Goulart, Maria das Gracas Vilela

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
FACULDADE DE ODONTOLOGIA DE PIRACICABA
MARIA DAS GRAÇAS VILELA GOULART
Ação do verapamil, bloqueador de canais de cálcio,
sobre o desenvolvimento do germe dentário de ratos e
sua correlação com os teores séricos de cálcio.
Dissertação apresentada à Faculdade
de Odontologia de Piracicaba da
Universidade Estadual de Campinas,
para obtenção do título de MESTRE
em Ciências- Área de Farmacologia.
Piracicaba- S.P.
1996
G729a
31014/BC
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
FACULDADE DE ODONTOLOGIA DE PIRACICABA
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MARIA DAS GRAÇAS VILELA GOULART
Ação do verapamil, bloqueador de canais de cálcio,
sobre o desenvolvimento do germe dentário de ratos e
sua correlação com os teores séricos de cálcio.
Orientadores : Prof. Dr. José Ranali - FOP/UNICAMP
Profa. Ora. Wilma P. Bastos Ramos- FOSJC/UNESP
Dissertação apresentada à Faculdade
de Odontologia de Piracicaba da
Universidade Estadual de Campinas,
para obtenyão do título de MESTRE em
Ciências • Area de Farmacologia.
Piracicaba- S.P.
1996
CM-OOC9'l800-4
Ficha Catalográfica Elaborada pela Biblioteca da FOP/UNICAMP
G729a
Goulart, Maria das Graças Vilela.
Ação do verapamil, bloqueador de canais de cálcio, sobre o
desenvolvimento do germe dentário de ratos e sua correlação
com os teores séricos de cálcio I Maria das Graças Vilela
Goulart.- Piracicaba: [s.n.], 1996.
118f : il.
Orientadores:José Ranali e Vilma P. Bastos Ramos.
Tese (Mestrado) - Universidade Estadual de Campinas,
Facuidade de Odontologia de Piracicaba.
1. Dente. 2. Medicamentos. 3. Farmacologia. I. Ranali, José.
II. Ramos, Vilma P. Bastos.. III. Universidade Estadual de
Campinas. Faculdade de Odontologia de Piracicaba. III. Título.
19.CDD- 617.634
-615.2
- 615.1
Índices para o Catálogo Sistemático
1. Dente
2~ Medicameotos
3. Farmacologia
617.634
615.2
615.1
UNICAMP
FACULDADE DE ODONTOLOGIA DE PIRACICABA
{i
~.
A Comissão Julgadora dos trabalhos de Defesa de Tese de Mestrado, em
sessão pública realizada em 18/12/96, considerou o candidato aprovado.
%_·~·"-~'""_··_"'_t_~J..
_________________
1.José Ranali _ _
2. Wilma Pereira Bastos Ramos
_..J.{'-11Ju:Lc~4lft~n!..<:Aw.l:.!.41!/.~li!C:::::::l--------
A meus pais HERNANI (In memorian) e
CÉLIA, que através de exemplos de
integridade, estímulo de vida e luta, me
ensinaram
a
caminhar
com
meus
próprios pés.
A meu marido MÁRIO e a meus filhos
ROGÉRIO e LARA que suportaram,
pacientemente, minhas ausências do lar
e por tudo que representam para mim,
ofereço o mérito desta conquista.
À Profa. Ora. Wilma Pereira Bastos Ramos, cuja sabedoria foi
imperativa, quando num gesto generoso soube me dar oportunidades para crescer.
Cara MESTRA MENTORA, a minha gratidão por seus ensinamentos,
segura orientação e valiosa contribuição à minha formação científica. Inestimável
exemplo de integridade e dedicação que merece ser seguido.
Ao Prof. Dr. José Roberto de Oliveira e Silva, professor titular da
disciplina de Farmacologia da Faculdade de Odontologia de São José dos Campos
- UNESP, com quem tenho a felicidade de conviver, competente mestre e
inestimável amigo, minha infinita gratidão pelo apoio e incentivo a me manter
sempre perseverante na busca do aprendizado.
À lvoneide Ramos Leandro, secretária do Departamento de Ciências
Fisiológicas da Faculdade de Odontologia de São José dos Campos - UNESP,
pela amizade, paciência, eficiência e dedicação na digitação e formatação deste
trabalho, o meu reconhecimento e admiração.
Agradecimentos
À Faculdade de Odontologia de Piracicaba - UNICAMP, através de seu
digníssimo diretor Dr. José Ranali, pela oportuna realização do curso de pósgraduação e incentivo aos que se dedicam ao ensino e à pesquisa.
Ao Prof. Dr. José Ranali, pela competência profissional, apoio e
orientação segura deste trabalho.
Aos Profs. Drs. Thales de Matos Filho e Eduardo Dias de Andrade,
grandes mestres, incentivadores e amigos, sinceros agradecimentos e admiração
pelo exemplo de integridade e dedicação.
Ao Prof. Dr. Pedro Luiz Rosalen, coordenador do curso de pósgraduação em Farmacologia da Faculdade de Odontologia de Piracicaba UNICAMP e demais professores e funcionários da Área de Farmacologia,
Anestesiologia e Terapêutica, pela competência, apoio e incentivo sempre
presentes.
Às colegas de turma do CPG, Elizabete Míriam, Elizabeth Lúcio, Míriam,
Rosa e Cláudia, pelo companheirismo, amizade e respeito mútuo que nos uniu
durante toda esta jornada.
À CAPES, pelo apoio financeiro (Bolsa de Estudo), que foi de suma
importância na realização deste trabalho.
À Faculdade de Odontologia de São José dos Campos - UNESP,
através de seu digníssimo diretor Dr. José Eduardo Junho de Araújo, o meu
reconhecimento pela valiosa permissão na realização deste trabalho, através de
estágio no Departamento de Ciências Fisiológicas na disciplina de Farmacologia
sob orientação da Profa. Ora. Wilma Pereira Bastos Ramos.
Ao grande mestre, Prof. Dr. Divo Leonardo Sanioto,
chefe do
Departamento de Ciências Fisiológicas da Faculdade de Odontologia de São José
dos Campos - UNESP, pelo exemplo de integridade e honestidade profissional,
meu sincero respeito e agradecimentos.
Ao Prof. José Benedito O. Amorim, pelas preciosas sugestões e valiosa
colaboração na aquisição dos artigos e publicações utilizadas na Revisão da
Literatura, o meu sincero respeito e admiração.
À Profa. Ora. Rosilene Fernandes da Rocha, pela eficiente colaboração
na realização da parte experimental deste trabalho, o meu reconhecimento.
Aos técnicos do Laboratório de Farmacologia, Guilherme Ortiz de Melo e
Domingos Gonçalves Pontes e ao bioterista Lourival Jacob , pelo competente
auxílio e dedicação no cuidado e manejo dos animais utilizados nesta pesquisa.
À Mônica Oliveira Guimarães Figueiredo, auxiliar acadêmica do
Laboratório de Apoio a Pesquisa, pela paciência, dedicação e eficiente execução
das lâminas e fotografias utilizadas.
Aos docentes e demais funcionários do Departamento de Ciências
Fisiológicas da Faculdade de Odontologia de São José dos Campos - UNESP,
pelo apoio, incentivo e sugestões durante a execução deste trabalho.
Aos Profs. Drs. Miguel Àngelo Castilho Salgado da disciplina de
Histologia e Embriologia da Faculdade de Odontologia de São José dos Campos UNESP e José Merzel da disciplina de Histologia e Embriologia da Faculdade de
Odontologia de Piracicaba - UNICAMP, meus sinceros agradecimentos pela
brilhante colaboração na orientação dos processos histológicos.
Às Sras. Zélia Sumie lkeda Borget, Bibliotecária da Faculdade de
Odontologia de São José dos Campos- UNESP e Suely Duarte de Oliveira Soliani,
diretora técnica da biblioteca da Faculdade de Odontologia de Piracicaba UNICAMP, pelo empenho e dedicação na revisão das referências bibliográficas.
Ao Prof. Ivan Balducci, da disciplina de Bioestatística do Departamento
de Odontologia Social da Faculdade de Odontologia de São José dos Campos UNESP, pela competente colaboração na análise estatística dos resultados.
À ROHM & HAAS Química Lida- Jacareí- S. P. -pelo fornecimento da
água deionizada, utilizada nesta pesquisa.
À todos que, de alguma forma, colaboraram despretenciosamente para a
realização deste trabalho.
Sumário
Páginas
1-listas
1.1- Lista de tabelas, gráficos, figuras (fotografias) ....................................
01
1.2- Lista de Abreviaturas .... ... .. ... .... .. .... .. ... ..... ... ... ... ...... ... .. ... .. ........ ..... .....
04
2- Resumo ............... ... ... ... ... ...... ..... .... .. ....... .. ... .. .......... ... .... ... ... ... .. ..... ... ..... .. .
06
3- Introdução e Revisão da Literatura ... ... ... ...... ... .. ...... ... .. ... ... ........ ...............
08
4- Proposição .................................................................................................
32
5- Material e Métodos .....................................................................................
33
5.1- Animais utilizados ... ... .... .. ... ..... .. ... ..... ... ... ........ ... ... ..... ...... .. ... .......... ....
33
5.2- Droga e doses .... ... ... ............ .. ....... ...... .. ... ... ... ...... ........ .. ........ ..... ........ .
33
5.3- Metodologia ................ ..........................................................................
34
5.3.1- Tratamento dos animais com verapamil ... ... ... .. ... .. ... ..... ... .. ...... .. ..
34
5.3.2- Acasalamento dos animais ....................................................... ....
35
5.3.3- Diagnóstico de prenhez ................................................................
35
5.3.4- Cesariana, contagem de implantações uterinas, filhotes e
reabsorções fetais. coleta do sangue das mães e filhotes. Coleta do
fêmur das mães........................................................................................
36
5.3.5- Estudo dos filhotes........................................................................
37
5.3.5.1- Análise macroscópica ............................................................
37
5.3.5.2- Análise microscópia dos germes dentários- Histologia ........
37
5.3.6- Dosagens bioquímicas do sangue das mães e filhotes ................
38
5.3.6.1- Concentração de Cálcio plasmático ......................................
38
5.3.6.2- Concentração de Fosfato plasmático ....................................
38
5.3.6.3- Concentração de Proteínas Totais plasmáticas ....................
39
5.3.7- Estudo das mães..........................................................................
39
5.3.7.1- Análise do desenvolvimento ósseo........................................
39
5.3. 7.1.1- Determinação do comprimento, pesos úmido e seco
dofêmur...........................................................................................
39
4- Sistematização da Pesquisa .. .. .. .. . .. . .. .... .. .. .. .. ...... .. .. ... .. .. .. . .. .. .. ...... .. .. .. .. .. .. .
40
5- Análise Estatística .... ... ...... ... .. ....... ... ... ... ..... ... ... ... ... ... ....... ... ..... ... ... ....... ....
42
6- Resultados ....................... ..........................................................................
43
6. 1- Número de implantações uterinas.........................................................
43
6.2- Número de reabsorções fetais..............................................................
46
6.3- Número de nascidos vivos ...................................................................
49
6.4- Análise macroscópica dos filhotes .......................................................
53
6.5- Peso médio de nascidos ......................................................................
54
6.6- Comprimento, pesos úmido e seco dos fêmures das mães .................
58
6.7- Dosagens bioquímicas .. . .. .. .. .. .. ... .. .. .. .. ... .. .. .. ... ... . .. .. .. .. .. .. ... ... .. ... .. ... .. .. .
63
6. 7. 1- Concentração de Cálcio plasmático das mães .. . .. .. ... . .. .. .. ... .. .. .. .. .
63
6.7.2- Concentração de Cálcio plasmático dos filhotes ..........................
64
6.7.3- Concentração de Fosfato plasmático das mães ...........................
65
6.7.4- Concentração de Fosfato plasmático dos filhotes ........................
66
6.7.5- Concentração de Proteínas Totais plasmática das mães .............
67
6.7.6- Concentração de Proteínas Totais plasmática dos filhotes ..........
68
6.8- Análise microscópica dos germes dentários de filhotes- Histologia ...
77
7- Discussão .... .......... .. ..... ... ... ... ... ......... ... .. ....... .. .. ....... .. ... ...... .. ... .. ... .. ... ..... ...
91
8- Conclusão ..................................................................................................
99
9- Sumary ... ... .. ....... ... ... ... ......... .. ... ... ...... ... ...... .. .... . .. .. ... ...... ..... ... .. ..... ... .. .... . ..
101
10- Referências Bibliográficas .. .. .. .. .... .. .. .. .. .. .. ........ ...... .. ..... ........ .... .. .. ...........
103
1
1- Listas
Páginas
1.1- Tabelas, gráficos e figuras presentes no texto.
Tabela 1
Número de implantações uterinas de ratas prenhes dos
grupos Controle e Tratados com verapamil.. ... .. ...... ........ .. .. ......
44
Tabela 1A Análise de variância (teste de Kruskaii-Wallis) relativa aos
dados da tabela 1 ......................................................................
45
Tabela 2
Número de reabsorções fetais de ratas prenhes dos grupos
Controle e Tratados com verapamil...........................................
47
Tabela 2A Análise de variância (teste de Kruskaii-Wallis) relativa aos
dados da tabela 2 ......................................................................
48
Número de nascidos vivos de ratas dos grupos Controle e
Tratados com verapamil............................................................
50
Tabela 3A Análise de variância (teste de Kruskaii-Wallis) relativa aos
dados da tabela 3......................................................................
51
Tabela 3
Tabela 4
Peso individual (g) de nascidos vivos de ratas do grupo
Controle.....................................................................................
55
Tabela 4A Análise de variância (teste de Kruskaii-Wallis) relativa aos
dados das tabelas 4 e 5 .. .. .. .. .. .. .. .. ... .. ... ... ... ... ... .. .. .. .. ... .. .. .. .. .. .. .
57
Tabela 5
Peso individual (g) de nascidos vivos de ratas dos grupos
Tratados com verapamil............................................................
56
Comprimento (mm), pesos úmido e seco (mg) do fêmur de
ratas dos grupos Controle e Tratados com verapamil...............
59
Tabela 6A Análise de variância (teste de Kruskaii-Wallis) relativa aos
dados da tabela 6 .. .. .. .. .. .. .. ... .. .. ... .. .. .. ... .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. ... ..
60
Tabela 68 Análise de variância (teste de Kruskaii-Wallis) relativa aos
dados da tabela 6.. ... ..... .... .. ... ... ...... .. .... .. ... ... .... .... ... .... .............
61
Tabela 6
Tabela 7
Concentrações plasmáticas de Cálcio (mg/100ml), Fosfato
inorgânico (mg/100ml) e Proteínas Totais (g/100ml) de ratas
dos grupos Controle e Tratados com verapamil........................
69
Tabela 7A Análise de variância (teste de Kruskaii-Wallis) relativa aos
dados da tabela 7 .. .. ... ... .. .. .. .. ... .. .. .. .. .. .. .. .. .. ... .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. .. ..
70
Tabela 78 Análise de variância (teste de Kruskaii-Wallis) relativa aos
dados da tabela 7 .... .... ..... .. .. .... .. .... .. .... .. .... .. ..... ...... .. ... ... ... .. .. ...
71
2
Tabela ?C Análise de variância (teste de Kruskaii-Wallis) relativa aos
dados da tabela 7......................................................................
Tabela 8
72
Concentrações plasmáticas de Cálcio {mg/100ml), Fosfato
inorgânico {mg/100ml) e Proteínas Totais {g/100ml) de
filhotes de ratas dos grupos Controle e Tratados com
verapamil.. ... .... ... ... ... .. ... .... .. ... ... ... ...... ... .. ... ...... ... .. ... ... .......... ... .
73
Tabela 8A Análise de variância {teste de Kruskaii-Wallis) relativa aos
dados da tabela 8......................................................................
74
Gráfico 1
Gráfico 2
Gráfico 3
Gráfico 4
Figura 1
Figura 2
Figura 3
Figura 4
Figura 5
Figura 6
Valores médios do número de implantações uterinas,
reabsorções fetais e nascidos vivos de ratas controle e
tratadas com verapamil .. .... ... .... .. .. ...... .. .... .. .. .. .. .. ... .... .. .. .. .... .. ..
52
Valores médios do comprimento (mm), pesos úmido e seco
(mg) dos fêmures das ratas controle tratadas com
verapamil........................... ... .. ... ...... ...... ... .. ... ... ..... ... ..... ... ... ... .. .
62
Valores médios de concentrações plasmáticas de Cálcio,
Fosfato (mg/100ml) e Proteínas Totais (g/100ml) de mães
Controle e Tratados com verapamil (01 e 02) .........................
75
Valores médios de concentrações plasmáticas de Cálcio,
Fosfato (mg/100ml) e Proteínas Totais (g/100ml) de filhotes
de mães Controle e Tratados com verapamil (01 e 02) .. .. .. .. ..
76
Microfotografia de germe dentário. Incisivo inferior, corte
longitudinal de filhote oriundo de mãe Controle.
Aumento 32X ...........................................................................
79
Microfotografia de germe dentário. Incisivo inferior, corte
longitudinal de filhote oriundo de mãe Tratada (01).
Aumento 32X ...........................................................................
80
Microfotografia de germe dentário. Incisivo inferior, corte
longitudinal de filhote oriundo de mãe Tratada (02).
Aumento 32X ...........................................................................
80
Microfotografia de germe dentário. Incisivo inferior, corte
longitudinal de filhote oriundo de mãe Controle.
Aumento 60X ...........................................................................
81
Microfotografia de germe dentário. Incisivo inferior, corte
longitudinal de filhote oriundo de mãe Tratada (01 ).
Aumento 60X ...........................................................................
Microfotografia de germe dentário. Incisivo inferior, corte
longitudinal de filhote oriundo de mãe Tratada (02).
Aumento 60X ...........................................................................
82
82
3
Figura 7
Microfotografia de germe dentário. Incisivo inferior, corte
longitudinal de filhote oriundo de mãe Controle.
Aumento 160X .........................................................................
83
Microfotografia de germe dentário. Incisivo inferior, corte
longitudinal de filhote oriundo de mãe Tratada (01 ).
Aumento 160X .........................................................................
84
Microfotografia de germe dentário. Incisivo inferior, corte
longitudinal de filhote oriundo de mãe Tratada (02).
Aumento 160X .........................................................................
84
Figura 1O Microfotografia de germe dentário. Incisivo superior, corte
longitudinal de filhote oriundo de mãe Controle.
Aumento 32X ... ... ... ... .. .... ......... .............. ... ... ... ....... ... ... ... .. .. .....
85
Figura 8
Figura 9
Figura 11
Microfotografia de germe dentário. Incisivo superior, corte
longitudinal de filhote oriundo de mãe Tratada (01 ).
Aumento 32X .... .......................................................................
86
Figura 12 Microfotografia de germe dentário. Incisivo superior, corte
longitudinal de filhote oriundo de mãe Tratada (02).
Aumento 32X ................................................. ..... .....................
86
Figura 13 Microfotografia de germe dentário. Incisivo superior, corte
longitudinal de filhote oriundo de mãe Controle.
Aumento 60X ... .... .... ... ... ... ... ........... ... ... ... ...... .. .. ... ... ...... ..........
87
Figura 14 Microfotografia de germe dentário. Incisivo superior, corte
longitudinal de filhote oriundo de mãe Tratada (01 ).
Aumento 60X .. .......... ... .. ....... ... .. .. .... ... ...... .. ...... .. ... .. ... ... ... ..... ..
88
Figura 15 Microfotografia de germe dentário. Incisivo superior, corte
longitudinal de filhote oriundo de mãe Tratada (02).
Aumento 60X .. .... .. ... ...... .. .... ... ... .. ... ... ... ..... .... ... ..... .. ........ .. ... ...
88
Figura 16 Microfotografia de germe dentário. Incisivo superior, corte
longitudinal de filhote oriundo de mãe Controle.
Aumento 160X .........................................................................
89
Figura 17
Microfotografia de germe dentário. Incisivo superior, corte
longitudinal de filhote oriundo de mãe Tratada (01 ).
Aumento 160X . ........................................................................
90
Figura 18 Microfotografia de germe dentário. Incisivo superior, corte
longitudinal de filhote oriundo de mãe Tratada (02).
Aumento 160X .........................................................................
90
4
1.2- Abreviaturas e siglas utilizadas no texto.
AMPc
Adenosina 3'.5' monofosfato
ALP
Fosfatase alcalina
ACTH
Adrenocorticotrofina
AV
Átrio Ventricular
BCC
Bloqueador dos canais de cálcio
Ca +2
íon cálcio
+2
íon cobre
Cu
c
o
graus centígrados
CT
calcitonina
canais L
canais lentos de cálcio
01
dose de verapamil correspondente a 24mg/rato/dia
02
dose de verapamil correspondente a 2,4mg/rato/dia
et ai
et ali i
ex
exemplo
F
frequência
g
grama
g/100ml
grama por 100 mililitros
g/kg
grama por quilograma
G.L
graus de liberdade
ICC
insuficiência cardíaca congestiva
=e outros
litro
LEC
líquido extra-celular
M
mediana
±
mais ou menos
mg/ml
miligrama por mililitro
mg/100ml
miligrama por cem mililitros
mEq/1
miliequivalente grama por litro
mm
milímetro
mmol/1
mil imolar por litro
mM
milimolar
5
nm
nanômetro
n°
número
Nacl
cloreto de sódio
%
porcento
pH
logaritmo negativo da concentração de íons
PTH
hormonio paratireoideo
P450
citocromo P450
q.s.p.
quantidade suficiente para
Ref
Referência
S
desvio padrão
11g
microgramas
11g/kg
microgramas por quilograma
11g/ml
microgramas por mililitro
x
média aritmética
6
2. RESUMO
Tendo em vista que os bloqueadores dos canais de cálcio, são
utilizados na terapêutica, geralmente, por longos períodos de tempo, muitas vezes
em gestantes, propôs-se estudar neste trabalho, os efeitos do verapamil sobre o
germe dentário de filhotes de ratas tratadas com a droga, antes e durante a
prenhez.
Avaliou-se os
efeitos da droga sobre
implantações uterinas,
reabsorções fetais, desenvolvimento ósseo e níveis plasmáticos de cálcio, fosfatos
e proteínas totais em mães e filhotes.
Utilizou-se 73 ratos Wistar (Ratus norvergícus, var. Albinus), com
controle de qualidade compatíveis com as necessidades deste experimento, sendo
52 fêmeas virgens e 21 machos reprodutores. As fêmeas foram divididas
aleatoriamente em 3 grupos, como segue: o primeiro recebeu verapamil na dose de
24 mg/rato/dia, denominado grupo tratado 01; o segundo recebeu a droga na dose
de 2,4 mg/rato/dia, denominado grupo tratado 02 e o terceiro constituiu-se no
grupo controle, recebendo água, sem adição de verapamil.
As ratas foram mantidas em gaiolas individuais e receberam a droga
na água de beber durante 1O semanas a saber, 7 semanas antes e 3 semanas
durante a prenhez. Ao 21° dia de prenhez foi realizada a operação cesariana.
Nesta ocasião, coletou-se amostras de sangue arterial, heparinizado, para
7
determinação de dosagens bioquímicas de cálcio, fosfato e proteínas totais.
Retirou-se também, o osso femoral para estudo do desenvolvimento ósseo. Dos
filhotes, por decapitação, , retirou-se as cabeças para estudo histológico dos
germes dentários
e,
amostras de sangue heparinizado,
para dosagens
bioquímicas.
Para análise estatística dos resultados,
utilizou-se
análise de
variância, não paramétrica, através do teste de Kruskai-Wallis.
Os resultados mostraram que o verapamil ao lado de estimular as
respostas ovarianas aumentando significativamente o número de implantações
uterinas, induziu em fases precoces da gestação, morte com reabsorção fetal, sem
causar efeitos teratogênicos nos filhotes que sobreviveram a essa fase.
Observou-se que o verapamil não causou sinais de intoxicação nas
mães, embora tenha ocorrido diminuição nas concentrações plasmáticas de cálcio,
quando as mães foram tratadas com a droga na dose alta.
O verapamil, em ambas as doses, induziu maior deposição de cálcio
no germe dentário, na região da dentina, acelerando,
aparentemente,
a
organização tissular dessas estruturas. Tais resultados são coerentes com uma
elevação dos pesos úmido e seco dos fêmures das mães tratadas, indicando
aporte de minerais para o tecido ósseo.
Palavras-chaves: bloqueadores dos canais de cálcio, verapamil, germe dentário.
8
3. INTRODUÇÃO
O íon cálcio é um elemento muito importante na constituição e função
do organismo aparecendo em grandes quantidades nos tecidos ósseo e dentário,
em pequenas proporções na estrutura e no citoplasma das células dos tecidos
moles e no líquido extra-celular. Ê essencial para a integridade fisiológica dos
tecidos nervoso e muscular, influenciando na excitabilidade dos mesmos e na
liberação de neurotransmissores. Ê necessário para a função cardíaca normal,
contração muscular, além de regular um grande número de processos bioquímicas
importantes tais como: reações enzimáticas, liberação de hormônios, processos
secretórios, integridade de membrana,
transporte através da membrana
plasmática e coagulação sangüínea. Para manter estas funções em equilíbrio, os
teores de cálcio, no meio interno, são regulados rigorosamente pela calcitonina,
vitamina D e hormônio paratireóideo (Guyton, 1989, Aires, et ai, 1991,
Harper,
1994, Goodman & Gilman, 1996)
As necessidades orgânicas de cálcio são atendidas pela alimentação,
principalmente pelo leite e derivados. Sua ingestão diária varia de 200 a 1500/mg,
sendo que mais de 90% deste cálcio, está armazenado nos tecidos ósseo e
9
dentário, onde junto com o fosfato, formam os cristais de hidroxiapatita, resultando
os componentes inorgânicos e estruturais do esqueleto. Os cristais ósseos contêm,
adicionalmente, íons como potássio,
sódio, magnésio, carbonato e fluoreto. O
cálcio dos ossos está em constante equilíbrio de troca com o líquido intersticial e a
integridade desse tecido é uma consequência do balanço entre reabsorção óssea
e formação do novo osso.
O cálcio plasmático se mentém numa concentração razoavelmente
constante de 5 mEq/1, onde existe em três formas diferentes: complexado com
ânions citrato e fosfato, ligado a proteínas, principalmente à albumina e ionizado. O
cálcio ionizado é a fração biologicamente ativa. Sua redução vem associada a
sintomas de hipocalcemia.
A hipocalcemia causada por hipoproteínemia se dá pela redução da
concentração de cálcio ligado a proteínas, não acompanhadas pelos sintomas de
hipocalcemia, a não ser que haja, concomitantemente, redução da concentração de
cálcio ionizado. Consequentemente a interpretação do significado de qualquer
valor plasmático de cálcio é impossível, sem se conhecer a concentração
plasmática de proteínas. Uma alteração das concentrações plasmáticas proteicas
(albumina), resulta em alterações paralelas de cálcio plasmático. Para cada grama
de albumina há uma diminuição de aproximadamente 0,8 mg de cálcio plasmático
numa situação de hipoalbuminemia. (Kalant & Roschlau, 1991, Katzung, 1992;
Harper, 1994, Goodman & Gilmam, 1996).
O cálcio plasmático é mantido dentro de limites muito estreitos, e o
organismo é pouco tolerante às alterações significantes dos limites normais de
10
cálcio ionizado que gira em torno de 1,3 m mol/1 na maioria dos mamíferos
'
pássaros e peixes de água doce. Alterações do nível de cálcio, biologicamente
ativo, dos parâmetros normais, podem provocar desordens nos processos
bioquímicas e fisiológicos, ameaçando a vida humana, o que o torna de grande
importância médica (Harper, 1994).
Na maioria das células, o cálcio intracelular está armazenado no
retículo endoplasmático e nas mitocôndrias. As células do músculo esquelético são
capazes de mobilizar o cálcio intracelular frente a um estímulo excitatório para
manter a junção excitação-contração, por mecanismos menos dependentes da
entrada
do cálcio extracelular. Já o acoplamento excitação - contração,
no
músculo cardíaco e liso, depende criticamente da concentração de íons cálcio no
líquido extracelular, em função das células lisas vasculares apresentarem um
retículo endoplasmático pouco desenvolvido ( Nayler, & Victória, 1967; Guyton,
1989; Rang & Dale, 1993).
A entrada de cálcio no citosol se faz através de canais de cálcio
específicos e depende de estimulação (Bolton, 1979, Stryer, 1992).
Os canais de cálcio são constituídos por proteínas que atravessam a
membrana celular favorecendo a entrada seletiva destes íons. Internamente,
nestes canais, existem regiões com cargas elétricas que servem de "portões", os
quais determinam a abertura ou o fechamento dos canais, permitindo assim a
passagem dos íons através da membrana celular, frente a estímulos como
mudanças morfológicas, elétricas, hormonais e de receptores vizinhos. Tal
mecanismo é ativado durante as despolarizações e repolarizações (alterações de
11
voltagem) das células contráteis, por isso são chamados "voltagem dependentes".
Outro mecanismo de ação dos canais de cálcio, decorre da estimulação de
receptores de membrana (beta-receptores adrenérgicos) provavelmente, mediado
por alterações intracelulares de AMPc (adenosina 3' 5', mono-fosfato) promovendo
abertura destes canais. Devido ao fenômeno de abertura ter sido desencadeado
pelo estímulo de receptor, tais canais são chamados "receptor-dependentes".
(Bolton, 1979; Snyder & Reynolds, 1985, Rang & Dale, 1993).
Tsien et ai, 1987, através da técnica de "patch-clamp" (clampeamento
de
voltagem
aplicado
à
célula
isolada)
observaram
que
evidências
eletrofisiológicas sugerem a existência de três tipos de canais de cálcio, voltagemdependentes: L, T e N distintos, com base em várias propriedades como grande
condutância, transitórios quanto à abertura, ou neuronais quanto à distribuição nos
tecidos.
Os canais lentos de cálcio do tipo L, dominantes nos músculos
cardíaco e vascular,
são conhecidos por terem vários receptores para
medicamentos e serem ativados em voltagens positivas para
-10mV. Estão
presentes em células glandulares e neuronais, constituindo o tipo de canal que
participa no acoplamento excitação-contração. Acredita-se que os canais N,
responsáveis
pelo
influxo
de
cálcio
que
desencadeia
a
liberação
de
neurotransmissores, existem somente nas membranas neuronais, sobretudo nas
terminações axônicas,
enquanto que os canais T estão presentes em células
musculares esqueléticas e glandulares, e são ativados em voltagens positivas para
-70mV, (Nowycky, 1985, Cognard, 1986, Tsien et ai, 1987; Kalant & Roschlau,
1991; Katsung, 1992).
12
A aplicação de um estímulo efetivo à célula muscular, abre os canais
de cálcio, provoca seu influxo para dentro da célula que, por sua vez, desencadeia
eventos intracelulares os quais resultam em contração muscular. Vários tipos de
drogas antagonistas podem alterar essa sequência de eventos que dependem da
presença de cálcio. (Kalant & Roschlau, 1991 ).
Atualmente,
têm
sido
sintetizadas
muitas
substâncias
medicamentosas, designadas como antagonistas dos canais de cálcio,
embora
não antagonizem diretamente os seus efeitos. Elas inibem a entrada do íon para o
interior das células, ou a sua mobilização a partir de estoques intracelulares, e, por
isso foram denominadas genericamente de "bloqueadores dos canais de cálcio".
Quando administradas ao organismo, induzem determinados efeitos fisiológicos
importantes com grande utilidade terapêutica em várias patologias (Fieckenstein et
ai, 1967; Weiner, 1988; Goodman & Gilman 1996).
Tais substâncias constituem um grupo heterogêneo de fármacos, com
a característica de bloquear a entrada ou acelerar a saída de cálcio das células
contráteis. O bloqueio ocorre ao nível dos canais lentos de cálcio voltagem dependentes do tipo L, através dos quais o cálcio extracelular ativa a contratilidade
da musculatura vascular. A denominação pelos autores como "bloqueadores dos
canais de cálcio", visa distinguir o grupo, de outros antagonistas de cálcio que
agem por diferentes mecanismos, como sejam o magnésio, manganês, cobalto,
antibióticos aminoglicosídeos e toxinas botulínicas. (Triggle & Swany, 1980; Kalant
& Roschlau, 1991; Rang & Dale, 1993, Katzung, 1994 Goodman & Gilman, 1996).
13
Os bloqueadores de canais de cálcio são substâncias que têm a
propriedade de inibir o binômio excitação-contração das células musculares lisas e
miocárdicas, diminuindo-lhes a força de contração, a utilização do fosfato
energético dependente de cálcio e o consumo de oxigênio, levando como resultado
final a uma depressão da atividade contrátil celular.
Nas doses usadas
clinicamente, a ação restringe-se principalmente à musculatura lisa vascular e
sistema de condução cardíaco, possuindo ação desprezível sobre a musculatura
esquelética. O músculo esquelético utiliza reservas intracelulares de cálcio, para
dar apoio ao acoplamento excitação-contração; desta maneira, não requer tanto
influxo transmembrana de cálcio. Conseqüentemente, esses agentes são úteis nos
tratamentos preventivos da hipertensão arterial, angina do peito, arritmias
cardíacas e em outras patologias cardiovasculares, destacando-se três ações
fundamentais: eletrofisiológica, miocárdio depressora e relaxante da musculatura
lisa dos vasos. Podem atuar também em processos fisiológicos extremamente
importantes, como; secreção glandular, liberação de neurotransmissores e função
plaquetária (Nayler et ai, 1982; Moser, 1987; Raddino et ai, 1987; Weiss, 1988;
Kalant & Roschlau, 1991; Katzung, 1994; Bode et ai, 1994; Goodman & Gilman,
1996).
Por outro lado, se vários processos fisiológicos básicos como
contração muscular, secreção de hormônios, liberação de neurotransmissores,
reações enzimáticas. coagulação sanguínea e outros, dependem da entrada de
cálcio nas células, poder-se-ia esperar que uma droga bloqueadora dos canais de
cálcio desencadeasse desastres fisiológicos que rapidamente levariam à morte.
14
Entretanto, as razões pelas quais essas drogas não são consideradas venenos
letais, ainda são parcialmente compreendidas (Rang & Dale, 1993).
Dos muitos bloqueadores dos canais de cálcio sintetizados, quatro
classes
estão
sendo
bem
estudadas:
fenilalquilaminas,
diidropiridinas,
benzotiazepinas e difenilpiperazinas. Atualmente, são muitos usados na clínica
médica o verapamíl (fenilalquilamina) o diltiazem (benzotiazepina) a nifedipina e
isradipina (díidropiridina). (Snyder & Reynolds, 1985).
Na tentativa de sintetizar análogos mais ativos da papaverina, um
alcalóide vasodilatador encontrado na papoula chegou-se ao verapamil, primeira
fenilalquilamina a ser usada clinicamente nas coronariopatias. A partir dai, muitos
agentes de estruturas variadas foram descobertos, mas com a mesma atividade
farmacológica fundamental. (Bolton, 1979; Katsung, 1993; Yedinak, 1993).
Acreditava-se inicialmente que o mecanismo de ação do verapamil
devia-se à vasodilatação coronariana e ao bloqueio dos receptores
beta-
adrenérgicos miocárdicos. Porém, em 1967, Fleckenstein et ai., sugeriram que tal
mecanismo de ação relacionava-se com o bloqueio do influxo de cálcio para o
interior das células, resultando na inibição do acoplamento excitação-contração, e
não, com o bloqueio beta-adrenérgico.
Em 1969, Rougier et ai, apresentaram evidências definitivas de que a
despolarização atrial era mediada por duas correntes iônicas convergentes para o
interior das células. Uma, resultante do influxo rápido de sódio através de canais
iônicos conhecidos como "canais rápidos de sódio", causando despolarização e
aumento da permeabilidade da membrana celular; a outra, causada em grande
15
parte pelo movimento de cálcio para o interior da célula através de um poro da
membrana denominado "canais lentos de cálcio", em função do tempo gasto para
o desencadeamento da corrente iônica. A entrada de cálcio pelos "canais lentos"
contribui para a manutenção da fase de platô do potencial de ação cardíaca e são
conhecidas como canais L.
Verificou-se, subseqüentemente, que um derivado do verapamil, o D
600, bloqueava o movimento de cálcio através do canal lento, alterando a fase de
platô do potencial de ação cardíaco. (Kolhardt et ai, 1972)
Os
bloqueadores
dos
canais
de
cálcio
possuem
estruturas
moleculares diversificadas, o que justifica diferentes mecanismos e locais de ação.
Acredita-se que as diidropiridinas atuem em locais diferentes do canal de cálcio do
que o verapamil e o diltiazem, embora os efeitos farmacológicos sejam idênticos.
O músculo liso arteriolar é mais sensível às ações dos bloqueadores
dos canais de cálcio, do que o das veias. Assim, essas drogas consistem em
dilatadores predominantemente arteriais, sobretudo do leito arterial coronariano
(Scarpa, & Carofoli, 1978, Kalant & Rochlau, 1991; ).
A ação seletiva destas drogas no coração e músculo liso varia; o
verapamil é cardiosseletivo; as diidropiridinas musculosseletivas e o diltiazem
possuem ações intermediárias. (Rang. & Dale, 1993).
Triggle, 1992 e
Yedinak, 1993,
relataram que o uso clínico dos
bloqueadores dos canais de cálcio tem sido feito desde 1970, no tratamento das
patologias cardiovasculares, e que a seletividade de ação destas drogas pode
diferir por vários fatores, entre eles, o tipo de canal envolvido, a possibilidade de
16
mobilização dos íons de cálcio e o estado patológico do tecido. Tais diferenças são
largamente responsáveis pelas variações hemodinâmicas e eletrofisiológicas
destes agentes.
A partir da década de 1980, houve maior interesse dos pesquisadores
em estudar o comportamento destas drogas nas doenças cardiovasculares,
comparando-as com outras drogas, comprovando sua eficácia e tolerabilidade pelo
organismo, além de motivar o estudo em campos variados das pesquisas
biológicas (Moser, 1987; Colluci, 1987; Handler et ai, 1988, Dahlof & Sweden,
1989;).
Além do verapamil, nifedipina e diltiazem, outros bloqueadores dos
canais de cálcio estão atualmente sendo bem estudados, dentre eles várias
substâncias do tipo da diidropiridina, como nicardipina, nimodipina, amlodipina,
felodipina, pramidipina e a isradipina.(Abemethy, 1988; Opie,
1988; Dahlof . &
Sweden, 1989; Yedinak, 1993; Uehara, 1994).
Todos os bloqueadores dos canais de cálcio podem causar bloqueio
AV (atrio ventricular) e redução da frequência cardíaca. Também possuem efeito
inotrópico negativo, resultante da inibição da corrente iônica lenta durante o platô
do potencial de ação. Causam dilatação arteriolar generalizada,
sem grande
alteração venosa. Afetam todos os leitos vasculares, e os efeitos regionais, variam
em grau considerável entre as diferentes drogas. A vasodilatação causa redução
da pressão arterial. (Zanchetti, 1987; Kalant, & Roschlau, 1991; Rang & Dale,
1993; Katsung, 1994).
17
A musculatura lisa das vias biliares, urinárias e do útero, também se
relaxam pela ação dos bloqueadores de canais de cálcio, do tipo diidropirinas, o
que sugere o seu uso no tratamento das cólicas biliares e cistite intersticial. (Kalant
& Roschlau, 1991; Rang & Dale, 1993, Fleischmam, 1994).
Weiner,
1988, mostrou que os antagonistas do cálcio formam um
grupo muito importante de drogas no tratamento da hipertensão arterial, orientando
no sentido de opções úteis em várias situações em que esta patologia ocorre
associada a outros fatores, tais como: obesidade, negros, mestiços e idosos.
Atualmente, começam a ganhar importância, indicações terapêuticas
no tratamento da síndrome de Reynaud, proteção miocárdica, infarto do miocárdio,
insuficiência cardíaca congestiva (ICC), cardiopatia com dilatação e hipertrofia do
miocárdio, hipertensão pulmonar e doenças cerebrovasculares. {Rodeheffer et ai,
1983; Colluci
et ai, 1987; Opie, 1988; Weiner, 1988; Sauter & Rudin, 1990;
Beubler, 1994). A eficácia e segurança da isradipina no tratamento da hipertensão
arterial foi estudada por Luscher & Waeber,
1991; sendo considerada
medicamento de primeira linha.
Anderson, P., 1986; Weiner, 1988;, Katsung, 1994, Goodman &
Gilman, 1996,
descreveram que os bloqueadores dos canais de cálcio, são
fármacos oralmente ativos que prontamente se ligam às proteínas plasmáticas (80
- 90%). O metabolismo hepático de primeira passagem é intenso para o verapamil,
o diltiazem e a nifedipina.
As meias-vidas de eliminação variam de 3 a 4 horas, sendo que a
nifedipina e o verapamil são excretados pela urina, enquanto que o diltiazem,
18
pelas fezes. A isradipina é absorvida de 90 a 95% pelo trato gastrointestinal, com
extenso metabolismo hepático de primeira passagem, com meia-vida de 4 a 8
horas. O metabolismo é completo, não sendo detectável na urina, sob forma
inalterada, cerca de 60-65% é excretada na urina e 25-35%, nas fezes.
Estudos dos bloqueadores dos canais de cálcio relacionados com
concentração plasmática de álcool, feitos por Zacny & Yajnick, 1993, constataram
que o pré-tratamento com nifedipina, diminuiu o nível de álcool no sangue.
A influência dos bloqueadores dos canais de cálcio na mobilização de
cálcio intracelular nas células endoteliais da córnea, e o uso terapêutico destas
drogas no tratamento da enxaqueca e da dor de cabeça, foram pesquisados por
Green et ai, 1994 & Beubler, 1994.
Os principais efeitos indesejados dos bloqueadores dos canais de
cálcio são consequências diretas de suas reações sobre o músculos liso e
cardíaco. Incluem hipotensão postura!, cefaléia e constipação. Podem precipitar a
insuficiência cardíaca, e este risco é maior quando são associados a antagonistas
dos beta-receptores. Efeitos vasodilatadores como rubor, vertigens e palpitações
podem ser observados com todos os bloqueadores de cálcio. Enquanto que edema
periférico é comum em pacientes em uso de nifedipina; sintomas gastrointestinais
como constipação e náusea, ocorrem mais freqüentemente com o verapamil.
(Weiner, 1988; Rang & Dale, 1993 Goodman & Gilman, 1996).
Trabalho recente de Nyska et ai, 1994, relata hiperplasia gengiva!,
possivelmente
causada pelo efeito de bloqueadores dos canais de cálcio na
indução do bloqueio na síntese de aldosterona no córtex adrenal, aumentando a
19
secreção hipofisária de adrenocorticotrofina (ACTH), desencadeando hiperplasia
da zona glomerulosa da adrenal. Há aumento na produção de andrógenos que são
transformados em testosterona, e podem agir nas células gengivais, produzindo
hiperplasia.
Os estudos relacionados com a influência dos inibidores dos canais
de cálcio sobre o tecido ósseo são escassos, embora seu uso clínico,
especialmente pela população idosa, esteja sendo discutido como fator de risco
para o desenvolvimento de osteoporose.
As primeiras drogas bloqueadoras dos canais de cálcio foram
introduzidas na prática médica há mais de 25 anos, sendo o verapamil considerado
protótipo deste grupo de drogas.
Goodmam & Gilmam, 1996; citam que "desde 1962, pesquisadores
relatavam os efeitos inotrópicos e cronotrópicos negativos do verapamil, efeitos
estes que não eram observados em outras drogas vasodilatadoras aparentemente
semelhantes, como a nitroglicerina". Sendo assim, o verapamil foi a primeira droga
do grupo a ser usada nas coronoriopatias. É um derivado da papaverina com
estrutura química C27 H38 Nz 04 , oralmente ativo e com um perfil farmacocinético
bem
definido.
É
bem
absorvido
pelo
trato
gastrintestinal,
porém
sua
biodisponibilidade é baixa como conseqüência de uma primeira passagem pelo
fígado, 90% se liga às proteínas plasmáticas. Os efeitos eletrofisiológicos são
evidentes uma a duas horas após administração oral, com um pico de ação em três
a cinco horas. Quando administrado por via intra-venosa, o efeito dromotrópico
negativo é precoce, iniciando-se após um a dois minutos, com um pico em dez a
20
quinze minutos. Possui nestas circunstâncias, um efeito hipotensor fugaz com pico
de ação em cinco minutos e duração de dez a vinte minutos. É metabolizado pelo
fígado, onde se transforma em Nor-verapamil, um metabólito biologicamente ativo,
mas menos potente como vasodilatador. Tem uma meia-vida plasmática em torno
de 6 horas, sendo eliminado pela urina (Storstein et ai, 1981, Anderson,
1986;
Weiner, 1988; Katsung, 1992, Goodman & Gilman, 1996).
Atualmente,
é usado como antiarrítimico, sendo que em 1967,
Fleckenstein et ai. relataram seu mecanismo de ação como conseqüência da
inibição
do
acoplamento
excitação-contração
muscular
e
liberação
de
transmissores neuro-humorais; reduzindo a mobilização do cálcio intracelular nas
células cardíacas.
O verapamil atua através dos canais lentos de cálcio voltagem
dependentes de alto limiar, classificados como "canais L" (Nowycky, 1985).
Clinicamente,
a ação bloqueadora dos canais L, exercida pelo verapamil,
é
específica para dois tipos de músculos, o músculo liso vascular e as fibras
musculares do sistema cardíaco de condução.
Em alguns locais específicos do sistema de condução cardíaco,
diminui a transmissão dos estímulos ectópicos do átrio para o ventrículo,
controlando a frequência cardíaca. Por suas ações combinadas vascular e
cardíaca, a vasodilatação, induzida pelo verapamil, não se acompanha
de
taquicardia reflexa, como ocorre com outros vasodilatadores coronarianos.
No músculo liso arterial, induz diminuição da resistência periférica e
dilatação arterial, sendo por isso usado na hipertensão arterial: mantém ou
21
aumenta a função renal, aumenta o fluxo plasmático, o filtrado glomerular, o fluxo
urinário e a excreção de sódio. Quando associado a diuréticos, diminui a perda de
potássio. (Laragh et ai, 1984; Opie, 1988).
Quando comparado com as diidropiridinas, em dose de 160 mg/dia
produz queda menor na pressão arterial e certa redução da frequência e débito
cardíaco, porém sem praticamente qualquer alteração na resistência vascular
sistêmica. (Kalant & Roschlau, 1991 ).
Nas doses clínicas, seu principal uso terapêutico abrange, agente
antiarrítmico no controle de arritmias supraventriculares, e também na angina
pectoris, revertendo 80% das taquicardias paroxísticas atriais quando administrado
por via venosa. (Storstein et ai, 1981; Snyder, 1985; Anderson, 1986).
No tratamento da angina estável, o mecanismo de ação consiste
provavelmente em redução da necessidade de oxigênio do miocárdio, produzida
pela diminuição da freqüência cardíaca, inotropismo negativo, vasodilatação
coronariana e conseqüente aumento de fluxo coronário. É bastante eficaz na
angina instável, angina variante e cardiomiopatia (Weiner,
1980, Snyder, 1985;
Anderson, 1986; Opie, 1988; Kalant & Roshlau, 1992; Katsung, 1992, Goodman &
Gilman, 1996).
Em 1988, Opie estudou o comportamento dos bloqueadores de canais
de cálcio frente a distúrbios cardiovasculares, comparando aos efeitos do
verapamil comprovando sua eficácia , tolerabilidade e segurança, motivando outros
pesquisadores para avaliação científica em outros campos de pesquisas
biológicas.
22
Assim o uso terapêutico do verapamil no tratamento da enxaqueca foi
relatado por Weiner, 1988; Rang & Dale, 1993.
Netland et ai, 1995 estudaram seus efeitos na pressão intra-ocular,
concluindo que o verapamil reduz essa pressão e altera a hemodinãmica ocular,
diminuindo a resistência vascular na artéria central da retina de voluntários
humanos, duas horas após a aplicaçao tópica, na concentraçao de O, 125%.
Seus efeitos colaterais são conseqüências diretas de suas ações
sobre os músculos cardíaco e liso e, incluem constipação, hipotensão postura! e
cefaléia. O verapamil pode precipitar a insuficiência cardíaca com um risco maior
quando associado com antagonistas b. receptores. (Weiner, 1988; Opie, 1988;
Hoffer, et ai, 1993).
Experimental e clinicamente foi observado que o verapamil, na
verdade, só é eficaz se administrado profilaticamente; não parece reduzir a lesão
tecidual ou a mortalidade, se administrado após o desenvolvimento de isquemia.
Relatos de provas clínicas sugerem que se administrado após episódio isquêmico,
pode ser prejudicial, possivelmente pela deficiência adicional da função ventricular
já em risco. (Nayler, 1987; Weiner, 1988; Rang & Dale, 1993).
O efeito antiaterogênico dos bloqueadores dos canais de cálcio bem
como a influência destes fármacos sobre os sistemas de prostaglandinas e função
plaquetária, com relação à possibilidade de benefícios em pacientes portadores de
aterosclerose foi demonstrado respectivamente por Weinstein, & Heider, 1987;
Heider et ai, 1987; Weiss, 1988 cujos dados apresentam grande valor científico no
estudo destas drogas.
23
Pesquisando os efeitos anti-hipertensivos do verapamil relacionados
às suas concentrações no plasma e à atividade do seu metabólito Noverapamil,
Stortein et ai, 1981,
verificaram que variações individuais na concentração da
droga eram substanciais para a resposta anti hipertensiva. A análise da
concentração plasmática de Norverapamil, após uma hora da administração de 160
mg de verapamil, comprova a metabolização da droga.
O aumento na
concentração do verapamil, reduziu significativamente a pressão sangüínea em
humanos.
Vários autores estudaram a influência do verapamil sobre o transporte
intestinal de cálcio, sendo que, Wrobel & Michalska, 1977, relataram que na
concentração de 1,5 mM, este fármaco reduziu a corrente de oxigênio pelo
segmento intestinal, sugerindo que o verapamil reduz o transporte ativo de cálcio
por redução da respiração mitocondrial.
Subseqüentemente, em 1983, Pento & Johnson, trabalhando com
verapamil, nifedipina e diltiazem vieram nos confirmar o efeito inibitório do
verapamil sobre o transporte de cálcio, no segmento intestinal,
ineficácia dos outros bloqueadores
provando a
dos canais de cálcio em estudo. Usaram
verapamil na concentração de 1-2 mM
em ratos como modelo experimental,
realizando o experimento in vitro. Através de estudos in vivo, Fox & Green, 1986;
Sjõdén et ai, 1987, deram seqüência às pesquisas sobre efeitos dos bloqueadores
de canais de cálcio no transporte duodenal, absorção e excreção de cálcio,
respectivamente. Fox & Green,
1986, concluíram que o verapamil influenciou
diretamente a translocação de cálcio no intestino, afetando a homeostasia de
cálcio, durante o tratamento crônico oral em doses altas (90,3-10mM). Sjõdén et ai,
24
1987, mostraram que o verapamil, em doses terapêuticas (80 a 120 mg/dia), não
afetou a absorção intestinal de cálcio, a concentração de cálcio sérico ou a
excreção
urinária,
durante
dois
meses
de
tratamento,
mas
reduziu
significativamente a pressão arterial, mantendo-a em nível constante durante o
tempo da pesquisa, e, aumentou o hormônio paratireóideo.
Em 1990, Sjodén et ai, mostraram que o verapamil, nas mesmas
condições experimentais anteriores, afeta o metabolismo celular ósseo, induzindo
alterações significantes na concentração sérica de fosfatase alcalina (ALP) em
pacientes hipertensos. A ALP,
tem ação refletora sobre a atividade dos
osteoblastos na formação óssea celular, no homem. O efeito do fármaco pode ser
secundário ao aumento da secreção do hormônio paratireóideo, já que este é o
maior regulador da reabsorção óssea.
Katsung, 1994 descreveu que o verapamil bloqueia a glicoproteína
P170 responsável pelo transporte de muitas drogas de células cancerosas e que o
aumento
desta
proteína
transportadora
multidroga,
está
associado
ao
desenvolvimento de resistência destas células à quimioterapia.
Embora o verapamil seja o primeiro bloqueador de cálcio a ser
estudado, é atualmente muito utilizado na clínica médica, o que o torna motivo de
preocupação
para
pesquisadores
em
função
de
possíveis
interações
medicamentosas.
A
complexidade
do
mecanismo
de
ação,
bem
como
sua
farmacocinética, são responsáveis pelos efeitos tóxicos. Assim, a administração de
drogas antineoplásicas,
como o daunomycin e vincristine associados ao
25
verapamil, predomina citotoxicidade dos antineoplásicos (Morrow,
et ai, 1986,
Nooter et ai, 1987). O índice de mortalidade causado por overdose de verapamil é
altamente significante. A cada trinta casos de envenenamento, existem oito
fatalidades, sendo os efeitos tóxicos desencadeados por hipotensão, diminuição do
nível de consciência, distúrbios do ritmo cardíaco, bradicardia, hiperglicemia,
hipokalemia e outros
Tais morbidades merecem atenção pela inexistência de
antídotos específicos: os intoxicados deverão receber cálcio endovenosamente. A
escolha de drogas simpatomiméticas para o tratamento, causa controvérsias. A
conduta mais adequada seria a utilização de agentes com ações antagônicas aos
bloqueadores dos canais de cálcio, como por exemplo o BayK 8644, que pode
melhorar as condições cardíacas diminuindo a hipotensão arterial. (Hofer, et ai,
1993).
Renton, (1985) através de estudo da inibição do metabolismo de
drogas microssomais hepáticas,
demonstrou que o diltiazem e
verapamil são
inibidores competitivos de drogas de biotransformação hepática, em células
isoladas de camundongos.
Ambos os fármacos,
possuem grupo químico
potencialmente oxidáveis pelo citocromo - P450. Mostraram também que tanto o
diltiazem como o verapamil prolongam o efeito hipnótico do pentobarbital, quando
associados em doses comparáveis àquelas usadas no homem, sugerindo
fortemente que, interações de drogas envolvendo inibição de biotransformação,
podem
desencadear
complicações
"bloqueadores de canais de cálcio".
cardiovasculares
durante
o
uso
dos
26
Houve relato de caso de disfunção hepática induzido pelo verapamil
na dose de 120 mg, três vezes ao dia por quatro semanas, possivelmente pelas
reações idiossincrásicas descritas por Nash, & Feer, 1983.
Outro importante efeito deste fármaco relaciona-se ao tecido ósseo,
uma vez que a estrutura histológica, metabolismo e densidade óssea estão
estritamente ligados à concentração sérica de cálcio e o controle fisiológico deste,
rigorosamente
controlado
pelos
hormônios,
PTH
(hormônio
paratireoideo)
calcitonina e vitamina D. Tais substâncias hormonais atuam sobre o osso,
regulando a troca de cálcio intra e extracelular, bem como a reabsorção, formação
e mineralização óssea. A nível de trato gastrintestinal, influenciam a reabsorção de
cálcio e fosfato. Em ratos, o verapamil diminui a absorção de cálcio no intestino in
vitro (Wrobel & Michalska, 1977, Pento & Johnson, 1983; Datta et ai, 1990; Kalant
& Roschlau, 1991 ).
Se o balanço de cálcio não for suficientemente mantido no organismo,
o cálcio extracelular o será, às custas de sua depleção no osso, sob influência do
hormônio paratireóideo. Esta mobilização de cálcio do osso, para líquido
extracelular é mediada pelos osteócitos e osteoblastos e somente se a deficiência
for prolongada é que ocorre aumento da reabsorção óssea mediada por
osteoclastos, secundária ao aumento da secreção do hormônio paratireoideo.
Assim sendo, vários autores estudaram a influência das drogas bloqueadoras dos
canais de cálcio no metabolismo ósseo, por vários anos (Dziak & Stern, 1975;
Simekova et ai, 1987; Chagnac, et ai, 1989; Zaidi, et ai, 1989; Messler et ai, 1990;
Datta et ai, 1990; Duriez et ai, 1990; Zaidi et ai, 1990; Samnegard & Sjodén, 1992;
Ritchie et ai, 1994).
27
Grygorczyk, 1989 através da técnica "path e clamp", constataram a
existência de canais de cálcio tipo L em células esteoblásticas de rato. Usaram
diidropiridina (BAYK 8644, nifedipina) como droga de escolha. Estudos realizados
em células ósseas isoladas, mostrando os efeitos do hormônio paratireóideo e
AMPc no transporte de cálcio nestas células, foram feitos por Dziak, & Stern, 1975,
evidenciando que o hormônio paratireoideo causa mudanças no
transpote de
cálcio através da membrana celular, mas não altera o estado estável de cálcio.
Tais efeitos não foram mimetizados pelo AMPc.
Em 1987, Simeckova et ai, estudaram os efeitos do verapamil e do
cálcio ionóforo A 23187,
sobre o cálcio e fósforo contido nos ossos, de ratos,
verificando que o verapamil aumentou a concentração de cálcio e fósforo no osso,
enquanto que o ionóforo A 23187 reduziu a concentração de cálcio. Assumindo
então, que o aumento significante na concentração de cálcio e fósforo nos ossos
do rato pelo verapamil causa inibição da função dos osteoclastos, preponderante
nos processos catabólicos do tecido ósseo. O ionóforo A 23187 aumenta o cálcio
ionizado
no citossol,
imita
a função
do
hormônio
paratireóideo,
causa
dismineralização do osso em cultura de células ósseas. Na opinião do autor, o uso
de substâncias calciotróficas equivalentes, a longo prazo, como o verapamil e o
ionóforo A. 23187, pode interferir com o metabolismo ósseo possibilitanto uma
culminante síndrome distinta clinicamente, atribuindo estes efeitos à interferência
na função do hormônio paratireóideo nas células alvo.
Dentre os trabalhos que estudaram a influência dos hormônios,
cálcio-regulatórios sobre o metabolismo ósseo e as células do coração,
poderíamos citar aqueles realizados por Dziak & Stern, 1975; Ramp et ai, 1979;
28
Pente, & Jonhsom, 1983; Habener et ai, 1984; Bogin et ai, 1981, Bogin et ai,
1987).
Chagnac
reabsorção
e
et ai, 1989;
formação
óssea,
pesquisaram os efeitos do verapamil na
em
ratos
urêmicos,
relatando
que
o
hiperparatireoidismo secundário é comum em pacientes com doença renal crônica,
responsável pelo desenvolvimento de doença óssea possibilitando outras
disfunções orgânicas. O verapamil melhora a doença óssea em ratos urêmicos,
provavelmente inibindo os efeitos do hormônio paratireóideo no osso, com
decréscimo na formação óssea, sugerindo que esta droga pode ser um antagonista
do hormônio paratireóideo.
Foi demonstrado também, neste mesmo ano, por Zaidi et ai, que os
osteoclastos são as únicas células capazes de promoverem reabsorção óssea,
sendo que a concentração de cálcio nos sítios reabsortivos é regulada diretamente
pelos osteoclastos, através da modulação da concentração de cálcio livre
intracelular por mecanismos de feedback, em cultura das respectivas células.
Usando drogas "bloqueadoras dos canais de cálcio" como ionomycin, níquel e
nifedipina, concluíram que a exposição de células osteoclásticas isoladas a uma
elevada concentração de cálcio extracelular e ionomycin, inibe reabsorção óssea.
O níquel, bloqueador inorgânico de cálcio, bloqueou a elevação da concentração
de cálcio intracelular, enquanto que a nifedipina, bloqueador orgânico de canais de
cálcio, mostrou efeito contrário em presença da elevada concentração de cálcio
extracelular.
29
Dando continuidade aos estudos das drogas bloqueadoras dos canais
de cálcio, relacionados com o metabolismo ósseo, Messler,
1990; colaboraram
pesquisando em coelhos, a possibilidade dos antagonistas de cálcio orgânico
exercerem efeitos análogos ao magnésio no crescimento epifísárío da lâmina
óssea. Trabalhando com verapamíl e nifedípina, concluíram que estes fármacos,
antagonistas de cálcio orgânico, produziram mudanças estruturais no crescimento
epifisárío da lâmina óssea de animais jovens. Relataram também que mudanças
morfológicas produzidas pelos fármacos em estudo, eram análogas às produzidas
pelo magnésio.
Como consequência dessas reações
similares,
sugeriram
mecanismos de ação similares entre o magnésio e nos antagonistas de cálcio
orgânico.
Kím et ai, 1991, estudando as respostas da linha celular osteoblástica
MC3T3-E1 ao bloqueio de canal de cálcio pelo diltiazem e verapamil, em cultura de
células de rato, concluíram que os bloqueadores dos canais de cálcio em estudo,
têm efeito inibitório direto sobre a função osteoblástica, aumentando a reabsorção
óssea, induzindo osteoporose.
Samnergard & Sjõdén, 1992; submeteram ratos machos e fêmeas, a
um tratamento com verapamil, por tempo prolongado, demonstrando que este
fármaco induziu aumento no comprimento e volume do osso tíbia! e osteopenia
em ratas fêmeas, enquanto que em ratos machos, causou, contrariamente,
diminuição do volume tíbia!. . É possível que o verapamil atue indiretamente no
desenvolvimento de osteoporose, afetando os níveis de hormônios sexuais. Se o
verapamíl atua estimulando a secreção de andrógeno, isto pode explicar o porquê
30
das ratas fêmeas desenvolverem osteopenia, enquanto que os ossos dos ratos
machos apresentaram mais densamente mineralizados.
Trabalho recente de
Ritchie
et ai.,
1994,
utilizando drogas
bloqueadoras dos canais de cálcio, do tipo diidropiridinas (nifedipina, PN 200-110
e(-) 202-791), em cultura de células enriquecidas de osteoclastos, relataram que
estes fármacos poderiam se ligar aos canais de cálcio dos osteoclastos,
bloqueando-os e produzindo aumento na concentração intracelular de cálcio com
subsequente diminuição da reabsorção óssea local.
Estudo feito por Amorim, 1995, sobre a influência da isradipina,
bloqueadora dos canais de cálcio, no processo de reparo em feridas de extração
dental de ratos, mostrou histologicamente que este fármaco quando administrado
em dose única de 2,5 mg/kg, após exodontia, não afetou a crononologia nem a
qualidade do processo de reparo alveolar.
Devido ao amplo uso clínico dos bloqueadores de canais de cálcio e
ao pouco conhecimento dos efeitos do verapamil relacionados ao tecido ósseo,
após o tratamento prolongado, propomo-nos a estudar possíveis influências deste
fármaco sobre o esqueleto em desenvolvimento e tecidos dentários de filhotes de
ratas tratadas com a droga, antes e durante a prenhez.
O rato constitui excelente modelo experimental para estudo de tecido,
erupção e desenvolvimento dentário, pois apresenta dentição única, desenvolvida
na hemiarcada por um dente incisivo e três molares superiores e inferiores. Os
incisivos erupcionam-se, calcificam-se e crescem ininterruptamente por toda a vida
31
do animal. Conseqüentemente, apresenta, em um único dente, o ciclo completo de
desenvolvimento dentário desde a formação até a maturidade.
Com
relação
aos
tecidos
dentários,
durante
sua
fase
de
desenvolvimento embrionário, os mesmos são presumivelmente sensíveis aos
níveis séricos de cálcio, haja vista que alterações plasmáticas do íon, podem afetar
a função celular dos tecidos em geral. Não foram encontrados na literatura
compulsada, estudos sobre a influência deste fármaco sobre tais tecidos.
A droga
de eleição
empregada foi
cloridrato
de
verapamil
(DilacoronR), primeiro bloqueador de cálcio a ser usado com finalidade terapêutica.
Atualmente, a indicação do seu uso terapêutico se estende além das cardiopatias,
como por exemplo no tratamento da enxaqueca. Por isso, constitui uma droga
sumamente importante no campo de pesquisas biológicas atuais.
32
4. PROPOSIÇÃO
Considerando-se:
a) o largo emprego terapêutico dos "bloqueadores dos canais de cálcio",
geralmente por longos períodos de tempo, muitas vezes em mulheres grávidas,
torna de grande importância o estudo de seus possíveis efeitos colaterais;
b) o restrito conhecimento existente quanto aos efeitos destes agentes sobre o
tecido ósseo e desconhecimento em relação aos tecidos dentários;
Propõe-se:
a) estudar os efeitos do verapamil sobre os tecidos
dentários e esqueleto em
desenvolvimento, em filhotes nascidos de ratas tratadas com verapamil antes e
durante a prenhez;
b) correlacionar os efeitos observados com os teores séricos de cálcio, fosfatos e
proteínas totais, de mães e de filhotes.
33
5. MATERIAL E MÉTODOS
5.1 - Animais Utilizados Foram utilizados 73 ratos, adultos, da linhagem Wistar
(Rattus norvegicus var. altbinus), sendo 52 fêmeas virgens com 90-100 dias de
idade ao início das experiências, com peso variando entre 180 e 250g e 21
machos adultos, utilizados para acasalamento, fornecidos pelo Biotério da
Faculdade de Odontologia de São José dos Campos, UNESP. Os animais
mantidos em gaiolas individuais recebiam
ração Labina®, fornecida pela
Purina SA e água deionizada fornecida pela ROOHM and HAAS - Jacareí SP.
5.2 - Droga e Doses
Cloridrato de verapamil (Cz? H38 Nz 04- HCI).
A droga foi administrada na água de beber, deionizada, sendo utilizadas em
duas doses a saber:
-dose 0,8 mg/ml (D 1) correspondente a 24 mg/rato/dia.
-dose 0,08 mg/ml (Dz), correspondente a 2,4 mg/rato/dia.
34
5.3 - Metodologia
5.3.1 -Tratamento dos animais com verapamil
As ratas foram separadas aleatoriamente e, pesadas, para a formação
dos grupos controle e tratados.
Os animais do grupo tratado com verapamil foram divididos em dois
grupos; um dos quais recebeu verapamil dissolvido em água deionizada na
dose de 0,8mg/ml/rato/dia denominada "dose alta" (D1), e o outro, 0,08
mg/ml/rato/dia, denominada "dose baixa" (0 2 ) Os animais foram tratados
durante 10 semanas, a saber, 7 semanas antes do acasalamento
semanas durante a prenhez, ao termo
e 3
da qual foi realizada a cesariana.
Cada rata recebeu, diariamente, 30 ml de solução de verapamil e esgotada
esta, era oferecida água sem a droga.
somaram 24 mg/rato/dia
Paralelamente foram
Cdose alta.. ) e 2,4 mg/rato/dia Cdose baixá").
realizadas
experimentais comparáveis,
As doses diárias de verapamil
experiências
controle
em
condições
porém sem administração de verapamil.
Os
pesos dos animais foram verificados semanalmente.
Foi adicionada sacarose na proporção de 0,5g/rato/dia na água de
beber do grupo controle e do grupo tratado.
35
5.3.2- Acasalamento dos animais
As ratas foram colocadas com machos durante a noite e pela manhã
colhia-se material vaginal para verificar a presença de espermatozóides,
determinando-se, se positiva, a instalação de prenhez.
5.3.3- Diagnóstico da prenhez
Foi realizado esfregaço de secreção vaginal, em lâmina de vidro,
utilizando-se uma alça de platina, que, depois de flambada, era colocada em
solução de NaCI a 0,9%, estéril e introduzida na vagina para a coleta de
secreção.
Constatada ao microscópio óptico a presença de espermatozóides e
verificada a fase estro do ciclo estral, fatores estes determinados para
diagnóstico positivo de prenhez, esse era considerado como dia zero da
gestação.
36
5.3.4 - Cesariana. contagem de implantes uterinos. filhotes e reabsorções fetais.
Coleta de sangue das mães e filhotes. Retirada do fêmur das mães.
Ao 21° dia de prenhez, as ratas foram anastesiadas com éter etílico,
pesadas e presas em decúbito dorsal em placa de cortiça. Foi feita incisão
mediana no abdômen com exposição dos cornos uterinos, e retirada amostra
de sangue arterial pelo segmento da aorta anatomicamente localizado na
altura do diafragma. Excisava-se o útero e contava-se o número
de
implantes, reabsorções fetais e/ou número de filhotes de cada corno. Foram
retirados e pesados os filhotes. Após análise macroscópica dos recémnascidos, seccionou-se as cabeças por decapitação e colheu-se amostra de
sangue de quatro filhotes,
fazendo-se um "pool" para cada ninhada. Do
sangue heparinizado das mães e filhotes obteve-se o plasma por
centrifugação a 4.000 r.p.m., durante 10 minutos, processando em seguida a
determinação espectrofotométrica de cálcio, fosfato inorgânico e proteínas
totais. Das mães, retirou-se
também, o fêmur, para determinação de
comprimento e pesos úmido e sêco.
O número de implantes, que corresponde à somatória dos filhotes e
das reabsorções uterinas,
era confirmado realizando-se a contagem do
corpo lúteo gravídico, o qual corresponde ao número de óvulos liberados na
fecundação.
37
5.3.5- Estudo dos filhotes
5.3.5.1- Análise macroscópica
Os filhotes foram limpos, secos em papel de filtro e pesados A seguir,
com auxílio de lupa de pequeno aumento, fez-se a análise macroscópica dos
mesmos, observando-se possíveis alterações morfológicas, tais como:
implantação das orelhas, olhos, conformação craniana fenda labial e
desenvolvimento dos membros inferiores e superiores.
5.3.5.2 -Análise microscópica dos germes dentários- Histologia
Após a análise macroscópica dos filhotes, separaram-se as cabeças
dos troncos (ocasião em que foi colhida amostra de sangue) fixando-as em
formal a 10%, por 24 horas. Após, foram seccionadas em plano mediano,
diafanizadas e incluídas em parafina para confecção de lâminas. Foram
separados aleatoriamente 4 filhotes de cada mãe.
As peças foram cortadas em micrótomo, na espessura de seis micras,
montadas em lâminas, e a seguir coradas pelo método histoquímico de Von
Kossa (1901). Ao microscópio, foram observadas células da polpa, tecido
alveolar e o próprio germe dentário.
38
5.3.6- Dosagens bioquímicas do sangue das mães e filhotes
5. 3. 6. 1- Concentração de cálcio plasmático
As concentrações de cálcio das amostras de sangue das mães e dos
filhotes
foram
determinadas
espectrofotometricamente
pelo
método
compleximétrico. O método se baseia na combinação dos íons de cálcio
com 0-cresolftaleína-complexona
em solução alcalina, formando um
complexo colorido que é medido espectrofotometricamente. A intensidade
de cor é proporcional à concentração de cálcio presente na amostra. Leu-se
em 570nm, em Espectrofotômetro Beckman Du-600. Utilizou-se "Kit" de
reagentes Merck. Os resultados foram traduzidos em mg/1 00 ml.
5.3.6.2- Concentração de fosfato plasmático
As concentrações de fosfato inorgânico das amostras de sangue das
mães e dos filhotes foram determinadas pelo método colorimétrico de FISKE
e SUBAROW, (1925). No método, o molibdato de amônio, em presença de
fósforo inorgânico, forma o fosfomolibdato de amônio que, posteriormente é
reduzido a azul de molibdenio e medido
espectrofotometricamente. A
intensidade de cor foi medida no comprimento de onda de 650 nm. Utilizouse "Kit" de reagentes Bioclin. Os resultados foram expressos em mg/100 ml.
39
5.3.6.3- Concentração de proteínas totais plasmáticas
As
concentrações de proteínas totais da amostra de sangue das
mães e dos filhotes foram determinadas pelo método fotocolorimétrico do
biureto .. As proteínas totais em presença de íons Cu+ 2 , em meio alcalino,
reagem-se formando um complexo de cor violeta, cuja intensidade de cor é
proporcional à concentração de proteínas totais, presentes na amostra. A
leitura espectrofotométrica foi feita no ponto de absorção máxima de 630
nm. Utilizou-se "Kit" de reagentes Bioclin. Os resultados foram expressos
em g/100 mL
5.3.7- Estudo das mães
5.3.7.1 -Análise do desenvolvimento ósseo
5.3.7.1.1 - Determinação do comprimento. peso úmido e peso seco do fêmur
das mães
Do osso femoral removeu-se todo tecido mole por raspagem. Após,
foi lavado em acetona e seco, determinando-se:
a) comprimento do osso através de paquímetro;
b) peso úmido, em balança semi-analítica,
c) peso seco, (700°C por 24 horas em forno de fundição) em balança
analítica.
40
5.4 - Sistematização da pesquisa
Para todo o experimento, foram utilizadas 52 ratas.
Desse lote, separaram-se,
aleatoriamente,
1O ratas
que foram
destinadas à observação de ingestão diária de água com, ou sem verapamil.
As 42 ratas restantes foram
separadas,
pesadas e divididas
aleatoriamente em grupos 1, 2 e 3, como segue:
Grupo 1 - Controle: Formado por 14 ratas, que colocadas em gaiolas individuais,
receberam ração e água sem adição de verapamil, durante
1O semanas, a saber, 7 semanas antes e 3 semanas durante
a prenhez.
Grupo 2 -Tratado:
2.1 - Formado por 18 ratas, que, colocadas em gaiolas individuais, receberam
ração e tratamento com verapamil na proporção de 0,8 mg/ml/dia (24
mg/rato/dia) de água de beber durante 1O semanas,
antes e 3 semanas durante a prenhez.
a saber, 7 semanas
41
2.2 - Formado por 1O ratas, organizadas da mesma maneira que o grupo anterior,
sendo que recebiam tratamento com verapamil na proporção de 0,08
mg/ml/dia (2,4 mg/rato/dia).
O verapamil foi administrado por via oral, na água de beber,
diariamente,
preparado da seguinte maneira: trituravam-se,
em graal de
porcelana; comprimidos de Dilacoron®, dissolviam-nos em água deionizada,
filtrava-se a solução e transferia-se quantítativamente para um balão
volumétrico, para completar o volume com água deionizada q.s.p. 30ml por
rata. Adicionava-se sacarose na proporção de 0,5g/rato/dia, para melhorar o
sabor da solução. Colocava-se em frascos, tipo mamadeira, distribuindo-se
um por gaiola. Para as ratas do grupo controle também se colocou igual
proporção de sacarose em água deionizada,
para padronização de
experiência. O volume da solução de verapamil oferecida a cada rata,
diariamente,
experiência
foi padronizado de acordo com resultados obtidos de
piloto,
previamente realizada,
quando 10 animais foram
observados durante o período de sete dias.
Calculando-se a média de consumo semanal de água, por rata,
constatou-se que 30 mlldia seria o volume adequado para padronização da
experiência, se cada rata ingerisse totalmente a droga dissolvida, na
concentração proposta pelo esquema experimental. Este volume estaria
sujeito a ajustes de acordo com a temperatura ambiente. Após a ingestão
completa do volume padrão de 30 ml de solução com verapamil, oferecia-se,
se necessário, água deionizada pura.
42
As ratas mães dos grupos controle e tratado receberam água pura ou
adicionada de verapamil durante 7 semanas, quando foi realizado o
acasalamento, continuando-se o tratamento até o termo da gestação (21°
dia). Nessa ocasião, foi realizada operação cesariana, colheu-se o sangue
das mães para dosagens bioquímicas, após o que, foram sacrificadas. Após
análise macroscópica, os filhotes foram pesados, sacrificados, separadas as
cabeças para histologia, ocasião em que se realizou a coleta de amostras de
sangue de cada qual, para dosagens bioquímicas, fazendo-se um "pool" de 4
filhotes. Foi extraído
também o fêmur das mães para medida de
comprimento, pesos úmido e seco.
5.5 - Anâlise Estatística
Como o experimento não apresentou homogeneidade de variância entre
os grupos estudados, (teste de Bartlett) utilizamos a análise de variância não
paramétrica de Kruskal Wallis.
Uma vez verificada a diferença significativa entre os grupos estudados,
efetuamos o teste de comparação múltipla, para identificar quais grupos diferem
significativamente, mediante o programa computacional GMC (versão 7.0, 1996)
que segue CONOVER, W.J.(1980).
43
6. RESULTADOS
Constam a seguir os resultados obtidos para o grupo controle e para os grupos
tratados com verapamil por tempo prolongado, nas doses de 24 mg/rato/dia (0 1)
e 2,4 mg/rato/dia (02).
6. 1. - Número de implantações uterinas
Os dados da tabela 1 referem-se ao número de implantações uterinas de ratas
prenhes dos grupos controle e tratadas com verapamil, na água de beber, deionizada,
na dose de 24 mg/rato/dia (01), 2,4 mg/rato/dia (02 ) durante 10 semanas.
Observa-se que as ratas do grupo controle apresentaram média de 8,1 ±2,4
no número de implantações uterinas, enquanto que os animais tratados por 1O
semanas e submetidos à cesariana, apresentaram média de 13,3±4,2 (0 1 ) e
13,0±2,7 (02).
Verifica-se aumento significante do número de implantações uterinas, nos
animais tratados em relação aos animais do grupo controle. O número de
implantações correspondeu ao número de óvulos liberados na época da
fecundação.
Os resultados constam na tabela 1 e são ilustrados no gráfico 1.
44
Tabela 1- Número de implantações uterinas de ratas prenhes dos grupos controle
e tratado com verapamil
na água de beber na dose de 24 mg/rato/dia
(01) e 2,4 mg/rato/dia (02)
durante 10 semanas*
cesariana, ao 21° dia de gestação.
Número de implantações uterinas por rata
controle
5
5
10
10
7
9
6
10
10
9
5
13
8
7
8,1
Média
O.Padrão ±2,4
Mediana
8,5
Tratado (01)
Tratado (02)
13
12
13
15
18
15
16
14
16
15
18
18
02
12
09
06
13
15
16
12
11
12
16
13
18
9
11
12
13,3
±4,2
14,5
13,0
±2,7
12,0
* 7 semanas antes e 3 semanas durante a prenhez.
e submetidas a
45
Tabela 1 A-
Análise de variância (tste de Kruskai-Wallis), relativa aos dados da
tabela 1.
Resultado do Teste de Kruskai-Wallis
Valor (H) de Kruskai-Wallis calculado
21.2988
Valor do X2 para 2 graus de liberdade
21.30
Probabilidade
H calculado
de
Ho
para
esse
valor
0.00%
*Significante ao nível,de 1% (a= 0,01)
Comparação entre médias dos postos das amostras
Amostras comparadas
Diferenças
(Comparações duas a duas) entre médias
Valores Críticos (a)
0,05
0,01
0,001
Signifícância
Controle
XD1
20.0833
5.8211
7.7935
10.2446
0,1%
Controle
XD2
11.1500
6.7635
9.0552
11.9032
1%
01
XD2
8.9333
6.4427
8.6258
11.3387
1%
46
6.2 - Número de reabsorções fetais
Pôde ser verificado pela tabela 2 que não houve nenhuma reabsorção fetal
nas ratas prenhes do grupo controle.
Observa-se ainda, que as ratas prenhes tratadas por 1O semanas com a
droga, em ambas as doses (24mg/rato/dia - (0 1 ) e 2,4 mg/rato/dia - (0 2 ))
apresentaram aumento significante na média do número de reabsorções,
correspondendo, em valores percentuais, a 61% e 30% respectivamente.
Os resultados constam na tabela 2 e gráfico 1.
47
Tabela 2 - Número de reabsorções fetais de ratas prenhes dos grupos controle e
tratado com verapamil na água de beber, na dose de 24 mg/rato/dia
(01) e 2,4 mg/rato/dia (02 ) durante 10 semanas* submetidas a
cesariana, ao 21° dia de gestação.
Número de reabsorções fetais por rata
Controle
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
Tratado(D1)
Tratado(D2)
o
o
01
13
11
12
12
7
9
02
16
14
16
15
14
4
12
o
9
o
o
18
o
12
9
6
13
15
Média
o
O.Padrão O
Mediana o
10,1
±6,0
12,5
5,8
±5,5
6,5
* 7 semanas antes e 3 semanas durante a prenhez.
48
Tabela 2 A- Análise de variância (teste de Kruskai-Wallis}, relativa aos dados da
tabela 2.
Resultado do Teste de Kruskai-Wallis
Valor (H) de Kruskai-Wallis calculado
16.4497
Valor do X2 para 2 graus de liberdade
16.45
Probabilidade
H calculado
de
Ho
para
esse
valor
0.03%
*Significante ao nível,de 1% (a:= 0,01)
Comparação entre médias dos postos das amostras
Diferenças
Amostras comparadas
(Comparações duas a duas) entre médias
Significância
Valores Críticos (a)
0,001
0,05
0,01
Controle
XD1
16.8889
6.9894
9.3577
12.3009
Controle
XD2
14.7500
8.1210
10.8727
14.2923
01
XD2
2.1389
7.7359
10.3571
13.6146
0,1%
0,1%
ns
49
6.3 - Número de nascidos vivos
Analisando a tabela 3, verifica-se que as ratas tratadas com verapamil nas
doses de 24/mg/rato/dia (01) e 2,4 mg/rato/dias (02),
por 10 semanas,
apresentaram redução estatisticamente significante de nascimentos de filhotes,
havendo uma diminuição de 61% nas ratas tratadas com a dose maior e de 30%
naquelas, tratadas com a dose menor.
50
Tabela 3- Número de nascidos vivos (= número de implantações - número de
reabsorções) de ratas dos grupos controle e tratado com verapamil na
água de beber nas doses de 24 mg/rato/dia (D1) e 2,4 mg/rato/dia (D2)
durante 1O semanas*.
Número de nascidos vivos por rata
Controle
5
5
10
10
7
9
6
10
10
9
5
13
8
7
Média
8,1
O.Padrão ±2,8
8,5
Mediana
Tratado (01)
13
11
o
Tratado (02)
16
o
11
4
o
11
13
7
o
o
o
o
9
6
o
11
12
4
o
2
o
o
o
o
o
3,22
±5,67
o
7,2
±5,8
8,0
*7 semanas antes e 3 semanas durante a prenhez.
51
Tabela 3 A- Análise de variância (teste de Kruskai-Wallis), relativa aos dados da
tabela 3.
Resultado do Teste de Kruskai-Wallis
Valor (H) de Kruskai-Wallis calculado
6.0727
Valor do X2 para 2 graus de liberdade
.6.07
Probabilidade
H calculado
de
Ho
para
esse
4.80%
valor
*Significante ao nível,de 1% (a= 0,01)
Comparação entre médias dos postos as amostras
Amostras comparadas
Diferenças
(Comparações duas a duas) entre médias
Valores Críticos (a.)
0,05
0,01
Significância
0,001
Controle
XD1
11.4167
8.1303
10.8851 14.3086
1%
Controle
XD2
2.2000
9.4465
126473
16.6251
ns
01
XD2
9.2167
8.9986
12.0476 15.8368
5%
Representação Gráfica dos dados das Tabelas 1, 2 e 3
Gráfico 1 - Valores médios de implantações uterinas, reabsorções fetais e nascidos vivos de ratas controle e
tratadas com verapamil nas doses de 24mg/rato/dia (01) e 2 ,4mg/rato/dia (02)
14
12 +---
- -1
10
11)
,
~ontrote
8
ratado (01)
.~
I
-G>
E
6
4
+----1
2 I
I
O I
.,..,
Implantações
Reabsorções
Nascidos vivos
I
ratado (02)
53
6.4 - Análise macroscópica dos filhotes
A análise macroscópica dos filhotes, realizada com auxílio de uma lupa de
pequeno aumento, não detectou alterações morfológicas quanto a implantações
das orelhas, olhos, conformação craniana, desenvolvimento dos membros
inferiores e superiores, em nenhum dos grupos experimentais estudados.
54
6.5 - Peso médio dos nascidos vivos
Os dados das tabelas 4 e 5, referem-se ao peso (g) individual dos nascidos
vivos de ratas dos grupos controle e tratadas com verapamil na água de beber,
deionizada, nas doses de 24mg/rato/dia (01) e 2,4 mg/rato/dia (0 2) durante 10
semanas.
Verificam-se alterações significantes do peso médio entre animais dos
grupos Controle e Tratado, constatando uma diminuição de peso em cerca de 18%
para os animais do grupo Tratado (01) e de 10% para os do grupo Tratado (02).
Tabela 4 - Peso individual (em gramas) de nascidos vivos (por ninhada) de ratas do grupo Controle e submetidas a
cesariana ao 21° dias de gestação.
Peso individual dos nascidos vivos por ninhada (g)
Controle
ninhadas
1
8,00
2
8,40
3
7,90
4
8,00
5
8,00
6
8,00
7
8
8,00
8,00
8,40
7,90
7,90
8,00
8,00
8,50
8,40
7,80
8,00
8,00
8,00
8,30
7,80
7,50
8,50
8,30
7,00
8,00
9
7,60
10
8,00
11
8,00
12
7,60
13
8,00
14
8,00
8,00
7,90
7,90
8,00
8,00
7,60
8,00
8,00
7,90
8,00
7,90
7,90
8,00
8,00
7,60
8,00
8,00
8,00
7,90
8,00
7,90
7,90
7,90
8,00
7,90
7,90
8,00
7,50
8,00
8,00
8,00
7,80
7,90
8,50
8,00
7,90
7,80
8,00
7,50
7,90
8,50
8,00
8,00
7,90
7,60
8,50
7,90
8,00
8,00
7,50
7,90
8,50
7,90
7,80
8,00
7,90
8,00
8,00
8,00
7,90
7,80
7,90
8,00
8,00
7,90
7,90
8,00
7,90
8,00
8,00
7,70
7,60
8,00
7,60
7,90
8,00
7,70
7,60
7,60
7,60
7,60
7,90
7,95
8,00
7,86
7,85
8,14
7,80
8,07
8,00
8,20
8,36
7,71
7,74
Média
D.Padrão
±0,27 ±0,05 ± 0,29 ±O, 19 ±0,24 ±0,05 ±0,00 ±O, 10 ±O, 17 ±0,24 ±0,00 ±0,16
8,00
7,90
7,90
8,00
8,00
7,90
8,00
8,00
7,85
7,60
8,00
8,40
Mediana
*7 semanas antes e 3 semanas durante a prenhez.
**Média, desvio padrão e mediana correspondente aos valores individuais de todas as ninhadas.
7,96
±0,07
8,00
8,00
±0,00
8,00
Tabela 5- Peso individual, em gramas, dos nascidos vivos (por ninhada) de ratas com gestação à termo dos grupos
tratados com verapamil na água de beber, durante 10 semanas*, nas doses de 24 mg/rato/dia (0 1 ) e 2,4
mg/rato/dia (0 2 } e submetidas a cesariana, ao 21°. dia de gestação.
Peso individual dos nascidos vivos por ninhada (g)
Tratado (01)
ninhadas
Média
D.Padrão
Mediana
Tratado (02)
1
2
3
4
5
6
7
1
2
3
4
5
6
7
5,90
5,90
6,00
6,40
6,60
6,60
6,80
6,80
6,70
7,00
7,00
5,90
5,90
6,50
6,50
5,80
6,80
5,80
6,50
5,90
5,90
6,80
6,90
6,90
7,00
7,00
7,00
6,90
6,40
6,90
6,40
5,90
6,60
6,50
5,90
6,80
5,90
6,80
6,90
6,40
6,40
6,40
6,50
5,90
5,80
5,80
6,50
6,50
6,40
6,80
6,80
6,90
7,00
5,90
5,90
7,00
7,00
7,00
7,50
7,50
7,50
7,90
7,60
7,60
7,00
7,00
6,90
6,90
7,00
7,20
7,20
7,00
6,90
6,90
7,00
7,20
7,20
6,90
6,90
7,30
7,30
6,80
6,80
7,30
7,00
6,90
6,90
7,00
7,00
7,00
7,30
7,30
7,60
7,60
6,90
6,70
7,00
7,00
7,20
7,50
7,50
7,30
7,30
7,30
7,40
7,00
7,50
6,50
6,50
6,50
7,00
7,00
7,00
7,50
7,50
7,50
6,50
6,50
7,90
7,90
7,20
7,20
7,80
7,80
7,80
8,00
8,00
8,00
8,00
8,00
6,47
±2,40
6,60
6,89
±0,45
0,50
6,97
±0,05
7,00
6,43
±0,40
6,50
6,39
±0,30
6,49
7,22
±0,32
7,10
7,06
±0,20
7,00
7,05
±0,17
7,00
6,90
±0,40
7,00
7,80
±0,30
7,90
- --
6,45
±0,63
6,45
7,00
±0,00
7,00
7,22
±0,33
7,20
*7 semanas antes e 3 semanas durante a prenhez
**Média, desvio padrão e mediana correspondente aos valores individuais de todas as ninhadas.
7,30
±0,16
7,30
y
57
Tabela 4 A- Análise de variância (teste de Kruskai-Wallis), relativa aos dados
das tabelas 4 e 5.
Resultado do Teste de Kruskai-Wallis
Valor (H) de Kruskai-Wallis calculado
21.6659
Valor do X2 para 2 graus de liberdade
21.67
Probabilidade
H calculado
de
Ho
para
esse
valor
0.00%
*Significante ao nível,de 1% (a= 0,01)
Comparação entre médias dos postos das amostras
Amostras comparadas
(Comparações duas a duas)
Diferenças
entre médias
0,05
Valores Críticos (a)
0,01
0,001
Significância
Controle
XD1
17.0357
3.6209
4.8987
6.5475
0,1%
Controle
XD2
10.2500
3.6209
4.8987
6.5475
0,1%
XD2
6.7857
4.1810
5.6566
7.5604
1%
58
6.6- Comprimento, peso úmido e peso seco dos fêmures de mães.
Constam na tabela 6 e gráfico 2, os resultados referentes ao comprimento,
peso úmido e peso seco de fêmures de ratas controle e de ratas tratadas com
verapamil nas doses de 24 mg/rato/dia (01) e 2.4 mg/rato/dia (02 ) durante 10
semanas (7 semanas antes e 3 semanas durante a prenhez).
Os dados mostram que não houve alterações estatisticamente significante
no comprimento do fêmur de ratas tratadas com verapamil, nas duas doses.
Os dados das tabelas 6 mostram que nas ratas tratadas com verapamil, em
ambas as doses, ocorreu aumento estatisticamente significante dos pesos úmido e
seco dos fêmures.
Tabela 6-
Comprimento, peso úmido e peso seco de fêmures de ratas controle e tratadas com verapamil nas
doses de 24 mg/rato/dia (01) e 2,4 mg/rato/dia (02).
Comprimento (mm) de fêmur
Controle
Média
D.Padrão
Mediana
Tratado
(O,)
Tratado
(02)
Peso úmido (mg)
Peso seco (mg)
Conrole
Tratado
(O,)
Tratado
(02)
Controle
340
320
300
250
322
273
377
300
300
252
270
315
345
345
21
21
21
20
35
36
36
37
35
35
36
35
36
36
36
36
38
36
35
35
36
37
35
22
21
20
21
21
21
20
21
29
31
30
30
30
30
31
29
30
29
825
884
866
835
600
600
740
620
590
500
640
570
620
700
851
894
872
780
852
811
854
815
880
959
867
837
780
902
963
872
755
767
633
769
800
720
689
696
674
674
635
690
31,57
±7,15
35,00
28,88
±7,80
35,00
29,90
±0,73
30,00
685,00
±123,75
630,00
850,61
±59,45
853,00
698,00
±53,10
689,50
Tratado
(O,)
Tratado
(02)
330
341
390
370
323
342
339
347
366
390
360
330
340
350
340
357
392
362
347
350
347
349
330
340
340
350
350
349
307,78
±37,49
307,50
*?semanas antes e 3 semanas durante a prenhez.
**Média, desvio padrão e mediana correspondente aos valores individuais de todas as ninhadas.
353,83
±21,21
348,50
345,20
±6,58
348,00
60
Tabela 6 A- Análise de variância (teste de Kruskai-Wallis), relativa aos dados da
tabela 6, referentes ao comprimento e ao peso úmido do fêmur.
Resultado do Teste de Kruskal-wallis,
relativo ao comprimento do fêmur
Valor (H) de Kruskai-Wallis calculado
2.0871
Valor do X2 para 2 graus de liberdade
2.09
Probabilidade de Ho para
H calculado
* Não significante (a> 0,05)
esse
valor
35.22%
Resultado do Teste de Kruskal-wallis,
relativo ao peso úmido do fêmur
Valor (H) de Kruskai-Wallis calculado
19.5686
Valor do X2 para 2 graus de liberdade
19.57
Probabilidade de Ho para esse
H calculado
*Significante ao nível de 1% (a> 0,01)
valor
O. 01%
Comparação entre médias dos postos das amostras
Amostras comparadas
(Comparações duas a duas)
Significância
Diferenças
entre médias
0,05
0,01
0,001
Valores Críticos (a:)
Controle
XD1
17.0238
6.5549
8.7759
11.5361
0,1%
Controle
XD2
0.2571
7.6161
10.1967
13.4037
ns
01
XD2
16.7667
7.2549
9.7132
12.7681
0,1%
61
Tabela 6B- Análise de variãncia (teste de Kruskai-Wallis), relativa aos dados da
tabela 6, referentes ao peso seco do fêmur.
Resultado do Teste de Kruskal-wallis,
relativo ao peso seco do fêmur
Valor (H) de Kruskai-Wallis calculado
14.5887
Valor do X2 para 2 graus de liberdade
14.59
Probabilidade de Ho para esse
H calculado
*Significante ao nível de 1% (a.> 0,01)
valor
0.07%
Comparação entre médias dos postos das amostras
Amostras comparadas
(Comparações duas a duas)
Diferenças
entre médias
0,05
0,01
0,001
Significância
Valores Críticos (a)
Controle
XD1
15.9484
7.2649
9.7265
12.7857
0,1%
Controle
XD2
13.8929
8.4411
11.3012
14.8556
1%
01
XD2
2.0556
8.0408
10.7653
14.1511
ns
Representação Gráfica dos dados da Tabela 6
Gráfico 2 - Valores médios de comprimento em (mm) e pesos úmido e seco (mg) dos fêmures das ratas controle tratadas
com verapamil nas doses de 24 mg/rato/dia (01) e 2,4 mg/rato/dia (02)
---~ 400 . 00
900,00
800,00
350,00
700,00
300,00
600,00
I
1
1Peso
úmido (mg)
az3 Peso seco (mg)
250,00
':I
500,00
C)
E
I
200,00 E
E
400,00
150,00
300,00
100,00
200,00
50,00
100,00
0,00
0,00
Controle
Tratado (01)
Tratado (02)
L
-
comprimento (mm)
63
6. 7 - Dosagens bioguímicas
6.7.1- Concentração de cálcio plasmático das mães
Com relação às concentrações de Cálcio plasmático das mães, os dados
demonstrados na tabela 7 e gráfico 3, mostram que ocorreu diminuição
significante, em cerca de 11% nos animais do grupo tratado com a dose de 24
mg/rato/dia, enquanto que aquelas ratas tratadas com a dose de 2,4 mg/rato/dia,
os níveis séricos de cálcio são comparáveis aos do grupo controle.
64
6.7.2- Concentração de Cálcio plasmático dos filhotes
Os filhotes das mães dos grupos controle e tratado com verapamil nas
doses de 24 mg/rato/dia (01) e 2,4 mg/rato/dia (02), não mostraram diferenças
significantes, em relação à concentração de Cálcio plasmático. Esses valores
são, contudo, significativamente menores do que nas mães, em todos os grupos.
Os dados constam na tabela 8 e gráfico 4.
65
6.7.3- Concentração de fosfato plasmático das mães
Os dados da tabela 7 e gráfico 3 referem-se à concentração média de
fosfato plasmático das mães dos grupos controle e tratados 1O semanas (T1 O)
nas doses de 24mg/rato/dia e 2,4 mg/rato/dia.
Certifica-se que houve diminuição significante na concentração média de
fósfato plasmático das mães tratadas com a dose maior, não ocorrendo
naquelas tratadas com a dose mais baixa.
66
6.7.4- Concentração de fosfato plasmático dos filhotes
Pelos dados da tabela 8 e gráfico 4 não houve diminuição significante,
quanto à concentração média de fosfato plasmático dos filhotes de mães do
grupo tratado quando comparadas com os filhotes das mães do grupo controle.
Observa-se que houve uma diminuição significante nos níveis de
fosfato plasmático dos filhotes com relação as mães controle.
Não se demonstrou influência do tratamento com verapamil sobre o
fosfato de filhotes.
67
6.7.5- Concentração de proteínas totais plasmáticas das mães
Nas ratas tratadas com verapamil não ocorreram alterações significantes
na concentração média de proteínas totais plasmáticas, em relação às ratas
pertencentes ao grupo controle. Os resultados constam na tabela 7 e gráfico 3.
68
6. 7.6 -Concentração de proteínas totais plasmáticas dos filhotes
Os filhotes apresentaram níveis plasmáticos de proteínas totais
consideravelmente mais baixos do que as respectivas mães. Entretanto,
o
tratamento com verapamil nas duas doses, não causou alteração significante
desse parâmetro.
Os resultados onstam nas tabela 8 e gráfico 4.
Tabela 7- Concentrações plasmáticas de Cálcio (mg/100 ml), fosfato inorgânico (mg/100 ml) e proteínas totais
(g/100 ml) de ratas dos grupos controle e tratados com verapamil na água de beber, deionizada, nas
doses de 24 mg/rato/dia (0 1 ) e 2,4 mg/rato/dia (02), durante 10 semanas.
Concentrações plasmáticas por rata
Tratado (01)
Controle
Câlcio
Fosfato
Proteínas
Câlcio
Fosfato
Proteínas
5,44
3,36
3,55
5,58
3,51
5,25
3,51
5,37
5,02
2,18
2,36
5,14
2,56
5,08
1,19
5,09
5,02
3,60
3,19
4,45
2,98
5,04
2,78
5,77
2,03
7,65
3,05
6,05
3,32
5,62
1,38
5,25
2,98
5,85
2,79
Média
6,13
3,97
7,66
5,45
±0,74
D.Padrão
±0,28
±0,60
±0,80
±0,68
2,98
Mediana
6,08
4,18
7,46
5,25
• 7 semanas antes e 3 semanas durante a prenhez
**Média, desvio padrão e mediana correspondente aos valores
6,24
6,74
6,02
6,06
5,97
6,53
6,07
6,09
6,40
5,97
6,09
6,05
6,13
5,53
3,80
2,47
3,12
3,68
4,69
4,48
3,57
4,21
4,28
4,35
4,25
4,14
4,07
4,53
8,90
9,08
7,36
7,27
8,27
7,47
6,63
8,03
6,99
6,46
7,09
8,54
7,73
7,45
Tratado (D2)
5,86
6,07
6,00
7,44
6,89
5,92
5,94
7,47
6,97
8,07
7,45
7,63
7,27
8,28
8,36
6,86
7,81
7,07
±0,85
7,27
Câlcio
Fosfato
Proteínas
5,97
5,90
5,85
6,08
5,50
6,10
6,30
5,90
6,50
5,90
4,05
3,98
3,70
4,05
3,93
3,70
3,90
4.05
3,93
3,80
7,90
7,48
7,01
8,40
8,78
8,50
7,97
7,65
8,25
7,97
6,00
±0,27
5,93
3,90
±0,12
3,83
7,99
±0,52
7,97
individuais de todas as ninhadas.
70
Tabela
7A - Análise de variância (teste de Kruskai-Wallis),
relativa aos dados da tabela 7, referentes às
concentrações plasmáticas de Cálcio das mães.
Resultado do Teste de Kruskal-wallis
Valor (H) de Kruskai-Wallis calculado
19.0825
Valor do X2 para 2 graus de liberdade
19.08
Probabilidade
calculado
de
Ho
para
esse
valor
H
0.01%
*Significante ao nível de 1% (a> 0,01)
Comparação entre médias dos postos das amostras
Amostras comparadas
(Comparações duas a
duas)
Diferenças
Significância
Valores Críticos (a)
entre médias
0,05
0,01
0,001
Controle
XD1
18.1492
6.4924
8.6980
11.4447
0,1%
Controle
XD2
4.7286
7.4482
9.9785
13.1296
ns
01
XD2
13.4206
7.1692
9.6047
12.6377
0,1%
71
Tabela
78 - Análise de variância (teste de Kruskai-Wallis),
relativa aos dados da tabela 7, referentes às
concentrações plasmáticas de fosfato.
Resultado do Teste de Kruskal-wallis
Valor (H) de Kruskai-Wallis calculado
23.9672
Valor do X2 para 2 graus de liberdade
23.97
Probabilidade
H calculado
de
Ho
para
esse
valor
0.00%
*Significante ao nível de 1% (a.> 0,01)
Comparação entre médias dos postos das amostras
Amostras comparadas
(Comparações duas a duas)
Diferenças
Significância
Valores Críticos (a)
entre médias
0,05
0,01
0,001
Controle
X 01
19.5021
5.6850
7.6163
10.0214
0,1%
Controle
X02
2.4286
6.5220
8.7376
11.4968
ns
01
X02
17.0735
6.2776
8.4102
11.0661
0,1%
72
Tabela
7C - Análise de variância (teste de Kruskai-Wallis),
relativa aos dados da tabela 7, referentes às
concentrações de proteínas totais das mães.
Resultado do Teste de Kruskal-wallis
Valor (H) de Kruskai-Wallis calculado
7.9557
Valor do X2 para 2 graus de liberdade
7.96
Probabilidade de Ho para esse valor H calculado
1.87%
*Significante ao nível de 5% (a> 0,05)
Comparação entre médias dos postos das amostras
Amostras comparadas
(Comparações duas a
duas)
Diferenças
Significância
Valores Críticos (a)
entre médias
0,05
0,01
0,001
Controle
XD1
7.0105
8.0389
10.7698
14.1708
ns
Controle
XD2
6.2071
9.2224
12.3554
16.2571
ns
01
XD2
13.2176
8.8769
11.8925
15.6480
1%
Tabela 8- Concentrações plasmáticas de Cálcio (mg/100 ml), fósffato inorgânico (mg/100 ml) e proteínas totais (g/100
ml) de filhotes de ratas dos grupos controle e tratados com verapamil na água de beber, nas doses de 24
mg/rato/dia (D 1 ) e 2,4 mg/rato/dia (D2), durante 10 semanas*.
Concentrações plasmãticas por ninhada
Tratado (01)
Controle
Cálcio
Fosfato
Proteínas
Cálcio
Fósforo
Tratado (02)
Proteínas
Cálcio
Fósforo
Proteínas
5,19
3,20
2,68
3,50
2,41
5,30
2,60
4,30
3,45
5,21
3,86
2,59
5,10
2,25
2,70
4,45
3,82
5,09
1,66
3,94
2,26
3,58
5,12
5,40
2,38
3,35
3,13
4,83
1,87
2,05
3,19
4,95
2,20
5,28
2,90
5,09
1,80
3,03
4,39
3,31
5,40
2,60
3,60
5,77
3,15
1,86
4,95
5,61
2,20
2,95
2,07
3,13
5,25
5,30
2,30
3,50
3,44
2,41
5,37
3,22
2,32
6,13
3,27
2,76
5,61
3,27
3,03
5,97
3,38
1,93
5,33
3,35
2,25
5,13
3,26
2,68
4,45
Média
5,27
2,48
3,39
5,08
2,47
2,86
5,20
2,42
3,36
D.Padrão
±0,55
±0,42
±0,33
±0,15
±0,99
±0,75
±0,19
±0,27
±0,33
Mediana
5,30
2,36
3,27
5,09
1,87
2,51
5 30
2,38
3,45
* 7 semanas antes e 3 semanas durante a prenhez
**Média, desvio padrão e mediana correspondente aos valores individuais das ninhadas(pool de filhotes).
--
74
Tabela 8 A- Análise de variância (Teste de Kruskai-Wallis, relativa aos
dados da tabela 8.
Resultado do Teste de Kruskal-wallis,
relativo às concentrações plasmáticas de Cálcio
Valor (H) de Kruskai-Wallis calculado
2.5973
Valor do X2 para 2 graus de liberdade
2.60
Probabilidade de Ho para
H calculado
*Não significante (a> 0,05)
esse
valor
27.29%
Resultado do Teste de Kruskal-wallis,
relativo às concentrações plasmáticas de fosfato.
Valor (H) de Kruskai-Wallis calculado
0.4320
Valor do X2 para 2 graus de liberdade
0.43
Probabilidade de Ho para
H calculado
*Não significante (a> 0,05)
esse
valor
80.57%
Resultado do Teste de Kruskal-wallis,
relativo às concentrações plasmáticas de proteínas totais.
Valor (H) de Kruskai-Wallis calculado
Valor do X2 para 2 graus de liberdade
Probabilidade de Ho para esse valor
calculado
*Não significante (a> 0,05)
H
2.4538
2.45
29.32%
Representação Gráfica dos dados da Tabela 7
Gráfico 3 - Valores médios de concentracões plasmáticas de Cálcio e Fosfato (mg/1 OOml) e proteínas totais (g/1 OOml)
de ratas controle e tratadas com verapamil nas doses 24mg/rato/dia (01) e 2,4mg/rato/dia (02)
7 , 00 ~--------------------------------------------------------------
10,00
9,00
6,00
- 1 - --t
8,00
5,00 + - - -
7,00
Cálcio (mg/ 1OOml)
6,00
e 4,oo
o
o
....
o,
5,00
E 3,00
4,00
3,00
2,00
- 1 - - -- i
1,00
0,00 '
e
....g
c:n
+ -----;
2,00 +----1
1' 00
-
ma· wra
'------+
Controle
Tratado (01 )
Tratado (02)
o'00
Fosfato (mg/100ml)
..,._Proteína (g/100ml)
Representação Gráfica dos dados da Tabela 8
Gráfico 4 - Valores médios de concentracões plasmáticas de Cálcio e Fosfato (mg/1 OOml) e proteínas totais (g/1 OOml)
de filhotes de ratas controle e tratadas com verapamil nas doses 24mg/rato/dia (01 ) e 2,4mg/rato/dia (02)
6,00
·---~~ 6 , 00
5,00 +--
4,oo I
13,00
-1
I
IRI
t
nszw:'
'.61
I
5,00
Mft'ftt
I
4,00
Fosfato (mg/1 OOml)
_ !. . _Proteína (g/100ml)
E
...
3,00
0,00 '
....g
Ql
2,00
1,00 +--
j ~ Cálcio (mg/100ml)
2,00
---'
I
1-
1,00
' - - - + 0,00
'>'j'","
Controle
Tratado (01)
Tratado (02)
77
6.8 -Análises microscópicas dos germes dentários dos filhotes - Histologia.
Na análise histomorfológica dos germes dentários de todos filhotes , estudouse, ao 21° dia da prenhez ,deposição de cálcio no tecido ósseo e dentário, tecido
alveolar, células da polpa e o próprio germe dentário.
As características histomorfológicas parecem indicar maior deposição de
Cálcio no tecido dentinário dos germes dentários de filhotes oriundos de mães
tratadas com verapamil em ambas as doses, em relação aos oriundos de mães do
grupo controle.
Os germes dentários apresentaram morfologia segundo Farris & Griffith,
1971, Moore, 1976; Mjor, & Fejers, 1990, no estágio caracterizado por fase de
"campânula" do órgão do esmalte dental, figuras 1 A 18. As células mesenquimais
formadoras dos dentes de crescimento contínuo, aparecem em camadas contíguas ,
de odontoblastos que são células produtoras de dentina e de ameloblastos
produtores de esmalte dental. Observa-se a cavidade pulpar totalmente preenchida
por tecido conjuntivo frouxo, circundada por uma nítida e fina camada rósea, clara
de matriz de pré-dentina. Pode-se observar ainda aposição de larga camada mais
escura avermelhada, de tecido começando a formar a dentina propriamente dita e
aparentemente, ausência de esmalte dental, nos germes dentários dos filhotes de
mães do grupo Controle. (figuras 7 e 16).
Nos germes dentários dos filhotes de mães do grupo Tratado, na região
tecidual relativa a dentina propriamente dita, observa-se
uma larga camada de
78
tecido bem escuro, praticamente preto, com grande concentração de cálcio
uniformemente distribuída, compacta, nitidamente visível e totalmente diferenciada
em relação ao Controle. (figuras 8, 9, 17 e 18)
Aparece em seguida a esta uma camada de ameloblastos colunares présecretores evidenciando ausência da matriz do esmalte dental.
Circundando o germe dentário, verifica-se presença da formação do osso
alveolar, com trabéculas de matriz óssea , uniformes e regulares, separadas entre si
por tecido conjuntivo frouxo. A matriz óssea mostrou nitidamente a deposição de
substância mineral, de maneira bem uniforme em todos os filhotes estudados,
caracterizando maior deposição de cálcio na estrutura óssea dos filhotes de mães
tratadas com verapamil em ambas as doses.
79
Figura 1- Microfotografia de germe dentário (21° dia da gestação). Incisivo inferior,
corte longitudinal, de fi lhote oriundo de mãe Controle - VON KOSSA - 32X.
80
Figura 2- Microfotografia de germe dentário (21° dia da gestação). Incisivo inferior,
corte longitudinal, de filhote oriundo de mãe Tratada (01)- VON KOSSA- 32X.
Figura 3- Microfotografia de germe dentário (21 o dia da gestação). Incisivo inferior,
corte longitudinal, de filhote oriundo de mãe Tratada (0 2 ) - VON KOSSA- 32X.
81
Figura 4- Microfotografia de germe dentário (21 ° dia da gestação). Incisivo inferior,
corte longitudinal, de filhote oriundo de mãe Controle - VON KOSSA - 60X.
82
Figura 5- Microfotografia de germe dentário (21° dia da gestação). Incisivo inferior,
corte longitudinal, de filhote oriundo de mãe Tratada (0 1)- VON KOSSA - 60X.
Figura 6- Microfotografia de germe dentário (21 o dia da gestação). Incisivo inferior,
corte longitudinal, de filhote oriundo de mãe Tratada (02 ) - VON KOSSA - 60X.
83
Figura 7- Microfotografia de germe dentário (21 o dia da gestação). Incisivo inferior,
corte longitudinal, de filhote oriundo de mãe Controle - VON KOSSA- 160X.
Polpa dentária (3) Pré-dentina (2) Dentina (1 ).
84
Figura 8- Microfotografia de germe dentário (21° dia da gestação). Incisivo inferior,
corte longitudinal, de filhote oriundo de mãe Tratada {D 1) - VON KOSSA - 160X.
Polpa dentária (3), Pré-dentina (2) e Dentina (1)
Figura 9- Microfotografia de germe dentário (21° dia da gestação). Incisivo inferior,
corte longitudinal, de filhote oriundo de mãe Tratada (D 2 ) - VON KOSSA - 160X.
Polpa dentária (1 ), Pré-dentina (2) e Dentina (1 ).
85
Figura 10- Microfotografia de germe dentário (21° dia da gestação). Incisivo
superior, corte longitudinal, de filhote oriundo de mãe Controle- VON KOSSA- 32X.
86
Figura 11- Microfotografia de germe dentário (21° dia da gestação). Incisivo
superior, corte longitudinal, de filhote oriundo de mãe Tratada (0 1) - VON KOSSA32X.
Figura 12- Microfotografia de germe dentário (21° dia da gestação). Incisivo
superior, corte longitudinal, de filhote oriundo de mãe Tratada (02 ) - VON KOSSA 32X.
87
Figura 13- Microfotografia de germe dentário (21 o dia da gestação). Incisivo
superior, corte longitudinal, de filhote oriundo de mãe Controle - VON KOSSA- 60X.
88
Figura 14- Microfotografia de germe dentário (21° dia da gestação). Incisivo
superior, corte longitudinal, de filhote oriundo de mãe Tratada (01)- VON KOSSA 60X.
Figura 15- Microfotografia de germe dentário (21° dia da gestação). Incisivo
superior, corte longitudinal, de filhote oriundo de mãe Tratada (02 ) - VON KOSSA60X.
89
Figura 16- Microfotografia de germe dentário (21° dia da gestação). Incisivo
superior, corte longitudinal, de filhote oriundo de mãe Controle - VON KOSSA 160X. Polpa dentária (3), Pré-dentina (2) e Dentina (1 ).
90
Figura 17- Microfotografia de germe dentário (21 o dia da gestação). Incisivo
superior, corte longitudinal, de filhote oriundo de mãe Tratada (D1)- VON KOSSA 160X. Polpa dentária (3), Pré-dentina (2) e Dentina (1).
Figura 18- Microfotografia de germe dentário (21° dia da gestação). Incisivo
superior, corte longitudinal, de filhote oriundo de mãe Tratada (D2) - VON KOSSA160 X. Polpa dentária (3), Pré-dentina (2) e Dentina (1 ).
91
7 - DISCUSSÃO
•
Uma das grandes preocupações médicas e científicas em relação
ao uso indiscriminado de drogas por gestantes, está nos riscos que as mesmas
podem trazer para o feto em desenvolvimento.
Sabe-se que muitas substâncias medicamentosas administradas
antes, durante e depois da gestação, podem causar tanto alterações no
desenvolvimento embrionário, como resultar em organismos debilitados ou
portadores de malformações congênitas, incompatíveis com a sobrevi da. Tais
modificações orgânicas
podem ser de origem morfológica ou funcional,
observadas em várias espécies animais, inclusive no homem. Fator importante
a considerar é a relação entre mãe e unidade feto-placentária. A unidade fetoplacentária é complexa com propriedades específicas de absorção, distribuição
e eliminação de drogas.
As drogas chegam à placenta pela circulação materna
e seu
transporte depende da difusão através da membrana, da quantidade de droga
que chega ao local de transporte, do fluxo sangüíneo placentário, e da
permeabilidade da barreira placentária. Desta maneira, o feto está exposto,
essencialmente, á ação de drogas lipossolúveis administradas à mães, as quais
podem provocar anomalias congênitas ou efeitos adversos, sobre o concepto.
92
O embrião é mais sensível às agressões químicas do que o feto em
estágios mais avançados de desenvolvimento,
devido à alta taxa de
proliferação e menor diferenciação celular, desencadeadas em curto período de
tempo. A agressão indireta ao feto, através dos efeitos sobre a mãe, seja pelo
suprimento inadequado de nutrientes, conseqüentes de má nutrição materna,
fisíopatologia, ou diminuição do fluxo sangüíneo útero-placentário para o feto,
pode trazer conseqüências graves, como reabsorções fetais. O fluxo sangüíneo
materno-fetal pode ser mantido pela perfusão de outros órgãos maternos, mas a
homeostasia pode ser influenciada por altas doses de droga que alteram o
débito cardíaco.
No presente trabalho, foi observado que a administração de drogas
bloqueadoras dos canais de cálcio (BCC), por tempo prolongado, em diferentes
doses, em ratas, antes e durante a prenhez,
provocou elevado número de
reabsorções fetais, crescente em proporção direta às doses, sem causar,
contudo, nos filhotes que evoluíram para o nascimento, anomalias congênitas
mensuráveis,
caracterizando
embriofetotoxicidade
da
droga.
Uma
das
conseqüências visíveis sobre os resultados obtidos, ao invés de malformações,
parece ser um atraso no desenvolvimento somático dos filhotes, o que foi
verificado pela diminuição do peso, quando as mães foram tratadas com a dose
mais alta. Pode-se supor que o verapamil não foi tóxico para os fetos, em que
pese a menor metabolização de drogas nestes, em decorrência da baixa
atividade dos sistemas enzimáticos envolvidos na biotransformação de drogas.
Somam-se
ainda,
mecanismos de excreção
imaturos,
sobrepostos
à
93
combinação de uma barreira hematoencefálica pouco desenvolvida e mais
permeável.
A significante diminuição do número de nascidos-vivos, o menor
peso dos filhotes e as menores concentrações séricas de cálcio e fosfato,
podem estar associados ao transporte da droga em estudo, da mãe tratada para
o feto, através da unidade placentária. As conseqüências mais pronunciadas
para os recém-nascidos de cujas mães receberam o bloqueador dos canais de
cálcio na dose mais alta (24 mg/rato/dia), indicam a importância da relação mãe
e unidade feto-placentária, a ser considerada quando do uso clínico destas
substâncias, durante a gestação.
No presente trabalho, o esquema experimental de tratamento foi
semelhante ao adotado por Samnegard & Sjõdén (1992), quando estudaram a
influência do verapamil sobre o tecido ósseo de ratos, constatando que a droga
causou aumento do volume ósseo e osteopenia em ratas fêmeas, enquanto que
nos ratos machos ocorreu, contrariamente, aumento do peso das cinzas,
traduzindo maior volume de mineralização, a par de diminuição de volume.
Esses autores supõem que, se o verapamil age por estimulação de hormônios
androgênicos, isso poderia explicar por que as fêmeas desenvolveram
osteoporose,
enquanto que os ossos
dos machos
se tornaram
mais
mineralizados. Os resultados obtidos no presente trabalho, contrariam tal
hipótese, uma vez que se observou maior mineralização nos ossos de fêmeas
tratadas, ao lado de significante hipocalcemia. Por outro lado, é bem conhecido
que a absorção de cálcio aumenta durante a gravidez e lactação (Brommage et
94
ai., 1990). Tal não foi demonstrado neste trabalho, porque, apesar de fatores
que aumentam o aporte de cálcio, como sejam a gestação e o verapamil, ao lado
de dieta normal, fornecendo 0,360 mg/dia/rato do íon, a hipocalcemia foi a
resposta observada.
Durante o presente experimento as ratas não evidenciaram efeitos
colaterais associados ao verapamil, quando receberam a droga nas duas doses,
as quais corresponderam a 1,2 e 12 vezes àquelas usadas no homem.
Entretanto, Hofer et ai, 1993, relataram um índice significante de mortalidade,
causada por superdosagem de verapamil, envolvendo adultos e crianças. Para
trinta casos de intoxicação, dos quais oito tiveram êxito letal, as pacientes
apresentaram hipotensão, alteração da consciência, bradicardia, hiperglicemia
e outros. As doses de verapamil que causaram intoxicação, variaram de 0,48 g a
9,3 g. Foi demonstrado por Triggle & Swamy, 1992, que a ação seletiva dos
bloqueadores dos canais de cálcio, depende de vários fatores, dentre eles o
estado patológico do tecido; pacientes com disfunção hepática ou renal que
fazem uso de doses terapêuticas são passíveis de superdosagem, com
intoxicação decorrente.
Os resultados obtidos das ratas mães, submetidas ao esquema
experimental
proposto,
chamaram
a atenção visto
implantações uterinas - estimulado
que o número de
significativamente
pelo
verapamil
-
correspondeu ao número de óvulos liberados, mas não ao de filhotes: em 61%
das ratas tratadas com a dose mais elevada (D1), e em 30% daquelas tratadas
com a dose menor (0 2 ), houve reabsorção total dos embriões. Tais resultados
95
indicam que o verapamil, ao lado de estimular as respostas ovarianas das ratas,
induziu, em fases precoces da gestação, morte com reabsorção fetal, enquanto
que não afetou, de maneira aparente, os filhotes que sobreviveram a essa fase.
Sabe-se que o íon de cálcio exerce papel preponderante no desenvolvimento
dos tecidos mineralizados, principalmente ósseo e dentário. Assim, qualquer
alteração dos níveis de cálcio sérico pode causar desordens fisiológicas,
comprometendo as células responsáveis pelo crescimento e desenvolvimento
estrutural desses tecidos. A diminuição da concentração sérica do cálcio das
mães,
observada com a dose mais elevada (01) de verapamil,
pode estar
relacionada com o elevado índice de reabsorções fetais nas ratas tratadas,
afetando, em conseqüência, o número de filhotes nascidos vivos. Contudo essa
assertiva é contrariada pelo fato de que reabsorções fetais ocorreram também
em ratas tratadas com a dose dez vezes menor (02), e nas quais o nível de
cálcio sérico não foi significativamente alterado pelo verapamiL O aumento das
implantações uterinas correspondeu ao maior número de óvulos liberados; o
fato, observado nas mães tratadas com as duas doses de verapamil, é curioso e
de difícil explicação. Como já foi referido, tal aumento de implantações não
correspondeu a aumento do número de filhotes, ocorrendo, contrariamente,
diminuição significante de nascidos vivos. Pode-se especular, para verificação
futura, que o cálcio teria influenciado na atresia ovariana, a qual é calciodependente, induzindo a liberação de alguns óvulos imaturos, os quais, ainda
que implantados não evoluíram para a formação de filhotes. Como o número de
filhotes nascidos vivos foi significativamente menor do que nas ratas controle,
96
supõe-se uma toxicidade intrínseca do verapamil sobre o embrião, resultando
em reabsorção.
É bem
conhecido
que
os
mecanismos
concentrações fisiológicas de cálcio se processam,
de
controle
das
principalmente, sob
influência dos hormônios calcitonina (CT) e paratormônio (PTH), e de Vitamina
D. Mudanças nas concentrações de cálcio extracelular, podem influenciar a
liberação e secreção dos hormônios cálcio-regulatórios. Assim, a liberação da
calcitonina é diretamente proporcional às concentrações de cálcio do líquido
extracelular, enquanto que a do paratormônio, ocorre de maneira inversa.
A calcitonina atua como regulador de cálcio a curto prazo, eleva a
quantidade de cálcio na urina e inibe a reabsorção óssea, por mecanismos de
retroalimentação. O paratormônio é um regulador de cálcio a longo prazo. Por
mecanismos
de
retroalimentação,
aumenta
a
concentração
extracelular, pelo aumento da reabsorção tubular,
de
cálcio
aumenta a absorção
intestinal e mobiliza o cálcio do osso com subsequente reabsorção óssea. As
ações do paratormônio sobre o tecido ósseo implicam ativação da adenilatociclase com formação de AMPc, nas células alvo. Aumentam a permeabilidade
dos osteoclastos, osteócitos e osteoblastos para o cálcio, mobilizando-o do osso
para o líquido extracelular, sob estimulação de vitamina D; conseqüentemente,
dispara a formação de osteoclastos, diminuindo a síntese dos osteoblastos,
aumentando a reabsorção óssea.
Com base nessas informações, vários autores estudaram a
influência desses hormônios cálcio regulatórios e os efeitos das drogas
97
bloqueadoras dos canais de cálcio sobre o metabolismo de cálcio ósseo e
plasmático (Dziak & Stern, 1975;
Sjõden et ai., 1977, Ramp et ai, 1979,
Haberner et al.1984, Fox & Della Santina, 1989, Chagnac et ai, 1989, Zaidi et
ai., 1989; Datta, 1990; Kim et ai, 1991; Bogin et ai, 1981, Samnegard & Sjõden,
1992; Richtie et ai, 1994).
Conforme trabalho de Ritchie et ai, (1994), os osteosclastos
atuariam na superfície óssea mineralizada, reabsorvendo a matriz óssea,
liberando cálcio dentro de uma área circunvizinha a essas células, dando como
resultado final, aumento da concentração intracelular de cálcio e subsequente
reabsorção óssea local. Utilizando bloqueadores dos canais de cálcio em cultura
de células ricas em osteosclastos, observaram que esses fármacos poderiam se
ligar também aos canais de cálcio dos osteoclastos,
bloqueando-os e
promovendo aumento na concentração de cálcio intracelular, com significativa
diminuição na reabsorção óssea.
Foi demonstrado por Simekova et ai, 1987; Sjõden et ai,
1987;
Fox & Della-Santina, 1989, Chagnac et ai, 1989; Zaidi et ai., 1990; Kim et ai.,
1991; que o verapamil atua possivelmente bloqueando os canais de cálcio dos
osteoclastos, mimetiza os efeitos do cálcio extracelular, promove uma rápida e
sustentada elevação da concentração de cálcio intracelular, inibe a liberação e o
transporte de cálcio do tecido ósseo e diminui
a reabsorção,
facilitando a
deposição de cálcio no esqueleto.
Já que a integridade do tecido ósseo depende de modo crítico do
íon cálcio para o equilíbrio dinâmico entre absorção óssea e neoformação, é de
98
se esperar que ocorra,
também,
bloqueio dos canais de cálcio voltagem-
dependente do tipo L, existentes nas células osteoblásticas de rato, relatadas
por Grygorczyk et ai, 1989.
Foi observado no presente trabalho, em cortes histológicos de
germes dentários dos filhotes de mães tratadas com verapamil, maior deposição
de cálcio em tecido relativo à dentina,
a par de aparente aceleração na
organização tissular dessas estruturas. Por outro lado, observou-se elevação
dos pesos úmido e seco do fêmur das mães tratadas, fazendo supor que o
verapamil tenha estimulado o aporte de minerais para o tecido ósseo. Esse
resultado é coerente com os achados de Simekova et ai., 1987, quando
relataram aumento da concentração de cálcio e fósforo no osso de rato,
influenciado pelo verapamil.
Os resultados apresentados neste trabalho sugerem que se
estudem os efeitos do verapamil na incorporação de cálcio por ameloblastos e
osteoblastos, usando-se técnica de cultura de tecidos. Encontra-se em
andamento trabalho em que se verifica,
usando o presente esquema
experimental, a influência do verapamil no tempo de erupção dentária e na
calcificação de dentes de ratos, após o nascimento.
99
8. CONCLUSÃO
Os resultados do presente trabalho permitem concluir, que o
verapamil, no esquema experimental utilizado e nas duas doses empregadas, a
saber, 24 mg/rato/dia (D1) e 2,4 mg/rato/dia (0 2).
a) não induziu sinais de intoxicação nas mães tratadas durante 1O semanas,
embora a dose mais elevada tenha causado hipocalcemia, aparentemente
assintomática;
b) a droga causou significante aumento do número de óvulos liberados na
fecundação e correspondente aumento de implantações uterinas; acarretou,
contudo, elevada taxa de reabsorção fetal e correspondente diminuição do
número de filhotes nascidos vivos. O efeito embriotóxico foi maior com a dose
mais elevada (O,).
c) a droga não apresentou efeito teratogênico, embora tenha sido observada
redução de peso dos filhotes.
d) em mães, e somente com a dose mais elevada, foi observada redução dos
níveis plasmáticos de cálcio e fosfato, enquanto que nos filhotes, os níveis
foram comparáveis aos controles. Entretanto, os níveis plasmáticos de cálcio,
fosfato e proteínas nos filhotes, foram significativamente mais baixos que nas
respectivas mães.
100
e) nas ratas tratadas com verapamil, nas duas doses, ocorreu aumento dos
pesos úmido e seco dos fêmures, indicando aumento da mineralização. O
comprimento do osso foi, contudo, reduzido.
f) nos germes dentários de filhotes de mães tratadas com ambas as doses, o
verapamil induziu maior deposição de cálcio na dentina, a par de aparente
aceleração na organização tissular dessas estruturas, traduzindo maior
mineralização de tecidos.
101
9. SUMMARY
Calcium channel blockers are widely used in therapeutics, usually
in long term treatments, often in pregnant women. lt was íntended, thís occasíon,
to study the effects of verapamíl on dental germ of new-born from mothers
treated with this drug, before and duríng pregnancy. lt was studíed the effects of
the drug on uteríne implantatíon, fetal reabsorption, bone development and
serum leveis of calcium, phosphate and total proteins in mothers and new-born.
lt was used 73 Wistar rats (Ratus norvergicus, var. Albinus), quality
controlled. The female were randomly divided in 3 groups, as fallows: the first
receíved verapamil in doses of 24 mg/raVday, named group (01) the second
received the drug in doses of 2.4 mg/raVday, named group (02); the third was a
control group. The rats were kept in individual cases and received the drug in the
drinking water during 1O weeks: 7 weeks before mating and three weeks during
pregnancy. The cesarean surgery was performed at the 21st day. This occasion,
heparinized blood samples were taken (to biochemical determinations) as well as
ísolated the femoral bone (to bone development determinatíon). The new-born
heads were isolated to hístology of dental germs and taken blood samples to
biochemical determinatíons.
To statistical analysis of the results were analyzed using nonparametrics Kruskai-Wallis variance test.
102
Results
show
that
verapamil
stimulates
ovarian
ovulation,
increasing the uterine implantation, induced early fetal death and reabsorption
but no malformation in the fetuses that succeed in overcoming this phase.
lt was observed that verapamil caused no sign of intoxicatíon to
mothers, but induced a lower serum calcium levei when the higher dose was
used.
Verapamil, in booth doses, induced a higher deposition of calcium
in the dental germ accelerated its tissue organization. These results are coherent
with the finding that verapamil increased femur wet and dry weight, indicating a
hígher mineral bone depositíon.
KEY-WORDS: calcium channel blockers, verapamil, dental germ.
103
10. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1 - ABERNETHY, D.R., GUTKOWSKA, J., LAMBERT, M.D.
Amlodipine in
elderly hipertensive patients: pharmacokinetics and pharmacodynamics.
J. card.lovasc. Pharmac.,.NewYork, v 12, n.p. 567-571, 1988.
2 -AIRES, M.M. et ai. Fisiologia médica. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan,
1991, 795 p.
3- AMORIM, J.B.O. Efeitos da isradipina (LOMIR). Agente inibidor de canais
de cãlcio no processo de reparo em feridas de extração dental:
estudo histológico em ratos. Dissertação (Mestrado em Odontologia,
Área de Prótese-Buco-Maxilo-Facial) Faculdade de Odontologia do
Campus de São José dos Campos Universidade Estadual Paulista "Júlio
de Mesquita Filho", 1995. 76p.
4 - ANDERSON, P., BONDESSAN, U., FAIRE, U.
verapamil in patients with hyppertension.
York, v.31, n.p. 155-163, 1986.
Pharmacokinetics of
Eur. J. clin. Pharmac., New
104
5- BAGUNSKI, E. S., et ai. Direct determination of serum calcium. Clínica Chim.
Acta., Amsterdam, v.46, n.p. 49-54, 1973.
6- BARTELS, P.C., ROIJERS, A.M.F. A kinetic study on the influence of the
parameters
in the
determínation of ínorganíc phosphate
by
the
molybdenum blue reaction. Clínica Chim. Acta, v.61, n.p. 135-144, 1975.
7 - BERQUÓ, E.S., SOUZA, J.M.P.; GOTHIES, S.L.A.
Bioestatística. São
Paulo: EPU, 1980. p. 246-325.
8 - BEUBLER, E.
Pharmakotherapie des kopfschmerzes unter besonderer
Berücksichtigung der migrane. Wien. Med. Wochenschr., v.144, n.p.
100-101, 1994.
9 - BODE, P.H. et ai.
pancreatic
Spontaneous calcium oscilations in clonal endocrine
glucagon-secreting
cells.
Biochem.Biophys.Res.
Commun. NewYork, v. 205, n.p. 435-440, 1994.
10- BOGIN, E. MASSRY, G.S., HARARY, I. Effect of parathyroíd hormonal on
rat heart cells. J. clin. lnvest, Baltimore, v.67, n.p. 1215-1227, 1981.
11 -
, et ai. Effect of verapamil on plasma arathyroíd hormone .. J. clin.
Chem. clin.Biochem., Berlin, v.25, n.p. 83-86, 1987.
105
12 - BOLTON, T.B. Mechanisms of actyíon of transmiter and other substances
on smooth muscle. Physioi.Rev., Baltimore, v.59, n.p. 606-718, 1979.
13 - BRADFORD, M.M. A rapíd and sensitiva method for the quantítatíom of
microgram quantities of protein utilizing the principie of protein - Dye
binding. Analyt.Biochem., NewYork, v.72, n.p. 248-252, 1976.
14- CHAGNAC, A. et ai. Effect of verapamil on bone resorption and formation
in uremic rats. Minerva. elect. metab., v.15, p. 291-294, 1989.
15 - COGNARD, C., LAZDUNSKI, M., ROMEY, G.
Different types of Ca+2
channels ín mammalían skeletal muscle cells in culture. Proc. natn.
Acad. Sei. U.S.A, Washington, v.83, p. 517-521, 1986.
16 - COLUCCI, W.S.
Usefulness of calcium antagonists for congestive heart
failure. Am. J. Cardiol., New York v. 59, n.p.528-588, 1987.
17 - CONOVER, W.J. Practical nonparametric statistics.
2ed.
New York:
John Wiley., 1980. p. 229-239.
18- DAHLOF, 8., SWEDEN, G. Hemodynamic response, safety and efficacy of
isradipine in the treatment of essential hypertension. Am. J. Med., New
York, v.86, n.p. 19-26, 1989.
106
19- DATIA, K.H., MACINTYRE, 1., ZAIDI, M. lntracellular calcium in the control
of osteoclast function. 1. Voltage - insensitivity and lack of effect
of
nifedipine, Bayk 8644 and diltiazem. Bioch. biophys. Res. Commun.,
v.167, n.p. 183-188, 1990.
20 - DURIEZ, J. et ai.
Effect dün inhibiteur calcique, le vérapamil sur le
dévelloppement des ossifications heterotopiques.
lnt. orthop., New
York, v 14. n.p. 415-421, 1990.
21 - DZIAK, R., STERN, H.P. Calcium transport in isolated bone cells 111. Effects
of parathyroid hormone and cyclic 3',5' - AMP.
Endocrinology,
Baltimore, v.97, n.p.1281-1287, 1975.
22- FARRIS, J.E., GRIFFITH, Q.J. The rat in laboratory investigation. 2. ed.
Philadelphia: J.B. Lippincott, New York, 1971. p. 542.
23- FISKE, C.H., SUBAROW, Y. The colorimetric determination of phosphorus.
J .Biol. Chem., v.66, n.p. 375-401; 1925.
24 -
FLECKENSTEIN, A. et ai.
Zum wirkungs mechanismus nenartiger
koronardilatoren mit glichzeitig
sauertoff - einsparenden Myokard-
Effekten, Premylamin und lproveratil. 2. Teil. Z. Kreislaufforsch.
Dresden., v.56, n.p. 839-853, 1967.
107
25 - FLEISCHMANN, J.
Calcium channel antagonists in the treatment of
intestitial cystitis. Urol. clin. N. Am., Washington, v.21, n.p. 107-111,
1984.
26- FOX, J., DELLA-SANTINA, P.C. Oral verapamil and calcium and vitamim D
metabolism in rats: effect of dietary calcium. J. Physiol., v.257, n.p. 632638, 1989.
27 -
, GREEN, T.D.
Direct effects of calcium channel blockers an
duodenal calcium transport in vivo. Eur.. J. Pharm., Amsterdam, v. 129,
p.159-164, 1986.
28 - GINDLER, E.M., KING., J.D. Rapid colorimetric determination of calcium in
biologic fluids with methylthymol blue. Am. J. clin. Pathol., Baltimore,
v.58, n.p. 376-382, 1972.
29 - GOLIGORSKY, M.S. et ai. Verapamil improves difective intestinal calcium
absorption in uremia. Adv. exp. Med. Biol., v. 178, n.p. 153-161, 1984.
30- GORNALL, A.G., BARDAWELL, C.J., DAVID, M.M. Determination of serum
proteins by means of the biuret reaction. J. biol. Chem.,
v. 177, n.p. 751-766, 1949.
Baltimore,
108
31 - GOODMAN, L.S., GILMAN, AG.
The pharmacological basis of
therapeutics. 9.ed. New York: Me Graw Hill, 1996. p. 1905.
32- GREEN, K, CHEEKS. L, HULL, D.S. Effects pf calcium channel blockers
on rabbit corneal endothelial function. Curr. Eye. Res., v.13, p. 401-408,
1994.
33- GRYGORCZYK, C., GRYGORCZYK, R, FERRIER, J. Osteoblastic cells
have L type calcium channels. Bone Miner., Toronto, v.7, p. 137-148,
1989.
34 - GUYTON, AC.
Tratado de fisiologia médica.
7.ed.
Rio de Janeiro:
Guanabara Koogan, 1989. p. 830.
35 - HABENER, J.F, ROSENBLATT, M., PATS. T.J.
Parathyroid hormone:
Biochemical aspects of biosynthesis, secretion, action, and metabolism.
Physioi.Rev., Baltimore, v.64, n.p. 985-1053, 1984.
36 - HANDLER, et ai. Comparison of isradipine and nifedipine in chronic stable
angina. lnt. J. Cardiol., v.18, p. 15-26, 1988.
37 - HARPER, HA
Manual de química fisiológica.
Atheneu, 1994. p.
7 ed.
São Paulo:
109
38- HEIDER, J.G. et ai. Anti-aterogenic activity of the calcium channel blocker
isradipine (PN-200-11 O): a novel effect on matrix synthesis independent
of calcium channel blockade. Transplant Proc., Orlando, v.19, n.p. 96101, 1987.
39 - HOFFER, C.A. et ai. Verapamil intoxication: a literatura review of overdoses
and discussion of therapeutic options. Am. J. Med., New York, v.95, n.p.
431-437, 1993.
40 - KALANT, H., ROSCHLAU, W.H.E. Princípios de farmacologia médica.
5ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 1991., p. 302-304.
41 - KATZUNG, B.G. Farmacologia básica & clínica. 5.ed., Rio de Janeiro:
Guanabara Koogan, 1994. p.128-131.
42 - KIM, Y.S. et ai. Responses of osteoblastic cell tine MC3T3 -EI cell to the
calcium channel blocker diltiazem and verapamil. Contrib. Nephrol,
Seoul, v.91, p. 43-49, 1991.
43- KOHLHARDT, M. et ai. Differentiation of the transmembrane Na and ca•2
channels in mammalian cardiac fibres by the use of specific inhibitors.
Pflügers Arch. ges. Physiol., Boon, v. 335, n.p. 309-322, 1972.
110
44 - KONRAD, T. et ai. Verapamil and flunarizine protect the isolated perfused
rat liver against warm ischemia and reperfusion ínjury. Res. exp. Med.,
NewYork, v.2, n.p. 61-68, 1995.
45 - KOSSA, J.V. The von Kossa method for calcium deposits. Beitr. path.
Anat. Jena, v.29, n.p.163, 1901.
46 -
, Von Kossa method for phosphates and carbonates. Med. Lab.
Techs. v.2, p.1012, 1958.
47 - LARAGH, J.H., et ai
Calcium metabolism and channel blockers for
understanding and treating hypertension. Am. J. Med., New York, v.77,
p.1-22, 1984. (Supplement, 68).
48- LEWIS, K.D. A sinple and sensitiva histochemical method for calcium. Soe.
exp. Bioi.Med., v.80, n.p. 474-479, 1952.
49- LUSCHER, T.F., WAL8ER, 8. Calcium antagonists as first-line therapy in
hipertension. Results of the swiss isradipine study. J. cardiovasc.
Pharmac., NewYork, v .18, p.51-53, 1991.
50 - Me GEE-RUSSEL, S.M. A new reagent for the histochemical and chemical
detection of calei um. Nature, London, v.175, p.301, 1955.
111
51 - MESSLER, H.H., KOCH., W., MUNZENBERG, J.K.. Analogous effects of
organic calcium antogonists and magnesium on the epiphyseal growth
plate. Clin. Orthop. Rei. Res., v.258, n.p. 136-141, 1990.
52 - MJOR, IA, FEJERSKOW, O. Embriologia e histologia oral humana. 3
ed. São Paulo: Médica Panamericana, 1990, p.31-49.
53- MOORE, K.L. Embriologia básica. Rio de Janeiro: lnteramericana, 1976.
cap.16, p.229-35.
54 - MORROW, M. et ai
Verapamil enhances antitumor activity increasing
myloid toxicity. v.101, p.63-68, 1987.
55 - MOSER, M.
Calcium entry blockers for systemic hypertension. Am. J.
Cardiol., NewYork, v. 59, n.p. 115A-121A, 1987.
56 -MOURA, R. A. et ai. Técnicas de laboratórios. 3._ Ed. São Paulo. Atheneu,
1994, p. 911.
57 - NASH, T.D., FEER, D.T. Hepatic injury possibily induced by verapamil. J.
Am. med. Ass. Chicago, v.249, p.395-396, 1983.
112
58- NAYLER, W.G., VICTORIA, D. Calcium exchange in cardiac muscle: A basic
mechanism of drug action. Am. Heart J., Saint Louis, v.73, n.p. 379391, 1967.
59 - NAYLER, W.G. et ai.
Fundamental mechanisms of action of calcium
antagonists in myocardiol ischemia. Am. J. Cardiol., New York, v.59,
n.p. 756-83-B, 1987.
60- NETLAND, PA et ai. Colar doppler ultrasound analysis of ocular circulation
after tropical calei um channel blocker. Am.J.Ophthai.,.Saint Lois, v.119,
n.6, .p.94-700, 1995.
61 - NOOTER, K., OASTRUM, R, DEURLOO, J.
Effects of verapamil on the
pharmacokinetics of daunomycin in the rat. Cancer.Chemother.Pharm.,
v.20, n.p. 176-178, 1987.
62- NOWYCKY, M.C., FOX, PA, TSIEN, W.R Three types of neuronal calcium
channel with different calcium agonist sensitivity. Nature, London, v.316,
p.440-443, 1985.
63 - NYSKA, M. et ai., Gengiva! hyploplasia induced by calcium channel
blockers, Made of action. Medicai Hypoanalysis., v. 43, n.p.115-118,
1994.
113
64 - OPIE, L.H.
Calcium channel antagonists. Part 111: Use and comparative
efficacy in hyppertension and supraventricular arrythmias. Minor
indications. Cardiovasc. Drugs. Ther., v.1, n.p. 625-656, 1988.
65- PANI, L et ai. Calcium receptor antagonists modify cocaine effects in the
nervous system diffetently. Eur. J. Pharm. Amsterdam, v.190. n.p. 217221, 1990.
66- PEARSE, AG.E. Histochemistry theoretical and applied. 2.ed., Boston:
Little Brown, 1972. cap. 24, p.681-715.
67 -
, Histochemistry theoretical and applied. 4.ed. C. Livingstone,
Ediburger: Reino Unido, 1985.
68 - PENTO, J.T., JONHSON, M.E.
The influence of verapamil on calcium
transport and uptake in segments of rat intestine. Pharmacology. v.27,
n.p. 343-349, 1983.
69 - RADDINO, R. et ai. Effects of calcium entry blockers not connected with
calcíum channels inhibition. Gen. Pharm. Elmsford., v.18,. p.431-436,
1987.
114
70 - RAMP, W.K. et ai.
Effects of calcium and cyclic nucleotides on rat
calcíotonin and parathyroid
hormone
secretion.
Molec.
Cell.
Endocr.,.Domerick, v.14, n.p. 205-215, 1979.
71 - RANG, H.P., DALE, M.M. Farmacologia. 2.ed. Rio de Janeiro: Guanabara
Koogan, 1993. p. 211-214.
72 - RENTON, W.K. lnhibition of hepatic microsomal drug metabolism by the
calcium channel blockers diltiazem and verapamil. Biochem. Pharmac.,
London, v.34, n.14, p.2549-2553, 1985.
73- RITCHIE, K.C., MAERCKLEIN, B.P., FITZEPETRICK, A.L. Direct effect of
calcium channel antagonists on osteoclast function: alterations in bone
resorption and intracellular calcium concentrations.
Endocrinology.
Baltimore, v.135, n.p.996-1003, 1994.
74- RODEHEFFER, J.R. et ai. Controlled double blind trial of nifedipína in the
treatment of Raynaud's phenomenon. New. Engl. J. Med., Lawrence,
v.308, n.p.880-883, 1983.
75 - ROUGIER, O. et ai. Existence and role of a slow inward current during the
frog atrial action potential. Pflügers Arch. ges. Physiol., Basel, v.308,
n.p. 91-110, 1969.
115
76 - SAUTER, A., RUDIN, M.
Calcium antagonists for reduction of brain
darmage in stroke. J. cardiovasc. Pharmac., NewYork, v.15, n.p. 543547, 1990.
77- SAMNEGARD, E., SJODÉN, G. Verapamil induces increased bone volume
and osteopenia in female rats but has the opposite effect in male rats.
Calcif. Tisue. lnt., NewYork, v.50, p.524-526, 1992.
78- SCARPA, A., CARAFOLI, E. Calcium transport and cell function. Ann. N.Y.
Acad. Sei., NewYork, v.307, n.p.1-655. 1978.
79- SILVA, O.J.R. Crescimento dentário e metabolismo do cálcio e do fósforo
total e inorgânico das preás (Cavia aperea aperea). Revta. Fac .Odont..
S. J. Campos, São José dos Campos, v. 3, n.p.11-14, 1977.
80- SIMECKOVA, A. et ai. The effect of verapamil and calcium ionophore A
23187
on
the
calcium
and
phosphorus
content
of
bone.
Physioi.Bohemoslov. v.36, n.p.149-152, 1987.
81 - SJODÉN, G., et ai. Verapamil increases serum alkaline phosphatase in
hipertensive patientes. J. int .Med., Tokyo, v.228, n.p.339-342, 1990.
116
82 - SJÓDÉN, G., et ai. Calcium absorption and excretion and patients treated
with verapamil. Br.J.Ciin.Pharmacol. v. 24, p. 367-71, 1987.
Calcium antagonists drugs. N. Eng. J.
83- SNYDER, H.S., REYNOLDS, J.l.
Med., Lawrence,. v.313, p.995-1001, 1985.
84 - STORSTEIN, L et ai. Antihypertensive effect of verapamil in relation to
plasma
concentrations
of
verapamil
and
its
active
metabolite
norverapamil. Cur. thera. Res., Trenton., v.29, n.p.112-119, 1981.
85 - STRYER, L
Bioquímica.
3.ed.,
Rio de Janeiro, Guanabara Koogan,
1992. p.753-776.
86 - TSIEN, R.W et ai.
Multiple types of calcium channel in excitable cells.
Soe. Gen. Physiol. Ser. v. 41, p.167-187, 1987.
87 - TRIGGLE, D.J., SWAMY, V. C. Pharmacology of agents that effect calcium:
agonistas e antagonistas.
Chest. Park
Ridge, v.78, n.p. 174-179,
1980.
88 -
, Calcium channel antagonists: mechanism of action, vascular
seletivities and clinicai relevance. Cleveland clin. J. Med., Cleveland,
v.59, n.p.617-627, 1992.
117
89 - UEHARA, Y. et ai.
New dihydropyridine calcium channel antagonist,
Pranidipine attenuates hypertensive renal injury in dahl salt-sensitive
rats. J. Cardiovasc. Pharmac., NewYork, v.23, n.p. 970-979, 1994.
90 - VIEIRA, S. Introdução a Bioestatistica. 2.ed. Rio de Janeiro: Campus,
1991. p. 203.
91 - WEISS, K. et ai.
Kalziumantagonistein: antiatherosklerotische wirkimg
durch beeinflussing des prostaglandinsystemy wien. Klin. Wschr., New
York, v.100, n.p.718-720, 1988.
92 - WEINER, A.D.
Calcium channel blockers.
Med. clin.
N. Am.,
v. 72,
n.p.83-111, 1988.
93 - WEINSTEIN, B.D., HEIDER, G.J.
Antiatherogenic properties of calcium
antagonists. Am. J. Cardiol., v. 59, n.p.163B-172-B, 1987.
94 - WROBEL, J., MICHALSKA, L The effect of verapamil on intestinal calcium
transport. Eur. J. Pharm., Amsterdam, v.45, n.p. 385-387, 1977.
95 - YEDINAK, K.C.
Use of calcium channel antagonists for cardiovascular
disease. Am. Pharm., Washington, v.NS33, p.. 49-64, 1993.
118
96- ZACNY, J.P., YAJNICK, S. Effects of calcium channel inhibitors on etthanol
effects and pharmacokinects in healthy volunters. Alcohl, v.1 O, n.p.505509, 1993.
97- ZAIDI, M., Mac INTYRE, 1., DATTA, H. lntracellular calcium in the control of
osteoclast function. 11 Paradoxical elevation of cytosolic free calcium by
verapamil.
Biochem. biophys. Res. Commun., New York,
v.167,
p.807-812, 1990.
98 - ZAIDI, M., et ai. Calcium activated intracellular calcium elevation: a novel
mechanism of osteoclast regulation. Bioch. biophys. Res. Commun.,
NewYork, v.29, n.p.1461-1465, 1989.
98- ZANINI, A.C., OGA, S. Farmacologia aplicada. 2.ed. São Paulo: Atheneu,
1982.
99- ZANCHETTI, A Role of calcium antagonists in systemic hypertension. Am.
J. Cardiol., NewYork, v.59, p.130B-136B, 1987.