Diagnóstico Laboratorial de Viroses
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Importância do diagnóstico laboratorial virológico Determinar a etiologia e acompanhar o curso de uma infecção viral Avaliar a eficácia do tratamento antiviral Diferenciar viroses com sintomas semelhantes Triagem de infecções virais em bancos de sangue Diagnosticar doenças congênitas Determinar o prognóstico ou a conduta a ser tomada com o paciente Estudos epidemiológicos Ameaça da emergência de infecções virais para a saúde pública Vírus Ebola Vírus Zyka Vírus da febre amarela Vírus Chikungunya Vírus MERS CoV Rapidez de disseminação e associação com complicações graves Importância do diagnóstico laboratorial: • Etapa fundamental para o controle das epidemias • Confirmação laboratorial necessária em virtude da similaridade de muitas de eventos clínicos e epidemiológicos de muitas doenças infecciosas Diagnóstico Laboratorial de Viroses MÉTODOS DIRETOS • Isolamento viral • Detecção de antígenos virais • Detecção do genoma viral MÉTODOS INDIRETOS • Pesquisa de anticorpos específicos (sorologia) 3 Onde procuramos os vírus ou os anticorpos formados contra eles ? 4 5 Escolha da amostra biológica: Vias de entrada Trato Aparelho respiratório respiratório Nariz e boca Conjuntiva Conjuntiva Ferida Trato Aparelho digestivo Trato Aparelho urogenital urogenital Artrópode Capilares Ânus Pele Pele Obtenção da amostra apropriada • Etapa mais importante do diagnóstico laboratorial : requer o conhecimento da cinética viral nos vários tipos de espécimes com relação ao tempo desde o início dos sintomas Precisa saber não somente o que coletar como quando coletar. Escolha da amostra biológica para diagnóstico Infecções respiratórias, urogenitais e oculares SECREÇÕES CORPORAIS Infecções entéricas FEZES Infecções dérmicas, biópsias TECIDOS Qualquer infecção SANGUE Infecções do SNC LIQUOR Secreções corporais Secreção nasal/orofaringe, esperma, secreção vaginal, secreção uretral Coleta pela raspagem de superfícies mucosas com swabs Tecidos Obtenção por biópsia ou raspagem de lesões (verrugas, vesículas) Incluídos pela parafina Congelados Fezes e urina 11 Sangue e líquidos corporais Coleta de sangue por punção venosa Coleta de líquor por punção lombar Métodos de diagnóstico laboratorial MÉTODOS DIRETOS Isolamento viral Isolamento viral Sistemas celulares:: Vantagens: alta sensibilidade, método padrão de diagnóstico, permite a detecção de um vírus desconhecido Desvantagens: método lento, alto custo e realização complexa Isolamento viral em cultivo celular • Exemplo: Investigação do vírus da poliomielite em um caso de paralisia flácida aguda Amostra biológica Isolamento viral: metodologia 1. Tratamento de amostras biológicas 2. Inoculação em cultura celular em fluxo laminar 3. Reconhecimento da replicação viral (efeito citopático) A, Células Vero não infectadas. B, após infecção por poliovírus, mostrando a perda da monocamada 3. Confirmação do vírus isolado A confirmação da identidade viral pode ser realizada por testes imunológicos (imunofluorescência, ELISA) ou técnicas moleculares Elisa PCR IF Métodos de diagnóstico laboratorial MÉTODOS DIRETOS Detecção de antígenos virais: IF ELISA Para pesquisar um antígeno é preciso ter... O anticorpo correspondente E como fazemos pra enxergar a reação Ag/Ac ? Marcando esse anticorpo IMUNOFLUORÊSCENCIA Exemplo: Diagnóstico de raiva Raiva humana Transmitida principalmente partir de caninos, felinos, macacos (saguis) e quirópteros. O diagnóstico laboratorial pela pesquisa do vírus no tecido nervoso de animais com suspeita da raiva é de fundamental importância para o tratamento profilático humano pósexposição, mediante a aplicação de imunobiológicos específicos, e para a adoção de medidas visando ao controle da doença nas populações de animais domésticos Método de diagnóstico laboratorial: Imunofluorescência direta Imunofluorescência (IF) 1. Adição da amostra teste (Ag) na lâmina de IF 2. Adição do anticorpo específico marcado Observação da fluorescência no microscópio 23 ENSAIO IMUNOENZIMÁTICO Exemplo: Triagem de portadores de hepatite B Hepatite B • Atualmente, a transmissão via transfusão de sangue e hemoderivados do vírus da hepatite B (HBV) é rara em face da triagem sorológica obrigatória nos bancos de sangue (desde 1978). • A triagem do HBV se baseia na pesquisa do antígeno de superfície deste vírus (HBsAg) em amostras de soro. • Método de diagnóstico laboratorial: ELISA direto Ensaio imunoenzimático (ELISA): 1. Adição da amostra teste (Ag) em cavidade de placa contendo o anticorpo específico 2. Adição de anticorpo marcado com uma enzima 3. Adição do substrato da enzima em solução cromógena com desenvolvimento de cor 26 Métodos de diagnóstico laboratorial MÉTODOS DIRETOS Detecção do genoma viral: Hibridização molecular PCR Hibridização in situ Exemplo: Diagnóstico do HPV Papilomavírus • A infecção causada pelo Papilomavírus Humano (HPV) representa a virose sexualmente transmissível mais prevalente no mundo • O diagnóstico do HPV se baseia na pesquisa do genoma viral em biópsia cervical (tecido parafinizado) • Método de diagnóstico laboratorial: Hibridização in situ Para pesquisar uma sequência nucleotídica em células de um tecido é preciso ter... E como fazemos pra enxergar a formação do híbrido ? 1. Marcando a sonda (p.ex. enzima) 2. Adicionando em seguida o substrato em solução cromógena: desenvolvimento de cor A sequência nucleotídica complementar (sonda) Reação em cadeia da polimerase (PCR) Exemplo: Diagnóstico de hepatite C Hepatite C • O diagnóstico inicial da infecção pelo vírus da hepatite C é feito pela pesquisa de anticorpos para o vírus por ELISA no soro • Por outro lado, a pesquisa do genoma do vírus da hepatite C (HCV) no soro é necessária para confirmar a infecção corrente pelo vírus em casos agudos e crônicos como também para monitorar a resposta ao tratamento Para amplificar uma sequência nucleotídica é preciso ter... Todos os componentes necessários para fazer o DNA Amplificação do genoma viral pela PCR • Amplificação exponencial in vitro de uma sequência específica do genoma viral pelo uso de uma polimerase termoestável em uma reação termocíclica Visualização do fragmento de DNA amplificado em gel de agarose 34 Métodos de diagnóstico laboratorial Pesquisa de anticorpos (sorologia) MÉTODOS INDIRETOS Anticorpos importantes no controle da infecção viral: IgM: marcador de infecção aguda diagnóstico de infecção congênita IgG: imunidade passada resposta vacinal IgA: imunidade de mucosa (trato respiratório, trato gastrointestinal) www.panbio.com.au Pesquisa de anticorpos para fins de diagnóstico viral Pesquisa de IgM Pesquisa de IgG Diagnóstico de infecções agudas recentes: mononucleose infecciosa, hepatite A, hepatite B, rubéola, dengue Investigação de infecção passada: pré-natal (CMV, EBV, rubéola, hepatite B, HIV), resposta vacinal (HBV), ou infecção crônica (HIV, HCV)
