Silvia Aparecida Ramos

UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIEDEMATOGÊNICA E
ANTINOCICEPTIVA DE DERIVADOS PIRAZOLÍNICOS
SILVIA APARECIDA RAMOS
Itajaí - 2012
UNIVERSIDADE DO VALE DO ITAJAÍ
PROGRAMA DE MESTRADO ACADÊMICO EM CIÊNCIAS
FARMACÊUTICAS
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E
SUBSTÂNCIAS SINTÉTICAS BIOATIVAS
SILVIA APARECIDA RAMOS
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIEDEMATOGÊNICA E
ANTINOCICEPTIVA DE DERIVADOS PIRAZOLÍNICOS
Dissertação apresentada à Universidade
do
Vale
do
Itajaí
como
parte
dos
requisitos parcial, para a obtenção do
grau
de
Mestre
em
Ciências
Farmacêuticas.
Orientador: Prof. Dra. Márcia Maria de
Souza
Co-orientadora: Prof. Dra. Fátima de
Campos Buzzi
Itajaí, Fevereiro de 2012.
DEDICATÓRIA
Por tudo o que a vida tem nos proporcionado.
Momentos bons e ruíns.
Pela amizade, cumplicidade e paciência.
Pela nossa história.
Dedico este trabalho ao meu irmão
Mário Nicanor Ramos.
AGRADECIMENTOS
Em primeiro lugar agradeço a Deus, pela força e vontade de continuar nos
momentos difíceis.
Aos meus “nove” irmãos e toda a minha família que me suportaram, pois eles
passaram todo este tempo escutando eu falar de um único assunto “Mestrado”. E as
minhas sobrinhas maravilhosas Thiana e Jéssica, minha cunhada Tati, que me
ajudaram a fotografar os animais.
Aos meus colegas de trabalho da UNIVILLE, Dalva Tomaz, Profa Roseneide,
Profa Carmen, Profa Bianca, Profa Vivia, que sempre me apoiaram a ir em frente e
me apresentaram a docência.
Aos professores do Programa de Mestrado em Ciências Farmacêuticas, que
contribuíram infinitamente para o meu amadurecimento. Vocês participaram de uma
etapa muito importante da minha vida. Em especial, muito obrigado à Professora
Nara, que sempre me ajudou quando precisei.
Agradeço à Maria Angélica, pelo abraço aconchegante quando eu chegava,
pelas palavras de apoio sempre bem vindas. Maggie você fez falta!!!
As minhas amiguinhas, Lilian, Liliane, Claudia, Gislaine e Nicole, pelo
companheirismo, pela ajuda com os experimentos, vocês foram muito importantes.
Sem você Nicole, este trabalho não teria sido realizado, você sabe disso né amiga!
À professora e coordenadora do Programa de Mestrado em Ciências
Farmacêuticas Tânia Mari Bellé Bresolin.
Aos meninos do biotério, que sempre me ajudaram com os animais.
Às minhas queridas Orientadoras pela confiança nas minhas idéias, pelo
respeito as minhas opiniões, pelo companheirismo e principalmente por confiar no
meu potencial. Professora Márcia e Fátima, eu admiro muito vocês!!! Obrigado por
tudo.
Agradeço a Lorena pelo desenvolvimento dos compostos e pela confiança na
utilização dos mesmos.
Pai e mãe, apesar de vocês não estarem mais entre nós, tenho certeza que
este seria um momento de muito orgulho. Tenho certeza que em todos os momentos
difíceis que eu passei durante este período, vocês estiveram ao meu lado. E tenho
certeza que de algum lugar vocês estão me aplaudindo. Obrigado, afinal de contas
sem o amor de vocês eu não teria nascido.
Aos meus queridíssimos, ratos e camundongos, sem eles este trabalho não
existiria. Não foi fácil sacrificar os ratos, depois de quase 30 dias de convivência.
E por fim, agradeço aqueles que me deram amor e foram verdadeiros...
EPÍGRAFE
Minha luta
Lutar é viver sensações de chegada
É iniciar cada dia uma jornada
É subir ao pódio dos recomeços
É silenciar os gritos e transpor defeitos
É clarear o dia da vida que quer recomeçar
É brigar com o sono, odiar o travesseiro
Lutar é persistir no rumo escolhido
É brigar contra vontades,
vontades, vencendo as próprias
Lutar é não levantar em vão
É encarar o leão nosso de cada dia
É sobreviver de espaços
É saber amanhecer a vida
É dominar o sonho de ser vencedor
Assim é ser, é assim que sou
Assim nasci assim é lutar.
Por, Nico Ramos.
AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIEDEMATOGÊNICA E
ANTINOCICEPTIVA DE DERIVADOS PIRAZOLÍNICOS
Silvia Aparecida Ramos
Fevereiro /2012
Orientador: Profa. Dra. Márcia Maria de Souza.
Co-Orientadora: Profa. Dra. Fátima de Campos Buzzi.
Área de Concentração: Produtos Naturais e Substâncias Sintéticas Bioativas.
Número de páginas: 147.
Os análogos pirazolínicos possuem importante participação no repertório de
fármacos utilizados para o tratamento de diversas patologias. Um fármaco muito
conhecido deste grupo é a Dipirona, porém, o seu uso tem sido questionado quanto
à possibilidade do mesmo em induzir distúrbios hematológicos, como a
agranulocitose. O presente estudo teve como objetivo fazer um screening de uma
série de compostos pirazolínicos substituídos segundo modelo de Topliss, em
modelos de dor aguda induzida pelo ácido acético (0,6%), hiperalgesia e edema de
pata induzidos pela ʎ-carragenina (Cg 300 µg/pata). O composto 3,5-bis(4clorofenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1H-pirazolina (C61) foi o que apresentou o melhor perfil
antinociceptivo e dessa forma foi avaliado quanto ao seu efeito antiedematogênico
induzido por substância P (SP, 30nmol/pata), histamina (HIS, 100 µg/pata),
bradicinina (BK, 3nmoL/pata) e prostaglandina E2 (PGE2, 3nmol/pata) no modelo do
edema de pata. O efeito antinociceptivo foi avaliado no modelo de hiperalgesia
induzida pela PGE2 (0,1nmol/pata), Lipopolissacarídeo (LPS 100 ng/pata), BK (500
ng/pata) e adjuvante completo de Freund (CFA 20 µg/pata). Além disso, o composto
foi avaliado no modelo de artrite induzida pelo CFA. Foram avaliados os possíveis
efeitos tóxicos do composto sobre as células sanguíneas da medula óssea e sangue
periférico, a função hepática e renal, temperatura retal e a atividade motora pelo
teste de campo aberto. Nos experimentos foram utilizados camundongos Swiss
machos ou fêmeas (20-35g) e ratos machos Wistar (250 - 380g), dependendo do
protocolo experimental adotado. Os animais foram divididos em grupos distintos
denominados controle negativo/veículo, controle positivo/fármaco referência e C61,
os quais receberam os tratamentos por via intraperitoneal (i.p.). O C61 foi capaz de
inibir de maneira significativa o edema de pata induzido pela HIS (30 ± 4% 0,3
mg/Kg), PGE2 (40 ± 4%, 3 mg/Kg), SP (28 ± 6%, 3 mg/Kg), BK (50 ± 2%, 1 mg/Kg),
além disso, o C61 também demonstrou expressiva redução da hiperalgesia
mecânica induzida pelo CFA (84 ± 6%, 3 mg/Kg), PGE2, (73 ± 10%, 3 mg/Kg), LPS
(58 ± 5%, 0,3 mg/Kg) e BK (64 ± 5%, 1 mg/Kg). No modelo de artrite induzido pelo
CFA os resultados demonstraram inibição siginificativa na hiperalgesia mecânica (52
± 8%, 0,3 mg/Kg) bem como no edema de pata (37 ± 4%, 1 mg/Kg). Além disso, o
tratamento crônico dos animais no modelo de artrite induzido pelo CFA, não
apresentou alterações significativas nos parâmetros hematológicos e bioquímicos. O
tratamento com o C61 também não interferiu na atividade motora e temperatura
corporal dos animais, nas condições experimentais avaliadas. Entretanto para
elucidar os possíveis mecanismos de ação do C61, bem como a sua segurança
terapêutica, outros experimentos devem ser realizados.
Palavras chave: Pirazolina, dor inflamatória, hiperalgesia.
EVALUATION OF THE ANTIEDEMATOGENIC AND
ANTINOCICEPTIVE ACTIVITY OF PYRAZOLINE DERIVATIVES
Silvia Aparecida Ramos
February /2012
Supervisor: Prof. Dr. Márcia Maria de Souza.
Co-Supervisor: Prof. Dr. Fátima de Campos Buzzi.
Area of concentration: Natural products and Bioactive and Synthetic Substances.
Number of pages: 147.
Pyrazoline analogs have extensive involvement in the repertoire of drugs used to
treat various diseases. A well-known drug of this group is Dipyrone. However its use
has been questioned as to the possibility that it induces haematological disorders
such as agranulocytosis. This study screens a series of pyrazoline substitute
compounds according to the Topliss model, in models of acute pain induced by
acetic acid (0.6%), hyperalgesia and paw oedema induced by carrageenan-ʎ (Cg
300µg/paw).
The
compound
3,5-bis
(4-chlorophenyl)-1-phenyl-4,5-dihydro-1H-
pirazolin (C61) was the one that showed the best analgesic antinociceptive profile,
therefore it was evaluated for its antiedematogenic effect induced by substance P
(SP, 30nmol/paw), histamine (HIS, 100 mg/paw), bradykinin (bradykinin (BK,
3nmoL/paw), and prostaglandin E2 (PGE2, 3 nmoL/paw) in the model of paw edema.
The antinociceptive effect was evaluated in the model of hyperalgesia induced by
PGE2 (0.1 nmoL/paw), Lipopolysaccharide (LPS 100 ng/paw), BK (500 ng/paw), and
complete Freund´s adjuvant (CFA 20 µg/paw). Furthermore, the compound was
evaluated in the model of arthritis induced by CFA. The possible toxic effects of the
compound on blood cells from bone marrow and peripheral blood, the liver and
kidney function, rectal temperature and motor activity were evaluated by the open
field test. Male and female Swiss mice (20-35g) and male Wistar rats (250-380g)
were used, depending on the experimental protocol adopted. The animals were
divided into distinct groups named negative control/vehicle, positive control/reference
drug and C61, which received the treatments intraperitoneally (i.p.). C61 was capable
of significantly inhibiting the paw oedema induced by HIS (30 ± 4% 0,3 mg/Kg), PGE2
(40 ± 4%, 3 mg/Kg), SP (28 ± 6%, 3 mg/Kg), and BK (50 ± 2%, 1mg/Kg), also, C61
also showed a significant reduction in mechanical hyperalgesia induced by CFA (84 ±
6%, 3 mg/Kg), PGE2 (73 ± 10%, 3 mg/Kg), LPS (58 ± 5%, 0,3 mg/Kg) and BK (64 ±
5%, 1 mg/Kg). In the model of arthritis induced by CFA, the results demonstrated a
significant inhibition in mechanical hyperalgesia (52 ± 8%, 0.3 mg/Kg) and in the paw
oedema (37 ± 4%, 1 mg/Kg). In addition, chronic treatment of animals in the model of
arthritis induced by CFA showed no significant changes in the hematological and
biochemical parameters. Treatment with C61 also did not interfere in motor activity or
body temperature of the animals, under the experimental conditions evaluated.
However, to elucidate the possible mechanisms of action of C61, as well as it’s
therapeutic safety, further experimental models are necessary.
Keywords: Pyrazoline, inflammatory pain, hyperalgesia.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Uma visão esquemática dos principais circuitos da dor nociceptiva...........27
Figura 2. Diferentes nociceptores detectam diferentes tipos de dor..........................30
Figura 3. Dor Nociceptiva...........................................................................................33
Figura 4. Vias de sinalização e transmissão da dor inflamatória...............................34
Figura 5. Migração dos leucócitos..............................................................................40
Figura 6. Escada Analgésica......................................................................................47
Figura 7. Esquema geral da reação das 1,3,5-triaril-pirazolinas................................55
Figura 8. Procedimento de coleta da medula óssea dos ratos utilizados no modelo
de artrite induzida pelo CFA. Fonte: Ramos, 2011....................................................64
Figura 9. Efeito das 1,3,5-triaril-pirazolinas sobre a contorção abdominal induzida
pela administração i.p. de ácido acético 0,6% em camundongos..............................69
Figura 10. Efeito da 5-(4-clorofenil)-1,3-difenil-4,5-dihidro-1H-pirazolina (C58), sobre
o edema de pata induzido pela administração i.pl. de ʎ-carragenina em
camundongos.............................................................................................................70
Figura 11. Efeito da 5-(4-clorofenil)-3-(4-metilfenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1H-pirazolina
(C60), sobre o edema de pata induzido pela administração intraplantar de ʎcarragenina em camundongos...................................................................................71
Figura 12. Efeito da 3,5-bis(4-clorofenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1H-pirazolina (C61), sobre
o edema de pata induzido pela administração intraplantar de ʎ-carragenina em
camundongos.............................................................................................................72
Figura 13. Efeito da 5-(4-clorofenil)-3-(4-metoxifenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1H-pirazolina
(C62), sobre o edema de pata induzido pela administração intraplantar de ʎcarragenina em camundongos...................................................................................73
Figura
14.
Efeito
da
5-(4-clorofenil)-3-(3,4-diclorofenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1H-
pirazolina (C66), sobre o edema de pata induzido pela administração intraplantar de
ʎ-carragenina em camundongos................................................................................74
Figura 15. Efeito da 5-(4-clorofenil)-1,3-difenil-4,5-dihidro-1H-pirazolina (C58), sobre
a
hiperalgesia
induzida
pela
administração
i.pl.
de
ʎ-carragenina
em
camundongos.............................................................................................................75
Figura 16. Efeito da 5-(4-clorofenil)-3-(4-metilfenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1H-pirazolina
(C60), sobre a hiperalgesia induzida pela administração i.pl. de ʎ-carragenina em
camundongos.............................................................................................................76
Figura 17. Efeito da 3,5-bis(4-clorofenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1H-pirazolina (C61), sobre
a
hiperalgesia
induzida
pela
administração
i.pl.
de
ʎ-carragenina
em
camundongos.............................................................................................................77
Figura 18. Efeito da 5-(4-clorofenil)-3-(4-metoxifenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1H-pirazolina
(C62), sobre a hiperalgesia induzida pela administração i.pl. de ʎ-carragenina em
camundongos.............................................................................................................78
Figura
19.
Efeito
da
5-(4-clorofenil)-3-(3,4-diclorofenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1H-
pirazolina (C66), sobre a hiperalgesia induzida pela administração i.pl. de ʎcarragenina em camundongos...................................................................................79
Figura 20. Efeito da 3,5-bis(4-clorofenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1H-pirazolina (C61) sobre
o edema de pata induzido pela administração i.pl. de BK em camundongos............81
Figura 21. Efeito da 3,5-bis(4-clorofenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1H-pirazolina (C61) sobre
o edema de pata induzido pela administração i.pl. de HIS em camundongos..........82
Figura 22. Efeito da 3,5-bis(4-clorofenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1H-pirazolina (C61) sobre
o edema de pata induzido pela administração i.pl. de PGE2 em camundongos.......83
Figura 23. Efeito da 3,5-bis(4-clorofenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1H-pirazolina (C61) sobre
o edema de pata induzido pela administração i.pl. de SP em camundongos............84
Figura 24. Efeito da 3,5-bis(4-clorofenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1H-pirazolina (C61) sobre
a hiperalgesia induzida pela administração i.pl. de BK em camundongos................85
Figura 25. Efeito da 3,5-bis(4-clorofenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1H-pirazolina (C61) sobre
a hiperalgesia induzida pela administração i.pl. de PGE2 em camundongos............86
Figura 26. Efeito da 3,5-bis(4-clorofenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1H-pirazolina (C61) sobre
a hiperalgesia induzida pela administração i.pl. de LPS em camundongos...............87
Figura 27. Efeito da 3,5-bis(4-clorofenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1H-pirazolina (C61) sobre
a hiperalgesia induzida pela administração i.pl. de CFA em camundongos..............88
Figura 28. Efeito da 3,5-bis(4-clorofenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1H-pirazolina (C61) sobre
o desenvolvimento da artrite (severidade) após a administração i.pl. de CFA
(100µL/pata) em ratos................................................................................................89
Figura 29. Efeito da 3,5-bis(4-clorofenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1H-pirazolina (C61) sobre
o desenvolvimento da artrite após a administração i.pl. de CFA (100µL/pata) em
ratos (Fotos) ..............................................................................................................90
Figura 30. Efeito da 3,5-bis(4-clorofenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1H-pirazolina (C61) sobre
o edema de pata induzido pela administração i.pl. de CFA (100µL/pata) em
ratos............................................................................................................................91
Figura 31. Efeito da 3,5-bis(4-clorofenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1H-pirazolina (C61) sobre
a intensidade de hiperalgesia induzida pela administração i.pl de CFA (100 µL/pata)
em ratos, ipsilateral (A e B) e contralateral (C e D)...................................................92
Figura 32. Efeito do tratamento crônico da 3,5-bis(4-clorofenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1Hpirazolina (C61) sobre as células sanguíneas............................................................94
Figura 33. Efeito do tratamento crônico da 3,5-bis(4-clorofenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1Hpirazolina (C61) sobre o peso dos órgãos e peso corporal........................................96
Figura 34. Efeito da 3,5-bis(4-clorofenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1H-pirazolina (C61) sobre
a atividade motora em camundongos........................................................................97
Figura 35. Efeito da 3,5-bis(4-clorofenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1H-pirazolina (C61) sobre
a temperatura corporal em camundongos..................................................................98
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Previsão teórica da solubilidade e permeabilidade das 1,3,5-triaril-2pirazolinas segundo a “Regra dos 5” de Lipinsk........................................................56
Tabela 2. Ordem de potência para diversos parâmetros físico-químicos proposta por
Topliss........................................................................................................................57
Tabela 3. Resultados das DI50 e % de inibição dos derivados pirazolínicos..............80
Tabela 4. Efeito das doses do C61 sobre a função renal e hepática.........................95
LISTA DE ABREVIATURAS
5-HT – Serotonina
AAS - Ácido acetil salicícilo
Aβ – A-Beta
ACE - Acetaminofeno
Aδ – A-delta
ALT - Alanina amino transferase
AMPc – Adenosina monofosfato cíclico
AINES - Anti-inflamatórios não esteroidais
ANOVA – Análise de variância
AR – Artrite Reumatóide
AST – Aspartato amino transferase
ATP – Adenosina tri-fosfato
AUC – Área sobre a curva
BK – Bradicinina
CFA – Adjuvant Completo de Freund
Cg – ʎ-carragenina
CGRP – Peptídeo relacionado ao gene da calcitonina
COX – ciclooxigenase
Dex - Dexametasona
DI50 – Dose inibitória 50%
Dip – Dipirona
EPM – Erro padrão da média
ERK - quinases reguladas por sinal extracelular (ERK1, ERK2)
Fenil – Fenilbutazona
G-CSF - Fator estimulador de colônia de granulócitos
GLU - glutamato
GM-CSF – Fator estimulador de colônia de granulócitos macrófagos
HIS – Histamina
HGB – hemoglobia
HTO – hematócrito
IASP - Associação Internacional de Estudos da Dor
ICAM-1 – Molécula intercelular de adesão
IκB – Proteínas inibidoras do κB
IΚΚs – Proteínas quinases IκB
IL - Interleucina
IL-1β – Interleucina – 1beta
IL-1R – receptor de IL-1
IM – Inibição máxima
Ind – Indometacina
iNOS – Óxido nítrico sintase induzida
I.p. – intraperitoneal
IP3 – Fosfotidilinositol
I.pl. – intraplantar
JNK - quinase c-Jun N-terminal
LT - Leucotrienos
LPS – Lipopolissacarídeo
MAPK – Proteínas quinases ativadas por mitógeno
M-CSF - Fator estimulador de colônia de macrófagos
MMPs - Metaloproteinases
NF-κB – Fator nuclear κB
NGF – Fator de crescimento do Nervo
NMDA- N-metil-D-Aspartato
NMR – Núcleo magno da rafe
NO – Óxido nítrico
NOS – Óxido nítrico sintase
nNOS – Óxido nítrico sintase neuronal
NOR - Noradrenalina
OMS – Organização Mundial da Saúde
PAF - Fator de agregação plaquetária
PAG – Substância cinzenta periaquedutal
PGs – Prostaglandinas
PGE2 – Prostaglandina E2
PM – peso molecular
PLT – plaquetas
PKA - Proteína quinase A
PKC – Proteína quinase C
RVM - medula rostroventromedial
s.c. - subcutânea
SI – Sistema Imune
SNC – Sistema Nervoso Central
SNP – Sistema Nervoso Periférico
SNS – Sistema Nervoso Simpático
SP – Substância P
TCAs – Antidepressivos tricíclicos
TTXr – Resistente à Tetrodotoxina
TTXs – Sensível à Tetrodotoxina
TLRs – Receptores do tipo Toll
TNF-α – Fator de necrose tumoral-α
TGF-beta1 – Fator transformador de crescimento Beta-1
VCAM1 – Moléculas de adesão celular vascular 1
v.o. – via oral
VHF – filamento de Von Frey
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 20
2 OBJETIVOS ........................................................................................................... 23
2.1 Objetivo Geral .......................................................................................... 23
2.2 Objetivos Específicos ............................................................................. 23
3 REVISÃO DA LITERATURA ................................................................................. 25
3.1 Dor: Características e processamento. ................................................. 25
3.2 Tipos de dor ............................................................................................. 32
3.3 Dor Inflamatória ....................................................................................... 34
3.4 Resposta Imune ....................................................................................... 37
3.5 Artrite Reumatóide .................................................................................. 41
3.5 Como proporcionar o alívio da dor e inflamação ................................. 44
3.6 Heterociclos: pirazol, pirazolinas e pirazolonas .................................. 50
4. MATERIAL E MÉTODOS ..................................................................................... 55
4.1 Obtenção das substâncias avaliadas .................................................... 55
4.1.1 Síntese dos derivados 1,3,5-triaril-pirazolínicos ......................................... 55
4.2 Métodos teóricos para avaliação da estrutura-atividade .................... 56
4.2.1 Regra dos cinco de Lipinski. ......................................................................... 56
4.2.2. Método de Topliss ......................................................................................... 57
4.3 Animais ..................................................................................................... 58
4.4 Reagentes................................................................................................. 58
4.5 Ensaios Farmacológicos ........................................................................ 59
4.5.1 Análise da Propriedade Antinociceptiva – Modelo de dor aguda. ............. 59
4.5.2 Análise da Propriedade Antinociceptiva – Modelo de dor persistente...... 59
4.5.3 Análise da Propriedade Antiedematogênica................................................ 60
4.5.4 Modelo de artrite induzida pelo CFA ............................................................ 61
4.5.6 Investigação de possíveis efeitos adversos e/ou colaterais ...................... 65
4.6 Análise Estatística ................................................................................... 66
5 RESULTADOS ....................................................................................................... 68
5.1 Efeitos dos derivados pirazolínicos sobre a nocicepção induzida pelo
ácido acético 0,6% em camundongos ......................................................... 68
5.2 Efeitos dos derivados pirazolínicos sobre o edema de pata induzido
pela ʎ-carragenina em camundongos ......................................................... 70
5.3 Efeitos dos derivados pirazolínicos sobre a hiperalgesia mecânica
induzida pela ʎ-carragenina em camundongos ......................................... 75
5.4 Efeitos do 3,5-bis(4-clorofenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1H-pirazolina (C61),
sobre o edema de pata induzido por diferentes agentes flogísticos em
camundongos ................................................................................................ 81
5.5 Efeitos do 3,5-bis(4-clorofenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1H-pirazolina (C61),
sobre
a hiperalgesia mecânica induzida por
diferentes
agentes
flogísticos em camundongos ....................................................................... 84
5.6 Efeitos da 3,5-bis(4-clorofenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1H-pirazolina (C61)
sobre o edema e hiperalgesia mecânica no modelo de artrite induzida
pelo Adjuvante Completo de Freund (CFA) ................................................ 88
5.7 Efeitos da 3,5-bis(4-clorofenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1H-pirazolina (C61)
sobre as células sanguíneas no tratamento crônico de artrite induzida
pelo Adjuvant Completo de Freund (CFA) .................................................. 93
5.8 Efeitos da 3,5-bis(4-clorofenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1H-pirazolina (C61)
sobre a função hepática, renal, peso corpóreo e peso de órgão após
tratamento crônico no modelo de artrite induzida pelo Adjuvant
Completo de Freund (CFA) ........................................................................... 95
5.9 Efeitos da 3,5-bis(4-clorofenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1H-pirazolina (C61)
sobre a deambulação em camundongos normais. .................................... 97
5.10 Efeitos da 3,5-bis(4-clorofenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1H-pirazolina (C61)
sobre a temperatura corporal em camundongos normais. ....................... 98
6 DISCUSSÃO .......................................................................................................... 99
7 CONCLUSÃO ...................................................................................................... 117
REFERÊNCIAS ....................................................................................................... 118
20
1 INTRODUÇÃO
Mesmo sendo um processo fisiológico de alerta para o indivíduo, a dor e a
inflamação ainda constitui, em muitos aspectos, o flagelo da humanidade (PORTH,
2004). Os processos inflamatório e doloroso ocorrem em resposta à lesão celular e
caracterizam-se por um fenômeno complexo, dinâmico e multimediado, os quais
podem ser desencadeados por vários tipos de agentes químicos, físicos ou
biológicos (CARVALHO; LEMÔNICA, 1998a).
De acordo com Celsus (30 a.c – 36 d.c), médico da antiguidade, a dor é um
dos sinais cardinais da inflamação, e por si só, também compreende um mecanismo
fisiológico designado a proteger o indivíduo (SCOTT et al., 2004; ZAMPONI et al.,
2009). Ao experimentar a sensação dolorosa, o indivíduo é alertado para uma lesão
real ou iminente, e a partir de então, aciona respostas adequadas de proteção
(JULIUS; BASBAUM, 2001). Para tal situação, o Sistema Nervoso Central (SNC) é
especializado em detectar e reagir ao estímulo externo. Cada espécie, de acordo
com sua evolução, tornou-se capaz de identificar e diferenciar um estímulo agressivo
de um estímulo inócuo (KRAYCHETE; CALASANS; VALENTE, 2006).
No entanto, nem sempre, a dor reflete um estado de defesa. Numerosas
condições fisiopatológicas, como diabetes, infecções virais, lesões no nervo, uso de
algumas classes medicamentosas e a inflamação propriamente dita, podem
provocar dor persistente e crônica. Este tipo de dor parece não servir a um propósito
de alerta e muitas vezes, é refratária aos tratamentos convencionais (PORRECA;
OSSIPOV; GEBHART, 2002; ZAMPONI et al., 2009).
A dor é, sem dúvida, o principal sintoma que motiva os pacientes a
procurarem atendimento médico. Alguns exemplos comuns da procura clínica
incluem: dor nas costas, dor lombar, cefaleia, processo doloroso secundário a
trauma agudo. No caso de pacientes com artrite reumatoide (AR), os mesmos
queixam-se mais da dor do que da própria perda da função. Tanto a dor aguda
quanto a crônica constitui um problema de saúde pública de alta prevalência na
sociedade, o que gera altos custos, diretos e indiretos, pois, acarretam em perda
substancial da produtividade (LEVINE; TAIWO, 1990; PAYNE, 1997; GUILLOT et al.,
2011).
21
O desenvolvimento de áreas da ciência como biologia molecular, genética,
imuno-histoquímica, histologia e neuroimagem, contribuíram muito nos últimos anos,
na descoberta de mecanismos moleculares envolvidos na neurobiologia da dor.
Consequentemente, esta evolução tem favorecido a Indústria Farmacêutica no
desenvolvimento de analgésicos mais modernos (BROOKS; TRACEY, 2005).
Esse grande avanço na farmacologia do processo doloroso reflete os
recentes conhecimentos e identificação de importantes alvos envolvidos na
transmissão nociceptiva, bem como na plasticidade neuronal. Dentre eles,
encontram-se os receptores, canais iônicos, neuromoduladores, fatores de
transcrição, que atuam em nociceptores periféricos, medula espinhal, tálamo e
córtex cerebral, onde a sensação é percebida (CARVALHO; LEMONICA, 1998b;
STUCKY; GOLD; ZHANG, 2001; WOOLF; MAX, 2001; BROOKS; TRACEY, 2005).
Considerando as opções de tratamento farmacológico para as desordens
inflamatórias e dolorosas, ainda são descritos muitos efeitos adversos, colaterais ou
não, que inviabilizam o tratamento, principalmente quando este é prolongado. Há
então, a necessidade de constante manejo no tratamento das enfermidades de
cunho doloroso, pois, muitas vezes, ocorre falta de adesão à terapêutica, em função
de tais efeitos (PIETROVSKI et al.,2008). Diante destes fatos, continua sendo
constante e necessária a investigação e busca de novos fármacos, ou então,
modificações estruturais em moléculas clássicas, que melhorem a sua relação
estrutura - atividade, diminuindo os efeitos adversos e aumentando os seus efeitos
farmacológicos desejados (ZHANG et al., 2009a).
Vários trabalhos na literatura descrevem os efeitos farmacológicos de
compostos heterociclos, em especial os que possuem um núcleo pirazol. Uma
revisão feita por Rahman e Siddqui (2010), relata diversos estudos decorrentes da
síntese e avaliação da atividade farmacológica de derivados pirazolínicos. Algumas
das propriedades demonstradas nos estudos foram: efeito antiepilético (SINGH et
al., 1974; KUCUKGUZEL et al., 2000), antidepressivo (PRASAD et al., 2005), antiinflamatório (BARSOUM; GIRGIS, 2008), antimicrobiano (OZDEMIR et al., 2007),
antitumoral (MANNA et al., 2005), antiamoébica (BUDAKOTI; ABID; AZAM, 2007),
antinociceptiva (GODOY et al., 2004), inseticida (SILVER; SODERLUND, 2005),
hipotensiva (TURAN-ZITOUNI et al., 2000), antioxidante (BABU et al., 2008), entre
outros.
22
Nesse aspecto, considerando que os núcleos pirazolínicos constituem um
importante grupo de moléculas com efeitos terapêuticos, e visando a necessidade
da busca de novas moléculas como candidatos a fármacos para a terapêutica da dor
e inflamação, o presente trabalho aborda a relação estrutura atividade de derivados
pirazolínicos, avaliando sua ação antiedematogênia e antinociceptiva, e também a
influência destas moléculas sobre alguns parâmetros que apontam toxicidade.
23
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Estudar a atividade antiedematogênica e antihiperalgésica dos derivados
pirazolínicos, em modelos experimentais de inflamação e dor, bem como, avaliar
possíveis efeitos adversos.
2.2 Objetivos Específicos
Analisar o efeito antiedematogênico e antinociceptivo de derivados pirazolínicos
através dos modelos de nocicepção induzida pelo ácido acético, edema de pata e
hiperalgesia mecânica induzidos pela ʎ-carragenina, em camundongos e escolher o
composto mais ativo para estudos posteriores de dor e inflamação;
Avaliar o efeito antiedematogênico do composto, escolhido no modelo de edema
de pata induzido por BK, HIS, PGE2 e SP, em camundongos;
Avaliar o efeito anti-hiperalgésico, do composto, por meio do modelo de
hiperalgesia mecânica induzida por diferentes agentes flogísticos (BK, PGE2, LPS e
CFA) em camundongos;
Avaliar a atividade antidematogênica e anti-hiperalgésica do composto no modelo
de artrite induzida pelo CFA em ratos;
Avaliar macroscopicamente os efeitos do composto sobre o índice de severidade
de instalação de artrite induzida pelo CFA em ratos;
Investigar o efeito da administração crônica do composto sobre as células da
medula óssea e sangue periférico nos animais submetidos ao modelo de artrite
induzido pelo CFA;
Investigar o efeito da administração crônica do composto, sobre a função renal e
hepática nos animais submetidos ao modelo de artrite induzido pelo CFA;
Investigar o efeito do composto sobre o peso corporal e de alguns órgãos, além da
temperatura corporal, verificando a existência de um possível efeito tóxico nos
animais submetidos ao modelo de artrite induzido pelo CFA;
Verificar se o composto em estudo possui efeito sobre a atividade locomotora dos
animais por meio do modelo de campo aberto, em camundongos;
24
Comparar os efeitos obtidos do composto mais ativo com fármacos utilizados no
tratamento clínico da dor e inflamação;
25
3 REVISÃO DA LITERATURA
3.1 Dor: Características e processamento.
A capacidade de detectar estímulos nocivos é essencial para a sobrevivência
e bem estar do indivíduo e encontra-se presente na maioria das espécies,
assumindo um alto grau evolutivo na espécie humana. Entretanto, algumas pessoas
sofrem de anomalias genéticas e/ou congênitas que as impede de executar este
simples reflexo de sobrevivência, ou seja, se tornam incapazes de detectar os
estímulos dolorosos (COX et al., 2006).
Os pacientes portadores dessas deficiências congênitas, não desenvolvem a
resposta fisiológica protetora induzida pelo processo doloroso. Obviamente este tipo
de situação pode levar a lesões extensas de uma determinada área, que, em muitos
casos pode causar mutilação ou ainda ser fatal. Diante desse fato, pode-se aferir
então, que a capacidade de detectar um estímulo nocivo desencadeado pela dor é
essencial para a sobrevivência do indivíduo (WOOLF; COSTIGAN, 1999; BASBAUM
et al., 2009).
A sensação “dolorosa” se refere a um conjunto de fatores que envolvem a
percepção do processo nociceptivo associada ao componente afetivo (DAMME et
al., 2010). Desta maneira, a Associação Internacional de Estudos da Dor (IASP)
definui a dor como: “Uma sensação ou experiência emocional desagradável,
associada com dano tecidual real ou potencial, ou descrita nos termos de tal lesão”
(LOSER; MELZACK, 1999; WILHELM et al., 2009). Esta definição é baseada no
conceito de dor como uma percepção e não somente como uma modalidade
puramente sensorial, e leva em conta o fato para que a dor seja conscientemente
experimentada, é necessário o processamento cognitivo (MORIARTY; McGUIRE;
FINN, 2011).
Nocicepção, no entanto, é o processo pelo qual estímulos nocivos são
detectados por uma subpopulação de fibras nervosas periféricas especializadas,
denominadas de nociceptores (BASBAUM et al., 2009). Não se deve confundir os
termos “Nocicepção” e “Dor”, pois, uma pode ocorrer sem a outra. Por exemplo,
após uma anestesia local do nervo mandibular para procedimentos odontológicos,
há nocicepção periférica sem haver a dor, enquanto em um paciente com dor
26
talâmica há dor sem nocicepção periférica. Logo, a nocicepção é uma sensação,
como o tato, a audição, a visão, enquanto a dor é a percepção desta sensação
(LOESER; TREEDE, 2008).
Há mais de um século, o fisiologista britânico Charles Scott Sherrington
(1906), propôs o conceito-chave de nocicepção. Sherrington descreveu a existência
de terminações nervosas livres na pele, responsáveis pela resposta nociceptiva
reflexa. Além disso, apontou como nociceptor, o neurônio sensorial primário, que é
ativado por estímulos capazes de desenvolver lesões (WOOLF; MA, 2007;
OMOIGUI, 2007).
De acordo com esta descrição, os nociceptores têm características
particulares, como limites e sensibilidade que os distinguem de outras fibras
sensoriais (JULIUS; BASBAUM, 2001). Os nociceptores são excitados somente
quando um estímulo intenso alcança o seu limiar, sugerindo que os mesmos
possuem propriedades biofísicas e moleculares capazes de detectar e responder
seletivamente a danos potenciais (BASBAUM et al., 2009).
A ativação dos nociceptores pode ter origem em estímulos de natureza
química, mecânica ou térmica, e a percepção de como será este estímulo (se
doloroso ou não) não é propriedade absoluta do mesmo. Ou seja, alguns dos
estímulos citados podem parecer mais agressivos do que realmente são, da mesma
maneira um estímulo totalmente inócuo, como um simples sopro, pode ser percebido
como potencialmente doloroso, a estes fenômenos denomina-se hiperalgesia e
alodinia, respectivamente (LARSSON, 2009).
Hiperalgesia é um termo psicofísico, que atualmente é proposto para designar
todas as condições de sensibilidade dolorosa aumentada. Dessa forma, a definição
de hiperalgesia está em paralelo com aquela do termo fisiológico “sensibilização”. A
hiperalgesia, geralmente ocorre em processos inflamatórios agudos ou crônicos
passando a ser um dos sintomas em processos dolorosos como a dor neuropática
(IRWIN, 2011).
Após a lesão cutânea, a hiperalgesia pode ser dividida em dois fenômenos: a
hiperalgesia primária, que ocorre no local da lesão e é caracterizada em resposta a
estímulos mecânicos e calor, e hiperalgesia secundária, que ocorre distante do local
da lesão, e é caracterizada por estímulos mecânicos. Um exemplo que se
assemelha a este tipo de hiperalgesia é a dor neuropática e a dor referida (TREEDE
et al., 1992).
27
A sensibilização dos nociceptores é o denominador comum de todos os tipos
de dor inflamatória (CUNHA et al., 1999). A hiperalgesia inflamatória é a
consequência da sensibilização dos neurônios aferentes primários, em particular as
fibras C polimodais de alto limiar. As mudanças em ambos os sítios, tecido inflamado
e sistema nervoso, são resultantes da diminuição do limiar nociceptivo, induzido por
mediadores inflamatórios, os quais possuem a capacidade de sensibilizar
diretamente o neurônio nociceptivo periférico (WOOLF et al., 1997; CUNHA et al.,
2008; PARANOS et al., 2011).
Quando os nociceptores são ativados por algum tipo específico de estímulo,
esta sensação é transmitida por vias aferentes até o gânglio da raiz dorsal (Figura 1)
(RITTNER; BRACK; STEIN, 2008). Esses neurônios então fazem sinapses com os
neurônios de segunda ordem na superfície do corno dorsal da medula espinhal.
Neste processo o corno dorsal age como filtro de informações dos sinais periféricos
antes de enviá-los a sítios supraespinhais, como o tálamo, córtex somatosensorial,
córtex insular e córtex cingular, onde as informações transmitidas serão processadas
no contexto nociceptivo (SCHMIDTKO; TEGEDER; GEISSLINGER, 2009).
Figura 1. Uma visão esquemática dos principais circuitos da dor nociceptiva. A
ativação da terminação nervosa periférica por um estímulo nocivo leva à geração de
potenciais de ação que são conduzidos até o corno dorsal da medula espinhal. A
neurotransmissão no corno dorsal transmite o sinal a neurônios do SNC, que enviam o sinal
ao cérebro. Esse circuito está sujeito a modulação pelo controle descendente (Esquema
adaptado de KUNER, 2010).
28
A transmissão da dor ocorre através de uma série de eventos finamente
regulados por neurônios, interneurônios, mediadores químicos, mecanismos
periféricos e centrais que modulam o processo nociceptivo de maneira complexa, e
ainda não estão totalmente esclarecidos (SCHMIDTKO; TEGEDER; GEISSLINGER,
2009).
O processo nociceptivo envolve, de maneira resumida, o estímulo inicial
gerando ativação dos nociceptores, a transmissão, a modulação e percepção do
estímulo (SERPELL; MAKIN; HARVEY, 1998; WU; ZHUO, 2009). Desta forma podese visualizar a medula espinhal como uma espécie de interlocutor ou uma estação
intermediária entre o estímulo agressor e o cérebro, formada por uma complexa
estrutura
com
grande
variedade
de
células
nervosas,
neuropeptídeos
e
neurotransmissores (CARVALHO; LEMÔNICA, 1998b).
Os neurônios que tem suas projeções no interior das lâminas I e V são as
principais saídas do corno dorsal da medula em direção ao cérebro, com a origem
de múltiplas vias ascendentes incluindo o trato espinotalâmico e o trato
espinoreticulotalâmico, que levam a mensagem dolorosa para o tálamo e para o
cérebro respectivamente (BASBAUM et al., 2009).
Os corpos celulares dos nociceptores que inervam o tronco, membros e
vísceras, estão localizados no gânglio da raíz dorsal, e os que inervam a face e
crânio localizam-se no gânglio do nervo trigêmio (BASBAUM et al., 2009). Os corpos
celulares dos neurônios que dão origem as fibras sensoriais de maior diâmetro são
chamadas de fibras A Beta (Aβ). Estas fibras são mielinizadas e de condução
rápida, onde a presença ou não da bainha de mielina interfere na condutibilidade da
fibra em questão e consequentemente na velocidade da transmissão do estímulo
doloroso (MILLAN, 1999). A maioria destas fibras Aβ, mas nem todas, detectam
estímulos inócuos aplicados na pele, músculos e articulações, e, portanto não
contribuem para o processo doloroso. (JULIUS; BASBAUM, 2001).
Uma teoria de grande importância na compreensão da transdução e
transmissão do estímulo nociceptivo é a teoria das comportas, “Controle de Portão
para a Dor” proposta por Melzack e Wall em 1965. Foi proposto que alguns
neurônios teriam a capacidade de suprimir a transmissão do sinal doloroso no corno
dorsal da medula, fechando assim uma espécie de portão hipotético, e inibindo a
passagem do impulso doloroso (MELZACK; WALL, 1965).
29
Os neurônios responsáveis pelo mecanismo de “fechar o portão” incluem as
fibras nervosas ascendentes de maior calibre (fibras Aβ), estimuladas por estímulos
cutâneos táteis indolores, e o sistema descendente inibitório da dor, constituído por
fibras originárias de neurônios da substância cinzenta periaquedutal (PAG) do
mesencéfalo e do núcleo magno da rafe (NMR) (MELZACK; WALL, 1965; MELZAK,
1999). Essas fibras estimulam as células da lâmina II do corno dorsal da medula
(substância gelatinosa), que consistem, principalmente, de interneurônios inibitórios
curtos, que se projetam para as lâminas I e V, regulando a transmissão da via
nociceptiva. Essa teoria explica que nem toda dor está associada a um estímulo
lesivo e que estímulos nocivos podem não causar dor (MELZACK; WALL, 1965;
LOSER; TREEDE, 2008).
Os aferentes nociceptivos primários incluem outros dois tipos de fibras, que
são as mais importantes (Figura 2): as fibras C e A-delta (Aδ). Como descrito
anteriormente, os corpos celulares destas fibras também estão localizados no
gânglio da raíz dorsal, e seus axônios podem ser mielinizados, de diâmetros finos,
ou não mielinizados (DRAY, 1995).
As fibras Aδ possuem diâmetro pequeno, são mielinizadas, e conduzem o
estímulo doloroso de maneira rápida. O tipo de dor conduzido por esta fibra é
característico da dor aguda, bem localizada. As fibras Aδ podem ser ativadas por
estímulos mecânicos, térmicos e às vezes químicos, por isso são chamadas de
polimodais. Este conjunto de fibras pode ser dividido em duas classes, tipo I que
responde a ambos os estímulos mecânicos e químicos e com alto limiar para
estímulos térmicos (>50°C), e o tipo II apresentando limiares para estímulo quente
menor (43°C), porém, um limiar mecânico muito alto. Essas fibras apresentam
terminações em todo o corno dorsal, mas terminam predominantemente na lâmina I
e mais profundamente na lâmina V (RICE; JUSTINS, 1999).
As fibras C nociceptivas são fibras não-mielinizadas, de diâmetro pequeno, e
de condução lenta. Neste caso, o tipo de dor conduzido é vaga e em queimação.
Podem apresentar-se como fibras C peptidérgicas, expressando neuropeptídeos
como a SP e o peptídeo relacionado ao gene da calcitonina (CGRP), e fibras C nãopeptidérgicas. Essas fibras também são chamadas de polimodais por responderem a
diversos tipos de estímulos, além dos dolorosos. Sua distribuição no corno dorsal da
medula espinhal contempla principalmente as lâminas I e II (CARVALHO;
LEMÔNICA, 1998b; LARSSON, 2009).
30
Figura 2. Diferentes nociceptores detectam diferentes tipos de dor. A. Nervos
periféricos incluem fibras mielinizadas aferentes de pequeno diâmetro (Aδ) e de médio a
grande diâmetro (Aα,β), bem como de pequeno diâmetro das fibras amielínicas aferentes
(C). B. O fato de que velocidade de condução está diretamente relacionada ao diâmetro da
fibra é destaque na gravação de um potencial de ação de um nervo periférico. A maioria dos
nociceptores são fibras Aδ ou C, e suas velocidades de condução são diferentes (12 a 30
m/s e de 0,5 a 2,0 m/s, respectivamente), de acordo com a primeira (rápida) e segunda
(lento) resposta de processo doloroso à lesão (Adaptado de BASBAUM; JULIUS, 2001).
Apesar da maioria dos nociceptores serem polimodais, a estimulação química
parece ser a mais comum e diversificada na geração de sinais em todos os tipos de
fibras. Alguns tipos de nociceptores denominados “silenciosos” (que pertencem ao
grande grupo das fibras C polimodais) têm sido identificados na pele e órgãos, e são
responsivos somente quando são sensibilizados por tecidos lesados, ou seja, são
irresponsivos mesmo com estímulo intenso, sem produção de lesão. Os
nociceptores silenciosos representam uma gama ampla das fibras aferentes
sensitivas, os quais contribuem para o fenômeno de sensibilização periférica (DRAY,
1995; JULIUS; BASBAUM, 2001).
Um dos mecanismos centrais de grande importância na fisiopatologia da dor é
o
da
transmissão
facilitada
no
corno
dorsal
da
medula
espinhal
e,
consequentemente, para as vias nociceptivas mais altas (CARVALHO; LEMÔNICA,
31
1998b). As lesões que se iniciam no sistema nervoso periférico (SNP) modificam a
anatomia e a fisiologia do SNC com hiperatividade celular, como um estímulo
inflamatório que provoca sensibilização periférica das fibras C nociceptivas. No
entanto, quando o estímulo torna-se repetitivo e prolongado, pode ocorrer um
fenômeno conhecido como Wind up, que é o resultado do somatório de potenciais
de ação pós-sinápticos lentos após estimulação aferente de baixa frequência (<5Hz)
repetida e por tempo prolongado, ocorre então aumento da condutividade de cálcio e
da resposta à dor (KRAYCHETE; CALASANS; VALENTE, 2006).
Este estímulo intermitente provoca a liberação de SP e glutamato (GLU). O
glutamato atua sobre os seus receptores do tipo N-metil-D-Aspartato (NMDA) na
medula espinhal, tornando o neurônio da medula espinhal ainda mais responsivo
aos estímulos. Ocorre então consequente elevação na frequência de descargas
espontâneas
destes
neurônios
e
exagerada
resposta
aos
estímulos
somatosensoriais, resultando na sensibilização central. A ativação de receptores
NMDA aumenta a resposta celular aos estímulos dolorosos e diminui a sensibilidade
neuronal a agonistas de receptores opioides (DICKENSON; SULLIVAN, 1987;
BENNETT, 2000).
Após a lesão no nervo, ocorrem alterações drásticas no sistema
somatosensorial, amplificando a experiência dolorosa e aumentando a sensibilidade
dos nociceptores aos estímulos periféricos. Logo, os estímulos que até então eram
inócuos ou de baixa intensidade, passam a ser dolorosos (FERRARI; BOGEN;
LEVINE, 2010). Quando os nociceptores são ativados por algum tipo de estímulo,
ocorre a ativação de vários canais iônicos. Neste caso os canais de sódio voltagemdependente e os canais de potássio, são fundamentais para a geração de potencial
de ação, os quais transmitem a informação dolorosa da periferia para o corno dorsal
da medula espinhal (BASBAUM, 2009).
Os canais de sódio voltagem-dependente são o principal tipo de canais
iônicos envolvidos na gênese da excitabilidade neuronal no SNC e SNP, e podem
ser classificados em dois grandes grupos: os sensíveis à tetrodotoxina (TTXs), que
estão presentes nas fibras Aδ, em todo sistema nervoso e no gânglio da raiz dorsal;
e os resistentes à tetrodotoxina (TTXr), que são encontrados especialmente nas
fibras C do gânglio da raiz dorsal. Os distúrbios que implicam em aumento da
hiperexcitabilidade ou aumento da sensibilidade à estimulação neuronal incluem a
dor (LAI et al., 2002; KRAFTE; BANNON, 2007).
32
As vias descendentes da dor se originam no tronco cerebral e outras
estruturas como hipotálamo, córtex, tálamo, NMR, PAG e estruturas adjacentes da
medula rostroventromedial (RVM), que exercem importante papel na integração e
modulação dos mensageiros nociceptivos no corno dorsal da medula espinhal
(OSSIPOV; DUSSOR; PORRECA, 2010). Os mecanismos descendentes modulam a
resposta nociceptiva por exercer suas ações em nociceptores presentes nas vias
aferentes primárias, bem como em neurônios intrínsecos do corno dorsal,
interneurônios excitatórios e inibitórios e neurônios de projeção (PORRECA;
OSSIPOV; GEBHART, 2002).
3.2 Tipos de dor
Existem várias maneiras de classificar a dor. Alguns dos critérios para a
classificação da dor podem ser de acordo com a duração, topografia, intensidade,
dentre outros. De acordo com os critérios temporais ela pode ser transitória, aguda
ou crônica (BRENNAN; CARR; COUSINS, 2007). Do ponto de vista fisiológico a dor
pode ser classificada como nociceptiva, inflamatória ou neuropática (SALTER,
2005).
Como dito anteriormente, a dor é uma experiência sensorial multidimensional,
intrinsicamente desagradável e se associa ao fato de ferir. Pode variar de
intensidade (leve, moderada ou grave), qualidade (aguda, afiada, ardor, maçante),
duração (transitória, intermitente ou persistente), localização (superficial, profunda,
localizada ou difusa), todas estas características são vinculadas a experiência
sensorial (WOOLF, 2004).
Outra forma de descrever os tipos de dor é essencialmente por duas grandes
categorias: adaptativa e mal-adaptativa. A dor adaptativa contribui para a
sobrevivência, protegendo os organismos de lesões ou promovendo a cura quando
a lesão ocorreu. A mal-adaptativa, ao contrário, é uma expressão do funcionamento
patológico do sistema nervoso, é a dor como doença (WOOLF, 2010).
No que se refere à dor aguda, caracteriza-se por ser de curta duração (alguns
segundos até poucos dias), sendo muitas vezes, decorrente de uma lesão tecidual,
com subsequente ativação de nociceptores, desaparecendo com a resolução do
processo que a originou (LOESER; MELZACK, 1999; MONTECUCCO; CAVAGNA;
CAPORALI, 2009).
33
A dor nociceptiva compreende a dor aguda, em outras palavras, é sistema
fisiológico de alerta rápido, com função protetora. Este sistema defensivo é essencial
para detectar e minimizar o contato com o estímulo nocivo. Essa é a dor que um
indivíduo sente ao tocar a ponta de uma agulha, o fogo ou o gelo, bater com um
martelo, ou queimar com um agente caústico (Figura 3) (WOOLF, 2004). A dor
nociceptiva detecta o agente específico (físico, químico ou térmico), que
possivelmente daria origem a uma lesão tecidual, por este motivo ela é chamada de
dor nociceptiva, e sem dúvidas é vital (WOOLF, 2010).
Mesmo a dor nociceptiva desempenhando o seu papel de alerta, a lesão
tecidual pode ocorrer, por exemplo, através de um trauma, cirurgia ou doença
inflamatória. Essas situações podem estimular mudanças na resposta nociceptiva,
visando promover a cura do tecido lesado. Neste momento a dor inflamatória se faz
presente (LOESER; TREEDE, 2008).
Figura 3. Dor nociceptiva. Estímulos nocivos são traduzidos em atividade elétrica nos
terminais periféricos de nociceptores por fibras amielínicas C e de fibras Aδ pouco
mielinizadas por receptores específicos ou canais iônicos sensíveis ao calor, e ao frio
(Adaptado de SCHOLZ; WOOLF, 2002).
34
3.3 Dor Inflamatória
Assim como a dor, a inflamação é uma resposta natural, que faz parte dos
mecanismos de defesa do ser humano. Na medida adequada é fisiológica e
essencial para a proteção contra agentes nocivos (LAUPATTARAKASEM et al.,
2003). É caracterizada pelos sinais cardinais da inflamação (calor, rubor, inchaço e
dor), primeiramente descritos por Celsus (30 a.c – 36 d.c) e aperfeiçoado por
Virchow, que descreveu a perda da função da área lesada, que sinalizam o início do
processo inflamatório (SCOTT et al., 2004).
Após a lesão tecidual por ação mecânica, infecção, isquemia, crescimento
tumoral ou processos autoimunes, múltiplos mediadores químicos são liberados no
local, além disso, ocorre o recrutamento de células inflamatórias. O resultado da
liberação dos mediadores forma a conhecida “sopa inflamatória”, rica em citocinas,
fatores de crescimento, cininas, purinas, aminas, prostanoides e íons incluindo
prótons (Figura 4) (SCHOLZ; WOOLF, 2002).
Figura 4. Vias de sinalização e transmissão da dor inflamatória. Os tecidos danificados,
as células inflamatórias ou tumores liberam mediadores químicos criando uma “sopa
inflamatória” que ativa ou modifica a propriedade de resposta do estímulo dos nociceptores
aferentes. Estes, por sua vez, estabelecem mudanças na capacidade de resposta dos
neurônios do SNC (Adaptado de SCHOLZ; WOOLF, 2002).
35
Alguns mediadores agem sensibilizando o sistema nervoso somatosensorial,
e assim, são capazes de facilitar a ativação das vias nociceptivas até a cura ou
recuperação tecidual (SCHOLZ; WOOLF, 2002). Estes mediadores também são
chamados de mediadores hiperalgésicos intermediários, entre eles destacam-se as
citocinas/quimiocinas, de origem celular, a BK, as proteínas do sistema
complemento C3a e C5a, liberados logo após o reconhecimento do processo
inflamatório (FERREIRA et al., 2009).
No que se refere às cininas, estes peptídeos vasoativos são gerados no
plasma e tecidos periféricos a partir dos cininogênios de alto peso molecular por
ação das enzimas kalicreínas, possuem diversas ações fisiológicas, dentre as quais,
aumento da permeabilidade vascular, promoção da dilatação venular, indução de
dor e hiperalgesia e controle da pressão sanguínea (CAMPOS; SOUZA; CALIXTO,
1998; MAURER et al., 2011).
O efeito das cininas está relacionado com a atuação em receptores B1 e B2,
sendo que os receptores B2 são constitutivamente expressos em muitos tipos
celulares, amplamente distribuídos no SNC e SNP. Os receptores B1 não são
normalmente expressos em tecidos íntegros, sua expressão é estimulada após lesão
tecidual, ou tecido inflamado, decorrente da ação de certos agentes como
endotoxinas bacterianas ou CFA (DRAY, 1995; CAMPOS; SOUZA; CALIXTO, 1998).
Ao agir sobre os receptores B2, a BK causa excitação e sensibilização dos
nociceptores causando dor e hiperalgesia. Assim, estes efeitos diretos levam a
produção de outros mediadores inflamatórios, como as PGs, leucotrienos (LT), HIS,
óxido nítrico (NO), fator de agregação plaquetária (PAF), e citocinas como o fator de
necrose tumoral-α (TNF-α), que agem não somente nos terminais aferentes
primários, mas também estão envolvidos na geração e manutenção da inflamação
(BURGESS et al., 2000).
Os receptores B1 e B2 são receptores acoplados a proteína G, desta maneira,
podem atuar através da estimulação da hidrólise do fosfotidilinositol (IP3) com
conseqüente aumento da concentração intracelular de cálcio, ou ainda ativar a
fosfolipase C (PKC) gerando os metabólitos derivados da via do ácido araquidônico
(McEACHERN et al., 1991; DRAY, 1995; CAMPOS; SOUZA; CALIXTO, 1998).
Quando há o aumento citosólico de cálcio na célula endotelial, promovido pela
ativação de receptores B2 por seus ligantes BK ou kalidina, ocorre ativação da óxido
nítrico sintase (NOS) e conseqüentemente a formação de NO a partir da arginina. O
36
NO se difunde do endotélio para o músculo liso e ativa guanilato ciclase, levando o
aumento de monofosfato de guanosina cíclica (GMPc), um segundo mensageiro que
promove o relaxamento da musculatura lisa (REGOLI et al., 1996; JU et al., 1998).
Outros mediadores inflamatórios ativam diretamente os nociceptores,
evocando a dor, e são chamados também de mediadores hiperalgésicos finais. Eles
atuam diretamente na membrana dos neurônios periféricos nociceptivos e induzem
mecanismos responsáveis pela sua sensibilização. Entre os mais importantes estão
os eicosanoides (PGs e prostaciclinas), as aminas simpáticas, LT, PAF, HIS e a
serotonina (5-HT) (SHOLZ; WOOLF, 2002; FERREIRA et al., 2009).
No que diz respeito à HIS, esta uma amina biogênica é amplamente estudada
por desempenhar diversos papéis na imunomodulação, alergia, inflamação,
hematopoiese, proliferação celular e na dor. Além de promover contração do
músculo liso e secreção do ácido gástrico, aumento da permeabilidade vascular e
tem papel neurotransmissor. Os efeitos da HIS são mediados por sua ligação aos
subtipos de receptores designados HR1, HR2, HR3 e HR4, sendo todos estes
receptores acoplados a proteína G (MAHDY; WEBSTER, 2011).
Uma vez liberadas no espaço intercelular as PGs se ligam aos seus
receptores específicos na membrana plasmática. Cada receptor é designado pela
letra P, precedido pela inicial da série da PG, por exemplo, o receptor da PGE2 é o
EP, o receptor da PGI é IP, e assim sucessivamente. Todos os receptores das PGs
são acoplados a proteína G, e os mecanismos intracelulares que medeiam a
ativação destes receptores, envolve modificações intracelulares de cálcio, adenosina
monofosfato cíclico (AMPc) e fosfotidilinositol (IP3) (VANEGAS; SCHAIBLE, 2001).
Quatro são os receptores ativados pela PGE2, EP1, EP2, EP3 e EP4 e tem um papel
importante no aumento da permeabilidade vascular e na geração da febre, além de
modular a hiperalgesia (CUNHA; TEIXEIRA; FERREIRA, 1999; REINOLD et al.,
2005; KASSUYA et al., 2007).
Recentemente foi demonstrado que a PGE2 promove aumento as expressão
da IL-6, via receptor EP4 na gênese da dor neuropatica (St-JACQUES; MA 2011).
Desta forma, a PGE2 é um contribuinte muito importante para a sensibilidade á dor
durante a inflamação. Sua produção requer a atividade de pelo menos uma das
duas isoformas de ciclooxigenase (COX), a COX-1 e COX-2, a qual é mais
expressiva e relevante para a inflamação. Os anti-inflamatórios não esteroidais
(AINES) clássicos bloqueiam em grau semelhante ambas as isoformas, enquanto
37
que os AINES seletivos como os Coxibes bloqueiam especificamente a COX-2. Em
virtude disso, os AINES tradicionais causam efeitos colaterais em virtude da não
seletividade enquanto que os seletivos não o fazem. Entretanto, o uso de inibidores
seletivos da COX-2 está associado com o risco aumentado de eventos
cardiovasculares (CHAPLAN et al, 2010).
A SP é um neuropeptídeo da família das taquicininas, que se estocado e
liberado
nos
terminais
nervosos
autonômicos
promove
vasodilatação
e
extravasamento vascular (MAPP; KIDD, 1994; BIRKLEIN; SCHMELZ, 2008). A SP
está intimamente relacionada com a inflamação neurogênica (BLACK, 2002;
BIRKLEIN; SCHMELZ, 2008).
Essa taquicinina é amplamente distribuída no SNC e SNP. No SNP é
localizada nas fibras C amielínicas, também chamadas de fibras C peptidérgicas,
que quando estimuladas transmitem a informação nociceptiva (MAPP; KIDD, 1994).
Assim como na dor, a SP também desempenha um papel eferente, onde o nervo
sensorial ativado causa transmissão antidrômica (reversa) dos impulsos nervosos
(além da transmissão ortodrômica para a medula espinhal) nos ramos da mesma
fibra C. A estimulação antidrômica do nervo periférico sensorial causa as respostas
típicas da inflamação aguda (GARRETT et al., 1992).
3.4 Resposta Imune
Em relação à resposta imune inata, que consiste na primeira linha de defesa
contra patógenos invasores, é uma importante via de reconhecimento de produtos
bacterianos (FURZE; RANKIN, 2008). A resposta inflamatória desencadeada, em
parte, via sistema imune inato se dá pela ativação de receptores do tipo Toll (TLRs)
que são expressos em monócitos, macrófagos, mastócitos, neutrófilos, células
dendríticas e queratinócitos (REN; DUBNER, 2010; GUILLOT et al., 2011).
Os receptores TLRs, são glicoproteínas de membrana integral tipo I,
responsáveis por fazer a comunicação entre os aspectos externo e interno da célula.
Dois membros dessa família, os receptores TLR-2 e TRL-4, foram identificados
como o receptor envolvido na sinalização do LPS via ativação do fator nuclear-κB
(NF-κB) (MOORE, 2001; CARRENHO, 2009). Este efeito pode também ser mediado
pelo aumento de interleucina-1β (IL-1β) através da sinalização dos TLR-2 e TLR-4,
bem como aumento de TNF-α através dos TLR2 (DREXLER; FOXWELL, 2009).
38
O LPS é um componente importante da membrana externa de bactérias Gram
negativas e um dos iniciadores microbianos mais potentes da inflamação. Os
mecanismos moleculares de ativação de macrófagos pelo LPS envolvem diversas
quinases como a proteína quinase C (PKC), proteína quinase A (PKA) e três classes
de proteínas quinase ativadas por mitógeno (MAPK): quinases reguladas por sinal
extracelular (ERK1, ERK2), quinase c-Jun N-terminal (JNK) e P38 MAPK. Além das
quinases, a ativação dos receptores TLR4, pelo LPS promove a ativação do NKKB o
qual por sua vez promove a ativação da transcrição de genes para diversos
mediadores da resposta imunológica (NICOTRA et al., 2011).
O LPS induz a produção de citocinas pró-inflamatorias como o TNF-α, IL-1β,
IL-6, IL-8,e também IL-12 por mastócitos e macrófagos. Também é relatado que os
macrófagos secretam, em resposta ao LPS, uma grande variedade de outros
mediadores da resposta inflamatória, incluindo PAF, PGs, enzimas e radicais livres
como o NO (FERREIRA; LORENZETTI; POOLE, 1993; CUNHA et al., 1992; CUNHA
et al.,2000).
A ativação dos receptores TLRs pela via proteína MyD88-dependente, gera
uma cascata de transdução de sinal por ativação do NF-κB (REN; DUBNER, 2010).
O NF-κB é um fator de transcrição que desempenha um papel importante na
regulação das respostas imunes inatas e adaptativas associado a funções efetoras,
por regular a expressão genética de muitos mediadores celulares. Nas células em
repouso, o NF-κB reside no citoplasma em uma forma fisicamente inativa, associado
com proteínas inibidoras conhecidas como proteínas inibidoras do kB (IkB)
(BÁRTHOLO; BÁRTHOLO, 2009).
Quando um ligante específico ativa o receptor de NF-κB (Ex: LPS, TNF-α, IL1β), é desencadeado uma série de eventos que resulta no recrutamento e ativação
de proteínas quinases IκB (IKKs) que fosforilam IκB. A degradação da IκB promove a
translocação do NF-κB para o núcleo da célula e conseguinte promoção de genes e
controle de transcrição, que desencadeia a síntese de citocinas inflamatórias
(CAAMAÑO; HUNTER, 2002; HANADA; YOSHIMURA, 2002).
Em função do aumento da permeabilidade vascular, frente à resposta
inflamatória, ocorre o extravasamento do líquido intersticial (edema), rico em água e
proteínas de fase aguda. O aumento da permeabilidade vascular também favorece o
infiltrado de células fagocíticas, como os neutrófilos (fase aguda) e monócitos (fase
39
crônica). A infiltração destas células nos tecidos é característica histológica
patognomônica de inflamação (SCHOTTENFELD; BEEBE-DIMMER, 2006).
Os neutrófilos são células do tipo polimorfonucleares, que constituem a maior
porção dos leucócitos circulantes do sangue periférico e medula óssea. A sua
produção na medula óssea é regulada pela expressão de fator estimulador de
colônia de granulócitos (G-CSF) (FURZE; RANKIN, 2008). No que diz respeito à
resposta imune, estas células desempenham papel crucial na limitação e expansão
da disseminação bacteriana. Quando há um estímulo inflamatório ou resposta
infecciosa, estas células são rapidamente mobilizadas dos seus sítios de reserva,
para o sítio da lesão (DA SILVA; HASHIMOTO, 2003; FURZE; RANKIN, 2008).
A homeostasia de produção destas células é mantida por um delicado
equilíbrio entre a granulopoiese (pool das stem cell, pool mitótico e pós mitótico) na
medula óssea, a porção no sangue periférico (pool circulante e marginação
intravascular) e a demanda tecidual (SUMMERS et al., 2010). Para atingir o tecido
alvo (ou possível foco infeccioso), o neutrófilo realiza um processo chamado
transmigração (FURZE; RANKIN, 2008).
A adesão dos neutrófilos circulantes ao endotélio microvascular é o passo
inicial na diapedese, ou seja, ocorre a migração das células através dos vasos
sanguíneos e vão se acumular no local da lesão (TONNESEN, 1989). Fatores
quimiotáticos
como
peptídeos
(N-formilmetionil-leucil-fenilalanina,
C5a)
e
mediadores lipídicos (LTB4 e PAF) atuam sobre receptores específicos na
membrana do neutrófilo, favorecendo uma firme adesão do neutrófilo a célula
endotelial. Assim é desencadeada uma série de eventos que vão favorecer
rolamento, adesão e diapedese celular, com posterior infiltração tecidual (Figura 5)
(TONNESEN, 1989; DA SILVA; HASHIMOTO, 2003).
Os sinusoides da medula óssea e o endotélio expressam moléculas de
adesão celular vascular 1 (VCAM-1) e moléculas intercelular de adesão (ICAM-1), Pselectina, E-selectinas (FURZE, RANKIN, 2008). As L-selectinas são expressas na
maioria dos leucócitos, enquanto que as E- selectinas e P-selectinas são expressas
em células endoteliais inflamadas. A P-selectina também é expressa por plaquetas
ativadas (LEY et al., 2007).
A expressão de L-selectina nos neutrófilos desencadeia o movimento de
rolamento ao longo do capilar, antes da sua transmigração através do endotélio
vascular (LEY et al., 2007). Os neutrófilos, monócitos e linfócitos podem se aderir à
40
parede dos vasos, migrar e se acumular no local da lesão. Desta maneira, estas
células contribuem para a sensibilização nociceptiva periférica, através da liberação
de fatores solúveis que vão interagir diretamente com os nociceptores (REN;
DUBNER, 2010).
Figura 5: Migração dos leucócitos. Os três passos são mostrados em negrito: rolamento,
que é mediado pelas selectinas, ativação, que é mediado pelas quimiocinas, e a
captura/parada que é mediada pelas integrinas. Moléculas chave envolvida em cada etapa
são mostradas nas caixas: ESAM, seletivas moléculas de adesão das células endoteliais.
ICAM1, molécula de adesão intercelular 1. JAM, molécula de adesão juncional. LFA1,
antígeno associado a função linfoide 1 (também conhecido como αLβ2-integrina). MAC1,
antígeno de macrófago 1. MADCAM1, mucosa vascular adressina molécula de adesão
celular 1. PSGL1, P-selectina glicoproteína ligante 1. PECAM1, molécula de adesão de
plaquetas/endotélio-célula 1. PI3K, fosfatidilinositol-3-quinase. VCAM1, molécula de adesão
células vascular 1. VLA4, antígeno muito tardio 4 (também conhecido como α4β1-integrina).
A resolução do processo inflamatório é resultante da produção de citocinas
anti-inflamatórias por células do SI, que ajudam a controlar e resolucionar tal
resposta. As citocinas anti-inflamatórias naturais são o antagonista do receptor de IL1 (IL-1R), IL-10, IL-4, IL-13 e o fator tranformador de crescimento – beta1 (TGFbeta1). Tem sido demonstrado que as citocinas IL-4 e IL-10 limitam a hiperalgesia
inflamatória, por inibição da produção de citocinas hiperalgésicas e PGs (CUNHA et
al., 1999).
Uma vez terminada a infecção ou inflamação, se instala a cura e a área uma
vez lesionada, deverá voltar a sua existência normal. Uma das vias finais da
resposta inflamatória se dá pelo fenômeno de apoptose (OMOIGUI, 2007). Diante do
41
conhecimento dos mecanismos expostos, muitos pesquisadores se esforçam para
encontrar novas opções terapêuticas, principalmente no que diz respeito à dor
inflamatória crônica (BECK et al., 2009).
3.5 Artrite Reumatóide
A artrite reumatóide é uma doença autoimune que envolve um influxo
descontrolado de células inflamatórias nas articulações, levando à lesão progressiva,
caracterizada por dor crônica e inflamação (ALZABIN; WILLIAMS, 2011). A dor
desencadeada durante a artrite afeta milhões de pessoas anualmente, em torno de
1% da população mundial, e os pacientes acometidos pela doença, freqüentemente
desenvolvem incapacidade motora e angústia psicológica, frente à qualidade de vida
prejudicada. Entretanto, os mecanismos relacionados com a dor articular não estão
totalmente elucidados (UEMATSU et al., 2011).
Sabe-se que durante o processo inflamatório na AR, ocorre uma complexa
interação entre mediadores químicos, células do SI e nervos presentes nas
articulações que são sensibilizados por estímulos mecânicos (MAPP; KIDD, 1994;
FOX et al., 2010). Além disso, o processo inflamatório na artrite gera mudanças
importantes na plasticidade periférica e no SNC, os quais reduzem o limiar da dor,
dando origem a alodínia e a hiperalgesia (WOOLF; COSTIGAN, 1999; RITTNER;
BRACK; STEIN, 2008; WALDBURGER; FIRESTEIN, 2010). Durante o processo,
uma maneira pela qual a dor articular é gerada é através da estimulação de
nociceptores silenciosos. Em condições fisiológicas normais estes nociceptores
estão quiescentes nas articulações, no entanto, após uma lesão tecidual ou
processo inflamatório pode ocorrer a ativação destas células (Mc DOUGALL, 2006).
Nas décadas de 50 e 60 Carl Pearson, divulgou vários trabalhos descrevendo
a metodologia de artrite induzida por CFA. A administração intraplantar de CFA em
ratos causa poliartrite migratória, e esta reação se assemelhava muito com a AR
humana. Ainda de acordo com Pearson, a reação inflamatória que ocorre não é
infecciosa, mas sim uma reposta imuno-mediada contra algum constituinte da
bactéria injetada (bacilo da tuberculose) (PEARSON, 1956; PEARSON; WAKSMAN;
SHARP, 1961). Em 1985 Van Eden et al., descreveram que a artrite induzida por
CFA ocorreria através de resposta auto-imune mediada por células, uma espécie de
42
mimetismo estrutural entre a micobactéria e proteoglianos (componente normal) da
cartilagem do animal.
Desde então a artrite induzida por CFA tem sido comumente utilizada como
modelo experimental em estudos in vivo em animais. Como já reportado, este
modelo desenvolve muitas características comuns a artrite que ocorre em seres
humanos, caracterizado por severo e persistente processo inflamatório e
comprometimento da cartilagem e estrutura óssea com o passar do tempo
(NEWBOLD, 1963). A semelhança comum da patologia induzida experimentalmente
com a artrite reumatóide em humanos faz com que este modelo seja utilizado para a
pesquisa de novos medicamentos para o tratamento desses processos crônicos,
envolvendo dor e inflamação persistente (PAN et al., 2009).
Dentre os mediadores inflamatórios envolvidos na rede de eventos
moleculares e celulares, envolvidos na patogênese da AR, o TNF-α tem papel de
destaque (TAYLOR; FELDMANN, 2009). O TNF-α é reconhecido por mediar uma
variedade de funções efetoras relevantes na patogênese da AR, incluindo a ativação
de células endoteliais, indução da produção de citocinas inflamatórias como a IL- 1,
IL-6, IL-8, facilitação dos processos de quimiotaxia de células inflamatórias, ativação
de enzimas matriz metaloproteinases (MMPs), inibição da síntese de proteoglicanos
na cartilagem, regulação da expressão da RANKL e fator estimulador de colônias de
macrófagos (M-CSF), bem como aumento da produção de PGE2, entre outras
funções (BRENNAN; MCINNES, 2008).
As citocinas são naturalmente produzidas no organismo, desde que foi
identificado o TNF-α tem sido exaustivamente estudado por pesquisadores do
mundo todo. Possui papel central na imunidade e inflamação, interferindo em um
amplo espectro de respostas celulares (SUH et al., 2006; PARK; KIM, 2007). Os
efeitos periféricos do TNF-α na sensibilização dos nociceptores (sensibilização
periférica) têm sido documentados. A injeção de TNF-α pela via intra.plantar (i.pl.),
intradérmica, intramuscular, endoneural, provoca hiperalgesia térmica, e alodínia
mecânica, sendo utilizado então como modelo de febre e alodinia (ZHANG et al.,
2011).
O TNF-α é uma citocina de 17KDa que é produzida por diversos tipos de
células, como neutrófilos, linfócitos ativados, macrófagos, células do revestimento
sinovial, células endoteliais, células musculares lisas, fibroblastos, queratinócitos
(CARSWELL et al, 1975; ZHANG et al., 1995; WOOLF et al., 1997; KARMAKAR;
43
KAY; GRAVALLESE, 2010). O TNF-α, exerce seus efeitos através da interação com
dois receptores denominados TNFR1 (p-55R) e TNFR2 (p-75R), os quais são
claramente dependentes da ativação de fatores de transcrição e a síntese de novas
proteínas envolvidas na resposta inflamatória (ROCHA et al., 2006; LEUNG;
CAHILL, 2010).
Tendo em vista a grande variedade de mediadores inflamatórios que atuam
nas terminações nervosas sensoriais, existem múltiplas oportunidades para produzir
alterações locais na sensibilidade terminal e, portanto hiperalgesia. Podemos citar
degranulação de mastócitos, ativação de cininogênios, interação simpática pósganglionar, fatores de crescimento dentre outros (WOOLF et al., 2007).
Apesar do mais óbvio sítio de inflamação na AR ser a sinóvia, citocinas como
TNF-α, IL-6 são liberadas de maneira sistêmica na circulação, possuindo múltiplos
efeitos em órgãos distantes (KU et al., 2009), e tem sido descritos como a chave no
desenvolvimento de artropatias inflamatórias (FONSECA et al., 2009).
A indução da artrite por CFA pode acarretar em monoartrite ou poliartrite. A
poliartrite é desenvolvida quando o adjuvante é administrado na superfície
intraplantar, subcutânea, intradérmica, na base da cauda (LABRECQUE; BUREAU;
REINBERG, 1995; RAMPRASATH; SHANTHI; SACHDANANDAM, 2005; SUH et al.,
2006; NEUGEBAUER et al., 2007). A monoartrite, no entanto, é desenvolvida
quando o adjuvante é administrado de forma intra-articular (normalmente na junção
tibiotarsal ou tibiofemoral) (VON BANCHER et al., 2000; BILEVICIUTE-LJUNGAR;
SAXNE; SPETEA, 2006; NEUGEBAUER et al., 2007). Ambas as situações,
monoartrite ou poliartrite induzidas pelo CFA desencadeiam resposta contralateral.
A artrite contralateral, ou a resposta característica da artrite que são a dor e a
inflamação, pode ser vizualizada tanto na artrite reumatóide em humanos, quanto na
artrite induzida por adjuvantes como o CFA em ratos. Em geral mudanças bilaterais
no sistema nervoso após uma patologia unilateral, como a lesão do nervo e
inflamação, não são incomuns, apesar dessas mudanças nem sempre serem
observadas (VON BANCHER et al., 2000).
Tal resposta contralateral exige a administração de concentrações ideais do
agente indutor, para que o estímulo inflamatório seja de grande magnitude. A
precisão topográfica da resposta contralateral fortemente implica em um mecanismo
neurogênico ao invés de um efeito sistêmico. Se a resposta ipsilateral é de origem
inflamatória, a resposta contralateral também será, caso for de origem neurogênica,
44
idem. A resposta contralateral é apenas uma sombra da resposta original tanto
temporalmente quanto em magnitude, conhecida como imagem ou espelho
(SHENKER et al., 2003).
O processo de ativação do nociceptor na articulação acarreta na transmissão
para a medula espinhal, onde os neurônios simpáticos pré-ganglionares na medula
espinhal serão seletivamente ativados. Estes neurônios se projetam através da
medula espinhal para os seus homólogos contralateral, estimulando a liberação de
neuropeptídeos, como a SP, a partir de neurônios sensoriais aferentes, que em
conjunto com a inervação simpática produzem a inflamação no lado oposto. A
transecção no nervo a partir de qualquer membro impede a manifestação de
inflamação e hiperalgesia no membro contralateral. Este processo indica que ambos
sistema nervoso simpático (SNS) e fibras C estão envolvidos neste processo
(LEVINE et al.,1985; BLACK, 2002).
3.5 Como proporcionar o alívio da dor e inflamação
O controle farmacológico da dor e inflamação é baseado principalmente em
duas estratégias. A primeira envolve o uso de fármacos que possam inibir a
sensibilização do nociceptor, impedindo a formação dos primeiros mediadores
envolvidos no processo e, portanto, inibir o desenvolvimento da hiperalgesia. Este é
o principal mecanismo de ação de fármacos como a aspirina, que inibem a COX,
prevenindo a sensibilização dos nociceptores pelas PGs (CURY et al., 2011).
A segunda estratégia envolve o uso de fármacos que agem diretamente no
bloqueio da transmissão da informação nociceptiva, ou deprimindo os centros
cerebrais decodificadores do processo doloroso resultando em analgesia. Este
mecanismo é exercido por fármacos como a morfina, anestésicos locais e gerais,
dipirona, e também por alguns anti-inflamatórios (via ativação de NO-GMPc) (CURI
et al., 2011).
Os recursos terapêuticos atuais costumam ser eficientes no que diz respeito
ao tratamento da dor aguda, pois, é capaz de minimizar o sofrimento do paciente.
Quando a dor aguda se mantém ativa, detecta-se a não efetividade dos
medicamentos e, neste momento, deve-se suspeitar de uma terapia mal
administrada, tendo como consequência o tratamento inadequado e a dor pode se
tornar crônica e persistente (MOORE, 2009).
45
A incidência da dor crônica é estimada em torno de 20-25% em todo o
mundo. Mais de um terço da população mundial sofre de dor persistente ou
recorrente. Poucos pacientes obtêm o alívio completo com os fármacos disponíveis
atualmente, e mais da metade tem tratamento inadequado (STUCKY; GOLD;
ZHANG, 2001; GOLD; GEBHART, 2010). O manejo da dor crônica, ao contrário da
dor aguda, é um problema de saúde pública (GUILLOT et al., 2011). A receita para
um tratamento bem sucedido, dos diversos tipos de dor, é conhecer os mecanismos
que geram a dor, e que a mantém (STUCKY; GOLD; ZHANG, 2001)
Os AINES são um grupo heterogêneo de moléculas com atividade analgésica,
antipirética e anti-inflamatória. Os AINES estão entre os agentes terapêuticos mais
utilizados mundialmente. Além da indicação para várias doenças inflamatórias, estes
fármacos também são aplicados no tratamento da artrite reumatoide (BADAWEY;
EL-ASHMAWEY, 1998; MANIVANNAN; CHATURVEDI, 2008).
O mecanismo de ação destes fármacos é determinado pela inibição não
seletiva da enzima COX (isoformas COX-1 e COX-2), consequentemente levando a
inibição da síntese de PGs. A etapa limitante para a síntese das PGs e tromboxanos
é a conversão do ácido araquidônico em prostaglandina H2, uma reação que é
catalisada pela COX (FERREIRA; MONCADA; VANE, 1973; MAZARIO; HERRERO,
1999).
As COXs são enzimas chave na síntese de prostaglandinas H2, que é
precursora da biossíntese de outras prostaglandinas, tromboxanos e prostaciclinas.
Existem duas principais isoformas da COX ligadas diretamente a processos
dolorosos e inflamatórios: COX-1 e COX-2. A COX-1 é constitutivamente expressa,
atuando em várias funções fisiológicas como: a proteção da mucosa gástrica,
agregação plaquetária e fluxo sanguíneo renal. A COX-2 por sua vez além de ser
constitutiva em alguns órgãos, por exemplo, nos rins, sua expressão e atividade
encontra-se aumentada em condições patológicas como inflamação, dor e
oncogênese, levando a se pensar que a enzima só apareça em tais processos
citados. Pelo fato da COX-2 participar em eventos patológicos, a identificação de
inibidores seletivos dessa enzima é essencial para a terapia de diversas doenças
(RATHISH et al., 2009).
Estudos recentes têm apontado o papel de uma terceira isoforma de COX, a
COX-3. Trata-se na realidade de uma variação da COX-1 que foi encontrada
principalmente em extratos de tecido encefálico de cães. Em humanos, a COX-3 foi
46
encontrada abundantemente em amostras de tecido encefálico e cardíaco.
Entretanto, seus efeitos biológicos e farmacológicos tem sido relacionados até o
momento com o controle da temperatura corporal, sendo a atividade desta enzima
fortemente inibida pelo acetaminofeno (RAINSFORD, 2009).
A PGE2, principal prostanoide formado nesta via, contribui tanto para a
sensibilização
periférica
de
nociceptores
quanto
senbilização
central.
A
sensibilização periférica ocorre por meio da ativação de receptores acoplados a
proteína G aumentado os níveis de AMPc dentro dos nociceptores. Os produtos da
COX também estão presentes na medula espinhal onde parece interagir com os
terminais nociceptivos. Desta maneira é possível obter um efeito analgésico, tanto
em sítios centrais, quanto periféricos com o uso de inibidores da COX (JULIUS;
BASBAUM, 2001).
Apesar da sua ampla aplicabilidade clínica, tanto na dor aguda quanto na dor
crônica, o uso terapêutico dos AINES é acompanhado de vários efeitos indesejáveis.
Estes efeitos são relacionados ao uso prolongado do medicamento e colaterais ao
próprio mecanismo de ação, ou seja, a COX-1 é constitutiva e participa de eventos
homeostáticos em vários tecidos, enquanto que a COX-2 induzida, produz potentes
mediadores inflamatórios e nociceptivos responsáveis pela propagação da dor e da
inflamação (PIAZ et al., 2003).
Quando não há inibição enzimática seletiva da COX-2, ocorrem efeitos
colaterais significativos por inibição da COX-1, como: ulcerações gastrintestinais,
nefrotoxicidade e eventos hemorrágicos (BADAWEY; EL-ASHMAWEY, 1998).
Embora a inibição seletiva da COX-2 por alguns coxibes, também tenha apresentado
efeitos colaterias alarmantes, como complicações cardiovasculares (MUKHERJEE;
NISSEN; TOPOL, 2001; GROSSER; FRIES; FITZGERALD, 2006). Ainda assim, os
estudos para a identificação de um inibidor seletivo da COX-2, se fazem presentes
na literatura. HAYASHI et al., (2011), demonstraram obter um composto sintético
com potente atividade anti-inflamatória e antipirética, com ação inibitória seletiva da
COX-2 em modelos experimentais “in vivo”e “in vitro”.
Outra classe de medicamentos para o alívio da dor surgiu há muitos anos. O
ópio e os seus derivados, além de exercerem ponderável influência sobre o
comportamento dos seres humanos, têm sido empregados como sedativo e como
analgésico. A partir do século XIX, com o isolamento dos alcaloides do ópio e as
facilidades para o emprego dessas substâncias por via parenteral, houve aumento
47
do interesse pelo uso criterioso dos opioides na área médica e da análise das
consequências sociais de seu uso abusivo (DUARTE, 2005).
A morfina e os opioides endógenos são agonistas dos receptores µ-opioides
(STUCKY; GOLD; ZHANG, 2001). Estes receptores localizam-se perifericamente,
em sítios pré e pós-sinápticos, no corno dorsal da medula espinhal, tronco cerebral,
tálamo e córtex. Constituindo o sistema ascendente da transmissão da dor, bem
como estruturas que compõem o sistema inibitório descendente, que modula a dor
ao nível de medula espinhal (INTURRISI, 2002). Os opioides são fármacos utilizados
para o tratamento da dor que é refratária a outros analgésicos, em especial a dor
severa (Figura 6) (MOORE, 2009).
Figura 6. Escada analgésica. Escada da Dor da Organização Mundial da Saúde. Alívio
da dor oncológica e cuidados paliativos. Genebra: OMS, 1996. (Adaptado de Manubay;
Muchow; Sullivan , 2011).
48
O opioide mais comumente utilizado para tratar a dor comum é a codeína,
que é considerado um analgésico fraco. A codeína é eficaz contra a dor leve a
moderada e pode ser combinado com outros AINES (MOORE, 2009).
A eficácia analgésica dos opioides pode variar segundo a característica,
duração de intensidade do estímulo; dosagem e espécie. Os opioides bloqueiam a
transmissão periférica e central da via nociceptiva aferente e por isso, tornam-se
bastante eficientes no tratamento da dor inflamatória aguda. No entanto, eles não
são igualmente eficazes para todo tipo de dor como, por exemplo, a dor neuropática
que possui uma resposta pobre ou de curta duração aos opioides (KLAUMANN;
WOUK; SILLAS, 2008).
Assim como os opióides, os glicocorticóides têm grande aplicação
terapêutica.
Porém,
possuem
potentes
efeitos
anti-inflamatórios
e
imunossupressores, e são utilizados clinicamente para o tratamento de doenças
inflamatórias desde meados de 1900. Sua importância está ligada não só à melhora
da qualidade de vida, como também à sobrevida de pacientes com doenças
reumáticas. Muitos estudos demonstraram excelente resposta anti-inflamatória de
pacientes com AR após o uso de cortisona (XIE et al., 2006; ANTI; GIORGI;
CHAHADE, 2008).
Muitos mecanismos são propostos para ação anti-inflamatória e analgésica
dos glicocorticoides. Tais medicamentos interagem com receptores nucleares e a
princípio, a administração de um glicocorticoide promove a diminuição da expressão
do ácido araquidônico por diversos mecanismos, consequentemente seus
metabólitos (PGs, LT e tromboxanos). Ademais, induzem diminuição da expressão
do NF-κB e citocinas como TNF-α e IL-1β, em contrapartida estimula o aumento de
citocinas anti-inflamatórias como a IL-10 (RHEN; CIDLOWSKI, 2005; XIE et al.,
2006). Os efeitos terapêuticos destes fármacos são na maioria das vezes
acompanhados por efeitos adversos e/ou colaterais importantes e alguns
irreversíveis deixando a terapia com glicocorticoides como uma das últimas opções
de tratamento (XIE et al., 2006; ROMANHOLI; SALGADO, 2007).
Uma alternativa importante para auxiliar a terapia da dor são os adjuvantes,
que envolvem outras classes de medicamentos além dos analgésicos tradicionais,
entre eles estão os antidepressivos, anticonvulsivantes, canabinoides (WALKER;
STRANGMAN; HUANG, 2001), antagonistas de receptores NMDA (WIESENFELDHALLIN, 1998; BENNETT, 2000), anestésicos locais, entre outros.
49
Fármacos
antidepressivos
tricíclicos
(TCAs)
agem
em
muitos
neurotransmissores envolvidos na nocicepção. Eles bloqueiam a recaptação de 5HT e noradrenalina (NOR), além disso, bloqueiam a hiperalgesia mediada por
receptores tipo NMDA, e bloqueiam canais de sódio, isso justifica em parte, o fato da
propriedade analgésica independente da propriedade antidepressiva (MOULIN et al.,
2007).
Os TCAs são de grande valia para os casos de dor constante, com sensação
de queimadura ou parestesia, embora também tenham papel importante nas dores
neuropáticas. É indicado que seja utilizada a menor dose possível de um TCA, e que
esta dose obviamente seja eficaz, em pacientes com dor neuropática. Este cuidado
é importante em relação aos pacientes idosos, em função das interações
medicamentosas, principalmente outros medicamentos que atuam no SNC e em
paciente com risco de doença cardiovascular. Apesar da presença da depressão
não ser necessária para o efeito analgésico dos TCAs, ela possa ser útil em
pacientes que sofrem de crises depressivas, principalmente na vigência da dor, e
são inadequadamente tratados (DWORKIN et al., 2007; REISNER, 2011).
Outra classe importante que tem sido empregada no tratamento da dor
crônica são os anticonvulsivantes. Logo depois que eles revolucionaram o
tratamento da epilepsia, em 1960, os anticonvulsivantes foram incluídos no manejo
da dor crônica. A Gabapentina (Neurotin) merece destaque por ter melhor perfil de
segurança no uso e maior janela terapêutica. Além da Gabapentina também são
utilizados a Carbamazepina (Tegretol), Fenitoína (preferencialmente na neuralgia
trigeminal) (Hidantal) e Valproato (Depakene) (outras síndromes dolorosas)
(McQUAY et al., 1995; REISNER, 2011).
A gabapentina, e seu análogo Pregabalina, se ligam a canais de cálcio
dependentes de voltagem em neurônios pré-sinápticos no corno dorsal da medula
espinhal, resultando na diminuição da liberação de neurotransmissores excitatórios
como o GLU e SP (MOULIN et al., 2007). Consequentemente, a sua ação no alívio
da dor se dá pela supressão de circuitos hiperativos da medula e do córtex cerebral
e estabilização das descargas neuronais nas membranas das vias aferentes
primárias (LISBOA; TEIXEIRA; MARTINS; 2002).
A
principal
utilização
dos
anticonvulsivantes
(em
associação
com
antidepressivos e analgésicos) é em casos de dor neuropática, como neuralgia do
50
trigêmeo, neuralgia pós-herpética e dor associada com compressão medular e
esclerose múltipla (McQUAY et al, 1995).
3.6 Heterociclos: pirazol, pirazolinas e pirazolonas
As Indústrias Farmacêutica e Agroquímica têm demonstrado interesse
consistente nos heterociclos pirazóis e seus análogos devido a sua variedade de
aplicações (MACHADO et al., 2009). Estes compostos heterociclos constituem um
grande grupo de moléculas com atividades farmacológicas diversificadas (MELO et
al., 2006).
Os heterociclos são compostos cíclicos que possuem um ou mais
heteroátomos na sua estrutura. Os heterociclos nitrogenados de cinco membros,
contendo um ou mais átomos de nitrogênio pertencem à classe de substâncias
denominada genericamente de azol sendo que o heterociclo nitrogenado mais
simples deles é o pirrol (1), seguido do pirazol (2), da pirazolina (3) e da pirazolona
(4) (PADMAVATHI et al., 2009).
O pirazol é um heterociclo com dois átomos de nitrogênio, três átomos de
carbono, e duas duplas ligações nas posições 2-3 e 4-5. Já o anel pirazolínico
possui apenas uma dupla ligação entre os carbonos 3-4, enquanto que a 5pirazolona além da uma dupla ligação entre os carbonos 3-4 possui uma carbonila
(C=O) na posição 5.
Outros azóis como o imidazol (5), 1,2,3-triazol (6), 1,2,4-triazol (7), tetrazol (8)
e pentazol (9) também apresentam relevantes atividades biológicas já referenciadas
na literatura, como atividade antimicrobiana e citotóxica (PADMAVATHI et al., 2009).
A substituição bioisostérica de um átomo de carbono por outros heteroátomos
constituem outros heterociclos relevantes. O heterociclo que possui a presença do
átomo de enxofre adicionalmente ao átomo de nitrogênio, denomina-se tiazol (10), e
no caso de um átomo de oxigênio adicionalmente ao átomo de nitrogênio,
denomina-se oxazol (11) (MELO et al., 2006).
Fatos importantes na história da medicina estão associados a fármacos
contendo núcleos heterociclos. A descoberta das pirazolonas foi registrada em de
1883, quando o químico alemão Ludwig Knorr, na tentativa de sintetizar derivados
quinolônicos acidentalmente sintetizou a antipirina, uma molécula com atividade
51
antipirética, analgésica e antirreumática (VOLZ; KELLNER, 1980; DE SOUZA et al.,
2001) e desde então, a utilização clínica destes compostos tem sido empregada.
H
N
1
2
5
H
N
1
5
H
N
N
3
4
4
(1)
H
N
O
NH
2
H
N
H
N
NH
H
N
N
N
3
(2)
(3)
H
N
N
N
N
(7)
N
N
N
N
(8)
(4)
H
N
(5)
N
N
N
(9)
N
(6)
N
S
O
(10)
(11)
A dipirona (12) também conhecida como metamizol, ou ácido 1-fenil-2,3dimetil-5-pirazolona-4-metilaminometanossulfônico, é um analgésico antipirético não
opioide, que pertence a classe dos AINES. Foram identificados pelo menos 4
metabólitos deste fármaco no plasma humano, após a administração oral em doses
variadas, 4-metilaminoantipirina (13), 4-aminoantipirina (14), 4-acetilaminoantipirina
(15) e 4-fomilaminoantipirina (16) (VOLZ; KELLNER, 1980). Além destes, vários
outros metabólitos já foram identificados (LEVY; ZYLBER-KATZ; ROSENKRANZ,
1995).
O
H3C
H3C
H3C
-
N
H3C
S
O
N
N
+
O Na
H3C
H3C
O
(12)
H3C
NH
N
H3C
O
N
(13)
NH
O
H3C
NH
CH3
H3C
N
N
(15)
O
N
(14)
O
H3C
N
NH2
H
H3C
N
N
(16)
O
O
52
Seus derivados e/ou análogos são fármacos considerados veteranos na
prática médica, sendo amplamente utilizado com sucesso desde 1922, apesar de a
dipirona ter sido banida em alguns países pelo risco de causar agranulocitose
(LEVY, 2000). Por sua vez, a agranulocitose foi descrita por Schultz em 1922, como
uma doença misteriosa. Alguns anos depois, Madison e Squier (1934), descobriram
que o fenômeno que causava uma diminuição na linhagem granulocítica e por vezes
aplasia medular, era decorrente da hipersensibilidade ao fármaco aminopirina, outro
derivado pirazolônico identificado também como metabólito da dipirona (RUVIDIÉ,
1996).
Além da possibilidade da origem da agranulocitose ser imunomediada, tem
sido investigado um efeito direto da dipirona sobre o granulócito no sangue periférico
e sobre as unidades formadoras de colônia na medula óssea, porém, faltam dados
na literatura sobre a maneira como ocorre a interação do composto com estas
células. A redução maciça da contagem de granulócitos pode ser explicada pela
interação e interferência na diferenciação e maturação de células progenitoras ou
mesmo indução de apoptose nesta linhagem (SABAGGA et al.,1993; GARCIAMARTINEZ et al., 2003).
A possibilidade da dipirona induzir discrasias sanguíneas, em especial a
agranulocitose, é um problema que preocupa os médicos e a população, pelo fato
da dipirona ser um medicamento amplamente consumido em nosso país
(DANIELLE; LEAL, 2003). Efeitos adversos não colaterais como a agranulocitose,
aplasia de medula (hemotoxicidade), são comuns a certos fármacos utilizados na
terapêutica (TAKEDA et al., 2002; COLEMAN; KHALAF; NICHOLLS, 2003). Em se
tratando da dipirona, estes efeitos têm chamado a atenção de pesquisadores, para
síntese de novos análogos ou derivados pirazolônicos (MILANO et al., 2008). A
proibição do uso da dipirona tem se estendido a outros continentes além do
europeu. Recentemente, de acordo com o caderno farmacêutico da Organização
Mundial da Saúde (OMS) que relata restrições de uso e disponibilidade de
medicamentos atualizado em 2010, o metamizol foi banido das Filipinas pelo centro
de farmacovigilância. A Fenilbutazona (18), também é um derivado pirazolônico e
possui propriedades farmacológicas antipirética, antiinflamatória e analgésica (GIRI;
MUKHOPADHYAY, 1998)
O conhecimento profundo do mecanismo de ação dos AINES (exemplo de
representante da classe a Indometacina (17)), levou muitos estudiosos a
53
investigarem novas moléculas que fossem capazes de inibir seletivamente a enzima
responsável pelos efeitos na dor e na inflamação, ou seja, um inibidor seletivo de
COX-2. Então Penning et al. (1997), demonstraram em seu estudo a identificação do
1-(4-[5-(4-metilfenil)-3-(trifluorometil)-H-pirazol-1-il]
benzenosulfonamida,
denominado comercialmente como celecoxib (Celebra®) (19), que na época
apresentava-se em estudos de fase clínica III com indicações terapêuticas para a AR
e osteoartrite. Além deste outros inibidores de COX-2 foram descobertos como o
Rofecoxib (VIOXX®) (20), equipotente à Indometacina porém sem efeitos
gastrintestinais (PRASIT et al., 1999), o Valdecoxib (Bextra) (21) (TALLEY et al.,
2000), entre outros.
Mais tarde alguns inibidores seletivos da COX-2 como o Rofecoxib
apresentaram riscos cardiovasculares (MUKHERJEE; NISSEN; TOPOL, 2001),
sendo retirados do mercado (DAVIES; JAMALI, 2004).
Cl
H3C
O
O
N
H3C
O
HO
(17)
CH3
N
N
CH3
O
N
O
N
(18)
H3C
H3C
O
S
O
S
O
O
CH3
H3C
O
O
O
(19)
S
NH2
O
N
O
(20)
(21)
Na perspectiva de melhorar a relação estrutura atividade destes compostos, a
fim reduzir ao máximo os efeitos colaterais e adversos, inclusive sobre o órgão
hematopoiético, modificações estruturais e/ou a síntese de análogos pirazolônicos
54
têm sido amplamente estudadas, principalmente por seus efeitos antinociceptivos
(DE SOUZA et al., 2001; MILANO et al., 2008).
As pirazolinas constituem uma importante classe de compostos sintéticos que
tem sido destaque em muitos modelos farmacológicos, apresentando atividade
antimicrobiana (antifúngica e antibacteriana) (ABUNADA et al., 2009; DAWANE et
al., 2010), atividade antinociceptiva (TABARELLI et al., 2004; KAPLANCIKLI et al.,
2009), antitumoral (HAVRYLYUK et al., 2009), antiamoébica
(BUDAKOTI et al.,
2008), antiulcerogênica e anti-inflamatória (SHOMAN et al., 2009). Seu amplo leque
de propriedades farmacológicas, sobretudo seu efeito antinociceptivo, impulsionou a
investigação farmacológica mais aprofundada de compostos inéditos desenvolvidos
na UNIVALI, resultando no presente trabalho.
55
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Obtenção das substâncias avaliadas
Os compostos utilizados neste estudo foram desenvolvidos e sintetizados no
laboratório de síntese orgânica da UNIVALI, por Lorena dos Santos.
4.1.1 Síntese dos derivados 1,3,5-triaril-pirazolínicos
Os derivados 1,3,5-triaril-pirazolínicos, foram sintetizados à partir de 5 mmol
das respectivas 4-cloro-1,3-difenil-2-propen-1-onas, contendo os substituintes de
Topliss (H, 4-CH3, 4-OCH3, 4-Cl e 3,4-Cl2) no anel A, previamente sintetizados a
partir das acetofenonas substituídas e do 4-clorobenzaldeído em meio básico
(NaOH) e etanol. Em seguida foi acrescentada a fenilhidrazina (6,5 mmol) e
carbonato de potássio (5 mmol), conforme descrito por Ghomi-Safael e
colaboradores (2006). A mistura foi submetida a refluxo com tempo reacional
variando de 30-180 minutos. O término da reação foi observado por cromatografia
em camada delgada. A reação foi vertida em água e gelo e o sólido formado foi
filtrado, lavado com água gelada e recristalizado em etanol.
Figura 7. Esquema geral da reação das 1,3,5-triaril-pirazolinas.
NH
O
Cl
NH2
R
N
R
Cl
MeOH/ K2CO3
R = H (58); 4-CH3 (60); 4-Cl (61); 4-OCH3 (62); 3,4-Cl2 (66)
N
56
4.2 Métodos teóricos para avaliação da estrutura-atividade
4.2.1 Regra dos cinco de Lipinski.
Modelos computacionais têm sido utilizados para estimar a solubilidade e
permeabilidade dos derivados sintetizados, baseando-se em parâmetros físicoquímicos propostos por Lipinski e colaboradores (2001). Esta regra prediz moléculas
com baixa absorção e permeabilidade, quando as mesmas apresentam mais de 5
doadores de ligação hidrogênio, acima de 10 aceptores de ligação hidrogênio, peso
molecular superior a 500 e valores de log P (ClogP) acima de 5 (ou MlogP > 4,15).
Os valores do peso molecular (PM), milog P, aceptores de ligação hidrogênio (N +
O), doadores de ligação hidrogênio (NH + OH), número de ligações rotáveis, área de
superfície polar e o número de violações foram obtidos a partir do programa “Free
molinspiration” disponibilizado on line, através do JME Editor, cortesia de Peter Ertl
da Novartis, disponível no site: http://www.molinspiration.com/cgi-bin/properties.
(SANTOS, 2008).
4.2.1.1 Previsão teórica da Regra dos 5 de Lipinski
Tabela 1. Previsão teórica da solubilidade e permeabilidade das 1,3,5-triaril-2-pirazolinas
segundo a “Regra dos 5” de Lipinsk.
N°
n.atom
logP
PM
n.
n.
n.lig.
ONa
OHNHb
rot.c
PSAd
n.viol.e
58
24
5,937
332,83
2
0
3
15,602
1
60
25
6,386
346,86
2
0
3
15,602
1
61
25
6,615
367,28
2
0
3
15,602
1
62
26
5,994
362,86
3
0
4
24,836
1
66
26
7,221
401,72
2
0
3
15,602
1
* Método de predição do LogP desenvolvido por Molispiration (milogP 2.2 – Novembro
2005)
a
Somatório das ligações aceptores e hidrogênio (N e O)
b
Somatório das lgações doadores de hidrogeno (NH e OH)
c
Número de ligações rotáveis
d
Área de superfície polar
e
Número de violações
57
4.2.2. Método de Topliss
A síntese desta série de compostos foi direcionada pelos substituintes
indicados segundo a metodologia manual de Topliss, que preconiza a variação em
um dos anéis aromáticos pelos substituintes: H, 4-CH3, 4-OCH3, 4-Cl e 3,4-Cl2. Esta
série de cinco derivados compreende uma seleção inicial para o direcionamento de
novos análogos. A ordem de potência avaliada nos modelos biológicos é organizada
na Tabela 2, a fim de determinar qual o parâmetro responsável pela atividade em
estudo. Neste modelo são avaliados os parâmetros lipofílicos (π), eletrônicos (σ) e
estéricos (Es) e uma combinação estatística dos parâmetros π e σ (π – σ, π - 2 σ, π
- 3 σ, π + σ, etc). Após a avaliação deste método pode-se estabelecer os próximos
análogos em uma tabela subsequente (TOPLISS, 1972) (não demonstrada).
Tabela 2: Ordem de potência para diversos parâmetros físico-químicos proposta por
Topliss.
Substituintes
Parâmetros físico-químicos de Topliss
π
2π– π 2
σ
π+σ
2π - σ
π-σ
Es
π - 2σ
σ π - 3σ
σ
3,4-Cl2
1
1-2
1
1
1
1-2
3-4
5
2-5
4-Cl
2
1-2
2
2
2-+3
3
3-4
3-4
2-5
4-CH3
3
3
4
3
2-3
1-2
1
1
2-5
4-OCH3
4-5
4-5
5
5
4
4
2
2
2-5
H
4-5
4-5
3
4
5
5
5
3-4
1
58
4.3 Animais
Foram utilizados camundongos Swiss Websters (20 a 35g) ambos os sexos, e
ratos Wistar machos (250 a 350g), aclimatizados a temperatura de 22 ± 2 °C com
ciclo claro/escuro de 12 horas, mantidos no biotério central da UNIVALI, tratados
com água e ração ad libitum. Os animais permaneceram no ambiente do teste por
aproximadamente 30 minutos antes da realização dos experimentos para
adaptação.
O número de animais utilizados por tratamento durante os experimentos foi
entre 6-8 por grupo. Os diferentes grupos foram pré-tratados com os compostos em
estudo
em
diferentes
doses
30
minutos
antes
do
teste
pela
via
i.p.
Comparativamente foi realizado um grupo controle negativo/veículo para cada
experimento, no qual os animais receberam apenas solução veículo nas mesmas
condições dos ensaios e um grupo controle positivo/fármaco referência. Após todos
os experimentos os animais foram eutanasiados em câmara de CO2.
Este estudo seguiu as recomendações do Guia de Uso e Cuidado com
Animais de Laboratório do National Institutes of Health (NIH) dos EUA (NIH n° 85-23,
revisado em 1996). O Comitê de ética e pesquisa para uso de animais da UNIVALI
aprovou os procedimentos experimentais (parecer número 532/09).
4.4 Reagentes
Os reagentes utilizados nos experimentos foram: os compostos derivados
pirazolínicos (Laboratório de síntese – UNIVALI), solução salina (NaCl 0,9%) , ácido
acético, 0,6%, ʎ-carragenina, SP, PGE2, BK, CFA, LPS (Todos Sigma Aldrich
Chemical Company, St Louis, MO, E.U.A.) Indometacina (Indo), Dexametasona
(Dex), Dipirona (Dip), Fenilbutazona (Fenil), Tween 80, Kits comerciais Labtest® para
a dosagem de uréia, creatinina, e Kits comerciais Labtest® para a determinação das
enzimas aspartato amino transferase (AST) e alanina amino transferase (ALT).
59
4.5 Ensaios Farmacológicos
4.5.1 Análise da Propriedade Antinociceptiva – Modelo de dor aguda.
4.5.1.1 Teste das contorções abdominais induzidas pelo ácido acético 0,6%
Este modelo foi utilizado para verificação da atividade antinociceptiva dos
compostos em estudo. Após o tratamento com os compostos C58, C61, C62 e C66
pela via i.p. nas doses 0,3 1 3 e/ou 10 mg/kg, esperou-se 30 minutos (i.p.), e
procedeu-se a injeção do ácido acético 0,6% (10 mL/Kg). Além dos compostos em
estudo, foi utilizado um grupo controle negativo/veículo, e um grupo controle positivo
tratado com Indometacina (10 mg/kg). Os animais foram colocados individualmente
em funis de vidro, e o número de contorções abdominais foi quantificado
cumulativamente durante um período de 20 minutos (FERREIRA et.al., 2000).
4.5.2 Análise da Propriedade Antinociceptiva – Modelo de dor persistente.
4.5.2.1 Hiperalgesia mecânica induzida pela ʎ-Carragenina
A indução da hiperalgesia inflamatória em camundongos foi realizada através
de injeção i.pl. de 50 µL de ʎ-carragenina (300 µg /sítio) na superfície plantar da pata
direita traseira. Esta dose é capaz de produzir edema, hiperalgesia e aumento
significativo do tamanho da pata injetada, porém os animais continuam
apresentando comportamento normal. Os animais foram pré-tratados com os
compostos C58, C60, C61, C62 e C66 pela via i.p. nas doses 0,3 1 e 3 mg/kg, 30
min antes da indução da hiperalgesia. Após os 30 minutos, os animais receberam
uma injeção i.pl. de ʎ-carragenina (300 µg/pata), e foram avaliados quanto a
hiperalgesia mecânica através do monofilamento de Von Frey 0,6g (VFH, Stoelting,
Chicago, USA), em diferentes tempos. Além dos derivados pirazolínicos, foi
realizado um grupo controle negativo tratado com o veículo utilizado para a diluição
dos compostos, e um grupo controle positivo tratado com Indometacina (10 mg/kg)
(DE CAMPOS et al., 1996; QUINTÃO et al., 2005), e dipirona 40 mg/kg.
60
4.5.2.2 Avaliação da hiperalgesia mecânica pelo monofilamento de Von frey
Para avaliar a hiperalgesia mecânica induzida por diferentes agentes
flogísticos, os animais foram individualmente colocados em compartimentos de
acrílico transparente (9 X 7 X 11cm), localizados em uma plataforma de arame
elevada para permitir o acesso à superfície ventral das patas traseiras. Os animais
foram aclimatizados por pelo menos 30 minutos antes da avaliação comportamental.
A frequência de resposta de retirada da pata, foi obtida através de 10 aplicações
(com duração de 1 segundo cada) do VFH 0,6g. Os estímulos foram realizados na
superfície plantar da pata traseira direita. Todos os grupos em estudo foram
submetidos a avaliação prévia e novamente re-avaliados em diferentes tempos de
acordo com cada protocolo experimental específico para cada agente indutor de
hiperalgesia utilizado.
4.5.2.3 Hiperalgesia mecânica induzida por outros agentes flogísticos
Os animais foram previamente tratados pela via i.p. com o derivado
pirazolínico C61 nas doses 0,3 1 e 3 mg/kg, antes da indução da hiperalgesia. Após
30 minutos do tratamento, os animais receberam uma injeção i.pl. do agente
flogístico e os tempos de leitura foram: PGE2 (0,1 nmol/pata), 1, 2, 4 e 6 h,
(MANJAVACHI et al., 2010) LPS
(SANTODOMINGO-GARZÓN
(100 ng/pata),0,5, 1, 2, 4, 6, 24 e 48 h
et al., 2006), BK (100 ng/pata),
1, 3 e 6 h,
(HAYASHI et al., 2001) ou CFA (20µL/pata), 1, 3, 4, 6, 24 e 48 h, (MANJAVACHI et
al., 2010, QUINTÃO et al., 2005). Os aimais foram avaliados quanto a hiperalgesia
mecânica através do VFH 0,6g, conforme descrito anteriormente,
em diferentes
tempos, de acordo com cada protocolo experimental.
4.5.3 Análise da Propriedade Antiedematogênica
4.5.3.1 Edema de pata induzido pela ʎ-Carragenina
A metodologia utilizada para a indução do edema de pata foi similar aquela
descrita por de Campos et al., (1996) com algumas adaptações. Para a realização
do experimento, os animais foram ligeiramente anestesiados com éter, antes da
61
injeção intraplantar de 50µL de solução salina contendo Cg (Cg, 300 µg/pata) na
pata direita e 50µL de solução salina (0,9%) na pata esquerda. Os diversos
derivados pirazolínicos C58, C60, C61, C62 e C66 foram administrados pela via i.p.
nas doses 0,3, 1 e 3 mg/kg, antes da indução do edema. A variação do volume da
pata foi expressa em µL, sendo que a diferença entre o volume da pata direita e
esquerda foi tomada como índice de edema. O edema de pata foi medido em
Pletismometro Ugo Basile®, nos intervalos de tempo de 0,5, 1, 2, 4, 6, 24 e 48 horas
após a injeção i. pl. de Cg. Para controle positivo neste experimento foi utilizada
Indometacina 10 mg/Kg (ERDEMOGLU et al., 2009).
4.5.3.2 Edema de pata induzido por outros agentes flogísticos
Os animais foram previamente tratados pela via i.p. com o derivado pirazolínico
C61 nas doses 0,3, 1 e 3 mg/kg, antes da indução do edema. Os seguintes agentes
flogísticos foram realizados, e as medidas do edema foram: SP 30 nmol/pata), leitura
realizada em 30, 60, 90, 120, 150 e 180 min, HIS 100 µg/pata, leitura realizada em
15, 30, 45, 60 e 120 min, PGE2, 3 nmol/pata, leitura realizada em 15, 30, 60 e 120
min,e BK, 3 nmo/pata, leitura realizada em 10, 20, 30, 60 e 120 min (CORREA;
CALIXTO, 1993). A variação do volume da pata foi expressa em µL, sendo que a
diferença entre o volume da pata direita e esquerda foi tomada como índice de
edema. O edema de pata foi medido em Pletismometro Ugo Basile®, em diferentes
intervalos de tempo.
4.5.4 Modelo de artrite induzida pelo CFA
4.5.4.1 Indução da Artrite induzida por CFA
Para a indução de artrite foram utilizados ratos machos Wistar (300-350 g). Os
animais foram divididos em grupos e tratados com o derivado pirazolínico C61 nas
doses 0,03, 0,1, 0,3, e 1mg/Kg i.p., controle negativo/veículo utilizado para a diluição
dos compostos i.p., controle positivo/fármacos referência: Dex (0,5 mg/kg, s.c.), Fenil
(80 mg/Kg v.o.) (PEDERNERA et al., 2006), Dip (40 mg/kg, i.p.) e Indo (5 mg/Kg, i.p.)
(BABU; PANDIKUMAR; IGNACIMUTHU, 2009). Após 30 min dos tratamentos pela
via i.p., 1h v.o. e 4h s.c., os animais foram anestesiados com éter e receberam uma
62
injeção intraplantar única de 100 µL de CFA na pata direita. Os mesmos tratamentos
foram repetidos por 22 dias consecutivos, a partir do primeiro dia de indução da
artrite (NEWBOLD, 1963; NAIR; SINGH; GUPTA, 2011).
4.5.4.2 Indíce de severidade de desenvolvimento da Artrite induzida por CFA
Os animais foram avaliados macroscopicamente quanto a severidade de
desenvolvimento da artrite. A metodologia utilizada para obter a pontução foi a
mesma descrita por DONALDSON; McQUEEN; SECKL, 1995. Os índices para a
pontuação foram: Índice zero = pata normal. Índice 1 = Leve vermelhidão. Índice 2 =
Vermelhidão moderada e inchaço. Índice 3 = Inchaço grave e lesões visíveis sobre
as articulações. Baseado em outros
autores foi avaliada a necessidade de
acrescentar mais um ponto no sistema de índices em função da gravidade de
instalação da artrite. Índice 4 = Inchaço grave, lesões e excesso de rigidez articular
(PAN et al., 2009) e deformidade do membro (andar arrastado) (LIU et al., 2008).
Os animais foram observados diariamente quanto a evolução da instalação do
processo inflamatório induzido pelo CFA, porém os índices foram quantificados nos
dias 3, 9, 15 e 21 após a injeção i.pl de CFA. Além disso, como medida clínica foi
incluído a determinação do peso corporal dos animais (PAN et al., 2009).
4.5.4.3 Avaliação do edema no modelo de Artrite induzido por CFA
Para a avaliação dos edemas decorrentes da indução de artrite pelo CFA, as
patas direita e esquerda dos animais foram medidas em Pletismometro Ugo Basile® a
cada 3 dias, após a indução, durante 21 dias (KIM et al., 2002; NAIR; SINGH;
GUPTA, 2011). A variação do volume da pata foi expressa em µL, sendo que a
diferença entre o volume da pata direita e esquerda foi utilizada como índice de
edema.
4.5.4.4 Avaliação da hiperalgesia mecânica pelo Von Frey eletrônico no modelo
de Artrite induzido por CFA
Para avaliar a nocicepção mecânica no modelo de artrite induzida pelo CFA, os
animais
foram
colocados
individualmente
em
compartimentos
de
acrílico
63
transparentes (17 x 13 x 22 cm, para ratos), localizados em uma plataforma de
arame elevada para permitir o acesso à superfície ventral das patas traseiras. Os
animais
foram
aclimatados
por
pelo
menos
1
hora
antes
dos
testes
comportamentais, em temperatura controlada, para determinar o limiar mecânico
basal. Após determinar esse parâmetro, os animais foram tratados com derivado
pirazolínico C61 e controles (como especificado no item 4.5.3.1).
A hiperalgesia mecânica dos animais foi avaliada através de um anestesiômetro
eletrônico Von Frey eletrônico, Insight® (VHF), que consiste em um transdutor de
pressão conectado a um contador digital de força expressa em gramas (g). O
contato do transdutor de pressão à pata dos animais foi realizado por meio de uma
ponteira descartável de polipropileno com 0,5 mm de diâmetro adaptada ao
transdutor de pressão. Entre as malhas da rede de arame, foi exercida uma pressão
linear crescente no centro da planta da pata do rato até que o animal produzisse
uma resposta caracterizada como sacudida (“flinch”) da pata estimulada.
Os estímulos foram repetidos até o animal apresentasse três medidas similares
com uma clara resposta de “flinch”. A intensidade de hiperalgesia foi quantificada
como a variação na pressão obtida subtraindo-se a média de três valores expressos
em gramas (força) observada antes do procedimento experimental (limiar basal dos
animais) da média de três valores em gramas (força) após a administração do
agente flogístico em diferentes intervalos de tempo (de acordo com o protocolo
experimental dos diferentes agentes flogísticos) (CUNHA et al., 2004; VIVANCOS et
al., 2004; QUINTÃO et al., 2005)
4.5.5. Determinação dos possíveis efeitos tóxicos no modelo de Artrite
induzido por CFA
Com o objetivo de avaliar o efeito cumulativo das doses do composto em
estudo, foram avaliados os possíveis efeitos tóxicos sobre o sistema hematopoiético,
sobre a função renal e sobre a função hepática. Os resultados obtidos foram
comparados
com
os
efeitos
da
Indometacina,
Dexametasona,
Dipirona,
Fenilbutazona.
No 22° dia de tratamento as patas dos animais foram fotografadas. Em seguida
os animais foram eutanasiados, para posterior coleta de sangue com anticoagulante
EDTA para as análises hematológicas, e soro para análises e bioquímicas. Em
64
seguida, foi realizada a extração do fêmur para a coleta das células da medula óssea,
e retirada dos órgãos: fígado e baço, servindo também como indicador de toxicidade.
O peso corporal foi determinado no início e no final do experimento (PEDERNERA et
al., 2006).
4.5.5.1 Avaliação do número de células do sangue periférico no modelo de
Artrite induzido por CFA
Para a avaliação de parâmetros hematológicos em sangue periférico após a
administração crônica do derivado pirazolônico C61 e controles, as amostras de
sangue foram coletas em tubos contendo anticogulante EDTA para a realização do
hemograma completo. O hemograma foi realizado em aparelho automatizado Micros
60 fornecendo parâmetros de eritrócitos (RBC x 106/µL), leucócitos (WBC x 103/µL),
hemoglobina (HGB g/dL), hematócrito (HTO %) e plaquetas (PLT x 103/µL).
(SAUZEM et al., 2009).
4.5.5.2 Avaliação do número total de células nucleadas da medula óssea no
modelo de Artrite induzido por CFA
Para a retirada das células da medula óssea, o fêmur de cada animal foi
extraído e cortado nas suas extremidade distais (epífises), e o seu canal interno foi
lavado com 3 mL de salina. Uma alíquota da suspenção celular obtida foi diluída em
salina e as suas células coradas com cristal violeta (0,5% em 30% de ácido acético)
para realizar a contagem das células na câmara de Neubauer com auxílio de
microscópio óptico comum em aumento de 400x (Figura 8).
Figura 8. Procedimento de coleta da medula óssea dos ratos utilizados no modelo de artrite
induzida pelo CFA (Fonte: Fotografia por Silvia Aparecida Ramos).
65
4.5.5.3 Avaliação da função hepática
Para avaliar os possíveis efeitos tóxicos sobre a função hepática após a
administração crônica do derivado pirazolínico C61 e dos controles positivos, foi
realizada a determinação da atividade das enzimas ALT e AST, sendo indicativos de
lesão hepática. As amostras de sangue dos animais foram coletadas em tubo gel,
separador de células, para a dosagem da atividade das enzimas ALT e AST. Após
20 min do procedimento de coleta, as amostras foram centrifugadas e
acondicionadas em freezer -20°, para posterior análise. A determinação da atividade
das respectivas enzimas foi realizada seguindo o protocolo experimental descrito na
bula
do
kit,
especificado
pelo
fabricante
LABTEST®.
A
determinação
espectrofotométrica foi realizada em aparelho semi automatizado STARDUST.
4.5.5.5 Avaliação da função renal
Para avaliar os possíveis efeitos tóxicos sobre a função renal após a
administração crônica do derivado pirazolínico C61 e dos controles positivos, foram
avaliados os parâmetros uréia e creatinina. Amostras de sangue dos animais foram
coletadas em tubo gel separador de células para a dosagem da concentração de
uréia (mg/dL) e creatinina (mg/dL). Após aproximadamente 30 min do procedimento
de coleta, as amostras foram centrifugadas e acondicionadas em freezer -20°, para
posterior análise. A determinação da concentração dos analitos foi realizada
seguindo o protocolo experimental descrito na bula do kit, especificado pelo
fabricante LABTEST®. A determinação espectrofotométrica foi realizada em aparelho
semi automatizado STARDUST.
4.5.6 Investigação de possíveis efeitos adversos e/ou colaterais
4.5.6.1 Avaliação da atividade motora através do Modelo do Campo Aberto
(Open-Field) em camundongos
O modelo de campo aberto visa investigar a possível influência dos
compostos sobre o SNC do animal, especificamente efeitos depressores, ansiolíticos
ou ansiogênicos. Na prática experimental é utilizado para avaliar estimulantes ou
66
depressores do SNC (DE SOUZA et al., 2003). Para verificar a possibilidade do C61
ter ação sobre o sistema locomotor dos animais, realizou-se o teste do campo
aberto. O campo aberto consiste em um aparato de acrílico transparente, com 60 cm
de diâmetro e borda de 50 cm de altura, com a parte inferior dividida em 12
quadrantes de área igual. Os animais foram avaliados individualmente durante 6
minutos, sendo o número de cruzamentos realizados com as quatro patas entre as
divisões, o parâmetro de análise. Para a realização do experimento, os animais
foram inicialmente pré-tratados via i.p. nas mesmas doses utilizadas nos ensaios e
morfina (5 mg/kg ou 13,3 µmol/kg, s.c).
4.5.6.2 Medida da temperatura retal em camundongos
A redução da temperatura retal é um dos efeitos indesejáveis observados em
muitos fármacos que são utilizados para o tratamento de processos dolorosos
crônicos (ZIMMERMANN, 2001) com o objetivo de verificar se o C61 produzia tal
efeito os animais foram tratados via i.p. nas doses utilizadas nos demais modelos
experimentais e a temperatura retal foi medida 1 hora após o tratamento, utilizando
um termômetro digital (B & D – NJ, EUA). A sonda (2 mm de diâmetro) foi
mergulhada em vaselina antes da inserção. O termômetro foi mantido no reto do
animal até a obtenção de leitura (20 segundos).
4.6 Análise Estatística
Os resultados foram apresentados como a média ± erro padrão da média
(EPM, 95%), exceto os valores DI50 (doses da droga que produziram uma inibição da
resposta em 50% em relação ao grupo controle), que são apresentadas como a
média geométrica acompanhada de seus respectivos limites de confiança, em nível
de 95%. As porcentagens de inibição foram citadas como a média ± erro padrão da
média da diferença (em porcentagem) entre as áreas sob as curvas (AUC) obtidas
para cada experimento individual em relação ao grupo controle correspondente. Em
alguns experimentos foram calculadas IM (porcentagem de inibição máxima do
efeito para a dose utilizada). A análise estatística dos dados foi realizada por meio
de análise de variância (ANOVA) de duas vias, seguido do teste de Bonferroni, de
análise de variância (ANOVA) de uma via seguida pelo teste de Dunett. Valores de p
67
menores que 0,05 (p<0,05) foram considerados como valores significantes. Todas
as análises citadas acima foram realizadas utilizando o programa Graphpad PRISM
5.0® ou Graphpad Instat®.
68
5 RESULTADOS
5.1 Efeitos dos derivados pirazolínicos sobre a nocicepção induzida pelo ácido
acético 0,6% em camundongos
Neste modelo foi avaliado o efeito dos compostos C58, C61, C62 e C66,
sobre a nocicepção aguda induzida por ácido acético. Os resultados em conjunto,
apresentados na Figura 9, demonstram que a administração i.p. dos derivados
pirazolínicos em estudo, foi capaz de produzir efeito antinociceptivo significativo nas
diferentes doses utilizadas.
Pode-se observar que C58, nas doses de 0,3 a 10 mg/Kg, reduziu de maneira
significativa o número de contorções abdominais induzidas pelo ácido acético. A
porcentagem de inibição máxima (IM) para a dose de 10 mg/kg deste composto foi
de 69 ± 4%. A Indometacina utilizada como controle positivo, na mesma dose,
apresentou resposta similar, com porcentagem de inibição de 67 ± 2%.
A administração i.p. do C61 nos animais apresentou uma expressiva redução
da resposta nociceptiva induzida pelo ácido acético, de forma dose dependente.
Com IM calculadas de 32 ± 4%, 60 ± 3%, 72 ± 3% para as doses 0,3, 1 e 3 mg/Kg
respectivamente, e DI50 de 1,12 (0,93 – 1,34) mg/Kg. Vale ressaltar que o C61 na
dose de 3 mg/Kg produziu efeito antinociceptivo similar ao fármaco de referência
utilizado como controle positivo, Indometacina, que apresentou IM de 75 ± 2%.
O número de contorções abdominais induzidas pelo ácido acético também foi
significativamente reduzido pelo C62. Obteve-se valores de IM de 60± 2% e 63 ± 2%
nas doses de 3 e 10 mg/Kg, respectivamnete, e DI50 de 2,04 (1,22 – 3,38) mg/Kg. A
Indometacina apresentou IM de 70 ± 3% na dose de 10 mg/Kg, neste caso o
composto C62 não apesentou melhores resultados quando compara-se ao fármaco
de referência, a Indometacina.
Assim como os demais compostos analisados, o C66 mostrou-se efetivo ao
inibir as contorções abdominais induzidas pelo ácido acético, apresentando IM de 37
± 4% e 67 ± 4% nas doses de 3 e 10 mg/Kg. A DI50 calculada no experimento foi de
5,96 (5,57 – 6,49 mg/Kg). A dose de 10 mg/Kg do C66, apresentou porcentagem de
inibição próximo ao da Indometacina que foi de 71 ± 2%.
69
Figura 9. Efeito das 1,3,5-triaril-pirazolinas sobre a contorção abdominal induzida pela
administração i.p. de ácido acético 0,6% em camundongos. (A) Efeito da 5-(4-clorofenil)-1,3difenil-4,5-dihidro-1H-pirazolina (C58). (B) Efeito da 3,5-bis(4-clorofenil)-1-fenil-4,5-dihidro1H-pirazolina (C61). (C) Efeito da 5-(4-clorofenil)-3-(4-metoxifenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1Hpirazolina (C62). (D) Efeito da 5-(4-clorofenil)-3-(3,4-diclorofenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1Hpirazolina (C66). Os animais receberam os tratamento nas diferentes doses (0,3 à 10 mg/kg
i.p.), Indometacina (10 mg/kg i.p.) ou veículo. O efeito antinociceptivo foi avaliado pelo
número de contorções abdominais 20 minutos após a injeção de ácido acético 0,6%. Cada
grupo representa a media de 6-8 animais e as barras verticais indicam os E.P.M. *P<0,05,
**P<0,01, ***P<0,001. A análise estatística utilizada foi ANOVA de uma via seguida pelo
post hoc Dunnett.
B
A
70
*
60
50
40
30
***
***
20
***
***
10
0
C
Ind
0,3
1
3
Número de Contorções Abdominais
Número de Contorções Abdominais
80
DI50 = 1,12 (0,93 - 1,34) mg/Kg
70
60
***
50
40
***
30
***
***
20
10
0
10
C
Ind
0,3
C58 (mg/Kg, i.p.)
3
D
C
DI50 = 2,04 (1,22 - 3,38 mg/Kg)
70
60
50
***
40
***
30
***
20
***
10
0
C
Ind
1
3
10
C62 (mg/Kg, i.p.)
Número de Contorções Abdominais
70
Número de Contorções Abdominais
1
C61 (mg/Kg, i.p.)
DI50 = 5,96 (5,57 - 6,49) mg/Kg
60
50
**
40
30
***
***
20
10
0
C
Ind
0,3
1
3
C66 (mg/Kg, i.p.)
10
70
5.2 Efeitos dos derivados pirazolínicos sobre o edema de pata induzido pela ʎcarragenina em camundongos
Neste modelo foi avaliado o efeito dos compostos C58, C60, C61, C62 e C66,
sobre o edema de pata induzido pela ʎ-carragenina. Na Figura 10 (A e B), pode-se
observar que o pré-tratamento i.p. com ocomposto C58 reduziu significativamente o
edema de pata induzido pela ʎ-carragenina, destacando-se a dose de 3mg/Kg,
exibindo melhor efeito antiedematogênico na 1° e 2°h após a indução do edema,
com inibição de 30 ± 4%. As demais doses utilizadas foram praticamente
equipotentes.
Entretanto, o efeito antiedematogênico foi inferior ao fármaco de
referência Indometacina (68 ± 6%), utilizado na dose de 10 mg/Kg (ZHANG et al.,
2009b).
Figura 10. Efeito da 5-(4-clorofenil)-1,3-difenil-4,5-dihidro-1H-pirazolina (C58), sobre o
edema de pata induzido pela administração i.pl. de ʎ-carragenina em camundongos. Os
animais receberam o tratamento de C58 (0,3, 1 e 3 mg/Kg, i.p.), Indometacina (10 mg/Kg,
i.p.), ou veículo. Após 30 min os animais receberam injeção i.pl. de ʎ-carragenina (300
µg/pata) na pata direita e solução salina na pata esquerda. Cada grupo representa a media
de 4-6 animais e as barras verticais indicam os E.P.M. *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0, 001. A
análise estatística utilizada foi ANOVA de duas vias para a variação no volume das patas
(A), e ANOVA de uma via para a análise da AUC (B), seguidos de post hoc Bonferroni e
Dunnet, respectivamente.
A
100
Carragenina (300µ
µg/pata)
Indometacina (10 mg/Kg, i.p.)
C58 (0,3 mg/Kg, i.p.)
C58 (1 mg/Kg, i.p.)
C58 (3 mg/Kg, i.p)
B
700
80
600
70
500
60
50
AUC
∆ do volume da pata ( µ L)
90
40
30
20
*** ***
***
10
0
0.5 1
**
400
300
***
200
**
**
***
***
***
**
*
***
*
***
2
4
6
24
48
Tempo (horas)
** ***
100
0
Cg
Indo
0,3
1
3
C58 (mg/Kg, i.p.)
71
A administração i.p. do composto C60, em todas as doses utilizadas, foi
capaz de inibir significativamente o edema de pata induzido por ʎ-carragenina,
conforme demonstram os resultados obtidos e expressos na Figura 11 (A e B). Os
efeitos foram observados desde o início da formação do edema, destacando as
doses de 1 e 3 mg/Kg, que apresentaram inibição de 45 ± 4% e 47 ± 3%,
respectivamente, tal efeito foi inferior ao observado com a Indometacina 10 mg/Kg
que apresentou inibição de 58 ± 2%.
Figura 11. Efeito da 5-(4-clorofenil)-3-(4-metilfenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1H-pirazolina (C60),
sobre o edema de pata induzido pela administração intraplantar de ʎ-carragenina em
camundongos. Os animais receberam o tratamento de C60 (0,3, 1 e 3 mg/Kg, i.p.),
Indometacina (10 mg/Kg, i.p.), ou veículo. Após 30 min os animais receberam injeção i.pl. de
ʎ-carragenina (300 µg/pata) na pata direita e solução salina na pata esquerda. Cada grupo
representa a media de 6-8 animais e as barras verticais indicam os E.P.M. *p<0,05, **p<0,01
e ***p<0, 001. A análise estatística utilizada foi ANOVA de duas vias para a variação no
volume das patas (A), e ANOVA de uma via para a análise da AUC (B), seguidos de post
hoc Bonferroni e Dunnet, respectivamente.
Carragenina (300 µ g/pata)
Indometacina (10 mg/Kg, i.p.)
C60 (0,3 mg/Kg, i.p.)
C60 (1 mg/Kg, i.p.)
C60 (3 mg/Kg, i.p.)
A
B
80
600
60
500
50
40
30
20
10
0
***
400
AUC
∆ do volume da pata (µ
µ L)
70
***
***
***
***
***
***
***
***
***
***
***
0,5 1
2
***
**
***
***
***
***
***
4
6
Tempo (horas)
300
***
200
***
*
***
*
**
24
48
*** ***
100
0
Cg
Indo
0,3
1
3
C60 (mg/Kg, i.p.)
72
O mesmo perfil farmacológico foi observado no pré-tratamento com o
composto
C61,
apresentando
também
uma
atividade
antiedematogênica
significativa, Figura 12 (A e B), evidenciada desde o início da formação do edema.
Os percentuais de inibição obtidos foram muito similares ao composto descrito
anteriormente (C60), sendo que a dose de 1 mg/Kg apresentou um percentual de
inibição de 43 ± 2% e a dose de 3 mg/Kg de 48 ± 2%. Ambas as doses
apresentaram-se menos efetivas que a Indometacina 53 ± 4%.
Figura 12. Efeito da 3,5-bis(4-clorofenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1H-pirazolina (C61), sobre o
edema de pata induzido pela administração intraplantar de ʎ-carragenina em camundongos.
Os animais receberam o tratamento de C61 (0,3, 1 e 3 mg/Kg, i.p.), Indometacina (10
mg/Kg, i.p.), ou veículo. Após 30 min os animais receberam injeção i.pl. de ʎ-carragenina
(300 µg/pata) na pata direita e solução salina na pata esquerda. Cada grupo representa a
media de 6-8 animais e as barras verticais indicam os E.P.M. *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,
001. A análise estatística utilizada foi ANOVA de duas vias para a variação no volume das
patas (A), e ANOVA de uma via para a análise da AUC (B), seguidos de post hoc Bonferroni
e Dunnet, respectivamente.
Carragenina (300 µg/pata)
Indometacina (10 mg/Kg, i.p.)
C61 (0,3 mg/Kg, i.p.)
C61 (1 mg/kg, i.p.)
C61 (3 mg/Kg, i.p.)
A
B
90
600
70
500
60
40
30
20
10
0
***
400
50
AUC
∆ do volume da pata ( µ L)
80
***
***
****
***
***
***
***
***
***
***
***
**
*
***
0.5 1
2
4
***
***
***
***
6
Tempo (horas)
***
300
*** ***
200
***
***
***
***
***
***
***
24
48
100
0
Cg
Indo
0,3
1
3
C61 (mg/Kg, i.p.)
73
Na Figura 13 (A e B), é possível observar que o pré-tratamento dos animais
com o composto C62 foi capaz de reduzir significativamente o edema induzido pela
ʎ-carragenina, apenas na dose de 1 mg/Kg, as demais doses não produziram efeito
antiedematogênico significativo. Tal efeito passou a ser observado a partir da 4a h,
após a indução do edema e persistiu até a 24h, sendo que a IM para a dose de 1
mg/Kg foi de 22 ± 6%.
Figura 13. Efeito da 5-(4-clorofenil)-3-(4-metoxifenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1H-pirazolina (C62),
sobre o edema de pata induzido pela administração intraplantar de ʎ-carragenina em
camundongos. Os animais receberam o tratamento de C62 (0,3, 1 e 3 mg/Kg, i.p.),
Indometacina (10 mg/Kg, i.p.), ou veículo. Após 30 min os animais receberam injeção i.pl. de
ʎ-carragenina (300 µg/pata) na pata direita e solução salina na pata esquerda. Cada grupo
representa a media de 6-8 animais e as barras verticais indicam os E.P.M. *p<0,05, **p<0,01
e ***p<0, 001. A análise estatística utilizada foi ANOVA de duas vias para a variação no
volume das patas (A), e ANOVA de uma via para a análise da AUC (B), seguidos de post
hoc Bonferroni e Dunnet, respectivamente.
A
110
Carragenina (300 µg/pata)
Indometacina (10 mg/Kg, i.p.)
C62 (0,3 mg/Kg, i.p)
C62 (1 mg/Kg, i.p.)
C62 (3 mg/Kg, i.p.)
B
100
80
600
70
500
60
**
50
**
40
30
**
**
20
***
**
***
10
0
0.5 1
2
4
Tempo (horas)
**
400
AUC
∆ do volume da pata ( µ L)
90
6
***
24
300
***
200
*
48
100
0
Cg
Indo
0,3
1
3
C62 (mg/Kg, i.p.)
74
A última molécula testada neste modelo foi a pirazolina C66. Decorridos 30
minutos após a indução do edema, pode-se observar grande semelhança no perfil
de atividade quando comparado com o composto C62. O composto C66 apresentou
melhor atividade antiedematogênica na dose de 1mg/Kg com uma IM de 29 ± 7%,
Figura 14 (A e B). Este efeito pode ser observado desde a 1ª até a 4ª h, após a
indução do edema.
Figura 14. Efeito da 5-(4-clorofenil)-3-(3,4-diclorofenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1H-pirazolina
(C66), sobre o edema de pata induzido pela administração intraplantar de ʎ-carragenina em
camundongos. Os animais receberam o tratamento de C66 (nas doses de 0,3 - 1 e 3 mg/Kg,
i.p.), Indometacina (10 mg/Kg, i.p.), ou veículo. Após 30 min os animais receberam injeção
i.pl. de Cg (300 µg/pata) na pata direita e solução salina na pata esquerda. Cada grupo
representa a media de 6-8 animais e as barras verticais indicam os E.P.M. *p<0,05, **p<0,01
e ***p<0,001. A análise estatística utilizada foi ANOVA de duas vias para a variação no
volume das patas e ANOVA de uma via para a análise da área sobre a curva, seguidos de
post hoc Bonferroni e Dunnet, respectivamente.
Carragenina (300 µg/pata)
Indometacina (10 mg/Kg, i.p.)
C66 (0,3 mg/Kg, i.p.)
C66 (1 mg/Kg, i.p.)
C66 (3 mg/Kg, i.p.)
A
B
100
80
700
70
600
60
500
50
*
40
30
20
*
***
***
**
**
***
***
10
0
AUC
∆ do volume da pata ( µ L)
90
300
2.0
4.0
6.0
Tempo (horas)
***
200
***
***
24
48
100
0
0.5 1.0
**
400
Cg
Indo
0,3
1
3
C66 (mg/Kg i.p.)
75
5.3 Efeitos dos derivados pirazolínicos sobre a hiperalgesia mecânica induzida
pela ʎ-carragenina em camundongos
Na figura 15 (A e B) são demonstradosos resultados obtidos após a
administração i.p. do composto C58, no modelo de hiperalgesia mecânica induzida
pela ʎ-carragenina. Pode-se observar que o C58 não foi capaz de inibir de maneira
significativa a hiperalgesia mecânica nos animais, quando comparado com o grupo
controle negativo. Pode-se observar inibição significativa apenas no controle positivo
utilizado, Indometacina, com inibição de 86 ± 8%. O gráfico B (Figura15), apresenta
a AUC com porcentagens de inibição de 15 ± 6% e 15 ± 8% nas doses de 0,3 e 1
mg/Kg, respectivamente.
Figura 15. Efeito da 5-(4-clorofenil)-1,3-difenil-4,5-dihidro-1H-pirazolina (C58), sobre a
hiperalgesia induzida pela administração i.pl. de ʎ-carragenina em camundongos. Os
animais receberam o pré-tratamento do C58 (0,3, 1 e 3 mg/kg i.p.), Indometacina (10 mg/kg
i.p.), Dipirona (40 mg/Kg, i.p.) ou veículo. Após 30 min os animais receberam injeção i.pl. ʎcarragenina (300 µg/pata). Cada grupo representa a media de 6-8 animais e as barras
verticais indicam os E.P.M. *P<0,05, **P<0,01 e ***P<0, 001. A análise estatística foi
realizada com ANOVA de duas vias para a freqüência de resposta (A), e ANOVA de uma via
para a análise da área sobre a curva (AUC) (B), seguidos de post hoc Bonferroni e Dunnet,
respectivamente.
B
80
70
60
600
50
500
40
400
30
20
***
**
*
10
***
*** ***
* **
AUC
Freqüência de resposta (%)
A
Carragenina (300 µg/pata)
Indometacina (10 mg/Kg, i.p.)
Dipirona (40 mg/Kg, i.p.)
C58 (0,3 mg/Kg i.p.)
C58 (1 mg/Kg i.p.)
C58 (3 mg/Kg i.p.)
***
***
200
***
***
3
4
6
Tempo (h)
24
***
100
0
B 1
***
300
48
0
Basal Cg
Ind
Dip
0,3
1
3
C58 (mg/Kg, i.p.)
76
Na Figura 16 (A e B) é possível observar que o tratamento i.p com o
composto C60 nas doses 0,3, 1 e 3 mg/Kg foi capaz de inibir significativamente a
sensibilidade mecânica induzida pela ʎ-carragenina, de forma dose-dependente.
Vale ressaltar que as doses de 1 e 3 mg/Kg foram mais efetivas a partir da terceira
até a sexta hora de avaliação. As IMs obtidas foram de 49 ± 6% para a dose de 1
mg/Kg e 64 ± 5% para a dose de 3 mg/Kg, e DI50 calculada de 2,52 (2,35 - 2,70)
mg/Kg. A dose de 3 mg/Kg do C60 apresentou IM ligeiramente maior, em relação ao
controle positivo dipirona 40 mg/kg, o qual foi obtida IM 62 ± 5%. No entanto,
compararmos o efeito inibitório desta dose do composto C60 com o outro controle
positivo utilizado, a Indometacina na dose de 10 mg/Kg apresentou IM de 72 ± 9%,
maior do que o C60.
Figura 16. Efeito da 5-(4-clorofenil)-3-(4-metilfenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1H-pirazolina (C60),
sobre a hiperalgesia induzida pela administração i.pl. de ʎ-carragenina em camundongos.Os
animais receberam o pré-tratamento do C60 (0,3, 1 e 3 mg/kg i.p.), Indometacina (10 mg/kg
i.p.), Dipirona (40 mg/Kg, i.p.) ou veículo. Após 30 min os animais receberam injeção i.pl. ʎcarragenina(300 µg/pata). Cada grupo representa a media de 6-8 animais e as barras
verticais indicam os E.P.M. *P<0,05, **P<0,01 e ***P<0, 001. A análise estatística foi
realizada com ANOVA de duas vias para a freqüência de resposta (A), e ANOVA de uma via
para a análise da área sobre a curva (AUC) (B), seguidos de post hoc Bonferroni e Dunnet,
respectivamente.
Carragenina (300 µg/pata)
Indometacina (10 mg/Kg, i.p.)
A
Dipirona (40 mg/Kg, i.p.)
C60 (0,3 mg/Kg, i.p.)
C60 (1 mg/Kg, i.p.)
C60 (3 mg/Kg, i.p.)
B
80
60
500
50
400
*
40
AUC
Freqüência de resposta (%)
70
30
***
***
***
***
20
10
***
***
****
***
0
B 1
3
***
***
*
***
***
***
6
24
4
Tempo (h)
*
48
300
***
*** ***
200
***
100
0
Basal Cg
Ind
Dip
0,3
1
3
C60 (mg/kg, i.p.)
77
Os resultados apresentados na Figura 17 (A e B), demonstram que o
tratamento pela via i.p. com o composto C61, inibiu significativamente a hiperalgesia
mecânica induzida pela ʎ-carragenina. Observa-se que o efeito do tratamento com o
composto nas doses de 1 e 3 mg/Kg perdurou das 3 até 48h. As IMs calculadas para
estas doses foram respectivamente, de 67 ± 6% e 71 ± 10%. Pode-se observar que
os resultados obtidos para este composto foram similares aos obtidos com os
controles positivos Indometacina 76 ± 7% e Dipirona 64 ± 5%.
Figura 17. Efeito da 3,5-bis(4-clorofenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1H-pirazolina (C61), sobre a
hiperalgesia induzida pela administração i.pl. de ʎ-carragenina em camundongos. Os
animais receberam o pré-tratamento do C61 (0,3, 1 e 3 mg/kg i.p.), Indometacina (10 mg/kg
i.p.), Dipirona (40 mg/Kg, i.p.) ou veículo. Após 30 min os animais receberam injeção i.pl. ʎcarragenina (300 µg/pata). Cada grupo representa a media de 6-8 animais e as barras
verticais indicam os E.P.M. *P<0,05, **P<0,01 e ***P<0, 001. A análise estatística foi
realizada com ANOVA de duas vias para a freqüência de resposta (A), e ANOVA de uma via
para a análise da área sobre a curva (AUC) (B), seguidos de post hoc Bonferroni e Dunnet,
respectivamente.
Carragenina (300 µg/pata)
Indometacina (10 mg/Kg)
Dipirona (40 mg/Kg)
B
60
500
400
40
20
***
***
**
***
***
***
***
***
****
***
AUC
Freqüência de Resposta (%)
A 80
C61 (0,3 mg/Kg i.p.)
C61 (1 mg/Kg i.p.)
C61 (3 mg/Kg i.p.)
***
***
***
***
0
B 1
3
4
Tempo (h)
6
**
**
***
***
**
**
24
48
300
***
200
*** ***
***
100
0
Basal Cg
Ind
Dip
0,3
1
3
C61 (mg/kg, i.p.)
78
Em
relação
ao
composto
obteve-se
C62,
uma
melhor
resposta
antihiperalgésia na dose intermediária de 1 mg/Kg com IM de 47 ± 11%, já a dose de
3 mg/Kg apresentou IM de 35 ± 12% (Figura 18 A e B). Neste experimento os
controles positivos utilizados demonstraram IM 81 ± 5% Indometacina e 64 ± 6%
Dipirona.
Figura 18. Efeito da 5-(4-clorofenil)-3-(4-metoxifenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1H-pirazolina (C62),
sobre a hiperalgesia induzida pela administração i.pl. de ʎ-carragenina em camundongos.
Os animais receberam o pré-tratamento do C62 (0,3, 1 e 3 mg/kg i.p.), Indometacina (10
mg/kg i.p.), Dipirona (40 mg/Kg, i.p.) ou veículo. Após 30 min os animais receberam injeção
i.pl. ʎ-carragenina (300 µg/pata). Cada grupo representa a media de 6-8 animais e as barras
verticais indicam os E.P.M. *P<0,05, **P<0,01 e ***P<0, 001. A análise estatística foi
realizada com ANOVA de duas vias para a freqüência de resposta (A), e ANOVA de uma via
para a análise da área sobre a curva (AUC) (B), seguidos de post hoc Bonferroni e Dunnet,
respectivamente.
Carragenina (300 µg/pata)
Indometacina (10 mg/Kg, i.p.)
A
Dipirona (40 mg/Kg, i.p.)
C62 (0,3 mg/Kg, i.p.)
C62 (1 mg/Kg, i.p.)
C62 (3 mg/Kg, i.p.)
B
80
60
500
50
400
40
30
20
*
10
***
****
***
***
**
*
AUC
Freqüência de resposta (%)
70
***
***
***
**
**
*
24
48
300
B 1
3
4
6
Tempo (h)
0,3
1
*
***
100
0
0
***
200
*
**
Basal Cg
Ind
Dip
3
C62 (mg/kg, i.p.)
O último composto testado neste modelo foi o C66, os resultados
apresentados na Figura 19 (A e B), demonstram uma discreta atividade antihiperalgésica, porém significativa na dose de 0,3 mg/Kg com uma IM de 24 ± 2%.
79
Figura 19. Efeito da 5-(4-clorofenil)-3-(3,4-diclorofenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1H-pirazolina
(C66), sobre a hiperalgesia induzida pela administração i.pl. de ʎ-carragenina em
camundongos. Os animais receberam o pré-tratamento do C66 (0,3, 1 e 3 mg/kg i.p.),
Indometacina (10 mg/kg i.p.), Dipirona (40 mg/Kg, i.p.) ou veículo. Após 30 min os animais
receberam injeção i.pl. ʎ-carragenina (300 µg/pata. Cada grupo representa a media de 6-8
animais e as barras verticais indicam os E.P.M. *P<0,05, **P<0,01 e ***P<0, 001. A análise
estatística foi realizada com ANOVA de duas vias para a freqüência de resposta (A), e
ANOVA de uma via para a análise da área sobre a curva (AUC) (B), seguidos de post hoc
Bonferroni e Dunnet, respectivamente.
Carragenina (300 µg/pata)
Indometacina (10 mg/Kg, i.p.)
Dipirona (40 mg/Kg, i.p.)
C66 (0,3 mg/Kg, i.p.)
C66 (1 mg/Kg, i.p.)
C66 (3 mg/Kg, i.p.)
A
B
70
500
60
50
400
40
300
30
20
***
*
*** ***
***
***
10
AUC
Freqüência de resposta (%)
80
***
***
***
***
**
**
0
3
4
6
24
48
*
Dip
0,3
***
200
100
0
B 1
*
Basal Cg
Ind
Tempo (h)
1
3
C66 (mg/kg, i.p.)
De forma geral, embora todos os compostos analisados tenham apresentado
atividade antiedematogênica significativa, nenhum deles foi tão efetivo quanto a
indometacina utilizada nos experimentos como controle positivo. Os compostos C60
e C61 tiveram IMs equiparáveis a Indometacina na dose de 3 mg/Kg, porem não
superior.
Ao avaliar os resultados obtidos nos modelos de nocicepção induzida pelo
ácido acético e hiperalgesia induzida pela ʎ-carragenina, pode-se observar que as
pirazolinas C60 e C61, destacaram-se nestes modelos, demonstrando maiores
atividades antinociceptivas e antihiperalgésicas.
A Tabela 3 fornece um panorama geral dos resultados obtidos nestes testes
preliminares.
A
partir
de
então,
optou-se
dar
continuidade
aos
ensaios
80
farmacológicos apenas com o composto C61, uma pirazolina que apresentou
maiores percentuais de inibição no modelo de dor induzida pelo ácido acético e no
modelo de hiperalgesia mecânica induzida pela ʎ-carragenina. Os resultados obtidos
no modelo de edema de pata induzido pela ʎ-carragenina não evidenciou uma
melhor molécula ou o grupo substituinte de melhor ação.
Tabela 3: Resultados das DI50 e % de inibição dos derivados pirazolínicos.
Pirazolinas
Ácido Acético
DI50
DI50
10 (mg/Kg)
mg/Kg
µmol
% de inibição
3 (mg/Kg)
C58 (H)
58 ± 2%
70 ± 5%
-
-
C60 (4-CH3)
58 ± 2%*
96 ± 2%*
2,57 (2,10 – 3,15)
7,40 (6,04 – 9,09)
C61 (4-Cl)
72 ± 3%
92 ± 2%*
1,12 (0,93 – 1,34)
3,05 (2,53 – 3,65)
C62 (4-OCH3)
61 ± 2%
63 ± 2%
2,04 (1,22 – 3,38)
5,62 (3,36 – 9,31)
C66 (3,4-Cl2)
37 ± 4%
67 ± 4%
5,96 (5,57 – 6,49)
14,84 (13,86–16,15)
Pirazolinas
Hiperalgesia (Cg)
DI50
DI50
% de inibição
1mg/Kg
3mg/Kg
mg/Kg
µmol
C58 (H)
16 ± 8%
5 ± 3%
-
-
C60 (4-CH3)
49 ± 6%
64 ± 5%
2,52 (2,35 - 2,70)
7,27 (6,77 – 7,78)
C61 (4-Cl)
67 ± 6%
71 ± 10%
-
-
C62 (4-OCH3)
47 ± 11%
35 ± 12%
-
-
C66 (3,4-Cl2)
12 ± 6%
24 ± 2%
-
-
DI50
DI50
Pirazolinas
Edema de Pata (Cg)
% de inibição
1mg/Kg
3mg/Kg
mg/Kg
µmol
C58 (H)
22 ± 4%
30 ± 4%
-
-
C60 (4-CH3)
45 ± 4%
47 ± 3%
-
-
C61 (4-Cl)
43 ± 2%
48 ± 2%
-
-
C62 (4-OCH3)
23 ± 6%
13 ± 3%
-
-
C66 (3,4-Cl2)
29 ± 7%
6 ± 3%
-
-
*Valores obtidos a partir de estudos preliminares, DOS SANTOS, 2008.
81
5.4 Efeitos do 3,5-bis(4-clorofenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1H-pirazolina (C61), sobre
o edema de pata induzido por diferentes agentes flogísticos em camundongos
Diante da melhor atividade do C61 nos modelos utilizados nos ensaios
preliminares, foi dado continuidade a uma investigação farmacológica mais
específica utilizando outros agentes indutores de processos inflamatórios e/ou
doloroso, com a finalidade de direcionar um possível mecanismo de ação desta
molécula. A princípio o agente flogístico utilizado para investigar um possível
mecanismo de ação do C61, foi a BK. A Figura 20 (A e B) apresenta os resultados
obtidos com o pré-tratamento com C61 após a indução do edema de pata induzida
pela BK, onde foi possível observar que todas as doses avaliadas mostraram
significativo efeito antiedematogênico, porém de maneira não dose-dependente.
Neste experimento ficou evidenciada a maior atividade do composto na dose de 1
mg/kg, que apresentou IM de 50 ± 2%, mais efetiva que o fármaco referência,
Indometacina, que apresentou IM de 46 ± 4%.
Figura 20. Efeito da 3,5-bis(4-clorofenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1H-pirazolina (C61) sobre o
edema de pata induzido pela administração i.pl. de BK em camundongos. Os animais
receberam o pré-tratamento com C61 (0,3 - 1 e 3 mg/Kg, i.p.), Indometacina (10 mg/Kg, i.p.),
ou veículo. Após 30 min os animais receberam injeção i.pl. de BK (3 nmol/pata) na pata
direita e solução salina na pata esquerda. Cada grupo representa a media de 6-8 animais e
as barras verticais indicam os E.P.M. *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001. A análise estatística
foi realizada utilizando ANOVA de duas vias para a variação no volume das patas (A), e
ANOVA de uma via para a análise da área sobre a curva (B), seguidos de post hoc
Bonferroni e Dunnet, respectivamente.
B K (3 nm o l/p ata)
Ind o m eta cin a (10 m g /K g, i.p .)
C 61 (0,3 m g /K g, i.p .)
C 61 (1 m g /K g, i.p .)
C 61 (3 m g /K g, i.p .)
A
B
60
40
50
30
40
AUC
∆ do volume da pata ( µ L)
50
20
**
10
**
***
10
0
20
**
**
20
**
*
0
10
***
30
30
T em p o (m in u to s)
60
120
C
Ind
0,3
1
3
C 61 (mg/K g , i.p.)
B rad icinin a (3 n mol/p ata)
82
Os resultados obtidos no modelo de edema de pata induzido pela HIS são
demonstrados na figura 21 (A e B). Pode-se observar que o composto C61 provocou
uma redução significativa (P< 0,01) do edema induzido pela HIS, no entanto, a
menor dose 0,3 mg/Kg, foi a que apresentou melhor percentual de inibição 30 ± 4%,
com melhor atividade nos tempos de 45 e 60 minutos após a indução do edema.
Este resultado pode ser comparado com a Indometacina, que apresentou inibição de
31 ± 4%.
Figura 21. Efeito da 3,5-bis(4-clorofenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1H-pirazolina (C61) sobre o
edema de pata induzido pela administração i.pl. de HIS em camundongos. Os animais
receberam o pré-tratamento de C61 (0,3 - 1 e 3 mg/Kg, i.p.), Indometacina (10 mg/Kg, i.p.),
ou veículo. Após 30 min os animais receberam injeção i.pl. de histamina (HIS – 100 µg/pata)
na pata direita e solução salina na pata esquerda. Cada grupo representa a media de 6-8
animais e as barras verticais indicam os E.P.M. *P<0,05, **P<0,01 e ***P < 0, 001. A análise
estatística foi realizada utilizando ANOVA de duas vias para a variação no volume das patas
(A), e ANOVA de uma via para a análise da área sobre a curva (B), seguidos de post hoc
Bonferroni e Dunnet, respectivamente.
Histamina (100 µg/pata)
Indometacina (10 mg/Kg, i.p.)
C61 (0,3 mg/Kg, i.p.)
C61 (1 mg/kg, i.p.)
C61 (3 mg/Kg, i.p.)
A
B
120
110
400
90
80
70
*
**
60
50
40
300
***
***
***
***
30
20
***
***
**
***
10
0
15
30
45
60
Tempo (minutos)
AUC
∆ do volume da pata ( µ L)
100
*
**
120
***
***
Ind
0,3
**
***
200
100
0
C
1
3
C61 (mg/Kg)
Histamina (100 µg/pata)
O pré-tratamento sistêmico via i.p. com o C61, foi capaz de reduzir de
maneira significativa e dose dependente a formação do edema induzido pela PGE2,
observado na figura 22 (A e B). Com inibições calculadas de 27 ± 2%, 35 ± 4%, 40 ±
4% para as respectivas doses, 0,3, 1 e 3 mg/Kg. A atividade da pirazolina ocorreu
83
desde o início da avaliação da formação do edema, extendendo-se até os 60
minutos após indução. Nenhuma das doses testadas, apresentou inibição maior do
que a da Indometacina que foi de 53,3 ± 2%.
Figura 22. Efeito da 3,5-bis(4-clorofenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1H-pirazolina (C61) sobre o
edema de pata induzido pela administração i.pl. de PGE2 em camundongos. Os animais
receberam o pré-tratamento de C61 (0,3 - 1 e 3 mg/Kg, i.p.), Indometacina (10 mg/Kg, i.p.),
ou veículo. Após 30 min os animais receberam injeção i.pl. de PGE2 (3 nmol/pata) na pata
direita e solução salina na pata esquerda. Cada grupo representa a media de 6-8 animais e
as barras verticais indicam os E.P.M. *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001. A análise estatística
foi realizada utilizando ANOVA de duas vias para a variação no volume das patas (A), e
ANOVA de uma via para a análise da área sobre a curva (B), seguidos de post hoc
Bonferroni e Dunnet, respectivamente.
A 70
PGE2 (100 ng/pata)
Indometacina (10 mg/Kg, i.p.)
C61 (0,3 mg/Kg, i.p.)
C61 (1 mg/kg, i.p.)
C61 (3 mg/Kg, i.p.)
B
50
150
40
30
20
10
0
100
***
***
**
***
***
***
***
15
30
***
AUC
∆ Volume de pata ( µ L)
60
***
*
***
60
***
50
0
120
***
PGE2
Tempo (Minutos)
Ind
0,3
1
***
3
C61 (mg/Kg)
PGE2 (3 nmol/pata)
Conforme demonstrado na Figura 23 (A e B), o efeito antiedematogênico do
C61, é observado logo após a injeção i.pl. da SP. Neste caso, observou-se maior
inibição com a maior dose utilizada, 3 mg/Kg, nos tempos de leitura de 30 e de 90
minutos após a injeção i.pl. de SP, com IM de 28 ± 6%. A inibição calculada para o
controle positivo utilizado, Indometacina foi de 45 ± 5%.
84
Figura 23. Efeito da 3,5-bis(4-clorofenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1H-pirazolina (C61) sobre o
edema de pata induzido pela administração i.pl. de SP em camundongos. Os animais
receberam o pré-tratamento de C61 (0,3 - 1 e 3 mg/Kg, i.p.), Indometacina (10 mg/Kg, i.p.),
ou veículo. Após 30 min os animais receberam injeção i.pl. de SP (30 nmol/pata) na pata
direita e solução salina na pata esquerda. Cada grupo representa a media de 6-8 animais e
as barras verticais indicam os E.P.M. *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001. A análise estatística
foi realizada utilizando ANOVA de duas vias para a variação no volume das patas (A), e
ANOVA de uma via para a análise da área sobre a curva (B), seguidos de post hoc
Bonferroni e Dunnet, respectivamente.
B
200
40
150
AUC
∆ Volume da pata ( µ L)
A 60
Substância P (30 nmol/pata)
Indometacina (10 mg/Kg, i.p.)
C61 (0,3 mg/Kg, i.p.)
C61 (1 mg/kg, i.p.)
C61 (3 mg/Kg, i.p.)
20
***
**
**
*
100
0
0
60
90
*
0,3
1
***
*
50
**
*
30
*
120
Tempo (minutos)
150
180
SP
Ind
3
C61 (mg/Kg)
Substancia P (30 nmol/pata)
5.5 Efeitos do 3,5-bis(4-clorofenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1H-pirazolina (C61), sobre
a hiperalgesia mecânica induzida por diferentes agentes flogísticos em
camundongos
A fim de avaliar um possível mecanismo de ação do C61 frente a sua
atividade anti-hiperalgésica, outros agentes flogísticos foram utilizados. A avaliação
da resposta anti-hiperalgésica induzida pela injeção i.pl. de BK também foi avaliada
após o pré-tratamento via i.p. com o C61. Foi observado que apenas as doses de 1
e 3 mg/Kg, apresentaram inibições significativas da freqüência de resposta induzida
pela BK, ilustrado na Figura 24 (A e B). As IM para este modelo foram de 64 ± 5% e
61 ± 4%, respectivamente.
85
Figura 24. Efeito da 3,5-bis(4-clorofenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1H-pirazolina (C61) sobre a
hiperalgesia induzida pela administração i.pl. de BK em camundongos. Os animais
receberam o tratamento de C61 (0,3 - 1 e 3 mg/Kg, i.p.), ou veículo. Após 30 min os animais
receberam injeção i.pl. de BK (500 ng/pata) na pata direita. Cada grupo representa a media
de 6-8 animais e as barras verticais indicam os E.P.M. *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0, 001. A
análise estatística foi realizada utilizando ANOVA de duas vias para a freqüência de
resposta (A), e ANOVA de uma via para a análise da área sobre a curva (B), seguidos de
post hoc Bonferroni e Dunnet, respectivamente.
Bradicinina (500 ng/pata)
C61 (0,3 m/Kg, i.p.)
C61 (1 m/Kg, i.p.)
C61 (3 m/Kg, i.p.)
A
IDose 0,3 mg/kg = 20 ± 8 %
IDose 1 mg/kg = 64 ± 5 %
B
IDose 3 mg/kg = 61 ± 4 %
400
300
60
*
40
20
***
***
0
AUC
Freqüência de resposta (%)
80
0
1
***
***
**
3
6
200
**
1
3
100
0
Horas
**
S
0,3
C61 (mg/Kg, i.p.)
Os resultados da hiperalgesia mecânica induzida pela PGE2 podem ser
visualizados na Figura 25 (A e B). Pode-se observar que o C61 foi capaz de reduzir
de forma acentuada a sensibilidade mecânica nas doses de 1 e 3 mg/Kg,com
inibições calculadas de 61 ± 11% e de 73 ± 9%, respectivamente. O efeito antihiperalgésico do composto pode ser observado até a 4h, após a indução do edema
pela injeção i.pl. de PGE2. O controle positivo utilizado neste experimento foi a
morfina, que apresentou inibição de 94 ± 5%.
86
Figura 25. Efeito da 3,5-bis(4-clorofenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1H-pirazolina (C61) sobre a
hiperalgesia induzida pela administração i.pl. de PGE2 em camundongos. Os animais
receberam o tratamento de C61 (0,3 - 1 e 3 mg/Kg, i.p.), Morfina (5 mg/Kg, s.c.), ou veículo.
Após 30 minutos os animais receberam injeção i.pl. de PGE2 (100 ng/pata) na pata direita.
Cada grupo representa a media de 6-8 animais e as barras verticais indicam os E.P.M.
*p<0,05, *p<0,01 e ***p<0,001. A análise estatística foi realizada utilizando ANOVA de duas
vias para a freqüência de resposta (A), e ANOVA de uma via para a análise da área sobre a
curva (B), seguidos de post hoc Bonferroni e Dunnet, respectivamente.
PGE2 (100 ng/pata)
Morfina (5 mg/kg, s.c.)
C61 (0,3 mg/Kg, i.p.)
C61 (1 mg/Kg i.p.)
C61 (3 mg/Kg i.p.)
A
B
100
80
400
70
60
300
** ***
50
AUC
Freqüência de Resposta (%)
90
40
30
***
*
***
***
20
10
0
B
1
***
**
***
***
**
***
2
4
Tempo (h)
200
100
6
0
***
Basal PGE2 Morf
0,3
1
3
C61 (mg/kg, i.p.)
A Figura 26 (A e B), apresenta os efeitos do pré-tratamento sistêmico dos animais
com o C61, sobre a hiperalgesia mecânica induzida pelo LPS. Também foi possível
observar nesse experimento a capacidade do composto em reduzir a sensibilidade
mecânica induzida pela administração i.pl. de LPS, tendo como IM 58 ± 5%, 36 ±
10% e 40 ± 9% para as doses de 0,3, 1 e 3 mg/Kg, respectivamente.Vale ressaltar
neste experimento, que a menor dose utilizada 0,3 mg/Kg, demonstrou efetividade
maior quando comparada com a Indometacina, na dose de 10 mg/Kg, que
apresentou inibição de 54 ± 4%.
87
Figura 26. Efeito da 3,5-bis(4-clorofenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1H-pirazolina (C61) sobre a
hiperalgesia induzida pela administração i.pl. de LPS em camundongos. Os animais
receberam o tratamento de C61 (0,3 - 1 e 3 mg/Kg, i.p.), Indometacina (10 mg/Kg, i.p.), ou
veículo. Após 30 min os animais receberam injeção i.pl. de LPS (100 ng/pata) na pata
direita. Cada grupo representa a media de 6-8 animais e as barras verticais indicam os
E.P.M. *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0, 001. A análise estatística foi realizada utilizando ANOVA
de duas vias para a freqüência de resposta (A), e ANOVA de uma via para a análise da área
sobre a curva, seguidos de post hoc Bonferroni e Dunnet, respectivamente.
A
LPS (100 ng/pata)
Indometacina (10 mg/Kg, i.p.)
C61 (0,3 mg/Kg, i.p.)
C61 (1 mg/Kg i.p.)
C61 (3 mg/Kg i.p.)
B
80
60
500
50
400
**
40
30
20
***
***
***
**
***
AUC
Freqüência de resposta (%)
70
**
**
***
*
0
2
4
6
Tempo (h)
*** ***
300
200
100
10
0.5 1
**
24
48
0
Basal LPS
Ind
0,3
1
3
C61 (mg/kg, i.p.)
A Figura 27 (A e B) apresenta o efeito do composto C61 frente à hiperalgesia
mecânica induzida pela administração i.pl. de CFA. Como se pode observar, houve
uma redução expressiva da sensibilidade mecânica nas doses de 0,3 e 3 mg/Kg,
com uma IM de 67 ± 10% e 84 ± 6%, respectivamente. Ambas as doses mostraram
ser efetivas desde o início do experimento, perdurando o efeito até as 48h após a
indução da hiperalgesia. Além disso, pode-se também observar que o efeito do
controle positivo Indometacina, fármaco de referência, foi menor do que a dose de 3
mg/Kg do referido composto.
88
Figura 27. Efeita do 3,5-bis(4-clorofenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1H-pirazolina (C61) sobre a
hiperalgesia induzida pela administração i.pl. de CFA em camundongos. Os animais
receberam o tratamento de C61 (0,3 - 1 e 3 mg/Kg, i.p.), Indometacina (10 mg/Kg, i.p.), ou
veículo. Após 30 min os animais receberam injeção i.pl. de CFA (20 µg/pata) na pata direita.
Cada grupo representa a media de 6-8 animais e as barras verticais indicam os E.P.M.
*p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001. A análise estatística foi realizada utilizando ANOVA de duas
vias para a freqüência de resposta (A) e ANOVA de uma via para a análise da área sobre a
curva, seguidos de post hoc Bonferroni e Dunnet, respectivamente.
CFA (20 µg/pata)
Indometacina (10 mg/Kg)
C61 (0,3 mg/Kg i.p.)
C61 (1 mg/kg, i.p.)
C61 (3 mg/Kg, i.p.)
A
90
B
70
600
60
500
50
**
**
***
***
40
30
***
***
*
*
20
10
0
B 1
***
*** ***
*** ****
*** ***
3
**
**
400
AUC
Freqüência de resposta (%)
80
6
***
200
***
***
***
***
4
*** ***
300
100
24
0
48
Tempo (h)
Basal CFA
Ind
0,3
1
3
C61 (mg/kg, i.p.)
5.6 Efeitos da 3,5-bis(4-clorofenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1H-pirazolina (C61) sobre
o edema e hiperalgesia mecânica no modelo de artrite induzida pelo Adjuvante
Completo de Freund (CFA)
A figura 28 (A e B) demonstra o efeito do C61 sobre a severidade de
instalação e desenvolvimento da artrite, nos animais que tiveram a pata direita
injetada com CFA. Pode-se
observar
que
o
C61
foi
capaz
de
reduzir
significativamente as características do processo inflamatório induzidas pelo CFA.
Como o índice de severidade de artrite é uma medida subjetiva, o desenvolvimento
do edema também foi avaliado em pletismômetro para comparar ação entre os
grupos, pois fornece uma medição física e objetiva na medida de inflamação (PAN et
al.,2009).
89
Figura 28. Efeito da 3,5-bis(4-clorofenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1H-pirazolina (C61) sobre o
desenvolvimento da artrite (severidade) após a administração i.pl. de CFA (100µL/pata) em
ratos. Os animais receberam o tratamento de C61 (0,03 - 0,1 - 0,3 e 1 mg/Kg, i.p.),
Indometacina (10 mg/Kg, i.p.), Dipirona (40 mg/Kg, i.p.), Dexametasona (0,5 mg/Kg, s.c.),
Fenilbutazona (80 mg/Kg, v.o.), e veículo. O índice de severidade foi determinado a cada
três dias. Cada grupo representa a media de 4-6 animais e as barras verticais indicam os
E.P.M. *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0, 001. A análise estatística foi realizada utilizando ANOVA
de duas vias para a variação no volume das patas (A) e ANOVA de uma via para a análise
da área sobre a curva (B), seguidos de post hoc Bonferroni e Dunnet, respectivamente.
CFA (100 µL/pata)
Indometacina (10 mg/Kg, i.p.)
Dipirona (40 mg/Kg, i.p.)
Dexametasona (0,5 mg/kg, s.c.)
Fenilbutazona (80 mg/Kg, v.o.)
C61 (0,03 mg/Kg, i.p.)
C61 (0,1 mg/Kg, i.p.)
C61 (0,3 mg/Kg, i.p.)
C61 (1,0 mg/Kg, i.p.)
80
4
60
3
AUC
Índice de Severidade de Artrite
5
2
40
***
20
1
0
0
3
9
15
Tempo ( dias após indução)
21
**
*** *** ***
***
*** ***
CFA Ind
Dip Dex Fen 0,03
0,1
0,3
1
C61 (mg/Kg, i.p.)
Pode-se observar na Figura 29 as fotografias das patas dos animais
submetidos ao modelo de artrite induzida pelo CFA no 22° dia após a indução.
Houve aparentemente uma melhora dos animais que receberam os tratamentos com
o C61 em todas as doses utilizadas, bem como os fármacos utilizados como controle
positivo.
90
Figura 29. Efeito da 3,5-bis(4-clorofenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1H-pirazolina (C61) sobre o
desenvolvimento da artrite após a administração i.pl. de CFA (100µL/pata) em ratos. Os
animais receberam o tratamento de C61 (0,03 - 0,1 - 0,3 e 1 mg/Kg, i.p.), Indometacina (10
mg/Kg, i.p.), Dipirona (40 mg/Kg, i.p.), Dexametasona (0,5 mg/Kg, s.c.), Fenilbutazona (80
mg/Kg, v.o.) e veículo.
A variação do volume da pata no modelo de artrite induzida pelo CFA, foi
avaliada em pletismômetro. Pode-se observar que a atividade do C61 foi um pouco
inferior a alguns fármacos de referência utilizados (Figura 30). Mas, mesmo assim, o
composto promoveu uma diminuição significativa do edema induzido pelo CFA. As
porcentagens de inibição foram bem próximas entre as doses, destacando a dose
maior de 1mg/Kg, a qual promoveu o maior percentual de inibição com 37 ± 4%.
91
Figura 30. Efeito da 3,5-bis(4-clorofenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1H-pirazolina (C61) sobre o
edema de pata induzido pela administração i.pl. de CFA (100µL/pata) em ratos.Os animais
receberam o tratamento de C61 (0,03 - 0,1 - 0,3 e 1 mg/Kg, i.p.), Indometacina (10 mg/Kg,
i.p.), Dipirona (40mg/Kg, i.p.), Dexametasona (0,5 mg/Kg, s.c.), Fenilbutazona (80 mg/Kg,
v.o.) e veículo. O efeito antiedematogênico foi avaliado a cada 3 dias em pletismometro.
Cada grupo representa a media de 6-8 animais e as barras verticais indicam os E.P.M.
*p<0,05, **p<0,01 e ***p<0, 001. A análise estatística foi realizada utilizando ANOVA de
duas vias para a variação no volume das patas (A) e ANOVA de uma via para a análise da
área sobre a curva (B), seguidos de post hoc Bonferroni e Dunnet, respectivamente.
CFA (100 µ L/pata)
Dexametasona (0,5 mg/kg, s.c.)
Fenilbutazona (80 mg/Kg, v.o.)
Dipirona (40 mg/Kg, i.p.)
Indometacina (10 mg/Kg, i.p.)
C61 (0,03 mg/Kg, i.p.)
C61 (0,1 mg/Kg, i.p.)
C61 (0,3 mg/Kg, i.p.)
C61 (1,0 mg/Kg, i.p.)
A
B
1400
25000
1000
20000
800
***
15000
600
5000
200
0
0
1
3
6
9
12
15
Tempo (dias após indução)
18
21
**
***
***
10000
400
*
**
AUC
∆ do volume da pata ( µ L)
1200
***
***
CFA Dex Fenil
Ind
Dip
0,03
0,1
0,3
1
C61 (mg/Kg, i.p.)
Na Figura 31 (A, B, C e D) pode-se observar o efeito farmacológico
decorrente da administração do composto C61, no modelo de artrite induzido pelo
CFA. Na Figura 31 (A e B) observa-se que houve com o tratamento, importante
redução da intensidade de hiperalgesia mecânica induzida pelo CFA, e a melhor
resposta frente ao processo doloroso artrítico foi obtida com a Fenilbutazona® (80
mg/Kg, v.o.) seguida da Dexametasona (0,5 mg/Kg, s.c). Quanto ao efeito do
composto C61, o mesmo apresentou uma resposta muito similar à Indometacina (10
mg/Kg, i.p.), ou seja, a dose de 0,1 mg/Kg apresentou um percentual de inibição de
46 ± 8% enquanto a Indometacina apresentou um percentual de 46 ± 7%. Ainda, é
importante destacar que o pré-tratamento na dose de 0,3 mg/Kg foi a que obteve o
maior percentual de inibição, com 52 ± 8% de redução da sensibilização mecânica
induzido pelo CFA.
92
Figura 31. Efeito da 3,5-bis(4-clorofenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1H-pirazolina (C61) sobre a
intensidade de hiperalgesia induzida pela administração i.pl de CFA (100 µL/pata) em ratos,
ipsilateral (A e B) e contralateral (C e D). Os animais receberam o tratamento de C61 (0,03 0,1 - 0,3 e 1 mg/Kg, i.p.), Indometacina (10 mg/Kg, i.p.), Dipirona (40 mg/Kg, i.p.),
Dexametasona (0,5 mg/Kg, s.c.), Fenilbutazona (80 mg/Kg, v.o.) e veículo. O efeito antihiperalgésico foi avaliado a cada 3 dias por Von Frey eletrônico. Cada grupo representa a
media de 6-8 animais e as barras verticais indicam os E.P.M. *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,
001. A análise estatística foi realizada utilizando ANOVA de duas vias para a variação no
volume das patas (A) e ANOVA de uma via para a análise da área sobre a curva (B),
seguidos de post hoc Bonferroni e Dunnet, respectivamente.
CFA (100 µ L/pata)
Dexametasona (0,5 mg/kg, s.c.)
Fenilbutazona (80 mg/Kg, v.o.)
Indometacina (10 mg/Kg, i.p.)
Dipirona (40 mg/Kg, i.p.)
C61 (0,03 mg/Kg, i.p.)
C61 (0,1 mg/Kg, i.p.)
C61 (0,3 mg/Kg, i.p.)
C61 (1,0 mg/Kg, i.p.)
A
B
90
1500
70
60
50
*
1000
40
AUC
Intensidade de hiper algesia
(∆
∆ da retirada da pata, g)
80
30
***
500
20
***
***
***
***
***
10
0
1
3
6
9
12
15
18
0
21
CFA Dex Fenil Ind
Tempo (dias)
50
0,03
0,1
0,3
1
C61 (mg/Kg, i.p.)
CFA (100 µ L/pata)
Dexametasona (0,5 mg/kg, s.c.)
Fenilbutazona (80 mg/Kg, v.o.)
Indometacina (10 mg/Kg, i.p.)
Dipirona (40 mg/Kg, i.p.)
C61 (0,03 mg/Kg, i.p.)
C61 (0,1 mg/Kg, i.p.)
C61 (0,3 mg/Kg, i.p.)
C61 (1,0 mg/Kg, i.p.)
C
Dip
D
140
120
30
100
AUC
Intensidade de hiper algesia
(∆
∆ da retirada da pata, g)
160
40
20
80
60
40
10
20
0
1
3
6
9
12
Tempo (dias)
15
18
21
0
CFA Dex Fenil Ind
Dip 0,03 0,1 0,3
1
C61 (mg/Kg, i.p.)
93
5.7 Efeitos da 3,5-bis(4-clorofenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1H-pirazolina (C61) sobre
as células sanguíneas no tratamento crônico de artrite induzida pelo Adjuvant
Completo de Freund (CFA)
Pode-se observar através da Figura 32 (A, B, D e F) que o tratamento crônico
com o composto C61 no modelo de artrite induzido pelo CFA, de maneira geral, não
apresentou diferenças significativas nos parâmetros hematológicos avaliados,
quando foram comparados com o grupo de animais não induzidos e que receberam
somente salina (valor basal de referência).
Foi realizada a contagem global de leucócitos, eritrócitos, plaquetas, e
contagem global de células nucleadas da medula óssea, além da dosagem de
hemoglobina e hematócrito. O número de Leucócitos do sangue periférico
apresentou alterações significativas nos grupos CFA (8,66 ± 0,80), Ind (9,45 ± 0,45),
Dex (12,30 ± 1,20), Fen (9,40 ± 0,86), e também na dose de 1mg/Kg do C61 (8,04 ±
0,88).
De acordo com os dados obtidos, não há evidência de sinais de
hematotoxicidade do composto, frente aos parâmetros hematológicos avaliados ao
final de 22 dias de tratamento, nas diferentes doses.
94
Figura 32. Efeito do tratamento crônico da 3,5-bis(4-clorofenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1Hpirazolina (C61) sobre as células sanguíneas. (A) Efeito dos compostos sobre os Leucócitos
(B) Efeito dos compostos sobre os Eritrócitos, (C) Efeito dos compostos sobre a
concentração de Hemoglobina, (D) Efeito dos compostos sobre o Hematócrito, (E) Efeito
dos compostos sobre as Plaquetas, (F) Efeito dos compostos sobre a contagem de células
nucleadas na Medula Óssea. Cada grupo representa a media de 6-8 animais e as barras
verticais indicam os E.P.M. *p<0,05, *p<0,01 e ***p<0, 001. A análise estatística foi realizada
utilizando ANOVA de uma via para seguidos de post hoc Dunnet.
A
B
15.0
***
7.5
10.0
**
**
**
*
7.5
5.0
2.5
0.0
S
CFA Ind
Dip Dex Fenil 0,03 0,1
0,3
Eritrócitos x 10 5/mm³
Leucócitos x 10² /mm³
12.5
5.0
2.5
0.0
1
S
CFA Ind
Dip Dex Fenil 0,03 0,1
C61 (mg/Kg)
C
17.5
40
35
12.5
10.0
7.5
5.0
30
25
20
15
10
2.5
0.0
5
0
S
CFA
Ind
Dip
Dex Fenil 0,03
0,1
0,3
1
S
CFA Ind
Dip
Dex Fenil 0,03
900
F
0,3
1
3500
*
3000
700
M.O. (Células x 10³ /mL)
Plaquetas x 10³/mm³
800
600
500
400
300
200
2500
2000
1500
1000
500
100
0
0,1
C61 (mg/Kg)
C61 (mg/Kg)
E
1
45
Hematócrito (%)
Hemoglobina (mg/dL)
D
*
15.0
0,3
C61 (mg/Kg)
S
CFA Ind
Dip
Dex Fenil 0,03
0,1
0,3
C61 (mg/Kg)
1
0
S
CFA
Ind
Dip Fenil Dex
0,03
0,1
0,3
C61 (mg/Kg)
1
95
5.8 Efeitos da 3,5-bis(4-clorofenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1H-pirazolina (C61) sobre
a função hepática, renal, peso corpóreo e peso de órgão após tratamento
crônico no modelo de artrite induzida pelo Adjuvant Completo de Freund (CFA)
A Tabela 4 apresenta os efeitos do tratamento crônico do C61 via i.p. no
modelo de artrite induzido pelo CFA. Ao final de 22 dias de tratamento com o
composto, os marcadores de função renal, uréia e creatinina, de uma maneira geral
apresentaram-se sem alterações significativas. Em relação à função renal, somente
o grupo de animais que receberam o tratamento com Indometacina demonstrou um
aumento significativo da creatinina (0,88 ± 0,23). Os valores de uréia não
demonstraram alterações significativas quando foram comparados com o grupo
salina. Os resultados da avaliação da função hepática também estão apresentados
na Tabela 4. Observa-se também, que o tratamento do composto em estudo, não
alterou de maneira significativa a da atividade das enzimas AST e ALT, em todas as
doses utilizadas do C61.
Tabela 4: Efeito das doses do C61 sobre a função renal e hepática
Grupos
(mg/Kg)
Função Renal
Uréia
Creatinina
(mg/dL)
(mg/dL)
Função Hepática
AST
ALT
(U/L)
(U/L)
Controle Salina
43,3 ± 2,0
0,42 ± 0,02
83,0 ± 6,4
35,2 ± 5,3
CFA
51,9 ± 1,6
0,54 ± 0,06
113,7 ± 7,9
53,5 ± 3,7*
Ind (10 mg/Kg, i.p.)
45,9 ± 5,2
0,88 ± 0,23**
126,3 ± 12,1**
26,7 ± 5,1
Dip (40 m/Kg, i.p.)
45,0 ± 5,8
0,49 ± 0,13
107,6 ± 6,8
32,8 ± 2,6
49,5 ± 3,3
0,41 ± 0,09
108,7 ± 16,3
44,0 ± 3,8
52,9 ± 1,9
0,36 ± 0,05
98,5 ± 4,9
72,2 ± 5,1 ***
52,1 ± 2,1
0,64 ± 0,04
69,3 ± 4,7
36,2 ± 1,4
48,5 ± 1,9
0,42 ± 0,08
66,5 ± 4,7
49,4 ± 8,8
46,1 ± 2,3
0,43 ± 0,04
62,2 ± 1,3
39,0 ± 3,3
40,5 ± 1,4
0,53 ± 0,12
53,5 ± 1,6
40,5 ± 2,7
Dex (0,5 mg/Kg, s.c.)
Fen (80 mg/Kg, v.o.)
C61(0,03mg/Kg, i.p.)
C61 (0,1 mg/Kg, i.p.)
C61 (0,3 mg/Kg, i.p.)
C61 (1 mg/Kg, i.p.)
Os valores representam a média de ± erro padrão de 6-8 animais.
96
Outro parâmetro avaliado neste estudo como indicativo de sinais de possível
efeito tóxico, foi a variação do peso corpóreo no período de desenvolvimento da
artrite, bem como o peso do fígado e do baço. Na Figura 33 observa-se uma
redução significativa no peso corpóreo dos animais tratados com Dexametasona
P>0,001. Nos outros tratamentos não houve variação no peso corporal dos animais
no período experimental de 22 dias. Os animais tratados com Fenilbutazona, com as
doses de 0,1 e 1 mg/Kg do C61, apresentaram aumento de peso significativo, em
relação ao controle negativo que recebeu somente veículo para a diluição dos
compostos.
Em relação ao peso dos órgãos pode-se observar também na Figura 33, que
o grupo tratado com a Indometacina apresentou diferença estatística no peso do
baço (1,63 ± 0,29). E os animais que foram tratados com Dexametasona (11,1 ±
0,44) e a maior dose do C61 (11,4 ± 0,28), apresentaram diminuição significativa no
peso do fígado.
Figura 33. Efeito do tratamento crônico da 3,5-bis(4-clorofenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1Hpirazolina (C61) sobre o peso dos órgãos e peso corporal. (A) Peso do baço, (B) Peso do
fígado, (C) Peso corporal (peso final – peso inicial). Cada grupo representa a media de 4-6
animais e as barras verticais indicam os E.P.M. *p<0,05, *p<0,01 e ***p<0, 001. A análise
estatística foi realizada utilizando ANOVA de uma via para seguidos de post hoc Dunnet.
B
2.5
***
Fígado - Peso (g)
Baço - Peso (g)
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
CFA
Ind
Dip
Dex
Fen
0,03
0,1
0,3
20
15
5
0
1
C
**
* **
10
CFA
Ind
Dip
Dex
Fen
0,03
0,1
0,3
1
C 61 (m g /K g , i.p .)
C 61 (m g /K g, i.p.)
100
80
∆ do Peso Corporal (g)
A
60
*
40
20
0
-20
-40
-60
-80
-100
***
*
*
C F A (100 µ L /p ata)
In d o m etacin a (10 m g /K g , i.p .)
D ip ir o n a (40 m g /K g , i.p .)
D exam etaso n a (0,5 m g /kg , s.c.)
F en ilb u taz o n a (80 m g /K g , v.o .)
C 61 (0,03 m g /K g , i.p .)
C 61 (0,1 m g /K g , i.p .)
C 61 (0,3 m g /K g , i.p .)
C 61 (1 m g /kg , i.p .)
97
5.9 Efeitos da 3,5-bis(4-clorofenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1H-pirazolina (C61) sobre
a deambulação em camundongos normais.
Para avaliar a atividade motora dos animais após a administração i.p. do
composto C61, utilizou-se o teste de campo aberto. Pode-se observar que o prétratamento com o C61, nas diferentes doses utilizadas, não alterou de maneira
significativa a movimentação, em relação ao grupo controle negativo, que foi tratado
com salina. (Figura 34).
Figura 34. Efeito da 3,5-bis(4-clorofenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1H-pirazolina (C61) sobre a
atividade motora em camundongos. Os animais receberam o tratamento de C61 (nas doses
de 1 - 3 e 10 mg/Kg, i.p.), Morfina (5 mg/Kg, s.c.). O efeito motor o número de cruzamentos
realizados pelo animal. Cada grupo representa a média de 6 animais e as barras verticais
indicam os E.P.M. *p<0,05, **p<0,01. A análise estatística foi realizada utilizando ANOVA de
uma via, seguidos de post hoc Dunnet.
Número de Cruzamentos
300
**
250
200
150
100
50
0
C
M
1
3
10
C61 (mg/Kg, i.p.)
98
5.10 Efeitos da 3,5-bis(4-clorofenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1H-pirazolina (C61) sobre
a temperatura corporal em camundongos normais.
Para avaliar possíveis efeitos colaterais do composto, foi verificada a
temperatura corporal, após o tratamento i.p. com o C61, a temperatura retal dos
animais foi verificada. Pode-se observar na Figura 35, que o pré-tratamento i.p. dos
animais com o C61 nas diferentes doses utilizadas na pesquisa não provocou
variação significativa na temperatura corporal.
Figura 35. Efeito da 3,5-bis(4-clorofenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1H-pirazolina (C61) sobre a
temperatura corporal em camundongos. Os animais receberam o tratamento de C61 nas
doses de (0,03 - 0,1 - 0,3 - 1 - 3 e 10 mg/kg i.p.). A temperatura retal foi verificada após 30
minutos da injeção i.p. dos compostos. Cada grupo representa a média de 6 animais e as
barras verticais indicam os E.P.M. *p<0,05, **p<0,01. A análise estatística foi realizada
utilizando ANOVA de uma via, seguidos de post hoc Dunnet.
30
20
10
C61 (mg/Kg, i.p.)
10
3
1
0,
3
0,
1
0,
03
0
C
Temperatura retal (° C)
40
99
6 DISCUSSÃO
A modificação molecular, a partir de uma estrutura protótipo, é o método mais
promissor na introdução de novos fármacos na terapêutica (WERMUTH, 2003). Um
substituinte pode produzir modificações que atinja várias propriedades físicoquímicas da molécula, tais como hidrofobicidade, densidade eletrônica, conformação
estrutural e propriedades farmacocinéticas, entre outras, cuja análise poderá orientar
as sínteses seguintes (BARREIRO, 2007).
Em uma tese de doutorado, realizado por Santos (2008), foram sintetizados e
avaliados no modelo de contorções abdominais induzidas pelo ácido acético 0,6%
uma série de 10 derivados pirazolínicos, os quais apresentaram relevante atividade
antinociceptiva na dose de 10 mg/kg. Das moléculas testadas apenas duas
apresentaram IM abaixo de 75% para a dose utilizada de 10mg/Kg, a melhor IM dos
compostos foi de 96,19 ± 1,5% da 5-(4-clorofenil)-3-(4-metilfenil)-1-fenil-4,5-dihidro1H-pirazolina, identificada como C60. Neste estudo apenas o composto mais ativo,
C60, foi avaliado em diferentes doses no modelo de contorção abdominal induzida
pelo ácido acético. Este composto chamou atenção devido a sua atividade biológica,
sendo cerca de 17 vezes mais ativo que o ácido acetilsalicílico (AAS) e o
acetaminofeno (ACE) e 22 vezes mais ativo que a Dipirona.
Outro ponto relevante desta série de compostos é sua estrutura pirazolínica,
uma vez que a Dipirona, fármaco do tipo AINE, aqui comparado, possui uma
estrutura pirazolônica e o Celecoxib fármaco seletivo para a COX-2 possui uma
estrutura pirazolínica. Desta forma, por similaridade, a estrutura dos compostos em
estudo, poderiam se acomodar de forma semelhante ao sítio receptor da COX, na
acomodação dos anéis aromáticos nos sítios lipofílicos. E, por possuir um anel a
mais na sua estrutura, em comparação ao Celecoxib, poderia promover uma
interação adicional contribuindo assim na sua atividade biológica (ABDEL-AZIZ;
ELTAHIR; ASIRI, 2011).
Estudos realizados em instituições de pesquisa e Indústrias Farmacêuticas,
nas últimas décadas, confirmam a grande importância da lipofilia e da determinação
do coeficiente de partição (log P), para o planejamento e a busca racional de
fármacos (LIPINSKI et al., 2004). Cabe ressaltar, que mesmo empregando-se os
métodos mais simples e clássicos da química medicinal na otimização de estratégias
100
de síntese, é possível contribuir no desenvolvimento dos estudos quantitativos da
relação estrutura-atividade (LUO et al., 2010).
No presente estudo, foi realizada previamente uma análise teórica proposta
por Lipinski et al., (2001), no intuito de determinar um perfil de absorção e
permeabilidade dos cinco derivados pirazolínicos. As propriedades físico – químicas
determinadas através da teoria de Lipinski (PM, milog P, aceptores de ligação
hidrogênio (N + O), doadores de ligação hidrogênio (NH + OH), número de ligações
rotáveis, área de superfície polar) são tipicamente usadas na construção de modelos
preditivos de absorção, distribuição, metabolismo, excreção e também toxicidade
(ADMET), formando assim a base para o que tem sido chamado de desenvolvimento
baseado nas propriedades físico-químicas (EKINS; MESTRES; TESTA, 2007).
Segundo os resultados observados em nossos estudos, todos os derivados da
série violaram o parâmetro de log P adequado (log P < 5,0), fato que diminui a
probabilidade de absorção e permeabilidade deses derivados quando administrados
via oral (LIPINSKI et al., 2001). Para Lipinski até uma violação é permitida, e a
violação de um parâmetro não invalida o estudo destas moléculas, uma vez que este
método avalia a biodisponibilidade por via oral, considerando apenas um dos vários
meios pelos quais os fármacos podem se distribuir através de barreiras
membranosas, no caso aqui o transporte passivo (LIPINSKI et al., 2001).
A partir destes resultados e considerando a atividade farmacológica
observada para o composto C60, administrado por via intraperitoneal obtida nos
estudos prévios conduzidos por Santos (2008), todos os demais ensaios foram
direcionados inicialmente por esta via.
Para uma melhor avaliação deste composto, estudos adicionais foram
realizados juntamente com outros quatro análogos desta série (C58, C61, C62 e
C66), os quais foram escolhidos de forma racional segundo os substituintes
propostos no modelo manual de Topliss. A avaliação da relação estrutura-atividade,
utilizando o método de Topliss (1977), prediz que a atividade biológica é dependente
de alguns efeitos hidrofóbicos (π), eletrônicos (σ) ou estereos (Es) dos substituintes
aromáticos (BUZZI; CECHINEL FILHO; CORRÊA, 2010).
Estes compostos foram então avaliados inicialmente no modelo de contorções
abdominais induzidas pelo ácido acético e no modelo de hiperalgesia mecânica e
edema de pata induzidos pela ʎ-carragenina, a fim de selecionarmos a molécula
101
mais promissora e identificarmos, se algum destes parâmetros estaria relacionado
com a atividade antinociceptiva e antiedematogênica desta série de compostos.
No modelo de contorções abdominais induzidas pelo ácido acético, a resposta
nociceptiva dos animais é caracterizada pela torção do tronco e extensão dos
membros posteriores (writhing), atribuídas à resposta reflexa, devido à irritação
peritoneal produzida pela injeção do agente irritante (COLLIER et al., 1968). Em
1964, Whittle descreveu a atuação indireta do ácido acético na liberação de
mediadores endógenos envolvidos na modulação da nocicepção, incluindo a BK, 5HT, HIS e as PGs.
De acordo com Ribeiro et al., (2000), a resposta nociceptiva neste modelo é
modulada a partir da liberação de citocinas como TNF-α, IL-1β e IL8 por macrófagos
e mastócitos residentes na cavidade abdominal, que em conjunto com outros
mediadores (como os acima indicados) induzem nocicepção característica (RIBEIRO
et al., 2000). Embora este seja considerado um modelo simples de nocicepção, e
pouco específico, a contorção abdominal induzida pelo ácido acético nos permite
avaliar a atividade antinociceptiva de várias moléculas do tipo AINEs, opioides e
outras substâncias de ação central (GALLANTINE; MEERT, 2004; MALEKI-DIZAJI;
FATHIAZAD; GARJANI, 2007). O tipo de dor avaliado através desse modelo é
inflamatória, decorrente de inflamação aguda, uma vez que o ácido acético provoca
indução da permeabilidade capilar e liberação do ácido araquidônico via biossíntese
de PGs (GULESHA et al., 2011).
Vários compostos, de origem natural ou sintética tem sido constantemente
avaliados
através
desse
modelo.
A
atividade
antinociceptiva
da
1-
[(benzoxazol/benzimidazol-2-il)tioacetil] pirazolina (22) foi dessa forma testada por
Kaplancikli et al., (2009), o qual demonstrou atividade antinociceptiva importante.
R1
X= O, NH
R2
R3
R1=H, OCH3
N
N
S
R2=H, CH3
X
R3=H, CH3
O
NH
R4=H, Cl
(22)
R4
102
Recentemente, Joshi et al., (2010), compararam a atividade antinociceptiva
de uma série de 3,2-(4,5-dihidro-5-(4-morfilinofenil)-1H-pirazol-3-il)fenol e Nfenilpirazol-1-carbotioamida (23) com o Diclofenaco, por meio desse modelo. Os
autores demonstraram que a série de pirazolinas inéditas, apresentaram atividade
antinociceptiva equivalente ao fármaco referência testado. Além disso, foi
evidenciado melhor atividade nas estruturas que tiveram halogênios substituídos no
anel aromático. Joshi et al., (2010), associaram os efeitos das pirazolinas ao fato de
haver substituição por halogênios no anel aromático. Este dado corrobora com a
efetividade do C61 no modelo do ácido acético. O composto possui um átomo de Cl
substituinte no anel aromático com orientação para em relação ao anel pirazolínico.
R1
R2
OH
N
R3
N
O
N
NH
S
(23)
Átomos de halogênio são capazes de produzir variados tipos de interações.
Diretamente eles podem estar implicados em interações hidrofóbicas ou polares e
indiretamente, eles são capazes de mudar a polaridade de determinados átomos ou
sistemas conjugados. A substituição por um átomo de cloro aumenta a atividade de
um derivado não substituído. Isso pode ser interpretado pela existência de um
espaço vazio correspondente ao volume de um átomo de cloro. Além disso, a
introdução do átomo de cloro pode aumentar a afinidade de ligação por estabelecer
interações adicionais de Van der Waals com uma proteína receptora. Outras razões
podem ser devido a alterações no volume total, na conformação ou nas
propriedades físico-químicas da molécula (SARAOGI, 2003).
Os resultados obtidos neste estudo demonstraram que o pré-tratamento
intraperitoneal dos animais com os compostos produziram redução significativa na
103
resposta álgica, sendo que a melhor atividade evidenciada foi a do composto C61
(4-Cl) (3,05 (2,53 - 3,65µmol)), seguido do C62 (4-OCH3) (5,62 (3,36 – 9,31µmol)) >
C60 (4-CH3) (7,40 (6,04 – 9,09µmol)) > C66 (3,4-Cl2) (14,84 (13,86 – 16,15µmol)),
no modelo do ácido acético. Como não foi possível determinar a DI50 para o C58, ele
não foi avaliado quanto a sua potência.
A ordem de potência encontrada demonstra que a atividade antinociceptiva
observada para esta série não é dependente dos efeitos hidrofóbicos (π), eletrônicos
(σ) ou estereos (Es) dos substituintes aromáticos. Apesar de não ter sido investigado
o possível mecanismo de ação destes compostos com relação à propriedade
antinociceptiva aguda, pode-se sugerir um possível efeito periférico, envolvendo a
supressão da liberação ou síntese de mediadores químicos como a BK, 5-HT, HIS e
as PGs (DERAEDT et al., 1980), evidenciado pelo modelo de contorção abdominal
induzida pelo ácido acético.
Dando continuidade a avaliação farmacológica dos compostos, foram
avaliados os efeitos, dos mesmos, sobre a resposta edematogênica e a hiperalgesia
mecânica induzida pela ʎ-carragenina. A ʎ-carragenina é um nome genérico dado a
uma família de polissacarídeos obtidos por extração de certas espécies de algas
vermelhas (Rhodophyta), sendo amplamente utilizada na indústria alimentícia,
cosmética e farmacêutica (CAMPO et al., 2009).
Em 1962, Winter, Risley e Nuss, introduziram o modelo de edema de pata
induzido pela injeção intraplantar de ʎ-carragenina em ratos, e desde então, tem
sido conveniente utilizar este modelo para investigar fármacos com possíveis efeitos
anti-inflamatórios. Em 1969, Vinegar, Schreiber e Hugo, descreveram a resposta
bifásica do processo inflamatório induzido pela ʎ-carragenina, sendo que a primeira
fase inicia imediatamente após a injeção do agente irritante, que leva a liberação de
BK, HIS e 5-HT, e se mantém até aproximadamente a 2,5h. Em seguida inicia-se a
segunda fase, caracterizada por elevada produção de PGs, espécies reativas de
oxigênio, e migração de células inflamatórias, além disso, ocorre a liberação
sequencial de uma cascata de citocinas (Di ROSA; WILLOUGHBY, 1971; CUNHA,
et al. , 2004).
A injeção i.pl. de ʎ-carragenina em roedores está associada à hiperalgesia
aguda, que é detectada como uma diminuição do limiar de retirada da pata em
resposta à um estímulo mecânico aplicado na pata inflamada. A resposta imune
ativada pela ʎ-carragenina envolve a ativação de macrófagos residentes, mastocitos
104
e células endoteliais, que resulta na liberação de citocinas pro-inflamatórias e
mediadores. A primeira citocina liberada no processo é o TNF-α, a qual desencadeia
a liberação de IL-6 e IL-1β, além da alta produção de PGs. Estes eventos levam a
sensibilização de neurônios sensoriais primários nociceptivos, frente a um estímulo
doloroso térmico ou mecânico (CHOU, 2003; CUNHA et al. , 2008).
É de extrema importância a participação do TNF-α na formação do edema,
bem como na resposta nociceptiva (alodínia mecânica) e migração de neutrófilos,
decorrentes da administração de ʎ-carragenina na pata de roedores. Logo, o modelo
de edema e hiperalgesia mecânica induzido pela ʎ-carragenina também podem ser
empregados para avaliar os efeitos do TNF-α “in vivo” e também possíveis inibidores
desta citocina e/ou vias relacionadas à ela (ROCHA et al., 2006).
A indução de inflamação aguda através da ʎ-carragenina mostra-se um
modelo pouco específico, por ser resultado de uma complexa diversidade de
mediadores.
O tipo de edema formado reflete a ampla produção de PGs na
segunda fase, o que faz deste modelo uma ferramenta importante para avaliar a
atividade de anti-inflamatórios com mecanismo de ação “Aspirina-like”, ou seja,
relacionados à inibição da COX (VANE, 1996; KHODE et al., 2009).
Estudos realizados com uma série de 5-aril-3-(3-coumarinil)-1-fenil-2pirazolinas (24) demonstraram efeito antiedematogênico no modelo de edema de
pata induzido pela ʎ-carragenina e artrite induzida pelo CFA. Alguns dos compostos
testados na série apresentaram inibição similar ao fármaco de referência da classe
dos AINES, em ambos os modelos (KHODE et al., 2009). Outros estudos similares
demonstraram também a atividade anti-inflamatória de derivados pirazolínicos
comprovando
o potencial farmacológico
desses
compostos em
processos
inflamatórios (SHOMAN et al., 2009; RATHISH et al., 2009; JOSHI et al., 2010;
TABARELLI et al., 2004; SAUZEM et al., 2009; MARIAPPAN et al., 2011).
105
R= 4-ClC6H4
N
2,4-(Cl)2-C6H3
N
R
3-OCH3C6H4
4-FC6H4
O
O
(24)
É reportado na literatura, que a diminuição do limiar de retirada da pata pelos
animais quando a hiperalgesia é induzida por ʎ-carragenina é caracterizada pela
liberação de diversos mediadores inflamatórios, dentre eles os metabólitos do ácido
araquidônico (PGE2), produtos originados a partir de mastócitos como a HIS, SP, BK
dentre outros (REICHILING; LEVINE, 2009). Cunha et al., (2005) ressaltam que a
hiperalgesia induzida pela carragenina em camundongos depende de duas citocinas
chaves, TNF-α e KC. Ambas atuam através da liberação de IL-1β e da produção de
prostanoides pela própria citocina IL-1β.
Nos resultados obtidos no presente estudo verificou-se que o tratamento
prévio dos animais com os compostos C61, C60 e C62, apresentaram uma maior
atividade antihiperalgésica quando comparado com o C58 e o C66. A resposta do
C61 se mostrou ainda mais proeminente e duradoura, porém de maneira não dosedependente, perdurando da terceira até 48h após a indução. Com base nesses
resultados, os compostos testados, em especial o C61, podem estar agindo nas
diferentes vias responsáveis pela sinalização da dor de origem inflamatória. Neste
caso, deve-se investigar a possível atuação dos compostos na liberação e/ou
atuação de citocinas, produção de prostanoides e sensibilização periférica de
neurônios sensoriais.
A ação ocorre principalmente na segunda fase da dor inflamatória induzida
pela ʎ-carragenina, onde há um predomínio da produção de PGs. Possivelmente
poderia estar ocorrendo inibição da atividade da COX, ou a liberação de citocinas,
que possam atuar como mediadores na inflamação e consequentemente sensibilizar
os nociceptores periféricos. Pode-se perceber também que estes compostos tiveram
perfil farmacológico similar aos fármacos de referência testados, a Indometacina e a
Dipirona e, parecem estar agindo da mesma forma que estes ao inibir a inflamação e
a dor.
106
Quanto ao efeito antiedematogênico dos compostos, o C60 e C61 também
apresentaram maior atividade farmacológica quando comparado aos demais
compostos. A atividade antiedematogênica foi observada, porém este efeito foi mais
discreto e de maneira não dependente da dose.
A partir de então, o delineamento experimental do estudo se voltou para o
aprofundamento dos efeitos farmacológicos do C61, em modelos experimentais de
dor e inflamação induzidos por outros agentes flogísticos, diferentes da ʎcarragenina. Além disso, por se tratar de uma estrutura derivada do núcleo pirazol e,
portanto, apresentar similaridade estrutural com a Dipirona, a qual é envolvida em
eventos de discrasias sanguíneas, foi avaliada nesse estudo os efeitos desta
pirazolina administrada cronicamente sobre parâmetros hematológicos e na função
renal e hepática.
No presente estudo, a injeção i.pl de BK promoveu aumento do edema e
hiperalgesia mecânica nos camundongos que foram submetidos à avaliação. O prétratamento sistêmico dos animais com o C61 demonstrou diminuição significativa na
formação do edema bem como diminuição da resposta hiperalgésica. Desta forma, é
possível correlacionar a atividade farmacológica do C61 com o sistema das cininas.
O mecanismo exato pelo qual o composto exerce este efeito deverá ser
aprofundado, para determinar o tipo de interação existente, por exemplo, se o
composto desempenha uma função antagonista dos receptores B2, ou inibe a
subseqüente liberação da cascata de mediadores induzidos pela injeção i.pl de BK.
Foi demonstrado que o aumento da expressão dos receptores de cininas está
envolvido no desenvolvimento da fase inicial da inflamação e da dor inflamatória
após cirurgia (HAMZA et al., 2010).
Outro mediador utilizado para investigar o possível mecanismo de ação do
C61, foi a HIS. Considerando os eventos que ocorrem no processo inflamatório,
sabe-se que a HIS é um mediador liberado nos eventos iniciais de lesão tecidual
(O’MAHONY; AKDIS; AKDIS, 2011). Esta amina biogênica, liberada a partir dos
mastócitos
sob
condições
inflamatórias,
induz
resposta
anafilática,
como
vasodilatação, aumento da permeabilidade vascular e contração do músculo liso
(HSIEH et al., 2010a). Além dos efeitos vasculares, a HIS também tem a capacidade
de excitar neurônios aferentes primários de pequeno diâmetro e evoca a liberação
de mediadores vasoativos nas terminações nervosas livres, como a SP, IL-1 e fator
107
de crescimento do nervo (NGF) (AMANN, 1995; DRAY, 1995; JUTEL; AKDIS;
AKDIS, 2009).
Assim como na inflamação a HIS também participa dos processos dolorosos.
Estudos demonstraram que o antagonismo seletivo de receptores H4, em modelos
experimentais in vivo, produziu resposta antinociceptiva significativa em modelos de
inflamação e dor neuropática (TILIGADA et al., 2009; HSIEH et al., 2010b; WALTER;
KOTTKE; STARK, 2011).
Interessantemente o extravasamento plasmático induzido pela HIS pode ser
atenuado em animais submetidos à desnervação pela capsaicina, neste caso, estes
animais têm suas fibras C aferentes destruídas, consequentemente são desprovidos
da liberação dos neuropeptídeos, normalmente liberados após a ação da HIS, como
a SP. Estes dados são importantes para predizer uma interação sinérgica entre os
terminais aferentes primários e a ação da HIS (JANCSÓ; JANCSO-GABOR;
SZOLCSANYI, 1987; SMITH et al., 2010), bem como para comprovar que a HIS
também é responsável pela liberação da SP. Os resultados deste estudo
demonstraram que o C61 foi capaz de diminuir o edema de pata induzido pela
injeção i.pl. de HIS, a partir dos 30 minutos da formação do edema, sendo provável
que o composto em estudo possa estar interagindo também com esta via.
Na sequencia do estudo os efeitos do C61 foram também avaliados frente ao
edema induzido por SP. A injeção intradérmica de SP na pata de roedores produz
vasodilatação com extravasamento plasmático e edema, através da liberação de
CGRP, 5-HT, bem como liberação de PGs e NO (ALVES et al., 1999; CASTARDO et
al., 2008). A SP também facilita o tráfego de células para o sítio da inflamação e
contribui para a formação do edema da pata injetada, pela interação especialmente
com os receptores NK1 (ALVES et al., 1999; BLACK, 2002).
No presente estudo, os resultados obtidos no modelo de edema de pata
induzido pela SP demonstraram que o composto C61, neste modelo também foi
eficaz em reduzir o edema induzido por esse mediador, porém os tratamentos não
foram tão eficaz em reduzir o edema quanto a Indometacina, utilizada como controle
positivo. Os dados nos permitem sugerir que o referido composto possa estar
inibindo a fase inicial da formação do edema, e inibindo a ação do neuropeptídeo e
reduzindo consequentemente o extravasamento vascular.
Como reportado anteriormente, as PGs são exemplos de mediadores que
participam do processo inflamatório e doloroso. Fazem parte da família dos
108
eicosanóides e são produzidas por quase todas as células do corpo. São
mediadores lipídicos que não são armazenados pelas células, mas sim, sintetizados
a partir do ácido araquidônico através da ação da COX. O prostanóide mais
abundante do corpo humano é a PGE2, e dependendo da situação específica,
exerce papel homeostático ou inflamatório e doloroso (PARK; PILLINGER;
ABRAMSON, 2006).
A hiperalgesia mecânica induzida pela PGE2 é normalmente mediada pela
ativação de AMPc, que ativa a proteína kinase A (PKA), segundo mensageiro da
cascata de sinalização em aferentes nociceptivos primários. Além disso, aumenta a
excitabilidade dos neurônios do DGR através do aumento da liberação de GLU
(KASSUYA et al., 2007; REICHLING;LEVINE, 2009)
No SNC a PGE2 atua em vários processos patológicos, envolvendo a geração
da febre, dor e comportamento. Parece atuar como chave na transmissão sináptica e
contribui para a lesão neuronal e neurodegeneração (O´BANION, 2010). Na
inflamação a COX-2 é induzida por mediadores inflamatórios como citocinas
pirogênicas, IL-1β, TNF-α, IL-6 e LPS (ARANOFF; NEILSON, 2001).
Os resultados do edema de pata e hiperalgesia mecânica induzidos pela
injeção i.pl de PGE2, demonstram que o C61 inibiu de maneira significativa e dose
dependente a formação do edema e a resposta hiperalgésica induzidos por esse
mediador, com resultado mais significativo no processo doloroso. Os resultados em
conjunto, nos permitem sugerir que o composto talvez tenha seu mecanismo de
ação envolvido com a inibição de alguns dos eventos mediados pela cascata da
PGE2, nos processos inflamatório e doloroso.
A fim de avaliar o suposto envolvimento de algumas citocinas na atividade do
C61 na hiperalgesia inflamatória, também foi avaliada a reposta farmacológica frente
a hiperalgesia e edema induzidos pela injeção i.pl. de LPS. Cunha et al., (2005)
ressaltam que a hiperalgesia mediada por LPS tem relação quase que direta com as
citocinas TNF-α e
IL-1β. Entretanto, nesse modelo, parece que a hiperalgesia
mediada por citocinas é independente de prostanóides, sugerindo um efeito direto
da IL-1β, embora outros mediadores primários possam participar como, por
exemplo, as endotelinas e aminas simpáticas.
A administração i.pl. de LPS, induz uma reação inflamatória aguda com
aumento do volume da pata e hiperalgesia, semelhante a outros agentes como a ʎcarragenina (CUNHA et al., 2000). Ressalta-se ainda que a inflamação induzida pelo
109
LPS envolve aumento da expressão de NF-κB, o qual consequentemente aumenta a
liberação de mediadores inflamatórios, portanto o LPS é um indutor da expressão de
diversas citocinas (VAJJA et al., 2004).
Os lipopolisacarídeos bacterianos consistem tipicamente de um domínio
hidrofóbico conhecido como lipídeo A ou endotoxina, uma parte central (núcleo), e
um polissacarídeo distal (antígeno-O) (GALVANI; KREBS; VAZ, 1999). O
componente imunogênico do LPS, lipídeo A, é capaz de ativar a resposta
imunológica induzindo a ativação de diversos tipos celulares e a produção e
conseqüente liberação de citocinas pró-inflamatórias como relatado anteriormente
(GOLENBOCK et al., 1991).
No presente estudo, o fármaco padrão utilizado Indometacina, mostrou
inibição, frente a hiperalgesia mecânica induzida pelo LPS. Da mesma forma, C61
também foi eficaz em promover as inibições da freqüência de resposta, porém ao
compararmos as doses, o C61 foi em torno de 33 vezes mais efetivo que a
Indometacina.
Como reportado anteriormente, a injeção de LPS induz a modulação de uma
série de mediadores a começar pela, BK →TNF-α →IL-1β → IL-6 → COX → IL8 →
aminas simpáticas (WOOLF et al., 1997; CUNHA et al., 2005). Ao analisarmos estes
mediadores e a resposta obtida dos tratamentos dos animais, no presente estudo,
pode-se perceber a ação antihiperalgésica comum aos fármacos da classe dos
AINEs
como
é
o
caso
da
Indometacina,
também
evidenciou-se
ação
antihiperalgésica do C61. Estes resultados suportam a hipótese de atuação do C61,
em algum dos eventos iniciados pelo LPS, durante a hiperalgesia e a inflamação.
A fim de estudar os efeitos do composto no processo doloroso e inflamatório
persistente, foi utilizado o CFA como agente indutor de sensibilização. Como
reportado por Woolf et al., (1997), embora o CFA produza uma resposta inflamatória
marcante dentro de poucas horas após sua injeção i.pl., é um agente utilizado para
avaliar a dor persistente, pois age tanto na sensibilização dos neurônios periféricos
(por possuir uma ação direta, sem a participação de prostanoides) quanto, através
da sensibilização central dos neurônios da medula espinhal. Essas alterações
centrais envolvem modificações teciduais dos neurônios da medula, especificamente
nas laminas superficiais (I e II), como também nas lâminas profundas (V e VI)
responsáveis pela recepção dos estímulos, levando a hiperexcitabilidade dos
neurônios nociceptivos do corno dorsal da medula, o que ocasiona resposta
110
hiperalgésica a estímulos mecânicos ou térmicos (FRASER et al., 2000; WILHELM
et al., 2009)
A injeção de CFA na pata de ratos aumenta os níveis de TNF-α, IL-1β e NGF
3h após a indução de inflamação periférica após a administração localizada. A
resposta das citocinas na inflamação é extremamente complexa, pois envolve
aumento da expressão de fatores pró e antiiflamatórios, que agem e interagem com
um amplo número de células produzindo muitas mudanças dependentes ou não de
fatores de transcrição (WOOLF et al., 2007).
Este modelo é amplamente utilizado em ensaios farmacológicos de dor e
inflamação, constituindo um modelo de grande similaridade com doenças crônicas
humanas tais como artrite reumatóide e as inflamações severas nas articulações
visto que, a injeção i.pl. de CFA produz hiperalgesia intensa e persistente em
roedores (WOOLF; COSTIGAN, 1999; ZHANG et al., 2009b).
Os estudos de Uematsu et al., (2011), demonstraram que a administração
intra-articular de antagonistas de receptores NK1, em modelo de monoartrite
induzida por CFA, foi capaz de reduzir a hiperalgesia mecânica induzida pelo
mesmo,
reforçando
a
importante
participação
dos
neuropeptídeos
no
desenvolvimento da artrite.
Um estudo realizado por Mariappan et al., (2011), demonstrou o efeito
antiedematogênico de algumas pirazolinas em modelo de Artrite induzido pelo
CFA,4-[4-N
dimetilamino
benzilidino]-3-metil
pirazolin-5(4H)-ona
(25),
4-[2-
clorobenzilidino]-3-metilpirazolin-5(4H)-ona (26) e 4-[benzilidino]-3- metilpirazolin5(4H)-ona (27). As pirazolinas testadas demonstraram atividade antiedematogênica
promissora, e foram comparadas com a Aspirina. A pirazolina (26) apresentou
inibição similar ao fármaco referência.
H3C
N
N
H
O
N
(25)
CH3
CH3
H3C
H3C
N
N
N
H
O
(26)
N
H
O
(27) Cl
111
Outro trabalho realizado por Sauzem et al. (2009), avaliou os efeitos dos
tratamentos agudo e crônico de derivados pirazolônicos, 5-trifluorometil-4,5-dihidro1H-pirazol (28), em artrite induzida por CFA em ratos. Neste estudo, a injeção i.pl de
CFA produziu edema e dor na pata ipsilateral, evidentes até o último dia de
avaliação experimetal (18 dias), caracterizando o desenvolvimento de um processo
inflamatório crônico. No entanto, os sinais inflamatórios ficaram restritos ao local da
injeção, sem propagarem-se para a pata contralateral. Neste mesmo estudo foi
utilizado a Dipirona como controle positivo, onde se observou resposta
antinociceptiva, porém não foi observado redução do volume da pata.
R1
R2
HO
F 3C
H2N
N
N
R1= -CH2CH3; R2= H
R1= H; R2= -CH3
O
(28)
Tatsuo et al., (1994), demonstraram que a dipirona induziu analgesia e
redução do volume da pata em ratos com artrite induzida por CFA de maneira dose
dependente, injetado na base da cauda e o edema foi avaliado 14 dias após a
injeção do CFA.
No modelo de poliartrite induzida pelo CFA, o C61 foi comparado com alguns
fármacos comerciais utilizados no tratamento da dor e da inflamação. A
Dexametasona, Fenilbutazona e Indometacina foram escolhidas como controle
positivo por serem utilizados em diversos processos inflamatórios e dolorosos,
inclusive os processos reumáticos, como os diferentes tipos de artrite. A Dipirona, no
entanto foi selecionada por ser uma pirazolona, ou seja, um fármaco amplamente
comercializado e estruturalmente similar ao C61 que é uma pirazolina.
No presente estudo, as respostas hiperalgésica e edematogênica foram
observadas desde os primeiros dias após a indução nos animais. Pode-se perceber
que o tratamento sistêmico com o C61, conseguiu inibir o desenvolvimento da
formação do edema. Em relação à hiperalgesia mecânica o tratamento com o C61
foi efetivo desde o início da experimentação e se manteve até o 21°dia. O C61
também demonstrou resposta antihiperalgésica superior a Indometacina e a
112
Dipirona. A resposta contralateral passou a ser discretamente observada a partir do
15° dia, porém de maneira não significativa, indicando possivelmente o início da
contribuição neurogênica que desencadeia o mecanismo de imagem (KELLY;
DUNHAM; DONALDSON, 2007), e/ou imunomodulação (TALWAR et al., 2011).
Como reportado anteriormente, existem divergências na literatura em relação
ao desenvolvimento das manifestações clínicas quando se utiliza injeção de CFA
que
podem
influenciar
também
nos
resultados.
Desta
maneira
algumas
considerações devem ser feitas, as quais são relacionadas ao método em si, tais
como: o local da injeção do adjuvante, o tipo de cepa de mycobacterium utilizada na
preparação do adjuvante, e a linhagem de ratos utilizada. Tais parâmetros interferem
diretamente na maneira pela qual a molécula testada vai demonstrar o seu efeito
(SAUZEM, 2008).
No presente trabalho o adjuvante utilizado foi o produzido com o
Mycobacterium tuberculosis e a linhagem de ratos foi a Wistar, e foi realizada injeção
i.pl do adjuvante, aparentemente nas mesmas condições experimentais utilizadas
por Sauzem et al., (2009). Entretanto, os resultados em relação ao aparecimento de
manifestações na pata contralateral e os resultados referentes aos efeitos da
Dipirona foram um pouco diferentes daqueles obtidos por Sauzem et al (2009).
Embora vários trabalhos na literatura reportam que, animais tratados com
CFA irão desenvolver um quadro artrítico (PEDERNERA et al., 2006; LEE et al.,
2009;
VISWANATHA
et
al.,
2011)
e
que,
a
mensuração
da
resposta
antiedematogenica e antihiperalgésica são suficientes para apontar um efeito “antiartrítico” de uma substância testada nesse modelo, concordamos com a ideia de que
outros ensaios devem ser realizados para uma verdadeira comprovação dessa
atividade, destacando-se dentre eles: histologia da cartilagem, dosagem de citocinas
como o TNF-α, IL-1β, IL-6, radiologia, mecanismos de osteoclastogênese e
osteoblastogênese (RANK, RANK-L, Osteoprotegerina) entre outros (SUH et al.,
2006; ZHANG et al., 2008; PAN et al., 2009; DONG et al., 2010; TALWAR et al.,
2011). Neste contexto, os resultados obtidos demonstraram atividade significativa,
sugerindo estudos mais específicos para que a atividade antiartrítica do composto
possa ser melhor comprovada e elucidada.
Como ressaltado anteriormente, compostos pirazolônicos e derivados destes,
apesar de potentes antiinflamatorios e/ou antipiréticos podem comprometer a função
hepática e de outros órgãos importantes na homeostasia do organismo. Desta
113
forma, procurou-se no presente estudo avaliar parâmetros funcionais de alguns
órgãos em animais com tratamento crônico do C61.
Uma maneira de avaliar alterações hepatobiliares é através da determinação
da atividade das enzimas hepáticas como a ALT e a AST. Essas são utilizadas para
detectar injúria tecidual em estudos toxicológicos (EVANS; WHITEHORN, 1995). Os
níveis séricos de ALT aumentam quando ocorrem mudanças na permeabilidade ou
lesão direta no tecido hepático. A AST possui uma isoenzima mitocondrial e não é
liberada tão rapidamente quanto a ALT, que é essencialmente citoplasmática. A
ALT, portanto, é um indicador mais sensível de hepatotoxicidade aguda em relação
a AST, pois essa também é encontrada em outros tecidos como o miocárdio, rins,
pulmões (BOONE et al., 2005).
Outro indicador importante de efeitos tóxicos dos medicamentos é avaliação
da função renal. A elevação dos níveis plasmáticos de uréia e creatinina fornecem
indícios de sobrecarga ou comprometimento renal, insuficiência renal aguda ou
ainda aumento do catabolismo protéico (ADEBAYO et al., 2003). No entanto, a
dosagem de creatinina sérica é um parâmetro mais sensível do que a uréia para
detectar nefropatias (ZHENGLE et al., 2012).
No presente estudo, o tratamento crônico com o C61 não causou lesão no
parênquima hepático, nas doses e tempo de administração utiizados neste estudo.
Este dado pode ser evidenciado ao analisarmos as enzimas hepáticas AST e ALT
que são marcadores de função hepática. O C61 não provocou alterações
significativas nos níveis destas enzimas, possivelmente o composto não toxicidade
para o parênquima hepático. Da mesma forma, a avaliação da função renal não
evidenciou sinais relevantes relacionados à nefrotoxicidade.
Clinicamente a agranulocitose se caracteriza pela vasta perda de granulócitos
do sangue periférico que se manifesta na clínica como ulcerações na garganta, no
trato gastrointestinal e outras mucosas, que se seguem por infecções graves
(GARCÍA-MARTINEZ et al., 2003). Essa condição tem sido relacionada ao uso
prolongado de alguns tipos de medicamentos, em especial a Dipirona, cuja
associação
com
a
agranulocitose
ainda
é
controversa
(HAMERSCHLAK;
CAVALCANTI, 2005).
Até o momento na literatura, não foi encontrado referência da indução da
agranulocitose por pirazolinas. Entretanto, a proximidade química de pirazolinas e
pirazolonas é evidente. Então, procurou-se verificar se o tratamento crônico com
114
C61 pudesse causar nos animais agranulocitose. Os resultados mostraram que os
animais que foram submetidos ao modelo de artrite induzida pelo CFA e tratados
com o C61 em diferentes doses, não apresentaram sinais de toxicidade nos
leucócitos, série vermelha ou plaquetas, excluindo um efeito agranulocítico do
mesmo. Entretanto, no presente estudo, não foi detectado o efeito da Dipirona sobre
os parâmetros hematopoéticos, fato esse que pode estar relacionado ao tempo de
tratamento e linhagem dos animais utilizados (SHENTON; CHEN; UETRECHT,
2004). Lucchetti et al., (2010), reportam que os efeitos da dipirona em seres
humanos são tempo dependentes, não sendo encontrados dados consistentes com
relação a esse fato em experimentos com animais .
O peso de órgãos linfóides primários e secundários de animais pode estar
relacionado com a influência de fármacos com a resposta imune. Em particular, a
diminuição do baço e o aumento do timo estão relacionados a um efeito positivo
sobre o SI (THEISEN-POPP; MULLER-PSDDINGHAUS,1994). O timo e o baço são
afetados durante a condição de artrite, que pode ser resultado do processo de
fagocitose (RAMPRASATH; SHANTHI; SACHDANANDAM, 2005). O fato do
composto C61 não ter afetado o peso do baço no modelo de inflamação utilizado
pode indicar que ele não interfere diretamente com alguma resposta imune
específica. No caso do efeito encontrado para a Dexametasona, a redução do baço
pode ser atribuída a sua ação antiproliferativa (PEDERNERA et al., 2006).
O ganho de peso corporal é considerado como um índice de atividade
antiinflamatória e um positivo efeito imunológico em animais com artrite induzida por
CFA (PEDERNERA et al., 2006). No presente estudo, não foi evidenciado alteração
do peso dos animais com os tratamentos feitos com o composto e os controles
positivos, com exceção do grupo tratado com a Dexametasona.
Nesse caso
específico, os animais em tratamento com Dexametasona desenvolveram severa
perda de peso, o que pode ser explicado novamente devido a sua propriedade
antiproliferativa e o efeito catabólico do fármaco em altas doses (SUH et al., 2006).
A medida da temperatura basal dos animais tem sido utilizada como indicador
de efeitos adversos no estudo de fármacos com propriedades analgésicas. Souza et
al., (2002), demonstraram o efeito hipotérmico das pirazolinas 3-metil- and 3-fenil-5hidroxi-5-triclorometil-4,5-dihidro-1H-pirazol-1-carboxiamidas (29), em camundongos
normais. Além disso, esses compostos também apresentaram atividade antipirética
induzida pelo LPS, com resposta com resposta foi similar a Dipirona. No presente
115
estudo não foram observadas variações na temperatura corpórea dos animais
tratados com o C61.
R1
HO
Cl 3C
N
H2N
N
R1= -CH3
R1= -C6H5
O
(29)
Modelos farmacológicos como o Open Field e o Rota- rod têm grande
importância na avaliação da ação de compostos, uma vez que através deles é
possível verificar possíveis efeitos adversos dos mesmos, como uma atividade que
venha a causar efeitos inespecíficos no SNC e, que possam alterar a capacidade
locomotora dos animais e induzir a interpretações errôneas nos resultados obtidos
(MONTIGLIO et al., 2010). Esses modelos também são arrolados no screening de
fármacos com propriedades antiinflamatória e analgésica, uma vez que, dependendo
do modelo utilizado, a integridade motora do animal deve ser preservada. No
presente estudo, também não foi evidenciado alterações motoras nos animais com
tratamento do C61.
As terapias atuais utilizadas nos processos dolorosos e inflamatórios de
diversas etiologias são eficazes, porém acompanhadas de muitos efeitos adversos.
Portanto, constantemente se faz necessário descobrir novas opções para o manejo
clínico destes pacientes. Nesse contexto, há um grande interesse na área da
Indústria Farmacêutica no desenvolvimento de novos fármacos que apresentem
maior segurança no uso, maior eficácia terapêutica e menos efeitos adversos.
Tambem tem sido descrito na literatura vários estudos voltados para a descoberta de
novas moléculas de origem sintética, em especial os heterociclos, dentre eles os que
são derivados do pirazol (MILANO et al., 2008).
No presente estudo, o C61 se apresenta como uma molécula promissora na
terapêutica de processos dolorosos e inflamatórios agudos e crônicos cujo
mecanismo de ação parece ser mediado pela inibição da resposta inflamatória de
mediadores PGs, 5-HT, HIS, BK, dentre outros, os quais são oriundos de vias
metabólicas clássicas ou não. Além disso, o composto se mostrou desprovido de
116
efeitos adversos comuns a fármacos de classe similar utilizados ao tratamento da
dor e inflamação.
117
7 CONCLUSÃO
Diante dos resultados obtidos neste estudo, podemos concluir que todos os
derivados pirazolínicos estudados, apresentaram atividade farmacológica frente aos
modelos
experimentais
realizados
no
screening
(atividade
antinociceptiva,
antiedematogênica, anti-hiperalgésica) proposto.
O composto 5-(4-clorofenil)-3-(3,4-dilorofenil)-1-fenil-4,5-dihidro-1H-pirazolina,
(C61) destacou-se por apresentar melhor atividade antinociceptiva e antiinflamatória
nos ensaios avaliados no screening. O que pode ser confirmado pelo seu
pronunciado efeito antinociceptivo no modelo de hiperalgesia mecânica, e atividade
antiedematogênica quando foi avaliado nos modelos de edema de pata, os quais
foram induzidos por diferentes agentes flogísticos.
Além disso, o C61 também se mostrou promissor no modelo de artrite
induzido pelo CFA, pois além de reduzir a hiperalgesia mecânica e o edema neste
modelo, o composto também não alterou de maneira significativa o resultado das
provas bioquímicas e hematológicas realizadas.
Os resultados em conjunto apontam o composto C61 como alvo promissor
para o tratamento de processos dolorosos e inflamatórios crônicos. Entretanto, para
confirmar tal hipótese uma avaliação farmacológica e também toxicológica mais
abrangente deverá ser realizada.
118
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