2 e
RD3, formando agrupamentos regionais basicamente dentro de um único
relevo, as montanhas do sul da Serra da Mantiqueira, com características
ecológicas definidas, como por exemplo, as mostradas nas Figuras 23, 24,
25, 26 27 e 28. Este fato permite caracterizar os grupos regionais do RABV
estudados como agrupamentos de linhagens regionais, segundo os
critérios expostos em Real et al. (2005), mas com sobreposição dos
agrupamentos filogenéticos.
143
Desta forma é factível afirmar que as linhagens estudadas que
circulam entre D. rotundus, divergem como conseqüência do seu
posicionamento em áreas de um mesmo ecossistema, não caracterizando
uma adaptação ecológica dos animais, e sim pelo distanciamento
geográfico e temporal, como relatado em Real et al. (2005). Os
agrupamentos filogenéticos das linhagens do RABV estudados não podem
ser interpretados como subdivisão ecológica da população do vírus, pois
são de um único bioma, mas com diferentes coberturas vegetais formadas
por ação antrópica, como mostra a Figura 31.
Os agrupamentos do RABV apresentados foram determinados por
meio de inferências filogenéticas, obtida através do agrupamento de pares
semelhantes (“pair-wise clustering”), com o método Neighbor-joining (NJ).
Com este método é possível analisar a diversidade do RABV (Smith, 2002).
O método NJ é uma versão simplificada do método ME (evolução mínima),
que utiliza distância genética. A distância evolutiva entre um par de
seqüências, geralmente, é medido pelo número de nt (ou aa) substituídos
em cada uma delas e é fundamental para o estudo de evolução molecular,
além de ser útil para reconstruções filogenéticas e a estimativa da
divergência entre linhagens genéticas (Saitou e Nei, 1987).
A formação dos agrupamentos regionais RD1, RD2 e RD3 corrobora
a variação intragenotípica do RABV e, em conseqüência, a diversidade dos
genes N e G do vírus, já determinada por outros pesquisadores como, por
exemplo, Velasco-Villa et al. (2005) no México.
Apesar da grande identidade apresentada pelas linhagens do RABV
isoladas na epidemia 1997-2002 e mostrada nas Figuras 37 e 38, foi
identificada, como esperado, maior variabilidade genética do gene G,
quando comparado com o gene N.
Interessante é notar que nas Figuras 37 e 38 observa-se uma
homogeneização constante entre os anos de 1997 e 2002. No início há
maior variabilidade que no final do período. Este resultado sugere que a
homogeneização do RABV pode ter ocorrido pelo grande contacto entre os
indivíduos da população de D. rotundus, provavelmente pela maior
proximidade entre os animais, possibilitando que poucas linhagens fossem
propagadas entre os indivíduos de diferentes colônias. Outro fator que pode
ter determinado esta homogeneização do vírus foi a introdução ou a
formação por mutação de uma linhagem do RABV com alto valor
adaptativo, como as encontradas ainda hoje nas áreas RD2 e RD3.
O comportamento territorialista e colonial de D. rotundus pode ser
uma das causas de incremento da homogeneização das linhagens do
144
RABV. O contato físico mais íntimo pode aumentar a infecção intraespecífica. Johnson et al. (2003), estudando canídeos na Turquia,
sugeriram que a transmissão do RABV entre as espécies é facilitada
durante o acasalamento, quando disputas territoriais são mais intensas.
Esta situação aumenta as chances de transmissão intra-específica de um
patógeno.
Além da necessidade de deslocamento do D. rotundus em procurar
sua presa para se alimentar de sangue, que algumas vezes pode atingir
dezenas de quilômetros (Flores-Crespo e Arellano-Sota, 1991), em épocas
de seca os animais se deslocam a procura de água e comida, como
sugerido por Taddei et al. (1991). Os deslocamentos de morcegos ocorrem
facilmente por sua capacidade de vôo. Em contrapartida a maior distância
entre as populações de D. rotundus minimiza a homogeneização das
linhagens do RABV destes hospedeiros; isto porque a distância geográfica
diminui a possibilidade de contacto entre os indivíduos das subpopulações
do animal. Este fato pode explicar a origem dos três agrupamentos
filogenéticos principais: RD1, RD2 e RD3. A maior identidade existente
entre os agrupamentos RD2 e RD3 se deve ao fato de RD3 ser produto da
expansão de RD2, constatado pela alta identidade genética do RABV
encontrada nas duas áreas. Porém, as linhagens das áreas RD2/RD3
podem ter se originado de uma mutação das linhagens RD1 ou estar
isolada em uma colônia de D. rotundus, que entrando em contacto com
outras foi propagada ou, ainda, pode ter sido deslocada pela migração do
hospedeiro de outra região não estudada
O deslocamento da epidemia de RD2 para RD3 pode ser
conseqüência da topografia das duas regiões. As áreas que dividem RD1
de RD2 são mais elevadas que aquelas que dividem RD2 de RD3, como
mostrado na Figura 25. Somado a este fato, a existência de áreas de
floresta nativa (Mata Atlântica), como mostra a Figura 31, também pode ter
tido influência, pois o deslocamento de D. rotundus neste tipo de área é
dificultado. Estes dois fatores ecológicos podem ter determinado a menor
homogeneização das linhagens do RABV das áreas RD1 e RD2, além do
fato de que gado é encontrado em pequeno número em áreas de topografia
elevada e com cobertura vegetal nativa.
A epidemiologia molecular do RABV possui um problema. Para que
se faça um estudo geral e amplo devem ser seguidos alguns critérios de
ordem prática como, por exemplo, em relação ao tamanho das seqüências
a serem analisadas, que devem ter o mesmo tamanho. Entretanto, os
pesquisadores da biologia molecular do RABV determinam individualmente
suas áreas de estudo e a seqüenciam sem se preocupar com possíveis
145
estudos futuros. Neste contexto, Velasco-Villa et al. (2005) argumenta e
afirma “não há sequer uma área do genoma do vírus escolhida como alvo
global” e a falta deste alvo não permite que muitas comparações sejam
realizadas. Wu et al. (2007) analisando os genes do RABV propõe que
algumas áreas do gene L da polimerase, devido sua conservação, possam
ser “alvo” de uso global.
O trabalho desenvolvido utilizou praticamente toda a região codante
do gene N (1320 nt) e toda a área amino-terminal do gene G (800 nt). Smith
(2002) enfatiza que seqüências genéticas de um gene com pequeno
tamanho, freqüentemente, contêm um número insuficiente de caracteres
informativos, não são estatiscamente significativas e não permitem a
precisa reconstrução das relações evolutivas entre clados.
Ciclos do RABV sobrepostos, como os apresentados, formados pela
mesma espécie de hospedeiros do vírus e com o mesmo nicho ecológico,
provavelmente, não poderiam ser identificados se muitas seqüências de
pequeno tamanho estudadas por outros autores e disponíveis no GenBank
fossem utilizadas, pois ou eram muito curtas ou não analisavam a mesma
área analisada neste trabalho. Felizmente, outros pesquisadores,
estudiosos da genética do RABV do Brasil já haviam produzido outras
seqüências similares as nossas e as depositado no GenBank, ô que
facilitou e auxiliou sobremaneira o estudo desenvolvido. Um exemplo deste
fato foi a Seqüência de Consenso gerada com as seqüências do gene N e
G de linhagens AgV3 apresentadas na Tabela 16.
A origem da epidemia 1997-2002, ainda hoje, é motivo de estudo.
Entretanto, uma nova epidemia de raiva pode emergir inesperadamente,
pois ocasionalmente uma espécie susceptível ao RABV se infecta e pode
transmitir a infecção a outro integrante de sua população e, através do
tempo e se as condições forem favoráveis, estabelecer um ciclo contínuo
(Bingham, 2005) e restrito a uma área.
O RABV é mantido regionalmente pelas espécies de animais que
ocorrem na região, normalmente com altas densidades populacionais e
bem adaptadas aos biomas geográficos (Kusmin et al., 2004). Estas
espécies se comportam como reservatórios regionais do RABV e, por esta
razão, podem ser chamadas de espécies-ecotipo da raiva (Rohde et al.,
1997). D. rotundus é uma espécie bem adaptada as condições ecológicas
da área geográfica aqui analisada. Nas espécies-ecotipo são encontrados
os geo-filogrupos do RABV, os agrupamentos regionais do vírus que, em
última análise, expressam a evolução molecular local do vírus (WHO,
2004).
146
A origem destes geo-filogrupos se dá por pressões seletivas locais ou
por isolamento geográfico. Nestas circunstâncias, os geo-filogrupos do
RABV se mantêm e ficam circunscritos (Bourhy et al., 1999). As linhagens
genéticas do RABV são responsáveis por ciclos epidêmicos da raiva e
estes agrupamentos de linhagens representam subdivisões da população
do vírus em habitats distintos (Real et al., 2005). Nadim-Davis et al. (1999)
sugerem que o deslocamento das linhagens nas subpopulações de
hospedeiros determina as relações filo-geográficas do vírus. Kusmin et al.
(2004) sugerem que diferenças regionais do RABV, encontrados em
espécies-ecotipo, são determinadas pela adaptação destas espécies aos
biomas geográficos e outras espécies, que não sejam o hospedeiro
preferencial da raiva na área geográfica, normalmente, são hospedeiros
terminais, como os bovinos e todos os outros herbívoros.
Aceitando as condições expostas anteriormente, podemos afirmar
que D. rotundus é uma espécie-ecotipo na América Latina, com uma
característica, é adaptados a diferentes tipos de Biomas, pois é encontrada
em áreas xerofíticas, como a caatinga e cerrado, como também em
hidrofílicas, como a Mata Atlântica, Floresta Amazônica e Pantanal,
tomando como exemplo o Brasil.
No Brasil, estudos com os genes da nucleoproteína (N) e
glicoproteína (G) apontam para a existência de dois filogrupos do RABV,
caracterizando dois ciclos: o urbano e o silvestre (Ito et al., 2001). A
principal espécie responsável pelo ciclo urbano é o cão, designado por
Johnson et al. (2004) como biotipo cão, sendo identificado antigenicamente
no Brasil como variante 2 (AgV2) (Diaz et al., 1994; Favoretto et al., 2002).
O ciclo silvestre é predominantemente composto pelo biotipo D. rotundus,
identificado antigenicamente como variante 3 (AgV3) (Diaz et al., 1994;
Favoretto et al., 2002). Os ciclos urbano e silvestre se sobrepõem em
várias áreas (Ito et al., 2003), ô que aumenta a complexidade da
epidemiologia da raiva.
Na Europa, casos de raiva entre animais susceptíveis, como os de
criação e domésticos ou mesmo silvestres, parecem estar condicionados,
principalmente, ao ataque ou inspeção destes às raposas moribundas em
fase terminal da doença e, portanto, condicionados espacialmente e
temporalmente a proximidade da principal espécie hospedeira infectada
pelo RABV, as raposas (WHO, 2005). No presente caso estudado, a raiva
em bovinos transmitida pelo D. rotundus, a situação é diferente, isto porque
a necessidade para se alimentar do sangue de suas vítimas é o que
determina que D. rotundus infecte herbívoros, sobretudo o gado.
147
A formação dos grupos regionais do RABV nas áreas RD1, RD2 e
RD3, determinadas na área epidêmicas 1997-2002, expressa diversidade
de linhagens, sugerindo coexistência ou coemergência de novas linhagens
separadas espacialmente, como determinado por Velasco-Villa et al., 2005,
e este fato pode ter determinado e possibilitado a identificação e a origem
do Grupo filogenético “Novas RD2/RD3”, mostrado na árvore filogenética
da Figura 33, em detrimento do Subclado “Antigas”, também identificado
nas árvores filogenéticas das Figuras 33, 34 e 35. Porém, o número de
amostras do ano de 1997, que compõe o subclado “Antigas”, é inferior aos
dos anos 1998, 1999 e 2000, como mostrado na Tabela 15 e este fato pode
ter influenciado na formação do Grupo filogenético “Novas RD2/RD3” e do
Subclado “Antigas”.
As linhagens genéticas do RABV, domésticas e silvestres, podem
disseminar-se entre outras espécies susceptíveis encontradas na mesma
área, ampliando a área de abrangência do vírus pelo contínuo
deslocamento dos animais reservatórios (Krebs et al., 2003; Kusmin et al.,
2004). Este motivo também pode ter sido um fator pelo qual houve a
substitução das seqüências do Sub-clado “Antigas” pelas do Grupo “Novas
RD2/RD3”. Assim sendo, linhagens de alto valor adaptativo, como
encontrado em “Novas RD2/RD3”, migraram e substituíram outras de
menor valor adaptativo como, por exemplo, as “Antigas”.
Os valores de similaridade de seqüências homologas obtidos por
meio de matriz de substituição e expressos nas Figuras 37 e 38, permitem
estimar a probabilidade (“likelihood”) de um resíduo de nt ou aa ser
substituído por outro durante a seleção natural. Algoritmos baseados em
métodos de distância, como o NJ, permitem a obtenção de agrupamentos
filogenéticos e caracterizam a topologia das árvores filogenéticas que
representam uma população subdividida em uma área geográfica (mesmo
que subdividida artificialmente como realizado neste trabalho) na área
estudada (Smith, 2002). Valores de bootstrap superiores a 70% são
considerados grupos filogenéticos (Hillis e Bull, 1993) e todas as
subdivisões do Clado Desmodus rotundus estudado, possuem valores de
bootstrap superiores a 70%, fato que dá segurança em relatar os
agrupamentos descritos.
A polimerase L não possui um sistema que permita a edição ou a
correção do genoma do vírus (“proofreading and post-replication error
correction”) durante a replicação do vírus (Domingo e Holland, 1994). Esta
característica, associada aos mecanismos evolutivos que geram
variabilidade genética dentro da população, como deriva genética, gargalo
evolutivo (“bottleneck”) e seleção ambiental, possibilitam a formação das
148
linhagens genéticas do RABV (Kissi et al., 1999; Smith, 2002), que são
preferencialmente encontradas nas espécies-ecotipo, ecologicamente e
espacialmente distribuídas.
Bourhy et al. (1999) discutindo a regionalidade do RABV na Europa
reconheceu pequenos agrupamentos dentro dos principais agrupamentos
filogenéticos e sugeriu que há, no mínimo, algum grau de isolamento entre
eles. Real et al. (2005) sugerem que a organização espacial das linhagens
é explicada como conseqüência da evolução neutra aliada a dispersão local
das linhagens e que os agrupamentos destas seqüências indicam
subdivisões da população do vírus. Morimoto et al. (1998) hipotetizaram
que as divergências encontradas entre as linhagens do RABV, permitem
que o vírus se adapte ao ambiente e é um reflexo da interação
hospedeiro/vírus.
O RABV, tal como com outros vírus RNA de sentido negativo, mostra
pouca fidelidade durante a replicação e isto determina que a freqüência
genética da população viral seja alterada continuamente, fazendo com que
haja a criação de linhagens genéticas que formam subpopulações virais
(quasispecies) (Kissi et al., 1999; Morimoto et al., 1998; Nowak, 1992).
Estas subpopulações podem ser introduzidas aleatoriamente em um novo
hospedeiro (Elena et al., 1997), permitindo que a variabilidade genética seja
mantida.
A variabilidade genética do RABV em populações de hospedeiros é
determinada durante o tempo, e estas mudanças ocorrem
independentemente em diferentes áreas geográficas (Bourhy et al., 1999),
gerando as linhagens características das espécies hospedeiras. Um
exemplo deste fato é a menor identidade genética encontrada nas
linhagens isoladas em bovinos e eqüínos e transmitidas pelo D. rotundus
nas áreas RD1 quando comparadas com as das áreas RD2 e RD3, que
provavelmente tem origem diferente, seja pela introdução de um vetor (o D.
rotundus) de colônia diferente e de outra área, ou mesmo, como produto de
mutação, como discutido anteriormente. Entretanto, a Figura 39 evidencia
pontos da nucleoproteína N, inferida pelo sequenciamento do gene N, que
são assinaturas específicas das áreas RD1 e RD2/RD3 e isto representa
seleção positiva (mutação não-sinônima), o que leva a acreditar que as
linhagens estudadas, tanto das áreas RD1 como das RD2 e RD3 possuem
diferentes ancestrais. Os dois pontos de mutação no gene N, responsáveis
pelas duas mutações são: Timina122Citosina (Asparagina na área RD1 e
consenso brasileiro e Histidina na área RD2) e Adenina207Citosina
(Tirosina na área RD1 e Fenilananina na área RD2 e consenso braileiro).
149
A pequena diversidade genética do RABV pode ser determinada por
recente “bottleneck” ou a pequena variedade de espécies hospedeiras (ou
indivíduos) na região epidêmica (Smith, 2002). Este não é o caso da área
da epidemia 1997-2002, pois a raiva é endêmica na região há tempos como
relatado no trabalho de Gomes (2008), excluindo a possibilidade de recente
“bottleneck”. O grande número de indivíduos é diretamente proporcional ao
grande número de colônias identificadas de D. rotundus nas áreas
estudadas, como mostra a Tabela 10. Este fator permite a manutenção da
variação genotípica do vírus. Aliado a estes fatos um mesmo hospedeiro
pode possuir, e conseqüentemente inocular, várias linhagens,
representadas pelas quasiespécies (Kissi et al., 1999), aumentando assim
a probabilidade de conservação da variação genotípica do RABV.
Como as linhagens são perpetuadas por espécies que atuam como
reservatório regional do vírus (Rupprechet, Hanlon, Hemachuda, 2002) a
homologia entre as linhagens permanece estável, possibilitando o estudo
dos padrões genéticos da infecção (Nadim-Davis, Muldoon, Wandeler,
2006). Por exemplo, a seleção negativa estabiliza o gene N pelo aumento
da taxa de mutações neutras (sinônimas) em populações geograficamente
distintas do vírus e o acúmulo de mutações silenciosas (sinônimas) é,
provavelmente, a fonte de divergência genotípica encontrada nas
populações do vírus (Kissi, Tordo, Bourhy, 1995). Porém, técnicas
moleculares não são suficientemente precisas para compreender a raiva
epidêmica e, neste caso, as evidências epidemiológicas são necessárias
(Bingham et al., 1999), e estas foram apresentadas no estudo.
Com o objetivo de esclarecer a epidemiologia da raiva entre os
bovinos e outros animais de interesse econômico, o presente estudo
comparou a identidade genética do gene N e da área amino terminal do
gene G de isolados do RABV. Os valores de identidade genética obtidos
indicam que há grande identidade entre as populações do RABV isolados
de gado e típicos de D. rotundus, mesmo entre as das áreas RD1 e
RD2/RD3.
Tomando por base diferentes observações encontradas em NadinDavis (2007), alguns pontos do trabalho são discutidos para justificar os
resultados. A identificação de assinaturas específicas entre as linhagens
estudadas demonstra que a análise molecular apresentada é consistente e,
assim, os marcadores específicos do RABV de cada linhagem podem ser
usados para distinguir as populações do RABV das áreas RD1 e RD2/RD3.
A utilização de toda região codante do gene N e mais da metade da do
gene G determina grande robustez à análise das linhagens. Quanto maior a
seqüência maior o número de sítios informativos e dá maior respaldo para a
150
árvore filogenética gerada pelo método de Distância Neighbor-joining (NJ) e
construída com o modelo de substituição GTR (para o gene N) e o modelo
de substituição TVM (para o gene G), incluindo o parâmetro de distribuição
Gamma com sítios invariáveis, de acordo com o modelo de substituição
selecionado pelo software Modeltest 3.6 e, também, pelos testes
estatísticos de confiabilidade (expressos pelo bootstrap). Quanto à seleção
de amostras utilizadas, que para análises de epidemiologia molecular
devem permitir comparações em relação ao tempo e espaço, deve-se evitar
a escolha de amostras provenientes de vigilância passiva, como as
analizadas, pois podem gerar tendências na análise filogenética. Amostras
provenientes de vigilância passiva são, normalmente, relacionadas a um
evento no tempo e espaço e não representam a realidade ecológica do
RABV na área estudada. Apesar das nossas amostras serem provenientes
de vigilância passiva, elas se distribuem dentro de uma grande área, como
também foram escolhidas aleatoriamente dentro do conjunto total de
amostras. As características precedentes fazem com que a tendência de
representar uma única situação dentro da epidemiologia da raiva na região
estudada diminua. Quanto ao período analisado (1997-2002), não foi
aleatório, é diretamente relacionado à disponibilidade de um número
significativo de amostras e que é diretamente relacionado ao período da
epidemia 1997-2002.
A pesquisa molecular do RABV, realizada pelo estudo dos genes N e
G utilizando métodos de análise filogenética baseados em distância e
associado a dados epidemiológicos, pode resolver uma análise de
identidade genética ou evolutiva de forma tão eficiente como os métodos de
máxima parcimônia e máxima verossimilhança, com a vantagem de ser um
método computacionalmente rápido (Smith, 2002). Além destes fatos, a
escolha do método de distância NJ se deve ao fato de ter sido analisado
um número de seqüências volumoso como, por exemplo, o encontrado na
árvore filogenética do gene N apresentada na Figura 33, que possui
incorporada 198 seqüências com 1320 nt de extensão, impossibilitando que
inferências realizadas pelo método de verossimilhança fossem realizados.
O uso do software DAMBE (Xia e Xie, 2001), utilizado para análise de
dados obtidos em biologia molecular e evolução, assegurou que o sinal
filogenético das seqüências genéticas geradas neste trabalho é informativo
em relação ao processo evolucionário que as gerou. O uso de DAMBE
neste trabalho se baseou no lançamento dos valores de transições e
transversões versus distância genética. O uso do software foi importante
porque exibe graficamente transições e transversões e calcula a
divergência. Foi utilizado na geração deste resultado o modelo de evolução
molecular F84 (Felsenstein, 1993), que possui dois parâmetros (transição e
151
transversão) e é baseado em distância. Com o Modelo F84 tornou-se
possível combinar as diferenças nas taxas de transição e transversão,
representado pela freqüência de pirimidinas e purinas (Xia e Xie, 2001), e
frequência desigual de bases em uma única estatística, ô que permite o
estudo de um modelo de evolução mais realístico para as seqüências de
DNA. Hanada, Suzuki e Gojobori (2004) e David et al. (2007) fizeram uso
do software DAMBE obtendo resultados concordantes com os dados
epidemiológicos associados as suas pesquisas. Os primeiros estudaram os
vírus RNA de maneira geral e os segundos o RABV.
A análise do gene N, quer com base no seu seqüenciamento parcial
ou total, permite os mais significativos agrupamentos de linhagens
semelhantes e, portanto, é o mais adequado para uma abordagem de
epidemiologia molecular da raiva, além do fato de ser o mais conservado
evolutivamente (Smith, 2002).
É consenso que o estudo do gene G é necessário, devido a sua
direta relação com as atividades biológicas do vírus, como resposta imune
do hospedeiro e reconhecimento dos receptores celulares, entre tantas
outras. Badrane et al. (2001), indo além, relaciona as variações de aa da
Glicoproteína G com a emergência de novos Lyssavirus no ambiente, pois
podem permitir adaptações a novos hospedeiros.
Os resultados apresentados da tipificação genética do RABV isolados
de bovinos e eqüinos nas áreas RD1, RD2 e RD3 do Estado de São Paulo,
são concordantes com trabalhos de outros autores, como por exemplo, Ito
et al. (2003), Shoji et al. (2004) e Kobayashi et al. (2005), mesmo que as
interpretações dos dados não sejam totalmente concordantes.
Quanto a análise do gene N da nucleoproteína N das linhagens AgV3
do RABV, os trabalhos de Ito et al. (2003), Shoji et al. (2004), Kobayashi et
al. (2005) e Kobayashi et al. (2007), que estudaram toda região codante do
gene N de linhagens de diferentes áreas do Brasil, inclusive de São Paulo,
obtiveram agrupamentos regionais, como as das áreas RD1, RD2 e RD3.
Analisando detalhadamente os dados dos trabalhos citados acima, se
constata a grande identidade entre as linhagens estudadas. Estas
identidades das linhagens AgV3 são semelhantes às apresentadas neste
trabalho, isto é, raramente ultrapassam 2% de divergência. Nos mesmos
trabalhos, os resultados relacionados aos morcegos do gênero Artibeus e,
também, em relação aos morcegos insetívoros, também foram semelhantes
aos apresentados. As linhagens AgV3 isoladas no gênero Artibeus
possuem a mesma identidade das de D. rotundus e bovinos. Quanto às
linhagens isoladas em morcegos insetívoros, elas são divergentes em
152
relação às linhagens AgV3, porém algumas linhagens recuperadas do
GenBank de morcegos insetívoros e também utilizadas neste estudo,
segregaram entre as linhagens AgV3 isoladas nos bovinos e eqüínos
estudados. Este resultado indica que morcegos insetívoros podem ser
infectados por D. rotundus.
Os estudos da área N-terminal do gene N de Ito et al. (2001),
Kobayashi et al. (2006) e Kobayashi et al. (2008) também são concordantes
com os estudos realizados. Apesar de não haver concordância quanto aos
valores de identidade (os nossos são superiores) é bom recordar que as
extremidades N-terminal e C-terminal do gene N possui maior variabilidade
genética que a região central (Kissi, Tordo, Bourhy, 1995; Delmas et al.,
2008). No mesmo contexto se situa o trabalho de Velasco-Villa et al.
(2006), que analisa a região C-terminal do gene N de RABV isolados de
bovinos e D. rotundus e outros animais no México. Apesar de duas
variantes antigênicas (AgV3 e AgV11) do RABV circularem na população
de D. rotundus e bovinos no México, é nítido que a identidade do RABV
AgV3 daquele país também é alta, como as identidades encontradas no
Brasil.
O motivo pelo qual as identidades entre as linhagens AgV3
estudadas se mostraram tão altas é conseqüência da sua origem
epidêmica. Porém, as identidades destas linhagens AgV3 são concordantes
com os autores anteriormente citados e que estudaram linhagens de
diversos Estados brasileiros (e do México).
No trabalho de Heinemann et al. (2002), que estudaram a área Nterminal do gene N de linhagens AgV3 isoladas em grande parte de
bovinos, na área epidêmica e do sul do Estado de São Paulo (Figura 34),
foram obtidos os resultados mais próximos dos apresentados. Heinemann
et al. (2002) concluem que as divergências existentes ("nucleotide
variabiliy”) entre as linhagens RABV AgV3 é produto de deriva genética, ou
seja, ao acaso. Outro fator, raramente mencionado e que pode gerar
divergências entre linhagens genéticas, é o viés ou tendência que ocorre
durante a geração, edição e análise de seqüências genéticas.
Guarino et al. (2008) analisando parcialmente o gene N de linhagens
AgV3 do Uruguai, isoladas de bovinos e eqüinos em 2007 e 2008,
obtiveram 100% de identidade entre elas e quando comparadas com
linhagens do Norte do Brasil foi obtido 98,4% de identidade. Bordignon et
al. (2005), analisando o gene N de linhagens AgV3 do RABV isoladas de
bovinos no Sul do Brasil, e Cisterna et al. (2005), realizando o mesmo tipo
de análise na Argentina e utilizando linhagens isoladas entre os anos de
153
1999 e 2001, obtiveram resultados semelhantes aos apresentados neste
trabalho. Estes resultados sugerem que o gene N das linhagens AgV3 da
área Atlântica da América do Sul é muito conservado, indicando que as
linhagens do RABV circulantes entre D. rotundus são adaptadas e
selecionadas em elevado grau por esta espécie;
É provável que a manutenção desta alta identidade do gene N em
linhagens AgV3 ocorra a longo tempo. Holmes et al. (2002) afirmam que o
gene N do RABV evolui sob um modelo de seleção purificadora, isto é,
mantendo a identidade ao longo do tempo, pois as funções da
nucleoproteína N o mantém restringido (“constrained”).
Para a comparação dos resultados obtidos em relação ao gene G da
glicoproteína G são utilizados dois trabalhos de Sato et al. (2004 e 2006). O
primeiro, estuda toda região codante do gene G de linhagens AgV3
isoladas nos Estados de São Paulo, Mato Grosso, Tocantins e Goiás. O
segundo, estuda a mesma área do gene G analisada neste trabalho (os
primers para o gene G aqui utilizados são os publicados em Sato et al,
2006) e são analizadas linhagens AgV3 isoladas em vários Estados do
Brasil das regiões Sudoeste, Centro-Oeste e também do Nordeste. Os
resultados de Sato et al. (2004 e 2006) apresentaram resultados
semelhantes aos do presente trabalho, isto é, as amostras AgV3
permanecem com identidade acima de 98% e formando agrupamentos
regionais. Estes resultados relacionados ao gene G da glicoproteína
chamam a atenção pelo fato do gene G também se mostrar conservado,
porém menos que o gene N, como pode ser observado nas figuras 37 e 38.
Em Wu et al. (2007), que reafirmam a menor conservação do gene G
em relação ao gene N, é discutido o valor dos genes N e G em análises
filogenéticas. Os autores afirmam que a taxa de substituição de nt dos
genes N e G são semelhantes e, sendo assim, ambos (como também os
outros genes) tem, provavelmente, o mesmo valor para análises
filogenéticas.
Neste contexto é interessante comentar o trabalho de Kobayashi et
al. (2007), que estudando os genes P e M do RABV, também obtiveram
agrupamento de linhagens AgV3, isoladas de D. rotundus e do gênero
Artibeus, com grande identidade entre si, indicando que mesmo estes dois
genes, pelo menos entre as linhagens AgV3, também são muito
conservados.
Analisando os artigos relativos a estudos moleculares do RABV no
Brasil, percebe-se que todos sugerem o isolamento geográfico de
populações do vírus, por cadeias de montanhas ou rios, como fator
154
determinante para a diversificação das linhagens AgV3. Sem eliminar a
importância destas barreiras geográficas para a diversificação genética do
RABV, pois é consenso geral, os resultados deste trabalho não permitem
que se concorde com esta origem de diversificação, pelo menos em relação
à área epidemica estudada (e nela encontramos rios e montanhas).
Inicialmente, quirópteros voam e este fato permite que distâncias e
barreiras geográficas sejam facilmente superadas, o que para outras
espécies, como canídeos, pode ser difícil. D. rotundus pode se deslocar
diariamente dezenas de quilômetros para se alimentar, sua área de ação
(“home-range”) é de 10-20 km2 (Arellano-Sota, 1988). Montanhas com
pouco mais de 2000 m de altura não são obstáculos para morcegos e nem
rios.
No Brasil, a Serra da Mantiqueira é a mais alta, e suas maiores
altitudes raramente ultrapassam 2000 m. É nesta região que as linhagens
do RABV estudadas foram isoladas. As áreas RD2 e RD3 do Estado de
São Paulo, vizinhas ao Estado de Minas Gerais, é uma região alta da Serra
da Mantiqueira e o RABV circulou facilmente e com uma velocidade maior
daquelas citadas em artigos clássicos sobre o assunto, como os de
Delpietro e Russo (1996) e Fornes et al. (1974). Algumas linhagens
estudadas são de cidades de Minas Gerais (ver Tabela 15), “do outro lado
da serra”, vizinhas das áreas RD2 e RD3 e a identidade destas linhagens é
similar às de São Paulo, motivo pelo qual estas linhagens pertencem aos
mesmos agrupamentos filogenéticos das áreas RD2 e RD3. Este resultado
sugere que o RABV circulou entre os dois Estados. Os mesmos resultados
também foram obtidos em relação aos Estados de São Paulo e Rio de
Janeiro.
Quanto a isolamentos geográficos do RABV AgV3 determinados por
rios é difícil concordar, pois o Brasil possui a maior rede fluvial do planeta,
formada por grandes rios, e encontramos o RABV que circula na população
de D. rotundus em todo o país (ver Figuras 12 e 13), demonstrando que,
pelo menos para quirópteros, rios não são barreiras geográficas. Em
verdade, na América do Sul, somente é encontrada uma barreira geográfica
que impede eficientemente a dispersão do RABV, a Cordilheira dos Andes.
Uma afirmação expressa em Kobayashi et al. (2006) e Kobayashi et
al. (2008), a qual os resultados obtidos também não permitem
concordância, é que a raiva transmitida pelo D. rotundus se propaga
através e em direção às terras de baixa altitude (e lembramos que são
nestas áreas onde há as melhores pastagens devido à umidade). As
regiões RD2 e RD3 são áreas de serra, como também o é boa parte da
155
área RD1, e a epidemia 1997-2002 analisada ficou circunscrita às áreas de
elevada altitude, não se propagando para as áreas vizinhas, de baixa
altitude e encontradas na maior parte do Estado de São Paulo.
Os artigos de Cunha et al. (2006) e Albas et al. (2005) provam que a
epidemia 1997-2002 ficou circunscrita as áreas serranas e que não houve
falta de vigilância epidemiológica da raiva no Estado de São Paulo. Cunha
et al. (2006) diagnosticaram 7.393 morcegos provenientes de 235
municípios do norte e noroeste do Estado de São Paulo, no período de
1997 a 2002. Os autores encontraram 1,3% de positividade (98 animais
positivos) e não foi encontrado nenhum D. rotundus positivo. Albas et al.
(2005) diagnosticaram 4950 amostras de diferentes animais, coletadas
entre 1996 e 2003 na região oeste do Estado de São Paulo e, entre o total,
identificaram o RABV em 74 amostras, sendo 58 (78,4%) em morcegos
não-hematófagos e 16 (21,6%) em bovinos. Ou seja, nas grandes áreas do
Estado de São Paulo analisadas pelos autores no mesmo período da
epidemia 1997-2002 não houve surto epidemico.
Outro trabalho que confirma a área de abrangência da epidemia
1997-2002 é o de Gomes et al. (2007), que utilizando dados georeferenciados e dados da Coordenadoria de Defesa Agropecuária da
Secretaria de Agricultura e Abastecimento do Estado de São Paulo (órgão
responsável pelo controle populacional do D. rotundus) afirmam que a
distribuição espacial dos abrigos dos morcegos é difuso e uma epidemia
pode tomar caminhos difusos, como a epidemia que se desenvolveu na
região da Serra da Mantiqueira. Observação: a epidemia da Serra da
Mantiqueira, a qual se refere os autores, é a mesma das áreas estudadas
neste trabalho. No mesmo artigo os autores concluem que o deslocamento
do D. rotundus se faz em direção à sua fonte de alimento, isto é, o gado,
como também é proposto por Delpietro e Russo, (1996).
Silva et al. (2001) sugerem o uso da terra como determinante da
distribuição da raiva bovina em Minas Gerais, Brasil. Gomes (2008) vai
além e sugere que a raiva bovina para São Paulo se estrutura em torno de
quatro grupos: (1) o relêvo e geomorfologia; (2) as características
relacionadas ao efetivo bovino no contexto do sistema de produção
pecuário; (3) as características dinâmicas do mosaico da paisagem
identificadas a partir da evolução dos tipos de uso e classes de cobertura
da terra e (4) ainda, os elementos relacionados a hidrografia e são as interrelações entre os elementos em cada um destes grupos que estão
participando na história natural da enfermidade e determinando as
mudanças observadas nos padrões espaciais das epidemias. O mesmo
autor ainda cita áreas com grande propensão a epidemias, entre elas a
156
estudada neste trabalho e são elas: a divisa estadual de São Paulo com o
estado de Minas Gerais e do Rio de Janeiro, as regiões das encostas no
interior e os Vales do Paraíba e Ribeira.
Delpietro e Russo (1996) afirmam que a duração de uma epidemia,
em geral, dura 18 meses. Os mesmos autores afirmam que epidemias de
raiva entre bovinos são dependentes do número de D. rotundus infectados
e ativos, o que é muito lógico. A população destes animais diminuindo, pela
infecção do RABV, cessa a epidemia; a população de D. rotundus
aumentando, no interstício entre epidemias, desencadeia o início de nova
epidemia. O que chama a atenção é que a epidemia 1997-2002
permaneceu durante cinco anos e somente o deslocamento geográfico da
intensidade foi variável. A epidemia estudada neste trabalho não seguiu o
padrão de ondas proposto por Delpietro e Russo (1996).
Uma constatação, que há comum acordo entre os pesquisadores da
raiva em bovinos, é o fato de que o comportamento de D. rotundus pode
explicar a abrangência da raiva propagada por esta espécie, porém pouco
é conhecido da etologia deste animal em relação à raiva. Equipes
multidisciplinares poderão elucidar muitas dúvidas após um período
adequado de estudo, em relação aos quirópteros e, também, a outros
animais silvestres. Romijn et al. (2003) sugere que somente monitorar
casos de raiva de uma região não auxilia muito a epidemiologia da doença
ou seu controle, pois também é necessário relacionar estudos de dispersão
e dinâmica da doença, rotas do D. rotundus, seus abrigos e presença de
alimento.
Atualmente, muito se fala das alterações ambientais como uma das
causas mais prováveis da existência da raiva em bovinos transmitida por D.
rotundus (Mayen, 2003), porém, as áreas aqui estudadas estão se
urbanizando desde o final do século XIX, principalmente devido ao cultivo
do café. Carini (1911) estudou a raiva entre animais de interesse
econômico no Estado de Santa Catarina e naquela época o meio ambiente
estava praticamente inalterado pela ação humana. Halpin et al. (2007),
observam que o estudo das infecções, como por exemplo, a raiva em
morcegos, associadas à ecologia, encontra-se na sua fase infantil.
Silva et al. (2001), analisando a raiva em Minas Gerais, escrevem
“...a raiva bovina é mais associada às lavouras permanentes e temporárias,
às pastagens naturais e plantadas e ao efetivo bovino, e menos associada
às matas naturais e plantadas, às lavouras em descanso e às terras
produtivas não utilizadas...as transformações antrópicas no espaço agrário,
especialmente no uso da terra, influenciaram de modo determinante a
157
distribuição espacial e temporal da raiva bovina em Minas Gerais”... Em
Minas Gerais, a concentração de bovinos associado à substituição de
matas naturais, em especial à de cerrado, por grandes extensões de
pastagens, propicia alimentação abundante e de fácil acesso às colônias de
morcegos hematófagos, conseqüentemente favorecendo a transmissão da
raiva entre as diversas espécies de quirópteros... A substituição das matas
naturais por lavouras e pastagens e a construção de uma grande
diversidade de estruturas como habitações, túneis, minas, fornos para
carvão, pontes e bueiros sob rodovias, que são proporcionadas, também,
pelos projetos de desenvolvimento agropecuário, imprimem profundas
mudanças ecológicas e sócio-econômicas”.
A vacinação entre bovinos no Brasil não é regular e é pequena e este
fato pode ter sido a origem da epidemia 1997-2002. Nogueira (2003), cita
que no Estado de São Paulo 210 mil animais foram vacinados em 1999,
400 mil em 2000, 2 milhões e setecentos mil em 2001 e 3 milhões e 900 mil
em 2002. Peres (2009), após minuciosa análise dos dados epidemiológicos
relacionados aos casos de raiva no Estado de São Paulo no período de
1997-2007, afirma que o controle da epidemia 1997-2002 obteve êxito após
a vacinação dos bovinos e eqüinos da área epidêmica e o concomitante
contrôle populacional de D. rotundus.
Um fato que chama atenção é o descrito por Menezes et al. (2008).
Os autores estudando a situação epidemiológica do Estado de Minas
Gerais descrevem uma redução constante nos casos de raiva e municípios
com casos positivos no Estado, entre 1998 e 2006, inclusive nos municípios
vizinhos as áreas RD1, RD2 e RD3. Em 1998, 1999, 2000, 2001 e 2002 o
Estado contabilizou 586, 476, 443, 246 e 306 casos de raiva em 180, 167,
150, 90 e 118 municípios, respectivamente. Esta descrição é intrigante,
pois no momento em que os casos de raiva diminuíam em Minas Gerais,
em São Paulo aumentavam. A relação filogenética entre as linhagens da
área epidemica de São Paulo com as de Minas Gerais ainda é
indeterminada e devem ser a próxima etapa para entender a relação
filogeográfica do RABV nestes dois estados brasileiros.
A epidemia estudada contraria muitas afirmações correntes, como
por exemplo, “a emergência e duração de raiva entre bovinos de uma
região dura, em média, 18 meses e cessa repentinamente”; “estas
epidemias se caracterizam por perturbação ecológica seguida da
introdução de bovinos”. Estes dados como outros apontados anteriormente,
devem ser reavaliados, pois os resultados deste estudo sugerem outras
hipóteses.
158
No Brasil a raiva entre D. rotundus é endêmica. A população deste
animal necessita ser controlada por meios ecológicos eficientes e novos
métodos de vacinação, como o sugerido por Almeida et al. (2008), devem
ser continuamente pesquisados. A vacinação dos herbívoros de criação
deve ser realizada amplamente e o Estado brasileiro deve estimulá-la
através de campanhas educativas.
159
6.Conclusões
As análises dos resultados deste trabalho permitem expressar, pelo
menos sete conclusões:
1-
A área RD1 é produto da expansão da área endêmica do
Estado de São Paulo.
2-
A menor identidade encontrada entre as linhagens da área
RD1 quando comparada com as linhagens das áreas RD2 e
RD3 indica que, provavelmente, as epidemias destas áreas
tiveram origens distintas.
3-
A área RD3 é uma expansão da área RD2.
4-
As análises das linhagens do RABV AgV3 estudadas permite
afirmar que um conjunto de linhagens AgV3 (Subclado
“Antigas”), semelhantes às linhagens de RD1, circulavam
em São Paulo anteriormente ao ano de 1998 e foram
substituídas, a partir deste ano, pelas linhagens das áreas
RD2 e RD3.
5-
A origem das linhagens RD2/RD3 é indeterminada.
6-
A epidemia 1997-2002 foi decorrente da falta de vacinação dos
animais envolvidos, pois com o incremento de vacinação a
epidemia cessou.
7-
A conclusão geral e mais importante dos resultados deste
trabalho é afirmar que as linhagens AgV3 que circulam
entre D. rotundus no Brasil são muito conservadas em
relação ao tempo e ao espaço.
160
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Anexos
Seqüências putativas da nucleoproteína N e da glicoproteína G do
RABV
PV
Consenso BR
97BI455E
97CP870E
97GU3919B
97JA633B
97MG1284B
97MG2439B
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99SO1989B
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99SO3951B
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99SO4114B
99SO4672B
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00BR5402B
20
30
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192
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193
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194
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Figura 41: Comparação das seqüências de amino ácidos alinhados e
deduzidos a partir das seqüências genéticas do gene da N da
nucleoproteína das linhagens do RABV AgV3 estudada. Os amino ácidos
das colunas em tom cinza são aqueles encontrados em todas as linhagens
e, portanto, são assinaturas genéticas. A seqüência Consenso BR está em
vermelho. O nome das seqüências da área RD1 é mostrado em cor verde e
os amino ácidos que caracterizam estas seqüências, as assinaturas da
área RD1, estão circundados também em verde. A numeração da primeira
linha da figura se refere ao número da posição do amino ácido em relação
à amostra fixa Pasteur Virus.
195
PV
Consenso BR
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00MO210E
00MO756B
00NA3299B
00PE312B
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00PI776B
00PN3141B
00SO4553B
00VA1040B
00VA4631B
00VA555E
00VA788B
01AM1064B
01CA142B
01CA1501B
01ES7518B
01IP40B
01IT4693E
01MC7792B
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10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
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196
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110
120
130
140
150
160
170
180
190
200
....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|
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........I......................Q...................I.............K..........K.L.IT..................
197
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220
230
240
250
260
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Figura 42: Comparação das seqüências de amino ácidos alinhados e
deduzidos a partir das seqüências genéticas do gene da Glicoproteína G
das linhagens do RABV AgV3 estudadas. Os amino ácidos das colunas em
tom cinza são aqueles encontrados em todas as linhagens e, portanto, são
assinaturas genéticas. A seqüência Consenso BR está em vermelho. A
numeração da primeira linha da figura se refere ao número da posição do
amino ácido em relação à amostra fixa Pasteur Virus.
198
Protocolos das Reações de Material e Métodos
CUIDADOS: fazer uso de cabines de fluxo laminar e utilizar controles
positivo e negativo. Para todas as reações utilizar tubos e ponteiras com
filtro RNase e DNase free.
Extração de RNA
Insumos: Trizol® (Invitrogen), clorofórmio, álcool isopropil, etanol 75%, água
ultra pura DNAse, RNAse free.
Aplicação da Técnica
Aplicar a técnica de acordo com as instruções do fabricante.
1. Macerar e picotar o material do qual se deseja extrair o RNA com
bisturi estéril e descartável.
2. Após a maceração colocar a amostra em tubos de 1,5mL,
acrescentando 1mL de Trizol®.
3. Agitar vigorasamente por aproximadamente 20 segundos e deixar à
temperatura ambiente por 05 minutos.
4. Acrescentar 200µL de clorofórmio.
5. Agitar vigorasamente.
6. Centrifugar por 15 minutos a 12000g na temperatura de 4°C.
7. Após esta centrifugação passar a fase aquosa para outro tubo de
1,5mL.
8. Acrescentar álcool isopropil, no mesmo volume da fase aquosa.
9. Agitar vigorasamente e deixar a temperatura ambiente por 10
minutos.
10. Centrifugar por 10 minutos a 12000g/4°C.
11. Após a centrifugação remover o sobrenadante.
12. Após a remoção do sobrenadante, acrescentar 1mL de etanol a 75%.
13. Agitar vigorasamente e centrifugar por 10 minutos a 7000g/4°C.
199
14. Após a centrifugação descartar o etanol e secar o conteúdo.
15. Após a secagem ressuspender o RNA final em 25µL de água
DNAse/RNAse free e deixar em banho Maria seco por 10 minutos à
56°C.
16. “Spin” e guardar a -80°C até o momento do uso.
Transcrição Reversa (RT)
Insumos: 5X First Strand Buffer, oligonucleotídeos (dNTP 10Mm), 1,4Dithiothreitol (DTT), SuperScript II Reverse Transcriptase, primers senso e
antisenso, água RNase e DNase free, RNaseOUT, todos da marca
INVITROGEN.
Aplicação da Técnica
Aplicar a técnica de acordo com as instruções do fabricante.
 Identificar os tubos de 0,5mL para cada amostra a ser testada.
 Descongelar todos os reagentes em gelo.
 Agitar vigorasamente e dar spin em cada um dos reagentes.
 Fazer um mix de todos os reagentes utilizados na reação para um
total de amostras testadas, seguindo o quadro abaixo:
Reagente
Volume em µL por amostra
5x First Strand Buffer
8
dNTPs 10 mM
6
DTT
4
Transcriptase reversa
1
Primer senso
5
Primer antisenso
5
Água
12
RNaseOUT
1
Total de MIX
42
RNA
5
 Distribuir 42µL do mix de reagente em cada tubo de amostra a ser
testada e em seguida acrescentar 5µL do RNA extraído de cada
amostra.
200
 Dar spin em cada tubo e levar ao termociclador submetendo a uma
ciclagem de 42ºC por 1 hora.
 Em seguida utilizar o cDNA produzido para o PCR ou guardar as
reações a 4ºC até o momento de uso.
Reação em cadeia pela polimerase (PCR)
Insumos: dNTPs à 1,25 mmolar, água ultra pura DNAse/RNAse free, primers
senso e anti-senso, Taq DNA-polimerase (INVITROGEN), 10x PCR Buffer e
cloreto de magnésio (MgCl2).
Aplicação da Técnica
Aplicar a técnica de acordo com as instruções do fabricante.
 Identificar os tubos de 0,5mL para cada amostra a ser testada.
 Descongelar todos os reagentes em gelo.
 Agitar vigorasamente e dar spin em cada um dos reagentes utilizados
na reação de PCR.
 Fazer um mix de todos os reagentes utilizadas na reação para um
total de amostras testadas, seguindo o quadro abaixo:
Reagente
Volume em µL
10x PCR Buffer
10
dNTPs 1,25 mM
16
Primer senso
5
Primer anti-senso
5
MgCl2
5
Taq DNA-polimerase
0,5
Água ultra-pura
50,5
Total de MIX
92
cDNA
10
 Distribuir 92µL do mix de reagente em cada tubo de amostra a ser
testada e em seguida acrescentar 10µL do cDNA de cada amostra.
 Levar ao termociclador programado com os seguintes ciclos:
201
Ciclo
Denaturação
Amplificação – 35x
Extensão final
Conservação
Temperatura/Tempo
95ºC/ 5 min
94ºC/ 45 seg - denaturação
55ºC/ 45 seg - anelamento
72ºC/ 2 min - extensão
72ºC/ 10 min
10ºC
 Após a termociclagem, manter a -20ºC até o uso.
Eletroforese
Insumos: Agarose (INVITROGEN); Brometo de etídio (INVITROGEN);
Tampão Tris-Borato EDTA (TBE); Água DNase e RNase free; Peso
molecular (MW) 100 pares de bases (PB) (INVITROGEN); 10X Blue Juice
Gel Loading Buffer (INVITROGEN).
Referência: Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning: a
Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory, New York,
1989.
Gel de agarose
 Pesar 1g de agarose e adicionar em 100mL de TBE (gel de agarose a
1%), aquecer a mistura até dissolver a agarose. Adicionar a mistura
na forma com espaçadores da cuba eletrorética e deixar em
temperatura ambiente até a solidificação da agarose.
 Preencher a cuba eletroforética com tampão TBE e dissolver 20µL de
Brometo de etídio no tampão da cuba. Colocar a forma com o gel
solidificado dentro da cuba.
 Pipetar 08µL do produto do PCR descongelado mais 2 µL de 10X
Blue Juice Gel Loading Buffer e adicionar no poço do gel de agarose.
 Adicionar 5µL de peso molecular 100pb em um dos poços.
 Ligar os fios da cuba eletroforética até a fonte eletroforética
programada para corrida de 1 hora a 110 Volts. Após este tempo
observar o resultado da corrida eletroforética em transluminador de
UV.
202
CUIDADOS: O brometo de etídio é carcinogênico e seu uso e descarte
devem seguir as normas adequadas. Toda a técnica tem que ser realizada
somente na sala de eletroforese, evitando contaminações com produtos do
PCR.
Purificação direto do produto do PCR utilizando o kit GFXTM PCR DNA
and GEL Band Purification Kit
Insumos: Tampão de captura (capture Buffer), tampão de lavagem (Wash
Buffer) e tampão de eluição (Elution Buffer – EB) presentes no kit GFXTM
PCR DNA and Gel Band Purification Kit (General Motors Healthcare).
Aplicação da Técnica:
Aplicar a técnica de acordo com as instruções do fabricante.
 Descongelar o produto de PCR.
 Adicionar no máximo 100µL do produto de PCR em tubo de 1,5µL e
adicionar 500µL de Capture Buffer, misturar com a ponteira de 4 a 6
vezes.
 Transferir a mistura para coluna (presente no kit) já dentro do tubo
coletor (também presentes no kit).
 Centrifugar por 30 segundos a 14000g.
 Descartar o material do tubo coletor (cuidado para não encostar o
liquido na parte final da coluna interna), voltar a coluna para o tubo
coletor e acrescentar 500µL de Wash Buffer.
 Centrifugar por 30 segundos a 14000g.
 Descartar o tubo coletor e colocar a coluna no tubo de 1,5mL novo
com identificação da amostra.
 Para eluir o DNA da coluna, acrescentar de 50 a 10µL de Elution
Buffer - EB (quantidade depende da concentração de DNA na
amostra e é subjetivo- bandas fortes mais EB, bandas fracas menos
EB), manter por 1minuto a temperatura ambiente e centrifugar por
1minuto a 14000g.
 Descartar a coluna e fechar o tubo contendo o DNA purificado.
203
CUIDADOS: Toda a técnica tem que ser realizada somente na sala de
eletroforese.
Purificação do produto do PCR à partir do gel utilizando o kit GFXTM
PCR DNA and GEL Band Purification Kit
*Utilizar em caso de identificação de banda espúria no produto de PCR.
Insumos: Tampão de captura (capture Buffer), tampão de lavagem (Wash
Buffer), tampão de eluição (Elution Buffer - EB) presentes no kit GFXTM
PCR DNA and Gel Band Purification Kit ((General Motors Healthcare);
agarose; tampão tris-borato EDTA (TBE); água DNase e RNase free; peso
molecular 100 pares de base (pb); low DNA mass ladder; 10X Blue Juice gel
loading buffer.
Aplicar a técnica de acordo com as instruções do fabricante.
Purificação
 Pesar tubos para micro centrífuga de 1.5mL de capacidade e anotar
seu peso.
 Recortar o pedaço do gel de agarose contendo a banda a ser
purificada e colocá-los nos tubos para microcentrífuga de 1.5mL já
pesados e identificados. Pesar os tubos novamente para obter o peso
do pedaço de gel recortado.
 Acrescentar o tampão de captura em cada tubo, na proporção de
10µL para cada 10mg de gel.
 Fechar o tubo e agitar vigorosamente. Incubar a 60°C, em banho seco
em bloco até a agarose se dissolver por completo (5-15 minutos).
 Durante a incubação, acondicionar a coluna (presente no kit) no tubo
coletor (também presente no kit), com a identificação da amostra a
ser utilizada.
 Após a completa dissolução da agarose, centrifugar o tubo
rapidamente em microcentrífuga e transferir a amostra do tubo para a
coluna, já dentro do tubo coletor. Incubar a temperatura ambiente por
1 minuto.
 Centrifugar por 30 segundos a 14000g.
204
 Descartar o material do tubo coletor (cuidado para não encostar o
líquido na parte final da coluna), voltar a coluna para o tubo coletor e
acrescentar 500µL de Wash Buffer .
 Centrifugar por 30 segundos a 14000g.
 Descartar o tubo coletor e colocar a coluna em um novo tubo de
1.5mL identificado.
 Para eluir o DNA da coluna, acrescentar de 50 a 10µL de tampão EB
(depende da concentração de DNA na amostra), deixar por 1 minuto a
temperatura ambiente e centrifugar por 1minuto a 14000g.
 Descartar a coluna e fechar o tubo contendo o DNA purificado.
CUIDADOS: Toda a técnica tem que ser realizada na sala de eletroforese,
para evitar contaminação por DNA. O brometo de etídio é carcinogênico.
Quantificação do DNA purificado realizado através do uso de Low DNA
mass ladder
Insumos: Agarose; tampão tris-borato EDTA (TBE); água DNase e RNase
free; low DNA mass ladder (INVITROGEN); 10X Blue Juice gel loading
buffer.
Aplicação da Técnica
Aplicar a técnica de acordo com as instruções do fabricante.
 Pesar 1 grama de agarose e adicionar em 50 mililitros de TBE (gel de
agarose a 2%), aquecer a mistura até dissolver a agarose. Adicionar a
mistura na forma com espaçadores da cuba eletrorética e deixar em
temperatura ambiente até a solidificação da agarose.
 Preencher a cuba eletroforética com tampão TBE e dissolver 20µL de
Brometo de Etídio no tampão da cuba. Colocar a forma com o gel
solidificado dentro da cuba.
 Com ponteiras de 10µL pipetar 4µL do DNA purificado juntamente
com 1µL de 10X Blue Juice gel loading buffer e adicionar no poço do
gel de agarose.
 Adicionar 4µL de low DNA mass ladder em um dos poços.
205
 Ligar os fios da cuba eletroforética até a fonte eletroforética
programada para corrida de 1 hora a 110 Volts. Após este tempo
observar o resultado da corrida eletroforética em transluminador de
UV.
 Observar a intensidade da banda de cada amostra e comparar com a
intensidade dos tamanhos de fragmentos de DNA do low DNA mass
ladder, a qual para cada tamanho de fragmento de DNA é fornecido o
volume em ng de DNA da amostra em tabela anexa ao produto.
 Em seguida manter a amostra a -20ºC até o momento da técnica de
reação de seqüenciamento.
CUIDADOS: Toda a técnica deve ser realizada na sala de eletroforese para
contaminação por DNA. O brometo de etídio é carcinogênico.
Reação de Seqüenciamento
Insumos: água ultra pura DNA/RNAse free; primers senso anti-senso à 3,2
mmolar; BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Amersham
Biosciences™).
Todas as etapas a seguir devem ser realizadas em ambiente pouco
iluminado.
Aplicação da Técnica
Aplicar a técnica de acordo com as instruções do fabricante.
 Identificar os tubos de 0,2mL para cada amostra a ser seqüenciada.
 Descongelar todos os reagentes em gelo.
 Agitar vigorasamente e dar spin em cada um dos reagentes utilizados
na reação de PCR. Não agitar vigorasamente o BigDye Terminator
v3.1 Cycle Sequencing Kit.
 Fazer um mix de todos os reagentes utilizados na reação para um
total de amostras testadas, seguindo o quadro a seguir:
206
MIX
BigDye
Primer 3,2uM
PCR
H2O
Total
µL
4
1
Definir pelo resultado
de quantificação de DNA
Definir completando até
10 µL
10 µL
 A quantidade de água e produto de PCR depende da quantificação do
DNA. Quanto mais concentrado o DNA menos produto será utilizado.
 Seguir a tabela abaixo em relação ao tamanho do amplicon:
Produto de PCR Quantidade
100-200bp
1-3ng
200-500bp
3-10ng
500-1000bp
5-20ng
1000-2000bp
10-40ng
>2000bp
40-100ng
 Levar ao termociclador programado com os seguintes ciclos:
96°C
96°C
50°C
60°C
10°C
1 min
10 seg
5 seg
35 ciclos
4 min
Conservação
 Assim que terminar a ciclagem, manter a reação a 4ºC para a
purificação da reação de seqüenciamento.
 O controle da reação se faz com a amostra pGEM que faz parte do
BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Amersham
Biosciences™).
 A reação de controle se faz como especificado na tabela abaixo:
MIX
µL
BigDye
4
Primer 0,8uM
4
pGEM 200ng/uL 1
H2O
1
Total
10
207
Purificação da Reação de Seqüenciamento e Preparo da Placa de
Sequenciamento
Insumos: Gelo em raspas; água ultra pura DNA/RNAse free; isopropanol
66%; etanol 70 %; formamida HiDi (Applied Biosystems).
Aplicação da Técnica
Aplicar a técnica de acordo com as instruções do fabricante.
 Adicionar 90 µL de isopropanol 66% a cada tubo da reação de
seqüenciamento.
 Spin na reação de seqüenciamento e adicionar 10 µL em cada tubo
com isopropanol 66%.
 Agite manualmente os tubos para homogeneizar seguido spin. Manter
os tubos à temperatura ambiente por 20 minutos.
 Centrifugar os tubos à temperatura ambiente em microcentrífuga por
25 minutos a 14000 g.
 Remova o sobrenadante por aspiração. Adicione 170uL de Etanol
70% para lavar o pellet.
 Centrifugar os tubos à temperatura ambiente em microcentrífuga por
10 minutos a 14000 g.
 Remova o sobrenadante por aspiração e deixe o pellet secar ao ar por
cerca de 30-40 minutos.
 Ressuspender o pellet em 10uL de Formamida Hi-Di.
 Agitar vigorasamente e manter a 4ºC protegido da luz. Caso as
reações não sejam corridas logo em seguida, secar as reações e
estocar a placa ou os tubos vedados (envoltos por alumínio) à -20ºC
até levar para seqüenciar, sem ressuspender na formamida Hi-Di.
 Ressuspender em 10uL de formamida Hi-Di, agitar vigorasamente e
dar spin. Caso as amostras tenham sido estocadas secas, retirar do
freezer e após chegar a temperatura ambiente ressuspender em 10uL
de formamida Hi-Di, agitar vigorasamente e dar spin.
 Transferir as amostras para a placa de sequenciamento e dar spin.
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 Denaturar a placa por 95ºC durante 5 min e colocar imediatamente
em gelo por aproximadamente 5 min.
 Em seguida dar spin novamente na placa e colocar no gelo
imediatamente.
 Deixar no gelo até o momento da corrida eletroforética no
seqüenciador.
Após a corrida eletroforética no seqüenciador extrair os dados gerados
(eletroferogramo) para uso com softwares de bioinformática relacionados
aos ácidos nucléicos.
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