DISTRIBUIÇÃO DA VARIABILIDADE GENÉTICA EM POPULAÇÕES

DISTRIBUIÇÃO DA VARIABILIDADE
GENÉTICA EM POPULAÇÕES NATURAIS
DE Eremanthus erythropappus (DC.) MacLeish
POR ISOENZIMAS E RAPD
MÁRCIA CRISTINA DE OLIVEIRA MOURA
2005
MÁRCIA CRISTINA DE OLIVEIRA MOURA
DISTRIBUIÇÃO DA VARIABILIDADE GENÉTICA EM POPULAÇÕES
NATURAIS DE Eremanthus erythropappus (DC.) MacLeish
POR ISOENZIMAS E RAPD
Tese apresentada à Universidade Federal de Lavras
como parte das exigências do Curso de Doutorado em
Engenharia Florestal, área de concentração em
Manejo Ambiental, para a obtenção do título de
“Doutor”.
Orientadora
Profa. Dulcinéia de Carvalho
LAVRAS
MINAS GERAIS - BRASIL
2005
Ficha Catalográfica Preparada pela Divisão de Processos Técnicos da
Biblioteca Central da UFLA
Moura, Márcia Cristina de Oliveira
Distribuição da variabilidade genética em populações naturais de Eremanthus
erythropappus (DC) MacLeish por isoenzimas e RAPD / Márcia Cristina de
Oliveira Moura. -- Lavras : UFLA, 2005.
165 p. : il.
Orientadora: Dulcinéia de Carvalho.
Tese (Doutorado) – UFLA.
Bibliografia.
1. Eremanthus erythropappus. 2. Candeia. 3. Estrutura genética. 4. Sistema
reprodutivo. 5. Isoenzima. 6. RAPD. I. Universidade Federal de Lavras. II. Título.
CDD-634.97355
-665.3
MÁRCIA CRISTINA DE OLIVEIRA MOURA
DISTRIBUIÇÃO DA VARIABILIDADE GENÉTICA EM POPULAÇÕES
NATURAIS DE Eremanthus erythropappus (DC.) MacLeish
POR ISOENZIMAS E RAPD
Tese apresentada à Universidade Federal de Lavras
como parte das exigências do Curso de Doutorado em
Engenharia Florestal, área de concentração em
Manejo Ambiental, para a obtenção do título de
“Doutor”.
APROVADA em 10 de agosto de 2005.
Prof. Dr. Eduardo van den Berg - UFLA
Profa. Dra. Maria Bernadete Lovato – UFMG
Pesquisador Dr. Alexandre Magno Sebbenn – Instituto Florestal-SP
Pesquisador Dr. Miguel Luiz Menezes Freitas - Instituto Florestal-SP
Profa. Dulcinéia de Carvalho - UFLA
(Orientadora)
LAVRAS
MINAS GERAIS - BRASIL
“... desejo também que você plante uma semente,
por mais minúscula que seja,
e acompanhe o seu crescimento,
para que você saiba de quantas
muitas vidas é feita uma árvore...”
Victor Hugo
AGRADECIMENTOS
A Deus, pela força e amparo em todos os momentos difíceis de minha
vida;
Ao curso de pós-graduação em Engenharia Florestal pela oportunidade
de realizar esse curso; Ao coordenador do curso Prof. Dr. Ary Teixeira de
Oliveira-Filho, que me estendeu a mão em momentos que tanto precisei;
À professora Dulcinéia de Carvalho pela orientação, por acreditar em
mim (quando nem eu mesma já acreditava...) e, sobretudo, pela amizade sincera
ao longo desses anos;
Ao professor Eduardo van den Berg por ter acompanhado esse trabalho,
com sugestões e questionamentos. Ao professor Eduardo Beazorti, pela
constante disposição em ensinar.
Aos membros da banca de defesa, Drª. Maria Bernadete Lovato, Dr.
Miguel Luiz Menezes Freitas e Dr. Alexandre Magno Sebbenn, pelas críticas,
sugestões e esclarecimentos que, certamente, muito contribuíram para esse
trabalho.
A todos os professores do Departamento de Ciências Florestais/UFLA
pela grata convivência, especialmente aos professores Sebastião Carlos da Silva
Rosado, José Tarcísio de Lima, Paulo Fernando Trugilho e José Aldo Alves
Pereira. Aos funcionários do DCF/UFLA, pela constante disponibilidade em me
ajudar, especialmente à Chiquita,Olívia, Lílian e Claudinha.
Ao pessoal do LEMAF, José Fábio, Charles, Vanete, Dimas e,
especialmente, ao Luís Fernando, pela valiosa ajuda no trabalho de campo. Ao
Marciel e Ana Carolina, pela ajuda na coleta de sementes. Ao José Carlos, pela
coleta em Baependi.
Aos amigos e colegas do Laboratório de Melhoramento Genético e
Recursos Genéticos, Maria Carolina, Evânia, Joema, Ana Cecília, Fábio,
Alisson, Luis Carlos, Anderson, Afrânio, Regiane, Sheila, Lívia, Marília,
Vássia, Sílvia, Leandra, Lidiane, Miriam e Lílian, pelo delicioso convívio e
momentos compartilhados. À amigona Cristiane, “ombro amigo” para os
momentos delicados. Ao Peterson, pessoa iluminada, que me ensinou o valor do
silêncio e de saber ouvir.
A todos os colegas do curso de pós-graduação em Engenharia Florestal
da UFLA, especialmente ao Luciano (Bodinho), Edmilson, Evandro.
A minha família, que sempre acreditou em mim, especialmente ao
Fernando, João Augusto e Gina, que me ajudaram nessa etapa final. À Reilda e
ao Luís Ricardo, pelas orações, pelo incentivo e pela amizade sincera ao longo
desses anos. Ao Celso e à Eda, um porto seguro para os momentos de
tempestade. Ao Flávio, Sérgio, Paulo e Andréa, meus irmãos de coração.
Ao Gabriel, meu “companheirinho”, por compreender meus momentos
de ausência, pela paciência e por ser a razão da minha vida.
Ao César, pela presença indispensável na minha vida, pelo amor
demonstrado, por cuidar tão bem de mim.
SUMÁRIO
Página
RESUMO.......................................................................................................
i
ABSTRACT..................................................................................................
iii
1. INTRODUÇÃO.........................................................................................
1
2. REFERENCIAL TEÓRICO......................................................................
3
2.1 Ocorrência natural da espécie..................................................................
3
2.2 Características da espécie........................................................................
5
2.3 Importância econômica da espécie..........................................................
7
2.4 Efeitos da fragmentação e do manejo de populações naturais de
espécies arbóreas...........................................................................................
8
2.5 Variabilidade genética em populações naturais.......................................
10
2.6 Estrutura genética....................................................................................
15
2.6.1 Caracterização da estrutura genética..................................................... 18
2.7 Fluxo gênico............................................................................................
23
2.8 Tamanho efetivo......................................................................................
26
2.9 Sistema reprodutivo.................................................................................
27
2.10 Distribuição espacial dos genótipos....................................................... 29
2.11 Marcadores moleculares no estudo de populações................................
32
3 MATERIAL E MÉTODOS........................................................................
38
3.1 Caracterização dos locais de estudo......................................................... 38
3.2 Amostragem dos indivíduos....................................................................
40
3.3 Extração das enzimas e análise eletroforética.......................................... 40
3.4 Extração do DNA genômico.................................................................... 43
3.4.1 Condições de amplificação do DNA genômico.................................... 44
3.4.2 Seleção de primers................................................................................ 45
3.5 Análise estatística dos dados de isoenzimas............................................
45
3.5.1 Análise de segregação........................................................................... 45
3.5.2 Análise do desequilíbrio de ligação......................................................
46
3.5.3 Caracterização da variação genética intrapopulacional........................
47
3.5.4 Caracterização da estrutura genética das populações...........................
50
3.5.5 Estimativa do fluxo gênico...................................................................
55
3.5.6 Estimativa do tamanho efetivo.............................................................
56
3.5.7 Caracterização do sistema reprodutivo.................................................
58
3.5.8 Distribuição espacial dos genótipos...................................................... 61
3.6 Análise estatística dos dados RAPD .......................................................
63
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO................................................................ 68
4.1 Sistemas enzimáticos...............................................................................
68
4.2 Padrões de segregação.............................................................................
70
4.3 Desequilíbrio de ligação..........................................................................
76
4.4 Sistema reprodutivo ................................................................................
4.4.1 Aderência ao Equilíbrio de Hardy-Weinberg e Equilíbrio de
Endogamia de Wright ...................................................................................
4.4.2 Homogeneidade das freqüências de pólen e óvulos.............................
4.4.3 Taxas de cruzamento multilocos e unilocos.........................................
4.4.4 Taxas de cruzamentos correlacionados.................................................
4.4.5 Coeficiente de coancestria e tamanho efetivo de variância..................
4.5 Distribuição espacial dos genótipos.........................................................
4.6 Caracterização da variação genética........................................................
4.6.1 Freqüências alélicas..............................................................................
4.6.2 Índices de variabilidade genética..........................................................
4.7 Estrutura genética....................................................................................
4.8 Fluxo gênico............................................................................................
4.9 Tamanho efetivo......................................................................................
4.10 Marcadores RAPD.................................................................................
4.10.1 Seleção dos primers............................................................................
4.10.2 Diversidade genética intrapopulacional..............................................
4.10.2.1 Similaridade genética intrapopulacional..........................................
4.10.3 Estrutura genética por marcadores RAPD..........................................
4.11 Considerações finais..............................................................................
5 CONCLUSÕES..........................................................................................
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.......................................................
78
78
81
86
91
94
95
105
105
110
113
117
120
122
122
123
126
134
140
143
144
RESUMO
MOURA, Márcia Cristina de Oliveira. Distribuição da variabilidade genética
em populações naturais de Eremanthus erythropappus (DC.) MacLeish
(Asteraceae) por marcadores isoenzimáticos e RAPD. 2005. 165 p. (Tese Doutorado em Engenharia Florestal) - Universidade Federal de Lavras, Lavras,
MG.1
A espécie Eremanthus erythropappus (DC.) MacLeish, conhecida
popularmente como candeia, apresenta grande potencial econômico, devido à
intensa utilização de sua madeira para a fabricação de moirões, sendo atualmente
muito visada por indústrias farmacêuticas e de cosméticos para a extração do
óleo α-bisabolol. Devido à sua importância comercial, esta espécie têm sido alvo
de intensa exploração. Para minimizar os efeitos da exploração indiscriminada,
têm surgido diversas propostas para o manejo sustentado dos candeiais, além de
sua inclusão em programas de melhoramento genético e de conservação
genética, in situ e ex situ. No entanto, para que tais programas sejam realmente
efetivos, é imprescindível que haja conhecimento sobre os níveis de
variabilidade genética existentes em suas populações naturais, como esta está
distribuída nessas populações, e também conhecer o sistema reprodutivo desta
espécie. Com o objetivo de disponibilizar tais informações, para que estas
possam auxiliar no direcionamento dos programas de manejo, melhoramento e
conservação, realizou-se o estudo da estrutura genética e do sistema reprodutivo
de E. erythropappus, por meio de técnicas moleculares (isoenzimas e RAPD). A
partir dos dados de 150 indivíduos, distribuídos em cinco populações naturais de
E. erythropappus, localizadas no Estado de Minas Gerais, Brasil, foi feita a
caracterização genética da espécie. Os resultados obtidos por marcadores
isoenzimáticos indicam alta variabilidade genética para espécie ( Ĥ e = 0,500 e
Ĥ o = 0,531). A análise da estrutura genética indicou que a maior parte da
variabilidade genética da espécie encontra-se dentro de suas populações naturais
( θˆ p = 0,035). Verificou-se a ausência de endogamia dentro ( fˆ = -0,091) e para o
conjunto das populações ( F̂ = -0,052), indicando que as mesmas encontram-se
em Equilíbrio de Hardy-Weinberg. O fluxo gênico estimado para o conjunto das
populações foi alto, com N̂m = 6,78. O tamanho efetivo para o conjunto das
populações N̂ e foi igual a 50, indicando o número mínimo de matrizes para a
coleta de sementes, visando a manutenção da variabilidade genética existente. A
análise da estrutura genética espacial mostrou que, em duas populações, BR e
1
Comitê Orientador: Dulcinéia de Carvalho - UFLA (Orientador).
i
CR, os genótipos não estavam distribuídos de maneira aleatória. As outras três
populações, BM, MP e PB não apresentaram estruturação espacial dos
genótipos. A análise de 400 progênies, provenientes de duas populações de E.
erythropappus, indica que esta é uma espécie alógama, com sistema misto de
reprodução ( tˆm iguais a 0,999 e 0,982, não diferentes da unidade e taxas de
cruzamentos individuais tˆ variando de 0,43 a 1,00). Apesar de não ter sido
verificada a ocorrência de endogamia nas progênies, as correlações de
paternidade indicaram a ocorrência de cruzamentos biparentais ( r̂p iguais a
0,651 e 0,718). Os níveis de variabilidade genética encontrados nas cinco
populações de E. erythropappus, obtidos por marcadores RAPD, são elevados,
com estimativas da diversidade genética de Nei ( Ĥ e ) variando de 0,335 a 0,367
e índice de Shannon ( Ĥ o ) variando de 0,498 a 0,539. Embora a maior parte
dessa variabilidade esteja contida dentro das populações, os valores de φˆST
iguais a 0,123 e 0,122, estimados pela AMOVA e o índice de Shannon,
respectivamente, indicaram divergência moderada entre as populações. A
estimativa da correlação de Mantel entre as matrizes de distâncias genética e
geográfica foi positiva e significativa (r = 0,653 e P= 0,0345), sugerindo que as
populações estudadas podem estar se diferenciando por um processo estocástico,
com fluxo gênico dependente da distância.
ii
ABSTRACT
MOURA, Márcia Cristina de Oliveira. Genetic variability distribution of natural
Eremanthus erythropappus (DC.) MacLeish (Asteraceae) populations obtained
by isozymatic markers and RADP. 2005. 165 p. (Doctoral Thesis in Forestry
Engineering) - Universidade Federal de Lavras, Lavras, MG.2
Eremanthus erythropappus (DC.) MacLeish, species known popularly as
“candeia”, presents a high economic potential, due to the intense utilization of its
wood for stakes production, and more recently, for the extraction of the αbisabolol oil by pharmaceutical and cosmetic industries. Due to its commercial
importance, this species has been target of predatory exploration. To avoid the
negative effects of such exploration, many proposals have been presented for the
sustainable management of the populations, such as the inclusion in programs of
genetic improvement and conservation in situ and ex situ. For these programs to
be effective, it is indispensable the information about the genetic variability
levels in its natural populations, how this variability is distributed in these
populations, and the knowledge of the reproductive system of this species.
Therefore a study of the genetic structure and the reproductive system of E.
erythropappus was carried out using molecular techniques (isozymes and
RAPD). The genetic characterization of the species was analyzed from the data
of 150 individuals, distributed in five natural E. erythropappus populations,
located in the State of Minas Gerais, Brazil. The results obtained from the
isozymatic markers indicate high genetic variability ( Ĥ e = 0.500 and Ĥ o =
0.531). The analysis of the genetic structure showed that the major part of the
genetic variability of the species is within its natural populations ( θˆ p = 0.035). It
was verified the absence of endogamy within ( fˆ = -0.091) and for the
population group ( F̂ = -0.052), indicating that these populations are in HardyWeinberg Equilibrium. The estimated genetic flow was high, with N̂m = 6.78.
The effective size of populations ( N̂ e ), which indicates the minimal number of
mother plants for seed collection aiming the maintenance of the existing natural
variability, was equal to 50 individuals. The analysis of the spatial genetic
structure showed that in two populations, the genotypes were not distributed
randomly. The other three populations did not show a spatial genotype structure.
The analysis of 400 progenies indicated that this is an allogamic species, with a
mixed reproduction system ( tˆm equals to 0.999 and 0.982). Although the
2
Advising Committee: Dulcinéia de Carvalho e Eduardo van den Berg, Universidade
Federal de Lavras, (UFLA).
iii
occurrence of endogamy was not verified in the progenies, the paternal
correlations indicated the occurrence of biparental crossings ( r̂p equals to 0.651
e 0.718). The genetic variability levels encountered in the populations of E.
erythropappus, obtained by RADP markers were high (Nei´s diversity ranging
from 0.335 to 0.367 and Shannon´s index from 0.498 to 0.539). Although the
greater part of this variability is present within the populations, the value of φˆST
equals to 0.123 and 0.122, estimated by the AMOVA and the Shannon index,
respectively, indicated significant divergence among the populations. The
Mantel correlation estimative among the genetic and geographical distances was
positive and significant (r = 0.653 e P= 0.0345), suggesting that the populations
analyzed may be differing by a stochastic process, with a genetic flow dependent
of the distance.
iv
1 INTRODUÇÃO
Os ecossistemas, nos quais se inserem as populações naturais de
espécies arbóreas tropicais, vêm sendo alterados ao longo dos anos, resultando
em áreas fragmentadas, formando mosaicos de vegetação remanescente,
mergulhados numa matriz antropizada. A redução indiscriminada dos biomas
pode reduzir sua diversidade biológica e comprometer o potencial evolutivo das
espécies, em função da perda de variabilidade genética, reduzindo o potencial
que as populações naturais têm de se adaptarem às mudanças ambientais.
Os estudos genéticos em populações naturais de espécies arbóreas visam
ao conhecimento dos níveis de variabilidade genética existente numa
determinada espécie, bem como da maneira que esta variabilidade está
distribuída entre e dentro de suas populações naturais. Este conhecimento é
fundamental para a efetivação de qualquer programa de conservação, manejo e
melhoramento genético de uma espécie. Nos estudos populacionais, diversos
parâmetros são estimados, permitindo o acesso a informações até então
desconhecidas para grande parte das espécies arbóreas tropicais. Dentre estas
espécies, a Eremanthus erythropappus, conhecida popularmente como candeia,
é uma espécie florestal bastante característica no Estado de Minas Gerais. Sua
madeira é muito valorizada, devido à sua durabilidade natural e produção de
óleo, cujo princípio ativo é utilizado amplamente em indústrias farmacêuticas e
de cosméticos. Devido à sua importância econômica, esta espécie vem sendo
explorada de maneira indiscriminada ao longo dos anos.
A exploração de E. erythropappus, caracterizada por práticas
predatórias, certamente levará a reduções drásticas no tamanho de suas
populações naturais, alterando o seu comportamento. Estas alterações podem
refletir nos seus padrões de distribuição espacial e no comportamento de
espécies relacionadas, como os polinizadores, por exemplo, afetando de forma
1
negativa a sua estrutura genética. Dentre os resultados dessas alterações, pode-se
mencionar a perda de alelos, reduzindo os níveis de variabilidade genética da
espécie e as modificações nas taxas de cruzamento, levando à ocorrência de
endogamia intrapopulacional. Como conseqüência, a manutenção e a utilização
da espécie, mesmo de forma sustentada, poderão ser comprometidas, devido à
erosão genética.
Considerando que o conhecimento da estrutura e da diversidade genética
de uma espécie, bem como a compreensão de outros fatores relacionados, é um
ponto chave para a adoção de estratégias de manejo mais adequadas para a sua
conservação genética, o objetivo geral desse trabalho foi fornecer informações
que possam ser utilizadas para a manutenção e conservação de E.
erythropappus. De maneira específica, este trabalho teve como finalidade:
i.
descrever os níveis de diversidade genética intrapopulacional em
cinco populações naturais de E. erythropappus, utilizando-se duas
classes diferentes de marcadores moleculares;
ii.
estudar a distribuição da variabilidade entre e dentro das populações
naturais, de modo a fornecer informações importantes para
programas de conservação e melhoramento genético da espécie;
iii. estimar o fluxo gênico e o tamanho efetivo das populações;
iv. estudar o sistema reprodutivo da espécie;
v.
verificar a existência de estruturação genética espacial nessas
populações.
2
2 REFERENCIAL TEÓRICO
2.1 Ocorrência natural da espécie
A espécie Eremanthus erythropappus (DC.) MacLeish (Vanillosmopsis
erythropappa Schultz-Bip) pertence à família Asteraceae, sendo conhecida
popularmente como candeia, pau-candeia e acende-candeia. Segundo Araújo
(1944), o nome candeia é devido à combustão da sua madeira e até mesmo das
folhas, que produz uma chama clara e brilhante semelhante a das candeias, não
deixando quase resíduos, devido à presença de seu óleo essencial. E.
erythropapus ocorre naturalmente em áreas montano-campestres nos estados da
Bahia, Espírito Santo, Rio de Janeiro, São Paulo e, de maneira abundante, em
Minas Gerais (Figura 1), formando amplos agregados nos cerrados e campos de
altitude (Araújo, 1944), com altitudes variando de 600 a 2000 m (Cândido,
1991).
No processo de sucessão ecológica, E. erythropapus é considerada uma
espécie pioneira, sendo precursora na invasão dos campos, colonizando solos
pobres, arenosos e até mesmo pedregosos (Araújo, 1944; Rizzini, 1981). As
árvores dessa espécie crescem em campos e pastagens abertas, com manchas de
vegetação baixa, cobrindo rapidamente o terreno, devido à fácil dispersão de
suas sementes e à alta adaptabilidade aos solos pobres, formando povoamentos
mais ou menos puros (CETEC, 1994), conhecidos como candeiais. Esta espécie
também se estabelece em floresta mesófila, após perturbações (Pedralli, 1997),
como a abertura de clareiras. Geralmente, os indivíduos de E. erythropapus
encontrados dentro dessas florestas são maiores, devido à competição com as
demais espécies por luz e, portanto, crescendo mais que os indivíduos que
formam os candeiais (Silva, 2001). No entanto, à medida que o processo
3
sucessional da floresta avança, ou seja, à medida que a floresta se torna mais
estruturada, o número de indivíduos da espécie diminui (Pedralli, 1997).
N
Km
0 40 80
160
240
320
Legenda:
Divisa do Estado de Minas Gerais
Ocorrência natural de Eremanthus erythropappus
FIGURA 1. Ocorrência natural de Eremanthus erythropappus no Estado de
Minas Gerais, Brasil (NEMAF, 2005).
Com relação às condições do solo, E. erythropapus parece ser pouco
exigente, pois ocorre em terrenos bem drenados nos altos das serras, em solos
arenosos e pedregosos, onde poucas espécies conseguem se estabelecer (Araújo,
1944). Já com relação às condições climáticas, de acordo com Cândido (1991), a
espécie prefere local em que a temperatura anual seja relativamente baixa,
porém, sem a ocorrência de geadas. Nos locais de ocorrência natural da espécie,
as chuvas são mais ou menos freqüentes, com cerca de 1200 a 1600 mm anuais.
4
2.2 Características da espécie
Fisionomicamente, E. erythropapus chama a atenção pela dupla
coloração de suas folhas, glabra e verde na face superior, tormentosa e alvacenta
na face inferior e nos ramos novos (Corrêa, 1931). As folhas são alternas, ovado
ou oblongo lanceolado, estreitadas na base e no ápice, acuminadas, subcoriáceas,
com sulcos no sentido longitudinal (Rizzini, 1981). Nos indivíduos adultos, o
tronco é casquento e acentuadamente gretado (Araújo, 1944) enquanto que, em
indivíduos jovens, o caule apresenta-se circundado por cicatrizes e arroxeado
próximo à base (Chaves & Ramalho, 1996). O sistema radicular é homogêneo,
com raiz pivotante (Araújo, 1944), pouco desenvolvido, não explorando uma
camada de terra muito profunda, sem o afloramento de raízes e sem dilatações
na base do tronco. De acordo com o CETEC (1994), o crescimento radicular é
rápido e, por não ser muito profundo, adapta-se bem aos solos rasos.
O porte das árvores de E. erythropapus, em ambiente de ocorrência
natural, está em torno dos 10 metros de altura, com fuste irregular e curto em
relação à copa, que se desenvolve no sentido horizontal (CETEC, 1994). Esse
formato da copa contribui para o processo de dispersão das sementes de E.
erythroappus que, por serem muito leves, são facilmente disseminadas pelo
vento a distâncias variáveis.
A floração de E. erythropapus começa quando a planta atinge os três
anos de idade (Cândido, 1991) e, embora a época de floração varie com o lugar e
os anos, ela ocorre na época seca, de julho a setembro (Cândido, 1991). O
período de frutificação da espécie varia de setembro a outubro (Pedralli, 1997),
podendo se estender até novembro (Cândido, 1991; Chaves, 1994), ou seja, a
frutificação se dá de dois a três meses após a floração. Os eventos fenológicos da
floração e posterior frutificação estão intimamente relacionados às condições
ambientais, principalmente à umidade (CETEC, 1994). Nos anos mais secos,
5
esses eventos ocorrem mais tarde do que em anos de maior precipitação. As
condições ambientais também influem na época de amadurecimento das
sementes, sendo essa uma característica individual da planta. É comum
observarmos indivíduos de E. erythropapus próximos apresentando diferentes
estágios de floração e frutificação, ou mesmo em um único indivíduo. Essa
variação, nos estágios de desenvolvimento floral, pode representar uma
estratégia de sobrevivência da planta, uma vez que apresentará, em diferentes
épocas, sementes maduras para o seu recrutamento via banco de sementes,
quando as condições ambientais forem favoráveis à germinação (Silva, 2003). A
floração da candeia, ocorrendo numa época mais seca e fria, a frutificação,
ocorrendo com o início da elevação da temperatura, e a dispersão das sementes,
coincidindo com o início das primeiras chuvas, representam também uma
estratégia de sobrevivência da espécie.
A espécie possui estruturas masculinas e femininas numa única flor
(andróginas) que se apresenta em capítulos de cor púrpura nas extremidades dos
ramos (Araújo, 1944). Na família Asteraceae, a unidade de dispersão é uma
semente aderida a uma estrutura de fruto (Baskin & Baskin, 1998). Nesse caso, o
fruto é do tipo cipsela, um aquênio de ovário ínfero. Este fruto possui uma
superfície cilíndrica com dez arestas de cor pardo-escura (Araújo, 1944), com
aproximadamente 2 mm de comprimento. A distribuição das flores e dos frutos
na borda externa da copa facilita a polinização e dispersão dos aquênios pelo
vento, graças a uma estrutura denominada “pappus”. A dispersão das sementes é
feita pelo vento, mas os frutos que caem no chão podem ainda ser transportados
pelo vento, água e até por animais, para locais mais propícios à sua germinação
(CETEC, 1994).
6
2.3 Importância econômica da espécie
A E. erythropappus é uma espécie submetida a um forte processo
exploratório, devido às propriedades da sua madeira. Embora podendo ser
utilizada para diversos fins como lenha, confecção de caibros, tacos e vigas, o
uso da espécie está mais voltado para a confecção de moirões, postes e esteios,
pois apresenta uma grande durabilidade natural. Cândido (1991) ressalta que,
embora a E. erythropapus apresente uma taxa de crescimento inferior à do
eucalipto, sua madeira dura cerca de cinco vezes mais. Nos últimos anos, a
exploração da espécie foi intensificada, devido ao aumento da procura de sua
madeira para a extração de óleo. Esse óleo essencial possui, como princípio
ativo, uma substância denominada alfabisabolol, que é largamente utilizada em
indústrias farmacêuticas e cosméticas, pois exibe propriedades antiflogísticas,
antibacterianas, antimicóticas e dermatológicas (Cristina, 1989; Rizzini, 1981) e
antiulcerogênicas (Nogueira, 2000).
Os produtos de E. erythropapus alcançam preços relativamente altos no
mercado, fazendo com que a candeia seja uma espécie bem remunerada. A dúzia
de moirões custa de R$35,00 a R$50,00, enquanto que o metro estéreo da
madeira para a extração do óleo varia de R$50,00 a R$90,00. Já o quilograma do
óleo bruto pode chegar a US$27,00, ao passo que o alfabisabolol pode ser
comercializado por até US$60,00 no mercado internacional (NEMAF, 2005).
Esses valores são interessantes pois mostram a viabilidade econômica dos
plantios dessa espécie, o que motiva a condução de programas de melhoramento
genético e a elaboração de planos de manejo para essa espécie. No entanto, além
da importância econômica, deve-se ter em mente a sua importância ambiental,
seja como espécie indicada para recuperar áreas degradadas (Silva, 2003), seja
como espécie constituinte de um ecossistema, englobando todas as suas relações
com outras espécies e com o próprio ambiente.
7
2.4 Efeitos da fragmentação e do manejo de populações naturais de
espécies arbóreas
Uma espécie é formada por populações espalhadas por sua área de
distribuição geográfica. Essas populações naturais são fonte de germoplasma
para programas de melhoramento genético e também são as unidades sobre as
quais incide o manejo para a produção ou conservação dos recursos naturais
(Robinson, 1998).
No entanto, os ecossistemas, nos quais as populações naturais estão
inseridas, vêm sofrendo diversas alterações, principalmente devido às atividades
humanas. Tais mudanças resultam em ecossistemas fragmentados, formando
mosaicos de vegetação remanescente, mergulhados numa matriz antropizada.
Nesse processo, grandes populações são reduzidas e subdivididas, o que pode
acarretar alterações em processos ecológicos e genéticos, como na riqueza e
composição de espécies (Murcia, 1995), no comportamento de polinizadores e
dispersores (Bawa, 1994; Nason & Hamrick, 1997), no sistema de reprodução
(Hall et al., 1996), e no fluxo gênico (Hamrick, 1987; Hamrick et al., 1993)
Young & Boyle (2000) consideram que os possíveis efeitos genéticos da
fragmentação são a perda da diversidade genética ao nível de população e de
espécie, mudanças na estrutura interpopulacional e aumento da endogamia. Uma
baixa variação genética poderia limitar a capacidade de resposta de uma espécie
a mudanças ambientais por meio de seleção. Após o processo de fragmentação,
as populações remanescentes apresentarão um número de indivíduos menor e,
se esse for abaixo do número mínimo adequado ( N e mínimo), pode ocorrer a
intensificação do processo de deriva genética, o que significa ter as freqüências
de seus alelos afastadas daquelas da população original, podendo até ocorrer a
perda de alelos. Além disso, aumenta-se a chance de ocorrência de endogamia,
8
decorrente da maior probabilidade de autofecundação e cruzamentos entre
indivíduos aparentados (Kageyama et al., 1998; Keller & Waller, 2002).
Além do processo de fragmentação, o manejo também pode ser
responsável pelas alterações nas populações naturais. Segundo Ratnam & Boyle
(2000) as atividades humanas modificam o tamanho e a estrutura da população,
tanto da espécie manejada como das outras espécies associadas a ela, alterando
sua estrutura genética e seus níveis de diversidade. Jennings et al. (2001)
consideram que o manejo pode resultar diretamente na perda de diversidade
genética, podendo levar à perda de alelos (especialmente alelos raros) e
promovendo um efeito conhecido como gargalo genético, que é o afunilamento
da base genética da população. Resultados publicados por Sebbenn et al.
(2000b) mostram que o manejo florestal levou a uma perda de alelos raros,
redução na diversidade gênica e aumento na taxa de autofecundação em
Tabebuia cassinoides.
Uma população sob manejo está sujeita a alterações no seu tamanho e
nos padrões de distribuição espacial dos seus indivíduos (Bawa & Krugman,
1990) acarretando mudanças na densidade e comportamento dos polinizadores,
alterando os níveis de cruzamento (Jennings et al., 2001; Murawski et al., 1994),
com o aumento da autofecundação e conseqüentemente da endogamia (Bawa &
Krugman, 1990). Nesse caso, a população natural pode estar sujeita à depressão
por endogamia (Keller & Waller, 2002), caracterizada pela redução na
produtividade, fertilidade, viabilidade das sementes, adaptação e vigor (Falconer
& Mackay, 1996; Mettler & Gregg, 1973).
Além desses efeitos, o
corte seletivo pode promover uma seleção
disgênica (Jennings et al., 2001; Lemes et al., 2003), resultante da contínua
exploração de indivíduos superiores, fazendo com que uma grande parte da
população remanescente seja constituída por indivíduos de qualidade inferior.
9
2.5 Variabilidade genética em populações naturais
O estudo genético de populações tem como um dos seus principais
objetivos a descrição da quantidade de variação genética existente. Tal variação
é uma condição fundamental para que haja evolução, uma vez que a seleção
natural atua entre as variantes que ocorrem dentro das populações em função da
adaptação ao ambiente, convergindo para a variação entre populações e,
finalmente, para a variação entre espécies (Torggler et al., 1995). Desta forma,
quanto maior a variabilidade genética existente na população, maiores suas
chances de perpetuação. A manutenção da variabilidade genética em populações
é a base da conservação de espécies (Yeeh et al., 1996) e, portanto, a sua
descrição e distribuição são fundamentais para o estabelecimento de práticas
conservacionistas realmente efetivas.
A detecção e quantificação da variabilidade genética também são de
grande interesse para o melhoramento genético, que busca variantes genéticas de
interesse para serem selecionadas (Torggler et al., 1995). De acordo com
Kageyama (1987) a diversidade genética ou variabilidade, devida a diferenças
nos alelos pode ocorrer nos seguintes níveis: a) de espécies dentro de
ecossistemas, b) de populações dentro de espécies e c) de indivíduos dentro de
populações da espécie.
A caracterização da variabilidade genética dentro de populações pode
ser efetuada a partir de medidas de diversidade genética intrapopulacional, que
poderão ser estimadas a partir de dados de marcadores genéticos.
Geneticamente, uma população não é apenas um grupo de indivíduos, mas um
grupo de indivíduos que se reproduzem e deixam descendentes e, portanto, além
de conhecer a constituição genética dos indivíduos, é necessário determinar
como os genes são transmitidos às próximas gerações. Nas progênies, novos
genótipos são formados a partir da combinação dos alelos transmitidos pelos
10
gametas dos genitores e, desta forma, a constituição genética da população em
relação aos alelos, que são transmitidos a cada geração, pode ser descrita pelas
freqüências alélicas (Falconer & Mackay, 1996). A freqüência alélica ou gênica
é a freqüência de um alelo particular em uma população e pode ser estimada
contando o número de vezes que cada alelo é encontrado, dividindo-se pelo
número total de genes da amostra (Nei, 1987).
A análise dos dados genéticos deve ser baseada em alguma teoria ou
modelo (Weir, 1996). O modelo clássico de uma população infinita, de
cruzamento aleatório, na ausência de mutação, migração e seleção – Teorema de
Hardy-Weinberg – permite que sejam feitas inferências estatísticas. Quando
ocorrem desvios das proporções esperadas pelo Equilíbrio de Hardy-Weinberg
significa que alguma das pressuposições do modelo foi violada e, então, são
propostos modelos alternativos para a verificação das possíveis causas do
desvio. As principais alterações nas freqüências alélicas nas populações naturais
podem ser devidas a processos sistemáticos como mutação, fluxo gênico
(migração) e seleção natural ou processo dispersivo, como a deriva genética
(Falconer & Mackay, 1996).
Considerando uma população em equilíbrio de Hardy-Weinberg, com N
indivíduos diplóides (2N), para um loco com dois alelos A1 e A2, com as
freqüências genotípicas dos indivíduos homozigotos dominantes (A1A1),
heterozigotos (A1A2) e homozigotos recessivos (A2A2) sendo P, H e Q,
respectivamente, podemos calcular que a freqüência do alelo A1 é igual a
(1/2)(2P + H) = p, enquanto que a freqüência do alelo A2 é igual a (1/2)(2Q + H)
= q. Nessa condição de equilíbrio, as freqüências genotípicas serão: P = p2, H =
2pq e Q = q2. A ocorrência desse equilíbrio pode ser verificada comparando-se
as freqüências genotípicas esperadas no equilíbrio com as freqüências
genotípicas observadas na população, fazendo o uso do teste do qui-quadrado ou
11
ainda, do teste exato de Fischer ou a razão da máxima verossimilhança (Weir,
1996).
Outra forma de caracterizar a variação intrapopulacional inclui a
variação alélica em locos estruturais (Weir, 1996), tais como a porcentagem de
locos polimórficos, o número médio de alelos por loco, o número efetivo de
alelos, heterozigosidade observada e a heterozigosidade média esperada segundo
as expectativas do EHW.
Porcentagem de locos polimórficos (P)
Um loco é chamado de polimórfico quando a freqüência do alelo
mais comum é igual ou inferior a 0,95 ou 0,99. Essa determinação de um
loco como sendo polimórfico ou não baseia-se em critérios arbitrários,
que classificam as freqüências alélicas de acordo com a sua maior ou
menor ocorrência na população. Segundo Cavalli & Winge (2003) esta
limitação impede que um loco cuja ocorrência de um alelo raro esteja
sendo mantida simplesmente por mutação recorrente seja considerado
polimórfico.
Esta medida expressa, em termos numéricos, a quantidade de
polimorfismo e é dada pela razão entre os locos polimórficos e o total de locos
da amostra (Torggler et al., 1995). No entanto, esta estatística apresenta alguns
problemas que incluem a própria definição de polimorfismo, a dependência do
tamanho amostral e o número e tipos de enzimas incluídas na pesquisa (Brown
& Weir, 1983). Conforme Nei (1987), a porcentagem de locos polimórficos não
é uma boa medida da variação genética, porém, quando um grande número de
indivíduos e locos são analisados, ela pode fornecer um aspecto importante
dessa variação dentro de populações.
12
Número médio de alelos por loco polimórfico (AP)
É uma medida que caracteriza um componente da diversidade, que é a
riqueza alélica (Brown & Weir, 1983). Quando o polimorfismo é alto, espera-se
que esta medida também seja alta. No entanto, Nei (1987) considera que, como
medida geral de variabilidade, esta estatística apresenta uma séria desvantagem,
que é a dependência do tamanho amostral. Esse entrave existe porque existem
muitos alelos de baixa freqüência em populações naturais e o número de alelos
aumenta com o tamanho amostral.
Número efetivo de alelos (Ae)
O conceito de número efetivo de alelos por loco foi introduzido por
Kimura & Crown (1964) e é definido como o recíproco da homozigosidade
esperada em cada loco por Ae = 1/Σ pi2 , em que pi é igual às freqüências
alélicas de cada loco i, calculando-se em seguida a média aritmética para todos
os locos. Murawski & Bawa (1994) consideram que ela reflete o número de
alelos necessário dentro de um loco para manter o nível atual de
heterozigosidade.
Heterozigosidade média esperada ( H e )
A medida mais completa de variabilidade genética intrapopulacional é o
grau de heterozigosidade esperada, pois sumariza a variação genética de uma
população em uma única estatística (Berg & Hamrick, 1997). Nei (1987)
13
considera que, por não depender da definição arbitrária de polimorfismo, a
heterozigosidade média é uma medida mais apropriada de variação genética.
Em uma população de cruzamentos ao acaso, seja pi a freqüência
populacional do i-ésimo alelo em um loco, a heterozigosidade para este loco
pode ser definida como:
hˆ = 1 − Σpi2
Nei (1987) considera que a média dessa quantidade sobre todos os locos
é a heterozigosidade média ( Ĥ ), sendo a proporção média de heterozigotos por
loco em uma população de cruzamentos aleatórios, sendo igual a proporção
esperada em Equilíbrio de Hardy-Weinberg de locos heterozigóticos em um
indivíduo escolhido ao acaso.
No entanto, essa interpretação não é valida para casos em que as
freqüências genotípicas desviam-se das proporções de Hardy-Weinberg. Neste
caso, Nei
(1973, 1987) considera Ĥ a probabilidade de que dois genes
escolhidos ao acaso numa população sejam diferentes, sendo equivalente a
heterozigosidade, e a chama de diversidade gênica. Assim, a heterozigosidade
média esperada ou diversidade gênica é uma medida de variação genética e seu
complemento é dado pela identidade genética ( Ĵ , sendo J = 1 − hˆ ). Desta
forma, independente de efeitos de migração, seleção, mutação ou sistema
reprodutivo, este valor permite uma idéia do nível de variação genética em uma
população de uma determinada espécie.
Brown & Weir (1983) consideram como principais vantagens da H e ,
como medida de variabilidade, sua relativa insensibilidade ao tamanho amostral
quando comparada a outras medidas e a fácil interpretação do seu significado e,
como desvantagem, sua dependência da freqüência dos dois alelos mais comuns.
Diversos estudos têm mostrado que a variabilidade genética difere entre espécies
14
(Tabela 1). Os níveis de variabilidade nas populações são afetados por uma
variedade de características genéticas e ecológicas e dos históricos de vida das
espécies, tais como, distribuição geográfica, sistema de reprodução, mecanismos
de dispersão de pólen e sementes (Brown, 1978; Hamrick, 1983).
Tabela 1. Número de populações (np), número de locos (nl), porcentagem de
locos polimórficos ( P̂ ), número médio de alelos por loco ( Â ) e
heterozigosidade esperada ( Ĥ e ) para algumas espécies arbóreas
tropicais, obtidos por marcadores isoenzimáticos.
Espécie
np
nl
P̂
Cedrella fissilis
1
8
76,9
2,31 0,243
Gandara (1996)
Genipa americana
2
8
50
1,63 0,182
Sebbenn (1997)
Pithecellobium elegans
8
6
35
1,24 0,130
Hall et al. (1996)
Bauhinia forficata
1
4
100
3,75 0,451
Santos (1994)
Euterpe edulis
8
7
87,5
2,98 0,446
Reis (1996b)
Cariniana legalis
4
14
100
2,87 0,355
Sebbenn (2001)
Caryocar brasiliense
4
10
100
2,80 0,499
Melo Júnior 2003)
Xylopia emarginata
2
11
100
1,72 0,410
Jaeger (2004)
Â
Ĥ e
Referência
2. 6 Estrutura Genética
Brown (1978) define estrutura genética como sendo a forma pela qual a
variabilidade genética é distribuída entre e dentro dos níveis hierárquicos de
subdivisão de uma espécie. Como os indivíduos de uma espécie raramente se
distribuem de maneira homogênea no espaço (Robinson, 1998), eles quase
sempre formam agregados, bandos, colônias ou qualquer outro tipo de
associação. Dessa forma, a estrutura genética de populações refere-se à
15
heterogeneidade na distribuição dos genótipos e do grau de endogamia dentro de
populações e entre estas. Loveless & Hamrick (1984) consideram que a estrutura
pode ser manifestada entre distintas populações geográficas, dentro de um grupo
local e até mesmo em grupos de progênies, podendo ainda ser definida como a
distribuição não aleatória dos alelos e genótipos (Hamrick, 1987).
O fundamento dos estudos de estrutura genética parte do teorema de
Hardy-Weinberg. Este modelo assume, sob certas premissas (já mencionadas no
tópico anterior), que a abundância relativa dos alelos não muda de uma geração
para outra; a única mudança na composição genética da população é a
redistribuição dos genótipos em freqüências que serão mantidas em todas as
gerações subseqüentes (Futuyma, 1992).
Assim, tomando-se como referência o teorema de Hardy-Weinberg, as
principais forças microevolutivas podem ser consideradas como desvios deste
equilíbrio e, portanto, a formação e manutenção da estrutura genética ocorre
devido às interações de um conjunto complexo de fatores evolutivos, tais como a
variação no conjunto gênico, organização desta variação dentro dos genótipos,
distribuição espacial dos genótipos, sistema de reprodução, dispersão das
progênies, seleção, deriva genética, mutação, fluxo gênico, eventos casuais,
além de processos de crescimento, mortalidade e reposição dos indivíduos, que
irão originar as futuras populações (Brown, 1978; Hamrick, 1983; Loveless &
Hamrick, 1984).
Hamrick (1989) considera que, em geral, a seleção e a deriva genética
aumentam a diferenciação entre as populações, enquanto que espécies que
apresentam intenso movimento de pólen e sementes têm menor diferenciação
do que espécies com fluxo gênico restrito. Espécies com grandes populações,
que apresentam sistema misto de reprodução e mecanismos eficientes de
dispersão de pólen e sementes apresentam, de maneira geral, alta variação
genética dentro das populações e baixa entre estas. Por outro lado, espécies com
16
pequenas populações, de autofecundação e/ou propagação vegetativa, com
limitada dispersão de pólen e sementes tendem a apresentar uma baixa
variabilidade dentro de suas populações e alta entre estas (Loveless & Hamrick,
1984; Zanettini & Cavalli, 2003).
A variabilidade genética para locos neutros de espécies arbóreas
tropicais está concentrada dentro das populações, apresentando baixos valores de
diferenciação entre estas (Tabela 2). Estudos sobre a distribuição da variação
genética em espécies tropicais, realizados por Loveless & Hamrick (1987)
mostram valores baixos de diferenciação populacional ( Ĝ ST médio = 0,050),
indicando que, para as oito espécies estudadas, 95% da variabilidade genética
estão contidas dentro das populações.
Para a compreensão da estrutura genética nas populações naturais de
plantas, além dos fatores já mencionados, é fundamental o estudo das variáveis
ecológicas que influem nessa estruturação. Existem vários fatores que
promovem a divergência entre populações, como a autogamia ou alogamia com
certo grau de endogamia; a morfologia floral a qual favorece ou dificulta certos
tipos de cruzamentos; a ação limitada de polinizadores e dispersores,
diretamente relacionada ao fluxo gênico; o estágio sucessional e o reduzido
tamanho populacional. Loveless & Hamrick (1984) procuraram avaliar a
influência destas variáveis biológicas e concluíram que espécies com reprodução
preferencialmente alógama, com amplo fluxo de pólen e sementes, pertencente
ao estágio final de sucessão, com ciclo de vida longo, tendem a apresentar
menor diferenciação entre suas populações.
17
Tabela 2. Distribuição da variabilidade isoenzimática em populações naturais de
espécies arbóreas tropicais, segundo abordagem pela estatística F de
Wright.
Espécie
Np
F̂IS
F̂IT
F̂ST
Referências
Myracrodruon urundeuva
2
0,449
0,517
0,035
Moraes (1992)
Euterpe edulis
8
-0,067 -0,033
0,031
Reis (1996b)
Chorisia speciosa
4
0,115
0,278
0,183
Souza (1997)
Cedrela fissilis
-
-
0,196
0,089
Gandara (1996)
Copaifera langsdorffii
3
-
0,130
0,131
Oliveira (2000)
Caryocar brasiliense
4
-0,449 -0,420
0,020
Melo Júnior (2003)
Xylopia emarginata
5
0,083
Jaeger (2004)
-
-0,298
np: número de populações estudadas.
2.6.1 Caracterização da estrutura genética
Modelos matemáticos derivados do teorema de Hardy-Weinberg
possibilitam quantificar a estrutura genética das populações sob estudo,
além de caracterizar seus eventos determinantes, permitindo assim o
entendimento do comportamento dos alelos e a dinâmica das populações
naturais.
Existem diferentes métodos estatísticos para caracterizar a estrutura
genética populacional, dos quais citam-se: as estatísticas F (Wright, 1951); a
diversidade genética de Nei (1973) e as análises de variância das freqüências
alélicas (Cockerham, 1969; Weir, 1996).
Na presença de equilíbrio de Hardy-Weinberg, pode-se dizer que não
existe nenhum nível de estruturação dentro da população, sendo que a
transmissão dos alelos se dá de maneira aleatória e a ocorrência de um alelo num
18
loco independe da ocorrência de outro alelo no mesmo loco (Carlini-Garcia,
2001). No entanto, diversos fatores podem levar a população a se desviar desta
condição de equilíbrio, entre eles o sistema reprodutivo. Quando a taxa de
autofecundação difere de zero ou quando há cruzamento entre indivíduos
aparentados, ocorre a endogamia, conduzindo a um desvio do EHW. Wright
(1922) propõem
uma medida desse desvio, denominado coeficiente de
endogamia. Esse coeficiente mede a redução da heterozigose a partir do teorema
de Hardy-Weinberg. No entanto, mesmo em espécies alógamas, o EHW deixa
de existir na presença de cruzamentos preferenciais, caracterizando uma
estruturação dentro da população. Além disso, podem existir outras causas para
este aumento da homozigose na população, como a ocorrência de deriva
genética. Por isso, talvez seja mais adequado utilizar o termo índice de fixação
para medir tais desvios.
O índice de fixação pode ser definido como a correlação entre os alelos
nos gametas que formam o zigoto. Wright (1951) também estabeleceu o índice
de panmixia P, sendo P = 1 – F. Malécot (1948), por sua vez, interpreta o
coeficiente F como a probabilidade de dois alelos presentes num loco de um
indivíduo serem idênticos por descendência. Desta forma, o índice de fixação
pode ser considerado como a correlação entre dois gametas, relativa à geração
parental, com o seu valor variando de –1 a + 1 ou como a probabilidade de
identidade por descendência na geração a qual pertencem, com seu valor
variando de 0 a + 1. Em termos numéricos, ambos os métodos dão o mesmo
resultado; a diferença estará apenas nas interpretações. No entanto, segundo
Wright (1965), as correlações se assemelham às probabilidades, pois correlações
entre gametas, calculadas a partir de genealogia, não podem ser negativas.
Quando o índice de fixação difere de zero, significa que está ocorrendo
desvio do EHW e, neste caso, a população pode atingir outro estado de
equilíbrio, denominado Equilíbrio de Wright (Equilíbrio com Endogamia).
19
Assim, numa população em equilíbrio , com um índice de fixação médio F, as
freqüências genotípicas passarão a ser: P = p2 + F pq, H = 2pq (1 – F) e Q = q2
+ F pq. Pelas expressões, nota-se que, se F é igual a 1, a população será
completamente homozigótica.
Wright (1951) considera o coeficiente F como uma medida do grau de
desvio do EHW nas populações. Como nas populações naturais podem ocorrer
vários níveis de estruturação, o autor, diante da necessidade de mensurar todos
os desvios possíveis, propôs um sistema aplicável a uma população com um
nível hierárquico de subdivisão. Considerando a população como um todo ( T ),
suas subpopulações ( S ) e seus indivíduos ( I ), foram definidos os seguintes
parâmetros: FIT como a correlação entre os gametas que se unem para formar os
indivíduos em relação à população, FST como a correlação entre gametas
tomados ao acaso nas subpopulações e mede o nível de diferenciação genética
entre subpopulações (Crow & Kimura, 1970; Wright, 1965) e FIS como a
correlação entre gametas que se unem para produzir indivíduos com relação à
subpopulação. Wright (1951, 1965) estabeleceu a relação (1 - FIT) = ( 1 – FIS)(1
– FST), sendo que o grau de endogamia dentro da população pode ser expresso
como FIS = (FIT – FST)/(1 – FST).
Nei (1973) propôs uma metodologia alternativa para a análise de
populações subdivididas que não requer o conhecimento das freqüências
genotípicas, podendo ser estimadas a partir das freqüências alélicas em termos
de heterozigosidade. Esta metodologia fornece a proporção da variabilidade
genética contida entre e dentro das populações e baseia-se nas identidades e
diversidades gênicas.
Como já mencionado anteriormente, a heterozigosidade esperada em
EHW H e é calculada por Hˆ = 1 − Σp i2 , sendo pi a freqüência do alelo i na
população. Para locos múltiplos, calcula-se a média aritmética dos valores de
Ĥ sobre todos os locos e, por isso, considera-se esta estatística como uma
20
versão multialélica das estatísticas F (Nei, 1973), sendo mais facilmente
estendida para locos com alelos múltiplos do que a estatística de Wright
(Robinson, 1998). A heterozigosidade esperada média total das subpopulações
( Ĥ T ) é decomposta em seus componentes Ĥ S , que corresponde à média
ponderada dos valores de Ĥ calculados para subpopulações e representa a
parte atribuída à variabilidade genética dentro de subpopulações e D̂ST que é o
componente da variabilidade atribuído à diferenciação entre subpopulações.
Dessa forma, temos que Hˆ T = Hˆ S + Dˆ ST . Nei (1973) fornece ainda uma razão
que mostra a proporção da variabilidade total explicada por diferenças genéticas
entre as subdivisões da população, que é expressa por Gˆ ST = Dˆ ST / Hˆ T .
A estatística GST é uma medida de diferenciação genética largamente
utilizada, pois não é afetada pelo sistema reprodutivo da espécie, pelo número de
alelos por loco e pela atuação de forças evolutivas (migração, seleção e
mutação). Seus valores variam de 0 a 1 e, de acordo Yeh (2000), valores
menores que 0,050 representam baixos níveis de diferenciação genética,
enquanto que valores acima de 0,151 indicam uma grande diferenciação.
Cockerham (1969) e Weir & Cockerham (1984) estabeleceram uma
outra metodologia para se estudar a estrutura genética de populações a partir de
marcadores codominantes, denominada análise de variância de freqüências
gênicas. Esta metodologia baseia-se na pressuposição de que as populações em
estudo são oriundas de uma mesma população ancestral, permitindo, assim, a
estimativa de coeficientes de coancestralidade e endogamia. Na ausência de
forças perturbadoras, as populações têm as mesmas freqüências alélicas. O
processo de amostragem genética (deriva), ao longo das gerações, promove
diferenciação intraespecífica e esta pode ser quantificada pela análise das
freqüências gênicas. Como a variância é uma propriedade dessas freqüências,
21
sua análise permite descrever a estrutura genética das populações (Cockerham,
1969; Weir, 1996).
Este método pressupõe um modelo aleatório, havendo uma população de
referência a partir da qual as populações ou subpopulações a serem estudadas se
originaram por deriva genética, ou seja, o modelo de Cockerham (1969) admite
geneticamente que a diversidade entre as populações foi provocada pela deriva
genética, ocorrida em gerações passadas (Vencovsky, 1992). Além disso, os
locos a serem analisados devem ser neutros, não podendo estar submetidos a
nenhuma pressão de seleção.
Cockerham (1969) aborda a estruturação em populações através das
covariâncias entre pares de alelos estimadas a partir de coeficientes de
coancestralidade entre indivíduos ou grupos, sendo estes obtidos a partir da
decomposição dos componentes da análise de variância das freqüências alélicas.
Considerando indivíduos diplóides, amostrados a partir de várias populações, as
três medidas propostas pelo autor são:
F (FIT de Wright): é a correlação entre alelos dentro de indivíduos em
todas as populações, representando o coeficiente de endogamia dos indivíduos
em relação ao conjunto de populações;
θ (FST de Wright): é a correlação de todos os alelos de diferentes
indivíduos na mesma população. É o coeficiente de coancestralidade e mede a
divergência entre populações;
f (FIS de Wrigth): é a correlação dos alelos dentro de indivíduos dentro
da população a qual estes indivíduos pertencem, ou seja, representa grau de
endogamia dentro de populações e pode ser expresso como f = (F - θ ) / ( 1 - θ ).
Desta forma, a análise das freqüências alélicas fornece os níveis de
fixação de alelos médios dentro das populações ( f ) e totais da população ( F ) e
a divergência genética entre populações (θ
relacionados por f = ( F - θ p) / ( 1 - θ p).
22
p),
sendo estes parâmetros
Na análise da estrutura genética de populações naturais, diversos autores
têm utilizado as estatísticas F de Wright (Eguiarte et al., 1992; Giudice Neto,
1999; Lacerda et al., 1999). Outros utilizam a partição da diversidade genética
de Nei (Loveless & Hamrick, 1987; Murawski & Bawa, 1994), enquanto que
muitos abordam a estrutura genética pelo modelo de Cockerham (Sebbenn,
2001; Jaeger, 2004). As três metodologias também têm sido utilizadas
simultaneamente por alguns autores (Moraes, 1992; Reis, 1996b; Melo Júnior,
2003). Destas, a análise de variância das freqüências alélicas apresenta uma
maior precisão (Reis, 1996b; Sebbenn, 2001), pois considera os dados como
uma amostra da população e suas estatísticas, sendo estimativas de um
parâmetro populacional verdadeiro, estão associadas a um erro amostral. As
estatísticas de Wright e a diversidade genética de Nei, por sua vez, não
consideram o erro associado à amostragem e, por isso, elas tendem a ser
viciadas, principalmente se o tamanho amostral for pequeno.
2.7 Fluxo gênico
As espécies arbóreas estão sujeitas a forças evolutivas que afetam a
distribuição da variação genética dentro e entre as suas populações. A seleção
natural favorece a adaptação a gradientes ambientais, podendo gerar
diferenciação genética entre as populações ou subdivisões numa população.
Enquanto que fatores, como o tamanho pequeno de uma população e a
endogamia, os quais reduzem a variação genética dentro da população via deriva
genética, podem contribuir para o desenvolvimento de uma heterogeneidade
genética entre populações, o fluxo gênico promove uma homogeneização
espacial da variação genética. Segundo Hamrick & Nason (2000), embora a
estrutura genética de uma população resulte de complexas interações entre
seleção, deriva e fluxo gênico, as espécies arbóreas com altas taxas de fluxo
23
gênico tendem a apresentar maior variação genética distribuída dentro de suas
populações e menor entre estas, quando comparadas a espécies com movimento
de genes limitado.
Neigel (1997) define fluxo gênico como o movimento de genes em
populações, incluindo todos os movimentos de gametas e propágulos que
efetivamente trocam genes na distribuição espacial. Conforme Slatkin (1981,
1985) o fluxo gênico é uma termo coletivo que inclui todos os mecanismos que
resultam no movimento de alelos de uma população para outra. As plantas
dispersam seus genes durante dois estágios de vida: a dispersão do pólen antes
da fertilização e a dispersão da semente após fertilização e desenvolvimento do
embrião. A ocorrência de dormência nas sementes de algumas espécies gera uma
sobreposição de gerações sucessivas, funcionando como um mecanismo de fluxo
gênico no tempo. Futuyma (1992) descreve quatro modelos básicos de fluxo
gênico: a) o modelo continente-ilha, em que o movimento dos genes é
unidirecional, partindo de uma população maior para outra menor e isolada ou,
para colonização; b) o modelo de ilhas, onde a migração ocorre ao acaso entre
um grupo de pequenas populações bem definidas; c) o modelo de alpondras ou
“stepping-stone”, onde as populações trocam migrantes entre populações
vizinhas e d) o modelo de isolamento por distância, no qual o fluxo ocorre entre
grupos vizinhos, em uma população contínua.
A importância do fluxo gênico está em contrapor os efeitos da deriva
genética, podendo ser quantificado através de medidas diretas e indiretas. Slatkin
(1985) apresenta resultados de diversos trabalhos com diferentes espécies e faz
uma revisão dos métodos utilizados para estimar o fluxo de genes, discutindo os
problemas e as pressuposições de cada um.
Os métodos diretos estimam o fluxo gênico contemporâneo e são
baseados em observações no movimento dos vetores de pólen e sementes, na
marcação do pólen e sementes, ou na identificação de alelos ou genótipos
24
migrantes, fazendo o uso de corantes, marcadores morfológicos e análise de
paternidade. Os métodos indiretos estimam o fluxo gênico histórico e baseiamse na distribuição da diversidade genética entre populações (Hamrick & Nason,
2000). Segundo Reis (1996a) os métodos indiretos fundamentam-se na relação
entre a taxa de migração (m) e a divergência entre populações, indicando uma
relação inversa entre a divergência e a migração, considerando um modelo de
ilhas.
Wright (1951) estabeleceu uma relação em que

^
1 1
Nm =  ^ −1
4  FST 
onde:
N̂m = número de migrantes por geração;
FST = divergência genética entre populações.
Dessa forma, o valor de FST pode ser usado para estimar o N̂m e,
conseqüentemente, o fluxo gênico. De acordo com Slatkin (1985), o FST obtido,
segundo o modelo de ilhas, não requer nenhuma pressuposição sobre as causas
das diferenças entre as subpopulações ou grupos. Slatkin & Barton (1989)
consideram ainda que a utilização de estimativas de divergência genética para
determinar o fluxo gênico é um método tão eficiente quanto outros métodos,
mesmo quando o modelo de estrutura populacional é contínuo ou quando
existem efeitos de seleção.
Wright (1951), baseando-se numa curva de distribuição de freqüências
gênicas entre grupos de uma população, demonstra que se Nm é igual a 1 por
geração, não haverá diferenciação genética significante entre populações, ou
seja, os efeitos da migração são suficientes para contrapor os efeitos da deriva.
25
As espécies arbóreas tropicais têm apresentado valores de Nm superiores a 1,
das quais citamos Euterpe edulis, com N̂m igual a 10,7 (Reis, 1996b), Genipa
americana com N̂m igual a 41,4 (Sebbenn, 1997) e Xylopia emarginata , cujo
N̂m foi igual a 13,8 (Jaeger, 2004).
Diversos são os fatores que podem afetar o fluxo de genes nas
populações naturais, como o sistema reprodutivo da espécie e as relações
ecológicas entre as plantas e seus polinizadores e dispersores. Em Hamrick &
Nason (2000) encontram-se valores de diversidade e de fluxo gênico para
diversas categorias de plantas.
2.8 Tamanho efetivo
O tamanho efetivo de uma população ( N e ) é o número de indivíduos
que efetivamente participam na reprodução e que contribuem para a geração
seguinte. Seu conceito e teoria foram desenvolvidos por Wright (1931) e Fisher
(1941) e ele representa o tamanho de uma população que apresenta a mesma
redução na variabilidade genética pela endogamia ou deriva de uma população
de referência panmítica, de tamanho finito N (Crow & Kimura, 1970). O
tamanho efetivo também refere-se à representatividade genética presente em
uma amostra n de plantas, sementes ou propágulos (Vencovsky, 1987).
Em populações naturais ocorre a sobreposição de gerações, existindo
indivíduos que ainda não atingiram a idade reprodutiva e outros que já a
ultrapassaram. Para fins genéticos, os indivíduos destas duas categorias não
contam para o tamanho efetivo da população (Robinson, 1998) e, portanto,
muitas vezes o tamanho efetivo costuma ser inferior ao tamanho da população.
Outros fatores contribuem para a redução desse tamanho, como o número
26
desigual de indivíduos masculinos e femininos, as diferenças de fertilidade entre
eles, o assincronismo no florescimento (; Lande, 1988; Loveless & Hamrick,
1984). Além disso, o tamanho efetivo depende dos níveis de endogamia e
parentesco existente na população e, portanto, quanto maiores estes níveis,
menor é a representatividade genética dos indivíduos (Vencovsky, 1987).
O conhecimento do tamanho efetivo de uma ou mais populações é
fundamental para conservação in situ de uma dada espécie, pois a partir dele
podemos delimitar a área mínima que deverá ser mantida. Frankel & Soulé
(1981) sugerem dois números de referência para o tamanho efetivo. Um N e de
50 seria suficiente para conter os efeitos da endogamia nas populações,
considerando 10 gerações, enquanto que um N e de 500 considera ainda que a
estocasticidade genética pode estar implicada na perda a longo prazo da
flexibilidade evolutiva e, por isso, este número seria suficiente para conter a
perda de variação genética na mesma. Entretanto, esses valores têm sido
criticados na literatura (Sebbenn, 2003), e outros tamanhos têm sido sugeridos.
Nunney & Campbell (1993) sugerem multiplicar os tamanhos efetivos de 50 e
500, determinados por Frankel & Soulé (1981), por duas a três vezes, o que
corresponde ao tamanho efetivo de 100 a 150, para conservação em curto prazo,
e de 1.000 a 1.500, para conservação em longo prazo.
2.9 Sistema reprodutivo
O sistema reprodutivo pode ser considerado como o fator mais influente
na estrutura genética das populações (Loveless & Hamrick, 1984), pois é ele
quem determina como as informações genéticas serão transferidas de uma
geração para a outra (Wright 1921). A caracterização do sistema de cruzamento
de uma espécie é fundamental para programas de melhoramento genético e de
conservação, permitindo o delineamento de estratégias que otimizem a
27
amostragem da variabilidade genética e a adoção de modelos genéticos e
estatísticos apropriados para a estimativa de seus parâmetros genéticos. As
espécies alógamas mantém a maior parte da sua variação genética dentro das
suas populações, enquanto que, em espécies autógamas, esta variação encontrase entre populações (Hamrick & Godt, 1989). O sistema misto de reprodução,
por sua vez, prediz variabilidade genética intermediária entre espécies de
autofecundação e alógamas, sendo o potencial de diferenciação entre populações
variável em função do balanço dessas duas formas de reprodução (Loveless &
Hamrick, 1984).
As espécies arbóreas apresentam uma ampla variedade de sistema de
reprodução, incluindo cruzamentos, autofecundação, apomixia e combinações
entre estas. Estudos sobre o sistema reprodutivo de espécies arbóreas tropicais
(Lacerda et al., 1999; Murawski et al., 1994; O’Malley & Bawa, 1987; Sebbenn,
2001), utilizando marcadores moleculares, mostram que a maioria das espécies
são alógamas ou apresentam um sistema misto de cruzamento, com
predominância de alogamia. Diversos fatores podem afetar o sistema
reprodutivo de uma espécie tais como o tamanho e a densidade populacional
(Franceschinelli & Bawa, 2000; Murawski & Hamrick, 1992), a sincronia no
florescimento e os padrões fenológicos (Hall et al., 1996), o grau de estruturação
genética nas populações (Franceschinelli & Bawa, 2000) e a presença de
mecanismos de auto-incompatibilidade (Murawski & Hamrick, 1992).
O sistema reprodutivo das espécies arbóreas pode ser caracterizado
basicamente por dois modelos: o modelo aleatório e o modelo misto de
reprodução. O modelo aleatório é o modelo de equilíbrio de Hardy-Weinberg e
de acordo com Sebbenn (2001), este modelo abstrai o problema essencial de
transmissão das informações genéticas em populações, ou seja, como a
distribuição das freqüências gênicas surge de uma geração para outra. A
pressuposição de cruzamentos aleatórios serve como um padrão de referência,
28
permitindo a comparação com os cruzamentos observados em populações
experimentais (Clegg, 1980).
Já o modelo misto de reprodução é o mais
difundido para a avaliação do sistema de reprodução em plantas, a partir de
dados de marcadores genéticos (Clegg, 1980) e ele divide o processo de
reprodução em dois componentes: cruzamentos aleatórios e autofecundação
(Clegg, 1980; Ritland & Jain, 1981). A taxa de cruzamento t pode ser estimada
pela metodologia proposta por Ritland & Jain (1981), baseada no emprego de
modelos multilocos.
2.10
Distribuição espacial dos genótipos
Diversos processos evolutivos e ecológicos, como a dispersão de
sementes, a competição inter e intraespecífica e a heterogeneidade do ambiente
podem afetar os padrões de distribuição espacial dos indivíduos dentro de uma
população (Kevin et al., 2004). Em adição aos processos ecológicos e
evolutivos, a estrutura genética espacial dentro das populações também pode
afetar os padrões de distribuição espacial, pela dispersão limitada de pólen e
sementes, deriva genética local, endogamia e seleção, favorecendo o mesmo ou
diferentes genótipos (Epperson, 1995; Heywood, 1991). Epperson & Allard
(1989) consideram que a estrutura espacial dos genótipos em populações é parte
integrante dos processos genéticos populacionais. De acordo com Sokal &
Menozzi (1982), a estruturação espacial dos genótipos pode servir como
indicativo de processos como migração, fluxo gênico, deriva genética e seleção
e, ainda, influenciar a dinâmica da endogamia biparental e depressão
endogâmica (Setsuko et al., 2004). A existência de estrutura genética espacial
positiva, ou seja, de indivíduos aparentados localizados próximos dentro das
populações, pode indicar ainda a ocorrência de cruzamentos endogâmicos
(Sebbenn, 1997).
29
O conhecimento e entendimento da estrutura genética espacial ao nível
populacional são cruciais para o manejo e conservação dos recursos genéticos
(Kevin et al., 2004), já que a presença de estruturação genética pode influenciar
padrões reprodutivos e evolucionários. Além disso, tal conhecimento é de
fundamental importância para o estabelecimento de estratégias de amostragem
em populações naturais, seja para fins de conservação ou melhoramento
genético (Miyamoto et al., 2002), permitindo a obtenção de amostras
representativas, podendo ainda minimizar o impacto das práticas de manejo na
sustentabilidade dos recursos genéticos (Gandara, 1996).
A estrutura genética espacial, ou seja, a maneira como os genótipos
estão distribuídos espacialmente numa população pode ser investigada utilizando
a análise de autocorrelação espacial. Os métodos de autocorrelação foram
desenvolvidos no início dos anos 50 (Moran, 1950 citado por Robinson, 1998) e
estendidos para a biologia por Sokal & Oden (1978), podendo ser aplicados à
genética como um procedimento exploratório (Robinson, 1998), procurando
explicar padrões de heterogeneidade genética. Legendre (1993) define a
autocorrelação espacial como a propriedade de variáveis assumirem valores, em
pares de localidades, separadas por uma certa distância, mais similares
(autocorrelação positiva) ou menos similares (autocorrelação negativa) do que
seria esperado pela associação aleatória dos pares observados. A análise de
autocorrelação espacial compreende um conjunto de procedimentos estatísticos
delineados para detectar e quantificar a dependência em uma variável baseada
em valores amostrados de localidades múltiplas, mapeadas em um espaço
geográfico (Heywood, 1991). Em estudos de genética populacional, utilizandose as freqüências alélicas, a autocorrelação espacial é usualmente mensurada
pelo índice I de Moran (Epperson & Chung, 2001; Kevin et al., 2004; Lacerda &
Kageyama, 2003b). Os valores da variável devem ser correlacionados com pares
de pontos em um plano; no entanto, nem todos os pares de pontos serão
30
relacionados, mas apenas aqueles considerados vizinhos (Sokal & Oden, 1978).
Entre os métodos mais freqüentemente utilizados para conectar os pares de
localidades amostrais vizinhas, estão o algoritmo do vizinho mais próximo e a
conexão de Gabriel (Heywood, 1991; Sokal & Oden, 1978).
A estrutura espacial dos genótipos também pode ser analisada a partir de
estimativas de coeficientes de parentesco ou coeficientes de coancestralidade,
baseados na probabilidade de identidade dos alelos em dois genes homólogos
amostrados da mesma maneira. As estimativas de coancestria são definidas
como probabilidade de identidade por descendência entre alelos (Ritland, 1996).
A partir de dados de marcadores genéticos estima-se uma “coancestria relativa”
que pode ser definida como a razão de diferenças de probabilidades de
identidade por estado (Rousset, 2002). O índice I de Moran tem sido utilizado
amplamente no estudo da distribuição espacial dos genótipos, mas,
recentemente, muitos autores têm empregado os coeficientes de coancestralidade
para analisar a estrutura genética espacial de espécies arbóreas (Loiselle et al.,
1995; Miyamoto et al., 2002; Ruggiero et al., 2005). Tais coeficientes, além de
informarem sobre a presença ou não de estruturação, indicam o grau de
parentesco entre os indivíduos.
Em uma população existem limitações físicas que podem dificultar os
cruzamentos aleatórios, devendo haver maior probabilidade de cruzamentos
entre indivíduos mais próximos, o que, por sua vez, pode levar à formação de
grupos, estruturando a população (Futuyma, 1992). Estudos sobre a estrutura
intrapopulacional de espécies arbóreas têm demonstrado que a distribuição de
alelos e genótipos não é aleatória dentro das populações. A existência de
estruturação genética espacial foi observada em populações de Ocotea odorifera
(Kageyama et al., 2003a), de Eschweilera ovata (Gusson, 2003), de Shorea
leprosula e Shorea ovalis (Kevin et al., 2004) e de Cryptocarya moschata
(Moraes et al., 2004). Por outro lado, há trabalhos envolvendo espécies arbóreas
31
tropicais que constataram a ausência de estruturação genética espacial, dos quais
citamos estudos com Platypodium elegans (Hamrick et al., 1993), Genipa
americana (Sebbenn, 1997), Chorisia speciosa (Souza, 1997), Cedrela fissilis
(Póvoa, 2002), Caryocar brasiliense (Melo Júnior, 2003) e Myracrodruon
urundeuva (Lacerda & Kageyama, 2003).
2.11
Marcadores moleculares no estudo de populações
O sucesso de um programa de melhoramento, manejo ou conservação
de uma espécie depende do conhecimento da quantidade de variação genética
presente. Esse importante conhecimento pode ser obtido por meio de marcadores
genéticos. Robinson (1998) define esses marcadores como sendo caracteres
qualitativos com herança mendeliana simples, facilmente reconhecida e cuja
expressão não é influenciada pelo meio ambiente.
Os
primeiros
marcadores
utilizados
foram
os
morfológicos,
determinados por mutações simples em um gene particular, gerando alterações
fenotípicas de fácil identificação. No entanto, devido às suas características
(reduzido número de marcadores, dependência do desenvolvimento da planta,
influência do ambiente) o uso desses marcadores ficou bastante limitado
(Carvalho & Torres, 2002; Ferreira & Grattapaglia, 1998).
Na década de 50, a introdução da técnica de eletroforese de isoenzimas
revelou uma nova fonte de marcadores genéticos capazes de detectar a
variabilidade de alelos de um loco codificador de uma proteína com função
enzimática. Segundo Pinto et al. (2001) esta técnica contribuiu para avanços
expressivos na área de genética de populações, revelando uma quantidade
significativa de variação nos mais diferentes organismos. As isoenzimas são
diferentes formas bioquímicas de uma enzima, com a mesma especificidade de
substrato, que podem ser identificadas por migração e coloração em gel. As
32
isoenzimas podem ser controladas por um ou vários alelos, situados num mesmo
loco, ou em diferentes locos (Alfenas et al., 1991) e são, em última análise,
produto da expressão dos genes.
A técnica de isoenzimas consiste em três etapas: extração das enzimas
do tecido vegetal, separação por eletroforese e coloração por métodos
histoquímicos. O padrão de bandas visualizado no gel constitui o fenótipo
eletroforético, que é interpretado, obtendo-se assim os genótipos dos indivíduos.
A população de indivíduos é então analisada em termos de locos e alelos, para
cada sistema enzimático. Para a interpretação dos padrões eletroforéticos, é
necessário o conhecimento prévio sobre o número de subunidades que compõe a
enzima (Carvalho & Torres, 2002; Pinto et al., 2001). A partir da leitura dos
fenótipos eletroforéticos são estimadas as freqüências alélicas e genotípicas, que
permitem a avaliação da estrutura genética das populações analisadas, levando a
conclusões sobre a magnitude e a distribuição da variabilidade entre e dentro das
populações, conseqüências evolutivas, diferenciação geográfica de populações
dentro de espécies, fluxo gênico e taxas de cruzamento (Torggler et al., 1995).
Estudos realizados na década de 60 por Lewontin & Hubby (1966) sobre
a estrutura genética populacional de Drosophila pseudoobscura contribuíram
para a disseminação dessa técnica e, atualmente, esse tipo de marcador tem sido
ainda muito utilizado no estudo de genética de populações, principalmente
naqueles envolvendo espécies arbóreas tropicais (Melo Júnior et al., 2004;
Oliveira et al., 2002; Ribas & Kageyama, 2004; Ribeiro & Lovato, 2004; Telles
et al., 2003). Entre as principais vantagens dos marcadores enzimáticos estão a
expressão
codominante,
permitindo
a
distinção
entre
homozigotos
e
heterozigotos e o custo relativamente mais baixo e acessível que dos marcadores
de DNA, principalmente quando se trabalha com espécies arbóreas nativas, das
quais poucas informações são conhecidas.
33
Com o advento das técnicas de biologia molecular, tornou-se possível a
manipulação do DNA, resultando no surgimento dos vários tipos de marcadores
moleculares disponíveis atualmente. O surgimento da técnica da reação de
polimerização em cadeia (PCR), na qual ocorre a síntese in vitro de milhões de
cópias de DNA, promoveu o desenvolvimento de novas classes de marcadores
moleculares. AFLPs, RAPDs, SCARs e microssatélites são exemplos de técnicas
baseadas em PCR que abriram novas e inúmeras possibilidades de utilização do
polimorfismo encontrado na molécula de DNA.
Os marcadores RAPD (Willians et al., 1990) baseiam-se na amplificação
via PCR de segmentos aleatórios de DNA, através de iniciadores (“primers”)
pequenos, com cerca de dez nucleotídeos, e de seqüência arbitrária com um
conteúdo de G + C entre 50 e 70%. Os primers ligam-se às seqüências
complementares em fitas opostas do DNA alvo e ocorre a amplificação in vitro
do segmento de DNA entre dois primers adjacentes, distanciados no máximo
entre 3 a 4 mil pares de bases, na presença da enzima Taq polimerase e de
nucleotídeos (Fritsh & Rieseberg, 1996). Essa técnica tornou-se muito popular,
devido, principalmente, à sua acessibilidade tecnológica e seu baixo custo,
podendo ser aplicada a um grande número de espécies. Além dessas, outras
vantagens são oferecidas pelos marcadores RAPD, como a não utilização de
radioatividade; não necessita do conhecimento prévio da seqüência a ser
amplificada e, ainda, a pequena quantidade de DNA necessária. Lynch &
Milligan (1994) consideram ainda que o uso desse tipo de marcador possibilita
uma amostragem aleatória mais ampla do genoma do que aquelas
proporcionadas por outras classes de marcadores.
No entanto, como o polimorfismo de RAPD está baseado em mutações
ou rearranjos nos sítios de anelamentos dos “primers”, ele se caracteriza pela
ausência ou presença de produtos amplificados, sendo, portanto, um marcador
com padrão de segregação dominante, com o qual não é possível a distinção
34
entre homozigotos e heterozigotos (Kirst, 1999). Essa dominância limita as
inferências estatísticas feitas com RAPDs, especialmente em organismos
diplóides, e pode fornecer algum viés na estimativa de alguns parâmetros
genéticos quando comparados com marcadores codominantes (Lynch &
Milligan, 1994). A natureza dominante e binária dos marcadores RAPD tem
limitado a análise da estrutura e diversidade em populações naturais,
principalmente com relação às estimativas da diversidade genética, freqüências
genotípicas, verificação do equilíbrio de Hardy-Weinberg e taxas de endogamia.
Modelos estatísticos foram desenvolvidos no sentido de contornar o
problema da dominância (Excoffier et al., 1992; Clark & Lanigan, 1993; Lynch
& Milligan, 1994). Em 1992, Excoffier et al. introduziram a estatística φ,
proporcionando uma nova alternativa para a análise dos dados obtidos por esses
marcadores. Uma análise de variância que incorpora as informações sobre a
divergência de DNA provenientes de dados de haplótipos, derivada de uma
matriz de distâncias quadradas em todos os pares de haplótipos, foi desenvolvida
por esses autores e é denominada análise de variância molecular (AMOVA). A
AMOVA estima os componentes de variância análogos às estatísticas F,
denominada estatística φ, refletindo a correlação da diversidade dos haplótipos
em diferentes níveis de subdivisão hierárquica. A significância dos componentes
de variância e das estatísticas φ é testada por meio de permutações. A base dessa
análise de variância molecular é que ela trata as distâncias genéticas como
desvios da média de um grupo e usa os quadrados dos desvios como variâncias,
permitindo a partição da variação genética entre e dentro das populações
analisadas. Esta metodologia acomoda diferentes tipos de matrizes de entrada,
fornecida por diversos tipos de marcadores moleculares, e diferentes tipos de
pressuposições evolutivas sem modificar a estrutura básica da análise. De acordo
com Excoffier et al. (1992) a AMOVA é facilmente aplicável em diferentes
35
situações e constitui uma estrutura coerente e flexível para a análise de dados
moleculares.
Além da questão estatística da análise dos dados obtidos por marcadores
dominantes, uma outra limitação dos marcadores RAPD se refere à baixa
repetibilidade de algumas bandas (Harris, 1999; Lacerda et al., 2002). No
entanto, esta limitação pode ser contornada por meio da utilização de uma
cuidadosa rotina laboratorial, evitando-se o máximo possível de variação nas
diferentes etapas da técnica, procedendo uma criteriosa escolha dos primers e
das bandas que serão utilizados (Bekessy et al., 2002; Palacios & GonzálesCandelas, 1997; Pérez et al., 1998). Huff et al. (1993) foram os primeiros a
utilizar a análise de variância molecular para dados provenientes de marcadores
RAPD no estudo da variação genética entre e dentro de populações naturais de
Buchloê dactyloides. A partir daí, surgiram diversos trabalhos utilizando
marcadores RAPD´s na determinação dos níveis de variação genética entre e
dentro de populações naturais de plantas e também para descrever parâmetros
populacionais, tais como o fluxo de genes, o sistema de cruzamento, o tamanho
efetivo e processos históricos que podem ter contribuído para estrutura genética
dessas espécies. Na literatura encontram-se relatados inúmeros trabalhos
envolvendo o uso de marcadores RAPD´s no estudo da genética de populações e
conservação genética de plantas. No caso de espécies arbóreas, esses estudos são
encontrados para Limonium dufourii (Palacios & Gonzáles-Candelas, 1997),
Caesalpinea echinata (Cardoso et al., 1998), Plathymenia reticulata (Lacerda et
al., 2001), Eugenia dysenterica (Zucchi, 2002), Trichilia pallida (Zimback et al.,
2004), Aspidosperma polyneuron (Torezan et al., 2005) e Cedrus atlantica
(Renau-Morata et al., 2005), entre outros.
O índice de Shannon, inicialmente utilizado em estudos ecológicos para
indicar a diversidade de espécies por área, foi introduzido em 1972 por
Lewontin (Lewontin. 1972) nos estudos de genética de populações. A utilização
36
desse índice como medida de diversidade populacional é bastante interessante,
especialmente quando se trabalha com dados RAPD, pois seu uso possibilita
contornar o problema da não detecção dos genótipos heterozigotos, já que o
índice de Shannon não se baseia na heterozigosidade da população e, sim, na
freqüência fenotípica da banda na população (Moura, 2003). Por isso, esse
índice tem sido utilizado em diversos trabalhos para estudo da variabilidade
genética com marcadores RAPD (Cardoso et al., 1998; Gillies et al., 1999;
Renau-Morata et al., 2005; Yeh et al., 1995).
Por ser uma técnica acessível, de custo relativamente menor a outras
técnicas que utilizam marcadores de DNA, como microssatélites e AFLPs, os
marcadores RAPD´s são considerados adequados para estimar a variabilidade
genética em bancos de germoplasma, para estudos de estrutura genética de
populações, estimativas de parâmetros genéticos, entre outros. Nymbom (2004)
considera que o uso de marcadores dominantes para acessar a variabilidade
genética entre indivíduos e populações, como o RAPD, é bastante promissor,
pois muitos locos polimórficos podem ser obtidos de forma rápida e fácil, num
espaço de tempo relativamente curto e sem o conhecimento prévio do genoma
das espécies sob estudo. Lacerda et al. (2002) consideram que essa técnica
mostra-se indicada para estudos envolvendo espécies ainda desconhecidas
geneticamente, como é o caso da maioria das espécies arbóreas tropicais,
permitindo a estimativa de importantes parâmetros genéticos em curto tempo. O
conhecimento desses parâmetros é fundamental para um direcionamento
adequado de programas de melhoramento, manejo e conservação genética,
tornando-os realmente efetivos.
37
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Caracterização dos locais de estudo
O material genético utilizado para a realização deste estudo foi
proveniente de cinco populações naturais de Eremanthus erythropappus,
localizadas no Estado de Minas Gerais, como pode ser visto na Figura 2.
A população Morro do Pilar (MP) localiza-se na Fazenda Coelhos, na
cidade de Morro do Pilar, MG. A cidade fica no centro do estado, localizada na
Serra do Cipó, que, por sua vez, faz parte do Complexo do Espinhaço. O clima
da Serra do Cipó é do tipo tropical de altitude com verões frescos e estação seca
bem definida. As temperaturas médias anuais estão em torno de 21,2 ºC, com
precipitação média anual de 1.622 mm. A vegetação é variada, com alto grau de
endemismo, composta por campos rupestres, campos cerrados e matas de
galeria.
A população Carrancas (CR) está contida num fragmento de Floresta
Semidecídua Alto-Montana, na Chapada das Perdizes, município de Carrancas,
MG. Esta área é considerada uma das mais importantes para a conservação da
biodiversidade no estado (Costa et al., 1998) e protege uma das nascentes do rio
Capivari.
Esta população
localiza-se nas coordenadas 21º36’29’’S
e
44º36’38’’W e a uma altitude que varia de 1.440 a 1.513 m. De acordo com
Oliveira-Filho et al. (2004) os campos de altitude predominam no alto da
chapada e estes encontram-se com a floresta ocupando um fundo de vale. O
clima é do tipo Cwa de Köppen, com temperatura média anual de 14,8 ºC e
precipitação média anual de 1.483 mm.
As populações Baependi Mônica (BM) e Baependi Roberto (BR)
localizam-se em Baependi, sul de Minas Gerais. O clima é mesotérmico úmido
do tipo Cwb, tropical de altitude, com verões suaves. A temperatura média anual
38
varia entre 18 a 19 ºC e a média anual de precipitação pluviométrica é de 1.400
mm. A área é caracterizada por vegetação do tipo campo cerrado, mata de
galeria e floresta semi-decídua montana.
A população Poço Bonito (PB) localiza-se no Parque Estadual Quedas
do Rio Bonito, situado ao sul do município de Lavras, MG, confrontando-se
com o município de Ingaí, MG, nas coordenadas 21º19’45’’S e 44º58’18’’W.
Está situado na região da Serra do Carrapato, que faz parte do complexo da
Serra da Bocaina, e apresenta altitudes que variam de 950 a 1.200m. A área do
parque é de 85,5 ha, e a vegetação é classificada por Oliveira-Filho & Fontes
(2000) como Floresta Semidecídua Alto-Montana.
N
Km
0 40 80
160
240
320
Legenda:
Divisa do Estado de Minas Gerais
Carrancas
Baependi
Poço Bonito
Morro do Pilar
"
"""
""""""
"""
"
"" """ " "
BM
""
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"""
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BR
FIGURA 2. Localização das populações naturais de Eremanthus erythropappus
avaliadas no presente estudo.
39
3.2 Amostragem dos indivíduos
Em cada uma das cinco populações foram amostrados aleatoriamente 30
indivíduos adultos, com a distância mínima de 50 metros entre eles. Os
indivíduos amostrados foram identificados e georeferenciados, utilizando-se o
Sistema de Posicionamento Global (GPS), para posterior análise de
autocorrelação espacial. A época das coletas variou de abril de 2002 a dezembro
de 2003.
Foram coletadas amostras foliares de cada indivíduo. As folhas eram
embaladas, identificadas e acondicionadas em caixa térmica com gelo para o
transporte. Em laboratório, o material vegetal era armazenado em freezer -80ºC,
até o momento da extração.
Em duas populações, BM e PB, foram coletadas sementes de todos os
indivíduos adultos (matrizes) para a análise das progênies. Para a produção das
mudas foram utilizadas sementeiras e, após a germinação, que ocorreu em torno
de duas semanas, as mudas foram selecionadas e mantidas no viveiro por cerca
de 30 a 40 dias. Vinte matrizes, de cada uma das populações, produziram boas
mudas para análise. De cada matriz, coletaram-se os tecidos foliares de 10
progênies, totalizando 200 progênies em cada população.
3.3 Extração das enzimas e análise eletroforética
Para a extração das enzimas utilizou-se 200 mg de tecido foliar para 1
mL de solução extratora. Após alguns testes, definiu-se a solução extratora que
melhor assegurou a integridade das enzimas (Tabela 3). Após a maceração, os
extratos obtidos foram centrifugados a 12.000 rpm a 4ºC por 10 minutos. Após a
40
centrifugação, 40 µL do sobrenadante, foram aplicados nas canaletas dos géis
para proceder as corridas eletroforéticas.
TABELA 3. Solução utilizada para extração de enzimas em Eremanthus
erythropappus (Alfenas et al., 1998).
Componentes
Fosfato de sódio monobásico
Sacarose
EDTA
DTT
L-ácido ascórbico; Na
Bissulfito de sódio
DIECA
PVP-360
β-mercaptoetanol
Albumina
Água destilada
Quantidade
552 mg
7g
29 mg
46 mg
99 mg
47 mg
102 mg
50 mg
100 µl
100 mg
100 ml
A eletroforese foi conduzida em cuba vertical, utilizando-se géis de
poliacrilamida como suporte. A concentração do gel de separação variou de 10 a
12,5%, de acordo com o sistema enzimático utilizado, buscando uma melhor
visualização do padrão de bandas. O gel de concentração utilizado foi de 4%.
Após a aplicação das amostras dos indivíduos no gel, conduzia-se a corrida
eletroforética a uma temperatura de 4ºC. A corrente elétrica aplicada era
constante (10 mA por gel) e a corrida durava cerca de 3 horas e 30 minutos.
Foram testados 21 sistemas enzimáticos (Tabela 4) para E.
erythropappus e, dentre estes, foram selecionados aqueles que apresentaram
maior número de locos polimórficos e melhores padrões isoenzimáticos para
interpretação.
41
TABELA 4. Sistemas enzimáticos testados para Eremanthus erythropappus,
suas siglas e código das enzimas.
Sistema Enzimático
Álcool desidrogenase
Diaforase
Enzima málica
α - esterase
β - esterase
Fosfatase ácida
Fosfatase alcalina
Fosfogluco isomerase
Fosfoglucomutase
6-fosfogluconato desidrogenase
Fumarase
β-galactose desidrogenase
Glucose 6-fosfato desidrogenase
Glucose desidrogenase
Glutamato desidrogenase
Glutamato oxaloacetato trasaminase
Isocitrato desidrogenase
Leucina aminopeptidase
Malato desidrogenase
Peroxidase
Sorbitol desidrogenase
Superóxido dismutase
Xiquimato desidrogenase
EC – “Enzime Comission”.
Sigla
ADH
DIA
ME
α-EST
β-EST
ACP
AKP
PGI
PGM
6PGDH
FUM
GLDH
G6PDH
GDH
GTDH
GOT
IDH
LAP
MDH
PO
SDH
SOD
SKDH
EC
1.1.1.1
1.6.04.3
1.1.1.4
3.1.1.1
3.1.1.1
3.1.3.2
3.1.3.1
5.3.1.9
5.4.2.2
1.1.1.44
4.2.1.2
1.1.1.48
1.1.1.49
1.1.1.47
1.4.1.3
2.6.1.1
1.1.1.42
3.4.11.1
1.1.1.37
1.11.1.7
1.1.1.14
1.15.1.1
1.1.1.25
Após a corrida eletroforética, foram feitas as revelações de acordo com o
sistema enzimático, segundo a metodologia de Brune et al. (1998), com algumas
modificações. Após o aparecimento das bandas, estas foram fixadas em solução
de glicerol 10% e, depois, os géis foram secos utilizando o conjunto Gel Dryer
(modelo 583) e Vacunn Pump da Biorad.
As interpretações dos padrões eletroforéticos obtidos foram feitas no
mesmo dia da corrida, logo após os géis terem sido colocados na solução de
glicerol 10%, quando as bandas eram mais nítidas. Fez-se, então, a genotipagem
42
dos indivíduos de cada população e também das progênies, originando o
zimograma de cada um. A identificação da zona codificadora dos locos e dos
alelos foi feita a partir da região mais catódica para a mais anódica. Desta forma,
o loco que mais migrou no gel foi denominado loco 1 e, dentro de cada loco, a
banda que migrou mais era denominada alelo 1.
A interpretação de cada sistema enzimático foi realizada seguindo os
padrões descritos por Alfenas et al. (1991), Kephart (1990) e Soltis & Soltis
(1989).
3.4 Extração do DNA genômico
Para a extração do DNA genômico utilizou-se o método CTAB descrito
por Doyle & Doyle (1987) com modificações. Utilizaram-se 200 mg de tecido
foliar de cada indivíduo e 800 µL d o tampão de extração (100mM de Tris pH
8,0; 1,4 M de NaCl; 20 mM de EDTA pH 8,0; 2% (p/v) CTAB; 1% (p/v) PVP40 e 0,2 % (v/v) de β-mercaptoetanol) pré- aquecido a 65ºC. O material foi
macerado em almofariz, utilizando areia lavada e PVP insolúvel. Após a
maceração, o material foi colocado em tubos Eppendorf de 2 mL,
homogeneizado e colocado em banho-Maria por 60 minutos a 65ºC, com
agitações periódicas. A primeira extração dos ácidos nucléicos foi realizada com
600 µL
de clorofórmio: álcool isoamílico (24:1, v/v), separando-se a fase
orgânica da fase aquosa por centrifugação a 12.000 rpm por 10 minutos. O
sobrenadante foi recuperado, sendo transferido para novo tubo, no qual
adicionaram-se 60 µL de solução 10% (p/v) CTAB
e 1,4 M NaCl. Após
homogeneização, nova extração com 600 µL de clorofórmio: álcool isoamílico
(24:1, v/v) foi feita e as amostra foram centrifugadas a 12.000 rpm por 10
minutos. A nova fase aquosa superior foi transferida para novo tubo,
43
adicionando-se 450 µL de isopropanol gelado, para precipitar o DNA, ficando
por 1 hora a –20ºC.
Após a precipitação do DNA, as amostras foram centrifugadas por 10
minutos a 10.000 rpm. O sobrenadante foi descartado e, em seguida,
adicionaram-se 200 µL de etanol 70 %, por 10 minutos. Após nova
centrifugação (10.000 rpm por 5 minutos), o etanol foi descartado e o pellet foi
seco em temperatura ambiente. O DNA foi então ressuspendido em 100 µL de
solução TE (1 mM Tris e 0,1 mM EDTA pH 8,0). A concentração de DNA de
cada amostra foi quantificada em fluorímetro Hoeffer DQ 200. Com a
concentração conhecida, o DNA de todas as amostras foi diluído a 10 ηg/µL,
para as reações RAPD.
3.4.1
Condições de amplificação do DNA genômico
Após a quantificação e diluição do DNA, as reações de amplificação
foram conduzidas em termociclador GeneAmp PCR System 9700, num volume
de 11 µL contendo: 50 mM de Tris pH 8,3; 2 mM de MgCl2; 5 µg/µL de BSA;
0,4 µM de primer (Operon Technologies); 0,2 mM dNTPs; 22 ng de DNA
molde; 1 unidade de Taq polimerase e H2O q.s.p.. As reações foram submetidas
a 45 ciclos de amplificação após desnaturação inicial a 94ºC por 2 minutos.
Cada ciclo constituiu-se de 15 segundos a 94ºC, 30 segundos a 42ºC e 30
segundos a 72ºC. Ao final dos 45 ciclos, foi realizada uma extensão final de 2
minutos a 72ºC.
Os produtos amplificados foram separados por eletroforese em géis de
agarose 1 %, utilizando o tampão de corrida TBE 1X. A voltagem aplicada foi
de 50 V durante 140 minutos. Após a corrida eletroforética, os géis foram
corados com brometo de etídio à concentração de 0,5 µL/mL, visualizados em
luz ultravioleta e fotografados.
44
3.4.2
Seleção de primers
Foram testados primers dos kits N, O e X da Operon Technologies.
Utilizaram-se duas plantas de cada população, totalizando 10 plantas para
verificar o perfil de amplificação de cada primer. Os critérios utilizados para a
escolha dos primers foi a maior produção e melhor resolução das bandas.
3.5 Análise estatística dos dados de isoenzimas
A interpretação dos zimogramas permitiu a determinação dos genótipos
de cada indivíduo, possibilitando a estimativa de vários parâmetros genéticos.
3.5.1 Análise de segregação
O estudo do padrão de segregação em E. erythropappus foi realizado
com base no método descrito por Gillet & Hattemer (1989), que compara o
genótipo da árvore materna com a segregação de suas progênies de polinização
aberta. Devem ser satisfeitas as seguintes condições: a) toda progênie de uma
árvore materna Ai Ai de possuir o alelo Ai da árvore mãe; b) em casos de uma
mãe heterozigota ( Ai A j , i ≠ j ): i) cada indivíduo de uma progênie deve possuir
um dos alelos da árvore materna, Ai . ou A j . ii) o número de progênies
heterozigotas Ai A j ( N ij ) deve ser igual à soma das progênies homozigotas
Ai Ai ( N ii ) e A j A j ( N jj ), N ij = N ii + N jj ; iii) o número de progênies
heterozigotas Ai Ak ( N ik ) é esperado ser igual ao número de progênies
heterozigotas heterozigotas A j Ak ( N jk ), N ik = N jk , com k ≠ i, j . Para esta
45
análise utilizaram-se as 10 plantas de cada uma das 20 progênies de polinização
aberta, de duas populações, BM e PB.
Os fenótipos observados em cada progênie de árvores heterozigóticas
foram comparados com o esperado pela hipótese de segregação 1:1. A hipótese
de segregação individual de cada progênie foi aceita ou descartada com base no
teste de G padrão, com um grau de liberdade. Posteriormente, todos os testes G
foram somados e um teste G total foi obtido ( G Hipótese1:1 ). Os fenótipos
observados, de progênies de árvores heterozigotas do mesmo genótipo materno,
foram somados e um teste G agrupado foi obtido ( G Agrupado ). A hipótese nula
desse teste é a de igual proporção dos tipos de gametas na progênie produzida
por diferentes árvores maternas de mesmo genótipo heterozigoto. A seguir,
testou-se a hipótese de homogeneidade de segregação entre progênies, usando
um teste G de homogeneidade ( G Homogeneidade ), obtido pela subtração do teste
G Agrupado do teste G Hipótese1:1 . Esses testes são aditivos, de forma que,
G Hipótese1:1 = G Homogeneidade + G Agrupado , com n e n-1 grau de liberdade,
respectivamente (Sousa et al., 2002).
3.5.2
Análise do desequilíbrio de ligação
O teste de desequilíbrio de ligação entre pares de locos foi realizado com
base na medida composta de Burrows ( ∆ ij ), de acordo com Weir (1979). Para a
obtenção dessa estimativa, utilizou-se o programa POPGENE versão 1.32
(Young et al., 2000). A hipótese nula de desequilíbrio de ligação ( ∆ ij = 0) foi
testada com o teste de qui-quadrado ( X 2 ), descrito em Weir (1979).
46
3.5.3 Caracterização da variação genética intrapopulacional
A variação genética de cada população foi caracterizada pela estimativa
das freqüências alélicas e dos índices de diversidade. As freqüências alélicas
descrevem a variação para cada loco e suas estimativas foram obtidas pelo
software BIOSYS-1 (Swofford & Selander, 1989), por meio da contagem direta
do número de alelos por loco, dividido pelo número de alelos no loco:
^
p
ij
=
nij
nj
em que:
pij - freqüência do alelo i na população j;
nij - número de ocorrência do alelo i na população j;
n.j - número total de alelos amostrados na população j.
A partir das freqüências alélicas foram obtidos os seguintes índices de
diversidade genética: heterozigose média observada ( Ĥ o ), heterozigose média
esperada ( Ĥ e ) de acordo com o equilíbrio de Hardy-Weinberg, número efetivo
médio de alelos por loco ( Â ) e porcentagem de locos polimórficos ( P̂ ). Esses
índices foram obtidos utilizando o software BIOSYS-1 (Swofford & Selander,
1989), com exceção do índice de fixação de Wright, obtido com o auxílio do
software Genetics Data Analysis - GDA (Lewis & Zaykin, 1999).
A porcentagem de locos polimórficos ( P̂ ) foi obtida pela média
aritmética do número de locos polimórficos pelo número total de locos.
Considerou-se polimórfico o loco em que a freqüência do alelo mais comum não
47
excedesse a 0,95, de acordo com Nei (1987), para amostras inferiores a 50
indivíduos.
O número médio de alelos por loco ( Â ) fornece uma idéia da
distribuição dos alelos nas diferentes populações estudadas. A estimativa do  ,
em cada população, foi obtida pela divisão do número total de alelos pelo
número total de locos.
Para a verificação dos locos em equilíbrio de Hardy-Weinberg utilizouse o teste exato de Fisher. Segundo Weir (1996), os testes exatos são geralmente
usados para tamanhos amostrais pequenos, quando há uma maior chance de ter
números esperados pequenos no teste qui-quadrado. Mesmo em amostras
moderadamente grandes, a existência de três alelos raros no loco resulta em
números esperados pequenos e, nesses casos, os testes exatos são preferíveis.
A heterozigose observada ( Ĥ o ) para cada loco foi obtida pela razão
entre o número total de heterozigotos e o número de indivíduos. Para se obter a
heterozigose média observada, as proporções obtidas para cada loco foram
somadas e divididas pelo número total de locos polimórficos:
^
H o = 1 − ∑ Pii
em que:
Ĥ o - estimativa da heterozigose observada;
Pii
- freqüência dos genótipos homozigotos.
A heterozigose esperada ( Ĥ e ) para cada loco em uma dada população,
foi obtida a partir das freqüências alélicas, segundo freqüências genotípicas
esperadas, conforme equilíbrio de Hardy-Weinberg, de acordo com Nei (1987).
48
A heterozigose média foi obtida pela média aritmética entre todos os locos
polimórficos analisados.
(
2n ∑ pi 2
(2n − 1)
^
He =
)
em que:
Ĥ e - estimativa da heterozigose esperada;
N - número de indivíduos amostrados na população em questão;
pi2 - freqüência alélica estimada do i-ésimo alelo.
O coeficiente f de Wright (1931), que mede a correlação entre os alelos
nos gametas que formaram um zigoto, foi obtido por loco e pela média dos
locos, a partir das seguintes relações:
Hˆ
f = 1 − o (locos)
Hˆ
^
^
f
e
Hˆ
∑
= 1−
∑ Hˆ
o
(média dos locos)
e
em que:
f
- estimativa do índice de fixação de Wright;
Ĥ e - estimativa da heterozigose esperada;
Ĥ o - estimativa da heterozigose observada.
Estes índices permitem acessar os níveis de fixações alélicas,
informando o grau de endogamia dentro das populações.
49
3.5.4 Caracterização da estrutura genética das populações
A estrutura genética foi abordada a partir dos coeficientes de
coancestralidade de Cockerham. Esta metodologia permite a avaliação da
divergência em diferentes níveis de hierarquia, além de calcular as estimativas
com correção para tamanho populacional finito. Os coeficientes de
coancestralidade são obtidos a partir da decomposição dos componentes de
variação da análise de variância das freqüências alélicas. Como este modelo
considera o processo amostral nas estimativas dos parâmetros, a análise de
variância apresenta uma precisão maior (Reis, 1996b; Sebbenn, 1997).
A análise de variância, considerando os indivíduos adultos, baseou-se no
seguinte modelo hierárquico de dois níveis:
Yijk = µ + pk + aj(k) + gi(jk)
em que:
Yijk
- freqüência do alelo i do indivíduo j da população k;
µ
- média geral;
pk
- efeito da população k;
aj(k) - efeito do indivíduo j dentro da população k;
gi(jk) - efeito do alelo i dentro do indivíduo j dentro da população k.
A partir das esperanças dos quadrados médios, demonstradas na Tabela
5, obtiveram-se as estimativas dos componentes de variância.
50
TABELA 5. Esquema de análise de variância das freqüências alélicas, com as
esperanças dos quadrados médios, E(QM) para os adultos de
Eremanthus erythropappus.
Graus de Quadrados
Esperanças (QM)
liberdade Médios (QM)
Fontes de variação
Entre populações
P–1
QMP
σ2G + 2σ2I + K1σ2p
Indivíduos/populações
1–P
QMI
σ2G + 2σ2I
G
QMG
σ2G
Alelos/Indivíduos/Populações
Total
n –1
Assim, os componentes de variância foram obtidos da seguinte maneira:
^ 2
G
σ
= QM G
σ
2
I
=
QM I − QM G
2
σ
2
P
=
QM P − QM I
K1
em que:
K1
- corresponde ao coeficiente das variâncias entre populações
O significado genético desses componentes, estimados a partir de cada
alelo, pode ser definido em termos de correlações intraclasse, ou coeficientes de
coancestralidade, nos diferentes níveis de hierarquia. Assim, baseado em
Cockerham (1969) e Weir (1996), tem-se que:
^
^
^
σ^ 2G = p1 − p 1 − F 



^
^
^
σ^ 2I = p1 − p 1 − θ P 


51

^
^
^
2
σ^ P = p1 − p  θ P

σ^
2
T
2
= σ^ G + σ^
2
I

^
2
^
+ σ^ P = p (1 − p )
em que:
p - freqüência alélica em um determinado loco;
^
^
F
^
θP
- coeficiente médio de endogamia de todas as plantas nas
populações analisadas;
- correlação entre as freqüências alélicas de diferentes indivíduos
da mesma população;
Dessa forma, a estimativa do coeficiente de coancestralidade foi obtida a
partir dos componentes de variância:
2
^
θP =
σ^ P
2
σ^ T
O coeficiente médio de endogamia de todas as plantas nas populações
( F̂ ) foi estimado por meio da seguinte expressão:
^
F=
2
2
σ^ T − σ^ G
2
σ^ T
Vencovsky (1992) estendeu o modelo de Cockerham para abrigar um
nível hierárquico intermediário de indivíduos dentro de famílias (progênies)
dentro de populações, permitindo a estimativa da coancestralidade entre
52
indivíduos dentro de famílias. Na análise de variância, envolvendo as progênies,
seguiu-se o modelo:
Yijk = µ + fk + aj(k) + gi(jk)
em que:
Yijk
- freqüência do alelo i do indivíduo j da progênie k;
µ
- média geral;
fk
- efeito da progênie k;
aj(k) - efeito do indivíduo j dentro da progênie k;
gi(jk) - efeito do alelo i dentro do indivíduo j dentro da progênie k.
As estimativas dos componentes de variância para as progênies foram
obtidas pela decomposição das esperanças dos quadrados médios da análise de
variância, conforme mostra a Tabela 6.
TABELA 6. Esquema de análise de variância das freqüências alélicas, com as
esperanças dos quadrados médios, E(QM) para as progênies de
Eremanthus erythropappus.
Fontes de variação
Entre progênies
Graus de Quadrados
Esperanças (QM)
liberdade Médios (QM)
σ2G + 2σ2I + K1σ2
F-1
QMF
F
Indivíduos/progênies
Alelos /Indivíduos/ progênies
Total
1–F
QMI
σ2G + 2σ2I
G
QMG
σ2G
n–1
Assim, tem-se:
^ 2
G
σ
53
= QM G
σ
2
I
=
QM I − QM G
2
σ
2
F
=
QM F − QM I
K1
em que:
K1
- Corresponde ao coeficiente das variâncias entre progênies
Baseado em Cockerham (1969) e Vencovsky (1992), esses componentes
podem ser definidos em termos de coeficientes de coancestralidade, nos
diferentes níveis de hierarquia. Assim, temos:
^
^
^
2
σ^ G = p1 − p 1 − F 



^
^
^
2
σ^ I = p1 − p 1 − θ F 



^
^ ^
σ^ 2 F = p1 − p  θ F


^
^
σ^ 2T = σ^ G2 + σ^ 2I + σ^ 2 F = p (1 − p )
em que:
p - freqüência alélica em um determinado loco;
^
F - correlação entre alelos de plantas de diferentes progênies, ou
^
coeficiente de endogamia de Wright;
^
θF
- coeficiente de parentesco ou coancestralidade das plantas dentro
de mesma progênie;
54
As estimativas dos coeficientes de coancestralidade podem, assim, ser
obtidas dos componentes de variância por:
^
θF =
^
σ^
2
F
2
σ^ T
2
F=
2
σ^ T − σ^ G
2
σ^ T
^
f =
Fˆ − θˆF
σˆ I2
=
σˆ I2 + σˆ G2 1 − θˆF
em que:
fˆ
- correlação entre alelos de plantas dentro de progênies ou
coeficiente de endogamia dentro das progênies.
Para verificar se as estimativas médias de θˆP , θˆF , F̂ e fˆ eram
diferentes de zero, foram estimados intervalos de confiança a 95% de
probabilidade pelo método de reamostragem bootstrap, com 10.000 repetições
sobre os locos. Para tal, empregou-se o programa GDA de Lewis & Zaykin
(1999).
3.5.5
Estimativa do fluxo gênico
As estimativas de fluxo gênico entre as populações basearam-se na
metodologia proposta por Wright (1951), que considera a quantidade de
migrantes ( N m ) e a divergência genética entre populações ( F̂ST ). Utilizou-se a
equação proposta por Crow & Aoki (1984):
55

1 1
Nˆm =  ^ −1
4α  FST 
em que:
(n (n − 1))2
α
-
n
- número de populações
N̂m - número de migrantes
No entanto, Cockerham & Weir (1993) consideram que o emprego do
θˆP como estimador da divergência entre populações é mais adequado, e por
isso, ele foi utilizado, ao invés do F̂ST .
No caso do modelo de ilhas, o N̂m mede o número de gametas que se
movem, enquanto que, nos modelos contínuos, como o isolamento por distância,
utiliza-se o N̂ b que representa o tamanho de vizinhança ou a área onde ocorre
panmixia. De acordo com Slatkin & Barton (1989), se assumirmos que a
dispersão ocorre de forma homogênea ao redor de uma árvore, a área de
vizinhança pode ser dada por:
Nˆ b = 2πNˆ m
3.5.6
Estimativa do tamanho efetivo
O tamanho efetivo pode ser estimado para várias situações, como para
uma população de plantas adultas, uma população estruturada em progênies,
várias populações, acessos de um banco de germoplasma, entre outras (Sebbenn,
2001). Com base em Vencovsky (1997), foram obtidas as estimativas de
tamanho efetivo para cada uma das situações:
56
a) Estimativa do N̂ e para amostra de indivíduos adultos de uma simples
população
Nˆ
e
=
n
1+ f
em que:
n - número de indivíduos;
f
- coeficiente de endogamia médio da população.
b) Estimativa do N̂ e para progênies maternas de uma simples população
Nˆ e =
0,5
 1 + C f 1  1 + Fˆ
−  +
m
n
2n

θˆF 
em que:
θˆF - coancestria entre indivíduos dentro de progênies ou divergência
genética entre progênies;
m - número de parentais ou progênies avaliadas;
n
Cf
- número total de indivíduos avaliados nas progênies;
-
quadrado do coeficiente de variação do número de indivíduos
avaliados nas progênies;
F̂ - índice de fixação para o conjunto das progênies.
57
c) Estimativa do N̂ e para várias populações
Nˆ e =
0,5
 1 + C P 1  1 + Fˆ
−  +
n
2n
 p
θˆP 
em que:
θˆP - coancestria entre indivíduos dentro das populações ou
divergência genética entre populações;
p
- número de populações avaliadas;
n
- número total de indivíduos avaliados nas populações;
CP
- quadrado do coeficiente de variação de ni sobre as populações;
F̂ - índice de fixação para o conjunto das populações.
3.5.7
Caracterização do sistema reprodutivo
O sistema de reprodução de Eremanthus erythropappus foi analisado
com base nos modelos de cruzamentos aleatórios, de cruzamentos mistos de
Ritland & Jain (1981) e de cruzamentos correlacionados (Ritland, 1989). O
modelo de cruzamentos aleatórios
foi avaliado pelo teste de Equilíbrio de
Hardy-Weinberg e pelo teste de homogeneidade entre as freqüências alélicas de
pólen e de óvulos. Para verificar a aderência dos dados ao Equilíbrio de HardWeinberg, utilizou-se o programa BIOSYS-1 (Swoford & Selander, 1989), que
calcula o desvio da distribuição dos genótipos observados com relação aos
esperados, segundo o EHW, fazendo o uso de três testes: a) o teste do quiquadrado agrupado b) o qui-quadrado não agrupado e c) o teste exato de Fisher.
Para separar os efeitos do sistema de reprodução (autofecundação, cruzamentos
58
entre aparentados ou preferenciais) dos fatores evolutivos (seleção, deriva
genética, migração e mutação) utilizou-se o teste de Equilíbrio de Endogamia de
Wright (EEW), de acordo com a Tabela 7. Este teste só foi realizado em locos
que apresentaram desvios do EHW e, no mínimo três alelos, visto que, em locos
com dois alelos não existem graus de liberdade suficientes (um grau de liberdade
a mais é perdido na estimativa do coeficiente de endogamia). O teste de
X 2 para verificar a aderência dos genótipos observados aos esperados no EEW
foi estimado conforme Vencovsky (1994):
X 2 = ∑ ( no − n e ) / n e
em que:
no
- freqüência genotípica observada;
ne - freqüência genotípica esperada.
No teste de homogeneidade das freqüências de pólen e óvulos, utilizouse o F̂ST (Nei, 1977) como uma medida de divergência genética entre as
freqüências alélicas dos diferentes grupos, semelhante a outros trabalhos (Hall et
al., 1994; Ribeiro & Lovato, 2004). Para testar a significância de F̂ST , para cada
loco, aplicou-se o teste de qui-quadrado, conforme Workman & Niswander
(1970):
X c = 2nFˆST (k − 1)
2
GL = (k − 1)( s − 1)
em que:
n
- número de indivíduos nos dois grupos;
k - número de alelos;
s - número de grupos.
59
TABELA 7. Freqüências genotípicas esperadas no Equilíbrio de HardyWeinberg e do Equilíbrio de Endogamia de Wright, para locos
com três alelos.
Genótipos
Freqüências genotípicas esperadas
Equilíbrio de HardyEquilíbrio de Endogamia de
Weinberg
Wright
A1 A1
A1 A2
A1 A3
A2 A2
A2 A3
A3 A3
p12
2 p1 p 2
2 p1 p3
p12 + p1 (1 − p1 ) f
2 p1 p 2 (1 − f )
2 p1 p3 (1 − f )
p 22
2 p 2 p3
p 22 + p 2 (1 − p 2 ) f
2 p 2 p3 (1 − f )
p32
p32 + p3 (1 − p3 ) f
Fonte: Reis (1996b).
Para a análise do sistema reprodutivo de Eremanthus erythropappus de
acordo com modelo de cruzamento misto de Ritland & Jain (1981), utilizou-se o
programa “MLTR” de Ritland (1997). Esse modelo de cruzamento assume que
as progênies resultam de uma mistura de cruzamentos aleatórios e
autofecundação e suas pressuposições básicas são:
1. cada evento de reprodução é o resultado de cruzamentos aleatórios (com
probabilidade t) ou de autofecundação (com probabilidade s);
2. a probabilidade de cruzamentos é independente do genótipo materno;
3. o conjunto de pólen é homogêneo para o cruzamento com todos os
genótipos maternos;
4. os alelos de diferentes locos segregam de maneira independente;
5. os locos avaliados não sofreram mutação ou seleção entre o tempo de
cruzamento e a análise.
60
A partir do programa foram estimados, para a população, a taxa de
cruzamento multilocos ( tˆm ), pelo método da máxima verossimilhança, a taxa de
cruzamentos unilocos
( tˆs ), a taxa de cruzamento entre aparentados
( tˆp = tˆm − tˆs ), as freqüências alélicas do óvulo e pólen (o e p), também pelo
método da máxima verossimilhança, a taxa de cruzamento por árvore materna, a
proporção de autofecundação ( sˆ = 1 − tˆm ), a correlação de autofecundação entre
dois irmãos ( r̂s ) e a correlação de paternidade entre dois irmãos ( r̂p ). Para
estimar o erro padrão da média para todos os parâmetros, o programa utilizou o
procedimento de amostragem bootstrap, com 1.000 reamostragens, com base em
Vencovsky (1997). Para a taxa de cruzamento individual por árvore materna, a
unidade de amostragem foram as plantas dentro das matrizes e matrizes para a
taxa de cruzamento média das populações.
3.5.8
Distribuição espacial dos genótipos
A análise da estrutura espacial dos genótipos foi realizada dentro de
cada uma das populações de E. erythropappus. Estimou-se o coeficiente de
coancestria θˆxy entre pares de indivíduos para 10 classes de distância, usando o
coeficiente de coancestria proposto por Ritland (1996). Para a estimativa θˆxy
empregou-se o programa SPAGeDi versão 1.1 (Hardy & Vekemans, 2003). O
erro padrão da média das estimativas foi obtido por reamostragem jackknife
entre locos e, a partir dele, foram construídos intervalos de confiança a 95% de
probabilidade do coeficiente de coancestria médio estimado para cada classe de
distância. A ausência de estrutura genética espacial foi testada dentro de cada
classe de distância utilizando-se 1.000 permutações.
61
A caracterização da estrutura espacial também foi efetuada pelo Índice I
de Moran, de acordo com Sokal & Oden (1978), o qual pode assumir valores
entre –1 e +1, sendo que –1 significa que os indivíduos pareados são
completamente diferentes, e o valor +1 significa que os indivíduos pareados são
idênticos. O valor zero significa ausência de autocorrelação, isto é, os indivíduos
estão distribuídos no espaço de forma aleatória. O índice de Moran é calculado
para uma dada classe de distância s q . Para cada alelo, o índice Iˆq é calculado
da seguinte forma:
n
n∑
Iq =
i=I
n
∑w
ij
(ai − a )(a j − a )
j ≠i
n
W ∑ (ai − a )
n
W =∑
2
i=I
n
∑w
ij
j ≠i
i=I
em que:
n
- número total da amostra;
wij - pesos utilizados na comparação dos pontos, sendo wij = 1 se os
indivíduos i e j pertencem ao intervalo s q ; do contrário, wij = 0.
ai aj -
W -
Peso dado ao indivíduo i (xi = 1,0; 0,5 ou 0)
Peso dado ao indivíduo j (xj = 1,0; 0,5 ou 0)
Soma de todos os pesos
Os valores estimados do índice I de Moran foram usados para testar a
significância dos desvios dos valores esperados, E ( I ) = −1 /(n − 1) , sobre a
hipótese de nulidade de distribuição aleatória (Cliff & Ord, 1981). Para análise
de autocorrelação espacial, utilizou-se o software SGS (Degen, 2001), obtendo-
62
se o correlograma da média entre locos e seus respectivos intervalos de
confiança a 95% de probabilidade.
3.6 Análise estatística dos dados RAPD
A partir da leitura criteriosa dos géis foi gerada uma matriz binária em
que os indivíduos foram genotipados quanto a presença (1) ou ausência de
bandas (0). As bandas que apresentaram coloração fraca e baixa definição foram
descartadas. Um loco foi considerado polimórfico para a população quando, pelo
menos, dois indivíduos foram diferentes em relação aos demais, considerando a
presença ou ausência de bandas. A porcentagem de polimorfismo obtido com
cada primer utilizado, através da fórmula:
P=
nbp
nbt
em que:
P
- porcentagem de polimorfismo;
Nbp - número de bandas polimórficas;
Nbt - número de bandas total.
O programa NTSYS – PC 2.0 (Rohlf, 1992) foi utilizado para estimar a
similaridade entre os genótipos. O cálculo de similaridade entre os indivíduos foi
realizado utilizando o coeficiente de similaridade de Jaccard, conforme a
expressão abaixo:
S ij =
63
a
a+b+c
em que:
a
b
c
- número de casos em que ocorre a presença da banda em ambos
os indivíduos, simultaneamente;
- número de casos em que ocorre a presença da banda somente
no indivíduo i;
- número de casos em que ocorre a presença da banda somente
no indivíduo j.
A partir dos índices de similaridade entre os indivíduos de cada
população obteve-se uma matriz de similaridade. A representação simplificada
das similaridades foi feita pela construção de dendrogramas para cada
população. Os dendrogramas foram definidos pelo critério de agrupamento
UPGMA (Unweighted Pair-Group Method Mean Analysis) utilizando a rotina
SAHN (Sequential Agglomerative, Hierarchical, and Nested Clustering).
Para a análise do intrapopulacional e também para o conjunto das
populações de E. erythropappus foi utilizado o software POPGENE versão 1.32
(Young et al., 2000), utilizando parâmetros para dados diplóides dominantes.
Foram estimados o número de alelos observados ( n a ), o número de alelos
efetivos ( ne ), a diversidade gênica de Nei (1973) ( Ĥ e ) e o índice de Shannon
( H o ).
Os estudos que utilizam marcadores RAPD para estimar as freqüências
alélicas p e q a partir da raiz quadrada da freqüência dos homozigotos nulos (q2)
devem assumir que as populações estão em equilíbrio de Hardy-Weinberg
(Aagaard et al., 1998; Morden & Loeffler, 1999). Entretanto, para as espécies
que apresentam algum grau de endogamia ou autofecundação, essa
pressuposição nem sempre é verdadeira e pode levar a estimativas enviesadas,
especialmente quando estas se baseiam em amostras de pequeno tamanho (Haig
et al., 1994; Lynch & Milligan, 1994). Como o índice de Shannon baseia-se na
freqüência fenotípica da banda na população, a pressuposição de equilíbrio de
64
Hardy-Weinberg não se faz necessária. Dessa maneira, o grau de diversidade
dentro de cada população foi quantificado pelo Índice de Shannon, além do Ĥ e
de Nei (1973). O índice de Shannon da diversidade fenotípica ( H o ) é dado pela
seguinte expressão:
Hˆ o = −∑ pi log 2 pi
em que:
pi
- freqüência da presença ou ausência de banda.
A diversidade média das populações é representada por Ĥ pop , calculada
pela média dos valores de Ĥ o . A diversidade total para a espécie ( Ĥ sp ) é dada
por:
Hˆ sp = −∑ p log 2 p
em que:
p
- freqüência média da presença ou ausência de banda
considerando todos os indivíduos amostrados.
Para inferir sobre a estrutura genética das populações, foi realizada a
análise de variância de dados moleculares – AMOVA (Excoffier et al., 1992),
realizada através da decomposição total nas suas componentes entre e dentro de
populações (Tabela 8). Semelhante ao índice de Shannon, a AMOVA não
necessita da pressuposição de EHW, o que é vantajoso. Essa análise utilizou as
distâncias genéticas ao quadrado, com o auxílio do programa ARLEQUIM
(Schneider et al., 2000), que foram obtidas conforme Nei & Li (1979):
65

2n xy 
D = δ xy2 = 100 1 −

 n x + n y 
{ }
em que:
n x e n y - números de marcadores observados em indivíduos x e y,
respectivamente;
2n xy
- número de marcas existentes em ambos indivíduos.
Para cada par de populações foi calculado uma medida análoga ao FST
de Wright (1951), simbolizada por φ ST . O número de migrantes foi estimado de
maneira indireta, pela expressão Nˆ m = 0,25(1 / φˆST − 1) .
TABELA 8. Esquema da análise de variância molecular (AMOVA).
Fonte de variação
GL
SQ
QM
E(QM)
Entre populações
P-1
SQa
QMa
nσ a2 + σ b2
Dentro populações
N-P
SQb
QMb
σ b2
Total
N-1
SQT
σ T2
(Fonte: Schneider et al., 2000).
onde n e φ ST são definidos por
N −∑
n=
N p2
P
P −1
66
N
φ ST
σ a2
= 2
σT
em que:
N
- número total de indivíduos para os dados genotípicos;
P
- número total de populações;
Np
- número de indivíduos na população p para os dados
genotípicos;
φ ST
- proporção da variabilidade molecular de haplótipos entre
populações.
Os parâmetros σ a2 e φ ST foram testados por meio de 1.000 permutações
dos haplótipos entre populações.
67
4
RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Sistemas enzimáticos
Dos 22 sistemas enzimáticos testados para E. erythropappus, 18
apresentaram atividade, enquanto que quatro sistemas – Fumarase (FUM),
diaforase (DIA), Superóxido Dismutase (SOD) e Enzima Málica (ME) – não
apresentaram atividade enzimática. Dez sistemas foram selecionados para o
estudo da espécie, em função da resolução do padrão de bandas e também do
número de locos presentes. A Figura 3 apresenta alguns padrões isoenzimáticos
obtidos para E. erythropappus.
Na análise dos indivíduos adultos, os dez sistemas isoenzimáticos
utilizados revelaram 38 zonas de atividade, sendo 21 passíveis de interpretação.
A maioria dos estudos com espécies florestais, utilizando dados de marcadores
genéticos, tem usado de 5 a 30 locos. De acordo com Ayala & Kinger (1984) a
utilização de pelo menos 20 locos proporcionam estimativas confiáveis dos
índices de diversidade e medidas de estrutura genética. As enzimas α e βesterase apresentaram cinco zonas de atividade, sendo três locos descartados por
problemas de interpretação. Destes dois locos analisados, o mais anódico
apresentou enzima com estrutura monomérica e três alelos. O mais catódico
também apresentou expressão monomérica, porém com dois alelos. A ACP
apresentou três zonas de atividade, sendo um loco monomórfico e apenas uma,
com dois alelos e composta por enzima monomérica, permitiu a interpretação.
As enzimas GDH, MDH e ADH apresentaram quatro zonas de atividade cada
uma, com bandas acromáticas, sendo as duas mais anódicas utilizadas no estudo,
com dois alelos cada e expressão monomérica. A GOT apresentou apenas um
loco, polimórfico com dois alelos e expressão monomérica. Para as enzimas
SDH e GLDH foi possível identificar quatro zonas de atividade, porém apenas
68
três foram utilizadas na análise, todas monoméricas e com dois alelos cada. A
GTDH apresentou quatro zonas de atividade, sendo uma delas descartada devido
à baixa resolução das bandas. Dos três locos analisados, todos apresentaram
enzima monomérica, com dois alelos, sendo que o mais catódico apresentou
bandas cromáticas, enquanto que os dois mais anódicos apresentaram bandas
acromáticas.
A análise genética das progênies de Baependi (BM) foi realizada
utilizando-se 18 locos polimórficos, distribuídos em dez sistemas enzimáticos,
enquanto que, na análise das progênies de Poço Bonito (PB), utilizaram-se onze
locos polimórficos, obtidos em nove sistemas enzimáticos. Os padrões de bandas
e as interpretações foram as mesmas dos indivíduos adultos, apenas descartando
os locos que apresentaram muitas falhas, instabilidade e dificuldades na
interpretação.
A
B
FIGURA 3. Amostras de géis de diferentes sistemas isoenzimáticos utilizados
para a análise genética de Eremanthus erythropappus. A: revelação
para enzima β-esterase. B: revelação para enzima MDH.
69
4.2 Padrões de segregação
Em estudos de sistema reprodutivo, é desejável o conhecimento dos
padrões de segregação, confirmando a herança genética mendeliana dos
marcadores isoenzimáticos (Lewandowski, 2000; Sebbenn, 2004), pois a todos
os modelos adotados na genética de populações assume uma segregação
meiótica regular nos locos, ausência de seleção e fertilização aleatória dos
gametas.
Foram detectados poucos indícios de heterogeneidade de segregação
entre as progênies de árvores heterozigóticas de mesmo genótipo materno.
Somente os locos GDH-1 e MDH-2 da população BM (Tabela 9) e os locos αEST-1 e GDH-1 da população PB (Tabela 10) apresentaram desvios
significativos para o teste G Homogeneidade . Estes resultados indicam que para a
maior parte dos locos avaliados, nas populações BM e PB, a segregação é
homogênea entre progênies de diferentes árvores de mesmo genótipo materno.
Nas progênies da população BM, apenas quatro dos dezoito locos avaliados
apresentaram desvios da segregação. O loco α-EST-2 apresentou desvio
significativo da hipótese 1:1 no teste G Agrupado1:1 , devido ao excesso de
homozigotos. O loco ACP-1 revelou desvios significativos do padrão
de
segregação esperada, para os testes de segregação total ( G Hipótese1:1 ) e agrupado
G Agrupado1:1 , devido ao excesso de heterozigotos, evidenciado pela relação
N ij : N ii + N jj (Tabela 9). Os locos GDH-1 e MDH-2 apresentaram desvios da
segregação 1:1 nos testes G Hipótese1:1 e G Homogeneidade . No entanto, todos os locos
acima mencionados revelaram ausência de desvios significativos, em todos os
testes G, quando as árvores da população BM com desvios da segregação 1:1
(Tabela 11) foram excluídas da análise, como pode ser vista na Tabela 9. Nas
70
progênies da população PB cinco dos onze locos avaliados apresentaram algum
desvio nos testes G.
O loco ADH-1 apresentou desvios significativos da
segregação na análise agrupada ( G Agrupado1:1 ), devido ao excesso de
heterozigotos. No entanto, quando a árvore que apresentou desvios significativos
(Tabela 11) foi excluída da análise, o loco adequou-se ao referido teste. Os locos
GOT-1, β-EST-1, α-EST-1 e GDH-1 apresentaram desvios significativos da
razão de segregação 1:1 para a hipótese total
( G Hipótese1:1 ) e agrupado
( G Agrupado1:1 ), sendo que os dois últimos locos também apresentaram
heterogeneidade na segregação em progênies de diferentes árvores para o
mesmo genótipo materno. A relação N ij : N ii + N jj apresentada na Tabela 10
mostra que os desvios significativos da segregação 1:1 ocorreram devido ao
excesso de homozigotos nos locos α-EST-1 e β-EST-1 e ao excesso de
heterozigotos nos locos GOT-1 e GDH-1. No entanto, quando as árvores com
desvios da segregação (Tabela 11) foram retiradas das análises, os locos
ajustaram-se ao modelo de segregação 1:1, conforme a Tabela 10.
Os desvios da razão de segregação 1:1 observados nos locos
isoenzimáticos de E. eryhtropappus podem ser atribuídos a distorções meióticas,
interações alélicas, presença de alelos nulos, ligações entre locos, controle das
isoenzimas por mais de um loco, erros amostrais e, até mesmo, a erros de
interpretação dos géis (Cheliak & Pitel, 1985; Gillet & Hattemer, 1989).
Diversos estudos de herança isoenzimática de espécies arbóreas têm observado
desvios da segregação meiótica 1:1. A maior parte desses estudos refere-se à
espécies arbóreas temperadas (Huang et al., 1994; Lewandowski, 2000; Wang
& Lin, 1998). Recentemente, algumas espécies arbóreas tropicais passaram a ser
contempladas com esses estudos, como por exemplo Araucaria angustifolia
(Sousa et al., 2002), Genipa americana (Sebbenn, 2004), Esenbeckia leiocarpa
(Seoane & Sebbenn, 2004) e Trema micrantha (Ribas & Sebbenn, 2004). Os
71
resultados obtidos nesse estudo confirmam a herança mendeliana simples para
todos os locos isoenzimáticos avaliados em E. erythropappus. No entanto, o
número de indivíduos por progênies, avaliado nesse estudo, pode ser
considerado baixo, pois, segundo Sebbenn (2004), é interessante trabalhar com
50 indivíduos por progênies, quando o objetivo é verificar se há desvios da
hipótese de segregação 1:1. Desta maneira, estudos mais consistentes podem ser
realizados utilizando maior número de árvores matrizes ou maiores tamanhos de
progênies.
72
TABELA 9. Teste para a hipótese de segregação regular de marcadores isoenzimáticos em progênies de Eremanthus erythropappus
provenientes da população BM.
Loco
α-EST-1
α-EST-2
β-EST-1
GOT-1
ACP-1
SDH-1
SDH-2
GDH-1
GDH-2
GTDH-1
GTDH-2
GLDH-1
GTDH-2
MDH-1
MDH-2
ADH-1
ADH-2
N ij e N ii
Genótipo
materno
Número
árvores(n)
N ij : N ii + N jj
∑G
Hipotese1:1
GL = n
G Homogeneidade
GL = n − 1
G Agrupado1:1
GL = n
Árvores com
desvio segregação
a
2
7 : 14
3,29
0,91
2,38
a
2
5 : 15
5,41
0,17
5,23*
1
b
1
3:7
1,65
0
1,65
a
3
12 : 18
2,05
0,84
1,21
A2 A3
a
8
43 : 33
14,51
13,19
1,32
A1 A2
a
8
58 : 21
25,66**
7,63
18,03**
4
A1 A2
b
4
26 : 14
7,65
3,99
3,66
a
12
71 : 47
15,54
10,62
4,92*
1
A1 A2
b
11
62 : 46
8,17
5,80
2,38
a
10
39 : 52
8,72
6,86
1,86
A1 A2
a
12
58 : 67
23,75*
23,24*
0,51
1
A1 A2
b
11
58 : 58
16,39
16,39
0,00
a
10
51 : 45
7,21
0,38
6,83
A1 A2
a
17
79 : 80
20,58
20,58
0,01
A1 A2
a
13
60 : 63
16,33
16,26
0,07
A1 A2
a
15
79 : 66
16,90
15,73
1,17
A1 A2
a
12
57 : 61
12,37
12,24
0,14
A1 A2
a
11
53 : 49
13,02
12,86
0,16
A1 A2
a
10
44 : 50
24,84*
24,46*
0,38
2
A1 A2
b
8
34 : 42
12,42
11,57
0,84
a
8
44 : 31
12,75
10,48
2,26
A1 A2
a
12
57 : 60
6,55
6,47
0,08
A1 A2
+ N jj são números observados de genótipos heterozigotos e homozigotos, respectivamente. a: inclui todas as árvores
A2 A3
A1 A2
heterozigotas em um dado loco. b: exclui as árvores com distorção de segregação em um dado loco. (*) P < 0,05. (**) P < 0,01.
73
TABELA 10. Teste para a hipótese de segregação regular de marcadores isoenzimáticos em progênies de Eremanthus
erythropappus provenientes da população PB.
Loco
Genótipo
materno
α-EST-1
A2 A3
α-EST-2
GOT-1
A1 A2
A1 A2
β-EST-1
A2 A3
β-EST-2
ACP-1
SDH-1
GDH-1
A1 A2
A1 A2
A1 A2
A1 A2
GTDH-1
MDH-1
ADH-1
A1 A2
A1 A2
A1 A2
a
b
a
a
b
a
b
a
a
a
a
b
a
a
b
Número
árvores(n)
N ij : N ii + N jj
3
2
4
8
6
5
3
11
7
11
16
14
15
10
13
12
7 : 18
7 : 12
9 : 18
54 : 23
35 : 22
11 : 31
9 : 13
39 : 33
42 : 26
60 : 45
103 : 74
75 : 72
71 : 62
42 : 50
81 : 54
71 : 53
∑G
GL = n
G Homogeneidade
GL = n − 1
G Agrupado1:1
GL = n
Árvores com
desvio segregação
16,27**
3,50
8,21
21,24*
4,31
17,85**
5,90
7,12
10,89
18,99
39,16**
7,58
8,27
16,00
16,63
11,24
11,94**
0,78
5,15
8,40
1,32
6,60
3,84
6,62
7,09
16,84
34,38**
7,52
7,66
15,30
11,19
8,62
4,33*
2,72
3,06
12,84**
2,99
11,25**
2,06
0,50
3,80
2,15
4,77*
0,06
0,61
0,70
5,44*
2,62
1
Hipotese1:1
N ij e N ii + N jj são números observados de genótipos heterozigotos e homozigotos, respectivamente.
a: inclui todas as árvores heterozigotas em um dado loco.
b: exclui as árvores com distorção de segregação em um dado loco.
(*) P < 0,05. (**) P < 0,01.
74
2
2
2
1
TABELA 11. Árvores de Eremanthus erythropappus que apresentaram desvios
significativos no teste G para a segregação meiótica 1:1.
População PB
Loco/número da árvore
α-EST-1
2
β-EST-1
20
23
GOT-1
17
25
GDH-1
10
20
ADH-1
20
População BM
Loco/número da árvore
ACP-1
23
SDH-1
11
GDH-1
1
MDH-2
15
22
G
Genótipo materno
N ij
N ii + N jj
A2 A3
0
6
5,54 *
A2 A3
A2 A3
1
9
7,36**
1
9
7,36**
A1 A2
A1 A2
1
9
7,36*
1
9
7,36*
A1 A2
A1 A2
10
0
13,86**
10
0
13,86**
A1 A2
8
2
3,85*
Genótipo materno
N ij
N ii + N jj
A1 A2
9
1
7,36*
A1 A2
9
1
7,36*
A1 A2
1
9
7,36*
A1 A2
A1 A2
1
9
7,36*
1
7
5,06*
GL = 1
G
GL = 1
N ij e N ii + N jj são os números observados dos genótipos heterozigotos e
homozigotos, respectivamente.
(*) P < 0,050. (**) P < 0,010.
75
4.3 Desequilíbrio de ligação
O modelo de cruzamentos mistos de Ritland & Jain (1981) tem como
um dos pressupostos a segregação independente dos alelos de diferentes locos,
ou seja, a ausência de ligação entre os locos utilizados em análises do sistema
reprodutivo. Assim, para avaliar a associação entre locos, utilizou-se o teste de
desequilíbrio gamético baseado na medida composta de Burrows. Das 153
combinações possíveis para os pares de locos das progênies da população BM,
somente quinze apresentaram desequilíbrio de ligação (Tabela 12), envolvendo
os locos β-EST-2, GOT-1, GDH-2, GTDH-1, GLDH-1 e MDH-2. Nas progênies
da população PB, os onze locos avaliados resultaram em 55 combinações de
pares de locos. Dessas, em apenas onze combinações foram detectados indícios
de desequilíbrio de ligação entre os pares, envolvendo três locos: α-EST-2, βEST-1 e β-EST-2 (Tabela 12). Esses resultados indicam que os alelos dos pares
de locos em desequilíbrio ligação estão associados e não segregam de maneira
independente, de modo que, um dos locos deve ser removido de análises que
requeiram locos em equilíbrio gamético. Como nos demais pares de locos não
foram detectados indícios de ligação gamética, os doze locos restantes das
progênies BM e os oito das progênies PB podem ser utilizados em estudos do
sistema de reprodução, estrutura e diversidade genética de populações de E.
erythropappus.
76
TABELA 12. Valores da medida composta de desequilíbrio de ligação de
ˆ ) , com respectivos testes de qui-quadrado ( X 2 ) e
Burrows ( ∆
ij
probabilidades associadas ( P ), para pares de locos
isoenzimáticos que apresentaram desvios significativos da
hipótese de desequilíbrio de ligação em populações de
Eremanthus erythropappus.
População BM
Locos
β-EST-2 : SDH-1
β-EST-2 : SDH-2
GOT-1 : GDH2
GOT-1 : SDH2
GOT-1 : GTDH1
GOT-1 : GLDH1
GDH2 : GDH1
GDH2 : GLDH1
GDH2 : β-EST-1
GTDH2 : GLDH1
GTDH2 : MDH1
GTDH2 : ADH2
GLDH1 : SDH1
GLDH1 : MDH2
MDH2 : ADH1
População PB
Locos
β-EST-1 : β-EST-2
β-EST-1 : ACP-1
β-EST-1 : α-EST-1
β-EST-1 : GOT-1
β-EST-2 : α-EST-2
β-EST-2 : SDH1
β-EST-2 : ACP-1
β-EST-2 : MDH1
β-EST-2 : ADH1
α-EST-2 : SDH1
α-EST-2 : GTDH1
∆ˆ ij
X2
P
0,063
-0,060
-0,071
0,125
-0,035
0,125
-0,024
-0,054
-0,040
0,070
0,020
0,031
0,037
0,065
0,063
5,00
7,5
5,10
10,00
7,50
10,00
5,14
6,14
3,99
4,04
4,38
5,00
12,86
4,31
3,97
0,0253
0,0062
0,0239
0,0016
0,0062
0,0016
0,0233
0,0132
0,0457
0,0443
0,0365
0,0253
0,0003
0,0380
0,0463
∆ˆ ij
X2
P
0,060
0,025
-0,022
0,056
0,040
-0,035
-0,047
0,094
-0,049
0,030
0,020
8,92
5,14
9,84
15,00
11,67
11,03
4,29
5,40
12,67
6,06
4,37
0,0028
0,0233
0,0017
0,0001
0,0006
0,0009
0,0384
0,0201
0,0004
0,0138
0,0365
77
4.4 Sistema reprodutivo
4.4.1 Aderência ao Equilíbrio de Hardy-Weinberg e Equilíbrio de
Endogamia de Wright
O sistema reprodutivo de E. erythropappus foi inicialmente abordado
pela avaliação da existência de EHW nas suas populações. Esta abordagem só é
possível quando se analisa mais de uma geração, como o caso das populações
BM e PB e, dessa maneira, nas populações BR, CR e MP verificou-se apenas o
ajuste das proporções genotípicas ao EHW. Assim, as cinco populações de E.
erythropappus e as progênies das populações BM e PB foram submetidas ao
teste exato de Fisher, para verificar se as proporções genotípicas se ajustam ao
modelo de EHW. Este teste se mostra mais adequado quando há freqüências
esperadas reduzidas (inferior a 5). O modelo de equilíbrio tem como
pressupostos cruzamentos aleatórios, ausência de mutação, migração, seleção,
deriva genética e tamanho infinito das populações (Futuyma, 1992; Mettler &
Gregg, 1973). Em EHW a freqüência relativa dos alelos deve permanecer a
mesma de uma geração para outra, sendo a única mudança possível na
composição genética da população a redistribuição dos alelos dentro dos
genótipos da nova geração (Futuyma, 1992). As porcentagens de locos em EHW
foram de 66,7% para a população BM, 57,1% para a BR, 52,4% para a
população CR, 76,2% para a MP e 61,9% para a população PB (Tabela 13). O
teste exato de Fischer detectou desvios significativos do modelo de equilíbrio
em 50% dos locos das progênies da população BM e em 72,7% dos locos das
progênies de PB. Apenas os locos ACP-1 e GLDH-3 apresentaram-se em EHW
para todas as populações, exceto nas progênies, enquanto que os locos SDH-2,
78
GDH-2 e GTDH-2 mostraram-se em EHW tanto para as populações, como para
as progênies.
Os desvios do EHW podem ser causados pelo sistema de reprodução ou
por fatores evolutivos como seleção, migração, mutação ou deriva genética. Por
meio do teste de Equilíbrio de Endogamia de Wright (EEW) é possível conhecer
se os desvios do EHW foram causados pelo sistema de reprodução ou por
fatores evolutivos (Sebbenn, 2001). No entanto, este teste só pôde ser aplicado
aos locos α-EST-1 e β-EST-1 por possuírem três alelos, devido à necessidade de
um grau de liberdade para a estimativa do coeficiente de endogamia. A Tabela
13 mostra que, na população BM, os dois locos, α-EST-1 e β-EST-1, assim
como o loco β-EST-1 da população PB, apresentaram desvios do modelo de
EEW, indicando a atuação de forças evolutivas, possivelmente, seleção a favor
de heterozigotos. Os resultados indicam que apenas o loco α-EST-1 da
população PB pode estar fora da condição de EHW devido ao sistema
reprodutivodaespécie.
79
TABELA 13. Probabilidade do teste exato de Fisher para a hipótese de Equilíbrio de Hardy-Weinberg (EHW) para cinco
populações naturais e duas progênies de Eremanthus erythropappus e teste de qui-quadrado para o teste de
Equilíbrio de Endogamia de Wright (EEW) nas progênies.
Loco
ACP-1
ADH-1
ADH-2
α-EST-1
α-EST-2
β-EST-1
β-EST-2
GDH-1
GDH-2
GLDH-1
GLDH-2
GLDH-3
GOT-1
GTDH-1
GTDH-2
GTDH-3
MDH-1
MDH-2
SDH-1
SDH-2
SDH-3
ns
BM
0,695 ns
0,719 ns
1,000 ns
0,005**
0,031*
0,008**
0,000**
0,009**
0,717 ns
0,008**
0,151 ns
0,443 ns
0,651ns
0,000**
0,146 ns
0,648 ns
0,379 ns
0,088 ns
0,153 ns
1,000 ns
0,189 ns
Adultos
EHW (P)
BR
CR
0,058 ns
0,058 ns
0,447 ns
0,721 ns
ns
0,487
1,000 ns
0,028*
0,043*
0,119 ns
0,000**
0,000**
0,000**
0,000**
0,013*
0,025*
0,003**
0,697 ns
0,705 ns
0,021*
0,700 ns
0,240 ns
0,417 ns
ns
0,288
0,273 ns
ns
0,076
0,001**
0,001**
0,465 ns
ns
0,127
1,000 ns
0,042*
0,002**
0,123 ns
0,027*
0,724 ns
0,495 ns
0,000**
0,005**
0,444 ns
0,212 ns
0,021*
0,017*
MP
0,248 ns
0,703 ns
0,479 ns
0,028*
0,675 ns
0,003**
0,179 ns
0,029*
0,219 ns
0,067 ns
0,724 ns
1,000 ns
1,000 ns
0,129 ns
0,130 ns
0,037*
1,000 ns
0,655 ns
0,136 ns
0,445 ns
0,008**
PB
0,718 ns
0,014*
0,002**
0,000**
0,106 ns
0,001**
0,253 ns
0,000**
1,000 ns
0,004**
0,050*
0,071 ns
0,066 ns
0,009**
0,713 ns
0,608 ns
0,063 ns
1,000 ns
1,000 ns
0,444 ns
0,253 ns
– não significativo; *
80
EHW (P)
BM
0,000**
0,000**
0,225 ns
0,000**
0,005**
0,000**
0,000**
0,662 ns
0,891 ns
0,190 ns
0,039*
0,047*
0,456 ns
0,873 ns
0,370 ns
0,530 ns
0,003**
0,438 ns
-
Progênies
EEW(X2 )
EHW (P)
BM
PB
0,000**
0,001**
32,37**
13,12**
0,000**
0,740 ns
0,000**
0,401 ns
0,018*
0,000**
0,018*
0,762 ns
0,039*
-
EEW(X2 )
PB
4,83
9,95**
4.4.2
Homogeneidade das freqüências de pólen e óvulos
O teste de homogeneidade das freqüências alélicas de pólen e óvulos
mostrou diferenças significativas em doze dos dezoito locos (66,7%) avaliados
na população BM. Na população PB, sete dos onze locos (63,6%) apresentaram
divergência genética significativa entre as freqüências de pólen e óvulos (Tabela
14). Esses resultados evidenciam que a distribuição do pólen não foi homogênea
para todas as árvores maternas, indicando que os cruzamentos não foram
aleatórios. Essa heterogeneidade nas freqüências de pólen e óvulos vai contra
um dos pressupostos do modelo de cruzamentos mistos de Ritland & Jain
(1981). No entanto, tais desvios podem propiciar o entendimento de outros
fatores no processo de reprodução (Gusson, 2003). A contribuição desigual de
pólen e óvulos entre árvores adultas dentro de uma população pode ter origem
na variação espacial e temporal entre árvores, na fenologia e fecundidade
(Mitton, 1992) e na proporção de árvores adultas que se reproduzem (Murawski
& Hamrick, 1991). A presença de pólen proveniente de outras populações, a
seleção entre o tempo de polinização e análise das progênies, a ocorrência de
cruzamentos não aleatórios e a amostragem não representativa das árvores
maternas também são fatores que levam à heterogeneidade nas freqüências
alélicas dos conjuntos gênicos materno e paterno (Lee et al., 2000; Ritland &
Jain, 1981).
A comparação entre as freqüências alélicas das árvores adultas vs. pólen
e adultos vs. óvulos revelaram divergências genéticas baixas (máxima de 0,062)
na população BM, com exceção do loco ACP-1 ( F̂ST =0,164), porém
significativas em grande parte dos locos. Na população PB, as mesmas
comparações revelaram resultados semelhantes à população BM, com
divergências genéticas baixas (máxima de 0,042), excetuando-se o loco GOT-1
81
( F̂ST iguais 0,166 e 0,128), mas significativas (Tabela 15). Esses resultados
indicam que as vinte árvores amostradas em cada população não representaram
as árvores adultas, em termos de freqüências alélicas. A heterogeneidade nas
freqüências alélicas dos adultos vs. pólen (Tabela 15) sugere, ainda, que o pólen
também não foi uma amostra representativa das populações. Este resultado pode
ter sido causado por cruzamentos entre parentes, cruzamentos biparentais e/ou
imigração de pólen de outras populações. Dessa forma, pode-se considerar que
as causas mais prováveis para a heterogeneidade detectada nas populações de E.
erythropappus foram o fluxo de genes externo, a amostragem não representativa
das árvores maternas e a ocorrência de cruzamentos não aleatórios nas
populações. Embora tenham sido detectadas violações nas pressuposições do
modelo misto de Ritland & Jain (1981), estes desvios têm pouco efeito sobre a
estimativa das taxas de cruzamento multilocos, principalmente quando tais
estimativas estão baseadas num grande número de locos, acima de quatro ou
cinco (Ritland & Jain, 1981).
Divergências genéticas ( F̂ST ) nas freqüências alélicas dos adultos vs.
progênies foram verificadas em alguns locos, nas populações BM e PB. Na
população BM um terço dos locos (33%) apresentaram desvios significativos,
enquanto na população PB esses desvios ocorreram em três dos onze (27%)
locos avaliados (Tabela 15). Considerando a natureza supostamente neutra dos
marcadores isoenzimáticos e a baixa taxa de substituição de códons detectáveis
por isoenzimas (10-7, de acordo com Nei, 1975), excluindo assim fatores
evolutivos, como a seleção e a mutação, os desvios podem ser atribuídos à
deriva genética e/ou o sistema de reprodução. O sistema reprodutivo, contudo,
não altera as freqüências alélicas, apenas as genotípicas. Portanto, embora a
maior parte dos locos nas duas populações não tenha revelado heterogeneidade
82
nas freqüências alélicas dos adultos e das progênies, os desvios encontrados
podem
ser
atribuídos
à
83
deriva
genética.
TABELA 14. Divergência genética ( F̂ST ) entre as frequências alélicas de pólen e óvulos das progênies de Eremanthus
erythropappus. X 2 : teste qui-quadrado; GL: graus de liberdade.
População BM
Loco
ACP
ADH-1
ADH-2
α-EST-1
α-EST-2
β-EST-1
β-EST-2
GDH-1
GDH-2
Alelo
1
2
1
2
1
2
1
2
3
1
2
1
2
3
1
2
1
2
1
2
Pólen Óvulos
0,221 0,725
0,779 0,275
0,648 0,275
0,352 0,725
0,451 0,750
0,549 0,250
0,205 0,025
0,388 0,450
0,407 0,525
0,596 0,475
0,404 0,525
0,132 0,024
0,399 0,366
0,469 0,610
0,513 0,425
0,487 0,575
0,676 0,375
0,324 0,625
0,505 0,700
0,495 0,300
População PB
F̂ST
n
X2
GL
0,255
191
97,32**
1
0,140
173
48,43**
1
0,093
181
33,73**
1
0,021
178
7,52*
2
0,015
185
5,44*
1
0,015
167
4,90
2
0,008
169
2,63
1
0,091
190
34,52**
1
0,040
194
15,40**
1
84
Pólen
0,323
0,677
0,439
0,561
Óvulos
0,650
0,350
0,500
0,500
0,006
0,420
0,575
0,434
0,566
0,023
0,335
0,642
0,452
0,548
0,513
0,497
0,033
0,400
0,567
0,750
0,250
0,025
0,350
0,625
0,650
0,350
0,400
0,600
F̂ST
n
X2
GL
0,107
196
41,95**
1
0,004
188
1,40
1
0,001
189
0,22
2
0,103
160
33,07**
1
0,001
180
0,09
2
0,039
141
11,17**
1
0,012
181
4,31*
1
“Tabela 14. Cont.”
GLDH-1
1
0,576
2
0,424
GLDH-2
1
0,512
2
0,488
GOT
1
0,549
2
0,451
GTDH-1
1
0,615
2
0,385
GTDH-2
1
0,633
2
0,367
MDH-1
1
0,522
2
0,478
MDH-2
1
0,675
2
0,325
SDH-1
1
0,632
2
0,368
SDH-2
1
0,596
2
0,404
n: tamanho amostral.
0,450
0,550
0,600
0,400
0,550
0,450
0,350
0,650
0,575
0,425
0,350
0,650
0,525
0,475
0,325
0,675
0,625
0,375
0,016
193
6,13*
1
0,008
194
3,04
1
0,000
172
0,00
1
0,070
182
25,59**
1
0,004
190
1,34
1
0,030
181
10,89**
1
0,023
180
8,44**
1
0,094
190
35,88**
1
0,001
189
0,33
1
(*): P ≤ 0,05. (**): P ≤ 0,01.
85
0,310
0,690
0,452
0,548
0,975
0,025
0,450
0,550
0,481
195
187,71**
1
0,000
165
0,00
1
0,407
0,593
0,525
0,475
0,014
186
5,20*
1
0,372
0,628
0,625
0,375
0,064
184
23,56**
1
Tabela 15. Divergência genética ( F̂ST ) entre as freqüências alélicas dos adultos
vs. progênies, adultos vs. pólen e adultos vs. óvulos em duas
populações naturais de Eremanthus erythropappus.
F̂ST
População BM
Adultos vs Adultos vs Adultos vs
Loco
progênies
pólen
óvulos
ACP
0,012*
0,164**
0,012*
ADH-1
0,001
0,062**
0,017*
ADH-2
0,000
0,017*
0,031**
0,025*
0,025*
α-EST-1 0,016
0,013*
0,000
α-EST-2 0,004
0,033**
0,045**
β-EST-1 0,043**
0,019*
0,050**
β-EST-2 0,019*
GDH-1
0,006
0,059**
0,004
GDH-2
0,001
0,004
0,019**
GLDH-1 0,003
0,001
0,010*
GLDH-2 0,000
0,005
0,000
GOT
0,037**
0,037**
0,038**
GTDH-1 0,000
0,018**
0,018**
GTDH-2 0,005
0,010
0,002
MDH-1
0,019**
0,059**
0,005
MDH-2
0,003
0,001
0,014*
SDH-1
0,002
0,018**
0,032**
SDH-2
0,021**
0,017*
0,025**
*: P ≤ 0,05. **: P ≤ 0,01.
4.4.3
População PB
Adultos vs Adultos vs
progênies
pólen
0,002
0,022**
0,017*
0,000
Adultos
vs óvulos
0,034**
0,004
0,003
0,002
0.001
0,034**
0,000
0,004
0,042**
0,001
0,008
0,003
0,002
0,015*
0,001
0,080**
0,002
0.005
0,000
0,166**
0,000
0,128**
0,000
0,028**
0,002
0,014*
0,000
0,021**
0,012*
Taxas de cruzamento multilocos e unilocos
O sistema reprodutivo da maioria das espécies arbóreas tropicais é
acessado por estimativas das taxas de cruzamento. O modelo de cruzamentos
mistos de Ritland & Jain (1981) tem sido bastante utilizado para estimar estas
taxas de cruzamento em diversas espécies arbóreas como Cedrela fissilis
(Gandara, 1996; Póvoa, 2002), Cariniana legalis (Sebbenn et al., 2000a),
Caryocar brasiliense (Collevatti et al., 2001) dentre outras. Esse modelo
considera que as progênies avaliadas resultam de uma mistura de cruzamentos
86
aleatórios e autofecundação e, como considera as combinações genotípicas
envolvendo todos os locos, as estimativas de cruzamento são consideradas mais
adequadas do que outros modelos.
As estimativas da taxa de cruzamento multilocos ( tˆm ) indicam a
proporção de cruzamentos pelas quais as progênies foram originadas. Estas
estimativas foram de 0,982 na população BM e 0,999 na população PB (Tabela
16), indicando que a espécie E. erythropappus é alógama, reproduzindo-se
predominantemente por cruzamentos, visto que tais estimativas não foram
significativamente diferentes de 1,0. Grande parte das espécies arbóreas
tropicais tem apresentado valores elevados nas estimativas da taxa de
cruzamento como 0,917 em Copaifera langsdorffii (Oliveira et al., 2002), 0,816
em Chorisia speciosa (Souza et al., 2002) e 0,990 em Cedrela fissilis (Póvoa,
2002). Os valores das taxas de cruzamento multilocos obtidos para E.
erythropappus são semelhantes aos encontrados para outras espécies arbóreas
classificadas como pioneiras e que apresentam alta densidade populacional,
como Trema micrantha, com tˆm variando de 0,819 a 0,966 e Cecropia
pachystachya, com tˆm igual a 1 (Kageyama et al., 2003b). Seoane et al. (2001)
também obtiveram taxas de cruzamento elevadas (maiores que 0,925) para
Esenbeckia leiocarpa, uma espécie que apresenta densidade populacional
elevada e Gusson (2003) estimou taxas maiores que 0,985 para Eschweilera
ovata, que ocorre em alta densidade e considerada uma espécie pioneira
antrópica.
87
Tabela 16. Estimativa dos parâmetros do sistema de reprodução de Eremanthus
erythropappus em duas populações naturais.
Populações
Parâmetros
BM
PB
Taxa de cruzamento multilocos ( tˆm )
0,982 (0,018)
0,999 (0,006)
Taxa de cruzamento unilocos ( tˆs )
0,965 (0,005)
0,978 (0,002)
Taxa de cruzamento entre aparentados ( tˆm − tˆs )
0,017 (0,018)
0,021 (0,002)
Correlação de autofecundação ( r̂s )
0,081 (0,016)
0,107 (0,000)
Correlação de paternidade ( r̂p )
0,718 (0,074)
0,651(0,089)
1,4
1,5
Proporção de irmãos de autofecundação ( P̂IA )
1,8%
0,01%
Proporção de irmãos completos ( P̂IC )
70,5%
65,1%
Proporção de meios-irmãos ( P̂MI )
27,7%
34,9%
Índice de fixação nas árvores maternas ( F̂m )
0,000
0,000
o
N médio de árvores doadoras de pólen ( 1 / r̂ p )
Índice de fixação nas árvores adultas ( F̂a )
-0,065
-0,125
[-0,224 a 0,093]
[-0,294 a 0,049]
Índice de fixação nas progênies ( F̂ p )
-0,085
-0,136
[-0,187 a 0,019]
[-0,259 a 0,007]
Coancestria dentro de progênies ( θˆxy )
0,206
0,181
Tamanho efetivo de variância ( Nˆ e ( v ) )
2,41
2,74
Tamanho efetivo de variância total ( Nˆ e ( v ) t )
48,2
54,8
63
55
Número de matrizes para reter N̂ e = 150 ( m̂ )
Número total de árvores matrizes (m)
20
20
Número total de progênies (n)
184
179
[ ] Intervalo de confiança a 95% de probabilidade, obtido por 10.000 reamostragens
(bootstrap) sobre locos.
( ) Erro padrão da média, obtido por 1.000 reamostragens (bootstrap).
As taxas de cruzamento uniloco estimadas foram menores que as taxas
de cruzamento multilocos, com valores de 0,965 na população BM e 0,978 na
população PB. Esta comparação entre as estimativas multilocos e unilocos
88
( tˆm − tˆs ) permite avaliar a ocorrência de cruzamentos entre aparentados,
possibilitando a caracterização da ocorrência de endogamia por essa via (Ritland
& Jain, 1981; Ritland & El Kassaby, 1985). As taxas de cruzamentos entre
aparentados ( tˆm − tˆs ) foram de 0,017 ( população BM) e 0,021 (população PB),
não sendo diferentes entre as duas populações (Tabela 16). Esses resultados
mostram valores inferiores aos encontrados para outras espécies arbóreas de alta
densidade populacional como Eschweilera ovata (Gusson, 2003) com taxas de
0,066 e 0,073, antes e após manejo, respectivamente. Kageyama et al. (2003b),
comparando espécies de diferentes estágios sucessionais, concluíram que as
espécies pioneiras tendem a apresentar maiores taxas de cruzamento entre
parentes, associadas à distribuição agregada, ao grande tamanho populacional e
ao ciclo de vida mais curto. Esses mesmos autores encontraram taxas de
cruzamento entre parentes de 0,071 e 0,123 para populações naturais de Trema
micrantha e de 0,180 e 0,199 para populações de Cecropia pachystachya, bem
mais elevadas do que as obtidas neste trabalho. Apesar dos baixos valores
estimados para as taxas de cruzamento entre parentes nas populações naturais de
E. erythropappus, a estimativa obtida para a população PB apresentou
significância a 95% de probabilidade, evidenciando um certo nível de
cruzamentos entre parentes dentro desta população. Essa presença de parentesco
pode ser resultado da ocorrência de sobreposição de gerações que, por sua vez,
pode ser intensificada pela rapidez de colonização, crescimento e extinção,
características de espécies pioneiras.
Segundo Allard (1971) o cruzamento
entre aparentados pode gerar endogamia biparental dentro das populações,
apesar desse tipo de endogamia ser menos drástico do que a autofecundação
efetiva. Os cruzamentos entre aparentados aumentam a quantidade de
homozigotos na população, possibilitando a depressão por endogamia pela
expressão de genes deletérios recessivos (Ellstrand & Elam, 1993). Em um
89
programa de melhoramento genético para E. erythropappus o conhecimento do
grau de parentesco é de grande importância, pois ele deve ser considerado nas
estimativas dos parâmetros genéticos, evitando-se, assim, a obtenção de
estimativas errôneas da variância genética aditiva e parâmetros afins (Squillace,
1974; Surles et al., 1990).
As estimativas das taxas de cruzamentos individuais variaram de 0,87 a
1,00 nas árvores maternas da população BM e de 0,43 a 1,00 nas árvores
maternas da população PB (Tabela 17). Seis das vinte progênies da população
BM apresentaram taxas de cruzamento inferiores a 1,0, mas apenas nas
progênies 08 e 18 essa diferença foi significativa. Analisando as progênies da
população PB, verificou-se que, em sete das doze progênies que apresentaram
taxas de cruzamento inferiores a 1,0, essa diferença foi significativa. Dessa
maneira, como 10% das progênies da população BM e 35% das progênies da
população PB apresentaram valores das taxas de cruzamento significativamente
diferentes da unidade, a espécie E. erythropappus pode ser considerada uma
espécie de reprodução mista, predominantemente alógama. As taxas de
autofecundação estimadas para a população BM (Tabela 17) podem ser
consideradas baixas (máximo de 0,13). Na população PB, apesar das taxas de
autofecundação também serem consideradas baixas, um maior número de
progênies apresentou estimativas mais elevadas de ŝ (Tabela 17). Esta variação
entre as taxas de cruzamentos individuais pode estar associada a um possível
assincronismo nas florações masculina e feminina ou, ainda, ao comportamento
dos polinizadores. É possível que as progênies 10 e 18, da população BM, e 04,
05, 08, 09 e 16, da população PB, tenham florescido no início ou no pico da
floração masculina, na qual havia menor quantidade de pólen disponível para os
cruzamentos, favorecendo, assim, a autofecundação.
90
Tabela 17. Estimativas das taxas de cruzamentos individuais por progênies ( tˆ ) e
taxas de autofecundação ( ŝ ) em duas populações naturais de
Eremanthus erythropappus.
População BM
Progênies
tˆ
População PB
Progênies
ŝ
tˆ
01
0,90 (0,10)
0,10
01
1,00 (0,00)
02
1,00 (0,00)
0,00
02
1,00 (0,00)
03
1,00 (0,00)
0,00
03
0,90 (0,09)
04
1,00 (0,00)
0,00
04
0,76 (0,16)
05
1,00 (0,00)
0,00
05
0,63 (0,17)
06
1,00 (0,00)
0,00
06
1,00 (0,00)
07
1,00 (0,00)
0,00
07
0,88 (0,18)
08
0,91 (0,08)
0,09
08
0,43 (0,20)
09
0,90 (0,10)
0,10
09
0,81 (0,13)
10
0,87 (0,15)
0,13
10
1,00 (0,00)
11
0,91 (0,09)
0,09
11
0,90 (0,09)
12
1,00 (0,00)
0,00
12
1,00 (0,00)
13
1,00 (0,00)
0,00
13
0,93 (0,08)
14
1,00 (0,00)
0,00
14
1,00 (0,00)
15
1,00 (0,00)
0,00
15
0,91 (0,09)
16
1,00 (0,00)
0,00
16
0,76 (0,18)
17
1,00 (0,00)
0,00
17
0,97 (0,07)
18
0,89 (0,10)
0,11
18
1,00 (0,00)
19
1,00 (0,00)
0,00
19
0,92 (0,09)
20
1,00 (0,00)
0,00
20
1,00 (0,00)
( ) Erro padrão da média, obtido por 1.000 reamostragens (bootstrap).
4.4.4
ŝ
0,00
0,00
0,10
0,24
0,37
0,00
0,12
0,57
0,19
0,00
0,10
0,00
0,07
0,00
0,09
0,24
0,03
0,00
0,08
0,00
Taxas de cruzamentos correlacionados
A correlação de autofecundação ( r̂s ) corresponde à probabilidade de
encontrar um indivíduo gerado por autofecundação em uma progênie onde exista
outro também gerado por autofecundação. As estimativas de r̂s foram de 0,081 e
0,107, para
as populações BM e PB, respectivamente. Estes valores são
diferentes entre si (Tabela 16) e podem ser considerados baixos, porém
91
significativos, indicando a presença de indivíduos advindos de autofecundação
nas progênies das duas populações de E. erythropappus. As estimativas de r̂s
revelaram que os indivíduos oriundos de autofecundação encontram-se
aleatoriamente distribuídos entre as progênies e sugerem que não há a tendência
de algumas plantas maternas gerarem mais indivíduos por autofecundação do
que outras, evidenciando ainda que a taxa de cruzamento não variou muito entre
as árvores (Tabela 17).
O sistema misto de reprodução é conceituado como a mistura de
cruzamentos aleatórios e autofecundações. No entanto, esta conceituação
desconsidera a ocorrência de cruzamentos biparentais, uma outra forma de
reprodução que também pode causar desvios de cruzamentos aleatórios, mesmo
em espécies obrigatoriamente de cruzamentos, como as espécies dióicas (Souza
et al., 2003). A correlação de paternidade ( rp ) de Ritland (1989) mede a
proporção de indivíduos de cruzamentos que foram gerados por cruzamentos
biparentais, ou seja, irmãos completos. As estimativas da correlação de
paternidade em E. erythropappus foram elevadas, de 0,718 para as progênies da
população BM e de 0,651 para as progênies da população PB, revelando que,
grande parte das progênies de cruzamentos, foram geradas por cruzamentos
biparentais (Tabela 16). Valores elevados de correlação de paternidade foram
descritos por Kageyama et al. (2003b) para Esenbeckia leiocarpa ( r̂p acima de
0,749) e para Trema micrantha ( r̂p de 0,606 e 0,602) e por Gusson (2003) para
Eschweilera ovata ( r̂p variou de 0,423 a 0,577), sendo todas as espécies de alta
densidade populacional. A taxa de cruzamentos multilocos ( tˆm ), combinada
com a correlação de paternidade ( r̂p ), permite inferir que 1,8 % das progênies
da população BM foram originadas por autofecundação, sendo sua relação de
parentesco de irmãos de autofecundação, 70,5% por cruzamentos biparentais,
92
sendo aparentadas no grau de irmãos completos e 27,7 % por cruzamentos
aleatórios, sendo aparentadas no grau de meio-irmãos. A relação 1 / r̂p indicou
que, em média, apenas dois indivíduos contribuíram com pólen no evento de
reprodução de uma árvore-mãe (Tabela 16). Na população PB, 0,1% das
progênies analisadas originaram por autofecundação, 65,0% por cruzamentos
biparentais e 34,9% por cruzamentos aleatórios. Cerca de dois indivíduos, em
média, doaram pólen para a reprodução de cada árvore materna na população
PB. O número de polinizadores efetivos foram baixos, mas semelhantes aos
números de polinizadores encontrados em Teobroma grandiflorum (Alves et al.,
2003 e em Myracrodruon urundeuva (Moraes et al., 2003). Os elevados valores
estimados para as correlações de paternidade indicaram que as progênies de E.
erythropappus avaliadas são, na maioria, irmãos completos, contrastando com a
teoria geral de que há o predomínio de cruzamentos aleatórios nas populações
naturais. De acordo com Sun & Ritland (1998), os cruzamentos biparentais
podem ser causados pelo assincronismo no florescimento das árvores, pelo
comportamento dos polinizadores, visitando de forma sistemática árvores
próximas, por poliandria e por pequenos tamanhos de vizinhança. Variações no
comportamento do polinizador, densidade de plantas e número de flores por
plantas podem alterar os parâmetros do sistema de cruzamento (Franceschinelli
& Bawa, 2000). É provável que alguns desses fatores tenham contribuído para as
altas taxas de cruzamentos biparentais observadas em E. erythropappus. Como
não há informações referentes à polinização, sobre quem é o polinizador e qual
o seu comportamento forrageiro, tornam-se necessários estudos sobre a biologia
reprodutiva desta espécie para uma melhor compreensão dos cruzamentos
biparentais detectados.
93
4.4.5
Coeficiente de coancestria e tamanho efetivo de variância
O coeficiente de coancestria ( θ xy ) é de fundamental importância em
programas de melhoramento genético, para a estimativa do coeficiente de
correlação de parentesco ( rxy ) entre plantas dentro de progênies, pois este
coeficiente de correlação é a base de cálculo da variância genética aditiva,
coeficientes de herdabilidade e ganhos genéticos na seleção. Em espécies de
cruzamentos, como no caso de E. erythropappus, o coeficiente de correlação de
parentesco é o dobro do coeficiente de coancestria ( rxy = 2θ xy ), de maneira que
alterações na coancestria geram alterações no coeficiente de correlação de
parentesco. No presente trabalho, os valores estimados para o coeficiente de
coancestria foram de 0,206 para as progênies da população BM e 0,181 para as
da população PB (Tabela 16). Estas estimativas são 39,3% e 30,9 % superiores
ao esperado em progênies de meio-irmãos (0,125) para as progênies das
populações BM e PB, respectivamente. As estimativas de coancestria acima do
esperado para meio-irmãos podem ser atribuídas aos elevados valores obtidos
para as correlações de paternidade ( r̂p ), pois a maior parte das progênies
geradas nas duas populações é aparentada no grau de irmãos completos. Os
modelos clássicos de genética quantitativa, utilizados em programas de
melhoramento genético, pressupõem que as progênies de polinização aberta são
compostas exclusivamente por meio-irmãos, no caso de espécies alógamas. No
entanto, não sendo esta pressuposição verdadeira, os parâmetros genéticos
podem ser superestimados. Dessa forma, em programas de melhoramento
genético para E. erythropappus, devem ser utilizados modelos que considerem o
sistema misto de reprodução, como os de Weir & Cockerham (1984) e de
Ritland (1989).
94
O conhecimento do coeficiente de coancestria ( θ xy ) permite estimar o
tamanho efetivo de variância ( N e ( v ) ), que é uma medida, em termos de deriva
genética, da representatividade genética de uma amostra de progênies retirada de
uma população ideal. A estimativa do N e (v ) é afetada pelo sistema misto de
reprodução, devido à endogamia causada por autofecundações e cruzamentos
entre aparentados, além da representatividade genética diminuir por causa da
menor diversidade de indivíduos doadores de pólen (Gusson, 2003). Para as
populações BM e PB, os valores estimados de Nˆ e ( v ) foram de 2,41 e de 2,74,
respectivamente. Considerando que para espécies alógamas com população
idealizada (tamanho infinito, cruzamentos aleatórios e ausência de seleção,
migração e mutação) o valor teórico máximo esperado do tamanho efetivo de
uma simples progênie é em torno de 4 (Gusson, 2003; Sebbenn, 1997), os
valores estimados são 39,7% e 31,5 % menores do esperado, para as populações
BM e PB, respectivamente. O número de matrizes necessárias para reter um
tamanho efetivo de 150 para E. erythropappus foi de 63 matrizes para a
população BM e de 55 matrizes para a população PB (Tabela 16). No entanto,
para a manutenção da variação genética em longo prazo, considerando um
tamanho efetivo de 1.500 e tomando-se como base as populações BM e PB,
seriam necessárias 630 e 550 matrizes, respectivamente, para representar a
espécie em E. erythropappus.
4.5 Distribuição espacial dos genótipos
A distribuição espacial dos genótipos de E. erythropappus, dentro de
cada população, foi obtida por meio de estimativas do coeficiente de coancestria
entre plantas, para cada uma das dez classes de distância estabelecidas. Dentre as
cinco populações estudadas, em duas populações, BR e CR, a avaliação da
95
distribuição espacial das árvores sugere uma possível ocorrência de estruturação
espacial (Figuras 4 e 5). Na população BR os coeficientes de coancestria,
obtidos nas segunda e terceira classes de distância (de 196 a 441 metros de
distância) foram estimados em 0,028 e 0,021, respectivamente. Após 10.000
permutações, verificou-se que estas estimativas de coancestria foram positivas e
significativas a 95 % de probabilidade (P= 0,012 e P= 0,025, respectivamente).
Na população CR o coeficiente de coancestria estimado foi igual a 0,032, sendo
tal valor positivo e significativo a 95% de probabilidade (P= 0,006), indicando a
presença de parentesco na primeira classe de distância (até 87 metros). O
parentesco estimado entre os indivíduos da população CR pode ser considerado
próximo ao parentesco esperado entre indivíduos primos de segundo grau
(0,031). Gusson et al. (2005) consideram que estimativas acuradas de
coancestria e parentesco são difíceis de serem obtidas, quando não há
informações sobre o pedigree do material, requerendo um grande número de
locos polimórficos, com um número relativamente alto de alelos. No entanto, a
despeito do número de alelos/loco ser menor quando comparados com
marcadores microssatélites, por exemplo, a análise da distribuição dos genótipos
nas cinco populações de E. erythropappus, aqui avaliadas, foi realizada a partir
de dados provenientes de 21 locos isoenzimáticos polimórficos. Este número de
locos é bem superior ao número utilizado por outros autores, para estudos de
estrutura genética espacial, empregando-se a técnica de isoenzimas (Gusson et
al., 2005; Loiselle et al., 1995).
Nas populações BM, MP e PB os valores estimados para os coeficientes
de coancestria foram bem próximos a zero ou negativos, não significativos a
95% de probabilidade (Figuras 6, 7, e 8). Estes resultados sugerem a ocorrência
de distribuição aleatória dos genótipos nessas três populações, indicando que
árvores localizadas espacialmente próximas não apresentam nenhum grau de
parentesco entre si. Não se deve desconsiderar, entretanto, que as populações
96
BM e PB apresentaram taxas de cruzamento entre aparentados diferentes de zero
(0,017 e 0,021 para BM e PB, respectivamente), como foi visto no item 4.6.5.
Estas taxas indicaram que existem indivíduos próximos, relacionados
geneticamente, responsáveis por alguns cruzamentos endogâmicos. No entanto,
os coeficientes de coancestria, estimados a partir de 21 locos de cada uma das
populações, BM e PB, não foram significativos, indicando que o parentesco
entre os indivíduos de cada população não foram suficientes para a formação de
uma estruturação familiar.
Coeficiente de coancestria
0,08
0,03
-0,02
195
319
441
592
732
906 1119 1349 1633 2165
-0,07
-0,12
Classe s de distância (m)
FIGURA 4. Correlograma para coeficiente de coancestria estimado por classes
de distâncias na população BR de Eremanthus erythropappus.
( coeficiente de coancestria; --- intervalo de confiança a 95% de
probabilidade).
97
Coeficiente de coancestria
0,08
0,03
-0,02
87
136
199 262
400
946 1046 1129 1228 1486
-0,07
-0,12
Classes de distância (m)
FIGURA 5. Correlograma para coeficiente de coancestria estimado por classes
de distâncias na população CR de Eremanthus erythropappus.
(
coeficiente de coancestria; --- intervalo de confiança a 95% de
probabilidade).
0,06
Coeficiente de coancestria
0,04
0,02
0,00
-0,02
144
223
285
353
433
521
612
754
907 1425
-0,04
-0,06
-0,08
-0,10
-0,12
Classe s de distância (m)
FIGURA 6. Correlograma para coeficiente de coancestria estimado por classes
de distâncias na população BM de Eremanthus erythropappus.
( coeficiente de coancestria; --- intervalo de confiança a 95% de
probabilidade).
98
Coeficiente de coancestralidade
0,08
0,03
-0,02
138
265
330
376
466
572
851 1367 2062 2821
-0,07
-0,12
Classe s de distância (m)
FIGURA 7. Correlograma para coeficiente de coancestria estimado por classes
de distâncias na população MP de Eremanthus erythropappus.
( coeficiente de coancestria; --- intervalo de confiança a 95% de
probabilidade).
Coeficiente de coancestria
0,08
0,03
-0,02
237 345
436
514
648 809 1001 1208 1514 2111
-0,07
-0,12
Classes de distância (m)
FIGURA 8. Correlograma para coeficiente de coancestria estimado por classes
de distâncias na população PB de Eremanthus erythropappus.
(
coeficiente de coancestria; --- intervalo de confiança a 95% de
probabilidade).
99
A presença de estruturação espacial dos genótipos, sugerida pelo
coeficiente de coancestralidade para as populações BR e CR, foi confirmada
pela estimativa do índice I de Moran (Figura 9 e 10). No caso da população BR,
o padrão espacial foi evidenciado pelos valores positivos e significativos do
índice I de Moran, a 95% de probabilidade, nas segunda e terceira classes de
distância, ou seja, até cerca de 450 metros de distância. Na classe de distância de
750 a 900 metros, o índice I de Moran apresentou-se negativo e significativo a
95% de probabilidade. A população CR apresentou valores positivos e
significativos do índice I de Moran nas segunda e quarta classes de distância,
sugerindo estruturação espacial dos indivíduos até 200 metros de distância.
Entre 350 e 400 metros o índice I de Moran apresentou valor negativo e
significativo. No entanto, apesar de apresentar valores do índice I de Moran
negativos e significativos em classes de distâncias maiores, em nenhuma das
populações, BR e CR, foi observada uma tendência que permitisse sugerir que
indivíduos mais distantes espacialmente sejam mais divergentes geneticamente.
Nas populações BM, MP e PB não foram detectados indícios de estruturação
genética espacial a partir do índice I de Moran (Figuras 11, 12 e 13), como já
havia
sido
sugerido
pelos
resultados
obtidos
pelos
coeficientes
de
coancestralidade. A análise dos valores médios do índice I de Moran, nestas três
populações, mostrou que os índices mantêm-se praticamente constantes,
demonstrando, assim, a não-formação de estrutura espacial significativa.
100
0.10
0.05
observado
0.00
I
150
300
450
600 750
900
1050 1200 1350 1500
95%
CI
-0.05
95%
CI
-0.10
Referência
-0.15
Distância espacial
FIGURA 9. Correlograma do índice I de Moran para dez classes de distâncias na
população BR de Eremanthus erythropappus.
0.4
0.3
observado
0.2
0.1
I
0.0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
95%
CI
-0.1
95%
CI
-0.2
-0.3
Referência
Distância espacial
-0.4
FIGURA 10. Correlograma do índice I de Moran para dez classes de distâncias
na população CR de Eremanthus erythropappus.
101
0.10
0.05
observado
0.00
I
100
200 300
400 500
600 700 800 900
1000
95%
CI
-0.05
95%
CI
-0.10
Referência
-0.15
Distância espacial
FIGURA 11. Correlograma do índice I de Moran para dez classes de distâncias
na população BM de Eremanthus erythropappus.
0.15
0.10
observado
0.05
I
0.00
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
95% CI
-0.05
95% CI
-0.10
-0.15
-0.20
Referência
Distância espacial
FIGURA 12. Correlograma do índice I de Moran para dez classes de distâncias
na população MP de Eremanthus erythropappus.
102
0.3
0.2
observedo
0.1
I
0.0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
95% CI
-0.1
95% CI
-0.2
-0.3
Referência
Distância espacial
-0.4
FIGURA 13. Correlograma do índice I de Moran para dez classes de distâncias
na população PB de Eremanthus erythropappus.
A presença de estruturação espacial dos indivíduos em populações
naturais de espécies arbóreas já foi verificada em diversos estudos (Gusson et
al., 2005; Moraes et al., 2004; Silva et al., 2004). Considerando a hipótese de
que a similaridade de condições ecológicas como clima, solo e altitude pode
levar a similaridade genética entre indivíduos (Graudal et al., 1997), e que a
dispersão do pólen e sementes dentro das populações muitas vezes podem ser
limitadas às vizinhanças da matriz, supõe-se que árvores mais próximas
apresentem maior similaridade genética do que árvores mais distantes
espacialmente (Graudal et al., 1997; Sokal & Menozzi, 1982). Futuyma (1992)
considera que, em uma população, existem limitações físicas que podem
dificultar os cruzamentos aleatórios, devendo haver maior probabilidade de
cruzamentos entre indivíduos mais próximos, o que, por sua vez, pode levar à
formação de grupos, estruturando a população.
103
Neste estudo, duas das cinco populações analisadas apresentaram
indícios de estruturação espacial de seus indivíduos (populações BR e CR). De
acordo com a análise da distribuição dos indivíduos nas referidas populações, a
estruturação parece estar ocorrendo nas primeiras classes de distâncias. Os
correlogramas da população BR (Figuras 4 e 9) demostraram agregação dos
genótipos em torno de 450 metros de distância, enquanto que os correlogramas
da população CR indicaram estruturação dos genótipos em distâncias, variando
de 87 metros (Figura 5) a 200 metros (Figura 10). Esse arranjo espacial dos
genótipos, estruturados em famílias, sugerido pelos resultados dessas duas
populações, BR e CR, pode ser atribuído a fatores ecológicos, como uma restrita
dispersão de pólen e sementes e também a fatores evolutivos como a seleção
intrapopulacional em microhábitats. No entanto, apesar de significativa, a
estruturação genética espacial nas populações BR e CR pode ser considerada
fraca, quando observamos os valores dos coeficientes de coancestralidade. As
estimativas desses coeficientes para as duas populações ( θˆxy BR igual 0,028 e
θˆxy
CR
igual a 0,032) podem ser consideradas baixas, assemelhando-se ao
parentesco entre primos de segundo grau. Estes resultados podem estar
indicando um princípio de estruturação genética espacial nas referidas
populações.
As demais populações de E. erythropappus analisadas (BM, MP e PB)
não apresentaram indícios de estruturação genética espacial. Apesar das
hipóteses de que exista estruturação espacial dentro de populações naturais, nem
sempre esse padrão é encontrado. Estudos com espécies arbóreas tropicais têm
revelado uma distribuição aleatória dos genótipos dentro de suas populações
naturais. É o caso de espécies como Aspidosperma polyneuron (Maltez, 1997),
Myracrodruon urundeuva (Lacerda & Kageyama, 2003) e Xylopia emarginata
(Jaeger, 2004). A ausência de estrutura espacial pode estar indicando que a
104
seleção local ou deriva genética local não são fortes o suficiente para promover
uma estruturação significativa na presença de fluxo gênico.
4.6 Caracterização da variação genética
4.6.1 Freqüências alélicas
As estimativas das freqüências alélicas nos indivíduos adultos e
progênies de E. erythropappus são apresentadas na Tabela 18. Pela análise das
freqüências alélicas dos 21 locos avaliados, verifica-se que não ocorreram alelos
exclusivos, ou seja, todos os alelos estavam presentes nas cinco populações e
também nas progênies. Apenas os locos α-EST-1 e β-EST-1 apresentaram 3
alelos, enquanto que nos demais locos o número de alelos encontrados foi 2.
Todas as populações, bem como as progênies, não apresentaram alelos fixados.
Alelos com baixa freqüência ocorreram apenas nos locos com 3 alelos; no loco
α-EST-1 foi verificada baixa freqüência para o alelo 1 na população BR (0,093),
para o alelo 1 na população PB (0,083), assim como nas progênies desta
população (0,024). No loco β-EST-1, o alelo 1 apresentou baixas freqüências
nas populações de MP (0,083), de PB (0,050) e nas progênies BM (0,066) e PB
0,019).
Observa-se que, para o loco β-EST-1, ocorreu uma mudança na
freqüência do alelo 1 dos adultos da população BM (0,267) com relação às
progênies (0,066), indicando a ocorrência de deriva genética ou seleção a favor
do alelo 2, visto que a freqüência do alelo 3 permaneceu praticamente inalterada.
Nas progênies da população PB, para o loco MDH-1, a freqüência do alelo 2
(0,543) também apresentou maior variação quando comparadas com os adultos
(0,704). Excetuando-se esses dois casos, quando se compara as freqüências
alélicas dos adultos das populações BM e PB com suas respectivas progênies,
105
verificam-se poucas diferenças entre elas, o que sugere a existência de um
equilíbrio entre as gerações. Além disso, observa-se que, para a maioria dos
locos analisados, o alelo mais comum nos adultos também foi o mais comum nas
progênies, indicando uma coerência nas freqüências alélicas.
TABELA 18. Freqüências alélicas e tamanho da amostra (n) em adultos e
progênies de E. erythropappus.
Loco
ACP-1
ADH-1
ADH-2
α-EST-1
α-EST-2
β-EST-1
β-EST-2
GDH-1
GDH-2
GLDH-1
Alelo
1
2
N
1
2
n
1
2
n
1
2
3
n
1
2
n
1
2
3
N
1
2
n
1
2
n
1
2
n
1
2
n
BM
0,621
0,379
29
0,400
0,600
30
0,583
0,417
30
0,138
0,259
0,603
29
0,483
0,517
30
0,267
0,167
0,567
30
0,648
0,352
29
0,433
0,567
BR
0,517
0,483
30
0,400
0,600
30
0,450
0,550
30
0,093
0,278
0,630
27
0,444
0,556
27
0,155
0,621
0,224
29
0,385
0,615
30
0,310
0,690
Adultos
CR
MP
0,483
0,577
0,517
0,423
30
26
0,433
0,464
0,567
0,536
30
29
0,433
0,534
0,567
0,466
30
29
0,133
0,100
0,200
0,350
0,667 0,55019
30
30
0,317
0,519
0,683
0,481
30
26
0,190
0,083
0,448
0,417
0,362
0,500
29
30
0,589
0,680
0,411
0,320
30
26
0,350
0,500
0,650
0,500
PB
0,467
0,533
30
0,328
0,672
29
0,621
0,379
29
0,083
0,367
0,550
30
0,638
0,362
29
0,050
0,317
0,633
30
0,367
0,633
30
0,450
0,550
Progênies
BM
PB
0.511
0.513
0.489
0.487
169
196
0.428
0.457
0.572
0.543
173
188
0.597
0.403
181
0.110
0.024
0.407
0.399
0.483
0.577
178
189
0.543
0.600
0.457
0.400
185
160
0.066
0.019
0.386
0.317
0.548
0.664
167
180
0.512
0.550
0.488
0.450
169
141
0.513
0.448
0.487
0.552
30
29
30
29
30
190
181
0,567
0,433
30
0,552
0,448
29
0,362
0,638
29
0,379
0,621
29
0,383
0,617
30
0,417
0,583
30
0,385
0,615
26
0,450
0,550
30
0,463
0,537
27
0,375
0,625
28
0.601
0.399
194
0.497
0.503
193
-
“...continua...”
106
“Tabela 18. Cont.”
GLDH-2
GLDH-3
GOT-1
GTDH-1
GTDH-2
GTDH-3
MDH-1
MDH-2
SDH-1
SDH-2
SDH-3
1
2
n
1
2
n
1
2
n
1
2
n
1
2
n
1
2
n
1
2
n
1
2
n
1
2
n
1
2
n
1
2
n
0,583
0,417
30
0,600
0,400
30
0,357
0,643
21
0,483
0,517
30
0,534
0,466
29
0,293
0,707
29
0,283
0,717
28
0,643
0,357
28
0,500
0,500
30
0,467
0,533
30
0,317
0,683
30
0,362
0,638
29
0,241
0,759
27
0,724
0,276
29
0,462
0,538
26
0,500
0,500
26
0,365
0,635
26
0,552
0,448
29
0,397
0,603
29
0,481
0,519
26
0,383
0,617
30
0,467
0,533
30
0,350
0,650
30
0,450
0,550
30
0,567
0,433
30
0,417
0,583
30
0,333
0,667
30
0,650
0,350
30
0,317
0,683
30
0,550
0,450
30
0,411
0,589
28
0,310
0,690
29
0,383
0,617
30
0,500
0,500
30
0,286
0,714
14
0,420
0,580
25
0,519
0,481
27
0,481
0,519
27
0,700
0,300
30
0,600
0,400
25
0,646
0,354
24
0,467
0,533
30
0,433
0,567
30
0,400
0,600
30
0,574
0,426
27
0,636
0,364
22
0,717
0,283
30
0,483
0,517
30
0,536
0,464
28
0,776
0,224
29
0,296
0,704
27
0,483
0,517
30
0,517
0,483
30
0,431
0,569
29
0,350
0,650
30
0.570
0.430
194
0.549
0.451
172
0.462
0.538
182
0.603
0.397
190
0.417
0.583
181
0.592
0.408
180
0.455
0.545
190
0.611
0.389
189
-
0.649
0.351
195
0.467
0.533
165
0.457
0.543
186
0.508
0.492
184
-
Observando a Tabela 18 e a Figura 14, nota-se que, para o conjunto das
populações,
não
houve
grandes
mudanças
nas
freqüências
alélicas.
Considerando como similares dois alelos que apresentem freqüências entre
0,350 e 0,650, observa-se que 67% dos locos das populações BM e MP
apresentam equidade gênica (ou baixa amplitude de variação), enquanto que nas
populações BR, CR e PB esta proporção é de 71%.
107
Alelo 1
Alelo 2
Alelo 3
1,0
0,8
0,5
0,3
0,0
Alelo 1
Alelo 2
Alelo 1
1,0
0,8
0,5
0,3
0,0
1,0
0,8
0,5
0,3
0,0
BM
BR
CR
MP
PB
BM
a -ES T 1
Aleo 1
Aleo 2
1,0
0,8
0,5
0,3
0,0
BR
Alelo 3
CR
Alelo 1
MP
CR
MP
PB
Alelo 2
MP
BM
BR
CR
Alelo 1
PB
MP
PB
BR
BM
Alelo 2
CR
GDH 1
MP
BR
Alelo 2
CR
Alelo 1
PB
Alelo 2
BR
CR
MP
PB
AC P 1
Alelo 1
MP
PB
Alelo 2
BM
BR
CR
MP
PB
S DH 3
Alelo 2
Alelo 1
1,0
0,8
0,5
0,3
0,0
BM
BM
S DH 2
1,0
0,8
0,5
0,3
0,0
PB
1,0
0,8
0,5
0,3
0,0
S DH 1
Alelo 1
MP
1,0
0,8
0,5
0,3
0,0
Alelo 2
CR
CR
Alelo 1
1,0
0,8
0,5
0,3
0,0
BR
BR
GOT 1
b-ES T 2
1,0
0,8
0,5
0,3
0,0
BM
BM
PB
1,0
0,8
0,5
0,3
0,0
b-ES T1
Alelo 1
BR
a -ES T 2
A l el o 1
BM
Alelo 2
Alelo 2
1,0
0,8
0,5
0,3
0,0
BM
BR
CR
GDH 2
MP
PB
BM
BR
CR
MP
PB
GTDH 1
“... continua ...”
FIGURA 14. Demonstrativo gráfico das freqüências alélicas em 21 locos de
cinco populações de Eremanthus erythropappus (eixo x:
populações BM, BR, CR, MP e PB; eixo y: freqüências alélicas).
108
“Figura 4. Cont.”
Alelo 1
Alelo 2
Alelo 1
1,0
0,8
0,5
0,3
0,0
Alelo 1
Alelo 2
1,0
0,8
0,5
0,3
0,0
1,0
0,8
0,5
0,3
0,0
BM
BR
CR
MP
PB
BM
BR
GTDH 2
Alelo 1
CR
MP
Alelo 2
Alelo 1
BR
CR
MP
PB
Alelo 2
Alelo 1
BM
BR
CR
MP
PB
BR
Alelo 2
CR
M DH 2
MP
A lelo 1
PB
MP
PB
Alelo 2
BR
CR
MP
PB
M DH 1
A lelo 2
A lelo 1
1,0
0,8
0,5
0,3
0,0
BM
BM
GLDH 3
1,0
0,8
0,5
0,3
0,0
CR
1,0
0,8
0,5
0,3
0,0
GLDH 2
Alelo 1
BR
GLDH 1
1,0
0,8
0,5
0,3
0,0
BM
BM
PB
GTDH 3
1,0
0,8
0,5
0,3
0,0
Alelo 2
A lelo 2
1,0
0,8
0,5
0,3
0,0
BM
BR
CR M P
ADH 1
PB
BM
BR
CR M P
PB
ADH 2
Segundo Frankel et al. (1996), a equidade gênica é conceituada como
aquela na qual a menor variabilidade das freqüências alélicas numa espécie é
indicativo de maior diversidade e pode manter as populações menos susceptíveis
à fixação e perda de alelos quando submetidas a perturbações e gargalos
genéticos. Assim, a população com maior diversidade estaria mais protegida dos
efeitos da deriva do que as que têm alelos em baixa freqüência, estando estes
mais susceptíveis de serem perdidos. A semelhança nas freqüências alélicas das
diferentes populações, juntamente com as proporções similares de eqüidade
gênica sugerem uma baixa divergência entre as populações em estudo.
109
4.6.2 Índices de variabilidade genética
A Tabela 19 apresenta os índices de variabilidade genética obtidos para
as cinco populações de adultos e duas de progênies de Eremanthus
erythropappus. Estas estimativas refletem altos níveis de variabilidade genética
para E. erythropappus, indicando que a espécie é potencial para programas de
conservação genética, melhoramento genético e manejo. O número médio de
alelos por loco ( Â ) variou de 2,18 (0,405) a 2,10 (0,300), sendo estes valores
semelhantes aos descritos por Kageyama et al. (2003b) para Trema micrantha,
uma espécie pioneira que também ocorre em alta densidade, cujo número médio
de alelos por loco foi de 2,10 a 2,20. Além de refletir a riqueza alélica, os
valores obtidos indicam uma distribuição semelhante dos alelos nas populações
tanto de adultos quanto de progênies. O número efetivo de alelos variou de 1,91
(população PB) a 2,00 (progênies BM) e, considerando o desvio padrão
apresentado para cada estimativa, nenhuma população diferenciou-se das
demais. Esses valores foram superiores aos obtidos para Myracrodruon
urundeuva (1,30 a 1,60) por Lacerda et al. (1999) e para Xylopia emarginata
(1,52 a 1,79) por Jaeger (2004). Segundo Murawski & Bawa (1994) essa
estimativa reflete o número de alelos necessário dentro de um loco para manter o
nível atual de heterozigosidade e Ellstrand & Ellan (1993) consideram que, a
longo prazo, a redução da riqueza alélica deve limitar a habilidade das espécies
responderem às mudanças devido à ação de forças seletivas. Assim, pode-se
considerar que E. erythropappus possui alto potencial evolutivo.
Para a média das populações, a estimativa da porcentagem de locos
polimórficos ( P̂95% ) foi de 100%, o número médio de alelos ( Â ) foi de 2,10, o
número médio de alelos efetivos ( Âe ) foi de 2,00, a heterozigosidade esperada
( Ĥ e ) foi de 0,500 e a heterozigosidade observada ( Ĥ o ) foi de 0,531. A alta
110
variabilidade genética de E. erythropappus fica evidenciada quando comparamse estes valores com os descritos por Hamrick & Godt (1990) para espécies
tropicais ( P̂95% = 58,9%; Â = 2,29; Ĥ e = 0,202), espécies de sistema misto de
reprodução e polinização animal ( P̂95% = 49,2%; Â = 1,89; Ĥ e = 0,148) e
estágio de sucessão inicial ( P̂95% = 40,0%; Â = 1,68; Ĥ e = 0,120).
TABELA 19. Índices de diversidade genética de cinco populações naturais e
duas progênies de Eremanthus erythropappus, em que: Âe número médio de alelos por loco;
Ĥ o - estimativa da
heterozigosidade observada; Ĥ e - estimativa da heterozigosidade
esperada; fˆ - estimativa do índice de fixação de Wright.
Â
Adultos
2,10
BM
Âe
P
1,94
100,0
(0,693)
Progênies
2,11
2,00
100,0
(0,709)
2,10
BR
1,92
100,0
(0,133)
2,10
CR
1,94
100,0
(0,196)
2,10
MP
1,96
100,0
(0,149)
Adultos
2,10
PB
1,91
100,0
(0,147)
Progênies
2,18
1,96
(0,063)
Média Pop.
2,10
2,00
100,0
100,0
Ĥ o
Ĥ e
fˆ
0.523
0,492
- 0,0648
(0,181)
(0,039)
[-0,224 a 0,093]
0,503
0,500
- 0,0849
(0,027)
(0,099)
[-0,187 a 0,019]
0,528
0,484
- 0,0917
(0,207)
(0,039)
[-0,272 a 0,099]
0,517
0,489
- 0,0568
(0,189)
(0,041)
[-0,230 a 0,125]
0,553
0,497
- 0,1149
(0,125)
(0,038)
[-0,187 a 0,019]
0,539
0,480
- 0,1252
(0,188)
(0,043)
[-0,295 a 0,049]
0,523
0,490
- 0,1360
(0,0171)
(0,129)
[-0,259 a 0,007]
0,532
0,488
- 0,0905
(0,144)
(0,135) (0,029)
[-0,216 a 0,043]
( )- desvio padrão; [ ] - intervalo de confiança a 95% de probabilidade.
111
O valor de heterozigosidade esperada obtido também foi superior ao
observado por Hamrick (1983) em um estudo envolvendo 38 espécies com
dispersão de sementes pelo vento ( Ĥ e = 0,238). Valores elevados de
heterozigosidade são comuns em espécies com alta densidade populacional, pois
a maior densidade de indivíduos pode permitir maior número de recombinações,
resultando em altos níveis de diversidade genética. Trabalhos como o de
Hamrick & Murawski (1991) mostram que a heterozigosidade esperada pode ser
maior em espécies comuns. Kageyama et al. (2003) também descrevem valores
elevados de heterozigosidade esperada para Trema micrantha (0,392) e para
Cecropia pachystachya (0,355), ambas espécies pioneiras e de alta densidade
populacional.
A heterozigosidade média esperada ( Ĥ e ) nas populações de adultos de
Eremanthus erythropappus variou de 0,472 a 0,488 e a observada ( Ĥ o ), de
0,517 a 0,553. As populações BM e PB apresentaram valores de Ĥ e menores
(0,483 e 0,472) que suas respectivas progênies (0,504 e 0,523). Giudice Neto
(1999) considera que pode ser esperada uma maior heterozigosidade nas
progênies, já que estas normalmente apresentam alelos exclusivos. No entanto,
no presente estudo, não ocorreram alelos exclusivos às progênies. O contrário
ocorreu quando se observa a heterozigosidade média observada ( Ĥ o ), sendo
esta menor nas progênies BM e PB (0,499 e 0,489, respectivamente) do que nos
adultos das populações BM e PB (0,520 e 0,539, respectivamente). Pode-se
dizer que existe uma tendência de a heterozigosidade alcançar maiores valores
em indivíduos adultos, sugerindo um mecanismo seletivo atuando em favor dos
heterozigotos. Tal tendência foi observada em diversos trabalhos, com espécies
como Euterpe edulis (Reis, 1996b), Chorisia speciosa (Souza, 1997) e
Copaifera langsdorffii (Oliveira, 2000).
112
De qualquer forma, verifica-se que as heterozigosidades ( Ĥ o e Ĥ e )
foram elevadas, ressaltando a alta diversidade genética para a E. erythropappus,
sendo os valores obtidos ligeiramente superiores aos descritos para Eschweilera
ovata por Gusson (2003), cuja Ĥ e variou de 0,354 a 0,431 e Ĥ o variou de
0,332 a 0,371, e um pouco inferiores aos valores obtidos por Melo Júnior
(2003) para Caryocar brasiliense, com Ĥ e variando de 0,450 a 0,530 e Ĥ o
variando de 0,583 a 0,817.
A relação entre os índices de heterozigosidade observada e esperada
gerou valores dos índices de fixação negativos, tanto para os adultos quanto para
as progênies, evidenciando um excesso de heterozigotos (Tabela 19). No
entanto, os valores obtidos não se diferenciaram estatisticamente de zero,
estando, portanto, em equilíbrio de Hardy-Weinberg e sugerindo ausência de
endogamia nos adultos e progênies de E. erythropappus. Comparando os valores
de fˆ entre os adultos da população BM (-0,0648) e suas progênies (-0,0069),
observa-se um aumento no excesso de heterozigotos nos adultos em relação às
suas progênies, concordando com o observado em Cryptocaria moschata
(Moraes, 1997), Chorisia speciosa (Souza, 1997) e Copaifera langsdorffii
(Oliveira, 2000).
4.7 Estrutura genética
A distribuição da diversidade genética entre e dentro das populações de
E. erythropappus (Tabela 20) foi avaliada utilizando-se a metodologia de Weir
& Cockerham (1984), por meio das estatísticas F. Estas estatísticas fornecem os
índices de fixação de alelos ao nível de populações ( fˆ ), total das populações
( F̂ ) e o coeficiente de coancestria ( θˆ p ), que é a probabilidade de se amostrar,
113
ao acaso, dois alelos idênticos por descendência em dois indivíduos dentro das
populações. As estatísticas F também se referem à aderência das populações ao
Equilíbrio de Hardy-Weinberg. Valores de F iguais a zero indicam genótipos
em EHW, valores positivos indicam excesso de homozigotos e valores negativos
indicam excesso de heterozigotos (Wright, 1965).
TABELA 20. Coeficientes de coancestralidade entre cinco populações de
adultos de Eremanthus erythropappus ( fˆ = índice de fixação
médio dentro das populações, F̂ = índice de fixação para o total
das populações e θˆ p = coeficiente de coancestria ou divergência
genética entre as populações).
Loco
fˆ
F̂
ACP-1
ADH-1
ADH-2
α-EST-1
α-EST-2
β-EST-1
β-EST-2
GDH-1
GDH-2
GLDH-1
GLDH-2
GLDH-3
GOT-1
GTDH-1
GTDH-2
GTDH-3
MDH-1
MDH-2
SDH-1
SDH-2
SDH-3
-0,162
-0,159
-0,108
-0,113
-0,104
-0,091
0,365
0,357
0,219
0,247
0,534
0,569
0,412
0,449
-0,542
-0,516
-0,055
-0,040
-0,360
-0,346
-0,128
-0,088
0,003
0,105
-0,326
-0,201
-0,495
-0,499
-0,229
-0,210
-0,075
0,102
-0,129
-0,040
-0,048
-0,018
-0,370
-0,376
-0,089
-0,089
-0,397
-0,392
-0,091
-0,052
Média
[ -0,216 a 0,043 ]
[ -0,181 a 0,082 ]
[ ] - intervalo de confiança a 95% de probabilidade.
114
θˆ p
0,002
-0,005
0,012
-0,013
0,035
0,074
0,062
0,017
0,014
0,010
0,035
0,103
0,094
-0,003
0,015
0,164
0,079
0,028
-0,004
-0,000
0,003
0,035
[ 0,017 a 0,055 ]
O índice de fixação médio ( fˆ ) foi negativo nas populações (-0,0905),
indicando ausência de endogamia dentro das populações. A ausência de
endogamia também foi verificada para o conjunto das populações (-0,0522) e,
embora estes valores não sejam diferentes de zero a 95% de probabilidade, eles
evidenciaram um excesso de heterozigotos. O excesso de heterozigotos em
populações naturais de espécies arbóreas tem sido descrito para outras espécies
tropicais como Caryocar brasiliense (Melo Júnior et al., 2004), Xylopia
brasiliensis (Pinto & Carvalho, 2004) e adultos de Trema micrantha (Ribas &
Kageyama, 2004).
A divergência entre as cinco populações de E. erythropappus obtida pela
estimativa do θˆ p foi de 0,035 (Tabela 20), indicando que a maior parte (96,5%)
da variabilidade genética encontra-se dentro das suas populações. Esse valor está
coerente com os valores obtidos para outras espécies arbóreas pioneiras e
abundantes, de 0,029 para Cecropia obtusifolia (Alvarez-Buyla & Garay, 2004),
de 0,026 para Cecropia pachystachya (Kageyama et al., 2003b) e de 0,039 para
Trema micrantha (Ribas & Kageyama, 2004). Segundo Loveless & Hamrick
(1984), espécies tipicamente alógamas apresentam alta variação genética dentro
de suas populações e baixa entre elas.
As estimativas de divergência genética entre cada par de populações
estão apresentadas na Tabela 21. Os resultados obtidos mostraram baixos
valores de divergência genética entre populações. No entanto, apesar dessas
baixas estimativas de divergência, todas foram significativas de acordo com o
intervalo de confiança. Como as populações BM e BR encontram-se mais
próximas geograficamente, distanciadas cerca de 2,6 km, esperava-se que
ocorresse uma menor divergência genética entre elas. No entanto, quando
comparadas duas a duas,
as populações BM e BR apresentaram a maior
estimativa de divergência ente os pares de populações ( θˆ p igual a 0,0619). Esse
115
resultado pode ser explicado pela diferença de altitude entre essas duas
populações. A população BM encontra-se numa altitude mais elevada, em torno
de 1.700 m de altitude, enquanto a população BR encontra-se numa altitude
inferior, em torno de 1.400 m. A presença desse gradiente altitudinal pode estar
afetando o fluxo gênico e, dessa forma, contribuindo para uma maior
divergência entre as populações BM e BR.
TABELA 21. Coeficientes de coancestralidade para cinco populações adultas de
Eremanthus erythropappus comparadas duas a duas ( F̂ = índice
de fixação para o total das populações, θˆ p = coeficiente de
coancestria ou divergência genética entre as populações, BM =
população de Baependi 1, BR = população de Baependi 2, CR =
população de Carrancas, MP = população de Morro do Pilar e PB
= população do Poço Bonito).
θˆ p
Populações
0,0619
[0,026 a 0,100]
0,0351
[0,014 a 0,061]
0,0302
[0,001 a 0,069]
0,0427
[0,004 a 0,093]
0,0194
[0,003 a 0,039]
0,0329
[0,006 a 0,062]
0,0516
[0,0142 a 0,095]
0,0153
[0,002 a 0,032]
0,0312
[0,013 a 0,052]
0,0342
[0,006 a 0,066]
BM e BR
BM e CR
BM e MP
BM e PB
BR e CR
BR e MP
BR e PB
CR e MP
CR e PB
MP e PB
[ ] - intervalo de confiança a 95% de probabilidade.
116
4.8 Fluxo gênico
O fluxo gênico é um termo coletivo que inclui todos os mecanismos que
resultam no movimento de alelos de uma população para outra (Slatkin, 1985).
A partir das medidas de divergência genética entre as populações, pode-se inferir
sobre o fluxo de genes entre estas. Em grande parte dos casos, as estimativas de
fluxo gênico consideram o modelo de migração de ilhas, no qual pequenas
populações trocam alelos aleatoriamente entre si, independente de sua posição
geográfica. No entanto, Slatkin & Barton (1989) consideram que os modelos
contínuos, como o isolamento por distância, são mais realistas para a maioria das
espécies de plantas. Desta forma, o conceito de tamanho efetivo populacional
ou tamanho de vizinhança, N b , proposto por Wright (1943) torna-se mais
adequado para estes casos.
No presente estudo, as estimativas de fluxo gênico foram realizadas a
partir da relação entre a divergência genética entre as populações e a quantidade
de migrantes, N̂m (Tabela 22). Os valores de fluxo gênico estimados foram
elevados, sendo os maiores entre as populações CR e MP (15,04) e entre BR e
CR (11,81). O fluxo gênico estimado para o conjunto das populações foi de 6,78
migrantes por geração. De acordo com as estimativas obtidas, o fluxo gênico
entre as populações de E. erythropappus é suficiente para contrapor os efeitos da
deriva genética, visto que, segundo Hartl & Clark (1997), quando o fluxo gênico
entre populações excede 4 migrantes por geração, ocorre a homogeneização dos
alelos entre estas, que funcionam como populações panmíticas.
117
TABELA 22. Fluxo gênico ( N̂m ), tamanho de vizinhança ( N̂ b ) para o conjunto
e para cada par de populações de Eremanthus erythropappus,
obtidos a partir da divergência genética ( θˆ p ).
Populações
θˆ p
N̂ m
N̂ b
BM e BR
0,062
3,536
22
BM e CR
0,035
6,422
40
BM e MP
0,030
7,502
47
BM e PB
0,043
5,237
33
BR e CR
0,019
11,808
74
BR e MP
0,033
6,867
43
BR e PB
0,052
4,294
27
CR e MP
0,015
15,035
94
CR e PB
0,031
7,254
45
MP e PB
Conjunto
0,034
6,597
41
0,035
6,780
42
Não foi observada uma relação entre o fluxo de genes e a distância
geográfica das cinco populações. Desta forma, as populações BM e BR,
distantes menos de 3 km uma da outra, apresentaram o menor valor de fluxo
gênico estimado (3,54). Um fator que poderia explicar tal resultado é a diferença
de 300 m de altitude entre estas duas populações. Da mesma forma, não se
esperava encontrar um fluxo gênico intenso entre as populações CR e MP, já que
esta última localiza-se a uma maior distância geográfica, superior a 250
quilômetros. No entanto, devemos considerar que o N̂m , calculado a partir da
divergência genética, reflete o fluxo de genes ocorrido durante um longo
período; ele não indica necessariamente que está havendo troca gênica em
determinado evento reprodutivo, mas estima os níveis de fluxo gênico que
118
devem ter ocorrido no passado para produzir os padrões observados de estrutura
genética. Assim, a baixa divergência entre as populações de E. erythropappus,
considerando especialmente a localizada em Morro do Pilar, não deve ter
ocorrido pelo fluxo de genes atual. É pouco provável que ele seja intenso o
suficiente para manter as populações similares geneticamente, devido às
distâncias que as separam.
Estimativas de fluxo gênico encontradas na literatura, como para
Euterpe edulis (Reis, 1996b), Cariniana legalis (Sebbenn, 2001) e Caryocar
brasiliense (Melo Júnior, 2003), indicam que a movimentação dos alelos
ocorrem a longas distâncias em espécies tropicais e, portanto, os processos
microevolutivos envolvem várias populações ou grupos mais distanciados.
Segundo Reis (1996a) numa concepção envolvendo o fator tempo, o conjunto de
alelos deve estar sendo compartilhado por grupos grandes de indivíduos,
formando metapopulações.
Utilizando a abordagem proposta por Slatkin & Barton (1989) foi
possível estabelecer o tamanho de vizinhança para E. erythropappus (Tabela
22). Este resultado indica que as unidades panmíticas ou vizinhanças, são de 42
indivíduos, ou seja, estes compõem os grupos parentais que trocam alelos ao
acaso. Numa mesma unidade de área, a redução neste número de indivíduos
pode levar a alterações na estrutura genética das populações em médio prazo,
aumentando a divergência entre as vizinhanças, devido ao aumento interno dos
níveis de endogamia. Restrições no fluxo de genes, com conseqüente redução do
tamanho de vizinhança, podem resultar em deriva genética mais acentuada,
queda dos níveis de heterozigosidade, reduzindo a diversidade genética da
espécie.
119
4.9 Tamanho efetivo
O tamanho efetivo populacional ( N̂ e ) é um parâmetro fundamental
quando se pensa em conservações ex situ e in situ, pois ele trata da
representatividade genética das amostras de plantas, sementes ou propágulos.
Como as estimativas dos tamanhos efetivos indicam a representatividade
genética das amostras a partir das freqüências alélicas, Moraes (1997) ressalta
que alguns fatores dinâmicos que afetam a distribuição das freqüências dos
alelos devem ser consideradas. Frankel et al. (1996) atentam para as flutuações
do tamanho populacional entre gerações, variação na fertilidade entre indivíduos
e sobreposição de gerações.
A partir dos coeficientes de divergência genética entre populações ( θˆP ),
coeficientes de endogamia das populações e coeficientes de endogamia para o
conjunto de populações, foram obtidas as estimativas de tamanho efetivo
(Tabela 23). Os resultados mostram que os tamanhos efetivos estimados para
cada população foram próximos do número de indivíduos amostrados. A
estimativa do N̂ e é feita em função dos índices de fixação ( fˆ ) (Vencovsky,
1992) e, como estes se apresentaram negativos, porém, não diferentes de zero,
podemos considerar que todas as populações estão em EHW (Tabela 19). Se o
excesso de heterozigotos, indicado pelos índices de fixação negativos, tivesse
sido mais expressivo, os indivíduos amostrados estariam representando
geneticamente mais indivíduos da população, com valores de N̂ e bem mais
elevados, pois em condições de heterozigose, a representatividade dos
indivíduos amostrados é maior (Sebbenn et al., 2003).
120
TABELA 23. Tamanho efetivo ( N̂ e ) e número de indivíduos (n) das amostras
de cinco populações naturais de Eremanthus erythropappus.
Populações
N̂ e
N
BM
32
30
BR
33
30
CR
31
30
MP
33
30
PB
34
30
Conjunto das Populações
50
150
De acordo com o resultado obtido para o conjunto das populações de E.
erythropappus, a coleta de sementes, para conservação ex situ, deverá
contemplar, pelo menos, 50 árvores matrizes, garantindo, assim, a manutenção
da variabilidade genética. Vencovsky (1987) considera que, para a coleta de
sementes e conservação de germoplasma, é fundamental que se faça o controle
gamético feminino, coletando-se sementes de um maior número possível de
plantas genitoras (matrizes) e, de preferência, em número igual de cada uma.
Com essa prática, reduz-se a variância do número de gametas contribuídos pelas
plantas genitoras e aumenta-se o tamanho efetivo. Portanto, as plantas genitoras
devem ser tomadas ao acaso e não suas sementes.
O conhecimento do tamanho efetivo populacional é, também, de grande
importância para o planejamento da conservação in situ, pois a relação entre e
tamanho efetivo e o tamanho da amostra ( Nˆ e / n) permite a estimativa da
população mínima viável (PMV), correspondendo ao número de indivíduos
necessários à população para a manutenção de sua integridade genética.
Tomando-se como base os valores de N̂ e (referência) iguais a 150 e 1.500 (Nunney
121
& Campbell, 1993), a PMV para o conjunto das populações é de 450 e 4.500
indivíduos, para a conservação a curto e longo prazo, respectivamente. Estes
valores referem-se ao número mínimo de árvores que deverão ser mantidas,
assegurando a manutenção dos níveis de variabilidade genética, para as
populações aqui avaliadas.
4.10 Marcadores RAPD
Marcadores RAPD também foram utilizados para avaliar os níveis de
variação genética entre e dentro de populações naturais de Eremanthus
erythropappus. Uma das razões para a escolha desse tipo de marcador deve-se a
não existência de informações sobre a sequência de DNA dessa espécie.
Portanto, a técnica de RAPD torna-se uma ferramenta mais acessível, quando
comparada a outras técnicas baseadas no polimorfismo de DNA, para
desenvolver esse tipo de estudo.
4.10.1 Seleção dos primers
Os critérios para a seleção dos primers utilizados para o estudo da
diversidade e estrutura genética de E. erythropappus foram o perfil de
amplificação, a repetibilidade e a nitidez das bandas. Oito primers foram
selecionados e produziram 42 bandas polimórficas (Tabela 24). Os primers
utilizados revelaram de 3 a 8 locos polimórficos e, em média, cada primer
produziu cerca de 5,3 locos polimórficos. Este número é próximo ao encontrado
por Estopa (2003), que obteve 5,6 locos polimórficos por primer, estudando três
populações naturais de E. erythropappus. No entanto, estes números são
inferiores ao obtido por Freitas (2001) no estudo genético de Eremanthus
erythropappus, cujos primers produziram, em média, 9,9 locos polimórficos.
122
Observando os perfis de amplificação dos 150 indivíduos amostrados, nota-se
que nenhum foi igual a outro, evidenciando a existência de variação genética nas
populações avaliadas. Na Figura 15, observa-se o perfil do primer OPX-06.
Tabela 24. Seqüência dos primers selecionados para Eremanthus erythropappus
e o padrão de polimorfismo.
Primer
OPO-10
OPN-06
OPN-08
OPN-09
OPN-14
OPX-06
OPX-14
OPX-15
Total
Sequência
5’- 3’
CCGAACACGG
GAGACGCACA
ACCTCAGCTC
TGCCGGCTTG
AAGCGACCTG
ACGCCAGAGG
ACAGGTGCTG
CAGACAAGCC
Número de
locos obtidos
6
7
8
7
6
7
7
9
56
Número de locos
polimórficos
4
3
6
5
5
5
6
8
42
Porcentagem de
Polimorfismo (%)
66,7
42,8
75,0
71,4
83,3
71,4
85,7
88,9
75,0
FIGURA 15. Perfil de um gel de RAPD utilizando o primer OPX-06 em
indivíduos de Eremanthus erythropappus.
4.10.2 Diversidade genética intrapopulacional
Os valores estimados para os índices de diversidade genética
intrapopulacionais encontram-se na Tabela 25. Os resultados mostram que não
ocorreram diferenças significativas para os parâmetros genéticos estimados entre
123
as cinco populações de E. erythropappus avaliadas. As porcentagens de
polimorfismo ( P̂ ) observadas foram bastante similares entre as populações,
variando de 90,48 a 92,86 %. Estes valores foram mais elevados do que os
obtidos por Freitas (2001), que relatou estimativas de polimorfismo variando de
54,5 a 70,7% em oito populações de Eremanthus erythropappus. O número de
alelos observados ( n̂a ) variou de 1,90 a 1,93, enquanto o número de alelos
efetivos ( n̂e ) variou de 1,57 a 1,64, entre as cinco populações de E.
erythropappus avaliadas (Tabela 25). De acordo com o desvio padrão
apresentado para as estimativas de n̂ a e de n̂e , nenhuma população diferenciouse das demais. A diversidade genética de Nei ( Ĥ e ) variou de 0,335 (população
BM) a 0,367 (população BR), não diferindo entre si, de acordo com o desvio
padrão. Estes valores de Ĥ e foram próximos aos obtidos por Estopa (2003), que
observou valores de Ĥ e variando de 0,299 a 0,333 em outras três populações
naturais de E. erythropappus. As estimativas de Ĥ e , encontradas nesse estudo,
podem ser consideradas maiores quando comparadas a outras espécies arbóreas
como Trichilia pallida Swartz ( Ĥ e variando de 0,27 a 0,33) (Zimback et al.,
2004) e Aspidosperma polyneuron Muell. Arg. ( Ĥ e médio de 0,287) (Torezan
et al., 2005), evidenciando altos níveis de variação intraespecífica nas
populações de E. erythropappus estudadas. Os valores estimados para o índice
de Shannon ( Ĥ o ) evidenciaram a alta diversidade genética dentro das
populações de E. erythropappus analisadas, variando de 0,498 a 0,539. Estes
valores foram semelhantes aos obtidos para outras populações, dessa mesma
espécie, cujo Ĥ o variou de 0,382 a 0,487, em estudo realizado por Freitas
(2001). Os desvios padrões apresentados para as estimativas de Ĥ o indicam
124
níveis similares de diversidade genética entre as diferentes populações. A
existência de alta diversidade genética dentro das populações naturais de E.
erythropappus é confirmada quando se comparam os valores do índice de
Shannon obtidos no presente estudo com aqueles encontrados para outras
espécies arbóreas, nos quais foram utilizadas metodologias similares. Lacerda et
al. (2001) observaram valores de Ĥ o variando de 0,301 a 0,367 para
Plathymenia reticulata. Torezan et al. (2005) obtiveram Ĥ o igual a 0,410 para
indivíduos adultos de Aspidosperma polyneuron. Tais comparações, juntamente
com o fato de que não foram observados indivíduos geneticamente semelhantes,
considerando os marcadores RAPD, revelam forte evidência de que a espécie E.
erythropappus apresenta níveis altos de variabilidade genética intrapopulacional.
TABELA 25. Parâmetros genéticos populacionais obtidos por meio de 42
marcadores RAPD para cinco populações naturais de
Eremanthus erythropappus. Ĥ e : diversidade genética de Nei;
Ĥ o : índice de Shannon de diversidade fenotípica; n̂a : número
de alelos observados; n̂e : número de alelos efetivos e P̂ :
porcentagem de locos polimórficos.
Populações
BM
BR
CR
MP
PB
P̂
Ĥ e
Ĥ o
90,48
0,335
(0,152)
0,367
(0,135)
0,349
(0,156)
0,352
(0,155)
0,359
(0,148)
0,498
(0,205)
0,539
(0,181)
0,514
(0,208)
0,517
(0,207)
0,526
(0,201)
92,86
90,48
90,48
90,48
( ): desvio padrão
125
4.10.2.1 Similaridade genética intrapopulacional
As similaridades genéticas entre os genótipos de cada população de E.
erythropappus, calculadas com base no coeficiente de Jaccard e agrupadas pelo
método
UPGMA,
foram
representadas
graficamente,
utilizando-se
dendrogramas. Nas cinco populações avaliadas os marcadores RAPD
possibilitaram a discriminação de diferentes genótipos, formando grupos com
números distintos de genótipos. O agrupamento dos indivíduos de E.
erythropappus da população BM é apresentado na Figura 16. Considerando um
nível de similaridade genética de 50%, os genótipos foram agrupados em cinco
grupos distintos, como podem ser vistos na Tabela 26. Nesta população (BM)
indivíduos que apresentaram maior similaridade genética foram os indivíduos 03
e 04 (82%). A importância desses resultados reside no fato de que estes nos
indicam quais são os genótipos mais divergentes dentro de cada população,
podendo servir de orientação na escolha dos parentais para os cruzamentos
realizados em programas de melhoramento genético.
126
FIGURA 16. Dendrograma representativo das similaridades genéticas entre os
indivíduos de Eremanthus erythropappus da população BM,
utilizando o método UPGMA.
TABELA 26. Agrupamento dos genótipos de Eremanthus erythropappus
provenientes da população BM, discriminados a 50% de
similaridade genética.
Grupo
Indivíduos
I
II
III
IV
16 e 18
2
30
24
VI A: 7, 9, 10, 11, 13, 15, 17, 22, 23, 25, 26 e 27
VI B: 1, 3, 4, 5, 6, 8, 12, 14, 19, 20, 21, 28 e 29
V
127
Para a população BR o agrupamento dos genótipos, de acordo com a
matriz de similaridade genética, está representado na Figura 17. Separando-se os
grupos a 55,6% de similaridade genética, foram obtidos quatro grupos distintos
(Tabela 27). Na população BR a similaridade genética entre os 30 indivíduos
analisados variou de 0,53 a 0,80. Os indivíduos 24 e 29 apresentaram o maior
nível de similaridade genética (80%), enquanto que os indivíduos 1 e 26 foram
os mais divergentes geneticamente.
TABELA 27. Agrupamento dos genótipos de Eremanthus erythropappus
provenientes da população BR, discriminados a 55,6% de
similaridade genética.
Grupo
Indivíduos
I
II
III
IV
19, 22, 24, 26, 27, 28, 29 e 30
16 e 23
3, 4, 5, 6, 14, 15, 18 e 25
1, 2, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 17, 20 e 21
128
FIGURA 17. Dendrograma representativo das similaridades genéticas entre os
indivíduos de Eremanthus erythropappus da população BR,
utilizando o método UPGMA.
A população CR apresentou seis grupos distintos (Tabela 28), separados
a 48,5% de similaridade genética. O agrupamento dos indivíduos obtido a partir
da matriz de similaridade genética está representado na Figura 18. Os indivíduos
03 e 08 apresentaram 84% de similaridade genética, enquanto que os indivíduos
mais divergentes geneticamente foram os 01 e 04 (65% de divergência genética).
129
FIGURA 18. Dendrograma representativo das similaridades genéticas entre os
indivíduos de Eremanthus erythropappus da população CR,
utilizando o método UPGMA.
TABELA 28. Agrupamento dos genótipos de Eremanthus erythropappus
provenientes da população CR, discriminados a 48,5% de
similaridade genética.
Grupo
Indivíduos
I
II
III
IV
V
4
16
20
2e5
12 e30
VI A: 19 e 24
VI B: 1, 3, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 13, 14, 15, 17, 18, 21, 22, 23, 25,
26, 27, 28 e 29
VI
130
Na população MP dois grupos de indivíduos apresentaram alta
similaridade genética. Um grupo formado pelos indivíduos 02 e 11 e outro
formado pelos indivíduos 06 e 24, ambos similares a 74%, como podem ser
vistos na Figura 19. Considerando todos os indivíduos da população MP, foram
formados seis grupos a 52,3% de similaridade genética (Tabela 29). Os
indivíduos mais divergentes geneticamente foram o 01 e 27, com 59% de
divergência entre eles.
TABELA 29. Agrupamento dos genótipos de Eremanthus erythropappus
provenientes da população MP, discriminados a 52,3% de
similaridade genética.
Grupo
Indivíduos
I
II
III
IV
V
27
22, 26 e 28
20, 23 e 25
18 e 21
29
VI A: 6, 9, 13, 14, 17 e 24
VI B: 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 10, 11, 12, 15, 16, 19 e 30
VI
131
FIGURA 19. Dendrograma representativo das similaridades genéticas entre os
indivíduos de Eremanthus erythropappus da população MP,
utilizando o método UPGMA.
As similaridades genéticas obtidas para a população PB estão
representadas na Figura 20. Os indivíduos desta população foram agrupados a
53,1% de similaridade, constituindo cinco grupos (Tabela 30). Os indivíduos
mais similares geneticamente foram o 07 e 08 (78%) e os indivíduos 01 e 28
apresentaram maior divergência genética (57%).
Dentre as cinco populações de E. erythropappus, estudadas via
marcadores RAPDs, a população CR foi a que apresentou maior divergência
genética entre os indivíduos (65%), ao passo que, na população BR, todos os
indivíduos analisados foram similares a 53%. Portanto, os indivíduos da
população BR
apresentaram divergência genética menor (47%) quando
comparados com os indivíduos das demais populações. Os resultados obtidos
132
neste estudo demonstraram que em todas as populações existe variabilidade
genética, com genótipos apresentando de 0,35 a 0,84 de similaridade genética.
Os valores de similaridade genética observados foram semelhantes aos valores
obtidos por Estopa (2003) estudando outras três populações de E. erythropappus
localizadas no sul de Minas Gerais A partir desses resultados, as cinco
populações naturais de E. erythropappus, aqui avaliadas, podem ser
consideradas como fonte de material genético para programas de melhoramento
genético da espécie. A informação gerada a respeito dos indivíduos mais
similares ou mais divergentes geneticamente pode ser de grande valor,
especialmente se o objetivo do programa de melhoramento for a ampliação da
base genética dessa espécie. Além disso, essas populações devem ser incluídas
em programas de conservação genética da espécie, devido a existência de
considerável variabilidade genética intrapopulacional.
TABELA 30. Agrupamento dos genótipos de Eremanthus erythropappus
provenientes da população PB, discriminados a 53,1% de
similaridade genética.
Grupo
Indivíduos
I
II
III
IV
V
27 e 28
18
30
15 e19
V A: 14,16,20,21,22 e 24
V B: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 17, 23, 25, 26 e 29
133
FIGURA 20. Dendrograma representativo das similaridades genéticas entre os
indivíduos de Eremanthus erythropappus da população PB,
utilizando o método UPGMA.
4.10.3 Estrutura genética por marcadores RAPD
O índice de Shannon e a análise de variância molecular (AMOVA)
possibilitaram o conhecimento da distribuição da variabilidade genética dentro e
entre as populações naturais de E. erythropappus. O índice de Shannon revelou
que 12,2% da variação foi devida à diferenças entre populações e 87,8% foi
devida à diferenças entre indivíduos dentro das populações (Tabela 31).
Observou-se que a subdivisão da diversidade genética variou entre os diferentes
primers. O primer OPN-14, por exemplo, detectou apenas 7,9% da variação
entre populações, enquanto que o primer OPN-16 detectou 16,7%, mostrando
134
que o emprego de vários primers resulta em uma melhor estimativa desse
parâmetro.
TABELA 31. Partição da diversidade genética (índice de Shannon) entre e
dentro de populações de Eremanthus erythropappus para 8
primers aleatórios.
Primer
Ĥ pop
Ĥ sp
Hˆ pop / Hˆ sp
( Hˆ sp − Hˆ pop ) / Hˆ sp
OPO-10
OPN-06
OPN-08
OPN-09
OPN-14
OPX-06
OPX-14
OPX-15
Média
0,474
0,483
0,554
0,495
0,550
0,517
0,543
0,506
0,515
0,541
0,579
0,627
0,558
0,598
0,592
0,605
0,593
0,587
0,877
0,833
0,884
0,886
0,921
0,873
0,897
0,854
0,878
0,123
0,167
0,116
0,114
0,079
0,127
0,103
0,146
0,122
A AMOVA, com base nos dados de 42 locos avaliados, mostrou que
87,62% da variabilidade genética de E. erythropappus está presente dentro de
populações e 12,38% entre populações, sendo o valor de φˆST igual a 0,1238
(Tabela 32). Trabalhos como os de Hamrick & Loveless (1989) e Loveless &
Hamrick (1987) mostraram que as espécies arbóreas tropicais tendem a
apresentar altos níveis de variabilidade genética dentro de suas populações e,
portanto, baixa divergência entre populações. Estudos mais recentes sobre a
estrutura genética de arbóreas tropicais têm confirmado essa hipótese. Gillies et
al. (1999) estudando a diversidade genética de Swietenia macrophylla King. por
marcadores RAPD, observaram que 87,43% da variabilidade genética da espécie
encontram-se dentro de populações, 12,01% entre populações dentro de regiões
e 0,57 entre regiões. Lacerda et al. (2001) observaram que 12,3% e 16% da
variação genética de Plathymenia reticulata podem ser atribuídas a diferenças
entre populações, de acordo com a AMOVA e índice de Shannon,
135
respectivamente. Os resultados de estrutura genética obtidos no presente estudo
podem ser comparados aos obtidos para esta última espécie, pois a P. reticulata
possui características semelhantes à E. erythropappus, como a alta capacidade
de dispersão de sementes e a provável polinização por abelhas.
Utilizando a metodologia proposta por Nei (1978), Zimback et al. (2004)
relataram que 12,5% da variabilidade genética de Trichilia pallida está contida
entre suas populações. Em populações de Eugenia dysenterica, Zucchi (2002)
observou uma divergência genética de 27,03% entre dez populações da espécie,
acessada por marcadores RAPD. Os resultados obtidos nesse estudo estão de
acordo com o esperado para espécies arbóreas, ou seja, eles indicam que as
populações naturais de E. eryhtropappus exibem consideráveis níveis de
variabilidade genética dentro de suas populações (87,62%) e níveis moderados
de divergência entre populações (12,38%).
Tabela 32. Resultado da análise de variância molecular (AMOVA) para 150
indivíduos de cinco populações de Eremanthus erythropappus.
Fonte de
variação
Entre
populações
Dentro
populações
Total
GL
4
145
149
Componentes
Porcentagem
de variância
de variação
160.627
1.08308
12.38
1111.333
7.66437
87.62
1271.960
8.74744
SQ
P
<0,001
<0,001
Observa-se que as duas metodologias empregadas para obter a partição
da variabilidade genética de E. erythropappus nesse estudo, apresentaram
resultados semelhantes. Pela partição da variabilidade, utilizando o índice de
Shannon, a divergência genética entre populações foi estimada em 12,20%
136
(Tabela 31), enquanto que, com base na AMOVA, o φˆST foi estimado em
12,38%. Dessa forma, pode-se concluir que houve concordância entre os
resultados derivados de ambos os métodos. Comparando os resultados obtidos
no presente estudo com aqueles relatados por Freitas (2001) e por Estopa (2003),
para esta mesma espécie, nota-se que os valores de divergência genética, entre as
populações aqui analisadas, foram mais baixos do que aqueles observados nos
referidos trabalhos. Freitas (2001) encontrou valores de divergência de 14,3% e
17,8% entre oito populações de E. erythropappus, utilizando o índice de
Shannon e AMOVA, respectivamente. No entanto, além das populações
estudadas por Freitas (2001) serem diferentes das populações avaliadas no
presente trabalho, elas estão distribuídas em áreas de mata e candeial, o que
pôde, provavelmente, ter contribuído para uma maior divergência genética entre
populações. A divergência genética obtida por Estopa (2003) para três
populações de E. erythropappus foi bem mais elevada ( Ĝ ST igual a 21,29%) do
que a observada no presente estudo. No entanto, esses resultados referem-se a
outras populações e, ainda, a divergência foi obtida pelas estimativas da
diversidade genética de Nei (1987), diferente da metodologia empregada nesse
estudo. Apesar das diferenças na magnitude da divergência genética entre
populações, os resultados obtidos podem ser considerados congruentes,
evidenciando que a maior parte da variabilidade genética da espécie E.
erythropappus está contida dentro de suas populações. O conhecimento dessa
distribuição da variabilidade genética é de essencial para a adoção de estratégias
realmente efetivas de conservação in situ e ex situ, além de fornecer informações
fundamentais para o sucesso de programas de manejo e melhoramento genético.
O valor da divergência genética entre as populações naturais de E.
erythropappus, estimado por marcadores RAPDs ( φˆST = 0,1238), pode ser
considerado moderado. De acordo com Wright (1978), valores de divergência
137
entre 0 e 0,05 indicam baixa diferenciação genética, entre 0,05 e 0,15 indicam
moderada diferenciação e entre 0,15 e 0,25 a diferenciação genética entre
populações pode ser considerada elevada. O valor estimado de φˆST nesse estudo
(0,1238) está de acordo com os valores relatados por Hamrick & Godt (1989)
para espécies com ampla distribuição geográfica, de fecundação cruzada e
dispersas pelo vento ( φˆST variando de 0,10 a 0,20). Os valores de φˆST obtidos
para cada par de populações indicam que estas podem ser consideradas
diferentes uma das outras, pois todos os valores foram significativos (P<0,001).
As maiores diferenciações genéticas foram encontradas entre as
populações BR e MP (0,166) e entre MP e PB (0,152). Esses níveis moderados
de variação genética entre populações refletiram nas estimativas do fluxo gênico
entre elas. O fluxo gênico estimado a partir da divergência entre as populações
foi de 1,77 migrantes/geração, variando de 1,26 a 3,63 (Tabela 33). Os valores
estimados para o fluxo gênico foram similares aos obtidos por Freitas (2001)
entre oito populações naturais de Vanillosmopsis erythropappa ( N̂m de 1,49).
As estimativas de N̂m também foram semelhantes às obtidas por Lacerda et al.
(2001) para P. reticulata, com a maioria dos valores de N̂m variando entre 1,2 a
3,5. Hartl & Clark (1997) sugerem que valores de N̂m acima de 4,0 indicam
que as populações se comportam como uma única população panmítica. No
entanto, o único valor de fluxo gênico mais próximo de 4,0 foi o encontrado
entre as populações BM e BR (3,63). Como estas duas populações ocorrem
muito próximas geograficamente (2,6 km de distância), possivelmente elas se
comportam (ou se comportavam, num passado não muito distante) como uma
população panmítica, realizando trocas alélicas.
138
TABELA 33. Valores de φˆST estimados para cada um dos pares de populações
(abaixo da diagonal) e número de migrantes ( N̂m ) entre
populações (acima da diagonal) de Eremanthus erythropappus.
População
BM
BR
CR
MP
PB
BM
-
3,63
1,73
1,62
1,54
BR
0,064
-
1,64
1,26
2,17
CR
0,126
0,132
-
2,17
2,06
MP
0,134
0,166
0,103
-
1,40
PB
0,139
0,103
0,108
0,152
-
As cinco populações de E. erythropappus foram agrupadas pelo método
UPGMA, de acordo com a matriz de divergência genética (Figura 21). A
correlação cofenética do agrupamento UPGMA desta matriz foi elevada (r =
0,804). A análise do agrupamento revela que as populações BM e BR são mais
semelhantes, formando um grupo distinto dos demais. O teste de Mantel,
utilizado para correlacionar a matriz de divergência genética e a matriz de
distâncias geográficas, revelou valores significativos (r = 0,572, P = 0,0247),
sugerindo um padrão espacial de estruturação dessas populações. Esses
resultados podem indicar que as populações estão sofrendo os efeitos da deriva
genética, devido à fragmentação e à diminuição do fluxo gênico, causada pelo
isolamento por distância.
139
FIGURA 21. Dendrograma de cinco populações naturais de Eremanthus
erythropappus, definido pelo critério de agrupamento UPGMA,
com base nas divergências genéticas ( φˆST ) obtidas pela
AMOVA.
4.11 Considerações finais
A estrutura genética de E. erythropappus foi analisada com base em
duas classes distintas de marcadores: isoenzimas e RAPD. Ambos marcadores se
mostraram adequados para esse tipo de estudo. A técnica de isoenzimas pode ser
mais laboriosa e por isso, demandar mais tempo para a obtenção de resultados.
Dessa forma, os marcadores RAPD podem utilizados para fornecer dados com
maior rapidez, gerando informações sobre a variabilidade genética das
populações e sobre a divergência genética entre populações e indivíduos. Por
outro lado, a utilização dos marcadores RAPD pode ser limitada devido à sua
140
herança dominante, o que não ocorre com as isoenzimas, cuja expressão
codominante permite a diferenciação entre indivíduos homozigotos e
heterozigotos. Assim, os marcadores isoenzimáticos podem ser mais adequados
aos estudos sobre o sistema reprodutivo e o fluxo de genes.
A espécie E. erythropappus apresentou elevados índices de diversidade
genética, revelados tanto por marcadores isoenzimáticos quanto por marcadores
RAPD. Ambos os tipos de marcadores indicaram que a maior parte da
variabilidade genética desta espécie encontra-se distribuída dentro de suas
populações naturais.
Os resultados sobre o sistema reprodutivo indicaram que E.
erythropappus reproduz-se por cruzamentos. No entanto, como ocorreram
diferenças significativas nas taxas de cruzamentos individuais, o sistema de
reprodução desta espécie deve ser considerado misto, com ocorrência de
cruzamentos e autofecundação. Houve indicativos de cruzamentos entre
indivíduos aparentados, pois as taxas de cruzamentos unilocos foram menores
que as taxas multilocos. As correlações de paternidade foram elevadas,
indicando a ocorrência de cruzamentos biparentais nas populações naturais de E.
erythropappus. Os coeficientes de coancestria estimados nas progênies foram
superiores ao esperado em progênies de meio-irmãos.
A estimativa de tamanho efetivo de variância permitiu estimar o número
de matrizes necessário para reter um N e de 150 para E. erythropappus. Este
número foi de 63 e 55 matrizes para as populações BM e PB, respectivamente.
Desta forma, cerca de 60 seria o número mínimo de matrizes a serem coletadas
para a conservação genética ex situ, em curto prazo, desta espécie, nas
populações avaliadas. Considerando N e ( referência ) de 150 e 1.500 (Nunney &
Campbell, 1993) a população mínima viável para a conservação de E.
erythropappus, em curto e longo prazo, deverá ser 450 e 4.500 indivíduos,
respectivamente.
141
A definição do número mínimo de árvores porta-sementes a ser mantido
em uma área sob manejo deve ser feito com base no tamanho efetivo da
população. Considerando o tamanho efetivo médio das populações avaliadas
nesse estudo, são necessárias 139 árvores porta-sementes por hectare, para
assegurar um tamanho efetivo de 150. Essas árvores devem estar em plena fase
reprodutiva, distribuídas de maneira uniforme por toda a área. Com o intuito de
evitar a ocorrência de seleção disgênica, as árvores remanescentes devem
apresentar genótipos superiores, além de um bom aspecto fitossanitário.
A análise da estrutura genética espacial indicou que E. erythropappus
apresenta distribuição aleatória dos genótipos. No entanto, uma certa
estruturação foi observada em duas das cinco populações avaliadas. A presença
de estruturação espacial deve ser considerada no planejamento da coleta de
sementes e de manejo.
142
5 CONCLUSÕES
Os estudos realizados nas populações naturais de Eremanthus
erythropappus possibilitaram chegar às seguintes conclusões:
A espécie apresenta altos níveis de variabilidade genética, caracterizando
seu potencial em programas de melhoramento genético, de conservação
genética in situ e ex situ e de manejo florestal;
A maior parte da variabilidade genética da espécie encontra-se dentro de
suas populações naturais;
Não foi detectada a ocorrência de endogamia dentro das populações;
O fluxo de genes encontrado entre as populações foi elevado, caracterizando
baixa divergência genética entre elas;
A espécie é alógama, reproduzindo-se predominantemente por cruzamentos;
Os cruzamentos nas duas populações analisadas não ocorreram de maneira
aleatória, sendo uma expressiva proporção das progênies resultantes de
cruzamentos biparentais;
Nas populações de Baependi 2 (BR) e de Carrancas (CR) os indivíduos de
E. erythropappus apresentam tendência à estruturação familiar. Nas demais
populações (BM, MP e PB) os indivíduos se encontram distribuídos
espacialmente de maneira aleatória;
O número mínimo de matrizes para a coleta de sementes, visando a
manutenção da variabilidade genética existente na espécie, é 60.
143
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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allozymes exhibit similar levels of diversity and differentiations amonh
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