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Interbio v.5 n.1 2011 - ISSN 1981-3775
AVALIAÇÃO DO EFEITO IMUNODEPRESSOR DA DEXAMETASONA EM
CAMUNDONGOS INOCULADOS COM BACTERINA DE STAPHYLOCOCCUS
AUREUS
EVALUATION OF THE IMMUNODEPRESSOR EFFECT OF THE
DEXAMETHASONE IN MICE INOCULATED WITH STAPHYLOCOCCUS AUREUS
BACTERINA
BARROS, Bismark José 1
Resumo
Através do presente trabalho, avaliou-se a ação da dexametasona como agente imunodepressor em camundongos
inoculados com bacterina de Staphylococcus aureus ATCC. A pesquisa foi realizada na Universidade
Paranaense (UNIPAR)-Umuarama/PR e se utilizou 5 grupos de 6 animais recendo o seguinte protocolo: GS1uma dose de bacterina sem tratamento com dexametasona; GSD1-uma dose de bacterina e tratamento com
dexametasona; GS2-duas doses de bacterina sem tratamento com dexametasona; GSD2-duas doses de bacterina
e tratamento com dexametasona; GC-duas doses de injeção salina (grupo controle).Os animais dos grupos foram
pesados e submetidos semanalmente à colheita de sangue para o teste soro-aglutinação em tubos para detecção
de anticorpos induzidos pela inoculação da bacterina de Staphylococcus aureus. Os resultados obtidos apontaram
para uma resposta imuno-humoral deprimida enquanto os animais estavam recebendo a dexametasona,
restabelecendo-se níveis normais após a suspensão da mesma.
Palavras-chave:Sistema imune, anticorpos, aglutinação, corticosteróides, dexametasona.
Abstract
Trough the present work,, evaluated it action of dexamethasone as immunodepressor agent on mice inoculated
with inativated strain of Staphylococcus aureus ATCC. The research was carried trough in the UNIPAR –
Umuarama/ PR, and it used 5 groups of 6 animals receiving the following protocol: GS1 – one dosis vial strain
withless dexamethasone; GSD1 – one dosis vial strain with dexamethasone; GS2 – two dosis vial strain withless
dexamethasone; GSD2– two dosis vial strain with dexamethasone; GC – two dosis vial of saline (control group).
The animals of the groups were heavy and weekly submitted to the crop of blood for the test serum-agglutination
in tubes for detection of antibodies induced by the inoculation of the antigen of Staphylococcus aureus The
results obtained aim to depresed response imunne however the animals are receiving the dexamethasone,
restabilish normal levels after your suspension.
Key-words: Imunne system; antybodies; agglutination;corticosteroydes; dexamethasone.
1
Médico Veterinário, Especialista em Clínica e Cirurgia de Pequenos Animais; Mestre em Ciência Animal.
Professor do Curso de Medicina Veterinária da Universidade da Grande Dourados – UNIGRAN:
[email protected]
BARROS, Bismark José
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Introdução
A resposta imune adquirida pode ser
dividida
em
fases
distintas:
o
reconhecimento do antígeno, a ativação dos
linfócitos e a fase efetora de eliminação do
antígeno, seguindo-se um retorno ao estado
de homeostasia e manutenção da memória.
Tais fases podem ser mediadas por
linfócitos B ou linfócitos T. No primeiro
caso, a resposta é do tipo humoral e se
caracteriza principalmente pela produção de
anticorpos. No segundo, a resposta é do tipo
celular e se manifesta basicamente por
citotoxidade (ABBAS; LICHTMAN, 2003).
Segundo Tizard (2001), antígenos
exógenos, tais como, microorganismos
extracelulares e vacinas inativadas, induzem
predominantemente uma resposta imune do
tipo humoral, observando-se inicialmente,
na estimulação primária , uma baixa
magnitude na produção de anticorpos. Após
a segunda estimulação, e estimulações
sucessivas, ocorre uma grande produção de
imunoglobulina, a qual se mantém na
corrente sanguínea por tempo prolongado,
conforme mostra a figura 1.
Figura 1: Efeitos de estimulações antigênicas sobre a produção de anticorpos em animai (Tizard, 2001) .
Ação dos corticosteróides no sistema
imune
Os primeiros relatos dos efeitos
benéficos com atividade imunossupressora
datam de 1949, com o uso da cortisona
Embora se utilize os corticosteróides como
agentes imunossupressores , seu preciso
modo de ação permanece obscuro. Podemse classificar os mamíferos como sensíveis
ou resistentes aos corticosteróides, com base
na facilidade na qual podem sofrer
esgotamento de linfócitos. Os roedores de
laboratório e o homem são muito mais
resistentes aos efeitos imunossupressores
dos corticosteróides que os animais
domésticos
(TIZARD,
2001).
Os
corticosteróides,
por serem altamente
lipossolúveis, em função de sua estrutura
química (figura 2), são rapidamente
absorvidos diretamente no interior da célula,
onde se conjugam com um receptor no
citoplasma. Este complexo (esteróidereceptor) é transportado para o núcleo onde
estimula a síntese da proteína denominada
IқBα . A IқBα suprime as atividades do
fator de transcrição NF-қB. O NF-қB é
normalmente mantido em estado inativo por
formar complexo com o IқBα . Quando um
linfócito é estimulado, as duas moléculas se
dissociam , a IқBα se degrada rapidamente e
o NF-қB ativo fica livre para agir. Por meio
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da estimulação da síntese de um excesso de
IқBα que se conjuga com o NF-қB , os
corticosteróides bloqueiam todos os
processos mediados pelo Nf-қB , incluindo
a síntese de citocinas (figura 3). De maneira
geral, os corticosteróides influenciam a
imunidade em quatro áreas (quadro 1),
interferindo na circulação de leucócitos, nos
mecanismos efetores dos linfócitos,
modulando as atividades dos mediadores
inflamatórios modificando o metabolismo
das proteínas, carboidratos e gordura
(TIZARD,2001).
Figura 2 : Estrutura química da dexametasona (FFUP, 2006).
Os corticosteróides causam apoptose
de timócitos, deprimindo a capacidade
dessas células produzirem citocinas, com
exceção da IL-2 . Os efeitos da terapia com
corticosteróides nas respostas de anticorpos
são variáveis e dependem do momento da
administração e da dose ministrada. Em
geral, as células B tendem a ser resistentes
aos corticosteróides naturais e sintéticos ,
sendo necessárias doses altas para deprimir
a síntese de anticorpos (TIZARD, 2001).
Figura 3: Mecanismo de ação dos corticosteróides dentro da célula (FFUP, 2006).
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Quanto à farmacocinética, os
corticosteróides são, em geral, rapidamente
absorvidos pelo trato gastrointestinal, sendo
distribuídos por todo o organismo. A ligação
da dexametasona às proteínas plasmáticas é
reversível e menor que a maioria de outros
corticosteróides (mais ou menos em torno de
77 %). A dexametasona tem elevada
afinidade para a globulina, mas baixa
capacidade de ligação. Somente a fração
livre pode entrar na célula e mediar os
efeitos corticosteróides. O tempo de meia
vida plasmática é de 3 h + ou – 0,8 h. Os
corticosteróides
são
essencialmente
metabolizados no fígado. A metabolização
lenta dos corticosteróides sintéticos, como a
dexametasona, associada a uma baixa
ligação às proteínas plasmáticas, explica a
elevada potência e a longa duração de ação
comparada com os corticosteróides naturais.
A excreção da droga ocorre basicamente por
via urinária e atinge 65 % em 24 horas,
sendo o clearence de 3,7 + ou – 0,9
ml/min./kg (FFUP, 2006).
Quadro 1: Efeitos dos corticosteróides no sistema imune (TIZARD, 2001).
CÉLULAS
EFEITOS
Neutrofilia
NEUTRÓFILOS
Depressão da quimiotaxia
Depressão da marginação
Depressão da fagocitose
Depressão da ADCC
Depressão da atividade bactericida
Depressão da quimiotaxia
MACRÓFAGOS
Depressão da fagocitose
Depressão da atividade bactericida
Depressão da produção de IL-1
Depressão do processamento de antígeno
Depressão da proliferação
LINFÓCITOS
Depressão das respostas de células T
Citotoxidade mediada por células T prejudicada
Depressão da produção de IL-2
Depressão da produção de citocinas
LINFÓCITOS B
Diminuição mínima na produção de
imunoglobulinas
Prova de aglutinação
Diversas técnicas de diagnóstico
imunológico podem ser utilizadas para se
avaliar uma resposta imune frente a um
agente infeccioso ou vacinal. No presente
trabalho, a técnica escolhida foi a
aglutinação, uma vez que ela se aplica bem
a antígenos particulados, como é o caso do
antígeno formado de células inativadas de
Staphilococcus aureus. Nesta técnica,
considerada como teste de ligação
secundário por medir os efeitos da ligação
antígeno-anticorpo,
os
anticorpos
combinam-se com antígenos de superfície
das partículas e dependendo de relação
ótima entre antígeno-anticorpo, pode-se
formar um mosaico que se apresenta
macroscopicamente como grumos. A
aglutinação é considerada prova qualitativa
e semi-quantitativa, de alta sensibilidade,
porém de baixa especificidade, sendo
utilizada, na maioria das vezes, como teste
de triagem (BIER, 1980).
O presente estudo teve como
objetivo principal avaliar a ação de uma
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droga imunodepressora sobre a resposta
imune-humoral primária e secundária, em
camundongos inoculados com bacterina de
Staphylococcus aureus, visando uma
possível extrapolação para situações
clínicas, nas quais o organismo animal
encontra-se imunodeprimido, como no
estresse e algumas infecções virais.
Material e Métodos
Produção de imunobiológicos
Staphylococcus aureus ATCC foi
cultivado em meio de cultura apropriado no
laboratório de Medicina Veterinária
Preventiva e Saúde Pública da UNIPAR, a
partir do qual se produziu dois tipos de
imunobiológicos. O primeiro material,
denominado inóculo, graduado em 0,5 na
escala de Mc Farland, correspondendo a
uma concentração de 109 bactérias/ ml, foi
utilizado como vacina neste experimento. O
outro, graduado em 3 na mesma escala,
correspondendo a 1015 bactérias/ml, foi
utilizado como antígeno na reação de
aglutinação. Ambos os materiais foram
previamente inativados com formalina.
Iniciou-se a administração da droga
imunossupressora desde 7 dias antes até 7
dias depois da primeira inoculação de forma
continuada na água de bebida dos
camundongos pertencentes aos grupos
GSD1 e GSD2, conjuntamente com um
antibiótico de largo expectro. Como droga
imunossupressora
utilizou-se
a
dexametasona2 na dosagem de 8 mg /L. O
antibiótico utilizado foi a oxitetraciclina 3 na
dosagem de 1 mg / L. O grupo GC foi o
controle do experimento.
Administração do inóculo (vacina)
No dia 0 (zero) do experimento,
injetou-se 0,2 ml do inóculo, por via
subcutânea na região abdominal ventral, nos
camundongos dos grupos (GS1,GSD1, GS2
e GSD2). O grupo GC, sendo o controle do
experimento, recebeu solução salina como
vacina. No dia 7, apenas os animais dos
grupos GS2 e GSD2 receberam o reforço
vacinal. Dessa forma, os animais dos grupos
GS1 e GSD1 constituíram-se no objeto de
estudo da resposta imune primária, enquanto
os dos grupos GS2 e GSD2 na avaliação da
resposta imune secundária.
Colheita de sangue
Animais de experimentação
Para a realização do presente
trabalho foram organizados 5 grupos
distintos, cada um constituído por 6
camundongos albinos da linhagem Swiss
Webstar em idade reprodutiva. Os referidos
grupos foram nomeados em GS1, GSD1,
GS2,
GSD2 e GC e mantidos
individualizados em caixas próprias para a
manutenção dos animais até o final do
experimento, quando os mesmos sofreram
eutanásia, de acordo com a resolução 714 do
Conselho Federal de Medicina Veterinária
(CFMV, 2002) e protocolo aprovado pelo
Comitê de Ética da Universidade
Paranaense (UNIPAR).
Administração
imunossupressora
da
droga
No dia 7 do experimento colheu-se o
sangue dos animais de todos os grupos,
objetivando a extração do soro para a
realização da prova de aglutinação. Utilizouse como técnica de colheita a punção venosa
do plexo vascular orbital com tubo capilar,
após prévia anestesia geral inalatória com
halotano4. O volume de sangue coletado foi
aproximadamente de 0,5 ml, que após
coagulação e centrifugação a 1500 G
(gravidade), permitiu um rendimento em
soro de 40 % em média. Novas colheitas,
utilizando-se a mesma técnica, foram
realizadas nos dias 14 e 21.
2
Decadron, Aché Laboratórios Farmacêuticos,
Guarulhos – SP.
3
Tormicina, Tortuga Companhia Zootécnica
Agrária, São Paulo- SP.
4
Halothano. Cristália Indústria Química
Farmacêutica Ltda, Itapira – SP.
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Realização da prova de aglutinação
Nos dias 7, 14 e 21 do experimento
foram realizadas as provas de aglutinação
em micro-placas de poliestireno com fundo
em “U”, distribuindo-se, inicialmente, 25
micro-litros de solução tampão PBS, pH 7,2,
em 48 poços , para cada grupo estudado,
perfazendo um total de 240 poços (5 grupos)
em
micro-placas
individualizadas.
Adicionou-se 25 micro-litros do soro dos
animais de cada grupo à primeira linha de
poços, objetivando a diluição e se transferiu
de forma seqüencial 25 micro-litros para as
linhas de poços seguintes, descartando-se 25
micro-litros na final da diluição. Com esse
procedimento, obteve-se diluições de 1:2,
1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128 e 1:256.
Depositou-se, em seguida, 25 micro-litros
do antígeno em cada um dos poços.Agitouse as placas suavemente sobre a bancada,
visando uma perfeita homogeneização.
Envolveu-se as micro-placas com plástico
(para evitar evaporação dos reagentes) e
incubou-se as placas por 24 horas, à
temperatura ambiente.
lâmpada fluorescente como fonte luminosa.
Considerou-se como resultado positivo uma
turvação difusa da solução e negativo a
formação de um botão de coloração
esbranquiçada no fundo do poço com
solução sobrenadante límpida.
Pesagem dos animais
Os camundongos, de todos os
grupos, foram pesados nos dias 7, 14 e 21,
utilizando-se balança automática com
precisão decimal.
Anotação dos
estatística
resultados
e
análise
Em todas as etapas, os valores de
pesagem e aglutinação foram anotados em
quadros para futura análise estatística e
confecção do gráfico referente à resposta
imune. Utilizou-se o programa GraphPad
InStat para a análise estatística : análise de
variância para o peso e teste de KruskalWallis para níveis de anticorpos no teste de
aglutinação.
Resultados e Discussão
Leitura das microplacas
Nos dias 8, 15 e 22 foram realizadas
as leituras das micro-placas, utilizando-se
uma caixa de fundo escuro contendo uma
No decorrer do experimento, adotouse como parâmetro indicativo de saúde dos
animais o peso, o qual foi determinado nos
dias 7,14 e 21 (tabela 1).
Tabela 1: Média dos pesos (gramas) e respectivos desvios padrão dos grupos de
camundongos inoculados com
GRUPOS
MÉDIA E DESVIO PADRÃO
GS1
GSD1
GS2
GSD2
GC
7 DIAS
35,33 +- 5,53
28,30 +- 4,32
36,42 +- 2,52
32,00 +- 5,27
34,25 +- 4,19
14 DIAS
35,58 +- 5,31
31,63 +- 3,75
37,75 +- 3,00
34,75 +- 2,38
34,83 +- 3,83
21 DIAS
36,17 +- 5,25
35,50 +- 3,56
37,33 +- 2,54
35,63 +- 4,57
36,30 +- 2,61
Staphilococcus aureus ATCC inativado.
GS1: animais inoculados com uma dose de S. aureus;
GSD1: animais inoculados com uma dose de S. aureus, tratados com dexametasona;
GS2: animais inoculados com duas doses de S. aureus com intervalo de 7 dias;
GSD2: animais inoculados com duas doses de S. aureus, tratados com dexametasona;
GC: animais inoculados com duas doses de solução salina ( grupo controle );
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A análise estatística indicou que aos
7, 14 e 21 dias não houve diferença
significativa entre os grupos, p = 0,0513 > p
= 0,05:, p = 0,2032 > p = 0,05 e p = 0,9448
> p = 0,05 respectivamente.
Analisando a Tabela 1, observa-se
que os animais dos grupos GSD1 e GSD2,
que
receberam
tratamento
com
dexametasona até o dia da pesagem,
apresentaram uma média de peso corporal
inferior às médias dos animais pertencentes
aos demais grupos que não receberam o
tratamento com a droga imunossupressora.
Após a suspensão da droga os animais dos
grupos GS1 e GSD2 obtiveram um aumento
em suas médias de peso corporal, enquanto
os animais dos demais grupos mantiveram
uma média constante. Esse fato pode ser
explicado, devido os animais dos grupos
GS1 e GSD2 terem sofrido os efeitos
catabólicos da dexametasona sobre proteínas
e gorduras, levando a uma perda de peso em
administrações prolongadas, porém esses
animais conseguiram recuperar o peso,
indicando que não adquiriram infecções
oportunistas, o que pode ser justificado pelo
uso de um antibiótico de largo espectro
(oxitetraciclina), uma vez que o uso crônico
de corticosteróides, pode aumentar a
suscetibilidade às infecções (TIZARD,
2001).
Tabela 2: Mediana da titulação de anticorpos em camundongos inoculados com
Staphilococcus aureus ATCC.
MEDIANA
GRUPO
7 DIAS
14 DIAS
21 DIAS
64
24
32
GS1
8
6
40
GSD1
8
20
32
GS2
6
12
64
GSD2
18
2
0
GC
GS1: animais inoculados com uma dose de S. aureus;
GSD1: animais inoculados com uma dose de S. aureus, tratados com dexametasona;
GS2: animais inoculados com duas doses de S. aureus com intervalo de 7 dias;
GSD2: animais inoculados com duas doses de S. aureus, tratados com dexametasona;
GC: animais inoculados com duas doses de solução salina ( grupo controle );
Quanto à resposta humoral, os
animais do grupo GS1, que receberam
apenas uma dose do inóculo de bacterina de
Staphylococcus aureus ATCC, apresentaram
uma cinética na produção de anticorpos
compatível com o esperado: elevado nível 7
dias após a inoculação e decréscimo em dias
subseqüentes.
Animais pertencentes ao grupo
GSD2 que receberam dexametasona antes e
durante a primeira inoculação apresentaram
uma resposta de anticorpos inversa, com
baixa titulação aos 7 dias e aumento
progressivo nos dias 14 e 21. Os animais do
grupo GS2 apresentaram o título inferior 7
dias após a primeira inoculação e aumento
após a segunda.Camundongos do grupo
GSD2 apresentaram baixo nível de
anticorpos 7 dias após a primeira inoculação
e uma elevação do nível de anticorpos após
a segunda. Os achados relatados acima
demonstraram a ação depressora da
dexametasona sobre a magnitude da
resposta imune-humoral.
O grupo controle também apresentou
títulos de anticorpos 7 e 14 dias após a
primeira
e
segunda
inoculações,
provavelmente porque alguns animais do
grupo tiveram contato prévio com a bactéria
Staphylococcus aureus ao longo se suas
vidas, tendo em vista que já eram animais
adultos
quando
recebidos
para
o
experimento.
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Figura 4: Cinética da produção de anticorpos em camundongos inoculados com Staphylococcus aureus ATCC.
(GS1: animais inoculados com uma dose de S. aureus; GSD1: animais inoculados com uma dose de S. aureus,
tratados com dexametasona; GS2: animais inoculados com duas doses de S. aureus com intervalo de 7 dias;
GSD2: animais inoculados com duas doses de S. aureus, tratados com dexametasona; GC: animais inoculados
com duas doses de solução salina (grupo controle)).
TIZARD, I. R. Imunologia veterinária – uma
introdução. São Paulo: Roca, 2002, 532 p.
Conclusão
A dexametasona, como agente
imunodepressor, diminuiu a magnitude de
produção de anticorpos nos camundongos
inoculados com Staphylococcus aureus
enquanto estava sendo administrada. Após a
suspensão do seu uso, os níveis de
anticorpos , tanto na resposta imune
primária
como
secundária,
foram
restabelecidos.
Referências Bibliográficas
ABBAS, A.K.; LICHTMAN, A. H. Imunologia
celular e molecular. Rio de Janeiro: Elsevier, 2003,
580 p.
BIER, O. Bacteriologia e imunologia. São Paulo:
Melhoramentos, 1980, 1063 p.
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Disponível
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http://www.cfmv.org.br/legislacao.php?mn=cfmv.
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Porto.
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BARROS, Bismark José