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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FISIOLÓGICAS LEONARDO RODRIGUES DOS SANTOS NARINGINA PROMOVE EFEITO INOTRÓPICO POSITIVO DEPENDENTE DE CATECOLAMINAS ENDÓGENAS EM CORAÇÃO ISOLADO DE RATO SÃO CRISTOVÃO 2016 LEONARDO RODRIGUES DOS SANTOS NARINGINA PROMOVE EFEITO INOTRÓPICO POSITIVO DEPENDENTE DE CATECOLAMINAS ENDÓGENAS EM CORAÇÃO ISOLADO DE RATO 2016 UFS i LEONARDO RODRIGUES DOS SANTOS NARINGINA PROMOVE EFEITO INOTRÓPICO POSITIVO DEPENDENTE DE CATECOLAMINAS ENDÓGENAS EM CORAÇÃO ISOLADO DE RATO Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Fisiológicas da Universidade Federal de Sergipe como requisito à obtenção do grau de Mestre em Ciências Fisiológicas Orientadora: Prof.ª Drª. Carla Maria Lins de Vasconcelos Co-orientadora: Prof.ª Drª. Evaleide Diniz de Oliveira SÃO CRISTOVÃO 2016 ii FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA BIBLIOTECA CENTRAL UNIVERSIDADE FEDERAL DE SERGIPE Santos, Leonardo Rodrigues dos S237n Naringina promove efeito inotrópico positivo dependente de catecolaminas endógenas em coração isolado de rato / Leonardo Rodrigues dos Santos ; orientadora Carla Maria Lins de Vasconcelos. – São Cristóvão, 2016. 64 f. : il. Dissertação (mestrado em Ciências Fisiológicas) – Universidade Federal de Sergipe, 2016. 1. Naringina. 2. Coração - Contração. 3. Flavonoides. Vasconcelos, Carla Maria Lins de, orient. II. Título. I. CDU 612.17:615.22 iii LEONARDO RODRIGUES DOS SANTOS NARINGINA PROMOVE EFEITO INOTRÓPICO POSITIVO DEPENDENTE DE CATECOLAMINAS ENDÓGENAS EM CORAÇÃO ISOLADO DE RATO Dissertação apresentada ao Núcleo de Pós-Graduação em Ciências Fisiológicas da Universidade Federal de Sergipe como requisito à obtenção do grau de Mestre em Ciências Fisiológicas. __________________________________________________ Orientadora: Profª. Drª. Carla Maria Lins de Vasconcelos __________________________________________________ Co-Orientadora: Profª. Drª. Evaleide Diniz de Oliveira _____________________________________________ 1º Examinador: Prof. Drª. Mônica Santos de Melo _____________________________________________ 2º Examinador: Prof. Dr. Carlos Alberto Menezes _____________________________________________ 1º Suplente: Prof. Drª. Brancilene Santos de Araújo _________________________________________ 2º Suplente: Prof. Drº. Charles dos Santos Estevam iv Dedicatória Aos meus pais, Leandro e Irani, pelo incentivo e apoio incondicionais em todas as minhas decisões e, sobretudo, por serem a base de todas as vitórias até aqui alcançadas. Amo vocês! À minha esposa, Carla, pelo apoio emocional irrestrito, ao longo dos últimos dois anos e ainda, por ter sido, de maneira tão responsável, mãe e “pai” de Julinha em todos os momentos em que estive ausente durante este difícil período. Te amo! À minha filha, Maria Júlia, motivação maior. v AGRADECIMENTOS Primeiramente agradeço a Deus, pela vida e saúde, bem como por estar ao meu lado durante as mais variadas adversidades pelas quais passei nos últimos tempos, mantendo-me forte e focado em meus objetivos. A Universidade Federal de Sergipe, por oportunizar através do Programa de Pós-Graduação em Ciências Fisiológicas, todo a experiência e conhecimento adquiridos. A toda equipe do Programa de Pós-Graduação em Ciências Fisiológicas/PROCFIS, por ter conduzido de maneira impecável o meu sonho e o de vários colegas, que tanto desejaram concluir este mestrado, amparando-nos e tornando esta árdua caminhada mais suave. A todos os professores, aos membros da coordenação do curso e à equipe da secretaria do Programa, o meu muito obrigado! À Profª. Drª. Carla Maria Lins Vasconcelos, minha orientadora, pelo desejo constante em contribuir com o crescimento intelectual dos seus orientandos, sempre com muita paciência e zelo. Agradeço pela excepcional disponibilidade em acompanhar as atividades por mim desenvolvidas no laboratório. Costumamos dizer que além de orientadora, é uma “Mãe”! Gratidão é a melhor palavra para traduzir o que sinto por você. Obrigado amiga! À minha co-orientadora, Profª Drª. Evaleide de Oliveira Diniz, pela extrema boa vontade em contribuir para o andamento dos experimentos assim como, pelos conselhos e opiniões, e ainda, pelos inúmeros ensinamentos transmitidos. Eva, muito obrigado! Ao Laboratório de Biofísica do Coração (LBC), em especial ao Prof. Drº. Eduardo Antônio Conde Garcia e aos caros companheiros: José Evaldo, Diego, Américo, Júlio, Valeska, Carlos Michel, Gilmara, Michel, Fernando, Luanderson, Maycon e Matheus, pelas valiosas contribuições ao longo do desenvolvimento deste trabalho. Aos professores, Dr. Luis Felipe Souza da Silva e Dr. José Ronaldo dos Santos, membros participantes das bancas examinadoras do PROASA, pelas importantes contribuições, assim como, aos professores que participaram das bancas de qualificação e defesa: Drª. Renata Grespan, Drª Brancilene Santos de Araújo, Drª. Mônica Santos de Melo e Dr. Carlos Alberto Menezes. vi “A mente que se abre a uma nova idéia jamais voltará ao seu tamanho original.” Albert Einstein vii RESUMO SANTOS, Leonardo Rodrigues; OLIVEIRA, Evaleide Diniz; VASCONCELOS, Carla Maria Lins. NARINGINA PROMOVE EFEITO INOTRÓPICO POSITIVO DEPENDENTE DE CATECOLAMINAS ENDÓGENAS EM CORAÇÃO ISOLADO DE RATO. Dissertação de mestrado em Ciências Fisiológicas, Universidade Federal de Sergipe, São Cristovão, 2016. A naringina é um glicosídeo flavonoide (C27H32O14) encontrado em uvas e frutas cítricas, reconhecida por exercer atividades antioxidante, antiaterogênica, hipoglicemiante, dentre outras. Os efeitos contráteis e elétricos da naringina foram caracterizados sobre o músculo cardíaco de rato. Os experimentos foram realizados em átrio esquerdo isolado de rato (cuba com 8 mL, Krebs-Hanseilet, 29 ± 0,1 °C; Estimulação: 1 gf, 1 Hz; 100 V; 1,5 ms). Os dados de força foram captados por transdutor isométrico (Grass FT03), amplificados (Grass P11T), digitalizados (DATAQ DI710) e armazenados em computador para análise. A naringina (0,003 - 6 mM) foi adicionada cumulativamente ao banho para determinar sua influência sobre parâmetros contráteis. Curvas concentração-efeito da naringina foram obtidas após a pré-incubação do átrio com 1 μM de propranolol ou 1 μM nifedipina ou 1 μM de rianodina ou ainda, usando átrios de animais com depleção de catecolaminas. Os efeitos da naringina sobre o eletrocardiograma foram obtidos através da técnica de Langendorff (10 mL/min Bomba peristáltica Milan; Solução de Krebs a 34 ± 0,1 °C aerada com carbogênio), com mensuração da pressão intraventricular esquerda (PVE) por inserção de balonete. Os dados foram expressos pela média ± erro padrão da média e os resultados foram avaliados pela análise de variância de uma via (ANOVA) com pós-teste de Tukey ou pelo teste t de Student. Valores de p ≤ 0,05 foram considerados significativos e as análises estatísticas foram realizadas com o GraphPad Prism© versão 5.0 (GraphPad Software Inc., San Diego CA, USA). A Naringina (0,03 - 2 mM) promoveu efeito inotrópico positivo em átrio (147%; CE50 de 0,32 ± 0,01 mM; n = 5) dependente de concentração. A partir de 3 mM, a naringina reduziu a força contrátil. No efeito inotrópico positivo máximo da naringina, houve redução da duração da sístole de 0,11 ± 0,006 s para 0,09 ± 0,002 s (p < 0,05) e aumento na duração da diástole de 0,84 ± 0,019 s para 0,88 ± 0,0024 s (p < 0,05). Observado aumento da dT/dt(+) de 6,16 ± 1,76 gf/s para 19,74 ± 2,64 gf/s (p < 0,01) e da dT/dt(-) de 6,21 ± 1,14 gf/s para 13,52 ± 1,78 gf/s (p < 0,01). A naringina também promoveu relaxamento diastólico (44 %). A préincubação dos átrios com propranolol (antagonista β-adrenérgico não-seletivo) ou nifedipina (antagonista de canais de cálcio tipo-L) ou rianodina (antagonista de receptores de rianodina) aboliu o efeito inotrópico positivo induzido pela naringina, assim como, não se evidenciou aumento de força contrátil em átrios obtidos de animais previamente reserpinizados. Quanto aos parâmetros elétricos, a naringina encurtou o PRi de 48,42 ± 0,81 ms para 47,31 ± 0,89 ms (n = 5, p < 0,05) e reduziu o intervalo QT(QTc) de 66,75 ± 2,35 ms para 64,36 ± 2,24 ms. Por outro lado, a duração do complexo QRS aumentou (Controle: 18,5 ± 1,0 ms e Naringina: 20,83 ± 1,24 ms). Este flavonoide também influenciou a atividade do marcapasso cardíaco, aumentando a frequência cardíaca 226,9 ± 1,12 bpm para 240,2 ± 3,94 bpm. Nenhum evento de arritmia cardíaca foi registrado durante a perfusão do coração com a naringina. A PVE sofreu aumento de 6%. A naringina exerce efeito cronotrópico e inotrópico positivos em coração de rato por ativação indireta de receptores β-adrenérgicos através da liberação catecolaminas endógenas e promove alterações eletrocardiográficas significativas, ao reduzir PRi, QTc e RRi, além de lentificar a velocidade do QRS. PALAVRAS-CHAVE: Naringina, Coração, Contratilidade, Receptor adrenérgico, Rato. viii ABSTRACT SANTOS, Leonardo Rodrigues; OLIVEIRA, Evaleide Diniz; VASCONCELOS, Carla Maria Lins. NARINGIN PROMOTES POSITIVE EFFECT INOTROPIC DEPENDENT CATECHOLAMINES ENDOGENOUS IN HEART MOUSE ISOLATED. Master’s degree dissertation in Physiological Sciences, Federal University of Sergipe, São Cristóvão, 2016. Naringin is a flavonoid glycoside (C27H32O14) found in citrus fruits and grapes, recognized for exercising antioxidant, antiatherogenic, hypoglycemic activity, among others. Contractile and electrical effects of naringin were characterized on the heart muscle of rats. The experiments were performed in the left atrium isolated rat (tub with 8 ml, Krebs-Hanseilet, 29 ± 0.1 ° C; Stimulation: 1 gf, 1 Hz, 100 V, 1.5 ms). The force data were obtained by isometric transducer (Grass FT03), amplified (Grass P11T), digitized (DATAQ DI710) and stored in a computer for analysis. The naringin (0.003 to 6 mM) was added cumulatively to the bath to determine their influence on the contractile parameters. Curves concentration-effect of naringin were obtained after atrial preincubation with 1 uM propranolol or 1 uM nifedipine or 1 uM ryanodine or still, using atria of animals with depletion of catecholamine. The effect of naringin on electrocardiograms were obtained by Langendorff technique (10 ml / min - Milan peristaltic pump; Krebs solution at 34 ± 0.1 °C aerated with carbogen), with measurement of the left intraventricular pressure (PVE) by inserting the balloon. Data were expressed as mean ± standard error of the mean and the results were evaluated by one-way analysis of variance (ANOVA) with Tukey post test or Student t test. P values ≤ 0.05 were considered significant and statistical analyzes were performed with the GraphPad Prism© version 5.0 (GraphPad Software Inc., San Diego CA, USA). Naringin (0.03-2 mM) induced a positive inotropic effect on atrium (147%; EC50 of 0.32 ± 0.01 mM, n=5) dependent on concentration. From 3 mM, naringin reduced the contractile force. At maximum positive inotropic effect of naringin there was a decrease of systole duration of 0.11 ± 0.006 sec to 0.09 ± 0.002 sec (p <0.05) and increase in the diastole duration of 0.84 ± 0.019 sec to 0.88 s ± 0.0024 sec (p <0.05). Observed increase dT/dt (+) of 6.16 ± 1.76 gf/sec to 19.74 ± 2.64 gf/sec (p <0.01) and dT/dt (-) of 6.21 ± 1.14 gf/sec to 13.52 ± 1.78 gf /sec (p <0.01). Naringin also promoted diastolic relaxation (44%). Preincubation of the atria with propranolol (Non-selective β-adrenoceptor antagonist) or nifedipine (L- type calcium channels antagonist) or ryanodine (ryanodine receptors antagonist) abolished the positive inotropic effect induced by naringin, as well as no detectable increase in contractile force in atria of animals with depletion of catecholamines. With regard to electrical parameters, naringin shortened PRi of 48.42 ± 0.81ms to 47.31 ± 0.89ms (n = 5, p <0.05) and reduced QT intervals (QTc) of 66, 75 ms ± 2.35 to 64.36 ± 2.24 ms. Conversely, the QRS complex increased (Control: 18.5 ± 1.0 ms and Naringin: 20.83 ± 1.24 ms). This flavonoid also influenced the activity of the cardiac pacemaker, increasing heart rate of 226.9 ± 1.12 bpm to 240.2 ± 3.94 bpm. No cardiac arrhythmia event was recorded during the perfusion of the heart with naringin. The PVE suffered increase of 6%. Naringin exerts positive inotropic and chronotropic effect on cardiac muscle by indirect activation of β-adrenergic receptors through endogenous catecholamines release and promotes significant electrocardiographic changes, reducing PRi, QTc and RRi, and slow down the speed of the QRS. KEYWORDS: Naringin, Heart, Contractility, Adrenergic receptor, Mouse. ix LISTA DE FIGURAS Figura 1. Morfologia básica da célula cardíaca. Topo: Músculo cardíaco visto à microscopia eletrônica, contemplando o padrão de estriações transversas observado neste tecido. Centro: Ilustração básica das células musculares cardíacas aderidas, umas às outras, por meio de discos intercalares. Inferior: Ilustração ampliada de uma parte do cardiomiócito e alguns de seus componentes estruturais. Intercalated disc: Disco intercalado; Fibre: Fibra; Nucleus: Núcleo; Sarcolemma: Sarcolema; Sarcoplasmic reticulum; T system: Sistema T; Sarcomere: Sarcômero; Fibril: Fibrila; Capillary: Capilar (Modificado de Sarantitis et al., 2012). ........................................03 Figura 2. Micrografia eletrônica mostando os componentes funcionais dos discos intercalares. Fa: Fascia adherens; Ds: Desmossomos; Gj: Gap junctions ou junções comunicantes. (Modificado de SHEIKH et al., 2009). ........................................................................................................................04 Figura 3. Estrutura de um sarcômero. Imagem obtida por microscopia eletrônica apresentando as bandas I e A, além das linhas/discos Z e M do sarcômero. Modificado de Luther (2009)................. 05 Figura 4. Potencial de ação (PA) de células cardíacas contráteis e correntes iônicas das principais fases responsáveis pelo PA do coração. Na parte inferior, principais correntes relacionadas à forma do PA. GNA: Condutância ao íon sódio; GK: Condutância ao íon potássio; GCa: Condutância ao íon cálcio (NERBONNE e KASS, 2005)............................................................. ....................................06 Figura 5. Potencial de ação de célula marcapasso. Fase 4: Despolarização diastólica lenta (DDL); Fase 0: Despolarização; Fase 3: Repolarização (PINNELL; TURNER; HOWELL, 2007)................07 Figura 6. Componentes do sistema de propagação elétrica do coração humano (NETTER, 2014)....09 Figura 7. Eletrocardiograma normal, mostrando as ondas de despolarização (P, QRS) e repolarização (T), e os principais intervalos (PR, QT e RR) e segmentos (ST) (HALL, 2010) ...............................09 Figura 8. Acoplamento excitação-contração no músculo estriado cardíaco. O Ca +2 promove a ativação dos miofilamentos gerando contração do coração e consequente ejeção de sangue ao longo dos vasos sanguíneos. Durante o potencial de ação (PA) cardíaco, A influxo de Ca +2 no cardiomiócito através dos canais de cálcio do tipo-L, contribui para a formação do platô do potencial de ação (PA). Dentre os mecanismos voltados ao esvaziamento intracelular de cálcio, a Ca +2ATPase citosólica se sobrepõe às demais em eficiência. T-tubule: túbulos-t; PLB: fosfolambam; RyR: canais receptores de ryanodina; Myofilaments: Miofilamentos; NCX: Trocador sódio/cálcio (BERS, 2002) ....................12 Figura 9. Ativação do receptor adrenérgico e alvos de fosforilação relevantes para o acoplamento excitação-contração cardíaco. AC, adenilato ciclase; ACh, acetilcolina; PKA, proteína cinase A; AKAP, proteína de ancoramento de cinase A; β-AR, receptor β -adrenérgico; M2-Rec, receptor M2muscarínico; PLB, fosfolambam; Reg, PKA subunidade regulatória; SR, retículo sarcoplasmático (BERS, 2002)......................................................................................................................................14 Figura 10. Estrutura básica de um flavonoide............................................................... .....................15 Figura 11. Estrutura química da naringina............................................................... ..........................16 x Figura 12. Esquema da montagem experimental usada para determinar a força de contração atrial. O átrio foi estimulado a 1 Hz, 100 V e 0,5 ms (STIMULATOR SD9 GRASS) e a força foi medida com um transdutor isométrico (GRASS FT03) acoplado a um amplificador (GRASS P11T), sendo os sinais digitalizados (DATAQ DI-710) e, em seguida, armazenados em computador.........................22 Figura 13. Esquema do set-up de Langendorff utilizado para avaliar os parâmetros eletrocardiográficos, a frequência cardíaca e a pressão intraventricular em coração isolado de rato. Eletrodos usados para captar os sinais eletrocardiográficos, balonete introduzido na cavidade do ventrículo esquerdo e sistema de perfusão aórtica com solução de Krebs são mostrados....................25 Figura 14. Efeito inotrópico da naringina em átrio esquerdo de rato. (A) Traçado experimental do efeito inotrópico bifásico produzido pela naringina, (B) Forças de contração atrial isoladas em situação controle, com 2,0 mM de naringina e as sobreposição de ambos..........................................28 Figura 15. Efeito inotrópico da naringina em átrio esquerdo de rato. (A) Curva concentração-resposta do efeito inotrópico positivo da naringina (CE 50 = 0,32 ± 0,01 mM) e (B) Relaxamento diastólico induzido pela naringina (2,0 mM) em átrio de rato. Ctr, controle; Wsh, washout (***p < 0,001, n = 6). .......................................................................................................................................................29 Figura 16. Efeito da naringina (2,0 mM) sobre a duração da sístole (A), duração da diástole (B) e duração do ciclo da contração atrial (C) em átrio esquerdo de rato (*p < 0,05, n = 5). Ctr, controle; Wsh, washout. ....................................................................................................................................30 Figura 17. Efeito da naringina (2,0 mM) sobre dT/dt (+) (A) e dT/dt(-) (B) em átrio esquerdo de rato (**p < 0,001 vs controle, #p < 0,05 vs naringina, n = 5). Ctr, controle; Wsh, washout. .......................31 Figura 18. Avaliação do efeito da naringina sobre os receptores β-adrenérgicos e canais para cálcio tipo-L. (A) Traçados representativos do efeito contrátil da naringina (NRG) em situação controle (a), na presença de 1,0 µM de propranolol (PROP) (b) e 1,0 µM nifedipina (NIF) (c). (B) Curvas concentração-resposta da naringina na ausência e presença do antagonista beta-adrenérgico propranolol e da nifedipina, um antagonista de canais para cálcio tipo L (n = 4)................................32 Figura 19. Avaliação do efeito da naringina sobre os canais receptores de rianodina. (A) Traçados representativos do efeito contrátil da naringina em situação controle (painel superior) e na presença de 1,0 µM de rianodina (painel inferior). (B) Curvas concentração-resposta da naringina na ausência e presença de rianodina (n = 4). ..........................................................................................................33 Figura 20. Efeito inotrópico da naringina em átrio esquerdo isolado de ratos controles e previamente reserpinizados (5 mg/Kg/ i.p., 24 h, n = 5) .........................................................................................34 Figura 21. Alterações eletrocardiográficas promovidas pela naringina (0,6 mM) em coração isolado de rato. (A) Intervalo PR (PRi), (B) intervalo QT (QTi), (C) duração do complexo QRS (QRS) e (D) frequência cardíaca em bpm (n=5, *p<0,05, ***p < 0,0001). ............................................................................................................................................................35 Figura 22. Efeito da naringina sobre a pressão do ventrículo esquerdo em coração isolado de rato (**p < 0,01, n = 5)...............................................................................................................................36 xi LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS ECG - Eletrocardiograma P, QRS, T, ST - Ondas do Eletrocardiograma QTi - Intervalo QT do eletrocardiograma QTc - Intervalo QT do eletrocardiograma corrigido QRS - Complexo QRS do eletrocardiograma PRi - Intervalo PR do eletrocardiograma RS - Retículo Sarcoplasmático PA - Potencial de ação RyR - Receptor da Rianodina CICR - Calcium-induced calcium release NCX - Trocador Na+/Ca2+ TT - Túbulos T [Ca+2]i – Concentração intracelular de cálcio SERCA2a - Ca+2-ATPase do retículo sarcoendoplasmático PLB - Fosfolambam SNA - Sistema nervoso autonômico SNS - Sistema nervoso simpático SNP - Sistema nervoso parassimpático AMPc - Adenosina monofosfato cíclico PKA - Proteína cinase A AC - Adenilato ciclase CE50 - Concentração que produz 50% do seu efeito máximo DDL - Despolarização diastólica lenta ATP - Adenosina trifosfato ADP - Adenosina difosfato PVE – Pressão ventricular esquerda ANPC – Antígeno nucelar de proliferação celular MAO - Monoamina oxidase LDL - Lipoproteína de baixa densidade TNF – α - Fator de necrose tumoral alfa xii Gs SOD - - Proteína G estumulatória Superóxido dismutase GSH – Px - Glutationa peroxidase CK - Creatina cinase SUMÁRIO RESUMO ................................................................................................................................. vii ABSTRACT ........................................................................................................................... viii LISTA DE FIGURAS .............................................................................................................. ix LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS ............................................................................ xi 1.INTRODUÇÃO ..................................................................................................................... 1 2.REVISÃO DE LITERATURA ............................................................................................. 3 2.1.Morfologia da célula cardíaca ........................................................................................... 3 2.2.Potenciais de ação cardíacos.............................................................................................. 5 2.3.Estrutura e fisiologia do coração ....................................................................................... 7 2.3.1 Mecanismo de acoplamento excitação-contração cardíaco..................................10 2.3.2 Influência do sistema nervoso autonômico sobre a função do coração................12 2.4.Flavonoides ...................................................................................................................... 14 2.5 Naringina............................................................. .................. ..........................................16 3.OBJETIVOS ........................................................................................................................ 18 3.1.Objetivo geral .................................................................................................................. 18 3.2.Objetivos específicos ....................................................................................................... 18 4.HIPÓTESE............................................................................................................................19 5.MATERIAL E MÉTODOS .............. ..................................................................................20 5.1.Aspectos éticos e animais ................................................................................................ 20 5.2.Drogas .............................................................................................................................. 20 5.3.Determinação da ação inotrópica da naringina em átrio esquerdo de rato ...................... 20 5.4. Avaliação da participação dos receptores β-adrenérgicos no efeito inotrópico da naringina em miocárdio atrial de rato........................................................................................................21 5.5.Avaliação da participação de canais para cálcio sarcolemais e do retículo sarcoplasmático (RyR) no efeito inotrópico da naringina em miocárdio atrial de rato........................................22 5.6.Avaliação da ação da naringina em átrios de animais com depleção de catecolaminas présinápticas .................................................................................................................................. 22 5.7.Avaliação dos efeitos da naringina sobre o eletrocardiograma em ratos ......................... 22 5.8. Avaliação do efeito da naringina sobre a frequência espontânea do coração isolado de rato............................................................................................................................................23 5.9.Avaliação do efeito da naringina sobre a frequência espontânea e a pressão intraventricular esquerda do coração isolado de ratos ..................................................................... 23 6.ANÁLISE ESTATÍSTICA.................................................................................................. 25 7.RESULTADOS .................................................................................................................... 26 8.DISCUSSÃO ........................................................................................................................ 35 9.CONCLUSÕES .................................................................................................................... 39 REFERENCIAL BIBLIOGRÁFICO ................................................................................... 40 ANEXOS.................................................................................................................................. 48 Certificado do comitê de ética animal ...................................................................................... 49 Termo de autorização para publicação eletrônica.....................................................................50 Autorização para publicação on line ........................................................................................51 1 1 INTRODUÇÃO Desde o período pré-histórico, diversas populações têm feito uso de plantas com finalidade medicinal, para tratamento de dores e enfermidades diversas (SANTIAGO et al., 2015). A Organização Mundial da Saúde (OMS) (2002) define plantas medicinais como espécies silvestres ou cultivadas utilizadas como recursos para aliviar, prevenir, curar ou modificar processos fisiológicos normais ou patológicos, ou quando estas são fontes de fármacos ou de seus precursores. No período inicial da década de 90, a OMS declarou que cerca de 60-80% da população de países considerados subdesenvolvidos utilizava plantas medicinais com foco na recuperação da saúde. Sabe-se que desde os anos 70, a OMS incentiva a implantação de políticas públicas voltadas ao uso coerente de tais plantas (JUNIOR, PINTO e MACIEL et al., 2005). O interesse pelo melhor entendimento dos mecanismos de ação dos compostos de origem natural observado nas últimas décadas, tem contribuído para o êxito das pesquisas voltadas ao uso farmacológico de princípios ativos provenientes do reino vegetal, colocando assim os produtos naturais em patamar privilegiado no contexto do desenvolvimento de novos fármacos (GOEL et al., 2008). Em condição de destaque, quando comparados a outros fitoterápicos estudados na atualidade, os flavonoides apresentam inúmeros efeitos biológicos e terapêuticos, devidamente comprovados através de ensaios experimentais e pesquisas com humanos (LAKHAMPAL e RAI, 2007). Neste contexto, a naringina, uma flavanona glicosilada, é extraída da casca de algumas frutas cítricas, podendo ainda ser encontrada na polpa dos frutos, nas folhas, flores e semente das plantas, possuindo sabor amargo (CASTILLO et al., 1992). Inúmeros efeitos benéficos têm sido atribuídos à naringina mediante estudos experimentais, dentre eles: atividades antioxidante (GUIMARÃES et al., 2010), anti-inflamatória (JAIN e PARMAR, 2011), antiaterogênica (CHOE et al., 2001), antihepatotóxica (PARI e AMUDHA, 2011) e hipoglicemiante (JUNG, 2004). A atividade biológica da naringina foi parcialmente caracterizada e pouco se sabe a respeito dos seus potenciais efeitos sobre as propriedades contráteis e elétricas em coração de rato. Um recente estudo mostrou que a naringina exerceu efeito inotrópico negativo sem alterar de forma significativa a frequência cardíaca em coração de rato, mas não elucidou o mecanismo 2 de ação (LÓPEZ-MEDINA et al., 2014). Entretanto, resultados obtidos no nosso laboratório mostraram que a naringina induz inotropismo positivo, com alteração significativa da frequência cardíaca. Esses resultados contraditórios motivaram-nos a estudar com maior profundidade os efeitos deste flavonoide sobre a função contrátil e elétrica do coração, assim como, elucidar o seu mecanismo de ação. 3 2 REVISÃO DE LITERATURA 2.1 Morfologia da célula cardíaca Segundo Vliegen, et al. (1991), em condições normais, cerca de 75% do volume tecidual miocárdico é ocupado por cardiomiócitos. Tais células apresentam citoesqueleto estruturalmente complexo e altamente organizado (SARANTITIS et al., 2012). Conforme Marian e Roberts (2001), além de possuírem formato cilíndrico, os cardiomiócitos têm diâmetro que varia de 10-15 µm e comprimento aproximado de 100 µm e ainda, usualmente, ramificamse e aderem às células cardíacas adjacentes através de estruturas conhecidas como discos intercalares (Fig. 1). Figura 1. Morfologia básica da célula cardíaca. Topo: Músculo cardíaco visto à microscopia eletrônica, contemplando o padrão de estriações transversas observado neste tecido. Centro: Ilustração básica das células musculares cardíacas aderidas, umas às outras, por meio de discos intercalares. Inferior: Ilustração ampliada de uma parte do cardiomiócito e alguns de seus componentes estruturais. Intercalated disc: Disco intercalado; Fibre: Fibra; Nucleus: Núcleo; Sarcolemma: Sarcolema; Sarcoplasmic reticulum; T system: Sistema T; Sarcomere: Sarcômero; Fibril: Fibrila; Capillary: Capilar (Modificado de Sarantitis et al., 2012). Os discos intercalares são estruturas com alto padrão organizacional, que estão envolvidas na transmissão do potencial de ação ao longo do músculo cardíaco, além de 4 contribuírem para a manutenção da integridade estrutural miocárdica. São constituídos pelos desmossomos, fascia adherens e junções comunicantes ou gap junctions. Os desmossomos e a fascia adherens conferem uma adesão reforçada entre os cardiomiocitos, enquanto as junções comunicantes contribuem com a rápida propagação do potencial impulso nervoso entre as células do coração (Fig. 2) (SHEIKH et al., 2009). Figura 2. Micrografia eletrônica mostando os componentes funcionais dos discos intercalares. Fa: Fascia adherens; Ds: Desmossomos; Gj: Gap junctions ou junções comunicantes. (Modificado de SHEIKH et al., 2009). Usando a microscopia eletrônica é possível evidenciar, tanto no tecido cardíaco, quanto no esquelético, um padrão regular de estriações transversas (MCNUT, 1975), além de miofibrilas contráteis semelhantes. Estas correspondem a proteínas com diâmetro aproximado de 1 a 2 μm dispostas de maneira longitudinal nas fibras musculares (BERS, 2001). A associação entre filamentos de miosina, também chamados de grossos e a sobreposição destes aos filamentos de actina formam a banda A, uma faixa escurecida observada à microscopia óptica. Já a banda I ou faixa clara, são constituídas pelos filamentos finos de actina e por proteínas que formam as linhas Z, estruturas onde os filamentos delgados se fixam (CONDEGARCIA, 1998; BERS, 2001). As estruturas contidas no intervalo entre duas linhas Z compõem o sarcômero, a unidade funcional do músculo, capaz de produzir força (Fig. 3) (GUATIMOSIM et al., 2002). 5 Figura 3. Estrutura de um sarcômero. Imagem obtida por microscopia eletrônica apresentando as bandas I e A, além das linhas/discos Z e M do sarcômero. Modificado de Luther (2009). 2.2 Potenciais de ação cardíacos Os cardiomiócitos ou células cardíacas podem exercer tanto atividade contrátil, como observado em células atriais e ventriculares, quanto atividade marcapasso, assim como verificado em células excitáveis dos nodos sinoatrial (NSA) e atrioventricular (NAV), além das células de Purkinje. Enquanto os miócitos contráteis possuem potencial de repouso estável e um potencial de ação prolongado em função da fase de platô, as células marcapasso apresentam potencial de repouso instável, condição que as permite, de forma espontânea, despolarizar-se (PINNELL, TURNER e HOWELL, 2007). Durante a fase 0 do potencial de ação (PA) das células cardíacas contráteis, ocorre redução da permeabilidade da membrana aos íons potássio e abertura de canais rápidos para sódio, cenário que favorece o influxo de íons Na+, responsáveis pela rápida condução do potencial de membrana de -90 mV a +10 mV (PINNELL, TURNER e HOWELL, 2007). A inativação dos canais rápidos para sódio, com consequente diminuição da permeabilidade da membrana ao Na+, associada à abertura de canais para potássio (Kto - transient outward channel) e cloreto (Cl-) marcam o início da fase 1, caracterizada pela repolarização parcial da célula cardíaca. Ainda nesta fase, os canais para potássio (K1) permanecem com baixa condutância ao K+, permitindo assim que o miócito se mantenha despolarizado. A fase 2, conhecida como platô, caracteriza-se pelo influxo de cálcio através da membrana celular por meio de canais para cálcio do tipo-L. Na fase 3, a condutância global ao K+ volta a aumentar, havendo efluxo de K+, condição que favorece a repolarização da célula, que alcança em seguida o potencial de repouso (fase 4) (Figura 1) (CONDE - GARCIA, 2002; KOEPPEN e STANTON, 2009). 6 As células marcapasso apresentam como característica principal um potencial de repouso instável, também chamada de despolarização diastólica lenta (DDL). A redução progressiva da permeabilidade da membrana celular aos íons potássio, abertura do canal para Na+ “funny” (IF), abertura dos canais para cálcio do tipo-L e tipo-T e a corrente do trocador Na/Ca+2 contribuem para a DDL (DIFRANCESCO, 2006; RUDY, 2008; CATTERALL, 2011). Ao atingir o limiar de excitabilidade, um número ainda maior de canais para cálcio se abrem, deflagrando a despolarização da célula, momento que corresponde à fase 0 do PA. Ao final da fase 0, os canais para cálcio se fecham e os canais para potássio se abrem, tendo início a fase de repolarização das células marcapasso (fase 3) (Fig. 4) (RODEN e GEORGE, 1997). Figura 4. Potencial de ação (PA) de células cardíacas contráteis e correntes iônicas das principais fases responsáveis pelo PA do coração. Na parte inferior, principais correntes relacionadas à forma do PA. GNA: Condutância ao íon sódio; GK: Condutância ao íon potássio; GCa: Condutância ao íon cálcio (NERBONNE e KASS, 2005). 7 Figura 5. Potencial de ação de célula marcapasso. Fase 4: Despolarização diastólica lenta (DDL); Fase 0: Despolarização; Fase 3: Repolarização (PINNELL, TURNER e HOWELL, 2007). 2.3 Estrutura e fisiologia do coração O coração é um órgão muscular oco que atua como bomba, sendo dividido em duas partes: O lado direito, responsável por propelir sangue para os pulmões, onde ocorrerá a hematose e, o lado esquerdo, que responde pela ejeção de sangue ao longo da via sistêmica, sendo que, ambos os lados possuem um átrio e um ventrículo (KRONENBERG et al., 2008). Em condições normais, a passagem de sangue pelo coração ocorre de forma unidirecional durante o ciclo cardíaco, que compreende a sístole ou contração e a diástole, o relaxamento do músculo cardíaco. Tal característica atribuída ao fluxo sanguíneo neste importante órgão é proporcionada por estruturas chamadas válvulas cardíacas. As válvulas atrioventriculares localizam-se entre os átrios e ventrículos e permanecem presas à base de um anel de tecido conectivo. Tais folhetos, cujas bordas mostram-se espessadas, fixam-se a prolongamentos da musculatura ventricular, isto é, aos músculos papilares, por meio de tendões colagenosos chamados de cordas tendíneas. Durante a contração ventricular, a pressão exercida pelo sangue contra as válvulas atrioventriculares as empurra, fazendo com que assumam a posição fechada (MISFELD e SIEVERS, 2007). As válvulas semilunares localizam-se entre os ventrículos e as artérias, atuando de modo a evitar o refluxo sanguíneo das artérias aorta e pulmonar para os ventrículos durante a fase diastólica do ciclo cardíaco (SACKS e YOGANATHAN, 2008). Surgindo logo acima da valva aórtica, as artérias coronárias direita e esquerda são os primeiros ramos da aorta e, em condições normais, asseguram adequado suprimento sanguíneo ao coração. A coronária esquerda divide-se em artérias descendente esquerda e circunflexa, ofertando sangue para as paredes anterior e lateral do ventrículo esquerdo e para dois terços do 8 septo interventricular, enquanto a artéria coronária direita irriga todo o ventrículo direito além da parede posterior do ventrículo esquerdo e o terço posterior do septo interventricular (RAMANATHAN e SKINNER, 2005). A veia posterior do ventrículo esquerdo drena a área cardíaca perfundida pela artéria circunflexa, enquanto a veia cardíaca média recebe sangue proveniente da superfície posterior do átrio e ventrículo direitos e, por fim, a pequena veia cardíaca, responsável por realizar a drenagem do sangue que irrigou a área anterior do átrio direito (MARTINI, TIMMONS e TALLITSCH, 2006). Além das células musculares cardíacas contráteis, o coração possui miócitos especializados em produzir, espontaneamente, potenciais de ação. Tais células autoexcitáveis podem ser encontradas em qualquer parte do coração (DOBRZYNSKI, BOYETT e ANDERSON, 2007), porém são vista com maior predominância no NSA (FRIEDMANN, 2011). Após serem gerados, os impulsos nervosos precisam se propagar pelo tecido cardíaco de modo a promover contração e ejeção de sangue eficientes. Em condições normais, o potencial de ação cardíaco é gerado no NSA, seguindo em direção ao NAV por meio das fibras internodais atriais, passando pelo feixe de His e seus ramos, chegando por fim, às fibras de Purkinje (Fig. 6) (CONDE- GARCIA, 2002). Os impulsos nervosos gerados e propagados no coração espalham-se pela superfície corpórea, podendo ser captados no eletrocardiograma (ECG), registro gráfico da atividade cardíaca, através de aparelho específico, o eletrocardiógrafo (GUIMARÃES, MOFFA e UCHIDA, 2003). A onda P do ECG (Fig. 7) resulta da propagação do impulso despolarizante do NSA pelos átrios, contraindo-os. Precedendo a contração dos ventrículos direito e esquerdo, o complexo QRS corresponde à despolarização ventricular (GACEK e PEDRYCZ, 2011). A onda T representa a repolarização ventricular, evento mais lento que a despolarização (HAARMARK et al., 2010). O intervalo PR (PRi) corresponde ao tempo gasto pelo potencial de ação desde o seu ponto de origem, ou seja, o NSA, até alcançar os ventrículos. O intervalo QT (QTi) é medido do início do complexo QRS até o término da onda T, espaço de tempo representado pela despolarização e repolarização total dos ventrículos (FRIEDMANN, 2011). Já o segmento ST possui estreita relação com o processo de repolarização dos miócitos ventriculares (FELDMAN e GOLDWASSER, 2004). 9 Figura 6. Componentes do sistema de propagação elétrica do coração humano (NETTER, 2014). Figura 7. Eletrocardiograma normal, mostrando as ondas de despolarização (P, QRS) e repolarização (T), e os principais intervalos (PR, QT e RR) e segmentos (ST) (HALL, 2010). 10 2.3.1 Mecanismo de acoplamento excitação-contração cardíaco Segundo Bers (2002), o acoplamento excitação-contração cardíaco corresponde ao processo em que, mediante estimulação elétrica, ou seja, despolarização, os cardiomiócitos contraem. O fenômeno de despolarização de células excitáveis depende da geração de potenciais elétricos, evento somente alcançado através da ativação de canais iônicos e consequentemente, transporte de íons através da membrana celular, tais como sódio, potássio e cálcio (CONDE-GARCIA, 2002). Dois tipos de canais para Ca+2 são encontrados no coração, sendo um deles o canal de Ca+2 tipo-L e o outro, o tipo-T. O canal para Ca+2 tipo-L (large conductance) foi assim chamado por apresentar abertura de longa duração associada a uma alta condutância (25 pS) e ainda, ativa-se em voltagens mais positivas. De maneira contrária, o canal para Ca+2 tipo-T (Tiny conductance) possui baixa condutância (8 pS), abertura transitória e ativação em voltagens mais negativas (NOWYCKY et al., 1985). Ao se propagar pela membrana celular dos miócitos, o impulso despolarizante adentra aos túbulos T (TT), induzindo a abertura de canais para cálcio dependentes de voltagem, os canais para Ca+2 tipo-L (BRETTE et al., 2006), ou canais de dihidropiridinas, expressos principalmente nos túbulos transversos da membrana plasmática (SCRIVEN et al., 2000). O cálcio extracelular que adentra à célula cardíaca, evento que coincide com a fase de platô do PA, induz a abertura de canais de liberação de cálcio receptores de rianodina (RyR) presentes na membrana do retículo sarcoplasmático (RS), levando à liberação do cálcio armazenado nesta organela no citosol (BERS, 2002), processo chamado de liberação de cálcio induzida por cálcio (CICR), “calcium-induced calcium release” (FABIATO, 1983; WILLIAMS, et al., 1992). Deve-se frisar que, a maior parte do cálcio que adentra a célula cardíaca é resultante da ICa-L (BERS, 2001). O espaço existente entre a membrana plasmática e a membrana do RS (RS) é conhecido como subespaço (CHENG e LEDERER, 2008). Foram identificados três tipos de genes (ryr1, ryr2 e ryr3) que expressam diferentes isoformas de RyR, sendo que a isoforma RyR2 localizase principalmente no músculo cardíaco. Ao arranjo funcional composto pelos DHPR, os RyR2 e subespaço que os intercala, dá-se o nome de unidade liberadora de cálcio (ULC), um complexo estrutural e funcional do acoplamento excitação-contração (AEC) (FRANZINIARMSTRONG et al., 1999; CHENG e LEDERER, 2008). 11 Antes que o processo de contração tenha início, a cabeça da miosina liga-se à molécula de ATP, que ao sofrer clivagem forma ADP e libera íon fosfato. Em seguida, quando os íons cálcio provenientes do RS e do meio extracelular ligam-se ao complexo troponinatropomiosina, os sítios ativos do filamento de actina ficam expostos, condição que permite a ligação destes com as cabeças da miosina. Tal fato gera mudança conformacional da cabeça da miosina, que inclina-se sobre o braço da ponte cruzada, puxando o filamento de actina e produz movimento de força, que se traduz em contração muscular (BERS, 1991; DE TOMBE, 2003). O fenômeno de inativação da ICa está relacionado ao aumento de Ca+2 intracelular, tanto pelo influxo deste cátion por canais de cálcio tipo L (ICa-L) quanto por sua liberação no citosol através do RyR presentes no RS, sendo provável que haja uma sinalização direta sobre canal. Desse modo, através deste mecanismo de feedback dependente de Ca +2 o canal inativa-se e consequentemente, há limitação do influxo deste íon na célula (BERS, 2001). A calmodulina (CaM) participa da sinalização de inúmeros eventos intracelulares. Este mensageiro possui 04 domínios de ligação (I, II, III e IV), ligando-se a 4 moléculas de cálcio através dos dois primeiros (I e II), os quais possuem maior afinidade a este íon em relação aos demais. Quando a célula encontra-se em repouso, os sítios de ligação da CaM para o cálcio encontram-se desocupados, entretanto o aumento da concentração intracelular de cálcio altera a sua conformação e liga-se ao cálcio (Ca+2- CaM), interação esta capaz de modular a atividade de proteínas no transporte de Ca+2, canais iônicos, contração celular, metabolismo celular, expressão gênica de proteínas quinases e a proliferação celular (BERS, 2002). A redução da concentração intracelular de cálcio [Ca+2]i dissocia o cálcio da molécula de troponina, culminando no relaxamento muscular. A atividade da Ca +2ATPase do RS (SERCA2a) (BERS, EISNER e VALDIVIA, 2003), do trocador Na +2/Ca+2, da Ca+2 ATPase sarcolemal (HILGEMANN, 2004), e o transporte uniporte mitocondrial, em conjunto, são responsáveis pelo esvaziamento do cálcio citoplasmático (BERS, 2002; BASSANI e BERS, 1995) (Fig. 8). A SERCA2a está presente na membrana do RS, sendo responsável pela remoção da maior fração do Ca+2 citoplasmático para o lúmen do retículo. Sua ativação é regulada pelo fosfolambam (PLB) que, em estado desfosforilado, inibe a atividade da SERCA2a. Sendo assim, a fosforilação do PLB acelera a recaptação de Ca +2 liberado previamente pelo RS (ORCHARD e BRETTE, 2008). Deve-se ressaltar que, em cardiomiócito de rato, tal fenômeno é responsável pela recaptação de 92% do cálcio na fase de relaxamento (BASSANI et al., 1994). 12 Segundo Bers (2002), a diminuição do cálcio intracelular é também auxiliada pelo trocador Na+2/Ca+2 (7%) pela Ca+2-ATPase sarcolemal (0,5%) e pelo uniporte mitocondrial de Ca+2 (0,5%). Figura 8. Acoplamento excitação-contração no músculo estriado cardíaco. O Ca+2 promove a ativação dos miofilamentos gerando contração do coração e consequente ejeção de sangue ao longo dos vasos sanguíneos. Durante o potencial de ação (PA) cardíaco, A influxo de Ca +2 no cardiomiócito através dos canais de cálcio do tipo-L, contribui para a formação do platô do potencial de ação (PA). Dentre os mecanismos voltados ao esvaziamento intracelular de cálcio, a Ca+2ATPase citosólica se sobrepõe às demais em eficiência. T-tubule: túbulos-t; PLB: fosfolambam; RyR: canais receptores de ryanodina; Myofilaments: Miofilamentos; NCX: Trocador sódio/cálcio (BERS, 2002) . 2.3.2 Influência do sistema nervoso autonômico sobre a função do coração Também conhecido como sistema nervoso visceral, o sistema nervoso autônomo (SNA) atua na ausência de controle voluntário e desempenha papel relevante na manutenção da homeostasia. Muitos parâmetros, assim como atividades desempenhadas pelos nossos sistemas orgânicos são monitorados e modulados via sistema autônomo, a exemplo da frequência cardíaca, pressão arterial, peristaltismo intestinal, temperatura corpórea, dentre outros (McCORRY, 2007). O SNA é subdividido, sob o ponto de vista anatômico e funcional, em sistemas nervosos simpático (SNS), parassimpático (SNP) e entérico (FURLAN, 2000). Enquanto a atividade do 13 SNS predomina em situações de “luta ou fuga” ou atividade física, o SNP atua com maior intensidade em situação oposta, de repouso (McCORRY, 2007). Existem 2 classes de receptores adrenérgicos para norepinefrina e epinefrina: alfa (α) e beta (β). Além disso, há pelo menos 2 subtipos de receptores em cada classe: α1, α2, β1, β2 e β3, todos eles acoplado à proteína G e, por conseguinte, vinculados a segundos mensageiros intracelulares (BYLUND, 1994). Dos receptores adrenérgicos conhecidos, os α são os mais frequentes, sendo que, ao serem ativados no músculo liso induzem contração (α1) ou contribuem para o relaxamento da musculatura (α2). Ambos os receptores α1 e α2 possuem igual afinidade à noradrenalina, liberada diretamente de neurônios simpáticos, e à adrenalina, produzida e liberada pela região medular da suprarrenais (MARKS, 2003; MADAMANCHI, 2007). O coração possui maior densidade de receptores adrenérgicos β1 do que β2, sendo que, neste órgão, a ativação de ambos produz aumento da atividade cardíaca, pela elevação dos níveis intracelulares de adenosina monofosfato cíclico (AMPc). Entretanto, quando os receptores β2 presentes nas células musculares lisas dos vasos ou vias aéreas são ativados por agonistas, o efeito tende a ser inibitório, respectivamente, vasodilatação e broncodilatação (MADAMANCHI, 2007; MCCORRY, 2007). Tendo como exemplo o tecido cardíaco, a estimulação dos receptores β-adrenérgicos promove ativação da proteína Gs, que ativa a adenilato ciclase (AC) e esta, converte ATP em AMPc (Fig. 9). Este por sua vez, ativa a PKA (proteína cinase A), que fosforila o fosfolambam, os canais para cálcio tipo-L, RyR, além da troponina I, componentes celulares envolvidos no mecanismo de excitação-contração, como já mencionado anteriormente (BERS, 2002). O efeito lusitrópico (relaxamento) mediado pela PKA resulta da fosforilação da fosfolambam e troponina I, que acelera a reabsorção do cálcio pelo RS e dissociação do cálcio dos miofilamentos, respectivamente. No entanto, a fosforilação da fosfolambam é o mecanismo dominante para o efeito lusitrópico e aceleração do declínio do [Ca+2]i (KENTISH et al., 2001). O efeito inotrópico da ativação da PKA é mediado pela combinação do aumento da I Ca e maior disponibilidade do Ca+2 do RS. Esse sinergismo aumenta a amplitude do transiente de Ca+2 e compensa a redução da sensibilidade dos miofilamentos ao Ca+2. O efeito depressor da PKA nos miofilamentos parece ser devido a fosforilação da troponina I (KENTISH et al., 2001; SONG et al., 2001; VIATCHENKO-KARPINSKI e GYÖRKE, 2001). 14 Figura 9. Ativação do receptor adrenérgico e alvos de fosforilação relevantes para o acoplamento excitação-contração cardíaco. AC, adenilato ciclase; ACh, acetilcolina; PKA, proteína cinase A; AKAP, proteína de ancoramento de cinase A; β-AR, receptor β -adrenérgico; M2-Rec, receptor M2-muscarínico; PLB, fosfolambam; Reg, PKA subunidade regulatória; SR, retículo sarcoplasmático (BERS, 2002). 2.4 Flavonoides O uso medicinal de produtos naturais, isto é, compostos derivados de plantas, animais ou microrganismos, acompanha a evolução dos nossos primeiros ancestrais, que utilizavam, por exemplo, determinadas ervas para alívio da dor e folhas na cobertura de ferimentos, a fim de favorecer a cicatrização das lesões (JI et al., 2009). Ao longo do desenvolvimento das civilizações oriental e ocidental, inúmeros exemplos do uso de produtos naturais podem ser dados, principalmente pelas civilizações egípcia, grecoromana e chinesa, seja no campo da medicina, do controle de pragas e em mecanismos de defesa (VIEGAS et al., 2006). Com o passar dos anos, a importância dada aos produtos naturais tem crescido e estes, muitas vezes, são vistos como a única esperança para tratar condições patológicas e lesões (JI et al., 2009), demonstrando a elevada importância que possuem para a saúde mundial. Aproximadamente, 25 a 30% do total das drogas caracterizadas como terapêuticas são derivadas de produtos naturais (VEIGA-JUNIOR e MELLO, 2008), o que os torna na atualidade, importante fonte de ingredientes medicinais ativos (HARVEY, 2008). 15 Em 1930, uma nova substância foi isolada de laranjas. A princípio, acreditou-se que tal sustância faria parte de uma nova classe de vitaminas, recebendo por isso o nome de vitamina P. Posteriormente, descobriu-se que aquela substância correspondia a um flavonoide e desde então, até os dias atuais, mais de 4000 tipos de flavonoides já foram descobertos (MIDDLETON, 1998). Os flavonoides são compostos polifenólicos que constituem um grande grupo de metabólitos secundários de plantas (BOHIN et al., 2012), sendo encontrados em abundância em frutas, grãos, cereais e verduras, além de bebidas, a exemplo do vinho, café e chá (PÉREZJIMÉNEZ et al, 2010). Tais polifenóis possuem um esqueleto de difenil propano (C6C3C6) com dois anéis benzênicos (A e B), unidos a um anel pirano heterocíclico (C) (Fig. 10). As principais classes dos flavonoides são: flavonóis, flavonas, catequinas, antocianinas, isoflavonas, diidroflavonóis, chalconas e as flavanonas (COOK e SAMMAN, 1996). Figura 10. Estrutura básica de um flavonoide O padrão de hidroxilação, glicosilação, esterificação e, no caso das proantocianidinas, o grau de polimerização, são características estruturais que conferem elevada variabilidade química aos polifenóis (PÉREZ-JIMÉNEZ et al., 2010). Dentre as inúmeras propriedades bioativas associadas aos flavonoides, tem-se a neuroproteção (GOPINATH e SUDHANDIRAN, 2012), ação anti-inflamatória (GARCÍALAFUENTE et al., 2009) e anti-câncer (KURZAWA-ZEGOTA et al., 2012), além de efeitos protetores contra doença de Alzheimer (BASTIANETTO et al., 2006), dentre outras. 16 2.5 Naringina Primeiramente isolado em 1866 por De Vry, na cidade de Java, a partir das flores de videira (RANGASWAMI et al., 1939), a naringina (4,5,7-trihidroxil flavanona-7rhamnoglicosídeo) é um glicosídeo flavonoide de formula molecular C27H32O14 (Fig. 11) e peso molecular de 580,4 g/mol. É comumente encontrada em uvas e frutas cítricas (ALAM et al., 2014). Inúmeras são as espécies de frutas cítricas que contêm a naringina, a exemplo da laranja (Citrus sinensis) (OOGHE et al., 1994), toranja ou grapefruit (Citrus Paradisi) (KAWAII et al.,1999), e a tangerina (Citrus reticulata) (BILBAO et al., 2007) que possui uma das maiores concentrações deste composto. Figura 11. Estrutura química da naringina Trangavel e Vaiyapuri (2013) avaliaram a atividade quimioprotetora da naringina em ratos Wistar submetidos à carcinogênese hepática induzida por dietil-nitrosamina (DEN). Neste estudo, a naringina exerceu atividade antiproliferativa sobre as células cancerígenas do fígado, através da menor expressão de antígeno nuclear de proliferação celular (ANPC), além de induzir a apoptose das células cancerígenas, condição detectada através do estudo de alterações ultraestruturais ocorridas nestas células. Outro estudo avaliou a atividade protetora da naringina contra a injúria pulmonar induzida por paraquat e a fibrose pulmonar em ratos. Os resultados demostraram que os grupos de animais que receberam 60 e 120 mg/Kg de naringina apresentaram redução significativa na produção de fator de necrose tumoral alfa (TNF-α), fator de crescimento tumoral β1 (TGF- β1), metaloproteinases de matriz-9 (MMP-9) e dos inibidores de tecido de metaloproteinases-1 (TIMP- 1). Também houve menor deposição de fibrose pulmonar, e ainda, aumento da superóxido dismutase (SOD), glutationa peroxidase (GSH – Px) e heme oxigenasse – 1 (HO- 17 1). Logo, a naringina exerceu proteção contra injúria pulmonar aguda induzida por paraquat e minimizou a fibrose pulmonar nos animais (CHEN et al., 2013). Em modelo de indução de tosse variante da asma por ovoalbumina em cobaias, demostrou-se que a naringina foi capaz de reduzir a hiperresponsividade das vias aéreas e a tosse nos animais, além de inibir o aumento de leucócitos e interleucinas (IL-4, IL-5 e IL-13) em fluido obtido de lavado bronco-alveolar, em relação ao grupo controle (JIAO et al., 2015). Em outro estudo, agora avaliando a atividade do flavonoide naringina em modelo de neurotoxicidade induzida por deltrametrina em ratos, encontrou-se que os animais que receberam naringina após tratamento com deltrametrina apresentaram redução significativa dos níveis de TBARS, LDL, CK. Além disso, a naringina foi capaz de prevenir anormalidades nos níveis de antioxidantes enzimáticos e não-enzimáticos no tecido cerebral, em relação aos animais que somente receberam o agente neurotóxico, demonstrando assim que a naringina possui efeito neuroprotetor (MANI et al., 2014). Rajadurai e Prince (2007) avaliaram a atividade cardioprotetora da naringina em ratos submetidos a infarto miocárdico induzido por duas injeções de isoproterenol administradas por via subcutânea (85 mg/kg em intervalo de 24 hs entre elas). Os animais que somente receberam isoproterenol apresentaram aumento dos níveis de troponina T, de enzimas lisossomais, da intensidade das bandas de isoenzimas da desidrogenase láctica (LDH 1 e LDH 2) e da atividade dos marcadores cardíacos enzimáticos, além de alterações eletrocardiográficas. Já aqueles que foram pré-tratados com naringina e, posteriormente, infartados com isoproterenol tiveram alterações positivas, isto é, um padrão contrário dos parâmetros citados anteriormente. Apesar de a naringina ter apresentado efeito cardioprotetor em modelo de infarto agudo do miocárdio, pouco se sabe sobre o mecanismo de ação da naringina no sistema cardiovascular. A potente atividade antioxidante dos flavonoides foi e ainda é foco de muitas pesquisas. Entretanto, muitos estudos têm mostrado que a resposta biológica desses flavonoides depende de sua ação moduladora de canais iônicos, receptores de membrana e da via de sinalização intracelular ativada (ALVAREZ-COLLAZO et al., 2014). Nesse ponto de vista, a literatura é muito escassa no que se refere ao mecanismo de ação da naringina no coração. Sendo assim, com este trabalho pretendeu-se analisar os efeitos contráteis e eletrofisiológicos da naringina sobre o coração de rato. A descoberta do mecanismo de ação da naringina no sistema cardíaco, dentre outros possíveis achados de valor, fornecerão subsídios para que, vislumbre-se a sua aplicabilidade no futuro, por exemplo, frente a condições patológicas que afetam a função cardíaca. 18 3 OBJETIVOS 3.1 Geral Caracterizar os efeitos contráteis e elétricos da naringina sobre o músculo cardíaco de rato. 3.2 Específicos Definir a atividade inotrópica da naringina em átrio esquerdo de rato; Avaliar a participação dos receptores beta-adrenérgicos no efeito inotrópico da naringina em miocárdio atrial de rato; Avaliar a ação da naringina sobre canais para cálcio em átrio esquerdo; Investigar a ação da naringina sobre receptores de rianodina em átrio esquerdo; Determinar a ação da naringina em átrios de animais com depleção de catecolaminas pré-sinápticas; Avaliar os efeitos da naringina sobre o eletrocardiograma do coração isolado de rato. 19 4 HIPÓTESE A naringina produz aumento de contratilidade e altera os intervalos eletrocardiográficos em coração de ratos. 20 5 MATERIAIS E MÉTODOS 5.1 Aspectos éticos e animais O protocolo de experimentação animal proposto nesta pesquisa foi submetido ao Comitê de Ética em Pesquisa com Animais (CEPA) da Universidade Federal de Sergipe/UFS, tendo sido aprovado sob protocolo nº 79/15 e baseou-se na Diretriz Brasileira para o Cuidado e a Utilização de Animais para fins Científicos e Didáticos – DBCA, Diretrizes da Prática da Eutanásia do Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal (CONCEA), na Normativa 15/2013 e ainda, respeitou a Lei Arouca (Lei nº 11.794 de 2008). Para avaliar os efeitos da naringina sobre o coração foram utilizados ratos da linhagem Wistar (250-300 g), provenientes do Biotério Setorial do Departamento de Fisiologia da Universidade Federal de Sergipe. Os animais foram alojados no interior de caixas de polipropileno, em sala climatizada com controle de temperatura e umidade (± 20,3º-23,1°C e 40-50%, respectivamente), sob ciclo luz/escuro controlado (12/12 h) e com livre acesso à água e dieta padrão. As gaiolas onde os animais permaneceram acomodados continham dimensões de 34 x 38,5 x 17,8 cm, sendo a área destinada a cada animal correspondente a 261,8 cm²/animal, conforme Resolução Normativa 15/2013, sendo que, cada gaiola acomodou no máximo 5 ratos. 5.2 Drogas O cloreto de sódio (NaCl), cloreto de potássio (KCl), cloreto de cálcio dihidratado (CaCl2.2H2O), cloreto de magnésio hexa-hidratado (MgCl2.6H2O), fosfato monossódico hidratado (NaH2PO4.H2O), bicarbonato de sódio (NaHCO3) e glicose (C6H12O6) foram obtidos da VETEC. A naringina (HPLC - 95%), reserpina, nifedipina, cloridrato de propranolol e rianodina foram adquiridos da Sigma-Aldrich (USA). O dimetil-sulfóxido (DMSO) foi adquirido da Neon (São Paulo, Brasil) e a heparina obtida da Roche (São Paulo, Brasil) 5.3 Determinação da ação inotrópica da naringina em átrio esquerdo de rato A força de contração foi determinada em átrio esquerdo isolado de rato. Os animais foram sacrificados por meio de decapitação em guilhotina. O átrio foi montado em cuba para órgão isolado (10 mL, 29 ± 0,1 oC) onde permaneceu em solução de Krebs (em mM: NaCl 120, KCl 5,4, MgCl2 1,2, NaHCO3 27, CaCl2 1,25, Glicose 11, NaH2PO4 2,0). Esta solução foi 21 aerada por uma mistura carbogênica (95 % de O2 e 5 % de CO2). O átrio esquerdo foi estirado até atingir-se uma tensão de repouso de 10 mN (1,02 gf) (MENEZES-FILHO et al. 2014) e, em seguida, submetido a uma estimulação de campo de 1 Hz (DIGITIMER D4030, 3072). Concentrações crescentes de naringina (0,003 a 6,0 mM) foram adicionadas ao banho a fim de determinar os seus efeitos sobre a contratilidade atrial. A força foi registrada isometricamente (transdutores: FTA10 HP/SUNBORN e HUGO-SACHS F30) e os sinais do transdutor foram enviados a um amplificador (HP8805B) e armazenados em computador (DATAQ DI400, DI 205, WINDAQ PRO) para o processamento “off-line” (Fig. 12). Em situação controle e em cada concentração testada, foram determinados os seguintes parâmetros: 1) força de contração, 2) relaxamento diastólico, 3) duração da sístole, 4) duração da diástole, 5) duração do ciclo da contração, 6) dT/dt (+) e 7) dT/dt (-). 29° Figura 12. Esquema da montagem experimental usada para determinar a força de contração atrial. O átrio foi estimulado a 1 Hz, 100 V e 0,5 ms (STIMULATOR SD9 GRASS) e a força foi medida com um transdutor isométrico (GRASS FT03) acoplado a um amplificador (GRASS P11T), sendo os sinais digitalizados (DATAQ DI-710) e, em seguida, armazenados em computador. 5.4 Avaliação da participação dos receptores β-adrenérgicos no efeito inotrópico da naringina em miocárdio atrial de rato Para avaliar a participação de receptores beta-adrenérgica no efeito promovido pela naringina, a resposta inotrópica deste flavonoide foi testada na presença de propranolol (1,0 22 µM), um conhecido antagonista beta-adrenérgico não-seletivo (REHSIA; DHALLA, 2010). Para isso, curvas concentração-efeito da naringina foram obtidas após 20 minutos de préincubação dos átrios com o antagonista. 5.5 Avaliação da participação de canais para cálcio sarcolemais e do retículo sarcoplasmático (RyR) no efeito inotrópico da naringina em miocárdio atrial de rato Para avaliar o efeito da naringina sobre canais para cálcio sarcolemais e do retículo sarcoplasmático, a resposta inotrópica deste flavonoide foi testada na presença de nifedipina (1,0 µM) bloqueador de canais para cálcio tipo-L (YONEMOCHI et al, 1990) e na presença de rianodina (1,0 µM), um conhecido bloqueador dos receptores de rianodina (RyR) (LOPEZMEDINA et al., 2014). Para isso, curvas concentração-efeito da naringina foram obtidas após 20 minutos de pré-incubação dos átrios com os respectivos bloqueadores. 5.6 Avaliação da ação da naringina em átrios de animais com depleção de catecolaminas pré-sinápticas Com o intuito de avaliar o possível envolvimento do mecanismo de liberação de catecolaminas pré-sinápticas na resposta inotrópica produzida pela naringina, realizamos experimentos com átrios de animais pré-tratados com reserpina (5 mg/Kg, i.p.) (PASSOS et al., 2013). Curvas concentração-efeito da naringina foram obtidas utilizando-se os átrios dos animais 24 h após a administração intraperitoneal do alcaloide. 5.7 Avaliação dos efeitos da naringina sobre o eletrocardiograma em ratos Os ratos foram previamente heparinizados (1000 U.I./kg, via subcutânea) e em seguida, eutanasiados (decapitação por guilhotina, 30 minutos após a administração de heparina). Em seguida, foram realizadas toracotomia e remoção do coração, que foi montado em sistema de perfusão aórtica do tipo Langendorff de fluxo constante (10 mL/min, Bomba peristáltica, Milan). A aorta foi canulada e o coração perfundido com solução de Krebs aerado por mistura carbogênica (95 % de O2 e 5 % de CO2) e aquecido a 34 ± 0,1 °C (Bomba HAAKE C/F3). A solução de Krebs foi previamente filtrada em millipore (0,45 µm) a fim de prevenir a microembolia coronariana (HARRISON; RAYMOND, 1951). O coração foi mergulhado em 23 solução de Krebs contida em Becker (50 mL). Neste recipiente, os potenciais elétricos foram captados por meio de três eletrodos (Ag/AgCl/NaCl 1M) imersos no Krebs e os sinais foram amplificados (HP ECG AMPLIFIER 8811B). O sinal eletrocardiográfico foi monitorado na tela de um cardioscópio (EMAI RX10), em seguida enviado a um conversor analógico/digital (DATAQ DI-205, DI-400, WINDAQ PRO), sendo armazenado em microcomputador para o processamento “off line” (Fig. 13). 5.8 Avaliação do efeito da naringina sobre a frequência espontânea do coração isolado de rato Para avaliar o efeito da naringina sobre a frequência cardíaca espontânea em coração de rato, os corações foram montados em sistema de Langendorff e mantidos com batimento espontâneo. Utilizando o software Labchart 8 foi possível determinar os intervalos RR e convertê-los em frequência cardíaca. Essa análise foi realizada em situação controle (Krebs normal), durante o teste com a naringina e, por fim, durante o “washout”. 5.9 Avaliação do efeito da naringina sobre a frequência espontânea e a pressão intraventricular esquerda do coração isolado de ratos A pressão no interior do ventrículo esquerdo foi determinada, em coração estimulado eletricamente, por meio de um balonete insuflado com água até uma pressão de 15 cmHg. O balonete foi cuidadosamente introduzido no ventrículo esquerdo do coração isolado após a remoção do átrio esquerdo (Fig. 13). Esta tubulação estava acoplada a um transdutor de pressão (HP 1290A), cujos sinais foram amplificados (HP 8805B), digitalizados (DATAQ DI-205, DI400, WINDAQ PRO) e gravados em computador. Todo o sistema hidráulico usado para determinar a pressão intraventricular estava preenchido com água destilada e foi calibrado com a ajuda de um manômetro de mercúrio. 24 Figura 13. Esquema do set-up de Langendorff utilizado para avaliar os parâmetros eletrocardiográficos, a frequência cardíaca e a pressão intraventricular em coração isolado de rato. Eletrodos usados para captar os sinais eletrocardiográficos, balonete introduzido na cavidade do ventrículo esquerdo e sistema de perfusão aórtica com solução de Krebs são mostrados. 25 6 ANÁLISE ESTATÍSTICA Os dados foram expressos pela média ± erro padrão da média (EPM). Os resultados foram avaliados pela análise de variância de uma via (ANOVA) com pós-teste de Tukey ou pelo teste t de Student. Os valores foram considerados significativos quando o valor de p ≤ 0,05. As análises estatísticas foram realizadas com o auxílio do programa GraphPad Prism© versão 5.0 (GraphPad Software Inc., San Diego CA, USA). 26 7 RESULTADOS O efeito inotrópico da naringina foi avaliado em átrio esquerdo de rato submetido à estimulação elétrica. A Fig. 14A mostra traçados representativos da curva concentraçãoresposta da naringina a partir dos quais pode-se observar que este flavonoide apresentou um efeito contrátil bifásico. Em concentrações que variaram de 0,003 a 2,0 mM, a naringina aumentou a contratilidade atrial, de forma dependente de concentração, apresentando um efeito máximo com 2 mM (150%). Em concentrações acima de 3 mM, observou-se uma resposta inotrópica negativa induzida pela naringina. A Fig. 14B mostra as curvas da contração atrial isométrica em (a) situação controle (0,22 gf), (b) na presença de 2 mM de naringina (0,57 gf) e a sobreposição de ambas (c). Nota-se que a naringina promoveu aumento significativo da força de contração atrial (159%). A partir da curva concentração-resposta da naringina foi possível obter o valor da CE 50 de 0,32 ± 0,01 mM (n = 5, Fig. 15A). Além disso, foi verificado que este flavonoide diminuiu a tensão diastólica, ou seja, promoveu melhora no relaxamento diastólico (Fig. 15B). Na concentração máxima, a naringina exerceu um relaxamento diastólico de 55,2 ± 12,95 gf, havendo uma recuperação parcial após o washout (34,8 ± 7,42 gf, n = 5). Ao analisar o curso temporal das fases de contração e relaxamento atrial observou-se que a naringina (2,0 mM) diminuiu a duração da sístole de 0,11 ± 0,006 s para 0,09 ± 0,002 s (p < 0,05) (Fig. 16A). Contudo, a duração da diástole foi aumentada de 0,84 ± 0,02 s para 0,88 ± 0,002 s (p < 0,05) (Fig. 16B). Por outro lado, não houve alteração significativa na duração total do ciclo da contração atrial (Fig. 16C). Outra variável analisada foi a dT/dt, que representa a variação da tensão exercida pelo átrio em função do tempo, consistindo em índice utilizado para avaliar a velocidade das fases de contração dT/dt(+) e do relaxamento cardíaco dT/dt(-) (IMANISHI, NAKATANI et al., 1994). Na concentração de 2,0 mM de naringina, a dT/dt(+) foi aumentada de 9,16 ± 1,76 gf/s para 19,74 ± 2,65 gf/s (n = 5, p < 0,001) (Fig. 17A) e a dT/dt(-) de -6,21 ± 1,15 gf/s para -13,52 ± 1,78 gf/s (Fig.17B). 27 A 2.0 1.0 3.0 5.0 6.0 Washout 0.3 0,25 gf 0.003 0.01 0.03 0.1 Naringina (mM) 5 min B 0,25 gf 0,2 s Controle (a) Naringina (2,0 mM) (b) Sobreposição (c) Figura 14. Efeito inotrópico da naringina em átrio esquerdo de rato. (A) Traçado experimental do efeito inotrópico bifásico produzido pela naringina, (B) Forças de contração atrial isoladas em situação controle, com 2,0 mM de naringina e as sobreposição de ambos. 28 B Relaxamento diastólico (%) A 0 -20 -40 * -60 *** -80 Ctr Naringina 2,0 mM Wsh Figura 15. Efeito inotrópico da naringina em átrio esquerdo de rato. (A) Curva concentraçãoresposta do efeito inotrópico positivo da naringina (CE50 = 0,32 ± 0,01 mM) e (B) Relaxamento diastólico induzido pela naringina (2,0 mM) em átrio de rato. Ctr, controle; Wsh, washout (***p < 0,001, n = 6). 29 A B Duração da diástole (s) * 0.10 0.05 0.00 1.0 * 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 Ctr Naringina 2,0 mM Wsh Ctr Naringina 2,0 mM Wsh C 1.00 Duração do ciclo (s) Duração da sístole (s) 0.15 0.75 0.50 0.25 0.00 Ctr Naringina 2,0 mM Wsh Figura 16. Efeito da naringina (2,0 mM) sobre a duração da sístole (A), duração da diástole (B) e duração do ciclo da contração atrial (C) em átrio esquerdo de rato (*p < 0,05, n = 5). Ctr, controle; Wsh, washout. 30 A 25 ** dT/dt (+) 20 15 # 10 5 0 Ctr B Naringina 2,0 mM Wsh 0 dT/dt (-) -5 # -10 -15 ** -20 Ctr Naringina 2,0 mM Wsh Figura 17. Efeito da naringina (2,0 mM) sobre dT/dt (+) (A) e dT/dt(-) (B) em átrio esquerdo de rato (**p < 0,001 vs controle, #p < 0,05 vs naringina, n = 5). Ctr, controle; Wsh, washout. Considerando-se que, o aumento da contratilidade atrial induzido pela naringina poderia estar relacionado à ativação de receptores beta-adrenérgicos, foram realizadas curvas concentração–resposta da naringina na presença de 1 M de propranolol (antagonista βadrenérgico). A Fig. 18A mostra traçados representativos da força atrial em situação controle e com 2 mM de naringina (a) mostrando o aumento da força contrátil induzida por este flavonoide. Entretanto, a pré-incubação do átrio com propranolol (b) ou nifedipina (c) impediu 31 o aumento a amplitude da força induzido pela naringina. A Fig. 18B mostra que em 5 átrios, a pré-incubação tanto com o propranolol quanto com a nifedipina, foi capaz de abolir a resposta inotrópico positiva induzida pela naringina. A a Controle NRG 2,0 mM b PROP 1 µM PROP 1 µM + NRG 2,0 mM c NIF 1 µM NIF 1 µM + NRG 2,0 mM B Figura 18. Avaliação do efeito da naringina sobre os receptores β-adrenérgicos e canais para cálcio tipo-L. (A) Traçados representativos do efeito contrátil da naringina (NRG) em situação controle (a), na presença de 1,0 µM de propranolol (PROP) (b) e 1,0 µM nifedipina (NIF) (c). (B) Curvas concentração-resposta da naringina na ausência e presença do antagonista betaadrenérgico propranolol e da nifedipina, um antagonista de canais para cálcio tipo L (n = 4). Como visto anteriormente, a naringina teve seu efeito anulado tanto na presença de antagonista dos adrenoceptores β quanto frente a um antagonista de canais para cálcio. Dessa 32 forma, com o intuito de complementar a investigação do efeito inotrópico da naringina sobre a via beta-adrenérgica, foram realizados experimentos com átrios pré-incubados com 1 µM de rianodina, um bloqueador dos RyR. A Fig. 19A mostra traçados experimentais da resposta contrátil da naringina em situação controle (painel superior) e na presença de rianodina (painel inferior). Como pode ser observado, na presença de rianodina, a naringina não foi capaz de elicitar aumento de força atrial. A Fig. 19B resume em 5 átrios, as curvas concentração-resposta do efeito inotrópico positivo da naringina na ausência e presença da rianodina. A 2,0 1,0 0,25 gf 0,3 0,1 0,01 0,03 0,01 0,03 5 min Ry (1 µM) 0,1 0,3 1,0 2,0 B Efeito inotrópico positivo (% do controle) Naringina (mM) 200 Controle Rianodina 150 100 50 0 0 1 2 3 4 Log [Naringina (M)] Figura 19. Avaliação do efeito da naringina sobre os canais receptores de rianodina. (A) Traçados representativos do efeito contrátil da naringina em situação controle (painel superior) e na presença de 1,0 µM de rianodina (painel inferior). (B) Curvas concentração-resposta da naringina na ausência e presença de rianodina (n = 4). Entretanto, como o efeito inotrópico positivo no átrio se manteve até a concentração de 2 mM, o que posteriormente foi progressivamente sendo desfeito, levantamos a hipótese da possibilidade da naringina estar induzindo a liberação de catecolaminas pré-sinápticas e, 33 portanto, ter aumentado a força contrátil. Dessa forma, seu efeito inotrópico foi avaliado em animais pré-tratados com reserpina, um alcalóide que depleta catecolaminas do terminal nervoso simpático. Os resultados mostraram que o aumento da resposta contrátil da naringina não foi evidenciado em átrios obtidos de animais previamente reserpinizados (Fig. 20). Figura 20. Efeito inotrópico da naringina em átrio esquerdo isolado de ratos controles e previamente reserpinizados (5 mg/Kg/ i.p., 24 h, n = 5). Como os resultados mostraram que a naringina alterou a homeostasia do cálcio intracelular e como sabemos que esse íon interfere nas propriedades elétricas do coração, resolvemos investigar possíveis alterações eletrocardiográficas induzidas por esse flavonoide. A Fig. 21A mostra os efeitos da naringina (0,6 mM) sobre o intervalo PR (PRi). Este intervalo mede, principalmente, o tempo de condução da onda elétrica pelo nódulo atrioventricular (NAV). Como podemos observar a naringina encurtou o PRi de 48,42 ± 0,81 ms para 47,31 ± 0,89 ms (n = 5, p < 0,05), facilitando a passagem do impulso elétrico pelo NAV. Quanto ao intervalo QT (QTc), que reflete a duração do potencial de ação ventricular, a naringina também reduziu este intervalo de 66,75 ± 2,35 ms para 64,36 ± 2,24 ms (Fig. 21B, n = 5, p < 0,05). Por outro lado, a duração do complexo QRS foi aumentada (controle: 18,5 ± 1,0 ms e naringina: 20,83 ± 1,24 ms, Fig. 21C, n = 5, p < 0,05). Além disso, a naringina influenciou a atividade do marcapasso cardíaco, aumentando a frequência cardíaca 226,9 ± 1,12 bpm para 240,2 ± 3,94 bpm (Fig. 21D, n = 5, p < 0,0001). Nenhum evento de arritmia cardíaca foi registrado durante a perfusão do coração com este flavonoide. 34 30 * 45 QRS (ms) PRi (ms) 50 40 35 * 20 15 10 30 Controle Controle * 65 60 55 50 Controle Naringina Frequência cardíaca (bpm) Naringina 70 QTi (ms) QTc 25 Naringina *** 250 225 200 175 150 Controle Naringina Figura 21. Alterações eletrocardiográficas promovidas pela naringina (0,6 mM) em coração isolado de rato. (A) Intervalo PR (PRi), (B) intervalo QT (QTc), (C) duração do complexo QRS (QRS) e (D) frequência cardíaca em bpm (n = 5, *p < 0,05, ***p < 0,0001). Corroborando os resultados obtidos em átrio esquerdo, a naringina também promoveu aumento da pressão intraventricular esquerda (PVE). A Fig. 22 mostra que este flavonoide promoveu aumento de 6% da PVE. Entretanto, esse efeito foi bastante inferior ao do observado em átrio esquerdo (159%). PVE (mmHg) 200 ** 150 100 50 Controle Naringina Figura 22. Efeito da naringina sobre a pressão do ventrículo esquerdo em coração isolado de rato (**p < 0,01, n = 5). 35 8 DISCUSSÕES A naringina (4,5,7-trihidroxil flavanona-7-rhamnoglicosídeo) é o principal flavonoide presente no suco da uva e frutas cítricas (ALAM et al., 2014). Apresenta algumas propriedades biológicas tais como atividade antioxidante e anti-inflamatória (GARCÍA-LAFUENTE et al., 2009). A potente atividade antioxidante dos flavonoides foi e ainda é foco de muitas pesquisas. Entretanto, alguns estudos têm mostrado que a atividade biológica desses flavonoides depende de sua ação moduladora de canais iônicos, receptores de membrana e da sinalização intracelular (LOPEZ-MEDINA et al., 2014). Nesse ponto de vista, a literatura é muito escassa no que se refere aos efeitos da naringina sobre o sistema cardiovascular. Em coração de rato, nossos resultados mostraram que a naringina exerceu um efeito contrátil bifásico, aumentando a força atrial em baixas concentrações (0,003 a 2 mM) e reduzindo a força contrátil em concentrações acima de 3 mM. A CE 50 calculada foi de 0,32 ± 0,01 mM. Em contraposição aos nossos resultados, López-Medina et al. (2014) verificaram que a naringina, em coração isolado de rato, exerceu inotropismo negativo na faixa de concentração de 1 a 100 µM. Alvarez-Collazo et al. (2014) também observaram que a naringina (0,001 a 100 µM) apresentou atividade inotrópica negativa em coração isolado de camundongo, explicado pela redução das correntes de sódio e de cálcio tipo-L. Na faixa de concentração usada por esses dois autores, em nossos experimentos, a naringina promoveu aumento significativo da força contrátil. Vale ressaltar que nossos experimentos foram realizados em átrio isolado e que os dois autores citados anteriormente fizeram o estudo em coração isolado, medindo a força contrátil nos ventrículos. Além de aumentar a tensão sistólica, a naringina melhorou significativamente o relaxamento diastólico e também foi capaz de alterar o curso temporal das fases de contração e relaxamento atrial, aumentado a velocidade da sístole e reduzindo a velocidade da diástole. O aumento da força contrátil associado à melhora no relaxamento diastólico é muito semelhante a drogas que são agonistas de receptores β-adrenérgicos. Para elucidar o mecanismo de ação para o aumento da contratilidade atrial induzido pela naringina, foram feitos experimentos para avaliar a ação direta ou indireta deste flavonoide sobre os receptores adrenérgicos. Como é de conhecimento, a estimulação destes receptores ativa a proteína Gs que estimula a adenilato ciclase (AC), promovendo ativação da proteína cinase A (PKA). A PKA, por sua vez, fosforila várias proteínas relacionadas com o acoplamento de excitação-contração do músculo cardíaco, tais como: (1) canal de Ca+2 tipo-L, (2) receptores de rianodina (RyR), 36 (3) a proteína fosfolambam e (4) a troponina I. Tanto a ativação dos canais de cálcio do tipo-L quanto do RyR leva a um aumento da concentração intracelular de cálcio e, consequentemente, aumento da força contrátil. Por outro lado, o fosfolambam (PLB) que é um inibidor endógeno de SERCA, uma vez fosforilado, aumenta a recaptação do Ca +2 para o retículo sarcoplasmático (RS), aumentando também a força de contração (BERS, 2002), além de melhorar o relaxamento diastólico. Dessa forma, também é importante avaliar a ação da naringina tanto sobre os receptores adrenérgicos, canais para cálcio tipo-L e sobre os receptores de RyR. Dessa forma, foram obtidas curvas concentração-efeito deste flavonoide na presença do propranolol (1 µM), um antagonista não-seletivo desses receptores β e na presença de nifedipina (1 µM), um antagonista de canais para cálcio tipo-L. Os resultados mostraram que na presença destes diferentes antagonistas, responsáveis pela inibição de etapas distintas da via beta adrenérgica, o efeito inotrópico de naringina foi totalmente inibido mostrando o envolvimento desta via no mecanismo de ação da naringina. Como foi dito anteriormente, a abertura dos canais para cálcio presentes na membrana do retículo sarcoplasmático dos cardiomiócitos, os canais receptores de rianodina (RyR2), promove liberação do cálcio no citosol, levando a um aumento de contratilidade cardíaca (BERS, 2002). Diante disso, resolvemos avaliar os efeitos da naringina em átrio isolado de rato na presença e ausência de rianodina, utilizada em concentração (1 µM) capaz de bloquear os RyR. Os resultados revelaram que na presença da rianodina, a naringina não foi capaz de aumentar a força contrátil. Esses dados corroboram os achados de López-Medina et al. (2014). Estes pesquisadores verificaram que, em anéis de aorta de rato na presença de rianodina, a naringina não foi capaz de induzir contrações. Entretanto, nos chamou a atenção que em concentrações maiores que 2 mM, a resposta da naringina passava a ser inotrópica negativa. Levantou-se a possibilidade da naringina poder atuar sobre a liberação de catecolaminas no terminal nervoso simpático. Essa estimulação iria promover aumento da força contrátil que seria mantida até que o estoque de catecolaminas fosse depletado. Para tanto, foram feitos experimentos em átrios de animais previamente reserpinizados a fim de promover a depleção dos estoques pré-sinápticos de norepinefrina. A reserpina é um alcaloide indólico que foi usado no tratamento de hipertensão arterial na década de 40 (SLIM et al., 2011), capaz de inibir o transportador de monoaminas vesicular, impedindo assim que a norepinefrina e a dopamina, livres no citoplasma do terminal axonal, sejam captadas para o interior das vesículas. Estas monoaminas livres são degradadas pela monoamino oxidase (MAO) promovendo a sua depleção do terminal pré-sináptico (FOLLMER 37 et al., 2013). Nessa condição experimental. os resultados mostraram que a naringina foi incapaz de aumentar a contratilidade atrial. Tais resultados mostram que este flavonoide foi capaz de liberar catecolaminas presentes no átrio isolado, e estas, por sua vez, ligam-se aos receptores beta-adrenérgicos promovendo aumento da atividade contrátil do tecido cardíaco. Essa atividade dependente de liberação de catecolaminas já foi observada em outros compostos de origem natural. O 2,3-dihidrosilibina, maior constituinte da silimarina, que é um flavonolignano extraído das sementes de Silybum marianum, exerceu resposta inotrópica positiva em coração isolado de rato, dependente da presença de catecolaminas endógenas (GABRIELOVÁ et al. 2015), tendo ainda sido atribuído a esta substância, a possibilidade de promover pré e póscondicionamento miocárdico frente a lesão induzida por isquemia-reperfusão. Além de alterar a atividade contrátil, a naringina foi capaz de alterar o perfil eletrocardiográfico em coração isolado de rato. Verificamos que a naringina promoveu encurtamento do intervalo PR o que nos mostra que ela atuou facilitando a propagação da onda elétrica pelo nódulo atrioventricular (NAV). Associado a isso, também observamos que ela induziu aumento da frequência cardíaca, ou seja, aumentou a atividade do marcapasso, o nódulo sinusal. Esses dois efeitos, diminuição de PRi e aumento de frequência cardíaca, são característicos de drogas que aumentam a corrente de cálcio, tal como acontece quando a via beta-adrenérgica é estimulada. Como nós sabemos, as correntes de cálcio fazem parte da despolarização diastólica lenta (DDL) e da fase 0 de despolarização das células marcapasso. Quando ocorre aumento do influxo de cálcio nessas células, há um aumento da frequência cardíaca e uma melhora da condução elétrica pelo NAV. Além disso, verificamos que a naringina induziu encurtamento do intervalo QT, que reflete a duração do potencial de ação ventricular. Dessa forma, tais dados mostram que a naringina aumentou as correntes repolarizantes de potássio, reduzindo a duração do intervalo QTc. Alvarez-Colazzo et al. (2014) verificaram que a naringina (30 e 100 µM) também foi capaz de reduzir o QTc em coração isolado de camundongo. Oki et al. (2012) e Yow et al. (2011) verificaram que a naringina é um ativador direto de corrente de potássio K1. A abertura desses canais para potássio aceleram a repolarização ventricular, encurtando, dessa forma, o QTi. De maneira contrária, Alvarez-Colazzo et al. (2014) verificaram que a naringina promoveu aumento significativo do intervalo RR, isto é, redução da frequência cardíaca, enquanto que a duração do QRS sofreu aumento, apesar de não ser significativo 38 estatisticamente, em coração de rato isolado. Em nossos resultados, também foi evidenciado aumento na duração do complexo QRS, porém, em nosso caso, significativo. Como a despolarização ventricular depende do influxo de íons Na+, o alargamento do complexo QRS pode relacionar-se a uma provável ação adicional da naringina sobre os canais de sódio dependentes de voltagem. Essa condição foi demonstrada por Alvarez-Colazzo et al. (2014) que, utilizando a técnica de patch-clamp, observou diminuição de aproximadamente 40% das correntes de sódio (INa) utilizando concentrações de naringina tão baixas quanto 0,02 µM. A pressão intraventricular, de forma semelhante ao observado no átrio isolado, sofreu aumento pela naringina. Nossos resultados mostraram que tanto em átrio quanto em ventrículo de rato, a naringina foi capaz de elicitar aumento da contratilidade cardíaca. Entretanto, percebeu-se que, o efeito inotrópico induzido pelo flavonoide sobre o ventrículo esquerdo foi muito menor que o observado no átrio. Segundo Herdberg, Minneman e Molinoff (1979), os ventrículos possuem essencialmente receptores beta-1, enquanto que o músculo atrial dispõe tanto de beta-1, na proporção de 1/4 do total de receptores, quanto de beta-2. Sendo assim, a ativação de ambos receptores beta no átrio poderia estar gerando uma elevação mais acentuada dos níveis intracelulares de AMPc em relação aos ventrículos, onde se encontra predominantemente o subtipo 1 deste receptor, resultando em um efeito inotrópico maior nas aurículas que nos ventrículos, como observamos nos resultados desta pesquisa. Além disso, a concentração de naringina utilizada nos modelos experimentais de átrio isolado foram pouco mais que três vezes superior, considerando o pico da ação do flavonóide, à usada nos corações submetidos à perfusão retrógrada (Langendorff), fato que também pode ter contribuído para que a força de contração atrial fosse superior à ventricular em nossos experimentos. Como a naringina apresentou efeito inotrópico dependente de liberação de catecolaminas pré-sinápticas em coração isolado de rato, acreditamos em um potencial efeito cardioprotetor desse flavonoide em promover pré e pós-condicionamento miocárdico frente à lesão induzida por isquemia-reperfusão. Além disso, sabemos que agentes inotrópicos positivos estimulam a contratilidade cardíaca e são, por esse motivo, utilizados na clínica para tratar determinadas condições que geram baixo débito cardíaco e consequentemente redução da perfusão tecidual. Sendo assim, considerando o efeito inotrópico positivo apresentado pela naringina, acreditamos que, mediante a realização de estudos complementares, este flavonoide possa, no futuro, ser utilizado clinicamente com esta finalidade. 39 9 CONCLUSÕES Em coração de rato, a naringina exerce efeitos cronotrópico e inotrópico positivos associados a melhora do relaxamento diastólico. Esses dados são mediados por ativação indireta de receptores β-adrenérgicos através da liberação de catecolaminas pré-sinápticas que induz ativação de canais para cálcio tipo-L e receptores de rianodina. As alterações eletrocardiográficas induzidas pela naringina tais como redução do PRi e aumento de frequência cardíaca são típicas de agonistas adrenérgicos. Além disso, este flavonoide é capaz de ativar corrente para potássio visto pelo encurtamento do QTc. 40 REFERENCIAL BIBLIOGRÁFICO ALAM, M. A., et al. Effect of citrus flavonoids, naringin and naringenin, on metabolic syndrome and their mechanisms of action. Advances in Nutrition: An International Review Journal, v. 5, n. 4, p. 404-417, 2014. ALVAREZ COLLAZO, J., et al. Mechanism of the negative inotropic effect of naringin in mouse heart. Journal of Pharmacy & Pharmacognosy Research, v. 2, n. 5, p. 148-157, 2014. BASSANI, R. A.; BERS, D. M. 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