CONTEÚDO PROGRAMÁTICO

Universidade de São Paulo
Instituto de Biociências
Departamento de Microbiologia
Disciplina BMM 271
Microbiologia Básica
CONTEÚDO PROGRAMÁTICO
DATA
Teórica (T)
Prática (P)
2004
ASSUNTO
FEVEREIRO
T
P
Introdução ao estudo da Microbiologia
Características gerais dos vírus
Multiplicação viral
Características gerais dos fungos
Morfologia e estruturas bacterianas externas
Técnicas de microscopia –
Citologia e morfologia bacteriana
Funções das estruturas internas bacterianas
Técnicas de isolamento e identificação bacteriana
T – 17
P
T
P
Técnicas de coloração de Gram
Metabolismo bacteriano
Leitura da aula anterior
S – 20
T
Nutrição e crescimento bacteriano
Período de estudo
T – 03
S - 06
T – 10
T
T
T
T
T
P
S – 13
T – 24
FERIADO
S - 27
1a AVALIAÇÃO
CARNAVAL
MARÇO
T
T
Genética bacteriana
Estudo dos genomas bacterianos
P
Demonstração do seqüenciamento bacteriano
T
T
P
Microbiota indígena do corpo humano
Antimicrobianos
Antibiograma
T
P
Infecção: Fatores de Virulência
Leitura da aula anterior
T
Enterobacterias (Escherichia coli, Shigela,
Salmonela, Yersinia ( Vibrio)
Enterobactérias de interesse odontológico
T – 02
S – 05
T– 09
S – 12
T
T – 16
S – 19
T
T
Gênero Corynebacterium ( Seminário)
Gênero Clostridium ( Seminário)
Gênero Bordetella (Seminário)
DTP Vacinas
T
T
Gênero Staphylococcus ( Seminário )
Gênero Streptococcus ( Seminário )
T – 23
T
T
T
Gênero Mycobacterium ( Seminário )
Gênero Pseudomonas ( Seminário )
Gênero Treponema (Seminário )
Gênero Neisseria (Seminário)
DST
2a AVALIAÇÃO
T
Controle da população microbiana: esterilização e desinfecção por agentes
físicos
Esterilização e desinfecção por agentes químicos e físicos
S - 26
T – 30
P
ABRIL
T
Controle da população microbiana : esterilização e desinfecção por agentes
químicos
Leitura e discussão da prática anterior
S – 02
P
T – 06
e
S - 09
SEMANA SANTA
T- 13
T
P
Micoses superficiais e sistêmicas
Estudo prático dos fungos
S – 16
T
P
Vírus respiratórios
Reações de HA e IHA
T - 20
T
P
Vírus dermotrópicos exantemáticos
Período de estudo
3a AVALIAÇÃO (FINAL)
S - 23
No de créditos: 05
Coordenadores:
Profa. Dra. Dolores Ursula Mehnert (Diurno)
Profa. Dra. Rita de Cássia Café Ferreira (Noturno)
Docentes: Profa. Dra. Beatriz L. Fernandes
Profa. Dra. Márcia Pinto Alves Mayer
Prof. Dr. Mario Júlio Ävila Campos
Profa. Dra. Silvana Cai
Prof. Dr. Valderez Gambale
Critério de Avaliação:
1a Avaliação: peso 2
2a Avaliação: peso 3 + 1 (seminário) = 4
3ª Avaliação: peso 4
Provas:
Substitutiva: apenas para quem perdeu UMA das provas e apresentou justificativa na aula
seguinte. Terá peso correspondente à prova perdida e constará de TODA a matéria.
Data: 29/04/2003 às 16: 00 h
Recuperação: alunos com média final 3,0 e 70% de presença. Matéria TODA
Data: 09/05/2003 às 16:00 h
Seminários: Cada seminário dos grupos bacterianos escolhidos, deverá apresentar os seguintes
itens: Condições de cultivo; Morfologia; Patogenicidade (Fatores de Virulência); Diagnóstico e
Tratamento.
Bibliografia:
1. Trabulsi, L.R et al Microbiologia. 3a edição. 1999
2. De Lorenzo, J.L. Microbiologia para o Estudante de Odontologia. Editora Atheneu, São
Paulo, 2004.
3. Pelczar Jr., et al. Microbiologia – Conceitos e Aplicações. 2a edição. 1996.
4. Brock, Madigan, Martinko, Parker. Biology of Microorganisms. 8a edição. 1997
5. Tortora, Funke, Case. Microbiologia: uma introdução. 6a edição. 1998
6. Body, R.F. Basic Medical Microbiology. 5a edição. 1996
7. Fields, B.N. Virology. 2a edição. 1990
Sites para consulta
http://www.tulane.edu/~dmsander/Big_Virology/BVHomePage.html
http://www.cdc.gov/ncidod/hip/GUIDE/infect.htm
http://www.cellsalive.com/index.htm
http://hub.med.uth.tmc.edu/~hong/
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ICTV/
http://www.tulane.edu/~dmsander/garryfavweb11.html
http://www.avert.org/photos.htm
http://www.doctorfungus.org/
TEÓRICAS
SEMINÁRIOS
INTRODUÇÃO AO ESTUDO DA MICROBIOLOGIA
Dra. Rita de Cássia Café Ferreira
1. Definição :
2. Visão geral dos microrganismos: Onde estão? Como afetam nossas vidas?
a. Causam doenças, mas ajudam na defesa de nossa saúde
b. Utilizados há milênios na fabricação de cerveja, vinho, queijos, mas também deterioram
nossos alimentos
c.
Reciclam elementos químicos (O2 e N2 no solo e na atmosfera)
d. Produzem substâncias químicas e drogas, poluem, mas também ajudam na eliminação de
poluentes e no tratamento de esgotos (aplicação industrial)
e. São armas na guerra biológica
3. Apresentam uma enorme diversidade: vírus, bactérias, fungos, parasitas unicelulares
4. História da Microbiologia: como os microrganismos foram descobertos?
(a) Anton van Leeuwenhooek inventou o microscópio (1632-1723)
(b) Louis Pasteur (1822-1895) fez experimentos fundamentais
(c) Robert Koch (1843-1910) demonstrou que os microrganismos causam doenças
(c )
(b)
(b)
(a)
5. A importância dos microrganismos a partir do séc. XX
Microrganismos são utilizados nas Técnicas do DNA Recombinante ( a base da Biologia Molecular )
CARACTERÍSTICAS GERAIS DOS VÍRUS
Profa. Dra. Dolores U. Mehnert
1. Histórico
1876 - A. Mayer - agente do mosaico do tabaco não é bacteria e não é fungo.
1892 - D. Ivanosky - demonstrou a transmissibilidade da doença do mosaico
1898 - M. Beijerinck - denominou o agente do mosaico de fluído vivo contagioso ou vírus
- Loeffler e Frosch - demonstraram a transmissibilidade da febre aftosa
1915/1917 - Twort (Inglaterra) e D’Herelle (França) observaram a ação de vírus bacteriófagos em culturas
bacterianas.
1940 - Invenção do microscópio eletrônico - permitiu a visualização dos vírus
2. Definição
3. Hospedeiros: animais, vegetais, fungos e bactérias
4. Dimensões - variam de 10 nm a 300 nm
5. Formas - arredondada ou icosaédrica ex.: vírus da poliomielite, rotavírus, adenovírus
paralelepípedo ex.: vírus da vaccínia, vírus da varíola
projétil ex.: vírus da raiva
helicoidal ex.: vírus do sarampo, vírus da gripe
6. Estrutura e composição química
Vírus nú
Vírus com envoltório
Genoma - localização central; ácido nucléico
(DNA ou RNA)
Capsídeo - capa protéica com simetrias :
icosaédrica ex.: vírus da poliomielite
helicoidal ex.: vírus do sarampo
complexa ex.: vírus da vaccínia
Envelope - envoltório mais externo, nem sempre
presente, composto por lipídeos e proteínas
7. Inativação por agentes físicos e químicos:
calor, radiação, detergentes, compostos clorados,
fenólicos, drogas anti-virais.
8. Classificação dos vírus
Adaptado de Leland, D.S. – Clinica Virology, W.S.Saunders Co., 1995
PROPRIEDADES GERAIS DOS VÍRUS
Profa. Dra. Dolores U. Mehnert
1. MULTIPLICAÇÃO VIRAL
1.1 Mecanismo de infecção viral
a) fase de adsorção ⇒ interação vírus-receptor
b) fase de penetração ⇒ fagocitose, pinocitose,fusão, injeção
c) fase de desnudamento ⇒ remoção do capsídeo viral
d) fase de síntese ⇒ replicação do genoma e síntese protéica
e) fase de maturação ⇒ montagem das partículas virais
f) fase de liberação ⇒ brotamento e/ou lise
1.2 Ciclos replicativos dos vírus
c) ciclo lítico
a) ciclo produtivo
b) ciclo não-produtivo
latente
oncogênico
d) ciclo lisogênico
Bacteriófagos
Vírus humanos e animais
Fonte:www.molgen.biol.rug.nl/molgen/research/lactis/phages.php
2. INTERFERÊNCIA VIRAL
2.1. homóloga
2.2. heteróloga
2.3. produção de interferon
3. HEMAGLUTINAÇÃO
Classe I
DN A vir al
DNA f it a dupla
t r anscr ipt ase celular
adeno, her pes, var íola
RN Am
Enzimas
(f ase pr ecoce)
Pr ot eínas
Classe I I
DN A f it a simples
par vovír us
DNA vir al
t r anscr ipt ase celular
DNA
f it a dupla
Classe I I I
RNA f it a dupla
(f ase t ar dia)
RNAm
Pr ot eínas
est r ut ur ais
RNA vir al d.f .
r ot avír us, r eovír us
f it a ( +)
f it a ( - )
f it a ( + )
molde p/ RNA (-) genômico
RNAm
10 Pr ot eínas
Classe I V
poliovír us
RN A vir al
f it a ( +)
RN A
f it a ( - )
RN A ( +)
genômico
RN A m
Pr ot eínas
Classe V
inf luenza
r aiva
sar ampo
RN A ( - )
genômico
RN A vir al
f it a ( - )
t r anscr ipt ase
vir al
RN A int er mediár io
f it a ( + )
RN A m
Pr ot eínas
RN A vir al
f it a ( + )
Classe VI
r et r ovír us
TR
cDN A
TR
Pr ot eínas
RN A m
DN A
dupla f it a
novos genomas vir ais
Fonte: Adaptado da Classificação de Baltimore.
genoma
celular
FUNGOS - CARACTERÍSTICAS GERAIS
Prof. Dr. Walderez Gambale
Definição
Os fungos não possuem nenhum pigmento fotossintético, não formam um tecido verdadeiro, não
apresentam celulose na parede celular (com exceção de alguns fungos aquáticos inferiores) e não
armazenam amido como substância de reserva. Na sua parede celular, há a presença de uma substância
quitinosa. Sua estrutura somática é representada por hifas, cujo conjunto constitui o denominado micélio.
Podem apresentar o fenômeno denominado de dicariofase (fase dicariótica prolongada), em que a
frutificação é composta de hifas binucleadas com presença simultânea de dois núcleos haplóides
sexualmente opostos. São heterotróficos, eucariotos.
Até há pouco tempo, eram considerados como pertencentes ao Reino Vegetalia, mas pelas
considerações feitas acima a tendência atual é considerá-los num reino a parte, o Reino Fungi ou Mycetalia.
Morfologia e Taxonomia
A identificação de um fungo é quase que exclusivamente baseada na sua morfologia. Como eles
habitam os mais variados substratos, apresentam em decorrência, uma sucessão formidável de tipos
morfológicos, dos mais simples aos mais complexos.
O seu enquadramento taxonômico é regido pelo Código Internacional de Nomenclatura Botânica e
os níveis taxonômicos gerais são:
Reino: FUNGI
Divisão: EUMYCOTA
Subdivisão:MASTYGOMYCOTINA-ZYGOMYCOTINA-ASCOMYCOTINA-DEUTEROMYCOTINA
BASIDIOMYCOTINA
Classe: Sufixo MYCETES
Ordem: Sufixo ALES
Família: Sufixo ACEAE
Gênero:
Espécie
E
MORFOLOGIA MACROSCÓPICA
Macroscopicamente, os fungos podem ser divididos em dois grandes grupos: os bolores, que
apresentam uma colônia filamentosa, e as leveduras, que apresentam em geral, uma colônia cremosa. São
importantes no estudo macroscópico, o tipo de colônia, verso e reverso, velocidade de crescimento,
formação de pigmentos de etc.
MORFOLOGIA MICROSCÓPICA
A unidade estrutural dos fungos é representada pela hifa que forma um conjunto denominado
micélio. O micélio pode se apresentar como micélio vegetativo exercendo as funções de assimilação,
fixação e crescimento das espécies, ou se diferenciar em micélio de frutificação que à reprodução da
espécie.
MICÉLIO VEGETATIVO
De acordo com sua morfologia, pode ser dividido em 3 tipos:
Unicelular: Representa o grupo das leveduras, sendo constituído por células arredondadas,
ovóides ou ligeiramente alongadas. O micélio unicelular reproduzir também por cissiparidade ou por
processos intermediários.
Filamentoso: Caracteriza os bolores e pode apresentar septos ou não, sendo chamado nesse
último caso, de cenocítico. O micélio cenocítico caracteriza a subdivisão ZYGOMYCOTINA.
Pseudofilamentoso: O micélio unicelular de leveduras do gênero CANDIDA, em determinadas
condições , reproduz-se por brotamentos sucessivos formando um micélio parecido com micélio dos
bolores.
MICÉLIO REPRODUTIVO
Cumpre as funções de conservação e disseminação da espécie, geralmente mediante a formação
de células especiais denominadas esporos. Os esporos possuem um conteúdo celular denso e risco
reservas, sendo por isso considerado também um elemento de resistência. Os esporos podem ser hialinos
ou pigmentados, simples, septados, várias formas, cada tipo, junto com outras características, definindo um
gênero ou uma espécie de fungos. Os esporos de acordo com sua origem podem ser assexuados ou
sexuados, podendo ser formados dentro de uma estrutura, quando são denominados endósporos, ou livres,
ectósporos.
Assexuado:
Ectósporos: esporos formados na extremidade de hifas especiais denominadas conidióforos.
Esses esporos são denominados conídios e caracterizam a subdivisão DEUTEROMYCOTIA.
Endósporos: esporos formados no interior de estruturas denominadas esporângios. Os esporos
são chamados de esporangiósporos. A hifa especial que carrega o esporângio é denominada
esporangióforo. Esses estruturas caracterizam a subdivisão ZYGOMYCOTINA.
Sexuado:
Os esporos resultam de um ato sexual. Os filamentos micelianos se diferenciam em gametângios
(anterídio e oosfera) que se unem para dar origem ao oósporo ou zigosporo.
Endósporos: Esporos formados no interior de estruturas denominadas ascos. Os esporos são
denominados ascósporos e caracterizam a subdivisão ASCOMYCOTINA.
Um mesmo fungo pode em determinadas ocasiões ter uma reprodução assexuada e em outras uma
reprodução sexuada. Dependendo do tipo de reprodução, sua morfologia varia e ele passa a ser
enquadrado em outra subdivisão. Como exemplo, temos os dermatófitos, agentes de micoses cutâneas,
que em sua fase assexuada são enquadrados na subdivisão DEUTEROMYCOTIA e na sua fase sexuada,
assumem características morfológicas da subdivisão ASCOMYCOTINA. Além disso alguns fungos
apresentam em determinadas condições, um micélio filamentoso e em outras condições, um micélio
unicelular, como o das leveduras. Como exemplo desse dimorfismo, temos o Paracoccidioides brasiliensis ,
o Histoplasma capsulatum e o Sporothrix schenckii, importantes agentes de micoses, que na natureza ou
em laboratório à temperatura de 25o C, apresentam-se em forma de bolor e quando infectando um
hospedeiro ou a 37oC em laboratório, apresentam-se em forma de levedura.
ECOLOGIA
Habitat
Os fungos tem como habitat, os mais diferentes substratos. A grande maioria dos fungos vive no
solo fazendo parte da reciclagem dos materiais na natureza. São encontrados também nos vegetais, água,
nos animais , etc. Os fungos formam diversas estruturas de dispersão, sendo a principal, os esporos, e
através de dispositivos especiais, essas estruturas entram em contato com várias vias de dispersão.
Vias de dispersão
A principal via de dispersão é o ar atmosférico, através dos ventos. Os fungos que se dispersam
pelo ar atmosférico são denominados de fungos anemófilos e tem importância em alergias no homem e
como agentes deteriorantes de diversos materiais. Os fungos podem se dispersar também pela água,
sementes, insetos, homem, animais, etc.
Substrato
Pelas vias de dispersão, os fungos são espalhados na natureza. Quando encontram um substrato
com nutrientes adequados, crescem e colonizam. Dessa maneira, podem deteriorar vários materiais e
ocasionar em vários hospedeiros, as micoses. Através de métodos específicos, os fungos podem ser
isolados de seu habitat, das vias de dispersão, dos vários materiais contaminados e de diversos
hospedeiros com micoses.
NUTRIÇÃO E CRESCIMENTO
Os fungos são seres heterotróficos retirando os nutrientes do meio ambiente circundante. Através
de digestão enzimática externa transformam as substâncias de maneira que possam ser absorvidas. De
maneira geral necessitam de 4 elementos básicos: H, O, C e N, além de outros elementos em menor
quantidade: P, S, K, Mg, Fe, Zn, Mn, Cu, Mb, sendo que alguns fungos necessitam ainda de determinados
fatores de crescimento, como por exemplo a tiamina. De maneira geral, para seu crescimento, necessitam
de uma fonte orgânica de C e de uma orgânica ou inorgânica de N. O meio artificial básico para trabalho
com fungos é ágar Sabouraud que tem como fonte de C, a glicose e como fonte de N, a peptona.
Um esporo de fungo, tendo os nutrientes adequados, germina, filamento , cresce e origina novos
esporos. Nesse processo de crescimento, vários fatores interferem como temperatura, umidade, pH , etc.
De maneira geral, o ótimo de temperatura é entre
20oC e 30oC, mas os fungos podem se manter em
temperaturas baixas ou altas. Há fungos termofílicos, termotolerantes, mesofílicos, psicrófilos. A umidade
ótima para seu crescimento é entre 75 e 95%, mas também suportam uma ampla variação. Da mesma
maneira acontece com o pH. As leveduras crescem em variações de pH entre 2,5 e 8,5 e os bolores entre
1,5 e 11. De maneira geral o ótimo é neutro.
Pelas características peculiares de nutrição e crescimento dos diferentes grupos de fungos vários
métodos foram idealizados para auxiliar a sua identificação. Como exemplo, temos o auxanograma, que é
um método para testar a assimilação de diferentes fontes de C e N, e é muito utilizado para a identificação
da maioria da leveduras.
IMPORTÂNCIA DOS FUNGOS
1 - Ciclo dos elementos na natureza
Os fungos são considerados os grandes decompositores na natureza. No solo junto com outros
microrganismos, tomam parte na reciclagem dos materiais na natureza.
2 - Alimentação
2a - Como alimentos - Os cogumelos, principalmente os gêneros Agaricus e Boletus são utilizados
desde a antigüidade na alimentação do homem. Seu valor nutritivo é grande e em determinados países, a
cultura desses fungos atinge níveis bastante elevados.
2b- Como produtor de alimentos. Nesse aspecto, os fungos estão enquadrados com um grande
potencial, principalmente como fonte não convencional de proteínas. Graças a seus sistemas enzimáticos
diversos, os fungos possuem a capacidade de transformar uma série de substratos em proteínas. Como
exemplo, temos o líquido sulfítico da indústria do papel, os resíduos glicídicos da indústria de alimentos,
hidrocarbonetos parafínicos dos petróleo crú. Na produção de proteínas, o grupo das leveduras é o mais
utilizado (Saccharomyces cerevisae, Candida utilis, etc.)
2c- No preparo de alimentos: Desde os primórdios da humanidade, os fungos são utilizados no
preparo de numerosos alimentos: S. cerevisae (na panificação e nas bebidas fermentadas); Candida
krusei (na remoção da polpa gelatinosa do cacau); Aspergillus oryzae (missô), Rhizopus oligosporus
(Tempeh), Neurospora (Ontjom), Monascus purpureus (Ang-Kak); Thamnidium (maturação de carnes)
Mucor pusillus (Coalho); Penicillium spp (queijos, etc.)
COMO AGENTES BIODETERIORANTES
Os fungos, pela sua capacidade de dispersão na natureza, estão presentes nos mais variados
locais. Quando encontram condições favoráveis em um determinado substrato, instalam-se e colonizam.
Pela sua variedade enzimática, podem retirar nutrientes de uma infinidade de substratos. Dessa maneira,
podem agir como agentes biodeteriorantes em alimentos, instrumentos óticos, madeiras, concretos, gessos,
tintas, combustíveis, livros, metais, etc. Nos alimentos, a consideração dada à contaminação pelos fungos é
inferior àquela dada às bactérias, sendo o problema principal a eliminação do alimentos pela aversão ao
produto. Os fungos que crescem no crescimento não produzem toxinas e não causam consequentemente,
intoxicações alimentares. Em determinados alimentos, pode haver crescimento de espécies de fungos,
como Aspergillus flavus, que produz toxinas, como a aflatoxina que está relacionada a câncer hepático,
além de constituir um sério problema em rações para uso animal.
No aspecto de biodeterioração podemos incluir as micoses humanas, animais e vegetais.
CONTROLE DOS FUNGOS
O controle dos fungos pode ser feito de diversas maneiras partindo-se de uma análise da equação
de infecção e resistência de Rich.
Equação de equilíbrio
Infecção= Num. de microrg X Virulência
Resistência do hospedeiro
Qualquer fator que contribua para o desequilíbrio da equação resulta em contaminação do
hospedeiro ou substrato. para o controle da contaminação pode-se atuar na diminuição do número de
fungos, através de agentes antifúngicos, aparelhos esterilizadores, diminuição de umidade, etc.; ou na
resistência do hospedeira ou substrato.
MORFOLOGIA E ESTRUTURAS BACTERIANAS EXTERNAS
Profa. Dra. Beatriz L. Fernandes
Bactérias apresentam grande variedade de formas e tamanhos.
Formas básicas: cocos (esferas), bacilos (bastonetes), bastonete curvo, espiraladas
arranjos ou agregados típicos para cada espécie: cadeias, cachos, etc
Estruturas externas:
Glicocálice: polímero viscoso e gelatinoso produzido por algumas bactérias.
Parede celular: estrutura complexa, semi-rígida, responsável pela forma da célula. Constituintes básicos da
parede celular de bactérias:
Gram-positivas: peptidoglicano (ou mureína) e ácidos teicóicos
Gram-negativas: peptidoglicano, fosfolipídios, proteínas, lipoproteínas, lipopolissacarídios.
Flagelos: motilidade
Classificação: monotríquias, lofotríquias, anfitríquias ou peritríquias
Filamentos axiais (endoflagelos): exclusivos de espiroquetas, movimento em espiral.
Fímbrias e/ou Pili: aderência bacteriana; pili: transferência de material genético entre bactérias.
Endósporos (esporos): estruturas celulares altamente desidratadas
FUNÇOES DAS ESTRUTURAS INTERNAS BACTERIANAS
Profa. Dra. Rita de Cássia Café Ferreira
1 – INTRODUÇÃO
2 – ESTRUTURAS INTERNAS
2.1. Membrana Interna, Plasmática ou Citoplasmática (MC)
. Estrutura dinâmica, flexível, envolvida em vários processos celulares.
. Formada de uma bicamada de fosfolipídeos e proteínas.
. Apresenta funções importantes como;
. biossíntese da parede celular
. transporte de nutrientes (nutrição)
. respiração
. sítio da síntese de DNA ( mesossomas ).
2.2. Citoplasma
O citoplasma apresenta duas áreas distintas quando visualizado ao microscópio eletrônico;
matriz amorfa que contém ribossomos, grânulos, nutrientes, metabólitos e íons, e uma região interna,
nucleóide, composta DNA.
2.3. Nucleóides ou Região Nuclear
Área de concentração do DNA ( cromossomo), sem
membrana
nuclear.
O cromossomo é formado por uma molécula de
circular não associada a proteínas.
DNA
2.4. Ribossomos
Estruturas envolvidas na síntese protéica. Os ribossomos são constituídos de duas
subunidades, cada uma contendo proteínas e um tipo de RNA, chamado de RNA ribossômico ( rRNA). Os
ribossomas de procariotos diferem dos eucariotos tanto no números de proteínas como no número de
moléculas de rRNA.
2.5. Grânulos ou Corpúsculos de inclusão
Partículas contidas no citoplasma, revestida ou não por uma membrana, contendo glicogênio,
lipídeos ou fosfato.
Reservas intracelular de certos nutrientes.
METABOLISMO BACTERIANO
Profa. Dra. Rita de Cássia Café Ferreira
METABOLISMO:
Definição:
É a soma de todas as reações químicas dentro de um organismo vivo. Devido ao fato das reações
químicas liberarem ou requererem energia, o metabolismo pode ser visto como um ato de balanceamento
de energia. Logo, o metabolismo pode ser dividido em duas classes de reações químicas: aquelas que
produzem energia e aquelas que utilizam energia.
REAÇÕES CATABÓLICAS E ANABÓLICAS.
Estas reações mediadas por proteínas (enzimas) são didaticamente divididas em 2 grupos:
CATABOLISMO e ANABOLISMO.
PRODUÇÃO DE ENERGIA.
-
Reações de Oxido-Redução
-
Geração de ATP
PROCESSOS DE PRODUÇÃO DE ENERGIA
( Reações Catabólicas )
Respiração Aeróbica
Glicólise
Ciclo de Krebs
Cadeia Respiratória ( cadeia de transporte de elétrons )
Respiração Anaeróbica
Fermentação
PRODUÇÃO DE ENERGIA FOTOSSINTÉTICA
NUTRIÇÃO E CRESCIMENTO BACTERIANO
Dra. Beatriz L. Fernandes
Crescimento bacteriano: Curva de crescimento
Fase de latência = fase Lag
Fase exponencial = fase logarítmica
Fase estacionária = fase de saturação
Fase de declínio = fase de morte
Multiplicação celular bacteriana
Fissão binária
Brotamento
Esporulação
Condições necessárias para o desenvolvimento bacteriano
Nutrientes
Água e eletrólitos
Condições atmosféricas
Temperatura
pH
Biossíntese de macromoléculas
Proteínas
Ácidos nucléicos
Açúcares
Peptídeoglicano
Componentes lipídicos, LPS
Crescimento e desenvolvimento bacteriano
Bactérias autotróficas
Bactérias heterotróficas
Bactérias fototróficas
GENÉTICA BACTERIANA
Dra. Beatriz L. Fernandes
Estrutura genética de bactérias
Cromossomo
Plasmídios conjugativos e de resistência
Expressão gênica
Transcrição
Tradução
Modificações pós-tradução
Regulação da expressão gênica - Operon
Alterações genotípicas
Mutação: mecanismos, seleção
Teste de Ames
Recombinação
Mecanismos de transferência genética
Conjugação
Tradução
Transformação
Importância da transferência genética na aquisição de resistência a antibióticos
ESTUDO DOS GENOMAS BACTERIANOS
Profa. Dra. Rita Café Ferreira
MICROBIOTA INDÍGENA DO CORPO HUMANO
Dra. Beatriz L. Fernandes
Microbiota humana
Microbiota transitória
Microbiota indígena ou residente
Fatores que influenciam o estabelecimento da microbiota normal
Modelos animais empregados no estudo da microbiota
Animais axênicos, livres de germes (germ-free)
Animais gnotobiotas
Barreiras naturais do corpo humano
Pele e mucosas
No trato respiratório
No trato gastro-intestinal
No trato gênito-urinário
Nos olhos
Na cavidade bucal
Mecanismos de proteção proporcionados pela microbiota indígena
Competição por nutrientes
Competição por receptores celulares
Produção de substâncias antimicrobians: Bacteriocinas
Estimulação contínua do sistema immune
Estímulo à produção de anticorpos
Especificidade celular
Adesinas e receptores
Infecções causadas por bactérias da microbiota indígena
AGENTES ANTIMICROBIANOS
Profa. Dra. Rita de Cássia Café Ferreira
1 - INTRODUÇÃO
1.1. Definições
1.1.1 - antibióticos
1.1.2 - quimioterápicos
1.2. Origem dos principais antibióticos
1.3. Atividade na célula
1.3.1 - bactericida
1.3.2 - bacteriostático
1.4. Principais propriedades dos agentes antimicrobianos
1.4.1 – toxicidade seletiva
1.4.2 – amplo espectro de ação
1.4.3 – apresentar solubilidade nos fluidos corporais
1.4.4 – concentração sangüínea
1.4.5 – não ser inativado pela acidez estomacal e proteínas sangüíneas
1.4.6 – não produzir efeitos colaterais, tais como reações alérgicas, lesões
nervosas ou irritação no trato gastro-intestinal.
2 - CARACTERíSTICAS GERAIS DOS ANTIBIÓTICOS E QUIMIOTERÁPICOS
1.1 – Antibióticos:
beta-lactâmicos; aminoglicosídeos; macrolídeos; clloranfenicol;tetraciclinas
1.2 – Quimioterápicos sintéticos:
sulfonamidas;isoniazida;nitrofuranos;quinolonas
3 – MECANISMOS DE AÇÃO
3.1 - Inibição da parede celular
3.2 - Alteração e lise da membrana citoplasmática
3.3 - Inibição da síntese protéica
3.4 - Inibição da síntese de ácidos nucléicos
4-
SINERGISMO E ANTAGONISMO
5 - RESISTÊNCIA BACTERIANA AOS ANTIMICROBIANOS
5.1 – Origem da Resistência
5.2 – Mecanismos de Dispersão
conjugação; transformação; transdução; transposição
6 - MECANISMOS DE RESISTÊNCIA AOS ANTIMICROBIANOS
6.1 – Alteração na permeabilidade das membranas
6.2 – Alteração do alvo
6.3 – Efluxo (bombeamento do antibiótico para fora da célula)
6.4 – Elaboração de uma via metabólica alternativa
INFECÇÃO: FATORES DE VIRULÊNCIA
Profa. Dra. Rita de Cássia Café Ferreira
1 - Introdução
1.1 - Infecção x colonização
1.2 - Virulência x patogenicidade
1.3 - Como definir um patógeno – Os Postulados de Koch e sua versão molecular
1.4 - Fatores de virulência
1.5 - Quantificação da virulência – DL 50 e DI 50
2 - Estratégias de virulência entre as bactérias – fatores que permitem a colonização
2.1 - Adesinas fimbriais e não fimbriais
2.2 - Invasividade
2.3 - Motilidade e quimiotaxia
2.4 - Captação de ferro
3 - Estratégias de virulência entre as bactérias – fatores que causam danos ao
hospedeiro
3.1 - Exotoxinas e mecanismos de ação
3.1.2 – Toxinas do tipo AB
3.1.3 – Toxinas que rompem membranas
3.1.4 – Superantígenos
3.1.5 – Toxinas injetadas na célula do hospedeiro
3.2 - Endotoxinas e mecanismos de ação
3.2.1 – Lipopolissacarídeos
3.2.2 – Ácido teicóico e parede celular
4 - Estratégias de virulência entre as bactérias – evasão dos mecanismos de
defesa do sistema imune
4.1 - Cápsulas e LPS
4.2 - Variabilidade antigênica
4.3 - Produção de proteases
5 - Abordagens experimentais para o estudo da virulência
5.1 - Abordagens in vivo x in vitro
5.2 - Abordagens celulares x moleculares
6 - Transmissão do patógeno
6.1 - Vias de contágio
6.2 - Organotropismo
6.3 - Bacteriemia x septicemia
7 - Evolução da doença infecciosa
7.1 - Período de incubação
7.2 - Período da doença
7.3 - Período de convalescência
ENTEROBACTÉRIAS
Profa. Dra. Rita de Cássia Café Ferreira
1. Introdução
2. Morfologia e características gerais
Bacilos Gram-negativos, podem ser móveis ou imóveis, não esp[orulados, aeróbicos facultativos.
Seu tamanho varia de 0,5 a 2um de espessura por 2 a 4 um de comprimento.
3. Distribuição no ambiente
4. Interação com homem
Comensais ; Oportunistas e Patogênicas
5. Principais enterobactérias de interesse médico
•
Escherichia coli
Classificação, Cultivo, Habitat e Identificação
Patogenicidade ( principais Fatores de Virulência )
Diagnóstico
Tratamento
.
Salmonella
Classificação, Cultivo, Habitat e Identificação
Patogenicidade ( principais Fatores de Virulência )
Diagnóstico
Tratamento
.
Shigella
Classificação, Cultivo, Habitat e Identificação
Patogenicidade ( principais Fatores de Virulência )
Diagnóstico
Tratamento
.
Yersinia
Classificação, Cultivo, Habitat e Identificação
Patogenicidade ( principais Fatores de Virulência )
Diagnóstico
Tratamento
CONTROLE DA POPULAÇÃO MICROBIANA POR AGENTES FÍSICOS
Profa. Dra. Silvana Cai
1. Introdução
2. Conceitos:
„ esterilização: destruição ou remoção de todas as formas de vida, inclusive endosporos.
„ desinfecção: eliminação de microrganismos na forma vegetativa, em um material inanimado, sem
que haja, necessariamente, destruição de todos os organismos presentes, como esporos bacterianos e
fúngicos.
„ desinfetante: agente químico que promove a desinfecção de superfície inerte.
„ antissepsia: eliminação de patógenos na forma vegetativa em um tecido vivo.
„ antisséptico: substância que pode ser aplicada na pele ou em outro tecido vivo, para prevenir ou
interromper o desenvolvimento microbiano, através de inibição do seu metabolismo ou morte dos
microrganismos.
„ sepse (ou sepsia) : indica contaminação bacteriana.
„ assepsia: conjunto de técnicas utilizadas para impedir a penetração de microrganismos em um
determinado local. São importantes em cirurgia para minimizar a contaminação dos instrumentos, da
equipe cirúrgica e do paciente.
„ descontaminação: remoção de microrganismos patogênicos de objetos, de maneira que o seu
manuseio seja seguro.
„ fungicida, virucida, bactericida, esporocida: agente físico ou químico capaz de matar
fungos, vírus, bactérias ou endosporos, respectivamente.
„ fungistático, bacteriostático: agente físico ou químico capaz de inibir a multiplicação de fungos
ou bactérias.
3. Métodos de esterilização ou desinfecção por agentes físicos:
3.1. Altas temperaturas:
3.1.1. Calor úmido
ƒ
Vapor d’água sob pressão: esterilização em autoclave (121oC/15 minutos)
ƒ
Água em ebulição: método de desinfecção (100oC/10 minutos)
ƒ
Pasteurização: método de desinfecção
ƒ
rápida: 72oC/15 segundos, seguido de rápido resfriamento
ƒ
lenta: 63 a 66oC/30 minutos, seguido de rápido resfriamento
3.1.2. Calor seco
o
o
„ estufa de esterilização (160 C/2 horas ou 170 C/1 hora): para instrumentos metálicos,
vidraria, pós, substâncias oleosas, ceras e outros materiais afetados pela água
o
o
„ incineração (1315 C/0,2 segundos ou 815 C/0,5 segundos): Processo de esterilização
que atinge altas temperaturas e reduz o material a cinzas. Indicado para lixo hospitalar, animais
infectados, lixo de consultórios médico e dentário, laboratórios, bancos de sangue, etc. Reduz o volume
do lixo a 10% do original
„ aquecimento ao rubro: processo de esterilização de metais que são levados diretamente à chama
do fogo até sua incandescência. Indicado para alça de platina.
„ flambagem: processo de desinfecção que consiste em levar o material em contacto com o fogo por
curto espaço de tempo.
3.2. Baixas temperaturas: refrigeração e congelamento
3.3. Radiações
ƒ
Radiações ionizantes: promovem esterilização através de raios gama e raios X
ƒ
Radiações não ionizantes: promovem desinfecção através de raios ultra-violeta ou
diminuição do número de bactérias em fornos de microondas
3.4. Filtração: promove esterilização – membranas filtrantes
ƒ
Filtros de partículas de ar de alta eficiência (HEPA)
3.5. Dessecação
ƒ
Liofilização
3.6. Utilização de altas concentrações de sais ou açúcares: efeitos da pressão osmótica
CONTROLE DA POPULAÇÃO MICROBIANA POR AGENTES QUÍMICOS
Profa. Dra. Silvana Cai
1. Introdução
2. Fatores que influenciam a desinfecção química
2.1. Natureza química do desinfetante
2.2. Natureza dos microrganismos
2.3. Concentração de microrganismos: importância da lavagem e escovação prévias
2.4. Estado fisiológico das células
2.5. Presença de matéria orgânica: importância da lavagem e escovação prévias
2.6. Concentração do desinfetante
2.7. Temperatura ambiente
2.8. pH.
2.9. Tempo de ação do agente químico
3. Características de um germicida químico ideal
3.1. Amplo espectro de ação em baixas concentrações
3.2. Toxicidade para microrganismos em temperatura ambiente ou corporal
3.3. Inocuidade para os tecidos humanos
3.4. Ausência de combinação com matéria orgânica
3.5. Ausência de poderes corrosivos e tintoriais
3.6. Solubilidade
3.7. Ação residual
3.8. Capacidade detergente
3.9. Disponibilidade a baixo custo
3.10. Estabilidade no armazenamento
4. Principais grupos de germicidas químicos
4.1. Óxido de etileno
4.2. Glutaraldeído
4.3. Formaldeído
4.4. Fenol e compostos fenólicos
4.5. Álcoois
4.6. Halogênios: iodo e iodóforos, cloro e hipocloritos
4.7. Metais pesados: sais de Hg; sais de Ag, Cu, Zn
4.8. Agentes tensoativos (ou surfactantes):detergentes sintéticos aniônicos e catiônicos
4.9. Oxidantes: H202
4.10. Biguanidinas: clorexidina
5. Mecanismos de ação dos germicidas químicos
5.1. Alterações da permeabilidade celular: compostos fenólicos, álcool, detergentes sintéticos.
5.2. Desnaturação protéica: compostos fenólicos, álcool, sais de mercúrio, prata, detergentes
sintéticos, óxido de etileno, glutaraldeído, I 2, formaldeído.
5.3. Oxidação: cloro e compostos clorados, H202 e I2.
5.4. Inibição de atividades enzimáticas: cloro, I2, H202, sais de Ag e Cu, formaldeído, detergentes
sintéticos, óxido de etileno.
5.5. Inibição da síntese de ácidos nucleicos: glutaraldeído, formaldeído e óxido de etileno.
6. Esterilizantes químicos ou germicidas de alto nível
6.1. Óxido de etileno
6.2. Glutaraldeído
6.3. Formaldeído
7. Desinfetantes hospitalares ou germicidas de nível intermediário
7.1. Fenóis sintéticos
7.2. Hipocloritos
7.3. Compostos tensoativos do iodo (iodóforos)
8. Saneantes hospitalares ou germicidas de baixo nível
8.1. Compostos quaternários de amônio
9. Antissépticos
9.1. Iodo polivinilpirrolidona (PVP-I)
9.2. Clorexidina
FUNGOS AGENTES DE MICOSES SUPERFICIAIS E SISTÊMICAS
Prof. Dr. Walderez Gambale
As doenças provocadas por fungos são classifícadas de acordo com a localização no hospedeiro:
Micoses superficiais
Pitiríasis versicolor-Malassezia furfur
Piedra preta- Piedraia hortae
Piedra branca- Trichosporon beigelii
Micoses Cutâneas
Dermatofitoses- Trichophyton, Microsporum e Epidermophyton
Candidíase-Candida albicans
Micoses Subcutâneas
Esporotricose-Sporothrix schenckii
Cromomicose-Phialophora, Cladosporium e Fonsecaea
Micetomas-Pseudoallescheria, Madurella, Acremonium
Doença de Jorge Lobo-Paracoccidioides loboi
Micoses Sistêmicas
Paracoccidioidomicose- Paracoccidioides brasiliensis
Histoplasmose- Histoplasma capsulatum
Criptococose- Crytococcus neoformans
Além das micoses, os fungos podem ainda produzir alergias e micotoxicoses
Diagnóstico laboratorial
Métodos diretos
1- Exame direto
à fresco - clareamento com KOH
após colorações : Gram, Giemsa
2- Histopatológico - HE, Gomory, PAS
3- Cultura: Sabouraud
Sabouraud + antibióticos
Meios específicos: seletivos e indicadores
Exame macroscópico e microscópico
4- Provas bioquímicas p/ identificação
Auxanograma para fontes de C e N.
Zimograma
Urease etc.
5- Provas imunológicas para identificação do agente
Métodos Indiretos
1- Imunológicos
Reação
de
Fixação
do
complemento,
aglutinação,
contraimunoeletroforese, imunofluorescência, intradermoreação, etc.
Precipitação,
imunodifusão,
Micoses Superficiais
Constituem um grupo de fungos que estão praticamente no limiar do saprofitismo e do parasitimos,
causando no hospedeiro apenas distúrbios estéticos.
PITIRIASIS VERSICOLOR
Definição: dermatose superficial crônica, cosmopolita, muito freqüente em clima tropical, caracterizada
pelo aparecimento de pequenas manchas bem delimitadas, de coloração variável, localizadas
principalmente, no troco e no abdômem. Não tem prefer6encia por raça ou sexo, atinge mais
freqüentemente adultos jovens.
Agente etiológico: Malassezia furfur (Baillon, 1889).
Características clínicas: Lesões superficiais, atingindo principalmente o tronco e abdômem, mas
podendo acometer pescoço, face, braços, e raramente mão e região inguinocrural. As lesões se apresentam
sob a forma de manchas hipocrômicas descamativas irregulares, de cor variável, dependendo da cor do
indivíduo, e condição do clima. Apresenta fluorescência à luz de Wood.
Diagnóstico micológico: as escamas devem ser clarificadas pela potassa diluída 20 ou 30%. Ao
exame microscópico observam-se esporos arrendondados, isolados ou em grupos ao lado de hifas curtas,
septadas, ramificadas.
As culturas das escamas um meio da Sabouraud + cloranfenicol + cicloheximida, adicionado de óleo
de oliva, pois esta levedura é lipofílica, e incubada à 37oC permite o isolamento de fungo leveduriforme.
PIEDRAS
PIEDRA BRANCA E PIEDRA NEGRA
Definição: infecção micótica dos pêlos caracterizados pela presença de nódulos mais ou menos duros,
esbranquiçados (piedra branca) ou negros (piedra negra).
As piedras são infecções benignas, mas muito contagiosas e de fácil propagação. Ambas são
distintas, não só pelos seus agentes etiológicos, mas também por sua distribuição geográfica e
epidemiológica Clinicamente, estas micoses podem ser confundidas com a tricomicose axiliar e com a
pediculose (lêndias). Atacam a região folicular dos pêlos.
PIEDRA NEGRA
Agente etiológico: Piedraia hortai
Epidemiologia: é observada em regiões tropicais e subtropicais da América do Sul, endêmica na
Amazônia, na Indochina e em Java. Ocorre, principalmente nas regiões onde há abundante queda
pluviométrica. Ataca somente os cabelos, apresentando nódulos visíveis ou não a olho nu. As nodosidades
da piedra preta são muito consistentes.
Exame micológico: o cabelo deve ser cortado e examinado após clarificação com potassa a 10% ou
lactofenol. Observa-se um nódulo constituído de um micélio largo de 2 a 4 µm, de paredes escuras,
presença de ascos ovais contendo ascóporos fusiformes.
Cultura em ágar-Sabouraud as colônias são verde-escuras, enegrecidas, acuminadas listas ou
plissadas, de crescimento lento.
Aspecto microscópico: filamentos escuros, curtos de paredes espessas, numerosos clamidoconídios.
PIEDRA BRANCA
Agente etiológico: Trichosporon beigelli
Epidemiologia: é de vasta distribuição geográfica cosmopolita Ataca os pêlos da barba e do bigode,
mais raramente os pêlos exilares. Recentemente observou-se ser comum em pêlos escrotais. Os nódulos
são menos consistentes e aderentes ao pêlo. São freqüentemente encontrados na extremidade do pelo e
pouco visíveis a olho nu.
Exame micológico: Após clarificação de pêlo com potasso a 10% ou lactofenol, observa-se um,
fragmentados em elementos mais ou menos retangulares ou arredondados não apresentam ascos
Cultura em ágar-Sabouraud as colônias, são de cor creme, moles, membranosas, tornando-se com
o tempo levemente penugentas e aderindo fortemente ao meio de cultura. Crescimento rápido.
Aspecto microscópico: Filamentos e artroconídos.
FUNGOS PRODUTORES DE MICOSES CUTÂNEAS
DERMATOFITOSES
Definição:
É uma infecção cutânea, com uma variedade em aspectos clínicos, cujos agentes etiológicos
atacam com predileção a queratina da pele, e unhas. A infecção é geralmente restrita às camadas não vivas
da superfície corpórea. A maioria destas infecções são causadas por um grupo homogêneo de fungos
queratinofílicos chamados dermatófitos.
Os dermatófitos são divididos em gêneros, segundo:
forma assexuada de reprodução
-
Microsporum sp
Trichophyton sp
Epidermophyton sp
forma sexuada da reprodução
-
Nanizzia sp
Arthroderma sp
quanto ao habitat os dermatófitos podem ser:
- geofílicos - quando têm seu habitat no solo
- antropofílicos - quando têm seu habitat no homem.
- zoofílicos -quando têm seu habitais nos animais.
Modo de infecção: a miceliano depositado sobre a pele e proveniente do solo, de animal ou do homem.
Os filamentos micelianos crescem excentricamente na camada córnea da pele e se ramificam. Após espaço
de uma semana há uma reação cutânea e formação de vesículas ao redor da lesão. O pêlo é penetrado
secundariamente; o dermatófito vai utilizando a queratina do pêlo e penetrando em direção ao bulbo. Os
cabelos parasitados, frágeis, podem-se quebrar (tinhas tonsurantes)
O aspecto dos elementos fúngicos dentro e no redor dos pêlos e a presença de hifas septadas,
ramificadas. artrosporadas nas escamas de pele e unhas, indicam seguramente uma infecção por
dermatófitos.
Aspectos clínicos das dermatofitoses:
Dependendo do local onde o dermatófito se instale podemos denominar a dermtofitose, por
exemplo, na região inguino-crural=tinha cruris; no corpo=tinha corporis; na barba=tinha barbas; na mãos=
tinha manum; nos pés= tinha pedis, na unha= tinha unguium; no couro cabeludo=tinha capitis.
Estudo biológico dos dermatófitos:
Podemos utilizar a lâmpada de Wood, não só para o auxílio diagnóstico, como para controle de
cura. As lesões de tinhas submetidas às radiações ultravioletas, filtradas, apresentam fluorescência verde,
principalmente na lesões de tinha do couro cabeludo.
Para a coleta do material biológico devemos utilizar: Placa de Petri; tesoura; bisturi; pinça e lâminas
de microscopia.
Das lesões do couro cabeludo devemos coletar, com pinça os fios de cabelo que já estão
tonsurados.
Nas lesões circinadas devemos raspar, com bisturi ou com a própria lâmina, na bordas das lesões,
pois é o local onde o fungo está em atividade.
Nas oníquias sub-ungueasis deve-se raspar por debaixo da unha, em contato com o tecido são. A
unha pode ser cortada.
Todo material deve ser coletado em placa de Petri ou entra duas lâminas. Não se deve misturar
materiais de locais diferentes.
Exame direto: principalmente, submeter o material ao amolecimento e a clarificação com potassa (KOH)
diluição a 10, 20 ou 30% .
O que procurar nas preparações:
Exame direto de escamas de pele ou unha filamentos micelianos longos, ramificados, septados
Exame direto de cabelo ou pêlo: bainha de esporos redondos ao redor do pêlo (parasitismos
ectothrix) ou esporos no interior do pêlo (parasitismo endothrix). Pode ocorrer parasitismo endo e ectothrix
ao mesmo tempo.
Cultura: todos os dermatófitos crescem facilmente no meio de ágar Sabouraud dextrose ou no meio
“Mycosel” que meio de Sabouraud acrescido de cloranfenicol, inibidor bacteriano, e de cicloheximida, que
inibe fungos filamentosos contaminantes.
CANDIDÍASE
Definição
Candidose ou Candidíase é uma infecção primária ou secundária envolvendo as espécies do
gênero Candida. Pode-se considerar cerca de 7 espécies patogênicas para o homem: C. albicans,
tropicalis, pseudotropicalis, krusei, guilliermondii, stellatoidea e parapsilosis. As manifestações
clínicas da doenças são as mais variadas, podendo ser subaguda, aguda ou crônica. O envolvimento pode
ser localizado na boca, garganta, couro cabeludo, vagina, dedos, unhas, brônquios, pulmões, trato
gastrointestinal ou generalizado, como na septicemia, endocardite e meningite.
Os processos patológicos também são variados indo desde irritação e inflamação até uma resposta
granulomatosa e supurativa. Desde que a C. albicans é uma levedura endógena, isto é, encontrada
normalmente no homem, sua manifestação representa um processo oportunístico.
Para que C. albicans seja considerada patogênica é necessário que a mesma seja isolada de
modo constante, em grande quantidade das lesões e, de modo geral, visualizada ao exame direto na forma
filamentosa.
Freqüentemente, o paciente apresenta debilitação em seus mecanismos de defesa ou tem uma
doença de base.
Nos pacientes idosos debilitados, recém-nascidos prematuros e nos desnutridos, a ocorrência de
candidose é alta, em suas variadas formas clínicas. Durante a gravidez, principalmente nos 3 últimos
meses, com o aumento de glicogênio nas células da mucosa vaginal, ocorre aumento de candidose vaginal.
Tratamentos prolongados com antibióticos, principalmente os chamados de largo espectro de ação,
corticóides, drogas antiblásticas e os anticoncepcionais favorecem a instalação de candidose.
Um dos principais fatores locais para a instalação de candidose é umidade. Assim, lavadeiras, cozinheiras,
faxineiras, estando muito em contato com água e sabão, são acometidas pela colonização do fungo,
principalmente nos sulcos ou dobras cutâneas. A maceração da pele por fatores mecânicos ou químicos
favorece o crescimento do fungo.
O mecanismo exato de penetração de C. albicans na pele e mucosa ainda não está elucidado.
Alguns pesquisadores defendem que ela ocorra através de blastoconídios, enquanto que a maioria sugere
que a penetração se efetue através do pseudomicélio, que teria maior virulência.
Diagnóstico micológico
Material biológico: raspados das lesões cutâneas e das mucosas, expectoração, raspados das unhas,
urina, sangue e biópsias, entre outros.
Exame direto:
-
à fresco com KOH a 20%
esfregaços corados pelo Gram ou Giemsa ( além de poder visualizar os elementos fúngicos,
permite avaliar a quantidade de microrganismos)
cortes histológicos: PAS ou Gomori & Grocott (elementos leveduriformes com brotamentos e
filamentos abundantes).
Cultura: em meio ágar Sabouraud dextrose + cloranfenicol; após 24-48 horas colônias cremosas,
esbranquiçadas, brilhantes. Ao exame microscópico visualiza-se apenas os elementos leveduriformes
comuns a todas as espécies de Candida.
Identificação da espécie de C. albicans
1. Produção de clamidoconídios : em meio de fubá (“corn meal ágar”+ tween 80), a C. albicans produz
produz clamidioconídios terminais ou intercalares, redondos ou ovais, após 24-48 hs.
2. Produção de tubo germinativo: a C. albicans produz o tubo germinativo em presença de soro (humano,
fetal bovino) após 1-3 horas à 37oC.
3. Assimilação de fontes de carbono e nitrogênio – Auxanograma.
4. Fermentação de açúcares – Zimograma.
CRIPTOCOCOSE
Definição
É uma infecção subaguda ou crônica de comprometimento pulmonar, sistêmico e, principalmente,
do sistema nervoso central, causada pelo Cryptococcus neoformans. A infecção primária no homem é
quase sempre pulmonar, devido a inalação do fungo da Natureza. A infecção pulmonar é quase sempre
subclínica e transitória, podendo imergir ao lado de outras doenças que debilitam o indivíduo, tornando-se
rapidamente sistêmica e fatal. Portanto, é conhecida como infeção oportunística. Este fungo tem tropismo
pelo SNC, ocasionado meningite criptocócica.
C. neoformans é essencialmente o único agente etiológico da criptococose, doença do homem e
de animais, tais como: gatos, cães e cavalos. A espécie C. neoformans caracteriza-se também por
provocar morte rápida (3 a 4 dias) de camundongos inoculados através de via cerebral, formando extensas
massas tumorais.
C. neoformans é de distribuição cosmopolita e está associado com habitat de aves. O pombo
parece ser o principal vetor para a distribuição e manutenção do fungo. Não parece que o pombo tenha a
infecção, uma vez que ele tem uma temperatura corporal em torno de 42oC. O fungo vive nas fezes e pode
permanecer viável por 2 anos se houver umidade suficiente.
A porta de entrada é através da via respiratória levando a uma infecção pulmonar
primária que pode ser inaparente. Então o fungo pode permanecer viável por anos até
haver alguma alteração na resistência do hospedeiro, quando então se manifesta a doença
no pulmão, no SNC ou disseminada.
Diagnóstico micológico
Materiais biológicos: liquor, escarro, pus ganglionar, exsudatos de lesões cutâneas e mucosas, urina
e sangue.
Exame direto: à fresco com tinta nanquim (C. neoformans é visualizado como uma célula redonda,
circundada por uma cápsula não corada)
Cultura: o material deve ser semeado em ágar Sabouraud dextrose e dará crescimento a uma colônia
viscosa, lisa, brilhante. Com o tempo, a colônia escorre para a base do tubo.
PARACOCCIDIOIDOMICOSE
Definição
P. brasiliensis é um fungo dimórfico, agente da Paracoccidioidomicose, doença de localização
sistêmica, grave e que se manifesta por diversas formas clínicas.
O exame direto a fresco é de grande valor no diagnóstico dessa micose, pois o
fungo apresenta-se sob a forma de levedura com dupla membrana, sendo a interna
enrugada e a externa lisa. Dependendo do material, apresenta-se com brotamentos
múltiplos Em material de biópsia, com coloração de Gomory, pode-se observar facilmente o
aspecto característico de “roda de leme”.
O cultivo pode ser feito em ágar Sabouraud a 25oC e em ágar BHI com sangue ou meio de Fava
Netto a 37oC e incubar de 20 a 30 dias. A 25oC, a cultura esta em fase M (mould-bolor) e observa-se o
desenvolvimento de uma colônia cotonosa, branca, elevada e de crescimento lento, cujo exame
microscópico revelará apenas micélio septado e alguns clamidósporos. A 37oC, a cultura está em fase Y
(yeast=levedura) e observa-se o desenvolvimento da colônia leveduriforme. Ao exame microscópico,
observam-se células isoladas com gemulação simples e múltipla.
O material de cultura quando inoculado em testículo de cobaios ou de ratos
originará orquite específica experimental.
De grande valor no diagnóstico e prognóstico dessa micose são as reações imunológicas, como por
exemplo, a reação de fixação do complemento, de precipitação e intradermoreação.
HISTOPLASMOSE
Definição
É uma doença fúngica granulomatosa, cujo agente etiológico é o Histoplasma capsulatum. Este
fungo apresenta especial afinidade pelo sistema reticuloendotelial
(SER), produzindo diversas
manifestações clínicas, sendo a forma pulmonar a mais freqüente.
Ecologia e epidemiologia
H. capsulatum cresce em solos com alto teor de nitrogênio, geralmente associado com excretas de
aves e morcegos. Solos de galinheiros, viveiros de aves, cavernas de morcegos são altamente propícios. As
aves fornecem o substrato ideal para o crescimento do fungo no solo, podendo transportá-lo para outros
locais em suas penas. Os morcegos são infectados, excretando o fungo em suas fezes, podendo
disseminar a doença em suas migrações. O principal agente vetor é o vento, que pode disseminar os
conídios a longas distâncias.
Patogenia
A inalação de uma quantidade suficiente de partículas infectantes do fungo, gera a infecção primária
no pulmão, com o crescimento de leveduras nos alvéolos pulmonares e interstício. A intensidade da
exposição inalatória, além de outros atores, determinará se a infecção resultante corresponderá a sintomas
clínicos. Se a exposição for leve, a infecção será provavelmente assintomática, e se for maciça, o resultado
será sintomática aguda.
Diagnóstico laboratorial
Exame direto: o exame à fresco não representa muito valor no diagnóstico dessa micose, pela
dificuldade de visualização das leveduras no interior das células do SER. Em material de biópsia corado
pelo método da hematoxilina-eosina (HE) ou pelo Giemsa, observam-se células leveduriformes pequenas,
redondas, intra-citoplasmáticas e que apresentam halo claro ao redor, imitando cápsula.
Cultura: o cultivo deve ser feito em ágar Sabouraud dextrose a 25oC e em ágar BHI com sangue ou em
meio Fava Netto a 37oC. A 25oC, a cultura está em fase M (mould-bolor) e observa-se o desenvolvimento de
colônia esbranquiçada, cotonosa, que revela ao exame microscópico, micélio septado com conídios
ornamentados denominados estalagmósporos. A 37oC a cultura está na fase y (yeast=levedura), observase colônia cremosa e microscopicamente, apenas células leveduriformes ovaladas e pequenas.
Testes sorológicos: provas sorológicas como reação de fixação do complemento, imunodifusão e
imunofluorescência podem ser úteis no diagnóstico dessa doença.
ESPOROTRICOSE
Definição
O Sporotrix schenckii é um fungo dimórfico e agente da esporotricose, micose subcutânea
gomosa, cuja principal forma clínica é a linfangite nodular ascendente dos membros.
O exame direto à fresco não apresenta muito valor no diagnóstico desta micose, pois as estruturas
fúngicas não revela características diferenciais em vida parasitária. Em material de biópsia observa-se
leveduras em forma de “naveta”.
O cultivo deve ser realizado à 25oC e `a 37oC. À 25oC a cultura encontra-se em fase M e observa-se
o desenvolvimento de colônia cotonosa, a princípio branca, tornando-se com o tempo enegrecida e úmida.
Ao exame microscópico observam-se hifas delgadas, septadas e conídios piriformes dispostos em forma de
“margarida” na extremidade e pedúnculos (conídióforos) ou inseridos diretamente nas hifas. Culturas
envelhecidas revelarão conídios arredondados e dispostos paralelamente às hifas. À 37oC, a cultura está
em fase Y e observa-se o desenvolvimento de uma colônia branca e cremosa. Ao exame microscópico
observam-se leveduras elípticas ou em forma de naveta.
Identificação laboratorial
Exame direto: à fresco não revela nenhuma forma conclusiva de S. schenckii. Esfregaços de pus
corados pelo Gram, PAS ou Gomori, raramente permitem visualização do fungo. Pela técnica de
imunofluorescência direta, a visualização do agente em pequeno número é mais fácil.
As células fúngicas observadas nas lesões são raras e quando presentes, são vistas como
leveduras com ou sem brotamento (formas de naveta), Gram +, PAS +, tamanho de 2-3µ x 3µ, sob forma
de corpo asteróide, células esféricas de parede espessa.
Cortes histopatológicos corados pelo Gram, PAS ou Gomori & Grocott mostram o fungo sob a
forma de naveta ou charuto ou ainda formas asteróides, resultantes de uma relação hospedeiro-parasita.
Cultura: excelente crescimento em ágar Sabouraud dextrose ou Mycosel. Cultura cresce em 3 a 5 dias, é
um processo seguro e de rápido diagnóstico. O exame cultural pode ser complementado pelo poder
patogênico experimental do fungo isolado, através de inoculação testicular em ratos, hamster ou
camundongos, que desenvolverão orquite com pus rico em elementos fúngicos.
Características macroscópicas da cultura: em meio de ágar Sabouraud-dextrose, à temperatura
ambiente, as colônias de S. schenckiii são de formas e cores variadas, de esbranquiçadas a negras,
superfície plissada, levemente aveludada e de consistência elástica. À temperatura de 37oC a cultura é
leveduriforme, de consistência cremosa e de cor amarelo creme.
Características microscópicas da cultura: a forma miceliana é obtida em microcultivo em
lâmina, verifica-se a presença de finos filamentos septados, com conídios redondos ou piriformes, dispostos
ao longo das hifas ou na forma característica em “margarida”. À 37oC apresenta-se sob a forma de levedura
com brotamento.
VÍRUS RESPIRATÓRIOS
Profa. Dra. Dolores U. Mehnert
1. Definição
2. Diversidade de agentes: vírus da influenza (tipos A, B, C), rinovírus (mais de 100 tipos), vírus
respiratório sincicial (VRS), vírus da parainfluenza (tipos 1-4), adenovírus respiratórios (1- 7, 14, 21).
3. Vírus da Influenza (ou da gripe)
3.1 Morfologia e estrutura:
genoma RNA fita simples fragmentado
capsídeo helicoidal
envoltório com espículas H e N
3.2 Hospedeiros naturais: homem e animais
3.3 Variações antigênicas: shift, drift
3.4 Patogenia
3.5 Quadro clínico e complicações
Fonte: www.virology.net/Big_Virology/BVRNAortho.html
3.6 Diagnóstico laboratorial: a. detecção do vírus em material clínico (isolamento e identificação
viral em culturas celulares e ovos embrionados de galinha); b. detecção de anticorpos no soro do doente
(sorologia ) através das reações de inibição da hemaglutinação (IHA), neutralização viral (Nt), ensaio
imunoenzimático (EIE) e fixação do complemento (FC).
3.7 Tratamento: geralmente sintomático, em casos especiais, droga anti-viral (amantadina)
3.8 Profilaxia: vacina contra um ou vários subtipos circulantes
4. Vírus da caxumba
4.1 Classificação
4.2 Morfologia e estrutura: genoma RNA fita simples, capsídeo helicoidal, envoltório com
espículas
4.3 Patogenia
4.4 Quadro clínico: Parotidite
4.4.1 Complicações: Orquite (20 a 30% dos homens após a puberdade), Ooforite (5% das
mulheres após a puberdade), Pancreatite, Miocardite, Otite
4.5 Diagnóstico clínico e laboratorial: a. exame direto; b. isolamento viral; c. sorologia
4.6 Tratamento: sintomático
4.7 Profilaxia: vacina atenuada (MMR) ou inativada
VÍRUS DERMOTRÓPICOS EXANTEMÁTICOS
Profa. Dra. Dolores U. Mehnert
1. Definições
2. Tipos de vírus: máculo-papulares e máculo-pustulares
3. Aspectos gerais dos vírus exantemáticos
SARAMPO
RUBÉOLA
PARVOVÍRUS B19
Paramyxoviridae
Togaviridae
Parvoviridae
RNA f. s.
capsídeo helicoidal
envoltório
RNA f. s.
capsídeo icosaédrico
envoltório duplo
DNA f. s.
capsídeo Icosaédrico
nú
9 a 11 dias
(crianças)
10 a 21dias
cerca de 7 dias
Quadro clínico
exantema
manchas de Koplik
exantema
exantema
Complicações
pneumonia
encefalite
SSPE
Congênita *
congênita?
problemas nas
articulações
Diagnóstico
laboratorial
Exame direto: IF
Isolamento do vírus em
cultura de células
Sorologia (IgM)
Exame direto: IF
Isolamento do vírus em
cultura de células
Sorologia (IgM)
Detecção do vírus por
EIE, sondas e PCR
Sorologia (IgM)
Tratamento
sintomático e
antibióticos para
infecção bacteriana
secundária
sintomático
sintomático
evitar contato com pessoa
doente e
vacina MMR
controle virológico de
produtos sangüíneos e
orgãos transplantados
Família
Características
gerais
Período de
incubação
Profilaxia
evitar contato com
pessoa doente,
administração de
δ-globulina e
vacina MMR
* Malformações mais freqüentes: Catarata, Microcefalia, Deformações ósseas, Retardo mental, Defeitos
cardiovasculares,Lábio e pálato fendidos.
Malformações tardias: Irrupção dental retardada, Diabetes, Hiper- e hipotiroidismo,
Surdez, Anomalias dentais
SEMINÁRIO: Corynebacterium diphtheriae
Responsável : Profa. Silvana Cai
1. MORFOLOGIA E COLORAÇÃO
2. CARACTERÍSTICAS CULTURAIS
3. PATOGENIA DA DIFTERIA
3.1. Produção e ação lesiva da toxina
3.2. Contágio e agentes de infecção
3.3. Evolução da doença
3.3.1. Períodode incubação
3.3.2. Período prodrômico
3.3.3. Período de doença - Manifestações clínicas
3.3.4. Período de convalescença.
4. DIAGNÓSTICO DE LABORATÓRIO
4.1. Exame bacterioscópico
4.2. Isolamento e identificação
4.3. Verificação da toxigenicidade
4.3.1. In vivo - inoculação em cobaias
4.3.2. In vitro - prova de Elek
5. TRATAMENTO
5.1. Soro antidiftérico - casos normais: 60.000 UA.
casos graves : 80.000-100.000 UA
5.2. Antibióticos - penicilinas, eritromicina
5.3. Tratamento sintomático
6. PROFILAXIA
6.1. Isolamento do doente
6.2. Vacinação: anatoxina ou toxóide diftérico; vacina tríplice DPT.
7. PROVA DE SCHICK (suscetibilidade à difteria)
8. PROVA DE MOLONEY ( hipersensibilidade ao toxóide)
SEMINÁRIO: GÊNERO Clostridium
Responsável Profa. Dra. Beatriz L. Fernandes
1. MORFOLOGIA
2. CULTURA
3. IDENTIFICAÇÃO - Determinação dos principais produtos metabólicos.
Tipagem por reações de precipitação contra antígenos específicos.
4. TÉTANO
Agente etiológico
Patogenia; sintomatologia
Diagnóstico
Prevenção e tratamento
5. BOTULISMO
Agente etiológico
Patogenia; sintomatologia
Diagnósotico
Tratamento e Prevenção
6. INTOXICAÇÃO ALIMENTAR E INFECÇÃO INVASIVA
Agente etiológico
Toxinas
Patogenia
SEMINÁRIO: GÊNERO Bordetella
( ESPÉCIE: Bordetella pertussis )
Responsável Profa. Beatriz L. Fernandes
1. INTRODUÇÃO
2. MORFOLOGIA
3. CONDIÇÕES DE CULTIVO
4. PATOGENICIDADE ( Fatores de Virulência )
5. DIAGNÓSTICO DE LABORATÓRIO
6. TRATAMENTO
SEMINÁRIO: GÊNERO Staphylococcus
Responsável Profa. Rita de Cássia Café Ferreira
FAMÍLIA: Micrococcaceae
1 – INTRODUÇÃO
S. aureus – espécies mais patogênica; 50% dos portadores são assintomáticos.
S epidermidis – geralmente saprófita, mas algumas vezes provoca infecção de próteses.
S. saprophyticus – agente de infecções do trato urinário
2 – MORFOLOGIA
3 – CULTURA
4 – EPIDEMIOLOGIA
Fontes de Contaminação e Vias de Transmissão
5 – FATORES DE VIRULÊNCIA
5.1 – Superficiais:
5.2 – Extracelulares:
6 - MANIFESTAÇÕES CLÍNICAS
6.1 – Infecções Cutâneas:
6.2 - Infecções de Mucosa
6.3 – Infecções Profundas
6.4 – Toxi-Infecções:
7 – DIAGNÓSTICO LABORATORIAL
8 - TRATAMENTO
SEMINÁRIO : GÊNERO Streptococcus
Responsável Profa. Rita de Cássia Café Ferreira
1. INTRODUÇÃO
S. pyogenes :
características estruturais importantes, fatores de virulência, doenças causadas
pela bactéria, doenças pós-estreptococicas, diagnóstico, tratamento
S. pneumoniae :
diagnóstico,
caracteristicas estruturais importantes, fatores de virulência, doenças,
tratamento
2. MORFOLOGIA
3. CLASSIFICAÇÃO
4. METABOLISMO
5. CULTURA ( CULTIVO )
6. FATORES DE VIRULÊNCIA
CURIOSIDADES
Genomas
Doenças causadas por Estreptococos orais ( Cárie dental )
Endocardite bacteriana
SEMINÁRIO: GÊNERO Mycobacterium
Responsável Profa. Beatriz L. Fernandes
1. Características gerais do gênero
Parece celular
Método Ziehl-Neelsen (álcool-ácido resistentes)
Necessidades nutricionais
2. Espécies importantes
3. M. tuberculosis
patogenia
resistência à ação de enzimas lisossomais; presença de antígenos Æ resposta inflamatória;
resistência a antibióticos; quadro clínico
diagnóstico
tratamento
4. M. leprae
patogenia
quadro clínico: forma lepromatosa e forma tuberculóide
cultivo
diagnóstico
tratamento
SEMINÁRIO: GÊNERO Pseudomonas
( Pseudomonas aeroginosas )
Responsável : Profa. Rita de Cássia Café Ferreira
1. INTRODUÇÃO
2. MORFOLOGIA E CARACTERÍSTICAS GERAIS
3. CLASSIFICAÇÃO
ƒ
PATOGENICIDADE E FATORES DE VIRULÊNCIA
( Adesinas, Exotoxinas, Fosfolipase C e outros )
ƒ
GRUPOS DE RISCO
ƒ
EPIDEMIOLOGIA
( relação com Infecção Hospitalar )
ƒ
DIAGNÓSTICO
ƒ
TRATAMENTO
( Resistência a antibióticos )
ƒ
PREVENÇÃO
GÊNERO Treponema
( Espécie Treponema pallidum )
Responsável: Profa. Rita de Cássia Café Ferreira
FAMÍLIA: Spirochaetaceae
GÊNERO : Treponema
ESPÉCIE : Treponema pallidum
1. INTRODUÇÃO
2. MORFOLOGIA
3. CULTURA
4. SÍFILIS ( Formas Clínicas ) Primária, Secundária , Terciária e Congênita
5. DIAGNÓSTICO
6. EPIDEMIOLOGIA
7. TRATAMENTO
SEMINÁRIO: GÊNERO Neisseria
Responsável: Profa. Rita de Cássia Café Ferreira
1. Propriedades Gerais
1.1. Características básicas do gênero
1.2. Espécies: habitat e patogenicidade
1.3. Cultivo
1.5 Resistência a antimicrobianos e agentes físicos e químicos
2. Neisseria gonorrhoeae
2.1. Transmissão e patogenia.
2.2. Diagnóstico de Laboratório
2.2.1.
Colheita do material
2.2.2.
Exame bacterioscópico
2.2.3.
Cultivo
2.2.4.
Provas bioquímicas para diferenciação de espécies
2.3. Tratamento
3. Neisseria meningitidis
3.1. Meningite meningocócica
3.2. Transmissão e patogenia
3.3. Diagnóstico de laboratório
3.4. Sorotipos e sua importância epidemiológica
3.5 Tratamento
PRÁTICAS
NORMAS A SEREM SEGUIDAS NO LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA
01)
O uso de AVENTAL branco, comprido e abotoado, é OBRIGATÓRIO no laboratório
de aulas práticas, a fim de proteger a roupa de contaminação.
02)
As bolsas, pacotes, livros etc, deverão ser colocados na bancada ao lado da
entrada do laboratório de aulas práticas e nunca sobre as bancadas de trabalho.
03)
Não fumar e não comer no laboratório. Não beber água das torneiras.
04)
Manter as mãos, canetas, lápis e quaisquer outros objetos sem contato com a boca
ou a face.
05)
Antes de cada aula prática serão dadas as instruções sobre a maneira de executar
os trabalhos. Não iniciar um trabalho prático sem haver lido, cuidadosamente, as
instruções e compreendido o modo de execução da experiência e seu objetivo.
Consultar o professor se encontrar dificuldades para entender ou para executar os
trabalhos práticos. Verificar se o material está completo; no caso de falta de algum,
dirija-se imediatamente ao professor.
06)
Durante o curso serão utilizados microrganismos patogênicos para o homem e
animais. Não haverá perigo se as técnicas de laboratório forem executadas
cuidadosamente.
07)
Em caso de qualquer acidente (derramamento de cultura, aspirações de cultura,
ferimentos etc), comunicar imediatamente ao professor ou ao pessoal técnico do
laboratório, para que sejam tomadas as providências necessárias.
08)
Todo o material contaminado (pipetas, bastões, lâminas, lamínulas etc) deverá ser
colocado nos recipientes adequados (provetas, cubas com desinfetantes etc) para
ser esterilizado; nunca deixá-lo sobre a mesa de trabalho ou na pia.
09)
A alça ou ponta de platina que se usa para semeadura do material ou repique de
culturas deve ser aquecida até o rubro, tanto antes do uso como depois dele. Antes
de tocar o material ou meio de cultura, deve-se deixar que a alça ou ponta esfrie,
mantendo-a próxima à chama.
10)
Os tubos de cultura deverão ser colocados nas estantes ou suportes adequados e
nunca nos bolsos do avental.
11)
O estudante é responsável pelo equipamento com que trabalha. Os microscópios
devem ser manuseados cuidadosamente. Qualquer dano ou defeito deve ser
imediatamente comunicado ao professor. Após o uso do microscópio limpar a
objetiva de imersão, usando lenço de papel.
12)
Após terminar os trabalhos práticos, verificar se as torneiras de água e de gás
estão fechadas, as lâmpadas desligadas e os microscópios limpos. Guardar os
microscópios em seus devidos lugares. Deixar o local de trabalho sempre limpo.
13)
LAVAR SEMPRE AS MÃOS, APÓS O TRABALHO PRÁTICO.
Técnicas de Microscopia - Citologia e Morfologia Bacterianas
Profa. Beatriz L. Fernandes
1. Material: Lâminas preparadas, óleo de imersão.
2. Técnica de microscopia em imersão
a. Depositar uma gota de óleo no centro do esfregaço corado;
b. montar a lâmina no microscópio, pretendendo-a bem;
c.
imergir a objetiva de imersão (100x) no óleo, até encosta-la na lâmina;
d. levantar ao máximo o condensador e abrir totalmente o diafragma;
e. focalizar com o macrométrico até notar o campo e, a seguir, aperfeiçoar o foco com o
micrométrico;
f.
terminado o exame ao microscópio, retirar a lâmina;
g. limpar a objetiva de imersão com lenço de papel.
3. Observação
coradas
microscópica das formas fundamentais em preparações
a. desenhe o que você observa nas respectivas lâminas, anotando o nome das bactérias e a
estrutura observada (p. ex. esporos, cápsulas, etc);
b. descreva as observações feitas de cada lâmina, junto ao desenho;
descreva: cor, forma das bactérias, arranjo de cadeias, etc.
Técnicas de isolamento e identificação bacteriana
Profa. Beatriz L. Fernandes
1. Conceito de isolamento
2. Finalidades do isolamento
•
Estudo de bactérias
•
Diagnóstico de doenças infecciosas
•
Antibiograma (teste de sensibilidade a antimicrobianos)
•
Preparo de vacinas e auto-vacinas
•
Formação de germotecas
3. Requisitos básicos do isolamento
3.1. Técnicas assépticas
3.2. Seleção do meio de cultura adequado
•
Meios orgânicos ricos - Fatores de desenvolvimento
•
Meios seletivos - ex.: Agar Staphylococcus 110, Agar MS (Mitis Salivarius),
MSB (Mitis Salivarius com bacitracina)
•
Meios diferenciais: permitem verificar, por exemplo, se a espécie isolada
fermenta não determinado carboidrato ou é hemolítica ou anemolítica.
•
Meios diferenciais-seletivos
ex.: Agar MacConkey - impedientes de Gram positivos: cristal violeta e taurocolato
de sódio.
- indicador ácido-básico: vermelho neutro
Fermentação de lactose:
colônias Lac + = produzem ácido = vermelhas (ex.: E. coli)
colônias Lac - = não produzem ácido = incolores e translúcidas (ex: Shigella, Salmonella)
3.3. Atmosfera adequada de incubação
4. Métodos de semeadura:
•
Técnica de esgotamento por estria
•
Técnica de semeadura em superfície (uso de alça de Drigalsky)
•
Método de pour-plate
Técnica de coloração de Gram
Profa. Beatriz L. Fernandes
Material necessário:
1. Um tubo de ensaio, contendo cultura de bactérias Gram positivas e Gram negativas em meio líquido
(cocos e bacilos).
2. Cobrir o esfregaço com violeta de genciana, esperar por minuto, lavar com água.
3. Colocar lugol, esperar um minuto, lavar novamente com água.
4. Diferenciar com álcool até não se observar mais a saída de corante, lavar com água.
5. Cobrir com fucsina, esperar 20 segundos e lavar com água. Secar a lâmina e observar ao
microscópio.
6. Anotar os resultados obtidos em cada etapa do esfregaço.
Limpar as objetivas do microscópio e desligá-lo.
Preparo de esfregaços e coloração
A coloração de Gram foi desenvolvida em 1884 pelo bacteriologista holandês Hans Christian Gram.
Esta coloração é uma das mais importantes e é rotineiramente utilizada no laboratório de Microbiologia. Ela
divide as bactérias em dois grandes grupos: GRAM POSITIVAS e GRAM-NEGATIVAS, além de permitir o
estudo da célula bacteriana quanto à sua morfologia (cocos ou bacilos) e arranjo.
Aquelas bactérias capazes de reter o complexo formado pelo cristal violeta (CV) mais o iodo
(complexo iodo pararosanilina) coram-se em violeta (gram-positivo), enquanto que as que não retém o
complexo coram-se em vermelho (gram-negativo).
A coloração de Gram é uma coloração diferencial porque não cora todos os tipos de células
igualmente. Essa maneira de reagir diferentemente, frente ao Gram, é em razão das diferenças na estrutura
da parede celular das bactérias gram-positivas e gram-negativas.
Bactérias gram-positivas possuem uma camada de peptideoglicano mais espessa que as gramnegativas. Quando aplicado em células gram-positivas e gram-negativas o cristal violeta (CV) e o iodo
penetram facilmente, e dentro das células eles se combinam para formar o complexo CV-iodo, que é maior
que a molécula de CV que penetrou. Por causa do seu tamanho o complexo não pode ser lavado das
células gram-positivas pelo álcool e então estas células permanecem coradas pelo CV e aparecem azuis.
Nas células gram-negativas o álcool rompe a camada lipolissacarídica e o complexo é lavado
através da camada fina de peptideoglicano, que não consegue reter o complexo. Estas células são então
contracoradas pelo segundo corante, a safranina ou fucsina e aparecem vermelhos.
A coloração de Gram não está relacionada com os constituintes químicos da parede celular, mas
sim com sua estrutura física, o que confere a característica de positividade ao Gram. Esta coloração é o
ponto de partida na identificação bacteriana, mas não deve nunca ser utilizada como um diagnóstico
definitivo. É importante ressaltar que a coloração de Gram somente será um recurso rápido e útil, quando
corretamente realizada e interpretada.
O objetivo desta prática é demonstrar a importância desta coloração e fazer com que os alunos
sejam capazes de distinguir entre gram-positivas e gram-negativas, concomitantemente,
devem ser capazes de distinguir formas e arranjos.
ANTIBIOGRAMA
Profa. Rita de Cássia Café Ferreira
O antibiograma é um teste que permite a verificação “in vivo”da sensibilidade de uma bactéria aos
antibióticos. Esta sensibilidade é demonstrada pela zona ou halo de inibição de crescimento que se forma
em volta do disco de antibiótico. De acordo com o diâmetro do halo de inibição diz-se que a bactéria é
sensível ou resistente.
Método de Difusão em Agar (Método de Kirby-Bauer)
Material:
. cultura bacteriana crescida por 18 horas (105 células por ml)
. placas com meio de cultura de Müller-Hinton
. discos de antibióticos
. cotonetes e pinças esterilizados
Procedimento:
1. Agitar bem a cultura bacteriana
2. Umedecer o cotonete na suspensão bacteriana, retirando o
excesso ao apertar o cotonete contra a parede interna do tubo.
3. Espalhar a suspensão bacteriana em toda a superfície do meio
de cultura, de modo homogêneo, inclusive nas bordas.
4. Colocar os discos de antibióticos com auxílio da pinça sobre a
superfície do meio e de modo eqüidistante ( ver figura)
5. Incubar as placas a 37o C por 18 horas.
Resultados:
Leitura e Interpretação: Verificar a presença ou ausência de halo de inibição ao redor dos discos.
Medir o diâmetro dos halos e verificar na Tabela o resultado obtido.
ANTIBIÓTICOS
RESULTADOS
(diâmetro em mm)
* Resistente (R) , Intermediário (I); Sensível (S)
R - I – S*
Antibiograma
•
Antibióticos:
Antibiótico
Símbolo
Concentração
Amoxilina
AX
10mg
Tetraciclina
TET
30mg
Penicilina G
PEN
5U
Estreptomicina
EST
10mg
Rifampicina
RIF
30mg
Tobramicina
TOB
10mg
Sulfonamida
SUL
300mg
Esterilização e desinfecção por agentes físicos e químicos
Profa. Rita de Cássia Café Ferreira
1. Ação de agentes químicos
Imergir 3 barbantes, esterilizados, em cultura mista (Escherichia coli + Bacillus cereus) por 20
segundos. Em seguida:
1.1. Imergir o 1o barbante em caldo nutriente (controle).
1.2. Imergir o 2o barbante em Lysoform puro (formol a 7, 4% ) por 1 minuto e, em seguida, colocá-lo
em caldo nutriente.
1.3. Imergir o 3o barbante em solução de hipoclorito de sódio a 0,2% (água sanitária) por 1 minuto e,
em seguida, colocá-lo em caldo nutriente.
1.4. Os tubos serão incubados a 37oC x 24 horas.
Resultados
Desenvolvimento
Gram
Controle
Lysoform
Água sanitária
2. Antissepsia das mãos
2.1. Dividir o fundo da placa de Petri contendo meio de cultura em 3 partes iguais.
2.2. Com auxílio de um cotonete, previamente esterilizado e umedecido em salina esterilizada, esfregar
sobre a pele da palma da mão. A seguir, semear 1/3 da placa com o cotonete e identificar “mãos sem lavar”.
2.3. Lavar as mãos com detergente, vigorosamente, em todas as superfícies, durante 5 minutos. A seguir,
com auxílio de outro cotonete, previamente esterilizado e umedecido em salina esterilizada, esfregar sobre
a pele da palma da mão. Semear 1/3 da placa com o cotonete e identificar “mãos lavadas”.
2.4. Aplicar álcool iodado a 2%, durante 1 minuto, nas mãos pré-lavadas. A seguir, com auxílio de outro
cotonete, previamente esterilizado e umedecido em salina esterilizada, esfregar sobre a pele da palma da
mão. Semear 1/3 da placa com o cotonete e identificar “antissepsia”.
2.5. As placas serão incubadas a 37oC x 24 horas.
2.6. Após este período, comparar o crescimento de colônias nas 3 partes da placa.
2.7. Fazer esfregaços de 3 a 4 colonias diferentes, corar pelo Gram e observar ao microscópio.
3. Ação da luz ultra-violeta (U.V.)
Semeadura
em estrias
1. - controle (sem expor U.V.)
2. - U.V. x 10 minutos
3. - U.V. x 20 minutos
Cultura mista
Incubação: as placas permanecerão embrulhadas em papel por 24 horas a 37oC.
Resultados
Desenvolvimento
Gram
Controle
U.V. x 10 min.
U.V. x 20 min.
4. Ação do calor
semeadura
em estrias
1. controle
2. 60oC x 10 min
3. 60oC x 30 min
semeadura
em estrias
1. controle
2. 100oC x 10 min
3. 100oC x 30 min
Cultura mista
Cultura mista
Incubação: as placas permanecerão por 24 horas a 37oC.
Resultados
Desenvolvimento
Controle
60o C x 10 min.
60o C x 30 min.
100o C x 10 min.
100o C x 30 min
Gram
Morfologia de Fungos
Identificação de Bolores e Leveduras.
Prof. Walderez Gambale
Material
Culturas de Aspergillus, Penicillium, Rhizopus e Candida
Lâminas prontas de Aspergillus, Penicillium, Rhizopus e Candida.
Placas de ágar Sabouraud
Placas para cultivo em lâmina e Placas para cultivo em lâmina-leveduras
Lâminas, lamínulas, corante lactofenol azul-algodão, alças em L
Tubos com solução fisiológica.
MORFOLOGIA MACROSCÓPICA
Descreva os principais aspectos macroscópicos característicos: tipo de colônia, verso, reverso,
pigmentação, etc. Observe a diferença entre levedura e bolor.
Obtenção de colônia gigante.
Com alça de platina em L, retire um pequeno fragmento da colônia do tubo e coloque no centro de uma
placa de Petri com ágar Sabouraud. Deixe à temperatura ambiente. Quando o desenvolvimento estiver
satisfatório, submeta à ação do formol para matar o fungo e descreva os aspectos morfológicos
característicos.
MORFOLOGIA MICROSCÓPICA
Descreva, através de lâminas prontas, os principais aspectos microscópicos dos fungos em questão.
Aspergillus
Penicillium
Rhizopus
Candida
MICROCULTIVO DE BOLORES.
Utilizar placas de Petri contendo lâminas dispostas sobre um bastão de vidro.
Com todo cuidado de assepsia, coloque um pequeno quadrado (1 cm) de ágar Sabouraud, sobre a lâmina.
Com alça de platina, retire um pequeno fragmento de uma colônia escolhida (placa de fungo do ambiente) e
semeie os lados do ágar. Coloque uma lamínula estéril sobre o ágar e água destilada estéril na placa para
evitar dessecamento do meio.
Feche a placa e deixe à temperatura ambiente.
Quando houver desenvolvimento satisfatório, submeta à ação do formol (0,5 ml durante 1 hora) retire a
lamínula e o fragmento do meio de cultura.
Coloque numa lâmina, uma gota de lactofenol azul algodão e a lamínula em cima. Examinar ao
microscópico e tentar identificar. Faça desenho:
MICROCULTIVO DE LEVEDURAS:
Utilizar placas de Petri contendo lâminas dispostas sobre um bastão de vidro.
Com todo cuidado de assepsia, coloque um ml de cornmeal agar + Tween 80 (fundido), sobre a lâmina.
Com alça de platina, retire um pequeno fragmento da colônia de levedura e semeie em estria. Coloque uma
lamínula estéril sobre o ágar e água destilada estéril na placa para evitar dessecamento do meio. Feche a
placa e deixe à temperatura ambiente.
Quando houver desenvolvimento satisfatório, submeta à ação do formol (0,5 ml durante 1 hora). Examine ao
microscópico. Faça desenho:
Provas Bioquímicas para identificação e biotipagem de fungos
Prof. Walderez Gambale
Material:
Cultivos de C. albicans
tubos com 1 ml de solução fisiológica estéril
tubos com 20 ml de meio C ou N
placas estéreis
conjuntos de açucares para auxanograma
espátulas estéreis
recipientes para água fervente
Zimograma para demonstração
Tubos com P. brasiliensis (Fase M e Y)
Ensaios bioquímicos
Auxanograma:
Preparar uma suspensão de C. albicans. Assinalar no fundo da placa, os açucares a serem
empregados. Fundir em banho maria, o meio de cultivo (meio C e meio N). Esfriar até 40-45o c. Semear a
suspensão da levedura pela técnica “pour plate”. Após solidificação, colocar os açucares (pequenas
alíquotas) com uma espátula de madeira estéril. Incubar a 25o C e realizar a leitura após 48 horas.
Zimograma (Demonstração):
Semear 2 ou 3 alçadas da suspensão da cultura em tubos de fermentação contendo solução de açucares a
2%. Agitar levemente os tubos, incubar a 25o C durante 5 a 14 dias. Observar a presença ou não de gás
retido nos tubos de Durhan.
Proteinase (Demonstração)
Enzima extracelular provavelmente relacionada como fator de virulência, tem sido utilizada na
biotipagem de leveduras.
Preparar meio básico ( 18g ágar + 900 ml água destilada) Autoclavar.
Preparar meio albumina (11,7 g YCB + 2 g albumina bovina fração V+ 2,5 ml Protovit + 100 ml água
destilada). Esterilizar por filtração.
Misturara os dois e distribuir em placas de Petri.
Semear uma alçada do dermatófito na placa. Utilizar como controle a cepa 12A de Candida albicans
(24-48 horas).
As amostras produtoras de proteinase produzem uma zona de degradação ao redor do ponto de
inoculação. Para melhor evidenciar o halo, adicionar solução corante (1 g negro de amido + 198,8 ml ácido
acético + 1000 ml água destilada); esgotar; adicionar solução reveladora ( 6,7 ml ácido acético + 1000 ml
água destilada)
Determinar o PZ ( atividade enzimática) = razão entre o diâmetro da colônia e o diâmetro da colônia
mais a zona de degradação.
Cod 1- Pz=1 negativo; Cod 2 pz>=0,64< 1 positivo; Cod 3 pz < 0,64 fortm positivo
Fosfolipase (Demonstração)
Enzima que degrada fosfolipideos e lisa membranas biológicas, também relacionada como fator de
virulência, tem sido utilizada para estabelecer biotipos de leveduras.
Preparar 40 g de gema de ovo pura ( Mergulhar ovos em alcool iodado (70% durante 1 hora.
Separar as gemas em recipiente esteril e aspirar asseticamente com pipeta Pasteur.
Preparar ágar fosfolipase ( 10 g peptona; 20g glicose; 57,3 g cloreto de sódio; 0,5 g de cloreto de
cálcio; 20g de ágar; 1000 ml água destilada). Esterilizar e adicionar 40 ml de gema de ovo. Distribuir em
placas de Petri.
Inocular uma alçada do dermatófito e da cepa padrão
As amostras produtoras de fosfolipases formam uma zona opaca de degradação ao redor do ponto
de inoculação.
Determinar o índice Pz
Urease
Para diferenciação de T. rubrum e T. mentagrophytes. Semear os dermatófitos no meio de ureia
com indicador de pH (fenol vermelho). Incubar em estufa. Verificar a mudança do pH até 20 dias. Urease+
(vermelho) urease- (amarelo).
Dimorfismo fúngico (Demonstração)
Reações de hemaglutinação e inibição da hemaglutinação
Profa. Dolores U. Mehnert
Alguns vírus, ou antígenos derivados de vírus, adsorvem a hemácias, através de receptores
existentes na supefície destas. Como resultado, as hemácias aglutinam, sendo este fenômeno chamado de
hemaglutinação.
A reação de hemaglutinação é uma técnica simples. Basicamente, as hemácias em
suspensão são colocadas em contacto com uma suspensão de vírus, ou do antígeno hemaglutinante. Por
ação da gravidade, as hemácias aglutinadas sedimentam de forma difusa. Na ausência de vírus, as
hemácias sedimentam na forma de um botão compacto, no fundo do tubo ou da placa.
Dependendo do vírus, há uma grande variação na espécie animal cujas hemácias vão ser
aglutinadas. Assim, alguns vírus aglutinam hemácias de uma grande variedade de espécies. O vírus de
influenza, por exemplo, aglutina hemácias de galinha, cobaio, carneiro e humanas do grupo O. Outros vírus
aglutinam hemácias de uma espécie apenas, como é o caso do vírus do sarampo, que só aglutina hemácias
de macaco.
A reação de hemaglutinação pode ser usada para detecção ou identificação preliminar de
vírus isolados de paciente, pesquisando-se quais as hemácias que estes vírus aglutinam. Pode também ser
usada para titular os vírus hemaglutinantes, determinado-se a mais alta diluição de vírus que ainda é capaz
de aglutinar hemácias.
As hemaglutininas virais são antigênicas e, quando um vírus hemaglutinante infecta o
organismo humano ou animal, além de anticorpos neutralizantes, fixadores do complemento e outros, há a
produção de anticorpos específicos contra as hemaglutininas virais.
Esses anticorpos presentes no soro são capazes de se combinar com o vírus in vitro,
inibindo assim a hemaglutinação. Este é o princípio da reação de inibição da hemaglutinação, que tem
grande utilidade no diagnóstico das viroses. Esta reação pode ser usada para identificar vírus isolados de
pacientes, usando antisoros padrões específicos, ou ainda para dosar anticorpos no soro de pacientes,
usando vírus padrões mantidos no laboratório. Neste último caso, para diagnóstico, deve-se colher duas
amostras de soro do paciente: uma na fase aguda, logo que se manifesta a doença e outra, na fase
convalescente, duas semanas após a primeira. Se houver um aumento do título de anticorpos inibidores da
hemaglutinação de pelo menos 4 vezes para um determinado vírus pode-se fazer um diagnóstico seguro da
infecção por este vírus. Este aumento de título, de pelo menos 4 vezes é chamado de soro conversão.
Exercício no 1: Demonstração da presença de agente viral através da evidenciação da hemaglutinina
produzida pelo mesmo e dosagem desse vírus, por reação de hemaglutinação (estabelecimento de 1
(uma) dose hemaglutinante de vírus).
1. Com pipeta conta-gotas distribuir 0,5 ml de solução fisiológica em cada um dos tubos 12 x 75mm. Por
último acrescentar também 0,5 ml ao tubo identificado como Newcastle (que contém 0,5 ml de vírus
não diluído).
2. Homogeneizar a suspensão do vírus Newcastle (diluição 1/2) e transferir 0,5 ml para o 2º tubo da série.
Homogeneizar e transferir 0,5 ml para o 3º tubo e assim sucessivamente, até o último tubo (1/512).
3. Adicionar, com a mesma pipeta conta-gotas, 1 gota de cada diluição viral, a cada orifício da placa,
começando do tubo mais diluído.
4. Para o controle de hemácias, adicionar 2 gotas de solução fisiológica a dois orifícios da placa.
5. Adicionar a seguir, 1 gota da suspensão de hemácias de galinha, a todos os orifícios com uma pipeta
conta-gotas.
6. Agitar suavemente a placa e incubar à temperatura ambiente por 30 minutos.
Leitura: Nos orifícios "controle", nos quais se dispensou solução fisiológica e hemácias, estas, por ação da
gravidade devem ter sedimentado, formando ao fundo um botão fechado, central. Nos orifícios que
contém aglutinina viral, as hemácias formam um aglomerado irregular.
Convencionou-se, como uma unidade hemaglutinante (UHA) do vírus, a maior diluição do
mesmo, capaz de produzir hemaglutinação, no volume considerado (0,050ml), e como título do antígeno
viral, a recíproca da maior diluição. Por exemplo: se temos uma unidade, na diluição 1/128 em 50µl, o título
será 128 UHA/50µl. Para se obter uma suspensão contendo 4 unidades hemaglutinantes (no volume em
questão), devemos diluir a suspensão viral 4 vezes menos, diluição esta que corresponde ao 3º orifício,
contado de trás para diante, a partir do orifício que contém uma unidade.
Exercício no 2: Demonstração da reação de inibição da hemaglutinação, através da dosagem de
anticorpos inibidores da hemaglutinação, em 2 amostras de soro de um mesmo paciente, colhidas na fase
aguda e na fase de convalescença.
Para a reação de inibição da hemaglutinação, os soros dos pacientes são diluídos na placa e cada
diluição é colocada em contato com um volume fixo de uma suspensão viral, contendo 4 unidades
hemaglutinantes. Esta mistura é incubada por 1 hora, para permitir a reação do anticorpo com antígeno e,
em seguida, adiciona-se 1 gota de hemácias a cada orifício da placa.
Após incubação de 30 minutos, faz-se a leitura: nos orifícios onde existem anticorpos em
quantidade suficiente para se combinar com a hemaglutinina viral, observa-se a inibição da hemaglutinação,
evidenciada pela sedimentação das hemácias, formando um botão fechado; nos orifícios onde não existem
anticorpos, as hemácias serão hemaglutinadas, sedimentando em forma de um aglomerado irregular.
O título do soro é a reciproca da maior diluição do mesmo, capaz de inibir completamente a
hemaglutinação.
1. As placas, preparadas para a aula, já estão com os soros diluídos na base 2, e com 4 unidades
hemaglutinantes de vírus.
2. Adicionar 1 gota de hemácias a cada orifício da placa. Agitar suavemente. Incubar por 30 minutos. Fazer
a leitura e anotar no protocolo.
Reação de Hemaglutinação
Data: ___/___/___
Hemácias: galinha a 1%
Diluente: solução fisiológica
Vírus: Newcastle
1/
2
1/
4
8
16
32
64 128 256 512
1/ 1/
1/
1/ 1/
1/
1/
CH
CH
*CH = controle de hemácias
Reação de Inibição da Hemaglutinação
Data: ___/___/___
Hemácias: galinha a 1%
Diluente: solução fisiológica
Soros: A – soro de fase aguda
Vírus: Newcastle
1/
2
1/
4
C – soro de fase convalescente
1/
8
1/
16
1/
32
1/
64
A
C
* CH = controle de hemácias
1/
128
1/
256
1/
512
CH
CH