(4-etilfenil)-imidazolidina-2,4-dio - TEDE
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RONALDO BEZERRA DE QUEIROZ EVIDÊNCIAS PRÉ-CLÍNICAS DA AÇÃO ANTINOCICEPTIVA DO 3-fenil-5-(4-etilfenil)-imidazolidina-2,4-diona EM ESTUDOS PSICOFARMACOLÓGICOS UNIVERSIDADE FEDERAL DA PARAÍBA CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS E SINTÉTICOS BIOATIVOS LABORATÓRIO DE TECNOLOGIA FARMACÊUTICA PROF DELBY FERNANDES DE MEDEIROS JOÃO PESSOA-PB 2011 RONALDO BEZERRA DE QUEIROZ EVIDÊNCIAS PRÉ-CLÍNICAS DA AÇÃO ANTINOCICEPTIVA DO 3-fenil-5(4-etilfenil)-imidazolidina-2,4-diona EM ESTUDOS PSICOFARMACOLÓGICOS Dissertação apresentada ao Programa de Pós – graduação em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos do Centro de Ciências da Saúde com sede no Laboratório de Tecnologia Farmacêutica Prof. Delby Fernandes de Medeiros da Universidade Federal da Paraíba, em cumprimento às exigências para obtenção do título de mestre em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos. Área de concentração FARMACOLOGIA. ORIENTADORA: Profª Drª Liana Clébia Soares Lima de Morais CO – ORIENTADOR: Prof. Dr. Reinaldo Nóbrega de Almeida JOÃO PESSOA-PB 2011 Q3e Queiroz, Ronaldo Bezerra de. Evidências pré-clínicas da ação antinociceptiva do 3-fenil-5-(4-etilfenil)imidazolidina-2,4-diona em estudos psicofarmacológicos / Ronaldo Bezerra de Queiroz.- - João Pessoa : [s.n.], 2011. 96f. : il. Orientadora: Liana Clébia Soares Lima de Morais . Co-orientador: Reinaldo Nóbrega de Almeida. Dissertação(Mestrado) – UFPB/CCS/LTF. 1.Farmacologia. 2.Psicofarmacologia 3.Atividade anti-inflamatória. 4. Derivados imidazolidínicos.. UFPB/BC CDU: 615(043) RONALDO BEZERRA DE QUEIROZ EVIDÊNCIAS PRÉ-CLÍNICAS DA AÇÃO ANTINOCICEPTIVA DO 3-fenil-5(4-etilfenil)-imidazolidina-2,4-diona EM ESTUDOS PSICOFARMACOLÓGICOS Dissertação apresentada ao Programa de Pós – graduação em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos do Centro de Ciências da Saúde com sede no Laboratório de Tecnologia Farmacêutica Prof. Delby Fernandes de Medeiros da Universidade Federal da Paraíba, em cumprimento às exigências para obtenção do título de MESTRE EM PRODUTOS NATURAIS E SINTÉTICOS BIOATIVOS. Área de concentração FARMACOLOGIA. Aprovado em 23 / 02 / 2011 BANCA EXAMINADORA Aos meus pais, minha filha, meus irmãos e aos amigos sinceros, dedico. AGRADECIMENTOS Primeiramente a Deus, pela minha existência e oportunidade de se fazer presente no trabalho que desempenho sempre. A minha querida orientadora Profª Drª Liana Clébia Soares Lima de Morais, que tem estado ao meu lado em todos os momentos nesta caminhada na vida acadêmica, presteza diante das minhas dúvidas, conselhos e em quem me inspiro como exemplo profissional e que na prática faz uso com mister dos conceitos de humanização. Aos meus pais, Pedro Leite de Queiroz “in memorian” e Maria José Bezerra de Queiroz, que com dedicação e exemplo me deram a oportunidade de crescer profissionalmente. A minha irmã Profª Maria do Socorro Queiroz de Morais por seu estímulo, orientação e dedicação de sempre. Ao Prof. Dr. Reinaldo de Almeida Nóbrega pela amizade e orientação. Aos membros da banca examinadora por terem aceitado o convite e poderem contribuir para a versão final desta Dissertação. A todos os colegas do laboratório da Psicofarmacologia pela amizade, cooperação e presteza no desenvolvimento desse trabalho em especial a Rubens Benedito. Ao Prof. Dr. Petrônio Filgueiras de Athayde Filho (UFPB), por ter fornecido as substâncias necessárias para desenvolvimento deste trabalho. A Profª Drª Margareth de Fátima Formiga Melo Diniz pelo apoio e entusiasmo na conquista deste mestrado. A Profª Drª Claudia Roberta Leite Vieira de Figueiredo pela participação na orientação, criatividade e amizade no desenvolvimento do trabalho científico. Aos professores da Pós – graduação pela participação em minha formação acadêmica. A Tânia Maria Araújo, Caroline Medeiros Mangueira e José Crispim Duarte pelos serviços prestados, e pelo apoio técnico e indispensável para realização desse trabalho. Ao Biotério Prof. Dr. Thomas George do Laboratório de Tecnologia Farmacêutica pelo fornecimento dos animais e realço meu respeito a todos os animais utilizados durante a realização dos testes. Aos meus colegas de turma mestrado, pelos momentos de boa convivência e ansiedades compartilhadas. Ao Prof. Dr. José Alberto Gonçalves da Silva pela amizade, constante estímulo e incentivo no meu crescimento profissional e pessoal. Aos meus amigos que souberam dar estímulo e entender as ausências de convivência necessária para realização deste trabalho. “Bem aventurado o homem que suporta com perseverança a provação; porque, depois de ter sido aprovado, receberá a coroa da vida, a qual o senhor prometeu aos que o amam” ______________________________________________________________________ Tiago 1:12 QUEIROZ, R. B. Evidências Pré-Clínicas da Ação Antinociceptiva do 3-fenil-5-(4etilfenil)-imidazolidina-2,4-diona em Estudos Psicofarmacológicos. 2011. 96f. Dissertação (Programa de Pós Graduação em Produtos Naturais e Sintéticos Bioativos, Farmacologia) – UFPB / CCS / LTF, João Pessoa. RESUMO Os derivados imidazolidínicos são produtos sintéticos com inúmeras diferentes aplicações terapêuticas. Muitos derivados imidazolidínicos apresentam propriedades farmacológicas em nível do SNC, por exemplo a fenitoína que é utilizada na prática clínica como anticonvulsivante, mas também atua no tratamento da dor neuropática e também já foi utilizada como antiarrítmico cardíaco. O 3-fenil-5-(4-etilfenil)imidazolidina-2,4-diona (IM-3), sintetizado recentemente a partir de aminoácido foi selecionado para realização de estudos psicofarmacológicos. Baseado nessa semelhança químico-estrutural, o presente trabalho investigou a atividade antinociceptiva do IM-3 em modelos animais. O estudo teve início com a triagem farmacológica comportamental e determinação da DL50. Na triagem os resultados apontaram para uma atividade depressora no SNC e a partir da DL50, foram escolhidas as doses para testes subseqüentes de 50, 100 e 200 mg/kg por via intraperitoneal. Em seguida, metodologias para avaliar a atividade antinociceptiva específicas foram utilizadas. A primeira foi a das contorções abdominais induzidas pelo ácido acético; em seguida, o teste da formalina e por fim, o teste da placa quente, que é específico para atividade antinociceptiva central. Nas três metodologias usadas, o IM-3 apresentou-se efetivo no teste das contorções abdominais pelo ácido acético na dose de 200 mg/kg que aumentou tanto a latência para o aparecimento das contorções abdominais como reduziu o número de contorções abdominais em relação ao grupo controle e no teste da formalina nas doses de 100 e 200 mg/kg diminuiu o tempo de lambida da pata na segunda fase do teste. Portanto, a partir destes dados experimentais, é possível inferir que o IM-3 possui atividade antinociceptiva do tipo anti-inflamatória. Palavras chave: derivados imidazolidínicos, antinociceptiva, atividade anti-inflamatória psicofarmacologia, atividade QUEIROZ, R.B. Preclinical evidence of antinociceptive action of 3-phenyl-5-(4etilfenil)-imidazolidine-2,4-dione in psychopharmacological studies. 2011. 96p. Dissertation (Post Graduate Program in Natural Products and Synthetic Bioactive, Pharmacology) - UFPB / CCS / LTF, Joao Pessoa ABSTRACT Imidazolidine derivatives are synthetic products with many different therapeutic applications. Many imidazolidine derivatives have pharmacological properties at the level of the CNS, such as phenytoin, which is used in clinical practice as an anticonvulsant. However, this also works effectively in the treatment of neuropathic pain and it has been already used as anti-arrhythmic heart. The 3-phenyl-5-(4ethyphenyl)-imidazolidine-2,4-dione (IM-3), recently synthesized from amino acid was selected for psychopharmacological studies. Based on the chemical and structural similarity, this study investigated the antinociceptive activity of IM-3 in animal models. The study has began with screening and behavioral pharmacology of the LD50 determination. In the screening results indicate a depressant activity on CNS and from the LD50 doses were chosen for subsequent tests with 50, 100 and 200 mg / kg intraperitoneally. In the next step, methodologies to evaluate the specific antinociceptive activity were used. The first was the writhing induced by acetic acid; afterwards, the formalin test and finally the hot plate test, which is specific for the central antinociceptive activity. In the three methodologies used, the IM-3 showed to be effective in the writhing test by acetic acid at a dose of 200 mg/kg which increased both the latency to the onset of writhing and reduced the number of writhing in the control group and in the formalin test at doses of 100 and 200 mg / kg decreased the time of the paw lick in the second phase of testing. Therefore, from these experimental data, it is possible to infer that the IM-3 has antinociceptive activity of the anti-inflammatory type. Keywords: imidazolidine derivatives, psychopharmacology, antinociceptive, anti inflammatory activity LISTA DE FIGURAS Figura 1 - Visão geral do circuito nociceptivo ................................................. 30 Figura 2 - Diagrama esquemático do sistema de controle da comporta ........... 32 Figura 3 - Sinapse excitatória medular ............................................................. 35 Figura 4 - Camundongo Suiço macho e albino ................................................. 45 Figura 5 - Camundongos em grupo de 4 animais no interior da gaiola ............ 46 Figura 6 – Estrutura química do 3-fenil-5-(4-etilfenil)-imidazolidina-2,4diona (IM-3)...................................................................................... 47 Figura 7 - Aparelho de placa quente ................................................................. 48 Figura 8A - Visão superior da caixa de observação para o teste da formalina .... 49 Figura 8B - Visão frontal da caixa de observação para o teste da formalina ...... 49 Figura 9 – Resumo esquemático do estudo psicofarmacológico do IM-3 em camundongos ................................................................................... 50 Figura 10 - Detalhe do camundongo no aparelho do teste da placa quente ....... 54 Figura 11 - Aspecto geral de um procedimento do teste da formalina ............... 55 LISTA DE QUADROS Quadro 1 - Seletividade de agonistas e antagonistas para os subtipos de receptores opióides............................................................................ 39 Quadro 2 - Protocolo utilizado na triagem farmacológica comportamental ...... Quadro 3 - Efeito do IM-3 via i.p. na triagem farmacológica ............................ 60 52 LISTA DE GRÁFICOS Efeito de IM-3 no teste do ácido acético: latência das contorções abdominais ....................................................................................... 61 Efeito de IM-3 no teste do ácido acético: número das contorções abdominais ....................................................................................... 62 Gráfico 3 - Efeito de IM-3 sobre o tempo de permanência na placa quente ...... 63 Gráfico 4 - Efeito do IM-3 na primeira fase do teste da formalina .................... 64 Gráfico 5 - Efeito do IM-3 na segunda fase do teste da formalina ..................... 65 Gráfico 1 – Gráfico 2 – LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS %– ºC – α– β– δ– κ– µ– µL – 5-HT1 5-HT2 AAS – AINES ANOVA – AMPA IM-3 – BTG – BRVMR – Ca2+ – CEPA – COX – CGRP – DL50 – Dr. – Drª. – E.U.A. – e.p.m. – et al – FAAH GABA – GABAA Glu h– HIV IASP – i.p. – K+ – Kg – LC – LTF – mg – n– Na+ Nav NMDA – NMR – NO - Por cento Graus Celsius Alfa Beta Delta Kappa Mu Microlitro Receptor 5-hidroxitriptamina tipo 1 Receptor 5-hidroxitriptamina tipo 2 Acido acetil salicílico Anti-inflamatórios não esteroidais Análise de variância Ácido alfa-amino-3-hidroxi-5-metil-4- isoxazol-propionico 3-fenil-5-(4-etilfenil)-imidazolidina-2,4-diona Biotério Prof. Dr. Thomas George Bulbo raquidiano ventromedial rostral Íon cálcio Comitê de Ética em Pesquisa Animais Ciclooxigenase Peptídeo relacionado ao gene da calcitonina Dose letal 50% Doutor Doutora Estados Unidos da América Erro padrão da média E colaboradores Amida hidrolase de acido graxo (Fatty Acid Amide Hydrolase) Ácido gama amino butírico Receptor do ácido gama amino butírico do tipo A Glutamato Horas Vírus da imunodeficiência humana Associação Internacional para Estudo da Dor Intraperitoneal Íon potássio Quilogramas Locus coeruleus Laboratório de Tecnologia Farmacêutica Miligramas Número de animais Íon sódio Canais de sódios regulados por voltagem N-metil-D-aspartato Núcleo magno da rafe Óxido Nítrico NRPG – PKC pH – Prof. – PGE2α – PGF2α – RNA RNAm RP-HPLC r.p.m. – SCPV – SG – SGB SNA – SNC – SNP – SP – TTX-S TTX-R Tween 80 – UFPB – U.S.A – VR-1 – VRL-1 – Núcleo reticular paragigantocelular Fosfoquinase C Potencial hidrogeniônico Professor Prostaglandina E2α Prostaglandina F2α Ácido ribonucléico RNA mensageiro Fase reversa de cromatografia líquida de alto desempenho Rotações por minuto Substância cinzenta periaquedutal Substância gelatinosa Síndrome de Guillain-Barré Sistema Nervoso Autônomo Sistema Nervoso Central Sistema Nervos Periférico Substância P Sensíveis a tetrodotoxina Resistente a tetrodotoxina Polioxetileno Sorbitano Monoleato Universidade Federal da Paraíba Estados Unidos da América Receptor vanilóide - 1 Receptor vanilóide – Like - 1 SUMÁRIO I - INTRODUÇÃO...................................................................................................... 18 II – FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA ........................................................................ 23 2.1 Aspectos gerais sobre drogas antinociceptivas de ação no SNC .......................... 23 2.2 Considerações gerais sobre a dor........................................................................ 26 2.2.1 Conceito e classificação de dor........................................................................ 27 2.2.2 Percepção da dor ............................................................................................. 29 2.2.3 Tratamento farmacológico da dor .................................................................... 35 2.3 Antinocicepção e envolvimento dos canais para Na+ e K+ .................................. 39 III – OBJETIVOS ....................................................................................................... 43 3.1 Geral:................................................................................................................. 43 3.2 Específicos: ....................................................................................................... 43 IV – MATERIAL ........................................................................................................ 45 4.1 – Animais .......................................................................................................... 45 4.1.1 Condições experimentais................................................................................. 46 4.2 Substâncias utilizadas ........................................................................................ 47 4.3 Substância teste utilizada ................................................................................... 47 4.4 Aparelhagem...................................................................................................... 48 4.4.1 - Aparelho de placa quente .............................................................................. 48 4.4.2 Caixa de observação para o teste da formalina................................................. 48 V - MÉTODOS ........................................................................................................... 49 5.1 ESTUDO PRELIMINAR DA ATIVIDADE SOBRE O SISTEMA NERVOSO CENTRAL E AUTÔNOMO DO IM-3 .................................................................... 49 5.1.1 Toxicidade Aguda ........................................................................................... 49 5.1.2 Triagem Farmacológica Comportamental ........................................................ 50 5.2. AVALIAÇÃO ESPECÍFICA DA ATIVIDADE SOBRE O SISTEMA NERVOSO CENTRAL E PERIFÉRICO DO IM-3.................................................. 53 5.2.1. Estudo da Atividade Antinociceptiva ............................................................. 53 5.2.1.1. Teste das Contorções Abdominais Induzidas por Ácido Acético.................. 53 5.2.1.2. Teste da Placa Quente ................................................................................. 54 5.2.1.3. Teste da Formalina ...................................................................................... 55 VI – ANÁLISE ESTATÍSTICA .................................................................................. 57 VII – RESULTADOS ................................................................................................. 59 7.1 TESTES PRELIMINARES ................................................................................ 59 7.1.1 Determinação da dose letal 50%...................................................................... 59 7.1.2 Efeito do IM-3 na triagem farmacológica comportamental .............................. 59 7.2 TESTES ESPECÍFICOS .................................................................................... 60 7.2.1 Estudo da atividade antinociceptiva................................................................. 60 7.2.1.1 Efeito do IM-3 no teste das contorções abdominais induzidas por ácido acético ..................................................................................................................... 60 7.2.2 Estudo da atividade antinociceptiva central ..................................................... 62 7.2.2.1 Efeito do IM-3 no teste da placa quente ........................................................ 62 7.2.2.2 Efeito do IM-3 no teste da formalina ............................................................ 63 7.2.2.2.1 Primeira fase ............................................................................................. 63 7.2.2.2.2 Segunda fase ............................................................................................. 64 VIII – DISCUSSÃO .................................................................................................... 67 IX – CONCLUSÕES .................................................................................................. 76 X – PERSPECTIVAS ................................................................................................. 78 REFERÊNCIAS .......................................................................................................... 80 Introdução QUEIROZ, R.B. Introdução 18 I - INTRODUÇÃO A Psicofarmacologia investiga processos comportamentais que são alterados pela administração de drogas, como por exemplo, a atividade locomotora, a esquiva, a memória, entre outras; além de analisar a influência de substâncias sobre alguns transtornos psiquiátricos tais como esquizofrenia, depressão e ansiedade (ALMEIDA, 2006). Estudos nesta área da farmacologia associada a efeitos no Sistema Nervoso Central (SNC), além de fornecer indícios quanto ao possível mecanismo de ação de drogas, também ajudam no entendimento dos substratos neurobiológicos que medeiam efeitos comportamentais específicos relacionados a desordens centrais. Pesquisas por novos fármacos tem se tornado crescente, já que os avanços tecnológicos não trouxeram somente progressos, mas também mudanças de hábitos, alterações nos ecossistemas e, por conseguinte, novas doenças. Nos primórdios da humanidade as fontes naturais eram as únicas alternativas para a cura e alivio das enfermidades, entretanto devido aos avanços da química orgânica, a síntese é uma ferramenta que contribui cada vez mais na descoberta de novos fármacos. Resultado disto é que cerca de 80% das moléculas utilizadas na terapêutica são de origem sintética, sendo que este crescimento também é corroborado pela aplicação de conhecimentos de outras áreas à síntese orgânica, que dispõe de métodos analíticos mais eficientes e rápidos. Neste ponto de vista é de grande relevância o investimento na área de síntese e planejamento de novas moléculas com perspectivas farmacológicas. Os compostos heterocíclicos, por sua vez, são as maiores fontes de fármacos sintéticos e estão envolvidos em diversos tipos de reações químicas. Sua importância está relacionada à possibilidade da introdução de heteroátomos no anel e novos grupos substituintes, o que lhes confere diferentes propriedades químicas e biológicas (LUIS et al, 2010). Aminoácidos são os nutrientes mais antigos que existem na face da Terra. Eles têm desempenhado um papel fundamental na existência da vida, desde os tempos dos seres vivos mais primitivos até o estágio presente de evolução marcado pelo aparecimento do ser humano. Os aminoácidos desempenham diversas funções QUEIROZ, R.B. Introdução 19 importantes no corpo e servem como material constituinte das proteínas e portanto das células, hormônios e enzimas. Embora seja o aminoácido mais simples, a glicina mostrou ser necessária para o funcionamento normal do sistema nervoso, da pele e dos tecidos musculares. Compostos heterocíclicos originados da glicina apresentam uma gama de atividades biológicas úteis ao homem. Destacamos as classes dos Compostos Mesoiônicos e das Imidazolidinas (Hidantoínas). A difenil-hidantoína, denominada genericamente de fenitoína, é amplamente utilizada como o anticonvulsivante de escolha no tratamento das crises epilépticas (HARDMAN, J. G. et al., 1996). Este fármaco, por sua eficácia já comprovada, faz parte da Relação de Medicamentos Essenciais da Organização Mundial de Saúde (WHO, 1997) e também da Relação Nacional de Medicamentos Essenciais (BRASIL, 2002). O fato do 3-fenil-5-(4-etilfenil)-imidazolidina-2,4-diona (IM-3) possuir estrutura similar as hidantoínas e diante do que foi exposto aliado ao uso clínico de rotina da fenitoína reforçam a intenção em analisar os efeitos dos derivados imidazolidínicos no Sistema Nervoso Central. Inicialmente, antes dos testes farmacológicos comportamentais mais específicos, o derivado imidazolidínico selecionado foi testado quanto à toxicidade. Além de provas da eficácia, uma nova droga tem que possuir estudos toxicológicos pré-clínicos para oferecer aos pesquisadores clínicos alguma segurança sobre as doses que potencialmente podem apresentar efeitos tóxicos. Um parâmetro muito importante que fornece indícios da toxicidade de um fármaco é a dose que provoca 50% de mortes (DL50 = dose letal 50%), e esta se calculou antes da escolha das doses que poderão ser utilizadas para os testes comportamentais. A etapa seguinte consistiu na realização de uma triagem farmacológica central onde foi avaliado, através da análise de vários parâmetros comportamentais, o tipo de influência que o derivado imidazolidínico exerceu sobre o SNC, ou seja, se houve um efeito farmacológico, em que modalidade (se analgésico e ou anti-inflamatório) a droga se enquadrou. Foram considerados os efeitos estimulantes, depressores ou perturbadores do SNC, bem como alguns efeitos relativos à estimulação do SNA. O método de triagem farmacológica é uma ferramenta imprescindível, de fácil aplicação e QUEIROZ, R.B. Introdução 20 relativamente barata, que é amplamente utilizada para a determinação de efeitos de substâncias no SNC. Como apresentou efeitos centrais significativos, uma avaliação mais detalhada, com modelos animais específicos foi realizada. Na etapa comportamental propriamente foram realizados os testes para avaliação da atividade antinociceptiva através da medida das contorções abdominais induzidas por ácido acético, do teste da placa quente e do método da formalina. Nos domínios da neurofisiologia, a dor é uma sensação resultante da excitação das terminações livres de função nociceptiva. É uma forma de sensibilidade química, cujos estímulos adequados são as moléculas orgânicas, (como as aminas, histaminas, e serotonina; ou peptídeos calidina e bradicinina), formadas ou liberadas quando ocorre lesão celular. Superando qualquer outra modalidade sensorial, a dor apresenta forte componente afetivo, mais acentuado na dor crônica leve que na aguda. A sensação dolorosa propriamente dita é acompanhada por sentimento de mal-estar, desprazer e angústia, condição essa, rotulada como hiperpatia, isto é, não só a reação subjetiva à dor é intensa, como também, a reação a outros estímulos fica alterada. A técnica de Siegmund et al. (1957), modificada por Koster et al. (1959), foi adaptada para avaliar a atividade antinociceptiva em camundongos. O ácido acético foi usado como uma substância algogênica em camundongos de acordo com o método de Koster e Anderson em 1959 (CALATAYUD et al. 1998). Agentes irritantes como exemplo, o ácido acético, formalina, capsaicina dentre outros atuam como estímulos nociceptivos, os quais provocam em camundongos determinados comportamentos caracterizados por contorções abdominais seguida de torção de tronco e extensão de membros posteriores (BLOCK et al. 1998). A atividade antinociceptiva positiva de uma droga é expressa através da redução do número de contorções abdominais dos animais pré-tratados com extrato e/ou droga padrão (ANTONIOLLI et al., 2001). O teste da placa quente foi descrito por Eddy e Leimback em 1953 (CALATAYUD et al. 1998), sendo utilizado para determinar o limiar nociceptivo do animal frente um estímulo álgico representado pelo calor. Os animais serão colocados individualmente sobre uma placa quente mantida a 50 ± 1º C. O parâmetro avaliado será a latência em segundos, que equivale o tempo para o animal lamber uma das patas dianteiras ou traseiras após ter sido colocado na placa quente. O tempo limítrofe de QUEIROZ, R.B. Introdução 21 permanência do animal no aparelho será de 30 segundos para prevenir dano tecidual (ANTONIOLLI et al. 2001). Em virtude dos vários efeitos indesejáveis graves advindos do tratamento com os analgésicos, os farmacologistas pesquisam incessantemente novas substâncias que apresentem atividade antinociceptiva e que possam ser utilizadas na terapêutica, sejam desprovidas de efeitos adversos graves como os apresentados pelos fármacos opióides e com melhor resposta farmacológica. Nesse contexto se insere a avaliação da atividade antinociceptiva do derivado imidazolidínico 3-fenil-5-(4-etilfenil)imidazolidina-2,4-diona (IM-3) em camundongos. Fundamentação Teórica QUEIROZ, R.B. Fundamentação Teórica 23 II – FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA 2.1 Aspectos gerais sobre drogas antinociceptivas de ação no SNC Estudos com o objetivo de avaliar a atividade analgésica de substâncias sintéticas bioativas no SNC são direcionados às ações depressoras destas, visto que são muito úteis na medicina, ajudando a diminuir o excesso de funcionamento cerebral e conseqüentemente a sensação somestésica da dor provocada pela lesão de alguma parte do corpo. Os psicolépticos, que são fármacos depressores do SNC, têm como característica predominante a redução da atividade funcional das estruturas encefálicas, a exemplo do cérebro. Dentre esses, encontram-se os neurolépticos, benzodiazepínicos, barbitúricos e opióides (ALMEIDA, 2006). Antipsicóticos também conhecidos como neurolépticos são substâncias utilizadas para atenuar ou abolir os sinais e sintomas da esquizofrenia e de outras psicoses. São classificados em neurolépticos clássicos ou típicos e os de nova geração ou atípicos (GALDURÓZ; BARBOSA, 2006). Os neurolépticos típicos são aqueles que atuam bloqueando principalmente os receptores dopaminérgicos chamados D2, além dos receptores muscarínicos do sistema colinérgico, atuando por antagonismo farmacológico na via mesolímbica, via essa postulada como causadora de sinais e sintomas das psicoses. Estão incluídos nessa classe de fármacos o haloperidol e a clorpromazina. Já os neurolépticos atípicos ou de segunda geração são definidos farmacologicamente, como antagonistas serotonina-dopamina apresentando-se menos específicos que os neurolépticos típicos por bloquearem mais de um sistema, apresentam menos efeitos extrapiramidais, como a clozapina, (agem menos na via nigroestriatal), além de bloquear relativamente pouco os receptores D2, tem importante afinidade pelos receptores D1, D4, 5-HT2, alfa1 e H1 e possuem eficácia sobre os sintomas negativos da esquizofrenia. Assim, alguns efeitos dos antipsicóticos dependem de sua atuação em outros sistemas de neurotransmissores além da QUEIROZ, R.B. Fundamentação Teórica 24 dopamina, como, por exemplo, as ações anticolinérgica e bloqueadora alfaadrenérgica (SILVA, 2010). Os fármacos psicoativos mais consumidos no mundo são os benzodiazepínicos devido as suas propriedades anticonvulsivante, ansiolítica, hipnótica e pré-anestésica. Entretanto, efeitos indesejáveis como relaxamento muscular, sedação, dependência física e tolerância, têm sido associados ao uso dessa classe de fármacos (RUBIN et al., 2000). Esses fármacos exercem suas ações farmacológicas por meio da interação com receptores específicos no SNC, localizados em uma subunidade dos receptores do GABAA, agindo como neuromoduladores alostéricos positivos. Esta interação ocorre através de um acoplamento estrutural, formando um complexo macromolecular que potencializa os efeitos do neurotransmissor inibitório GABA, aumentando a transmissão gabaérgica pré e póssináptica (OGA; CAMARGO; BATISTUZZO, 2008; SILVA, 2010). Na subunidade de ligação dos benzodiazepínicos dos receptores GABAA existem múltiplas formas de receptores benzodiazepínicos, com distintos perfis farmacológicos. Os receptores ômega 1, são preferencialmente abundantes no cerebelo e contém sítios de reconhecimento com alta afinidade para benzodiazepínicos e outras substâncias de diferentes estruturas químicas. São responsáveis pelas ações ansiolíticas e hipno-sedativas. Os tipo ômega 2, estão localizados predominantemente na medula espinhal e estriato, e estão envolvidos na mediação da atividade miorelaxante. Já os tipo ômega 3, também conhecidos como tipo periférico são abundantes nos rins e seu papel na atividade ansiolítica permanece desconhecido (STHAL, 2000). Barbitúricos são de outra classe de fármacos depressores do SNC que causam especificamente sedação e hipnose. Os barbitúricos se ligam a receptores associados ao ionóforo de GABA-cloreto; todavia, esses fármacos parecem prolongar os efeitos do GABA, em lugar de intensificá-los (DAILEY, 2005). Em doses baixas, os barbitúricos aumentam a duração de abertura do canal de cloreto GABAA produzida pelo GABA. Em doses altas produzem anestesia geral, coma ou morte. Os barbitúricos abrem o canal independentemente do GABA. Por outro lado, a ativação do receptor para benzodiazepínicos modula o receptor GABAA, aumentando ou diminuindo a freqüência de abertura dos canais de cloreto em resposta ao GABA (GRAEFF; GUIMARÃES, 2005). Com o surgimento dos benzodiazepínicos, apenas aqueles barbitúricos mais específicos como fenobarbital, usado por sua atividade QUEIROZ, R.B. Fundamentação Teórica 25 anticonvulsivante, e o tiopental, muito empregado como agente anestésico intravenoso é que ainda permanecem em ampla utilização (RANG et al., 2007). Os analgésicos de ação central ou simplesmente opióides têm como característica principal aumentar o limiar neuronal ao estímulo nocivo ou até mesmo erradicar a sensação dolorosa (ALMEIDA; OLIVEIRA, 2006a). O termo "opióide" é habitualmente empregado para substâncias de natureza sintética ou peptídica com ação semelhante à morfina, enquanto que "opiáceo" representa uma terminologia mais antiga sendo aplicado a sustâncias naturais isoladas do ópio como a morfina e codeína. Entretanto, alguns autores relacionam o termo opióide de forma ampla a todos os compostos que estão relacionados com o ópio, o suco extraído da papoula, ou Papaver somniferum L. (GUTSTEIN; AKIL, 2003). Os efeitos desses fármacos incluem principalmente analgesia, sendo esse o mais relevante efeito para a utilização dessa classe de substâncias, mas também é observado sedação, depressão respiratória, miose, supressão do reflexo de tosse e efeitos no trato gastrointestinal, a exemplo de constipação. É importante destacar que além dos efeitos citados, todos os agonistas opióides produzem graus variados de tolerância e dependência física (WELCH; MARTIN, 2005). Segundo vários autores, (GANGAROSA; MAHAN; CIARLONE, 1991; OKESON, 1996; TUCKER; DOLWICK, 1996; TORTAMANO, 1997) os opióides são mais úteis em condições de dores agudas, quando há exacerbação da dor musculoesquelética, já que produzem menos efeitos colaterais quando usados num curto período de tempo (DOS SANTOS JR., 1995). A morfina, a codeína (metilmorfina) e seus derivados semi-sintéticos constituem os opióides mais amplamente utilizados para o controle da dor. Tipicamente a morfina é considerada o opióide de referência com o qual os outros opióides são comparados. Os antagonistas dos receptores opióides são utilizados para reverter os efeitos colaterais potencialmente fatais da administração de opióides, especificamente a depressão respiratória. A naloxona, que é um desses antagonistas, é um derivado sintético da oximorfona, e utilizada através da administração por via parenteral (GRIFFIN; WOOLF, 2009). QUEIROZ, R.B. Fundamentação Teórica 26 2.2 Considerações gerais sobre a dor A dor na verdade, é o sintoma mais importante de doença e também um dos “sinais mais precoces de morbidade da natureza” e continua a ser a mais importante entre todas as experiências sensoriais através das quais os seres humanos avaliam a existência de doenças em si mesmos. Nas civilizações antigas, como a assíria-babilônica, egípcia e hebraica, o conceito de dor adquiriu uma conotação religiosa. Eles acreditavam ser a dor uma intoxicação produzida pelos espíritos malignos, ou um castigo divino resultado de pecados cometidos (BRAUN FILHO, 1999). A dor caracteriza-se por uma resposta orgânica protetora, pois alerta o indivíduo para uma lesão iminente ou real dos tecidos, induzindo ao surgimento de respostas reflexas e comportamentais coordenadas com o intuito de manter o dano tecidual o mais controlado possível (WOOLF; MANNION, 1999). Todos os indivíduos, exceto portadores de insensibilidade congênita, sabem o que é dor. Entretanto, é difícil para alguém descrever a própria dor e impossível conhecer exatamente a experiência dolorosa do outro, isso porque esta é uma experiência individual, com aspectos peculiares, associada às características únicas de cada organismo (GUIMARÃES, 1999). Dados da literatura norte-americana mostram que existiam em 2000, cerca de 86 milhões de norte-americanos com dores crônicas, dos quais 65 milhões apresentavam-se incapacitados total ou parcialmente. No Brasil, não se tem dados epidemiológicos que permitam tais análises. Estimativas levantadas em um trabalho realizado no Hospital das Clínicas da Universidade de São Paulo mostram dados aproximados de que 13,6 milhões de brasileiros seriam portadores de quadros dolorosos persistentes e intensos, dos quais 50 a 60% seriam dores crônicas (MARQUEZ, 2004). Mesmo nos dias atuais, a dor continua sendo uma das grandes preocupações da humanidade. O homem sempre procurou esclarecer as razões que justificassem a ocorrência da dor, bem como os procedimentos destinados ao seu controle (BERTOLUCCI et al., 2011). QUEIROZ, R.B. Fundamentação Teórica 27 2.2.1 Conceito e classificação de dor A nocicepção é definida como os mecanismos pelos quais os estímulos periféricos nocivos são transmitidos ao SNC, sem, no entanto, apresentar o componente subjetivo que é característico da dor (ALMEIDA; OLIVEIRA, 2006a). Por outro lado diante da complexidade e das várias influências que envolvem o processo doloroso a IASP - Intemational Association for the Study of Pain, conceituou a dor como "uma experiência sensorial e emocional, em geral desagradável, associada com dano tissular real ou potencial, ou descrita em termos deste dano". É essencialmente uma manifestação subjetiva, variando a apreciação de um mesmo estímulo nóxico de indivíduo para indivíduo (VILELA FILHO, 1998). Dentre os vários fatores que modificam esse componente afetivo e subjetivo, podemos citar o estado emocional, posição social, nível cultural, preferência religiosa, plano econômico-financeiro e fatores ambientais; esses alteram profundamente o significado que a experiência dolorosa pode causar. A dor ocorre em um momento específico da existência de uma pessoa, relacionada à sua história e ao contexto no qual o acontecimento doloroso se desencadeou (LEMONICA, 1997). A dor pode ser classificada sob vários aspectos, um deles leva em consideração sua distribuição temporal, em aguda e crônica (VILELA-FILHO, 1998). A dor aguda é aquela que se segue a um estímulo nóxico; deve-se à ativação das vias da dor e se faz acompanhar de manifestações neurovegetativas, tais como taquicardia e sudorese, desaparecendo com a resolução do processo patológico que lhe originou. É uma importante modalidade de natureza sensorial, desempenhando um papel de alerta para o próprio organismo. A dor crônica é aquela que persiste por um período de tempo superior àquele necessário a função de alertar o indivíduo e gera acentuado estresse e incapacidade para o trabalho. Sob o aspecto conceitual, pode está associada a patologias crônicas ou decorrentes de lesão do SNC ou periférico. De fato, a dor provocada por estímulo lesivo tem a função de alertar o indivíduo e, assim, lhe permite a possibilidade de fugir do estímulo prejudicial ou diminuir o dano que causa a sensação dolorosa. Em alguns casos, a dor persiste por tempo excessivamente longo e passa a representar sofrimento, sendo muitas vezes prejudicial ao organismo. Portanto, o primeiro caso corresponde a "dor aguda", e o QUEIROZ, R.B. Fundamentação Teórica 28 segundo, à chamada "dor crônica". Para alguns autores a dor crônica significa um processo patológico (dor patológica) e não tem o caráter protetor da dor aguda (dor fisiológica) (GRAEFF; GUIMARÃES, 2005). Outras classificações e modalidades de dor, além das já citadas, incluem a dor nociceptiva, a somática, a neuropática, a referida e a visceral. A nociceptiva é a forma de dor que surge em todos os indivíduos normais, como conseqüência da aplicação de estímulos que produzem dano ou lesão nos órgãos somáticos ou viscerais. Origina-se da ativação dos nociceptores. A dor somática tem origem na pele, músculos, articulações, ligamentos e ossos. Trata-se de uma dor bem localizada, circunscrita à área lesada e caracteriza-se por sensações claras e precisas (BRAUNFILHO; BRAUN, 2004). A doença neurológica que afeta a via sensorial pode produzir dor crônica severa, sendo essa então designada por dor neuropática, que segundo a IASP, é definida como uma dor causada ou iniciada por uma lesão primária ou por disfunção do SNC e/ou Periférico (SNP). Esta desordem pode ser provocada ou iniciada por disfunção do sistema nervoso ou por lesão como compressão, transecção, infiltração, isquemia, injúria metabólica de corpos celulares de neurônios ou uma combinação desses fatores, diferindo-se em etiologia e local de lesão (GALLUZZI, 2007; BERTOLUCCI et al., 2011). Dor do membro fantasma e diabetes mellitus são causas de dor neuropática (BOWSHER, 1999). Esse tipo de dor pode não está diretamente relacionada a qualquer lesão tecidual periférica e ser decorrente de distúrbios do SNC, tal como na esclerose múltipla (RANG et al., 2007). As síndromes dolorosas neuropáticas que tem origem no SNC podem ser por lesão medular ou encefálica. Quando por lesão no SNP podem ser por mononeuropatia e polineuropatia. As condições patológicas associadas com mononeuropatias que levam a dores neuropáticas mais comuns são por herpes zoster, diabetes, poliarterite nodosa, artrite reumatoide, lúpus eritematoso sistêmico, trauma, tumor, vírus da imunodeficiência humana (HIV), hipotieroidismo, porfiria, isquemia etc. As polineuropatias podem ser de causa metabólica (diabete, hipotireoidismo, amiloidose, uremia, doença de Fabry); carencial (beribéri, pelagra); tóxica (álcool, organofosforado); medicamentosa (isoniazida, cloranfenicol, metronidazol, vincristina); infecciosa (HIV, tuberculose); inflamatória (SGB); tumoral (mieloma, linfoma). As síndromes dolorosas acometendo nervos cranianos são principalmente a neuralgia do trigêmio e a neuralgia do glossofaríngeo (BERTOLUCCI et al., 2011). QUEIROZ, R.B. Fundamentação Teórica 29 A dor visceral é a forma de dor que surge com mais freqüência como conseqüência de enfermidades. É o sintoma comum na maioria das síndromes dolorosas agudas e crônicas de interesse clínico. É vaga, mal localizada e se estende além do órgão lesado. Pode ser referida em regiões distantes da víscera que a originou (BRAUN-FILHO; BRAUN, 2004). Não é raro uma pessoa sentir dor em uma parte do corpo consideravelmente distante dos tecidos que a causaram. Esse tipo de dor visceral é chamada de referida, sendo iniciada em um dos órgãos viscerais e referida a uma área na superfície corporal. A dor pode ainda ser referida a uma área do corpo não exatamente coincidente com a localização da víscera que a produziu (GUYTON; HALL, 2002). A dor psicogênica, por sua vez, está relacionada à prevalência de fatores psicológicos na gênese da sensação dolorosa. Esse tipo de dor pode ser observado em distúrbios psicológicos como na depressão e na ansiedade generalizada (FURST, 1999; MERSKY, 1986). 2.2.2 Percepção da dor A dor é uma percepção altamente individualizada, baseada em experiências e associações passadas, no contexto cultural e espiritual, constituição psicológica, bem como nos mecanismos físicos e fisiológicos (WILDER-SMITH, 2007). Pressupõe-se a existência de três componentes envolvidos no processo doloroso: um é a ativação de nociceptores, que é a transdução, induzida por estímulos nocivos que podem ser exógenos, tais como, biológicos, químicos, físicos ou ainda endógenos, caracterizados principalmente por processos inflamatórios; outro ocorrendo por consequência a transmissão dos citados estímulos pelas vias nervosas até o córtex cerebral. O componente seguinte seria a reação emocional à dor, que corresponderia à interpretação afetiva dessa sensação. A reação emocional à dor de caráter individual é representada principalmente por experiências prévias, tais como a QUEIROZ, R.B. Fundamentação Teórica 30 lembrança de alguma forma de sofrimento. A percepção final da dor será consequência da integração destes componentes (MORAES; CAMARGO, 1999; BRAUN-FILHO; BRAUN, 2004). Portanto, a dor não envolve apenas a transdução, transmissão do estímulo nociceptivo ambiental, mas também envolve um evento cognitivo e emocional processado pelo cérebro. (JULIUS; BASBAUM, 2001). Portanto o reconhecimento da dor como reação sensitiva envolve três mecanismos básicos: transdução, transmissão e modulação. Figura 1. Visão geral do circuito nociceptivo (Fonte: Adaptado de SILVERTHORN, 2003). Denomina-se transdução ao fenômeno de ativação dos receptores da dor, conhecidos como nociceptores (Figura 1), isto é, a transformação de um estímulo mecânico, térmico ou químico nóxico em potencial de ação (impulso nervoso) pelo nociceptor (VILELA-FILHO, 1998). No processo de transdução, no caso da sensação dolorosa, ocorre uma amplificação dos eventos pela liberação local de uma grande variedade de substâncias químicas, denominadas genericamente de substâncias algogênicas, que surgem em grande quantidade nos tecidos em decorrência de processos inflamatórios, traumáticos QUEIROZ, R.B. Fundamentação Teórica 31 ou isquêmicos. Essas substâncias incluem serotonina, bradicinina, noradrenalina, histamina, citocinas, prostaglandinas, leucotrienos e substância P (MARQUEZ, 2004). Os nociceptores são terminações nervosas livres das fibras mielínicas Aδ e das fibras amielínicas C localizados na pele, músculos, articulações, tecido conjuntivo e vísceras. Alguns tecidos possuem nociceptores que podem ser térmicos, ativados por temperaturas extremas, nociceptores mecânicos que são ativados por intensa pressão e os polimodais, ativados por estímulos químicos, térmicos ou mecânicos de elevada intensidade (PINTO, 2000). O processo de transmissão de mensagem da periferia até a medula espinhal é feito por fibras nervosas, sendo as fibras Aδ e C já referidas, envolvidas primariamente na nocicepção e, também, pelas fibras mielinizadas, de condução rápida Aβ, que carreia informações não nociceptivas, mas, participa de forma conjunta no processo doloroso. Os sinais de dor rápida são transmitidos nos nervos periféricos em direção a medula espinhal pelas fibras tipo A (rápidas) e a dor lenta, por fibras tipo C amielínicas (MARQUEZ, 2004). Na medula espinhal os neurônios nociceptivos aferentes fazem sinapse na coluna cinzenta posterior com neurônios das lâminas I a VI (lâminas de Rexed). As células que dão origem às fibras espinotalâmicas e espinoreticulares, localizam-se na coluna cinzenta posterior. As células situadas na lâmina II, que corresponde a tradicional área gelatinosa da medula, recebem projeções descendentes do núcleo magno da rafe; existem evidências que exercem papel no “bloqueio”da dor (DORETTO, 2005). A informação nociceptiva é transmitida da medula espinhal para o tálamo e para o córtex por cinco vias ascendentes: os tratos espinotalâmico, espinoreticular, espinomesencefálico, cervicotalâmico, espinohipotalâmico (BASBAUM; JESSELL, 2000; PINTO, 2000). O sistema de modulação mais conhecido e o mais aceito para explicar a regulação da dor é o da Teoria da Comporta ou “Mecanismo de Controle do Portão Medular” ou “Gate-Control”, segundo a qual as fibras mielínicas grossas Aβ (responsáveis pela condução do tato, propiocepção e pressão) excitariam os interneurônios inibitórios da substância gelatinosa (lâmina II), os quais promoveriam a inibição pré-sináptica dos aferentes nociceptivos, que por sua vez, inibiriam os interneurônios inibitórios e, ao mesmo tempo, excitariam os neurônios das vias de projeção da dor. Esta teoria explicaria o fato de que a estimulação tátil de uma área QUEIROZ, R.B. Fundamentação Teórica 32 dolorosa diminui a sensação de dor (VILELA-FILHO, 1998). Foi proposta por Ronald MELZACK e Patrick WALL em 1965. Constitui-se em um modelo de percepção da dor no qual há uma regulação da passagem dos impulsos das fibras aferentes periféricas para o tálamo através dos neurônios de transmissão no corno dorsal. Ela funciona como uma estação regulatória para a transmissão da dor. Assim, a percepção da dor se dá pelo somatório da estimulação sensorial e um intenso controle central (Figura 2). Figura 2 – Diagrama esquemático do sistema de controle da comporta Os axônios de neurônios que formam os tratos ascendentes, projetam-se para áreas do tálamo e daí seguem em direção ao neo-córtex e sistema límbico. As fibras paleo-espino-talâmicas enviam ramificações para a formação reticular no tronco cerebral, mesencéfalo (região periaqueductal) e hipotálamo (próximo ao terceiro ventrículo). Os tratos paleo-espinotalâmico e espinomesencefálico, dirigem-se aos núcleos medial e intra-laminar do tálamo, de onde surgem projeções para o sistema límbico e lobo frontal, áreas correlacionadas com o componente afetivo da percepção da dor, fortemente influenciado por experiências pregressas. O trato neo-espinotalâmico projeta-se ao neo-córtex, e suas fibras projetam-se por sua vez para os núcleos póstero-látero-ventral e posterior do tálamo, onde fazem sinapses com neurônios que se projetam para a neo-córtex somato-sensorial. Essas vias são QUEIROZ, R.B. Fundamentação Teórica 33 primariamente correlacionadas com a percepção cognitiva (localização, intensidade e natureza do estímulo) e reconhecimento consciente da dor. O trato espino-reticular projeta-se principalmente para o tronco cerebral e formação reticular mesencefálica. As informações processadas desencadeiam em cada um desses centros superiores uma resposta em consequência aos estímulos recebidos, por exemplo, a ativação da formação reticular explica o estado de vigília, agitação e ansiedade que por muitas vezes acompanha a dor. Como o centro vasomotor está localizado nesta área é comum o aparecimento de aumento da pressão arterial, frequência cardíaca, sudorese e taquipnéia por aumento do tônus adrenérgico nos pacientes com dor. Ao nível supra-espinhal há um mecanismo descendente de controle da dor originado na medula rostroventromedial com participação de outros núcleos do tronco cerebral como o núcleo do trato solitário, parabraquial, dorsal reticular, hipotalâmico e córtico cerebral, interagindo com fibras aferentes, interneurônios e neurônios de projeção (Millan, 2002). O sistema inibitório central de modulação da dor é também ativado por intermédio das aferências do fascículo antero-lateral ao tronco cerebral e mesencéfalo. A região cinzenta periaquedutal recebe tanto impulsos provenientes da medula espinhal como do hipotálamo, tálamo, córtex, sistema límbico e ínsula. Estes impulsos seguem para estruturas pontinas, bulbares e da medula espinhal. Em resumo as fibras aferentes nociceptivas transmitem o impulso doloroso para o tálamo através de células transmissoras da dor localizadas no corno dorsal na medula espinhal, constituindo a via de transmissão da dor, a qual é controlada pelos neurônios da substância gelatinosa (SG), que tem participação importante na transmissão de impulsos nociceptivos para o encéfalo. Neurônios inibitórios descendentes ou influxo aferente não-nociceptivo ativam os neurônios da SG os quais, por sua vez, inibem as células transmissoras da dor dificultando a passagem do impulso doloroso para os centros superiores. Já a estimulação das fibras C, inibe os neurônios inibitórios da SG (Figura 2), permitindo a passagem do impulso doloroso para o tálamo, constituindo-se então o processo de regulação da passagem do impulso doloroso para os centros superiores (YAKSH; MALMBERG, 1994). A teoria da comporta não aborda somente o aspecto sensorial da dor, mas também as variáveis psicológicas e sua influência na sensação dolorosa. Isso ocorre por meio de uma avaliação cognitiva e por informações de experiências anteriores que QUEIROZ, R.B. Fundamentação Teórica 34 estão armazenadas em regiões corticais superiores ligadas ao componente motivacional. Alterações neste componente, principalmente na dor crônica, podem modificar as reações à dor mesmo não havendo mudanças no seu componente sensorial (BROTON; ROSENFELD, 1982). Sabe-se que os impulsos dolorosos estão sujeitos a influências modulatórias centrais e que, em situações de estresse físico ou de grande concentração, os estímulos dolorosos são tolerados. Foi sugerida, então, a existência de um sistema fisiológico de controle central da dor. (URBAN; GEBHART, 1999). O processo analgésico ocorre pela estimulação de vários locais como a substância cinzenta periaquedutal (SCPV), locus coeruleus (LC) e o bulbo raquidiano ventromedial rostral (BRVMR), que inclui o núcleo magno da rafe (NMR). Projeções diretas conectam o córtex pré-frontal e insular, o hipotálamo, a amígdala e o tronco cerebral à SCPV. Esta se liga ao NMR no BRVMR o qual, por sua vez, projeta-se para o corno dorsal da medula. O BRVMR é a maior fonte de neurônios do tronco cerebral para o corno dorsal, principalmente para as lâminas I, II e V (FIELDS; BASBAUM, 1999; URBAN; GEBHART, 1999). Deste modo, a estimulação da SCPV provoca excitação dos neurônios do BRVMR que, por sua vez, liberam neurotransmissores, como serotonina e encefalina, os quais vão inibir as respostas nociceptivas dos neurônios do corno dorsal, provocando assim uma diminuição das respostas à dor (BASBAUM; JESSEL, 2000). Existe também a via noradrenérgica proveniente do locus coeruleus, que possui como principal agonista a noradrenalina (FRITSCHY et al. 1987; CLARK; PROUDFIT, 1991). Esta exerce um efeito inibitório sobre a transmissão da dor no corno dorsal (BELCHER; RYALL; SCHAFFNER, 1978). O sistema modulatório descendente parece originar dois tipos de modulação: inibitória ou excitatória. A atividade excitatória pode ser desencadeada pelo glutamato, provavelmente por ativação do receptor NMDA e inibido por opióides, através de ativação do receptor µ. Quando ocorre uma despolarização prolongada ou repetitiva há aumento do influxo de cálcio na célula, estimulando a NO sintase. O NO é originado da L-arginina por ação da NO sintase. O aumento da produção do NO que age como segundo mensageiro, ativa as proteínas quinases responsáveis pela ativação dos canais iônicos AMPA e NMDA gerando despolarizações longas, e estimulando a liberação de mais glutamato, aumentando o período de ativação da sinapse. O aumento de cálcio e talvez do NO estimulam a QUEIROZ, R.B. Fundamentação Teórica 35 produção de proto-oncogenes, como (c-fos e c-jun) que ativam a transcrição de RNA mensageiro e controladores da síntese de proteínas. Estas são fundamentais para o funcionamento de neurônios como os receptores do glutamato, aumentando a densidade dos receptores e a sensibilidade ao glutamato em vigência de doença ou processo inflamatório crônico (Millan, 2002).Na Figura 3 está esquematizado o funcionamento da sinapse excitatória medular. Figura 3- Sinapse excitatória medular. APUD Luis Fernando de Oliveira. Master Dor organizado por Sérgio de Oliveira. São Paulo, 1998. Glutamato (Glu), substância P (sP), (NK), (Mcta), AMPA (ácido 2-amino-3-hidroxil-5-metil-4isoxazol propriônico), NMDA (N metil D aspartato), óxido nítrico (NO), fosfoquinase (PKC), RNA mensageiro (ARNm), cálcio (Ca), sódio (Na) 2.2.3 Tratamento farmacológico da dor Segundo Marquez (2004) os analgésicos representam uma das classes de fármacos mais vendidas no mundo. No ano de 2001 chegaram a segunda posição em vendas, perdendo apenas para as drogas anti-infecciosas. Se fossem somados aos analgésicos, os considerados analgésicos adjuvantes, seguramente seriam atingidos números muito acima do primeiro lugar em consumo e venda de fármacos no mundo. QUEIROZ, R.B. Fundamentação Teórica 36 O termo analgesia é empregado para o alívio ou o cessar da sensação dolorosa, sem, no entanto, ocorrer à perda da consciência. As substâncias capazes de causar analgesia são designadas analgésicos (ALMEIDA; OLIVEIRA, 2006a). Diversas classes de fármacos são amplamente utilizadas para o alívio da dor. Esses fármacos incluem os agonistas dos receptores opióides, os anti-inflamatórios nãoesteroidais (AINEs), os antidepressivos tricíclicos, os anticonvulsivantes, os antagonistas do receptor N-metil-D-aspartato (NMDA) e os agonistas adrenérgicos. Além disso, os agonistas dos receptores da 5-hidroxitriptamina tipo 1 (5HT1) possuem aplicações específicas no tratamento agudo da enxaqueca (GRIFFIN; WOOLF, 2009). Na prática clínica, utilizada na medicina humana e veterinária, a cetamina é uma droga dissociativa usada para fins de anestesia, com efeito hipnótico e características analgésicas em baixas doses, representa um dos poucos antagonistas NMDA disponíveis, apresentando propriedade analgésica não relacionada ao receptor NMDA, como a ativação do sistema inibitório descendente monoaminérgico, envolvidos na modulação de processos nociceptivos e geralmente ativados por opióides sistêmicos (LODGE; JOHNSON, 1990; PEKOE; SMITH, 1982). O efeito da cetamina (25 mg por via intranasal) foi estudada em 11 pacientes com grave e incapacitante auras resultantes da enxaqueca hemiplégica familial. Em cinco pacientes cetamina diminui a intensidade e duração do déficit neurológico, enquanto que nos restantes seis pacientes nenhum efeito benéfico foi observado. Cetamina ofereceu, pela primeira vez, uma opção de tratamento possível para a aura grave e prolongada (KALBE et al., 2000). Os agonistas α2-adrenérgicos através da estimulação dos seus respectivos receptores no corno dorsal da medula espinhal produzem um estado antinociceptivo. No caso da clonidina, ocorre ligação a nível pré-sináptico com as terminações nociceptivas Aδ e C reduzindo a liberação de neurotransmissores, e a nível póssináptico, pela hiperpolarização dos neurônios de segunda ordem dentro da medula espinhal (RATHMELL; LAIR; NAUMAN, 2005). Os analgésicos podem ser divididos, de maneira geral, em analgésicos periféricos, fármacos adjuvantes e os de ação central (BRAINER-LIMA, 1997; ALMEIDA; OLIVEIRA, 2006a). Os analgésicos periféricos são representados pelos anti-inflamatórios nãoesteroidais, também conhecidos por analgésicos não-opióides. Esses fármacos são QUEIROZ, R.B. Fundamentação Teórica 37 úteis no tratamento dos sinais e sintomas da inflamação, e para redução da agregação plaquetária. Embora sejam menos eficazes do que os opióides no alívio da dor, eles não causam tolerância nem dependência física. O mecanismo de ação dos antiinflamatórios não-esteroidais tradicionais envolve o bloqueio da produção de prostaglandinas pela inibição da enzima ciclooxigenase (COX) no local de lesão, diminuindo assim a formação de mediadores da dor no sistema nervoso periférico (WELCH; MARTIN, 2005). Dos anti-inflamatórios não esteroidais (AINES) os efeitos colaterais a serem lembrados estão a influência sobre a hemostase (inibição reversível sobre a COX), o risco de lesão da mucosa gástrica (risco moderado se o tratamento for inferior a 5 dias), alteração da função renal (aumento da resistência vascular renal, hipercalemia, retenção hidrossalina, risco elevado em pacientes hipovolêmicos) e o risco de indução de broncoespasmo, em pacientes asmáticos (SLULLITEL; SOUSA, 1998). O ácido acetilsalicílico (AAS) é um dos AINES mais importantes, visto que diminui a dor em locais predominantemente periféricos, com pouca interação cortical, apresentando consequentemente poucos efeitos sobre o SNC. Fazem ainda parte dessa classe de fármacos a indometacina, o piroxicam e o diclofenaco (WELCH; MARTIN, 2005). Fármacos que agem como adjuvantes no tratamento da dor e podem ser definidos como aqueles que não têm indicação analgésica primária, atuando como analgésicos em circunstâncias bem definidas. Os principais grupos desta classe incluem antidepressivos, anticonvulsivantes, ansiolíticos e antipsicóticos (REITAN, 1996; BRAINER-LIMA, 1997). Os antidepressivos tricíclicos são analgésicos adjuvantes efetivos em algumas condições dolorosas. O efeito deles é distinto daquele empregado nos distúrbios do humor, sendo indicados principalmente no tratamento da dor neuropática. O mecanismo de ação dos antidepressivos como analgésicos ainda não está bem esclarecido. A explicação padrão é que eles agiriam em áreas cerebrais moduladas pela serotonina e noradrenalina, que transmitem o estímulo doloroso pela medula espinhal. Essa explicação é insatisfatória, mas o fato é que os antidepressivos têm papel importante no alívio da dor crônica (McQUAY, 1997; MORAES; CAMARGO, 1999). QUEIROZ, R.B. Fundamentação Teórica 38 Outra classe de fármacos analgésicos adjuvantes são os anticonvulsivantes efetivos no tratamento de dores crônicas, a exemplo da carbamazepina, gabapentina, clonazepam e valproato de sódio, sendo esses dois últimos úteis na profilaxia da enxaqueca (McQUAY, 1995; ROTHROCK, 1997; MORAES; CAMARGO, 1999). Os ansiolíticos são adjuvantes no tratamento da dor por atuarem reduzindo a ansiedade, a insônia e também promovendo relaxamento muscular. Já os antipsicóticos atuam com funções analgésicas através de mecanismos de modulação da dor que levam à diminuição da excitabilidade neuronal, proporcionando sedação e analgesia (SAKATA; GOZZANI, 1994; TEIXEIRA et al., 1999, LIRA, 2001). Os opióides podem modificar tanto os aspectos sensitivos da dor quanto o emocional. Agem via ligação a receptores específicos no SNC e periférico, inibindo a nocicepção. O mecanismo de ação destas substâncias, no processo nociceptivo, ocorre pela interação com receptores opióides, levando ao fechamento de canais para Ca2+ voltagem-dependentes nas terminações nervosas présinápticas, o que reduz a liberação de neurotransmissores. Além disso, a ativação destes receptores leva à abertura de canais para K+, produzindo hiperpolarização da membrana celular de neurônios póssinápticos, reduzindo a liberação de neurotransmissores, a exemplo da substância P (DICKENSON, 1997; GRAEFF; GUIMARÃES, 2005). Três principais classes de receptores opióides foram identificadas em vários locais do SNC e em outros tecidos. Estas classes incluem receptores µ, κ e δ. Em nível molecular, todos são membros da família de receptores acoplados à proteína G, e, portanto, capazes de afetar a regulação iônica, o processamento do Ca2+ intracelular e a fosforilação de proteínas. Foi sugerida a existência de diversos subtipos de receptores opióides; atualmente, os mais caracterizados por critérios farmacológicos incluem µ1, µ2, δ1, δ2, κ1, κ2 e κ3 (WAY; FIELDS; SCHUMACHER, 2003). No quadro 1 estão listados alguns agonistas e antagonistas e suas respectivas atividades nos subtipos de receptores opióides. Outros tipos de receptores como os serotoninérgicos, GABAérgicos, glutamatérgicos e adrenérgicos estão envolvidos no processo de analgesia, sendo que esses receptores respondem ao tratamento com opióides (PINTO, 2000). O uso de fármacos opióides no tratamento da dor é limitado pela intensa quantidade de efeitos colaterais graves que essas substâncias causam nos pacientes. Dentre esses efeitos indesejáveis, merecem mais atenção a tolerância, dependências física e psíquica, além de náuseas e vômitos. QUEIROZ, R.B. Fundamentação Teórica 39 Quadro 1 – Seletividade de agonistas e antagonistas para os subtipos de receptores opióides AGONISTAS OPIÓIDES Morfina, codeína Meperidina Etorfina Sulfentanil, fentanil ANTAGONISTAS OPIOIDES Naloxona Naltrexona µ κ δ +++ ++ +++ +++ + + +++ - + + +++ + +++ +++ ++ +++ + + + apresenta atividade; ++ atividade moderada; +++ alta atividade; - sem ou atividade fraca. Fonte: RANG et al., 2007. p. [599] A tolerância é o estado no qual doses progressivamente maiores do fármaco são requeridas para manter o mesmo efeito analgésico. Desenvolver-se-á sempre, seja em maior ou menor velocidade, dependendo do opióide que esteja sendo utilizado. A dependência física está associada com a síndrome de abstinência quando se suspende o fármaco ou quando se usa um antagonista puro como a naloxona, levando o paciente a desenvolver sintomas e sinais em função dessa retirada de tratamento (DELGADO, 2000). A dependência psíquica é caracterizada por um desejo compulsivo pelo uso do opióide apresentado pelo indivíduo. Náuseas e vômitos ocorrem em até 40% dos pacientes quando tomam pela primeira vez morfina e esses efeitos não parecem ser separáveis do efeito analgésico opióide (RANG et al., 2007). 2.3 Antinocicepção e envolvimento dos canais para Na+ e K+ Os canais iônicos estão largamente envolvidos em vários mecanismos fisiológicos e patológicos. A compreensão do funcionamento, da estrutura e regulação desses canais leva ao entendimento de muitos processos fisiopatológicos. Dentre esses processos, pode-se citar a sensação dolorosa. QUEIROZ, R.B. Fundamentação Teórica 40 Os canais iônicos pertencem a uma família de proteínas que formam poros macromoleculares através de membranas lipoprotéicas e que se encarregam de controlar o fluxo de partículas carregadas eletricamente (íons) entre o meio interno e externo das células (HERNANDEZ; FÉLIX, 2001). Na maioria das células excitáveis, a corrente de entrada que dá início ao potencial de ação resulta da ativação dos canais para sódio regulados por voltagem (Nav). Até o momento foram identificadas pelo menos nove isoformas de Nav (WOOD et al., 2004). Os Nav são geralmente classificados em dois grandes grupos: os sensíveis à tetrodotoxina (TTX-S), que estão presentes nas fibras Aδ, em todo sistema nervoso e nos gânglios da raiz dorsal, e os resistentes à tetrodotoxina (TTX-R), que são encontrados especialmente nas fibras C do gânglio da raiz dorsal (LAI et al., 2002). Alterações na atividade ou expressão dos subtipos dos Nav, principalmente a excitabilidade, estão associados com a dor. Em particular, estados de dor crônica que envolvem também alterações na composição dos subtipos dos neurônios sensoriais (EKBERG, ADAM; 2006). Dados clínicos e experimentais indicam que a mudança na expressão dos Nav tem um papel fundamental na patogênese da dor neuropática e isso mostra que drogas que bloqueiam esses canais são alvos potencialmente terapêuticos (AMIR et al., 2006). Os bloqueadores dos Nav de interesse incluem os anestésicos locais, usados em doses baixas sem que prejudiquem a propagação do impulso nervoso ou a função cardiovascular, e os antidepressivos tricíclicos, cujo efeito analgésico pode estar envolvido pelo menos em parte com o bloqueio dos Nav, bem como os analgésicos centrais (MAO, CHEN, 2000; BURGESS et al., 2002). Enquanto o papel preciso dos Nav em estados de dor está para ser elucidado, é incontestável a importância desses canais na sensação dolorosa e como alvo para futuros fármacos dotados de atividade analgésica. Uma das funções mais marcantes dos canais para K+ está na manutenção do potencial de repouso da membrana de todas as células. No entanto, à medida que os estudos acerca desses canais se intensificam, novas funções são atribuídas a eles (HILLE, 2001). Vários estudos descritos na literatura demonstram o envolvimento de todos os tipos de canais de K+ no processo de antinocicepção. A abertura de canais para K+ e o consequente aumento da condutância a esse íon para o exterior da célula leva a QUEIROZ, R.B. Fundamentação Teórica 41 hiperpolarização celular, assim não ocorrendo a propagação do estímulo nociceptivo (RANG et al., 2007). Estudos eletrofisiológicos demonstraram que agonistas de receptores µ- e δ- opióides abrem canais para K+ retificadores de entrada em neurônios pela ativação de proteínas Gi/o. O primeiro estudo que sugeriu o envolvimento da abertura de canais para K+ na antinocicepção induzida por agonistas µ-opióide mostrou que a glibenclamida, um bloqueador de canais para K+, inibiu o efeito da morfina no teste da placa quente e retirada da cauda em roedores (OCAÑA; DEL POZO; BAEYENS, 1993; OCAÑA et al., 1990; 1995; 2004; ROANE; BOYD, 1993). Portanto, fármacos capazes de ativar canais para K+ são importantes em mediar a antinocicepção induzida por opióides. Drogas que agem em determinados canais para K+ induzem a antinocicepção por ativarem esses canais, dessa forma, representando importantes alvos para o desenvolvimento de novos agentes no tratamento da dor. Drogas que bloqueiam esses canais podem ter eficácia terapêutica em doses abaixo da que possa prejudicar a propagação do impulso nervoso ou a função cardiovascular. Portanto, o entendimento da relação dos canais iônicos com o processo nociceptivo pode levar a elaboração de fármacos analgésicos mais específicos e seguros, com poucos efeitos colaterais e melhor eficácia clínica. Objetivos QUEIROZ, R.B. Objetivos 43 III – OBJETIVOS 3.1 Geral: Estudar os efeitos psicofarmacológicos do derivado imidazolidínico 3-fenil-5-(4etilfenil)-imidazolidina-2,4-diona em camundongos, dando ênfase a investigação da atividade antinociceptiva. 3.2 Específicos: Determinar as ações do 3-fenil-5-(4-etilfenil)-imidazolidina-2,4-diona sobre os parâmetros da triagem farmacológica e toxicidade aguda. Investigar o efeito antinociceptivo decorrente do tratamento agudo com este derivado imidazolidínico, que possa ter indicação de atividade no SNC através de modelos animais; Contribuir para o aumento do conhecimento farmacológico acerca dos derivados imidazolidínicos em especial o 3-fenil-5-(4-etilfenil)-imidazolidina-2,4-diona, em camundongos. Material e Métodos QUEIROZ, R.B. Material 45 IV – MATERIAL 4.1 – Animais No desenvolvimento do presente estudo, foram utilizados camundongos (Mus musculus) machos albinos da linhagem Swiss, com 2 a 3 meses de idade, pesando entre 25 a 35 g (Figura 4), provenientes do Biotério Prof. Dr. Thomas George do Laboratório de Tecnologia Farmacêutica Prof. Delby Fernandes de Medeiros da Universidade Federal da Paraíba. No biotério, os animais foram alojados em gaiolas de polietileno, contendo 20 camundongos cada, mantidos sob condições monitoradas de temperatura equivalente a 21 ± 1º C, com livre acesso a uma dieta controlada a base de ração tipo pellets (Purina) e água disponível em garrafas de polietileno com bicos de inox, encaixadas na parte superior da grade metálica da gaiola. Os animais foram mantidos em ciclo claro/escuro de 12 horas, sendo a fase clara de 6:00 às 18:00 horas. Figura 4 – Camundongo Suiço macho e albino QUEIROZ, R.B. Material 46 4.1.1 Condições experimentais Os testes foram realizados no Biotério Prof. Dr. Thomas George, onde os camundongos foram previamente alojados em gaiolas de polietileno, contendo 4 animais cada (Figura 5), com pelo menos 60 minutos de antecedência à execução dos testes, visando minimizar as possíveis alterações comportamentais do animal decorrentes da mudança de ambiente, bem como permitir uma adaptação à sala de experimentação. Os camundongos foram mantidos a temperatura de 21 ± 1º C e privados de água e ração 60 min antes dos testes. Antes de cada procedimento, a bancada foi limpa com etanol 70%, entretanto, durante os testes foi utilizado etanol de baixa graduação (10%). Os experimentos foram executados no período compreendido entre as 08:00 e 17:00 horas, sendo os animais utilizados uma única vez e, em seguida, eutanasiados por deslocamento cervical. Todos os procedimentos experimentais foram analisados e previamente aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa Animal (CEPA) do LTF / UFPB, sob a certidão nº 0404/ 10 (anexo). Figura 5 - Camundongos em grupo de 4 animais no interior da gaiola. QUEIROZ, R.B. Material 47 4.2 Substâncias utilizadas 3-fenil-5-(4-etilfenil)-imidazolidina-2,4-diona (LTF/UFPB, Brasil); Ácido acético glacial (Reagen - Brasil); Água destilada (LTF/UFPB, BRASIL); Cloridrato de morfina (Merck, E.U.A.); Etanol (LTF / UFPB – Brasil). Formaldeído 37% (Vetec – Brasil); Tween 80 (polioxetileno sorbitano monoleato) (Vetec – Brasil); A preparação das doses foram realizadas minutos antes de sua utilização, sendo o composto dissolvido em água destilada usando como agente suspensor duas gotas de Tween 80 de forma a possibilitar a injeção de 0,1 mL/10 g de peso de camundongo. 4.3 Substância teste utilizada O composto sintético 3-fenil-5-(4-etilfenil)-imidazolidina-2,4-diona, obtido do aminoácido glicina, identificado também como IM-3 (LUIS et al, 2010), figura 6, utilizado nestes estudos psicofarmacológicos foram fornecidos pelo Laboratório de Síntese Orgânica sob a coordenação do Prof. Petrônio Filgueiras de Athayde Filho CCEN/UFPB. Figura 6. 3-fenil-5-(4-etilfenil)imidazolidina-2,4-diona (IM-3). C17H15N2O2 QUEIROZ, R.B. Material 48 4.4 Aparelhagem 4.4.1 - Aparelho de placa quente A placa quente (modelo 7406 – LE) permite avaliar a atividade de drogas antinociceptivas por meio de um aparelho cuja temperatura de sua placa, localizada na superfície superior, pode ser controlada entre 45 e 62 ºC, em incrementos de 0,1 ºC. Neste aparelho, um cronômetro acoplado é ativado por um pedal externo, que permitia a medida precisa do tempo de reação do animal ao estímulo térmico. Acoplado à placa, há um cilindro de acrílico transparente, que isola o animal para observação sobre o aparelho (Figura 7). Figura 7 – Aparelho de placa quente 4.4.2 Caixa de observação para o teste da formalina Este aparato é formado de um encaixe de metal que forma uma caixa triangular em ângulo de 45°, com os lados e altura medindo 25 cm cada, sendo duas paredes formadas por espelho e uma de vidro transparente, que dá ao observador um maior campo de visão (Figura 8A e 8B). QUEIROZ, R.B. . Figura 8A – Visão superior da caixa de observação para o teste da formalina Métodos 49 Figura 8B – Visão frontal da caixa de observação para o teste da formalina. V - MÉTODOS 5.1 ESTUDO PRELIMINAR DA ATIVIDADE SOBRE O SISTEMA NERVOSO CENTRAL E AUTÔNOMO DO IM-3 Na figura 9 encontra-se uma visão geral de todo um estudo psicofarmacológico, estando listada a avaliação da atividade antinociceptiva realizada com o IM-3. Inicialmente foram feitos os testes preliminares, que inclui a verificação da toxicidade e cálculo da DL50 como também realizando a triagem farmacológica comportamental, partindo em seguida para testes mais específicos para verificar a possível atividade analgésica. 5.1.1 Toxicidade Aguda A determinação da toxicidade aguda foi estimada através do cálculo da dose letal 50% (DL50) em camundongos pela via intraperitoneal, utilizando IM-3 nas doses de 400, 800, 1200, 2000, 3000 mg/kg de peso animal por via i.p. utilizando-se grupos de 10 animais, registrando-se durante 72 horas o número de animais mortos, QUEIROZ, R.B. Métodos 50 seguindo-se os procedimentos da metodologia descrita por Litchifield & Wilcoxon (1949). Dose letal 50% Triagem farmacológica comportamental Testes preliminares Atividade antinociceptiva Testes das contorções abdominais induzidas por ácido acético Testes específicos Atividade antinociceptiva central Teste da formalina Teste da placa quente Figura 9. Resumo esquemático do estudo psicofarmacológico do IM-3 em camundongos. 5.1.2 Triagem Farmacológica Comportamental A triagem farmacológica comportamental é uma metodologia preliminar para avaliar o possível efeito de uma droga no SNC e SNA, na qual são observados alguns parâmetros comportamentais no animal que possibilitam caracterizar o efeito QUEIROZ, R.B. Métodos 51 central da droga (ALMEIDA; OLIVEIRA, 2006b; ALMEIDA et al., 1999). Assim, esse modelo e a determinação da DL50 permitem avaliar se determinadas drogas ou extratos vegetais apresentam toxicidade, possibilitando o estudo farmacológico com uma determinada margem de segurança (ALMEIDA et al., 1999). Os experimentos foram realizados de acordo com o protocolo experimental descrito por Almeida e colaboradores (1999), adotado pelo Laboratório de Psicofarmacologia Prof. Dr. Elizaldo A. Carlini que investiga as influências sobre o SNC e SNA (Quadro 2). Os efeitos observados em cada período de tempo eram computados como ausente ou presente. Caso o efeito estivesse presente, um escore de intensidade era marcado com + (efeito aumentado) ou ++ (efeito intenso). Caso os comportamentos observados estivessem reduzidos ou ausentes, o efeito do extrato era computado como – (efeito diminuído) ou 0 (ausente). Foram utilizados camundongos machos (n = 10) separados em dois grupos, experimental (IM-3) e grupo controle (o veículo utilizado nas preparações – água e Tween 80 ). Foi escolhida a via i.p. e foram administradas as doses 400, 800, 1200, 2000, 3000 mg/kg de peso animal. Parâmetros comportamentais descritos no protocolo experimental (Quadro 2) foram observados durante as 4 primeiras horas nos intervalos de 30, 60, 120, e 240 minutos. A ocorrência de alterações comportamentais nos animais, em decorrência do tratamento com IM-3, permite inferir uma relação com a atividade no sistema nervoso central e, conseqüentemente, sinais de toxicidade. Os animais foram observados ainda a cada 24 horas até que se completasse um período de 72 horas com a finalidade de verificar se haveria alguma morte e, conseqüentemente, determinar a DL50 do IM-3 na via de administração empregada (i.p.). QUEIROZ, R.B. Métodos 52 Quantificação dos efeitos ATIVIDADE FARMACOLÓGICA (0) sem efeito, (-) efeito diminuído, (+) efeito aumentado, (++) efeito intenso até 30` 1h 2h 3h 4h 1 – SNC a – Estimulante Hiperatividade Irritabilidade Agressividade Tremores Convulsões Piloereção Movimento intenso das vibrissas Outras_____________________ b – Depressora Hipnose Ptose palpebral Sedação Anestesia Ataxia Reflexo do endireitamento Catatonia Analgesia Resposta ao toque diminuído Perda do reflexo corneal Perda do reflexo auricular c – Outros comportamentos Ambulação Bocejo excessivo Limpeza Levantar Escalar Vocalizar Sacudir a cabeça Contorções abdominais Abdução das patas do trem posterior Pedalar Estereotipia 2 - SN AUTÔNOMO Diarréia Constipação Defecação Respiração forçada Lacrimejamento Micção Salivação Cianose Tono muscular Força para agarrar 3 – MORTE Quadro 2 – Protocolo utilizado na triagem farmacológica comportamental. Fonte: ALMEIDA et al., 1999. QUEIROZ, R.B. Métodos 53 5.2. AVALIAÇÃO ESPECÍFICA DA ATIVIDADE SOBRE O SISTEMA NERVOSO CENTRAL E PERIFÉRICO DO IM-3 5.2.1. Estudo da Atividade Antinociceptiva 5.2.1.1. Teste das Contorções Abdominais Induzidas por Ácido Acético O teste das contorções abdominais induzidas por ácido acético é um método que se baseia no fato de que a injeção intraperitoneal da solução de ácido acético a 0,85% em camundongos provoca irritação nesta região, envolvendo a estimulação de nociceptores que gera reações comportamentais, sendo tal efeito nociceptivo caracterizado por contorções abdominais seguidas de extensões dos membros posteriores (KOSTER; ANDERSON; DEBBER, 1959). De um modo geral, as drogas com propriedades analgésicas reduzem ou mesmo inibem esse comportamento (COLLIER et al., 1968). Para este experimento cinco grupos de oito camundongos foram usados, sendo que três grupos receberam o pré-tratamento com o IM-3 nas doses de 50, 100 e 200 mg/kg, por via i.p., um grupo controle recebeu o veículo (água destilada + 2 gotas de tween 80) 0,1 mL/10 g por via i.p. e outro grupo recebeu morfina (6 mg/kg) por via i.p. que funcionou como padrão positivo. Trinta minutos após os tratamentos iniciais, os animais foram tratados com solução de ácido acético 0,85% em água destilada (0,1 mL/10 g) por via i.p. e colocados em caixas de polietileno individuais, cinco minutos depois, foi então registrado o número de contorções abdominais apresentado por cada animal durante um período de 10 minutos de observação. Uma redução significativa do número de contorções quando comparado ao grupo controle negativo é considerada uma resposta antinociceptiva (NARAYANAN et al., 2000; BASTOS et al., 2006). QUEIROZ, R.B. Métodos 54 5.2.1.2. Teste da Placa Quente Este teste, descrito por Eddy e Leimback (1953), representa uma modificação do modelo original de Woolfre e MacDonald (1944). Consiste em quantificar o tempo de reação do animal ao estímulo térmico de 50 ± 1ºC, quando é exibido o comportamento de levantar (tentativa de pular) ou lamber uma das patas (SILVA et al., 2005), sendo estas respostas indicativas de nocicepção (ALMEIDA; OLIVEIRA, 2006a). O estímulo térmico do teste da placa quente é utilizado para avaliar a atividade analgésica mediada por mecanismos centrais (AL-GHAMDI, 2001). Os animais foram submetidos a uma seleção prévia (sem administração de substâncias), na qual foram considerados aptos os animais que apresentaram resposta em até 15 segundos após terem sidos colocados na placa (leitura basal). Foram utilizados neste experimento cinco grupos de oito camundongos, sendo que três grupos foram tratados nas doses de 50, 100 e 200 mg/kg, por via i.p. com IM-3, um grupo controle que recebeu o veículo (água destilada + 2 gotas de tween 80) 0,1 mL/10 g por via i.p.e um grupo padrão foi tratado com morfina na dose de 10 mg/kg. Trinta minutos após o tratamento os animais foram colocados na placa quente, sendo registrado o tempo de latência, que é o tempo compreendido entre a colocação do animal na placa pré-aquecida e a tentativa do animal de saltar ou lamber uma das patas, sendo estas respostas indicativas de nocicepção. Este procedimento foi repetido com 30, 60 e 120 minutos após a administração. Os animais o permaneceram na placa por um tempo máximo de 30 segundos, para evitar a lesão tecidual (ALMEIDA; OLIVEIRA, 2006a). Figura 10 - Detalhe do camundongo no aparelho do teste da placa quente QUEIROZ, R.B. Métodos 55 5.2.1.3. Teste da Formalina O teste da formalina foi introduzido por Dubuisson e Dennis (1977), e posteriormente modificado para uso em camundongos por Hunskaar e Hole (1987). No entanto, este teste foi realizado como descrito por Vaz e colaboradores (1996), que é uma modificação do modelo de Hunskaar e Hole (1987). Nessa metodologia, uma solução de formalina é injetada na região subplantar do camundongo o que leva a estimulação dos nociceptores, sendo o tempo de lambida da pata do animal considerado indicativo de resposta nociceptiva (SOUZA et al., 2000). São observadas duas fase em que é quantificado o tempo de lambida da pata. A primeira fase, normalmente ocorre nos cinco primeiros minutos após a injeção da formalina e, provavelmente, é resultante da estimulação direta de nociceptores; a inibição dessa fase é indicativa de drogas analgésicas que atuam em nível central. Em seguida, há uma interfase de aproximadamente 10 minutos caracterizada por mecanismos inibitórios da dor. A segunda fase (15-30 minutos após o tratamento) é conhecida principalmente por uma resposta inflamatória, gerada tanto pela estimulação de nociceptores como pela liberação de mediadores inflamatórios (HUNSKAAR; HOLE, 1987). Figura 11 – Aspecto geral de um procedimento do teste da formalina. Neste experimento foram utilizados cinco grupos de oito camundongos, sendo dois grupos experimentais tratados nas doses de 50, 100 e 200 mg/kg, por via i.p., com IM-3, um grupo controle que recebeu o veículo e um grupo padrão foi QUEIROZ, R.B. Métodos 56 tratado com morfina na dose de 10 mg/kg. Após trinta minutos, 20 µL de solução de formalina 2,5% (0,92% de formaldeído diluído em solução salina) foram injetadas na região subplantar da pata posterior direita dos camundongos. Em seguida, esses animais foram colocados nas caixas de observação, sendo então registrado o tempo total de lambida da pata que recebeu a formalina durante cinco minutos (1ª fase). Após um período de 10 minutos, novamente foi registrado o parâmetro citado por mais 15 minutos (2ª fase). QUEIROZ, R.B. Análise Estatística 57 VI – ANÁLISE ESTATÍSTICA Os resultados obtidos foram analisados através de ANOVA, seguido do Teste de Dunnett. A determinação da dose letal 50% foi calculada por regressão nãolinear. Os dados numéricos foram aplicados no programa Graph Pad Prism versão 4,02. Os valores obtidos, exceto os da DL50, foram expressos em média ± erro padrão da média (e.p.m.), sendo os resultados considerados significativos quando apresentaram um valor de p < 0,05. Resultados QUEIROZ, R.B. Resultados 59 VII – RESULTADOS 7.1 TESTES PRELIMINARES 7.1.1 Determinação da dose letal 50% A administração do IM-3 em camundongos para a determinação da DL50, foi realizada nas doses de 400, 800, 1200, 2000, 3000 mg/kg, sendo possível preconizar as doses para os testes com segurança, evitando o desperdício de substância e animais. O IM-3 nas doses de 400 e 800 mg/kg não promoveu mortalidade dos camundongos. No grupo de animais tratado com 1200 mg/kg, foi observado 10% de mortes. Já o grupo administrado com 2000 mg/kg, 70% dos camundongos morreram, enquanto que, na dose de 3000 mg/kg registrou-se 100% de letalidade. Com tais resultados, foi possível calcular, por regressão não-linear, a DL50 do IM-3 em camundongos, por via i.p., sendo essa estimada em 1358,9 mg/kg com limite de confiança de 1000 – 1584,9 mg/kg. 7.1.2 Efeito do IM-3 na triagem farmacológica comportamental No quadro 3, estão registrados os principais efeitos da triagem comportamental, realizada com camundongos (n=8) tratados com IM-3 na dose de 50 mg/kg, 100 mg/kg e 200 mg/kg via i.p. aos 30, 60, 120, 180 e 240 minutos de observação. Na dose de 50 mg/kg foi verificado uma resposta de limpeza dos animais aos 240 minutos de observação e nenhuma alteração nos minutos anteriores. Com a dose de 100 mg/kg nenhuma alteração foi observada em relação ao controle, apenas um comportamento de limpeza aos 120 minutos. No tratamento com a dose de 200 mg/kg foi observado uma analgesia como resposta ao pinçamento da cauda até os 180 minutos de observação, como QUEIROZ, R.B. Resultados 60 anotou-se uma constipação e ambulação diminuída nos primeiros 60 minutos e comportamentos de limpeza dos 120 aos 240 minutos de observação. Quadro 3 – Efeito do IM-3 via i.p. na triagem farmacológica em camundongos; Tratamento Dose (mg/kg) via i.p. IM-3 50 IM-3 100 IM-3 200 Tempo de Observação Efeitos Comportamentais 30 min Sem efeitos. 60 min Sem efeitos. 120 min Sem efeitos. 180 min Sem efeitos. 240 min Limpeza*. 30 min Sem efeitos. 60 min Sem efeitos. 120 min Limpeza*. 180 min Sem efeitos. 240 min Sem efeitos. 30 min Constipação, analgesia**. 60 min Constipação; Ambulação diminuída.. 120 min Limpeza*, analgesia**. 180 min Limpeza*, analgesia**. 240 min Limpeza. * aumento da atividade motora ou ansiedade, possivelmente ** observada pela redução da resposta ao pinçamento da cauda. por estímulo externo. 7.2 TESTES ESPECÍFICOS 7.2.1 Estudo da atividade antinociceptiva 7.2.1.1 Efeito do IM-3 no teste das contorções abdominais induzidas por ácido acético No gráfico 1 estão registrados os efeitos da substância sintética IM-3 nas doses de 50, 100 e 200 mg/kg via i.p. sobre a latência no teste das contorções abdominais em camundongos (n=8). Apenas na dose de 200 mg/kg o IM-3 foi capaz QUEIROZ, R.B. Resultados 61 de aumentar significativamente a latência para o aparecimento das contorções abdominais em relação ao controle. Latência (s) 800 ** ** 200 Morfina 600 400 200 0 Controle 50 100 Tratamento (i.p.) Gráfico 1 – Efeito de IM-3 nas doses de 50, 100 e 200 mg/kg via i.p. sobre a latência no teste das contorções abdominais em camundongos (n=8). **p < 0,01 No gráfico 2 estão registrados os efeitos da substância sintética IM-3 nas doses de 50, 100 e 200 mg/kg via i.p. sobre o número de contorções no teste das contorções abdominais em camundongos (n=8). Nas doses de 100 e 200 mg/kg foi possível observar redução significativa no número de contorções em relação ao controle. QUEIROZ, R.B. Resultados 62 Número de contorções 50 25 * ** ** 200 Morfina 0 Controle 50 100 Tratamento (i.p.) Gráfico 2 – Efeito de IM-3 nas doses de 50, 100 e 200 mg/kg via i.p. sobre o número de contorções no teste das contorções abdominais em camundongos (n=8). *p < 0,05. **p < 0,01 7.2.2 Estudo da atividade antinociceptiva central 7.2.2.1 Efeito do IM-3 no teste da placa quente O gráfico 3 apresenta os efeitos da substância sintética IM-3 nas doses de 50, 100 e 200 mg/kg via i.p. sobre o tempo de permanência na placa quente em camundongos (n=8). Não houve registro de efeito antinociceptivo da IM-3 nas doses de 50, 100 e 200 mg/kg em relação ao controle. Tempo de permanência (s) QUEIROZ, R.B. Resultados 63 25 ** 20 * 15 * 10 Controle 50 mg/kg 100 mg/kg 200 mg/kg Morfina 5 0 0 30 60 90 120 Tempo de observação (min) Gráfico 3 – Efeito de IM-3 nas doses de 50, 100 e 200 mg/kg via i.p. sobre o tempo de permanência na placa quente em camundongos (n=8). * p < 0,05; **p< 0,01 7.2.2.2 Efeito do IM-3 no teste da formalina 7.2.2.2.1 Primeira fase Com base no gráfico 4, os camundongos tratados com 50, 100 e 200 mg/kg de IM-3 não demonstraram redução significativa do tempo de lambida da pata, na primeira fase do teste da formalina quando comparado ao grupo controle. Os animais do grupo padrão apresentaram uma diminuição do tempo de lambida da pata. QUEIROZ, R.B. Resultados 64 Primeira Fase Tempo de lambida da pata (s) 120 100 80 60 40 ** 20 g/ kg 0m M or 1 g/ kg IM -3 20 0m 0m g/ kg 10 IM -3 IM -3 C 50 m on tr o g/ kg le 0 Gráfico 4 – Efeito do IM-3 na primeira fase do teste da formalina em camundongos tratados via i.p. Os valores estão expressos em média ± e.p.m. (n=8), ** p<0,01 vs grupo controle (ANOVA - Teste de Dunnett). 7.2.2.2.2 Segunda fase Conforme os resultados apresentados no gráfico 5, o IM-3 diminuiu o tempo de lambida da pata na segunda fase do teste da formalina nas doses de 100 e 200 mg/kg, quando comparada ao grupo controle, sendo este comportamento similar ao observado com o grupo padrão. QUEIROZ, R.B. Resultados 65 Segunda Fase Tempo de lambida da pata (s) 200 160 120 * 80 * 40 ** g/ kg or 10 m M g/ kg IM -3 20 0m g/ kg 10 0m IM -3 IM -3 C 50 m on t g/ kg ro le 0 Gráfico 5 – Efeito do IM-3 na segunda fase do teste da formalina em camundongos tratados via i.p. Os valores estão expressos em média ± e.p.m. (n=8), * p<0,05; ** p<0,01 vs grupo controle (ANOVA - Teste de Dunnett). Discussão QUEIROZ, R.B. Discussão 67 VIII – DISCUSSÃO O interesse quanto ao estudo da atividade antinociceptiva do 3-fenil-5-(4etilfenil) imidazolidina-2,4-diona (IM-3) foi baseado por este composto ser um derivado imidazolidínico, além do fato de muitos destes derivados apresentarem atividades farmacológicas, sendo necessário iniciar os estudos submetendo-os a protocolos comportamentais utilizando roedores. Entre estes derivados, difenilhidantoína, denominada genericamente de fenitoína, é amplamente utilizada como o anticonvulsivante de escolha no tratamento das crises epilépticas (HARDMAN, et al., 1996) e também no tratamento da dor neuropática (BERTOLUCCI et al., 2011). A hidantoína foi descoberta por Baeyer, em 1861, enquanto pesquisava as reações do ácido úrico e corresponde ao 2,4-dicetotetra- hidro-imidazol, embora seja também denominada imidazolidina-2,4-diona. A primeira fórmula estrutural da hidantoína foi sugerida por Kolbe, em 1870, tendo sido modificada por Strecker, que, neste mesmo ano, propôs uma nova fórmula que é aceita até hoje. A partir dessa época, o sistema anelar hidantoínico tem sido intensivamente estudado tanto no tocante aos aspectos químicos, quanto biológicos (OLIVEIRA, et al., 2008). A substituição dos átomos de oxigênio carbonílicos da hidantoína por átomos de enxofre origina três tio-derivados: a 2- tio-hidantoína (2-tioxo-imidazolidin-4-ona), a 4 tiohidantoína (4-tioxo-imidazolidin-2-ona) e a 2,4-ditiohidantoína (imidazolidina-2,4ditiona) (OLIVEIRA, et al., 2008). Derivados da glicina têm despertado considerável atenção, nos últimos anos, devido ao fato de serem, potencialmente, inibidores de diversas enzimas ou parte de substâncias peptidiomiméticas de importância farmacológica, e também podem ser atuantes na inibição de outros processos bioquímicos. A glicina é o principal neurotransmissor inibidor do tronco cerebral e medula espinhal. Tem também propriedades excitatórias, uma vez que se ligando ao receptor NMDA, aumenta a sua sensibilidade para o glutamato. Não é sintetizada pelo organismo e tem origem da dieta. A sua inativação dá-se por recaptação neuronal (RANG, et al, 2007). Os derivados imidazolidínicos apresentam muitas atividades farmacológicas úteis: atividade fungicida, bactericida, hipoglicemiante, anti-inflamatória, QUEIROZ, R.B. Discussão 68 anticarcinogênica, antiviral, atividade antiúlcera, anti-hipertensiva, antileishmaniose, tripanossomicida e ansiolítica. A fenitoína (5,5-difenil-hidantoína), já utilizada como medicamento por suas ações antiarrítimica cardíaca e centrais como anticonvulsivante no tratamento da epilepsia (VIDA et al., 1975; BATEMAN, 1980; CORTES et al., 1985), especificamente de convulsões parciais e tônico-clônicas, mas não nas crises de ausência. Sua atividade antiepilética é, principalmente, associada ao bloqueio dos canais de sódio (OLIVEIRA, et al., 2008). No que se refere à ação no sistema nervoso, são conhecidas também diversas atividades biológicas, tanto nas hidantoínas, como nas tio-hidantoínas (OLIVEIRA, et al, 2008). Por exemplo, autores, descobriram que a 2,4-ditio-5,5-dimetil hidantoína possuía ação hipnótica (HENZE; SMITH, 1943). Este composto revelou também atividade anticonvulsivante superior à 5,5-dimetil-hidantoína. Outros trabalhos também demonstraram que derivados 2-tioxo-imidazolidina-4,5-dionas possuíam atividade anticonvulsivante (SINGH; AUYONG; PARMAR, 1974). Novas hidantoínas substituídas, como 4-hidróxi-2-imidazolidinonas, 2-imidazolonas, 2-imidazolidinonas, diaminas vicinais e derivados de aminoácidos, foram sintetizadas e avaliadas quanto à atividade anticonvulsivante por Cortes e colaboradores (1985). Estes estudos demonstraram que a seqüência de átomos N-CC-N-C presente nas hidantoínas era essencial para esta neuroatividade. Anteriormente outros autores tinham verificado que compostos que continham a estrutura 2-tioxo-imidazolidina-4,5-diona apresentavam atividade sedativa (DANIELSON; SUNDELL, 1965). A partir desses estudos, foi sintetizado e testado a atividade hipnótico-sedativa dos derivados 2-tioxo-imidazolidina-4,5-dionas, tendo o composto 1- (benzilideno-amino)-3-ciclo-hexil-2-tioxo-imidazolidina-4,5-diona apresentado maior atividade (OZKIRIMLI; HAMALI, 1995). Karali e colaboradores, em 1998, obtiveram derivados com atividade anticonvulsivante, onde o composto 1-alil-3-(2-oxo-1,2- diidro-indol-3-ilidenoamino)2-tioxo-imidazolidina-4,5-diona foi identificado como o mais potente. A influência das características estruturais e da lipofilicidade de derivados hidantoínicos sobre a atividade anticonvulsivante foi investigada por Scholl e colaboradores, em 1999. As lipofilicidades de 75 hidantoínas determinadas experimentalmente por RP-HPLC foram correlacionadas com valores estimados teoricamente a partir de estruturas obtidas por modelagem molecular. Foi então proposto um modelo farmacofórico para a interação dos derivados hidantoínicos com o QUEIROZ, R.B. Discussão 69 canal de sódio, envolvendo um aromático, um sítio aceptor e um sítio doador de ligação de hidrogênio fazendo parte de um sistema quiral de três pontos. Com o intuito de investigar a importância do anel hidantoínico como bloqueador de canais de sódio, Zha e colaboradores em 2004 avaliaram as afinidades de ligação ao canal de sódio dependente de voltagem neuronal de compostos não-hidantoínicos, como hidróxiamidas, oxazolidina-dionas, hidróxiácidos e aminoácidos. Os resultados demonstraram que o anel hidantoínico é relativamente importante para compostos com pequenas cadeias laterais, sendo, portanto, menos relevante para compostos com longas cadeias hidrofóbicas. Um outro aspecto relevante, é que são observadas duas regiões farmacofóricas hidrofóbicas, o que está de acordo com o modelo de Khodorov de 1981 e uma terceira região hidrofóbica adicional pode aumentar a eficiência da interação e fornecer inibidores mais potentes. Em 1999, Kanyonyo e colaboradores, sintetizaram e avaliaram 24 derivados 3alquil-5,5-difenil-imidazolidina-2,4-diona como ligantes de receptores canabinóides e concluíram que alguns derivados exibiram afinidade superior ao composto aminoalquil-indol de referência. Adicionalmente, foram evidenciadas as suas propriedades antagonistas ao receptor canabinóide CB1. Posteriormente, derivados 3-substituídos5,5-difenil da imidazolidina-2,4-diona e da 2-tioxo imidazolidin-4-ona, já descritos previamente como ligantes de receptores canabinóides CB1, foram avaliados por Muccioli e colaboradores, em 2006 , como inibidores da enzima FAAH (Fatty Acid Amide Hydrolase); observou-se que os derivados da 2-tioxo-imidazolidin-4-ona são mais potentes que os derivados oxo correspondentes. Estes derivados atuam como inibidores competitivos da FAAH, sem ser hidrolisados pela enzima. Dentre eles, o composto 5,5-difenil-tetradecil-2-tioxo-imidazolidin-4-ona apresentou a mais alta atividade frente à enzima FAAH. Pesquisa prévia realizada no laboratório de psicofarmacologia (LTF/UFPB) no trabalho de Iniciação Científica de André Silveira Pinho indicou um possível efeito antinociceptivo do IM-3, além de outros estudos em andamento com outros derivados imidazolidínicos com ação no SNC, foram determinantes na justificativa para concretização deste estudo. O presente estudo consistiu na determinação da DL50, triagem farmacológica comportamental, e testes específicos para avaliar a atividade antinociceptiva. A determinação da DL50 foi realizada da seguinte forma: os animais receberam as doses de 400, 800, 1200, 2000 e 3000 mg/kg i.p. e foram submetidos à avaliação de QUEIROZ, R.B. Discussão 70 efeitos sugestivos de atividade sobre o SNC e/ou SNA (ALMEIDA, 1999), os animais foram mantidos sobre observação por um período de 72 h para contabilização do número total de mortes. As cinco doses citadas foram utilizadas para a determinação da dose letal 50%. A DL50 do IM-3 por via i.p. foi de 1358,9 mg/kg com limite de confiança de 1000 – 1584,9 mg/kg. A determinação da toxicidade aguda (DL50) teve o objetivo de avaliar os seus possíveis efeitos tóxicos, e estabelecer doses seguras que poderiam ser utilizadas nos ensaios subsequentes, evitando assim que doses tóxicas pudessem ser administradas e os efeitos observados não fossem fidedignos em relação à real ação psicofarmacológica da substância em estudo. Em todos os experimentos comportamentais, com exceção da avaliação da toxicidade aguda (DL50), as doses de 50, 100 e 200 mg/kg foram testadas. A triagem farmacológica comportamental é um teste preliminar de fácil execução e capaz de detectar, de forma qualitativa, algumas importantes ações centrais (ALMEIDA et al., 1999). Neste teste, as doses de IM-3 citadas acima provocaram alterações comportamentais sugestivas de substâncias que reduzem a atividade do SNC, entre elas, a diminuição da ambulação e antinocicepção/analgesia. A diminuição da ambulação em camundongos é talvez a forma mais comum de verificar se uma substância analisada apresenta efeito depressor do SNC, porém, é muito temerário utilizar apenas esse parâmetro para classificar uma droga. A sedação é um grau de depressão do SNC que se caracteriza por sonolência, relaxamento, serenidade e diminuição da atividade motor, sem perda de consciência. Diminuição da resposta ao toque consiste na demora da reação do animal quando submetidos a estímulos apropriados, podendo indicar um estágio elevado de depressão do SNC. Uma redução da resposta a estímulos mecânicos sugere uma atividade antinociceptiva ou analgésica. (ALMEIDA; OLIVEIRA, 2006). Como foi observado um possível efeito depressor do SNC na triagem farmacológica, a partir de então, seguiu-se a avaliação da atividade específica do tipo antinociceptiva do IM-3. Em um artigo de revisão (ALMEIDA et al., 2001) envolvendo a atividade analgésica de plantas estudadas e publicadas nas revistas Phytomedicine, Fitoterapia, Planta Médica, Journal of Etnopharmacology e Phytotherapy Research, mostrou que mais de 66 trabalhos foram publicados, abordando o uso de extratos obtidos de plantas, em roedores, e para avaliar a atividade analgésica, 42,1% dos trabalhos utilizaram as contorções abdominais induzida por QUEIROZ, R.B. Discussão 71 ácido acético, 18,7 % dos trabalhos o teste da formalina e 17,9 % utilizaram o teste da placa quente (CARLINI et. al., 2003). Com base nas considerações acima, neste estudo, a atividade antinociceptiva do IM-3 foi primeiramente avaliada pelo modelo das contorções abdominais, que é simples, rápido e confiável para avaliar a atividade antinociceptiva de substâncias (SHINDE, et al., 1999) e é caracterizado por ser uma metodologia de alta sensibilidade, sendo sensível a drogas centrais e periféricas (VAZ et al., 1996; VOGEL; VOGEL, 1997; RAMEZANI; HOSSINZADEH; DANESHMAND, 2001). O modelo químico de nocicepção de contorções abdominais em camundongos baseia-se na contagem das contorções da parede abdominal, seguidas de torção do tronco e extensão dos membros posteriores, como resposta à irritação peritoneal e à peritonite produzidas pela injeção intraperitoneal de ácido acético. (WHITTLE, 1964). Alguns autores descreveram a quantificação de prostaglandinas por radioimunoensaio no exsudato peritoneal de ratos, obtidos após injeção intraperitoneal de ácido acético, onde foram observados altos níveis de prostaglandinas PGE2α e PGF2α durante os primeiros 30 minutos após a sua administração (DERAEDT et al.,1980). A administração intraperitoneal de ácido acético induz à liberação de prostaglandinas, mas também a liberação de mediadores (aminas – norepinefrina e acetilcolina) do SNC (DUARTE; NAKAMURA; FERREIRA, 1988; BORSATO et al., 2000). Desta forma, tanto as substâncias com atividade anti-inflamatória, como os anticolinérgicos ou os anti-adrenérgicos podem estar envolvidos na atividade analgésica periférica (FERREIRA et al., 2003). Os resultados mostraram que neste modelo de nocicepção o IM-3 foi capaz de diminuir, de maneira dose dependente, o número de contorções abdominais nas três doses testadas, 50, 100, 200 mg/kg, quando comparada ao grupo controle, de forma semelhante à droga padrão opióide, a morfina. Resultado similar foi obtido com o fármaco imidazolínico rilmenidina que mostrou atividade antinociceptiva em camundongos no teste das contorções abdominais pela primeira vez (ROMAN, A. A. S. R., 2004). A rilmenidina é um fármaco imidazolínico que também possui atividade agonista no receptor ∝2 adrenérgico e tem sua estrutura relacionada com a clonidina (VAN ZWIETEN et al.,1986; FELDMAN et al., 1990), parece não compartilhar das propriedades sedativas dos agonistas ∝2–adrenérgicos como a clonidina, ∝- metildopa e QUEIROZ, R.B. Discussão 72 dexmedetomidina (VAN-ZWIETEN et al.,1986). Talvez a possível explicação para tal fato, se deva a maior afinidade da rilmenidina por receptores imidazolidínicos no núcleo reticular lateral da medula oblonga ventro-lateral, e por possuir menor afinidade por neurônios do locus coeruleus (BOUSQUET; FELDMAN; SCHWARTZ,1984; BRICCA et al., 1989; Feldman et al., 1990). Existem evidências de que a rilmenidina possa se ligar à sítios específicos no sistema nervoso central denominados de receptores imidazolínicos (BOUSQUET; FELDMAN; SCHWARTZ,1984; BOUSQUET, 2000). Embora as contorções abdominais induzidas pelo ácido acético representem um modelo de nocicepção periférico (WEI et al., 1986), este não é um modelo específico, pois os analgésicos opióides (FRANÇA et al., 2001; GONZALES et al., 2001), antidepressivos tricíclicos (TAKAHASKI; PAZ, 1987), anti-histamínicos (YEH et al., 1985), além das substâncias já mencionadas, também inibem as contorções induzidas por ácido acético. Apesar do IM-3 reduzir a quantidade de contorções, foi necessário a utilização de outros modelos de nocicepção para reforçar e melhor caracterizar tais efeitos. Consequentemente, foram utilizados os testes mais específicos, sendo eles o teste da formalina e da placa quente. O teste da formalina é um modelo químico de nocicepção que fornece uma resposta mais específica em comparação ao modelo do ácido acético (SHIBATA,et al., 1989), além de ser considerado, atualmente, o modelo que mais se aproxima da dor clínica (TJÖLSEN; HOLE, 1997). A principal característica desse teste é o fato de que o animal apresenta duas fases diferentes de nocicepção, que parece envolver estímulos distintos. A primeira fase inicia-se imediatamente após a injeção de formalina e estende-se pelos primeiros 5 minutos (dor neurogênica ou aguda), estando relacionada com a estimulação química direta dos nociceptores das fibras aferentes do tipo C e em parte das fibras do tipo Aδ, ela está associada à liberação de aminoácidos excitatórios, óxido nítrico e substância P, entre outros. A segunda fase ocorre entre 15 e 30 minutos após a injeção de formalina e está relacionada com a liberação de vários mediadores próinflamatórios, como a bradicinina, prostaglandinas e serotonina, entre outros (HUNSKAAR; HOLE, 1987). Drogas que atuam em nível central, tais como analgésicos opióides, inibem ambas as fases do teste da formalina, entretanto, drogas de ação periférica como os QUEIROZ, R.B. Discussão 73 antiinflamatórios somente são eficazes na segunda fase (SANTOS et al., 1994; FARSAM et al., 2000; ADEYEMI; OKPO; OKPAKA, 2004). Segundo HUNSKAAR e HOLE (1987), tanto antiinflamatórios não-esteroidais quanto os corticosteróides agem na segunda fase da formalina, a exemplo do AAS, indometacina e dexametasona (RUJJANAWATE; KANJANAPOTHI; PANTHONG, 2003). As três doses de IM-3 utilizadas no teste da formalina (50, 100, 200 mg/kg) não promoveram como as drogas de ação central, a exemplo da morfina, uma diminuição do tempo de lambida na primeira fase do teste. (gráficos 4). As doses de 100 e 200 mg/kg diminuíram o tempo de lambida da pata na segunda fase do teste da formalina sendo este efeito indicativo de uma ação anti-inflamatória do IM-3 (gráfico 5). Esses resultados, mesmo somado ao obtido no teste das contorções abdominais, não são conclusivos para indicar que o efeito antinociceptivo do IM-3 apresenta um possível componente central. Para investigar um envolvimento do IM-3 em estruturas centrais, foi realizado o teste da placa quente. Neste teste, utiliza-se a temperatura como estímulo nociceptivo. Este modelo foi descrito inicialmente por WOOLFE e MACDONALD (1944) e é um teste seletivo para detecção de substâncias analgésicas com efeito central (ANKIER, 1974). Em 1997 os autores Dickenson e Besson descreveram que este teste caracteriza-se por produzir uma resposta rápida ao estímulo nocivo, mediada pela ativação dos nociceptores (fibras C e Aδ), conduzindo o impulso ao corno dorsal da medula espinhal e posteriormente aos centros corticais, sendo que a resposta é proporcional à freqüência e classe de fibras responsáveis pela mensagem. Estas fibras são estimuladas após a ativação de receptores, entre eles os receptores vanilóides, especificamente o receptor do tipo VR-1 (limiar de ativação = 43ºC) e receptor do tipo VRL-1 (limiar de ativação = 52ºC), que são responsáveis pela resposta ao aumento na temperatura, sendo que os receptores VRL-1 são mais importantes na medição da resposta a estímulos térmicos nocivos (JULIUS; BASBAUM, 2001). As mesmas doses de IM-3 utilizadas no teste da formalina (50, 100, 200 mg/kg) foram avaliadas na placa quente e todas não promoveram um aumento na latência de resposta ao estímulo térmico (50ºC ± 1) no aparelho, após 30 minutos de suas administrações. Este estudo não apresentou resultados em metodologias comportamentais específicas de ação central, baseadas em estímulos nocivos químicos e térmicos (formalina e placa quente), embora, nestas metodologias específicas os mecanismos QUEIROZ, R.B. Discussão 74 de ação central envolvidos nesta atividade permanecem desconhecidos. Os sistemas opióide, serotoninérgico, adrenérgico, entre outros, são alguns dos possíveis alvos de atuação, sendo necessários mais estudos com ferramentas farmacológicas apropriadas, que levem à elucidação de tais mecanismos. Em resumo, os resultados obtidos no presente trabalho demonstram que o composto sintético 3-fenil-5-(4-etilfenil)-imidazolidina-2,4-diona (IM-3) não apresenta perfil de substância com atividade antinociceptiva do tipo central. Entretanto por apresentar resultados em metodologias comportamentais não específicas (contorções abdominais induzidas pelo ácido acético e teste da formalina), esta substância pode correlacionar-se com uma possível atividade anti-inflamatória, anticolinérgica ou anti-adrenérgica que pode estar envolvida na atividade analgésica periférica. Os resultados obtidos neste trabalho são um estímulo para continuarmos a testar o IM-3 em outros testes psicofarmacológicos. Conclusões QUEIROZ, R.B. Conclusões 76 IX – CONCLUSÕES Diante dos resultados obtidos no presente estudo, conclui-se que o composto sintético 3-fenil-5-(4-etilfenil)-imidazolidina-2,4-diona (IM-3) nas doses utilizadas por via intraperitonial em camundongos: Promoveu alterações comportamentais semelhantes às de drogas depressoras do SNC observadas durante a triagem farmacológica comportamental; Possui significativo efeito antinociceptivo e/ou anti-inflamatório, considerando o fato de o IM-3 ser efetivo na redução do número de contorções abdominais induzidas pelo ácido acético; Apresenta efeito analgésico periférico do tipo anti-inflamatório observado na segunda fase do teste da formalina, em que há uma resposta inflamatória, gerada tanto pela estimulação dos nociceptores como pela liberação de mediadores inflamatórios. Perspectivas QUEIROZ, R.B. Perspectivas 78 X – PERSPECTIVAS Baseado nos resultados apresentados e nas conclusões obtidas no presente estudo da ação psicofarmacológica do IM-3 surgiram perspectivas futuras para complementar a caracterização das propriedades farmacológicas deste sintético bioativo, entre elas: Detalhar o estudo da atividade antinociceptiva, em outros testes psicofarmacológicos para se obter dados sobre a via envolvida nesta atividade do IM-3; Aprofundar o estudo através do uso de metodologias ainda mais específicas que possam investigar com detalhes outros efeitos ansiolítico-sedativos; anticonvulsivante e antiparkinsoniano; Realizar estudos crônicos para avaliar o efeito do IM-3 a longo prazo, bem como, melhor caracterizar possíveis efeitos tóxicos nesse período. Referências QUEIROZ, R.B. Referências 80 REFERÊNCIAS ADEYEMI, O. O.; OKPO, S. O.; OKPAKA, O. The analgesic effect of the methanolic extract of Acanthus montanus. Journal of Ethnopharmacology, v. 90, p. 45-48, 2004. 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