“Estudo de Tecido Mamário Humano por Espectroscopia FT
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Universidade do Vale do Paraíba Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento “Estudo de Tecido Mamário Humano por Espectroscopia FT-Raman” Renata Andrade Bitar Carter Dissertação apresentada Graduação como no em de Mestrado Programa Engenharia complementação de Pós- Biomédica dos créditos necessários para obtenção do título de Mestre em Engenharia Biomédica. São José dos Campos, SP 2004 Universidade do Vale do Paraíba Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento “Estudo de Tecido Mamário Humano por Espectroscopia FT-Raman” Renata Andrade Bitar Carter Dissertação apresentada Graduação como no em de Mestrado Programa de Engenharia complementação Pós- Biomédica dos créditos necessários para obtenção do título de Mestre em Engenharia Biomédica. Orientador: Prof. Dr. Airton Abrahão Martin. Co-orientador: Prof. Dr. Carlos Julio T.Criollo São José dos Campos, SP 2004 À minha Família. Agradecimentos Ao Reitor da Universidade do Vale do Paraíba, Prof. Dr. Baptista Gargione Filho. Ao Diretor do Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento da Universidade do Vale do Paraíba, Prof. Dr. Marcos Tadeu Tavares Pacheco, pela oportunidade e pelo apoio oferecido durante o mestrado. Ao Prof. Dr. Airton Abrahão Martin pela oportunidade, pela confiança em mim depositada neste grande projeto, pelo apoio intelectual e paciência durante o decorrer deste trabalho. Ao Prof. Dr. Mário Mourão Netto pela dedicação na coleta das Amostras deste projeto. À Profa. Dra. Leandra Naira Zambelli Ramalho pelo apoio intelectual e grande entusiasmo na análise histopatológica das Amostras. Ao Prof. Dr. Carlos Julio Criollo pela disposição no esclarecimento das dúvidas, pelo apoio na cuidadosa análise estatística dos dados. À Profa. Dra. Emília Loschiavo Arisawa pela disposição em ajudar-nos, pelo apoio intelectual e carinho na revisão da tese. Ao Dr. Ronaldo Roesler pela amizade, carinho e apoio na providência das amostras e dedicação intelectual. À Secretaria do IP&D, em especial às amigas Claudia e Ivone sempre atenciosas e prestativas. Ás funcionárias da Biblioteca Central, Rosângela e Rúbia, pelo carinho. Aos meus Amigos do LEVB e IP&D pela alegria nos momentos de ansiedade, pelo carinho, pelo apoio, pela troca de experiências e companheirismo. Às pacientes que acreditaram nesta pesquisa, sem as quais seria impossível sua realização. “A vida é complicada, mas não desinteressante”. (Jersy Neyman) “Estudo de Tecido Mamário Humano por Espectroscopia FT-Raman” RESUMO O objetivo primário deste estudo foi o de identificar, via Espectroscopia Raman com Transformada de Fourier, tecido mamário humano tanto normal quanto de algumas alterações benignas e malignas que acometem este órgão. Uma das principais vantagens da Biópsia Óptica, é o de fornecer diagnóstico diferencial de maneira minimamente invasiva. No presente estudo, foram obtidos 208 espectros FT-Raman de tecido mamário, separados em 9 grupos classificados pela análise histopatológica. Os espectros FTRaman de cada grupo diagnóstico apresentaram alta correlação entre os elementos do mesmo grupo, favorecendo a realização das médias espectrais. A presença dos Lipídios, que possuem forte sinal Raman, foi identificada em abundância no tecido normal. A estrutura primária das proteínas foi identificada através dos deslocamentos dos picos e bandas referentes aos aminoácidos; a identificação da estrutura secundária das proteínas ocorreu através das ligações peptídicas Amida I e Amida III. Em relação aos carboidratos, os espectros dos carcinomas infiltrante mucinoso, doença fibrocística e carcinoma infiltrante foram comparados e identificou-se aumento de intensidade na região de deslocamento Raman de 800 a 1200cm-1 , o que pode indicar a expressão espectral da variação de líquido cístico. Foram identificadas as alterações nos picos e bandas nos regiões de deslocamento Raman de 500 a 600cm-1 e 2000 a 2100cm-1 , que sugerem ser picos referentes aos ácidos nucléicos. Através do teste estatístico t de Student e Diagrama de Dispersão foram processados os sinais Raman de Mama Normal, Doença Fibrocística e Carcinoma Ductal Infiltrante a fim de verificar se a diferença entre os dados se dava pela diferenças das médias ou devido a um erro amostral. Através da dispersão binomial das áreas dos picos analisados pelo teste t de Student tentou-se promover a separação entre os grupos. Comprovou-se que as áreas dos picos identificados entre os espectros realmente identificam diferenças moleculares consistentes para a promoção de diagnósticos diferenciais via “Biópsia Óptica”, porém exigem uma metodologia estatística mais apurada, como Redes Neurais. Palavras chaves: Espectroscopia FT-Raman; Câncer de Mama, Biópsia Óptica. “Study of Human Breast Tissue by FT-Raman Spectroscopy” ABSTRACT The main objective of this study was to identify human breast tissue, normal and abnormal, by Fourier Transform Raman Spectroscopy. The main advantage of this technique of Optical Biopsy is to supply differential diagnosis non- invasively. In the present study, 194 breast tissue FT-Raman spectra had been gotten, separate in 9 groups according to the histopathological analysis. The FT-Raman spectra of each histopathological group had presented high correlation enter the elements, favoring the accomplishment of the spectral averages. Lipid has shown a strong Raman signal, and this structure was identified in abundance in the normal breast tissue spectra. The primary structure of proteins was identified through the displacements of the peaks and referring bands to amino acids; the identification of the secondary structure of proteins occurred through the peptide linkages (Amide I and Amide III). In relation to the carbohydrates, the spectra of ductal infiltrate carcinoma with mucin, fibrocystic condition, and infiltrate ductal carcinoma had been compared and identified increase of intensity in the region of Raman shift of 800 to 1200 cm-1 , that could indicate the spectral expression of the presence of cystic liquid. To the alterations in the peaks in the regions of Raman shift 500 to 600 cm-1 and 2000 to 2100 cm-1 may suggest refer to the nucleic acids region. Through the t test and binomial dispersion the signals of Normal breast tissue, fibrocystic condition and Ductal infiltrate carcinoma had been processed in order to verify if the difference between the data occurred due to differences of the averages or due to an amostral error. Through the binomial dispersion, the areas of the peak analyzed by t-test, was plotted to promote the separation between these three groups. The t-test proved that the identified peaks really identify consistent molecular differences, but the binomial dispersion proposed to distinguish the three diagnostic groups failed. However, a more accurate statistics methodology is needed, like Neural Networks. Key Words: FT-Raman spectroscopy; Breast Cancer, Optical Biopsy. Lista de Figuras Figura 1. Corte histológico de glândula mamária adulta jovem normal, onde se observa o sistema secretor composto por lóbulos e ductos situados no estroma interlobular composto predominantemente por tecido fibroso denso, com alguns adipócitos.* 47 Figura 2. Corte histológico de glândula mamária feminina adulta jovem normal durante a lactação. Neste observa-se o sistema secretor preenchido por secreção lactífera.* ................................................................................................................................. 47 Figura 3. Corte histológico de doença fibrocística da mama.* ....................................... 47 Figura 4. Corte histológico de Carcinoma ductal in situ.* ............................................. 47 Figura 5. Corte histológico Carcinoma ductal in sit u tipo comedo.* ............................. 48 Figura 6. Aspecto Macroscópico do Carcinoma ductal infiltrante de Mama.* .............. 48 Figura 7. Corte histológico e lâmina citológica de Carcinoma ductal infiltrante.* ....... 48 Figura 8. Corte histológico de Carcinoma ductal infiltrante. *....................................... 48 Figura 9. Corte histológico de Carcinoma ductal infiltrante inflamatório.* ................... 49 Figura 10. Corte histológico de Carcinoma ductal infiltrante medular, com linfócitos infiltrando nas camadas de células tumorais de alto grau.* .................................... 49 Figura 11. Corte histológico de carcinoma ductal infiltrante mucinoso. Observe os lagos de mucina levemente corada, com pequenas ilhas de células tumorais.*............... 49 Figura 12. Corte histológico de Carcinoma lobular infiltrante.* .................................... 49 Figura 13. FT-Raman Spectrometer RFS 100, Bruker. .................................................. 51 Figura 14.Geometria de Espalhamento e Porta Amostra do FT-Raman Spectrometer RFS 100................................................................................................................... 52 Figura 15 - Médias dos espectros FT-Raman normalizados pelo pico máximo dos tecidos de Mama normal (1), Condição fibrocística (2), Carcinoma ductal in situ (3), Carcinoma ductal in situ tipo comedo (4), Carcinoma ductal infiltrante (5), Carcinoma ductal infiltrante inflamatório (6), Carcinoma ductal infiltrante medular (7), Carcinoma ductal infiltrante mucinoso (8) e Carcinoma lobular infiltrante (9). ................................................................................................................................. 57 Figura 16 - Média dos Espectros FT-Raman não-normalizados dos diferentes tecidos mamários representados entre 1200 a 1800cm-1 . .................................................... 60 Figura 17 - Média dos Espectros FT-Raman normalizados pelo pico máximo (1446 cm1 ) de tecido mamário humano normal, Carcinoma ductal in situ e Carcinoma ductal infiltrante representados no deslocamento Raman entre 800 a 1400cm-1 . Em evidência estão as regiões espectrais identificadas como referentes os aminoácidos formadores do colágeno. ......................................................................................... 61 Figura 18 - Média dos Espectros FT-Raman de tecido mamário normal, Carcinoma ductal in situ e Carcinoma ductal infiltrante e representação dos Picos e Bandas entre 1200 a 1700cm-1 . Em evidência estão as regiões espectrais identificadas como referentes à representação espectral da estrutura secundária das proteínas, através das ligações peptídicas................................................................................ 63 Figura 19. Média dos Espectros FT-Raman de Carcinoma ductal in situ e Carcinoma ductal in situ Comedo. ............................................................................................ 64 Figura 20. Média dos Espectros FT-Raman referentes aos Nove tipos Histológicos estudados na região de deslocamento Raman de 2700 a 3400cm-1 referente ao gasto energético tecidual. ................................................................................................. 65 Figura 21. Média dos Espectros FT-Raman de Carcinoma ductal infiltrante, Carcinoma ductal infiltrante mucinoso e Condição fibrocística. .............................................. 66 Figura 22. Médias dos Espectros FT-Raman referentes aos tecidos Mama normal, Carcinoma ductal in situ, Carcinoma ductal infiltrante e Carcinoma lobular infiltrante. ................................................................................................................ 67 Figura 23. Médias dos Espectros FT-Raman referentes aos espectros Mama normal, Carcinoma ductal in situ, Carcinoma ductal infiltrante e Carcinoma lobular infiltrante. ................................................................................................................ 68 Figura 24 – Espectros FT-Raman de tecido mamário normal, com correção de linha de base e normalizado em seu pico máximo pelo software Matlab . ........................ 69 Figura 25 - Espectros FT-Raman de Condição fibrocística, com correção de linha de base e normalizado em seu pico máximo pelo software Matlab . ........................ 70 Figura 26 - Espectros FT-Raman de Carcinoma ductal infiltrante, com correção de linha de base e normalizado em seu pico máximo pelo software Matlab ..................... 70 Figura 27. Nível de Significância (p) para o Teste t de Student (linha horizontal, p= a = 0,05) entre Média dos Espectros de Mama Normal e Condição Fibrocística......... 71 Figura 28. Nível de Significância (p) para o Teste t de Student (linha horizontal, p= a = 0,05) entre média dos espectros de Mama normal e Carcinoma ductal infiltrante. 72 Figura 29. Nível de Significância (p) para o Teste t de Student (linha horizontal, p= a = 0,05) entre média dos espectros de Condição fibrocística e Carcinoma ductal infiltrante. ................................................................................................................ 72 Figura 30. Média dos espectros FT-Raman de Mama normal, Condição fibrocística e Carcinoma ductal infiltrante, obtidas pelo espectrômetro FT-Raman RFS 100, Bruker, onde estão demarcados pelos quadrados os picos analisados pelo teste t de Student. ................................................................................................................... 74 Figura 31 - 2028 cm-1 versus 2084 cm-1 ......................................................................... 75 Figura 32 - 1657 cm-1 versus 2084 cm-1 ......................................................................... 75 Figura 33 - 1657 cm-1 versus 2028 cm-1 ......................................................................... 76 Figura 34 - 1457 cm-1 versus 2084 cm-1 ......................................................................... 76 Figura 35 - 1457 cm-1 versus 2028 cm-1 ......................................................................... 77 Figura 36 - 1457 cm-1 versus 1657 cm-1 ......................................................................... 77 Figura 37 - 1340 cm-1 versus 2084 cm-1 ......................................................................... 78 Figura 38 - 1340 cm-1 versus 2028 cm-1 ......................................................................... 78 Figura 39 - 1340 cm-1 versus 1657 cm-1 ......................................................................... 79 Figura 40 - 1340 cm-1 versus 1457 cm-1 ......................................................................... 79 Figura 41 - 1270 cm-1 versus 2084 cm-1 ......................................................................... 80 Figura 42 - 1270 cm-1 versus 2028 cm-1 ......................................................................... 80 Figura 43 - 1270 cm-1 versus 1657 cm-1 ......................................................................... 81 Figura 44 - 1270 cm-1 versus 1457 cm-1 ......................................................................... 81 Figura 45 – 1270 cm-1 versus 1340 cm-1 ......................................................................... 82 Figura 46 - 1457 cm-1 versus 2084 cm-1 ......................................................................... 82 Figura 47 - 1004 cm-1 versus 2084 cm-1 ......................................................................... 83 Figura 48 - 1004 cm-1 versus 2028 cm-1 ......................................................................... 83 Figura 49 - 1004 cm-1 versus 1657 cm-1 ......................................................................... 84 Figura 50 - 1004 cm-1 versus 1457 cm-1 ......................................................................... 84 Figura 51 - 1004 cm-1 versus 1340 cm-1 ......................................................................... 85 Figura 52 - 1004 cm-1 versus 1270 cm-1 ......................................................................... 85 Figura 53 - 940 cm-1 versus 2840 cm-1 ........................................................................... 86 Figura 54 - 940 cm-1 versus 2028 cm-1 ........................................................................... 86 Figura 55 - 940 cm-1 versus 2028 cm-1 ........................................................................... 87 Figura 56 - 940 cm-1 versus 1457 cm-1 ........................................................................... 87 Figura 57 - 940 cm-1 versus 1657 cm-1 ........................................................................... 88 Figura 58 - 940 cm-1 versus 1340 cm-1 ........................................................................... 88 Figura 59 - 940 cm-1 versus 1270 cm-1 ........................................................................... 89 Figura 60 - 940 cm-1 versus 1004 cm-1 ........................................................................... 89 Figura 61 - 540 cm-1 versus 2084 cm-1 ........................................................................... 90 Figura 62 - 540 cm-1 versus 2028 cm-1 ........................................................................... 90 Figura 63 - 540 cm-1 versus 1657 cm-1 ........................................................................... 91 Figura 64 - 540 cm-1 versus 1457 cm-1 ........................................................................... 91 Figura 65 - 540 cm-1 versus 1270 cm-1 ........................................................................... 92 Figura 66 - 540 cm-1 versus 1340 cm-1 ........................................................................... 92 Figura 67 - 540 cm-1 versus 1004 cm-1 ........................................................................... 93 Figura 68 - 540 cm-1 versus 940 cm-1 ............................................................................. 93 Lista de Tabelas Tabela 1 - Distribuição dos tipos histológicos de câncer de mama ................................ 42 Tabela 2. Parâmetros ajustados com auxílio do Software OPUS 4.2 para a aquisição dos espectros no FT-Raman Spectrometer RFS 100. .................................................... 53 Tabela 3 - Coeficiente de correlação dos Espectros FT-Raman dos Grupos Histopatológicos...................................................................................................... 58 Tabela 4 - Relação dos Picos Raman analisados pelo Software Origin 5.0 através da Análise Gaussiana de Múltiplos Picos e tentativa de identificação da maioria dos modos vibracionais observados nos tecidos mamários normais e patológicos....... 59 Tabela 5 - Modos Vibracionais e Biomoléculas referentes picos Raman de tecido mamário humano normal e patológico.................................................................... 60 Tabela 6. Teste t de Student correspondente aos espectros FT-Raman de mama normal, condição fibrocística e carcinoma ductal infiltrante em relação aos picos estatisticamente relevantes para diferenciação das médias..................................... 73 Lista de Abreviaturas, Siglas e Símbolos FT-Raman Fourier Transform Raman Spectroscopy LASER Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation Nd:YAG Neodímio Ítrio-Alumínio-Granada Ti:Safira Titânio-Safira InGaAs Índio-Gálio-Arsênio CCD Charge Couple Device SERS Surface Enhanced Raman Scattering CARS Coherent Anti-Stokes Raman Scattering USG Ultra-sonografia RNM Ressonância nuclear magnética PAAF Punção aspirativa por agulha fina IR Infrared (Infravermelho) NIR Near Infrared (Infravermelho próximo) UV Ultravioleta PCA Principal Components Analysis DNA Deoxyribose nucleic acid (Ácido desoxirribonucléico) RNA Ribonucleic Acid (Ácido Ribonucléico) ν Modo de Estiramento νS Modo de Estiramento Simétrico ν AS Modo de Estiramento Assimétrico δ Modo de Dobramento δS Modo de Dobramento Simétrico δ AS Modo de Dobramento Assimétrico C Carbono H Hidrogênio O Oxigênio N Nitrogênio = Dupla Ligação Ligação Simples MB Membrana basal E. coli Escherichia coli MN Mama Normal CF/DF Condição Fibrocística CDIS Carcinoma Ductal in Situ CDISC Carcinoma Ductal in Situ Comedo CDI Carcinoma Ductal Infiltrante CDII Carcinoma Ductal Infiltrante Inflamatório CDIM Carcinoma Ductal Infiltrante Medular CDIMU Carcinoma Ductal Infiltrante Mucinoso CLI Carcinoma Lobular Infiltrante MHz Mega Hertz cm-1 /s 1/Centímetro/ segundo cm-1 1/Centímetro mm Milímetro µm Micrômetro nm Nanômetro o Grau C Celsius mW mili Watt % Porcentagem CA Carcinoma Ác. Ácido AN Ácido Nucléico aa aminoácido BRCA1 gene supressor do câncer BRCA2 gene supressor do câncer Sumário 1 INTRODUÇÃO....................................................................................................... 17 2 OBJETIVOS............................................................................................................ 20 3 REVISÃO DE LITERATURA................................................................................. 21 3.1 Espectroscopia Molecular.................................................................................... 22 3.1.1 Espectroscopia Raman....................................................................................22 3.1.2 Espectroscopia Raman em câncer de mama......................................................30 3.2 Inferência para duas populações.......................................................................... 35 3.2.1 Teste t de Student para duas amostras independentes.........................................35 3.3 A Mama Humana e a Carcinogênese ................................................................... 37 3.3.1 Histofisiologia da Mama .................................................................................38 3.3.2 Condição Fibrocística .....................................................................................39 3.3.3 Carcinoma de Mama.......................................................................................41 4 METODOLOGIA.................................................................................................... 50 4.1 Obtenção das amostras de tecido mamário .......................................................... 50 4.1.1 Cirurgia para Ressecção das Amostras.............................................................50 4.1.2 Armazenamento das amostras antes da Espectroscopia FT-Raman.....................50 4.2 Obtenção dos espectros FT-Raman...................................................................... 51 4.2.1 Espectrômetro FT-Raman ...............................................................................51 4.2.2 Parâmetros do Equipamento ............................................................................52 4.2.3 Preparação das Amostras para Experimento .....................................................53 4.3 Análise Histopatológica........................................................................................ 54 4.4 Análise dos Dados Espectrais............................................................................... 54 4.4.1 Análise Qualitativa .........................................................................................54 4.4.2 Análise Quantitativa .......................................................................................55 5 RESULTADOS........................................................................................................ 57 6 DISCUSSÃO............................................................................................................ 95 7 CONCLUSÃO....................................................................................................... 104 8 PROPOSTAS......................................................................................................... 105 REFERÊNCIAS............................................................................................................ 106 ANEXOS E APÊNDICES.............................................................................................. 111 1 INTRODUÇÃO Hoje, o progresso da Medicina está intimamente relacionado aos muitos fenômenos de interações moleculares dos sistemas biológicos. O desenvolvimento tecnológico se espelha nestas dúvidas e intensifica as pesquisas na instrumentação auxiliar para a análise físico-química visando investigar as estruturas e interações dos sistemas moleculares. Dentre estes avanços tecnológicos, a Espectroscopia Óptica vem se estabilizando como uma ferramenta prática para as análises morfo-químicas de amostras sólidas, líquidas ou soluções de arranjos moleculares altamente complexos, como as macromoléculas de interesse biológico. Sem dúvida, a técnica de Espectroscopia Raman, com suas numerosas variantes, é um desses métodos. Poucas técnicas espectroscópicas têm encontrado tanta faixa de aplicação quanto à técnica de Espectroscopia Vibracional Raman. Isto pode ser explicado tanto pela própria característica dos movimentos vibracionais moleculares, quanto pelos substanciais desenvolvimentos instrumentais ocorridos nas duas últimas décadas, envolvendo a construção de lasers mais potentes, detectores multicanais intensificados, assim como instrumentos interferométricos com Transformada de Fourier. Permitiu a aplicação da técnica Raman, conhecida e utilizada há muito tempo, ser acessada por não-especialistas nos procedimentos de diagnósticos estruturais e/ou finalidades analíticas. Baseados no sucesso da Espectroscopia Raman em biologia, muitos grupos reconhecem o potencial desta técnica no estudo e diagnóstico de doenças. No entanto, as primeiras tentativas de medir os Espectros Raman de células e tecidos biológicos foram retardadas basicamente por dois fatores: a altíssima fluorescência natural dos tecidos biológicos, que obscureciam os fracos sinais Raman destes tecidos, e as limitações instrumentais, exigindo maior potência do laser e maior sensibilidade dos equipamentos para obter uma adequada razão sinal/ruído dos espectros. Melhorias implementadas na instrumentação Raman desde os anos 80, particularmente nos instrumentos que trabalham na região de infravermelho do espectro eletromagnético favoreceram o fantástico crescimento das aplicações biomédicas da Espectroscopia Raman. Diversos autores recentemente reportaram suas pesquisas em espectroscopia de vários tecidos biológicos, ilustrando o potencial diversificado desta técnica estendendose desde o monitoramento de patologias, preciso diagnóstico molecular do processo cancerígeno in vivo, ao desenvolvimento de imagem química de células e tecidos através dos espectros Raman (MAHADEVAN-JANSEN, 1995; MAHADEVANJANSEN; RICHARDS-KORTUM, 1996; MAHADEVAN-JANSEN et al., 1998; KLINE; TREADO, 1998). As técnicas espectroscópicas que em conjunto denominam-se “Biópsia Óptica”, têm o potencial de serem altamente sensíveis e serem utilizadas de maneira minimamente invasiva, possibilitando o surgimento de métodos diagnósticos mais seguros e rápidos, proporcionando maior conforto para um maior número de pacientes (KLINE; TREADO, 1998). A “Biópsia Óptica” pode empregar a Espectroscopia Vibracional para sondar regiões teciduais suspeitas in locu sem extensa preparação das amostras e longa espera do resultado. A informação diagnóstica é fornecida pela assinatura espectral singular de cada amostra, permitindo a diferenciação entre tecidos biológicos normais e anormais em tempo real através de extensas análises estatísticas de seus espectros. A Espectroscopia Raman é uma das técnicas da “Biópsia Óptica” que será utilizada largamente na caracterização da variedade de estados patológicos no câncer. A técnica Raman poderá contribuir para o estudo histológico e histoquímico através da implementação das variantes da técnica Raman, como Micro-Raman e Surface Enhanced Raman Scattering (SERS). As duas técnicas ampliarão o campo de visualização e aumentarão significativamente o sinal Raman a ser coletado, possibilitando a identificação de alterações nucleares e de proteínas tumorais também in locu. Este presente estudo também revisa brevemente a literatura relevante relacionada ao desenvolvimento tecnológico e ao uso da Espectroscopia Raman para fins diagnósticos, principalmente de patologias mamárias, e considerações sobre as vantagens da utilização dos equipamentos com Transformada de Fourier. Finalmente, a exposição dos Espectros Raman de tecido mamário, com referências ao trabalho em nível microscópico e molecular. Os espectros FT-Raman obtidos dos tecidos mamários, neste estudo, comprovaram ter informações altamente relevantes em relação à composição molecular dos tecidos normais e das alterações moleculares no processo da carcinogênese. Desenvolveu-se para este estudo parâmetros para aquisição dos espectros FT-Raman de tecido mamário normal e alterado a fim de produzir uma biblioteca espectral, assim como a introdução ao estudo de construção de modelos matemáticos para classificação dos espectros em grupos semelhantes aos obtidos pela análise histopatológica. Obtivemos com esta técnica nove modelos espectrais, com alto índice de correlação: mama normal, Condição fibrocística, Carcinoma ductal in situ, Carcinoma ductal in situ comedo, Carcinoma ductal infiltrante, Carcinoma ductal infiltrant e inflamatório, Carcinoma ductal infiltrante medular, Carcinoma ductal infiltrante mucinoso, Carcinoma lobular infiltrante. Os testes estatísticos aplicados nos espectros, sendo Coeficiente de correlação e Teste t Student serviram tanto para validar diferenças espectrais facilmente visualizadas quanto para início do desenvolvimento de algoritmos matemáticos para classificação dos espectros de acordo com o tipo histológico. Esperamos que este trabalho seja uma base para adicionar às futuras interpretações dos sinais Raman de tecido neoplásico que guiarão o desenvolvimento racional das técnicas de diagnóstico para utilização clínica. 2 OBJETIVOS O Projeto de Pesquisa envolvendo Espectroscopia Raman com transformada de Fourier e tecido mamário humano feminino, é composto por inúmeras etapas, envolvendo diferentes linhas de pesquisa, até culminar no desenvolvimento de uma tecnologia de análise em tempo real. Para tanto, o objetivo deste trabalho consiste em: 1. Obter espectros FT-Raman de tecido Mamário humano normal e de patologias malignas e benignas que acometem este tecido; 2. Qualificação dos dados espectrais através de observação das variações dos espectros de acordo como o tipo histopatológico; 3. Validar estatisticamente, através de Teste t de Student, os espectros FT-Raman obtidos de Mama normal, Condição fibrocística e Carcinoma ductal infiltrante, a fim de verificar se as diferenças encontradas são válidas estatisticamente ou se ocorrem devido a um erro amostral. 3 REVISÃO DE LITERATURA O câncer se configura como um grande problema de saúde pública tanto nos países desenvolvidos como nos países em desenvolvimento. As estatísticas mundiais mostram que no ano 2000, ocorreram 5,3 milhões de casos novos de câncer em homens e 4,7 milhões em mulheres, e que 6,2 milhões de pessoas morreram por essa causa, sendo 3,5 milhões de homens e 2,7 milhões de mulheres, correspondendo a 12% do total de mortes por todas as causas, que somam 56 milhões de pessoas. O câncer de pulmão é o mais comum no mundo, somando cerca de 1,2 milhão de novos casos anualmente, seguido pelo câncer de mama feminina o segundo câncer mais comum e o primeiro entre as mulheres, com aproximadamente um milhão de novos casos por ano. (INCA, 2003). A Holanda é o país com a maior incidência, com uma taxa de incidência ajustada de 90,2/100.000 habitantes. Nos Estados Unidos, a taxa é de 86,9/100.000. Taxas elevadas também são encontradas na Europa, Austrália, Nova Zelândia e no sul da América do Sul, especialmente no Uruguai e na Argentina. As populações da África e da Ásia possuem, em sua maioria, baixos valores de incidência. As taxas de incidência por câncer de mama aumentam com a idade, alcançando seu pico na faixa etária de 65 a 70 anos (INCA, 2003). A rotina clínica para detecção do câncer de mama se utiliza largamente da mamografia para monitoramento diagnóstico. Devido a incorreções relacionadas à própria densidade da radiografia, como resultados destas são obtidos 22% de índices de falso-negativos assim como uma alta taxa de resultados falso-positivos, 56% com risco acumulativos de 10 exames, em mulheres com idade inferior a 50 anos. Além disso, o uso de terapia de reposição hormonal (HRT) em mulheres pós-menopausa é conhecidamente um fator de aumento da densidade da mama, demo nstrado recentemente que impede a total eficácia do mapeamento da mama por mamografia radiográfica. Técnicas como a Ressonância Magnética por Imagem (MRI) e Ultrasonografia (US) são utilizadas como procedimentos secundários devido aos fatores como alto custo e pobre especificidade da técnica MRI e baixa sensibilidade para US. Geralmente, procedimentos invasivos como a punção aspirativa por agulha fina (PAAF), Core Biopsy ou biópsias cirúrgicas são implementadas para promover diagnóstico definitivo, porém em 80% dos casos estas biópsias são realizadas em tecidos com alterações benignas que geralmente não possuem características morfológicas malignas. Dentro desta problemática, diversas investigações são propostas para a utlilização de metodologias capazes de identificar alterações morfo-químicas das amostras através de suas propriedades ópticas. Através das técnicas espectroscópicas no infravermelho se propõem novas abordagens para diagnóstico de câncer de maneira minimamente invasiva. Estas técnicas baseadas nas propriedades ópticas dos tecidos se mostram vantajosas, pois permitem ser acessadas por não-especialistas, não oferecem riscos de radiação ionizante ao médico e ao paciente, além de promover diagnóstico diferencial em tempo real. 3.1 Espectroscopia Molecular A Espectroscopia estuda a interação da radiação eletromagnética com a matéria, sendo um dos seus principais objetivos a determinação dos níveis de energia de átomos ou moléculas. De maneira direta, são obtidas as diferenças entre estes níveis de energia a partir de medidas que determinam as posições relativas dos níveis energéticos. No caso das moléculas, a região espectral onde estas transições são observadas depende do tipo de níveis energéticos envolvidos: eletrônicos, vibracionais e/ou rotaciona is, assim, as vibrações moleculares podem ser medidas por diferentes técnicas como a Espectroscopia de Absorção Eletrônica, Espectroscopia de Fluorescência, Espectroscopia de Absorção no Infravermelho, Espectroscopia Raman, e variáveis destas mesmas técnicas (SALA, 1995). 3.1.1 Espectroscopia Raman As técnicas espectroscópicas, de uma maneira geral, fornecem informações detalhadas sobre os níveis de energia dos espécimes em estudo. Particularmente, no caso da espectroscopia vibracional Raman, a grande vantagem reside na aquisição de uma maior riqueza de detalhes proporcionada pelos níveis de energia vibracional frente aos níveis de energia eletrônico. Enquanto os espectros eletrônicos, conhecidos como fluorescência, são constituídos por bandas largas e usualmente sem estrutura, os vibracionais Raman representam a “impressão digital” das moléculas (FARIA; SANTOS, 1997). A Espectroscopia Raman vem sendo utilizada para determinar a composição química dos mais diversos materiais por mais de 70 anos. Devido aos espetaculares avanços na área tecnológica, foram desenvolvidos instrumentos extremamente sensíveis e de menor custo, despertando o interesse de pesquisadores em todas as áreas do conhecimento científico (ANGEL; CARRABBA; COONEY, 1995). 3.1.1.1 Histórico O efeito Raman foi previsto teoricamente por Smekal et al. (1923) e confirmado experimentalmente por Chandrasekhara Venkata Raman (1928). Surpreendentemente, o equipamento empregado por Raman para a observação do efeito não poderia ser mais simples: a luz do sol, um espectroscópio de bolso e, como detector, o olho humano. Essencialmente, Raman imaginou a possibilidade da radiação visível interagir com a matéria de modo tal que houvesse a variação na energia do fóton incidente, sendo que essa transferência de energia seria dependente da massa de do tipo de ligações das moléculas (FARIA; SANTOS, 1997). O primeiro artigo de Raman sobre este efeito foi publicado na revista Nature em 31 de Março de 1928. Neste artigo, Raman descreveu o arranjo experimental utilizado que o possibilitou visualizar o espalhamento inelástico da radiação. Neste experimento, Raman focalizou, através de uma série de lentes especiais, a luz solar em um recipiente contendo um líquido cuidadosamente purificado. Antes da amostra, porém, era colocado um filtro azul que deixava passar somente radiação na região de maior energia do espectro visível (vermelho). Observando a amostra, em uma direção perpendicular à direção de iluminação, era possível observar o traço luminoso, azul esverdeado, devido ao espalhamento inelástico da radiação. Assim estava descoberto um novo tipo de fenômeno, batizado de Efeito Raman por um dos estudantes do pesquisador indiano (RAMAN; KRISHNAN, 1928). Com esta descoberta Raman ganhou o prêmio Nobel de Física em 1930 (JAYARAMAN et al., 1989). Desde a sua descoberta inicial, o efeito despertou interesse entre os físicos, que procuraram explicar seu mecanismo, pois tal efeito sugeriu a possibilidade de fornecer informações valiosas sobre a estrutura molecular dos compostos através de uma metodologia não destrutível. Os trabalhos experimentais daquela época se limitavam à obtenção de espectros e em alguns casos à atribuição das freqüências aos modos vibracionais. Na década de 1940 os químicos já usavam a Espectroscopia Raman para obtenção de informações relativas à simetria molecular e às ligações químicas (JAYARAMAN, 1989). A introdução do uso da radiação laser como fonte de excitação na Espectroscopia Raman, em 1962, se deve ao brasileiro Sérgio Porto, que em colaboração com Wood, utilizaram laser pulsado de rubi para obtenção de espectros Raman. Kogelnik e Porto (1963) foram os primeiros a utilizar laser contínuo de HélioNeônio (He-Ne) no comprimento de onde de 632,8 nm na Espectroscopia Raman. Este processo de constante inovação e desenvolvimento na tecnologia disponível permitiu que a Espectroscopia Raman se tornasse uma poderosa ferramenta analítica acessada por não especialistas (PORTO; WOOD, 1962; KOGELNIK; PORTO, 1963). A crescente utilização da técnica de Espectroscopia Raman em diversos segmentos científicos direcionou e acelerou o desenvolvimento de equipamentos. Surgiram, a partir de então, técnicas mais específicas de análise Raman, ampliando as possibilidades de análises dos materiais, como o efeito Raman Ressonante, efeito Raman Intensificado por Superfície (SERS), efeito Raman Inverso, espalhamento Raman Anti-Stokes Coerente (CARS) e Micro-Raman. 3.1.1.2 Efeito Raman O Efeito Raman é o espalhamento inelástico da luz produzido por íons, átomos e moléculas, relacionado à mudança de freqüência da luz incidente quando espalhada. Quando um feixe de luz monocromática incide em uma molécula cujas dimensões são menores que o comprimento de onda da luz incidente, ocorre o fenômeno do espalhamento. Uma parte da energia monocromática dos fótons incidentes é transferida para as moléculas de uma tal maneira que alguns dos elétrons pertencentes aos diferentes níveis de energia se tornam então excitados, ocorrendo aumento na freqüência de vibração de algumas ligações desta molécula. Para esta molécula voltar ao seu estado fundamental, mais estável que o estado excitado, existe a necessidade de que esta energia seja entregue novamente ao meio. Esta variação na freqüência entre a energia emitida e a espalhada pela molécula é um fenômeno dependente da massa da molécula e dos tipos de ligações que a constitui. A estrutura da molécula, massa atômica, tipos de ligações, substitutos moleculares, geometria molecular e pontes de hidrogênio afetam a constante de força vibracional que dita a vibração molecular. Sendo assim, existem diversos movimentos que constituem o conjunto de modos vibracionais normais, entre estes podemos citar: modo de estiramento entre duas ligações atômicas; modo de dobramento entre três átomos conectados por duas ligações; modo de deformação fora do plano que muda a estrutura da molécula de plana para angular (SALA, 1995). A Espectroscopia Raman é fundamentada no fenômeno de mudança de freqüência da luz quando esta é espalhada pelas moléculas. Uma dada freqüência de uma luz incidente é ? 0 e a freqüência da luz espalhada por uma molécula é ? r, a variação de freqüência incidente e espalhada pode ser entendida por: ∆ν = ν r −ν 0 A freqüência de deslocamento Raman é equivalente a mudança de energia h∆ν . Os resultados observados são usualmente expressos em termos de número de ondas (wavenumbers) e não freqüência. 3.1.1.3 Espalhamento Raman A maior parte da luz espalhada apresenta o mesmo comprimento de onda da luz incidente, e este espalhamento é conhecido como espalhamento elástico ou Rayleigh. Uma pequena parcela desta luz espalhada, no entanto, apresenta um comprimento de onda diferente daquele da luz incidente, e a sua existência constitui espalhamento inelástico ou Raman. A proporção de fótons espalhados inelasticamente em relação aos espalhados elasticamente é da ordem de 10-7 , o que torna a sua detecção problemática em algumas situações. Estas mudanças de freqüências estão diretamente relacionadas à quantidade de energia de excitação das partículas que são distintas para cada tipo de moléculas. Filtrando-se a linha Rayleigh, de freqüência conhecida, pelo fato de se utilizar uma luz monocromática como fonte de excitação de moléculas, obtem-se somente as freqüências espalhadas inelasticamente. Assim, a energia vibracional de diversos materiais pode ser deduzida e a estrutura de suas partículas identificada através do espectro Raman. No processo de espalhamento, um fóton de energia é destruído e simultaneamente um fóton espalhado de energia é criado. No espalhamento Raman a radiação que interage com a molécula é espalhada com freqüência ligeiramente modificada. Esta variação de freqüência corresponde à diferença de energia entre dois estados vibracionais. A interação, entretanto, pode ser inelástica, a qual leva a matéria para um nível de energia excitado, o que resulta em uma perda de energia do fóton, e este é espalhado com freqüências menores que a incidente, sendo estas freqüências Raman conhecidas como linhas Stokes. Se a matéria está em um estado excitado, a colisão com um fóton pode causar uma perda de energia e os elétrons sofrem uma transição para um estado de energia mais baixa. Neste caso, as freqüências Raman são conhecidas como Anti-Stokes (SALA, 1995). 3.1.1.4 Polarizabilidade Para um modo vibracional ser Raman ativo existe a necessidade da variação da polarizabilidade da molécula durante a vibração, isto é, o momento de dipolo a ser considerado é induzido pela radiação eletromagnética. O campo elétrico produzido pelo feixe de luz monocromática polariza os elétrons da molécula em ressonância, promovendo a deformação da nuvem eletrônica molecular. Nesta distorção, a carga positiva do núcleo é atraída em direção oposta ao pólo negativo do campo elétrico, o elétron em direção oposta ao pólo positivo. Esta separação de cargas causa uma indução no momento dipolo e se diz que a molécula está polarizada (SALA, 1995). O campo elétrico produzido pela molécula polarizada oscila na mesma freqüência da onda passante, então a molécula age como uma fonte de radiação própria emitindo fótons para todas as direções (SALA, 1995). Se a polarização é constante, o espalhamento é elástico; se a molécula muda sua polarizabilidade, ou seja, muda o centro de carga, então, o espalhamento é inelástico, ou Raman. 3.1.1.5 Instrumentação em Espectroscopia Raman Espectroscopia Raman requer o uso de fontes de luz monocromáticas, ou seja, com um único comprimento de onda, visto que é baseada no deslocamento da freqüência a partir da luz incidente, que é muito pequena e pode ser obscurecida por uma fonte de largos comprimentos de onda. A Espectroscopia Raman pode ser classificada baseada por sua fonte de luz utilizada, como por exemplo: Ultra-Violeta (UV), Visível e Infra-Vermelho (IR). Para a maioria das aplicações da Espectroscopia Raman na área Bioló gica/ Biomédica, fontes de excitação no infravermelho são mais utilizadas devido à propriedade física de conseguir diminuir virtualmente a emissão de autofluorescência de, por exemplo, enzimas presentes nos tecidos biológicos. Os lasers mais comuns usados pela Espectroscopia Raman no infravermelho são: Neodímio Ítrio-Alumínio-Granada (Nd: YAG) e Titânio-Safira (Ti: Safira) (SALA, 1995). Quando uma luz monocromática no comprimento de onde visível, ou até mesmo em 780 nm, são utilizadas como fonte de excitação para o efeito Raman, estas linhas fracas geralmente são encobertas pela radiação de fluorescência emitida por constituintes celulares, como enzimas, que estão sempre presentes mesmo em concentrações muito baixas. Para driblar este obstáculo, diminui-se a energia quântica da fonte de excitação para um grau tal que somente os níveis vibracionais são excitados e não os níveis eletrônicos. Com excitação a 1064 nm a partir de um laser de Nd: YAG, por exemplo, esta fluorescência é virtualmente eliminada (SCHRADER, 1989; SCHRADER, 1995; SCHRADER; MOORE, 1997; SCHRADER et al., 1997). A Espectroscopia Raman também pode ser classificada de acordo com tecnologia empregada, por exemplo: Transformada de Fourier (FT-Raman) ou de Sistema Dispersivos. O Sistema FT-Raman tem inúmeras vantagens sobre o Sistema Dispersivo, incluindo a vantagem “multiplex” o qual lidera a capacidade de coletar vários comprimentos de onda em um curto período de tempo. No entanto, a Espectroscopia Raman Dispersiva tem se tornado muito mais popular desde o advento de um detector CCD (Charge Couple Device Detector) devido ao alto ganho de eficiência quântica. A partir desta tecnologia, provavelmente serão desenvolvidos os equipamentos para coleta de espectros Raman in vivo, a atual dificuldade é a baixa sensibilidade do detector CCD nos comprimentos de onda de excitação acima de 830 nm (SCHRADER, 1989; SCHRADER, 1995; SCHRADER; MOORE, 1997; SCHRADER et al., 1997). 3.1.1.5.1 Espectroscopia FT-Raman Sinais Raman obtidos a partir de amostras biológicas são extremamente fracos, e a emissão de fluorescência acaba sendo a maior interferência para as medidas de Espectroscopia Raman (ALCANTARA, 2002). No Raman convencional onde para excitação geralmente se utilizam lasers de radiação visível, cerca de 90% das amostras que contém impurezas produzem forte fluorescência, mascarando assim, o sinal Raman (ANGEL et al., 1995). Para remover esta fluorescência indesejável no espectro Raman, utilizam-se diversas técnicas como, por exemplo, a Espectroscopia Raman Anti-Stokes Coerente (CARS). Este método, porém, requer um sistema óptico complexo e muito caro, não sendo, portanto, um método de primeira escolha. A melhor opção para esta situação é a Espectroscopia Raman com Transformada de Fourier (FT-Raman) utilizando como fonte de excitação o laser de Nd: YAG no comprimento de onda de 1064 nm que mantém a maioria das bandas de absorção dos fluoróforos fora do espectro Raman. Na região do comprimento de onda de 1000 a 1300 nm, o método de FT-Raman promove a maior sensibilidade óptica devido ao sistema multiplex do espectrômetro FT (ALCANTARA, 2002). A excitação no infravermelho próximo, a 1064 nm, também minimiza a degradação fotolítica da amostra, permitindo que uma maior potência de incidência do laser seja utilizada para compensar o espalhamento Raman menos intenso quando excitado por comprimentos de onda mais longos. Há alguns anos, foi demonstrado que quando se emprega um laser de Nd: YAG como fonte de excitação para o efeito Raman, o número de amostras que fluorescem diminui enormemente (SCHRADER, 1989; SCHRADER, 1995; SCHRADER; MOORE, 1997; SCHRADER et al., 1997). 3.1.1.5.1.1 Transformada de Fourier O interesse em métodos de processamento digital de imagens advem principalmente de duas áreas de aplicações: a melhoria da informação para interpretação humana e para o processamento de dados em computador. A Transformada Discreta de Fourier Bi-dimensional, desenvolvida por Jean Baptiste Joseph Fourier, um matemático francês, se tornou uma ferramenta matemática de grande aplicabilidade na solução dos problemas de processamento digital de imagens, ou seja, promove a mudança do domínio do tempo ou espaço (x, y) para o domínio da freqüência facilitando, assim, o processamento digital da imagem (FONSECA NETO; ALCOCER, 1998). 3.1.1.6 Aplicações Bioquímicas e Biomédicas da Espectroscopia Raman A Medicina, para muitos estudiosos, é a ciência que se baseia firmemente nos fundamentos das Ciências Biológicas, na qual traça sua evolução a partir das Ciências Exatas como Química, Física e Matemática (MADSEN et al., 1994). A exemplo desta interação entre Ciências Biológicas e Exatas, a Espectroscopia Raman se torna uma ferramenta potencialmente importante na análise química na área médica, permitindo futuramente a detecção, o monitoramento e o estudo das patologias humanas in vivo promovendo diagnóstico em tempo real (PARKER, 1971; LONDON et al., 1992; FRANK et al., 1994; KELLER et al., 1994; MIZUNO et al., 1994; FELD et al., 1995; MAHADEVAN-JANSEN RICHARDS-KORTUM, 1996; et al, 1995; MANOHARAN; MAHADEVAN-JANSEN; WANG; FIELD, 1996; MAHADEVAN-JANSEN et al, 1998; MANOHARAN, 1998; HATA et al., 2000; PAPPAS, 2000; STONE et al., 2000; HAKA et al., 2002, KENDALL et al., 2003; LAU et al., 2003; MOLCKOVSKY et al., 2003; CROW et al., 2004; GNIADECKA et al., 2004; STONE et al., 2004). Idealmente, todos os procedimentos diagnósticos deveriam ser não- invasivos. No entanto, não é a realidade dos métodos de análise histopatológica atual, que analisam o tecido cirurgicamente removido antes do diagnóstico final. No caso de amostras de tecidos biológicos, uma fina secção do tecido removido é examinada pelo patologista que identifica os elementos essenciais das patologias como grau de diferenciação celular, anormalidades celulares e nucleares, invasão, fibroses, entre outros (JACKSON; MANTSCH, 1997; CONTRAN; KUMAR; COLLINS, 2000; MARTONELLI FILHO, 2000; HONDERMARCK et al., 2002). A Espectroscopia Vibracional ou Raman poderá ser aplicada com eficiência em vários tipos de análise com grandes benefícios ao paciente. Em trabalho proposto por Jackson e colaboradores (1997), foram relacionadas informações sobre a concentração de todos os componentes presentes no fluído sanguíneo obtidas através de análises matemáticas baseadas em dados espectrais de referência, promovendo diagnóstico sobre a concentração dos componentes celulares presentes em amostra de sangue (JACKSON; MANTSCH, 1997). Na Espectroscopia Vibracional, destacam-se duas técnicas diferentes que, de acordo com regras de seleção das bandas vibracionais, são complementares: a Espectroscopia Raman e Espectroscopia de Absorção no Infravermelho. Os espectros FT-Raman no Infravermelho Próximo (FT-NIR Raman) e Espectroscopia Vibracional no Infravermelho (FT-IR) de microorganismos, células vegetais, animais e células humanas, incluindo fluidos corporais, se tornam altamente específicos, possuindo assinaturas espectrais que podem ser usadas para discriminar os diversos subgrupos e patologias existentes, caracterizar os fenômenos do processo de crescimento celular, estudar as interações celulares com diferentes drogas e a diferenciação de estágios patológicos. Estas informações espectrais são altamente poderosas na caracterização biomédica que pode ser distribuída por toda a região do infravermelho do espectro eletromagnético. No entanto, a chave do problema se encontra na elucidação de um método de avaliação das informações vibracionais extraídas a partir do espectro infravermelho de amostras complexas como são as biológicas (MAHADEVANJANSEN, 1995; MAHADEVAN-JANSEN; RICHARDS-KORTUM, 1996; MANOHARAN; WANG; FIELD, 1996; MAHDEVAN-JANSEN et al., 1998; MANOHARAN, 1998). Os espectros Raman de tecidos biológicos com alterações benignas e malignas mostram crescimento no conteúdo de proteína e decréscimo no conteúdo de lipídios em comparação aos tecidos biológicos normais. A Espectroscopia Raman macroscópica executada eficientemente em amostra de tecido mamário evidencia o espectro de um grande número de células. Sendo uma pequena porção da amostra compostas por células cancerosas, em estágio inicial de desenvolvimento da patologia, o macro-Raman geralmente será insensível na presença da doença. Uma estratégia para detectar uma baixa média de concentração de células cancerosas no tecido é promover a resolução espacial do espectro Raman usando Micro-Raman (KLIN E, TREADO, 1998). 3.1.2 Espectroscopia Raman em câncer de mama A Espectroscopia de Fluorescência dominou as pesquisas no passado devido a sua alta intensidade e sensibilidade. Com o advento da tecnologia e detectores apropriados, a Espectroscopia Raman vem se tornando a técnica espectroscópica de escolha no estudo do câncer de mama, devido a sua alta especificidade e sensibilidade (PAPPAS, 2000). Mudanças na estrutura da célula associada à doença são geralmente aparentes no Espectro Raman, permitindo sua identificação em fase inicial (PAPPAS, 2000). Além disso, a Espectroscopia Raman oferece uma vantagem significativa sobre as outras técnicas de analise pelo fato da água ter um sinal Raman extremamente fraco (CROW et al., 2004). Tanto os tecidos normais quanto os cancerosos estão sob influência de processos bioquímicos. Portanto, possuem fatores particulares ou marcadores que podem ser usados para diferenciá- los. Podemos entender marcadores bioquímicos como sendo alguns componentes teciduais importantes que fa zem parte do metabolismo e/ou constituição celular, como o citrato e o glicogênio, fosfolipídios, glicose e até mesmo o DNA (MAHADEVAN-JANSEN, 1995; MAHADEVAN-JANSEN; RICHARDSKORTUM, 1996; MANOHARAN; WANG; FIELD, 1996; MAHDEVAN-JANSEN et al., 1998; MANOHARAN, 1998). Estes marcadores informam sobre a diferenciação de tecido com alterações pré-cancerosas que podem vir a desenvolver um tumor maligno. Desta maneira, pode ser possível que se utilize a Espectroscopia Raman para identificar este tipo de lesão em estágios menos avançados, aumentando as chances do paciente ser submetido a tratamentos bem sucedidos. A caracterização do tecido mamário humano por Espectroscopia Raman Dispersiva, em comprimentos de onda de excitação do visível ao infravermelho, primeiramente visava identificar os picos Raman e compostos predominantes para classificar as lesões em três grandes grupos baseados no diagnóstico histológico: normal, tecido com alterações fibrocísticas e carcinoma ductal. Em 1992, Redd e colaboradores identificaram diferenças nas concentrações de lipídios e carotenóides, que se mostraram mais intensas no tecido normal do que nas alterações fibrocísticas e carcinoma ductal. Porém, o diagnóstico diferencial entre patologias benignas e malignas não foi possível. Frank e colaboradores (1994), também caracterizaram amostras de tecido mamário humano em diferentes comprimentos de onda de excitação, em relação à composição dos lipídios e carotenóides presentes nestes tecidos e as suas alterações no decorrer do processo de carcinogênese. Em 1995, Frank e colaboradores fixaram o comprimento de onda de excitação em 784 nm com um detector de CCD que reduzia a interferência da fluorescência produzida. O estudo baseou-se nas diferenças entre os espectros de tecido mamário de diversos pacientes, onde primeiramente verificou-se que as diferenças entre todos os espectros de tecido normal foram menores que 5 %. Identificaram também uma drástica mudança a partir da obtenção dos espectros de tecido fibrocístico e carcinoma intraductal, porém ainda não conseguiram estabelecer diagnóstico diferencial. A dificuldade, portanto, se encontra na diferenciação entre os Espectros Raman dos tecidos mamários com alterações benignas e malignas. Análises estatísticas multivariadas, baseadas na Análise dos Componentes Principais (PCA), foram empregadas na tentativa de resolver este problema. Manoharan e colaboradores (1996) foram capazes de diagnosticar corretamente 14 em 15 amostras de tecido normais, 13 em 15 amostras de tecido com alterações benignas e 31 em 31 amostras de tecido mamário humano com alterações malignas, utilizando-se destes métodos estatísticos. A reação desmoplásica dos carcinomas justificava a comparação do espectro Raman dos carcinomas ductais com espectro de colágeno. Porém, o verdadeiro potencial diagnóstico desta técnica permanecia obscurecido: os espectros dos ductos alterados não conseguiam ser identificados. A partir desta lógica, o estudo do câncer de mama por Espectroscopia Raman tomou novos rumos. Kline e colaboradores (1998) foram os pioneiros na utilização da técnica de imagem Raman obtida de tecido mamário humano por Espectroscopia Micro-Raman. Utilizaram esta técnica, associada à análise matemática multivariada, para avaliar a distribuição de lipídios e proteínas dentro do tecido mamário normal e com câncer, e assim promover o diagnóstico diferencial, a partir do fato de que as alterações cancerosas apresentam reação desmoplástica, ou seja, o desenvolvimento de tecido fibroso em substituição a um tecido lipídico. Justifica-se a visualização dos componentes como um passo essencial no desenvolvimento de uma “Biopsia Óptica” quantitativa adequada para a detecção não invasiva do câncer de mama. Manoharan e colaboradores (1998) conseguiram obter o diagnóstico diferencial entre mama normal e tecidos mamários com alterações neoplásicas benignas e malignas, obtidos de amostras de punção por agulha fina, utilizando a técnica de Espectroscopia Micro-Raman, com o objetivo de melhorar a exatidão do diagnóstico das amostragens por agulha fina. Além disso, pôde com a técnica, identificar em solução objetos microscópicos fluorescentes, comprovando a possibilidade de se identificar estas alterações em meio heterogêneo. O potencial clínico da Espectroscopia Raman desperta interesse para o desenvolvimento de importantes pesquisas baseadas nos espectros obtidos por MicroRaman confocal, a partir de amostras de tecido mamário colhidas por punção de agulha fina. Estes resultados futuramente servirão de dados base para o SERS através da amplificação destes sinais para o estudo de marcadores tumorais (MC DANIEL et al., 2003). Shafer-Peltier e colaboradores (2002), publicaram trabalho baseado nos espectros de tecido mamários obtidos pela técnica de Espectroscopia Micro-Raman. O princípio é o mesmo da técnica macroscópica, no entanto, ao equipamento foi acoplado um microscópio confocal para ajustar a imagem microscópica permitindo o foco do laser a até 1µm pontual. Ainda câmeras CCD de captura de imagens digitais, desenvolvimento de algoritmos matemáticos sofisticados para filtragem e análise destes espectros, possibilitaram a obtenção de uma imagem química da amostra, facilmente comparável a uma lâmina histológica. Para o entendimento da morfologia e da bioquímica dos tecidos mamários obtidos a partir desta técnica, Shafer-Peltier e colaboradores obtiveram imagens espectrais a partir da soma dos espectros isolados dos componentes do tecido mamário humano: componentes celulares, lipídios, colesterol, beta caroteno, colágeno, hidroxiapatita de cálcio, oxalato de cálcio e água. O resultados desta pesquisa descrevem em porcentagem as variações existentes entre estes componentes em diferentes estados do tecido mamário: sem alterações, com alterações benignas e em tumores malignos. A imagem química Raman da distribuição de lipídios, proteínas e ácidos nucléicos em tecido mamário é realizada sem a utilização de agentes de contraste invasivos. Ao contrário, a discriminação dos componentes tissulares é baseada na particularidade do espectro vibracional intrínseco dos compostos. No entanto, o contraste da imagem química é conseguido quando a técnica de Espectroscopia Raman é empregada, incluindo as análises dos deslocamentos de picos e análises multivariadas de imagem. A visualização de componentes tissulares de mama é um passo essencial no desenvolvimento de uma análise quantitativa de biópsia óptica baseada na técnica Raman compatível para detecções minimamente invasivas para classificação das diversas patologias mamárias (KLINE; TREADO, 1998). Baseados nos fundamentos das análises mamográficas para diagnóstico clínico de câncer de mama, Haka e colaboradores (2002) analisaram, utilizando Espectroscopia Micro-Raman, as microcalcificações de tumores benignos e malignos da mama através de lâminas histológicas. O estudo pode ser assim realizado pelo fato de as microcalcificações serem relativamente inertes aos efeitos da preparação da amostra para estudo microscópico, e, além disso, os autores possuíam espectros Raman de amostras de microcalcificações não fixadas para efeito de comparação. Neste estudo utilizou-se um Equipamento Raman Dispersivo, com laser de excitação em 830 nm, acoplado a um microscópio confocal, focando o laser em 2 µm. Aplicando a Análise dos Componentes Principais (PCA) nos espectros obtidos, foram capazes de diferenciar os diferentes tipos de microcalcificações que ocorrem nos ductos mamários. Para as alterações benignas diagnosticaram a presença de calcificação tipo I, as calcificações tipo II foram diagnosticadas tanto para neoplasias benignas quanto para malignas, porém com maior significância para as últimas. Os resultados apresentaram 88% e 93% de sensibilidade e especificidade, respectivamente, promovendo uma discussão sobre o desenvolvimento desta técnica diagnóstica frente a mamografia, que não permite tal diferenciação das microcalcificações (HAKA et al., 2002). Existem também estudos promissores na análise dos linfonodos axilares das pacientes com diagnóstico de câncer de mama. Smith e colaboradores (2003) publicaram o estudo baseado no mapeamento dos linfonodos axilares. O método de mapeamento espectral consiste na varredura de toda a amostra biológica, deslocando pequenos pontos para a aquisição dos espectros Micro-Raman. A imagem, visualizada na tela do computador obtida a partir da escolha de um pico significativo da amostra, e por análises matemática, como PCA, mostraram a distribuição deste pico dentro do espaço de mapeamento. Escolhidos os picos de interesse e feita a plotagem em imagem química, o que se obtém é uma imagem computadorizada que futuramente será idêntica às lâminas histológicas. A Espectroscopia FT-Raman pode ser melhorada, ainda medindo amostra macroscópicas, para identificação de compostos protéicos muito importantes para o diagnóstico e prognóstico de câncer de mama. Os marcadores tumorais podem ser identificados pela técnica Raman Intensificado por Superfície (SERS), técnica na qual se aplicam substratos metálicos, como a prata, na amostra de tecido biológico, aumentando enormemente a eficiência do Efeito Raman e melhorando o detalhamento do espectro Raman. McDaniel e colaboradores (2003) avaliaram, pela técnica SERS, o genótipo do citocromo P450 3A4 para identificação de tumores mamários, baseando-se nas hipóteses de que a expressão do gene CYP 3A4 tem representação clínica no câncer de mama e que a espectroscopia juntamente com análises genéticas permitem resultados exatos, podendo ser perfeitamente aplicados em clínica. 3.2 Inferência para duas populações Nesta fase do presente estudo, existe a necessidade de se padronizar as medidas bem como verificar a correlação entre os espectros FT-Raman coletados neste trabalho. Assim, abordaremos o tópico importante de comparar duas populações baseadas em técnicas estatísticas, supondo que as variáveis deste estudo tenham distrib uição normal (BUSSAB, 2004). 3.2.1 Teste t de Student para duas amostras independentes Este teste estatístico é provavelmente o mais amplamente utilizado em todos os tempos. É certamente o mais conhecido de todos por ser um teste simples, direto, fácil de aplicar e adaptável a vários tipos de situações. Sua utilidade é ocasionada pelo fato de que a pesquisa científica freqüentemente examina o fenômeno da natureza através de duas variáveis ao mesmo tempo, com a finalidade de questionar questões do tipo: “Este tecido mamário está doente ou é normal?”; “Existem diferenças entre o tecido com condição fibrocística da mama e carcinoma ductal infiltrante baseados em seus espectros FT-Raman?”. Cada uma destas perguntas, para este estudo, propõe o estudo estatístico de três amostragens independentes, sendo cada um destes grupos compostos por um conjunto de espectros FT-Raman separados de acordo com o modelo histopatológico: tecido de mama sadio; tecido alterado benigno, no caso condição fibrocística; e carcinoma ductal infiltrante, representando as lesões malignas. Sendo assim se torna obvio que o grupo mama normal seja independe ao grupo condição fibrocística e carcinoma ductal infiltrante. Para inferir sobre a diferença estatística entre duas populações o teste da hipótese nula H0 : não existe diferença entre as médias de dois grupos, será utilizado. A aceitação ou rejeição desta hipótese parte da fixação a priori de um nível de significância α, que neste estudo é de 0,05, ou 5 %. Sendo assim, o intervalo de confiança e a região crítica com base nos valores críticos para α/2 e 1-α/2, são determinados. Para valores da diferença das médias fora do intervalo de confiança H0 é rejeitada. Porém, existe outra maneira de proceder, a qual tem como chave o valor p, chamado de probabilidade de significância, que é calculado a partir dos dados obtidos na investigação. A principal diferença está em não construir a região crítica ou intervalo de confiança. Este procedimento indica a probabilidade de ocorrer valores da estatística mais extremos do que o observado sob a hipótese H0 ser verdadeira. (MORETTIN; BUSSAB, 2004). Assim, a estratégia para comparar populações por meios de seus parâmetros envolve suposições sobre a forma das suas distribuições de probabilidades, para então, testar médias e variâncias. Se H0 for verdadeira, todas as amostras têm origem em populações com a mesma distribuição de probabilidades, assim, a diferença entre grupos se deve à amostragem aleatória. Se o valor p for baixo (p < α), Ho é rejeitada, e conclui- se que a diferença é estatisticamente significativa para o nível de significância α, e as possibilidades de sobreposição das distribuições de probabilidade é pequena. Se p for alto (p ≥ α), Ho é aceita, e os dados não dão nenhuma razão estatística para concluir que as médias dos grupos diferem significativamente e haverá uma quantidade significativa de sobreposição entre as distribuições de probabilidades dos grupos (ZAR, et al., 1999). O teste t de Student é apropriado para inferir esse tipo de situação. Sendo assim neste presente trabalho, o tecido mamário humano feminino foi estudado através do teste t de Student a partir dos espectros FT-Raman de cada tipo histológico (mama normal, condição fibrocística e carcinoma ductal infiltrante) usados como padrão espectral que descrevem sua bioquímica e morfologia. As mudanças transicionais encontradas nos tecidos pré-cancerosos assim como as anormalidades benignas como inflamação podem também gerar espectros que permitem sua diferenciação (MAHADEVAN-JANSEN; RICHADS-KORTUM, 1996). Para o teste t de Student utilizou-se como hipótese de Ho que as amostras randomizadas são parte de populações que possuem a mesma distribuição normal. As hipóteses nulas a serem verificadas são: (1) médias das componentes espectrais de mama normal e condição fibrocística são iguais; (2) médias das componentes espectrais de mama normal e carcinoma ductal são iguais; (3) médias das componentes espectrais do carcinoma ductal e infiltrante são iguais. A implicação imediata é que qualquer diferença encontrada entre as médias das amostras deveria ser significativamente diferente de zero. 3.3 A Mama Humana e a Carcinogênese A incidência do câncer de mama feminina vem experimentando um crescimento contínuo na última década, o que pode ser resultado de mudanças sócio-demográficas e acessibilidade aos serviços de saúde permitindo o seu diagnóstico. Seu prognóstico é relativamente bom se diagnosticado nos estádios iniciais. Estima-se que a sobrevida média geral cumulativa após cinco anos seja de 65%, podendo variar entre 53 e 74%, nos países desenvolvidos, e de 51%,variando entre 49 e 56%, para os países em desenvolvimento. Na população mundial, a sobrevida média após cinco anos é de 61% (INCA, 2003). Fatores de risco em mulheres incluem história familiar de câncer de mama, endométrio e próstata, diagnóstico confirmado de hiperplasia atípica, densidade da mama aumentada, história de menarca precoce ou menopausa tardia, obesidade após a menopausa, reposição hormonal pós- menopausa, nuliparidade ou primeira gravidez após 30 anos de idade e consumo de bebidas alcoólicas. Os genes BRCA1 e BRCA2, genes supressores identificados como responsáveis pelo desenvolvimento de câncer de mama familiar, são responsáveis por apenas 5% de todos os casos que ocorrem na população feminina. Por outro lado, a atividade física regular parece ser fator de proteção (INCA 2003). Apesar do desenvolvimento de novas técnicas cirúrgicas e dos avanços em quimioterapia e radioterapia, observa-se que a mortalidade causada por esta enfermidade se ma ntém em um patamar pouco variável. No entanto, quando detectados e tratados de forma adequada precocemente, as taxas de mortalidade reduzem significativamente (STOCKS, 1992; MURPHY et al., 1995; SOUEN, 1996; MARTORELLI FILHO, 2000; PINOTTI; TEIXEIRA, 2000; GREENBAUN, 2000). 3.3.1 Histofisiologia da Mama A glândula mamária em repouso é constituída de seis a dez sistemas de ductos principais, cada um deles subdividido em lóbos, que são as unidades funcionais do parênquima mamário. Cada sistema ductal drena, através de um ducto excretor principal separado, denominado seio lactífero. As ramificações sucessivas dos grandes ductos distais dão origem aos ductos terminais. Antes da puberdade, o complexo sistema de ductos ramificados termina em fundo cego. No início da menarca ocorre a proliferação distal, dando origem a lóbulos, que consistem em agrupamentos de dúctulos ou ácinos revestidos de epitélio (LONGACRE; BARTOW, 1986; ELLIS et al., 1993; CONTRAN; KUMAR; COLLINS, 2000). A maior parte do estroma da mama consiste em tecido fibroconjuntivo denso misturado com abundante tecido adiposo, o estroma interlobular, contendo fibras elásticas que sustentam os grandes ductos. Os lóbulos estão contidos em delicado estroma mixomatoso frouxo, específico da mama hormonalmente responsivo, que contém alguns linfócitos espalhados, o estroma interlobular (Figura 1) (LONGACRE; BARTOW, 1986). Assim como o endométrio aumenta e diminui a cada ciclo menstrual, observa-se o mesmo com a mama. Na primeira metade ou fase folicular do ciclo menstrual, os lóbulos são relativamente em repouso. Após a ovulação, sob a influência do estrógeno e dos níveis crescentes de progesterona, tanto a proliferação celular quanto o aumento no número de ácinos por lóbulos aumentam, e ocorre vacuolização das células epiteliais basais. O edema do estroma lobular torna-se pronunciado. Esse efeito estimulador combinado com o estrogênio e a progesterona sobre os elementos mamários intralobulares é responsável pela sensação de edema comumente percebida pelas mulheres durante a fase pré- menstrual do ciclo. Quando ocorre menstruação, a queda dos níveis de estrógeno e progesterona é acompanhada da morte de células epiteliais por apoptose, desaparecimento do edema do estroma, infiltração linfocítica e regressão global do tamanho dos lóbulos (LONGACRE; BARTOW, 1986). Somente com o início da gravidez é que a mama assume a sua maturação morfológica e atividade funcional completa. A partir de cada ducto terminal, numerosas glândulas secretoras verdadeiras desenvolvem-se, formando aglomerados semelhantes a cachos de uva. Em conseqüência, ocorre uma reversão da relação habitual entre o estroma e o epitélio, de modo que no final da gravidez, a mama é quase inteiramente constituída de lóbulos separados por uma quantidade relativamente escassa de estroma. Os lóbulos são revestidos por células cubóides e, no terceiro trimestre, são encontrados vacúolos secretores de material lipídico no interior das células. Imediatamente após o nascimento, começa a secreção de leite (Figura 2) (LONGACRE; BARTOW, 1986). Depois da terceira década de vida da mulher, os ductos atrofiam-se com maior redução do estroma intra e interlobular. Os ácinos lobulares e o estroma podem desaparecer quase por completo nas mulheres muito idosas, deixando apenas ductos que criam um padrão morfológico semelhante ao da mama masculina. Entretanto, na maioria das mulheres, existe uma estimulação estrogênica persistente suficiente, possivelmente de origem supra-renal ou das reservas de gordura corporal, para manter os remanescentes vestigiais dos lóbulos que diferenciam até mesmo a mama de mulheres muito idosas da mama masculina. O estroma interlobular radiodenso da mama de mulheres jovens limita-se predominantemente ao sexo feminino. Nos homens, a mama é uma estrutura rudimentar relativamente insensível às influencias endócrinas e aparentemente resistente ao crescimento neoplásico. Por outro lado, na mulher, a estrutura mamária mais complexa, o maior volume mamário e a extrema sensibilidade às influencias endócrinas predispõem esse órgão a diversas condições patológicas (LONGACRE; BARTOW, 1986). 3.3.2 Condição Fibrocística As doenças da mama manifestam-se, em sua maioria, como massas palpáveis, lesões inflamatórias, com secreção de líquido não-lactífero pelo mamilo, ou anormalidades mamográficas (CONTRAN; KUMAR; COLLINS, 2000). O termo condição fibrocística engloba uma variedade de alterações morfológicas que ocorrem na mama feminina e constituem um distúrbio isolado mais comum da mama, sendo responsável por mais da metade de todas as intervenções cirúrgicas da mama feminina. Em um estudo que se considera mama normal, isto é, em casos post- mortem forenses não–selecionados, foram encontradas alterações císticas e fibroses macroscopicamente evidentes em 20% dos casos, enquanto ocorrem alterações histológicas em 59% das mulheres. A condição é rara antes da adolescência. Pode ser diagnosticada freqüentemente entre 20 e 40 anos de idade, atinge um pico na menopausa ou imediatamente antes e raramente desenvolve-se após a menopausa. Entretanto, as lesões pré- menopausas podem persistir durante muitos anos (CONTRAN; KUMAR; COLLINS, 2000). Acredita-se que os distúrbios hormonais sejam fundamentais para o desenvolvimento desse distúrbio de múltiplos padrões. O excesso de estrogênio pode representar um aumento absoluto, como nos tumores ovarianos funcionantes raramente associados, ou pode estar relacionado a uma deficiência de progesterona, conforme observado em mulheres anovulatórias. Há também algumas evidências de metabolismo anormal dos hormônios no órgão terminal na patogenia da doença cística. O uso de anticoncepcionais orais diminui o risco de alterações fibrocísticas, presumivelmente devido ao suprimento de uma fonte equilibrada de progesterona a e estrogênio. Existem três padrões principais de alterações morfológicas: (1) formação de cisto, freqüentemente com metaplasia apócrina; (2) fibrose; (3) adenose (Figura 3) (CONTRAN; KUMAR; COLLINS, 2000). Os cistos, macroscopicamente, podem ocorrer em uma das mamas, porém a doença é multifocal e com freqüência bilateral. Em conseqüência da dilatação cística dos ductos e lóbulos, as áreas acometidas revelam, à palpação, um aumento difuso mal definido na sua consistência, bem como nodularidades discretas. Os cistos pequenos e estreitamente agregados produzem uma textura nodular. Os cistos maiores, particularmente quando solitários, causam maior alarme quando aparecem como massas isoladas firmes enganosamente persistentes. Os produtos secretórios no interior dos cistos sofrem calcificação, resultando em microcalcificações detectadas na mamografia. Esses cistos intactos exibem coloração acastanhada a azulada, devido ao líquido semitransparente contido. Com freqüência os cistos são revestidos por grandes células poligonais que possuem abundante citoplasma granular eosinófilo, com pequenos núcleos redondos intensamente cromáticos, lembrando o epitélio apócrino das glândulas sudoríparas (metaplasia apócrina). Essa metaplasia apócrina é encontrada comumente na mama normal e é quase sempre benigna. O crescimento epitelial exagerado e as projeções papilares são comuns nos cistos revestidos por epitélio apócrino. Nos cistos maiores, as células de revestimento podem ser achatadas ou totalmente atróficas. Com freqüência os cistos sofrem ruptura liberando material secretório no estroma adjacente. A conseqüente inflamação crônica e fibrose contribuem para a consistência firme da mama (CONTRAN; KUMAR; COLLINS, 2000). A adenose é reconhecida como aumento no número de unidades acinares por lóbulo. Ocorre adenose fisiológica durante a gravidez, todavia, essa alteração também pode ser observada em mulheres não- grávidas. As luzes glandulares estão freqüentemente aumentadas, caracterizando adenose ductal, e não são deformadas como as das lesões distintamente proliferativas denominadas adenoses esclerosantes. Em certas ocasiões, observam-se calcificações no interior das luzes. Na ausência de doença mamária proliferativa, as alterações fibrocísticas não aumentam o risco de desenvolvimento de câncer. Todavia, essas alterações podem chamar a atenção clínica quando imitam um carcinoma ao produzir massas palpáveis, densidades ou calcificações na mamografia ou secreção do mamilo. Os cistos e a fibrose produzem os achados nodulares no exame físico, podendo dificultar a detecção de outras massas mamárias. Os cistos aumentados solitários podem formar densidades na mamografia ou massas palpáveis, entretanto, podem ser geralmente diagnosticados pelo desaparecimento da massa após aspiração do conteúdo cístico que contêm resíduos sólidos ou os aglomerados de pequenos cistos, podendo exigir excisão cirúrgica. As calcificações, sempre formam aglomerados suspeitos na mamografia. As alterações fibrocísticas também estão raramente associadas a uma secreção unilateral espontânea do mamilo (CONTRAN; KUMAR; COLLINS, 2000). 3.3.3 Carcinoma de Mama Os carcinomas são divididos em carcinomas não- infiltrantes ou in situ e carcinomas infiltrantes. O carcinoma in situ foi originalmente classificado em ductal ou lobular, baseando-se na semelhança dos espaços afetados com ductos e lóbulos. Embora estes termos descritos ainda sejam utilizados, acredita-se que todos os carcinomas se originam da unidade lobular ductal terminal, de modo que os termos “ductal” e “lobular” não implicam mais um local ou um tipo celular de origem. Os tipos histológicos mais comuns de carcinoma de mama invasivo, infiltrante, estão relacionados na Tabela 1. Outros tipos menos comuns, como carcinomas apócrinos, carcinomas com diferenciação neuroendócrina, carcinoma de células raras, entre outros, assemelham-se clinicamente aos carcinomas sem tipo especial de comportamento e prognóstico, de modo que não estão incluídos. O carcinoma inflamatório se refere à manifestação clínica de um carcinoma que afeta extensamente os linfáticos dérmicos, resultando em aumento de mama eritematosa, sem padrão histológico específico (CONTRAN; KUMAR; COLLINS, 2000). Tabela 1 - Distribuição dos tipos histológicos de câncer de mama Cânceres Totais * Carcinoma In Situ 15-30% Carcinoma ductal in situ 80% Carcinoma lobular in situ 20% Carcinoma Invasivo 70-85% Carcinoma ductal – sem tipo especial 79% Carcinoma lobular 10% Carcinoma tubular – cribiforme 6% Carcinoma colóide – mucinoso 2% Carcinoma medular 2% Carcinoma papilar 1% *A proporção de carcinomas in situ detectados depende do número de mulheres submetidas à triagem com mamografia, e varia de menos de 5% em populações não submetidas à triagem a 50% em pacientes com cânceres detectados com triagem. Os números atuais observados se situam entre esses dois extremos. (DIXON et al., 1985). 3.3.3.1 Carcinoma Ductal In Situ O número de casos de carcinoma ductal in situ (CDIS) aumentou rapidamente nas últimas duas décadas, de menos de 5% de todos os carcinomas antes da triagem com mamografia a atualmente 15 a 30% dos carcinomas em populações submetidas à triagem. Entre os cânceres detectados através de mamografia, quase metade é representada por CDIS. A lesão consiste numa população de células malignas que carecem da capacidade de invadir através da membrana basal, sendo, portanto incapaz de produzir metástases distantes. Entretanto, essas células podem sofrer disseminação através de um sistema ductal e produzir lesões extensas, comprometendo todo um setor da mama. Quando o carcinoma in situ afeta lóbulos, os ácinos estão freqüentemente deformados e sem dobras, assumindo o aspecto de pequenos ductos (Figura 4). Historicamente, ao carcinomas in situ foram divididos em cinco subtipos arquiteturais: comedocarcinoma, sólido, cribiforme, papilar e micropapilar. Alguns casos de carcinomas in situ exibem um único padrão de crescimento, porém a maioria apresenta uma mistura de padrões (CONTRAN; KUMAR; COLLINS, 2000). 3.3.3.2 Carcinoma Ductal in situ tipo Comedo ou Comedocarcinoma O Comedocarcinoma se caracteriza por camadas sólidas de células malignas de indiferenciadas e necrose central. A necrose, que costuma sofrer calcificação, é detectada na mamografia como aglomerados ou microcalcificações lineares ramificadas. Ao exame macroscópico, podem ser observadas áreas puntiformes de material necrótico, semelhante ao comedão. É comum a ocorrência de fibrose concêntrica periductal e inflamação crônica, e, algumas vezes, lesões extensas são palpáveis como área de nodulidade vaga (Figura 5) (CONTRAN; KUMAR; COLLINS, 2000). 3.3.3.3 Carcinoma Ductal Infiltrante O carcinoma ductal infiltrante inclui a maioria dos carcinomas, cerca de 70 a 80 %. A maioria destes cânceres exibe um aumento pronunciado no estroma fibroso denso, dando ao tumor uma consistência dura, conhecido como carcinoma cirroso. Esses crescimentos ocorrem na forma de nódulos bem delimitados, de consistência pétrea, com diâmetro médio de um a 2 cm, que raramente ultrapassam quatro a 5 cm. À palpação, pode revelar uma aderência infiltrativa às estruturas adjacentes, com fixação à parede torácica subjacente, enrugamento da pele e retração do mamilo. A massa é característica em corte transversal. É retirada abaixo da superfície de corte, possui consistência cartilaginosa dura e produz um som áspero quando raspada. No foco central, existem pequenos focos puntiformes ou estrias de estroma elastótico esbranquiçado e, em certas ocasiões, pequenos focos de calcificação (Figuras 6 e 7) (CONTRAN; KUMAR; COLLINS, 2000). Ao exame histológico, o tumor consiste em células malignas dispostas em cordões, ninhos celulares sólidos, túbulos, massas anastomosantes e misturas de todas essas formas invadindo o estroma. O detalhe citológico das células tumorais varia desde pequenas células com núcleos regulares moderadamente hipercromáticos até células gigantes com grandes núcleos irregulares hipercromáticos. Com freqüência, a invasão dos linfáticos e espaços perineurais é facilmente evidente (Figura 8). A aneuploidia e a ausência de receptores hormonais variam com o grau, ocorrendo em mais da metade dos tumores pouco diferenciados e em menos da metade dos tumores bem diferenciados (CONTRAN; KUMAR; COLLINS, 2000). 3.3.3.4 Carcinoma Ductal Infiltrante Inflamatório Alguns tumores ductais infiltrantes da mama tendem a comprometer amplamente o tecido mamário, danificando a maioria dos vasos linfáticos dérmicos, produzindo edema agudo e eritema com hipersensibilidade da mama. Esta condição clínica é conhecia como carcinoma ductal infiltrante inflamatório (Figura 9) (CONTRAN; KUMAR; COLLINS, 2000). 3.3.3.5 Carcinoma Ductal Infiltrante Medular O carcinoma medular é responsável por um a 5 % de todos os carcinomas mamários e ocorre em mulheres mais jovens que a média. Entretanto, são desproporcionalmente descritos em mulheres com gene BRCA1 , quando representam, nesse grupo, 13 % dos cânceres. O tamanho típico do carcinoma medular é de dois a 3 cm, entretanto, alguns produzem grandes massas tumorais de 5 cm de diâmetro ou mais. Esses tumores não exibem a notável desmoplasia do carcinoma comum e, portanto, são nitidamente mais acessíveis à palpação externa e corte transversal. O tumor possui consistência mole e carnosa, o termo medular é de origem latina e se refere a uma estrutura mole, e é bem circunscrito. Do ponto de vista histológico, o carcinoma se caracteriza por: (a) camadas sólidas, semelhantes a sincícios, que ocupam mais de 75 % do tumor, de células grandes com núcleos vesiculares, freqüentemente pleomórficos, que contêm nucléolos proeminentes e mitoses freqüentes, (b) infiltrado linfoplasmocitário moderado a pronunciado no interior do tumor e ao seu redor e (c) borda não- infiltrativa (Figura 10). Os carcinomas medulares possuem prognóstico ligeiramente melhor do que os carcinomas ductais infiltrantes sem tipo especial, apesar da presença quase universal de fatores de prognóstico sombrio, incluindo elevado grau nuclear, aneuploidia, ausência de receptores hormonais, expressão de p53 e elevada taxa de proliferação. O padrão de crescimento sincicial e as bordas não- infiltrativas podem refletir retenção ou expressão excessiva de moléculas de adesão passíveis de limitar o potencial metastático (CONTRAN; KUMAR; COLLINS, 2000). 3.3.3.6 Carcinoma Colóide ou Mucinoso Essa variante incomum, cerca de um a 6 % de todos os carcinomas, tende a ocorrer em mulheres de idade mais avançada e cresce lentamente no decorrer de muitos anos. Ao exame histológico, são observados grandes lagos de mucina amorfa, de coloração clara, dissecando e se estendendo nos espaços teciduais contíguos e nos planos de clivagem. Flutuando nessa mucina, são encontradas pequenas ilhas e células neoplásicas isoladas, que algumas vezes formam glândulas. Em 14 a 50 % dos casos, ocorre diferenciação neuroendócrina na forma de grânulos argirófilos (Figura 11). O tumor é extremamente mole e possui a consistência e o aspecto de gelatina cinzaazulado pálida. Em geral, os carcinomas colóides são bem circunscritos e podem limitar lesões benignas ao exame físico e na mamografia. A taxa de sobrevida é apreciavelmente menor no carcinoma colóide do que nos carcinomas sem tipo especial, e ocorrem metástases para linfonodos em pelo menos de 20 % das pacientes (CONTRAN; KUMAR; COLLINS, 2000). 3.3.3.7 Carcinoma Lobular Infiltrante Apesar de constituírem apenas cinco a 10 % dos carcinomas de mama, os carcinomas lobulares infiltrantes possuem interesse particular devido sua tendência a ser bilateral com mais freqüência do que outros tipos, e a probabilidade de ocorrer câncer na mama contralateral é da ordem de 20 %; tendem a ser multicêntricos na mesma mama. Com freqüência, possuem padrão difusamente invasivo, que pode dificultar a detecção dos tumores primários e das metástases através de exame físico ou estudos radiológicos. Metastatizam-se mais freqüentemente para o líquido cefalorraquidiano, superfícies serosas, ovário e útero e para a medula óssea em comparação com outros subtipos. Ao exame macroscópico, o tumor se apresenta elástico e pouco circunscrito; entretanto, algumas vezes, possui aspecto cirroso típico. Ao exame histológico, observam-se feixes de células tumorais infiltrantes, muitas vezes com largura de apenas uma célula, formando uma fila única, que estão frouxamente dispersos me toda a matriz fibrosa. No tipo clássico, as células do carcinoma lobular infiltrante são pequenas, apresentando relativamente pouco pleomorfismo nuclear. É comum a presença de células em anel de sinete. Além disso, podem ocorrer ninhos sólidos de forma irregular em continuidade com o padrão em paliçada. As células tumorais estão freqüentemente dispostas de maneira concêntrica ao redor dos ductos normais (Figura 12). Em geral, os carcinomas lobulares infiltrantes bem diferenciados clássicos são diplóides, possuem receptores hormonais e em mais de 90 % dos casos e apresentam prognóstico mais satisfatório do que os carcinomas ductais sem tipo especial. Praticamente todos os carcinomas lobulares infiltrantes carecem da molécula de adesão celular caderina-E, em comparação com apenas 52 % dos carcinomas ductais infiltrantes (CONTRAN; KUMAR; COLLINS, 2000). Figura 1. Corte histológico de glândula mamária adulta jovem normal, onde se observa o sistema secretor composto por lóbulos e ductos situados no estroma interlobular composto predominantemente por tecido fibroso denso, com alguns adipócitos.* Figura 2. Corte histológico de glândula mamária feminina adulta jovem normal durante a lactação. Neste observa-se o sistema secretor preenchido por secreção lactífera.* Figura 3. Corte histológico de doença fibrocística da mama.* Figura 4. Corte histológico de Carcinoma ductal in situ.* Figura 5. Corte histológico Carcinoma ductal in situ tipo comedo.* Figura 6. Aspecto Macroscópico do Carcinoma ductal infiltrante de Mama.* Figura 7. Corte histológico e lâmina citológica de Carcinoma ductal infiltrante.* Figura 8. Corte histológico de Carcinoma ductal infiltrante. * Figura 9. Corte histológico de Carcinoma ductal infiltrante inflamatório.* Figura 10. Corte histológico de Carcinoma ductal infiltrante medular, com linfócitos infiltrando nas camadas de células tumorais de alto grau.* Figura 11. Corte histológico de carcinoma ductal infiltrante mucinoso. Observe os lagos de mucina levemente corada, com pequenas ilhas de células tumorais.* Figura 12. Corte histológico de Carcinoma lobular infiltrante.* *(Cortesia de Profa. Dra. Leandra Naira Zambelli Ramalho – FMRP-USP) 4 METODOLOGIA Esta pesquisa seguiu os Princípios Éticos, segundo as diretrizes e normas regulamentadoras de pesquisa envolvendo seres humanos, conforme Resolução no 196/96 do Conselho Nacional de Saúde. Esta pesquisa teve aprovação das Comissões de Ética em Pesquisa do Hospital do Câncer A. C. Camargo (N o 268/00 – Anexo A) e da Universidade do Vale do Paraíba (UNIVAP) (017/2000/CEP – Anexo B). Todas as pacientes foram informadas sobre a pesquisa e assinaram um termo de consentimento para utilização do material colhido para a realização da mesma (Apêndice A). 4.1 Obtenção das amostras de tecido mamário 4.1.1 Cirurgia para Ressecção das Amostras As amostras de tecido mamário alterado foram obtidas de 30 pacientes do gênero feminino atendidas no Ambulatório de Mastologia do Hospital do Câncer A. C. Camargo, São Paulo, no período de Fevereiro a Outubro de 2001. Estas pacientes apresentavam nódulos ao exame físico e/ou alterações radiográficas à mamografia. As amostras de tecido mamário normal foram obtidas de cinco pacientes submetidas à cirurgia estética para redução de mama. Todas as amostras apresentaram diferentes tamanhos e formatos, com dimensões variando de 0,3 x 0,5 x 0,3 cm a 0,5 x 1,5 x 0,5 cm. 4.1.2 Armazenamento das amostras antes da Espectroscopia FT-Raman. A separação das amostras para o experimento foi realizada logo após o procedimento de ressecção cirúrgica do material. As mesmas foram devidamente identificadas, sendo colocadas em tubos criogênicos Nalgene ® e, em seguida, armazenadas em nitrogênio líquido a –196 o C até o momento da realização da Espectroscopia FT-Raman no Laboratório de Espectroscopia Vibracional Biomédica (LEVB) da Universidade do Vale do Paraíba (UNIVAP) em São José dos Campos, São Paulo 4.2 Obtenção dos espectros FT-Raman 4.2.1 Espectrômetro FT-Raman O equipamento utilizado neste estudo para aquisição dos espectros Raman das amostras de mama humana foi o FT-Raman Spectrometer RFS 100 da Bruker Alemanha, instalado no LEVB (Figura 13). O equipamento se compõe de subunidades importantes que serão descritas a seguir. Figura 13. FT-Raman Spectrometer RFS 100, Bruker. 4.2.1.1 LASER Nd: YAG (Neodímio: Ítrio Alumínio Granada) O LASER de Nd: YAG usado no FT-Raman Spectrometer emite alta intensidade de radiação em 1064 nm A potência do laser deste equipamento é de no máximo 500 mW, podendo ser eletronicamente ajustada para cada tipo de amostra a ser estudada. Neste experimento, a potência ajustada para o laser de Nd: YAG foi de 110 mW na amostra, potência máxima ajustada para a coleta dos sinais com melhor razão sinal/ruído, sem que houvesse aquecimento ou degradação das amostras. 4.2.1.2 Geometria de Espalhamento Neste estudo, utilizou-se a geometria de espalhamento de 180 o (Figura 14), devido ao alto grau de rejeição contra o Espalhamento Rayleigh. Para maximizar o sinal Raman, fixou-se cada amostra em um espelho de Alumínio. Figura 14.Geometria de Espalhamento e Porta Amostra do FT-Raman Spectrometer RFS 100. 4.2.2 Parâmetros do Equipamento A partir do software instalado no FT-Raman Spectrometer RFS 100, o OPUS versão 4.2, Copyright Bruker Optik GmHb 1997-2002, pode-se ajustar todos os parâmetros do equipamento, como potência do laser, abertura de feixe, ajuste na transformada de Fourier, auxílio durante a aquisição dos espectros, armazenamento e manipulação dos dados espectrais, gráficos em três dimensões (3D); análises quantitativas, armazenamento dos dados em forma de bibliotecas. A seguir serão descritos (Tabela 2) os parâmetros ajustados no Equipamento FTRaman, para a aquisição dos espectros Raman, tanto para as amostras normais, quanto para as amostras alteradas. Tabela 2. Parâmetros ajustados com auxílio do Software OPUS 4.2 para a aquisição dos espectros no FTRaman Spectrometer RFS 100. Tecido Mamário Normal Espectrômetro FT-Raman RFS 100 Tecido Mamário Alterado Parâmetros de Aquisição Espera antes das medidas 10 segundos 10 segundos Espera para Estabilização 5 segundos 5 segundos Número de Varreduras 100 150 Resolução 4 cm-1 4 cm-1 Tempo total de Varreduras (médio) 180 segundos 246 segundos Parâmetros Ópticos Abertura do Feixe Potência do Laser Raman Potência do Laser na Amostra Velocidade da Varredura 5.0 mm 150 mW saída 110 mW 4; 5.0 KHz Neste experimento, estabeleceu-se que as amostras não ficariam expostas ao ambiente por mais de 10 minutos. Sendo assim, ajustados os parâmetros do equipamento, adequamos a coleta de um a três espectros Raman por amostra. Este número variou porque o equipamento rejeita espectros de baixa qualidade, aumentando o tempo de coleta para atingir o número de varreduras desejadas. 4.2.3 Preparação das Amostras para Experimento Sendo o objetivo da Espectroscopia Raman fornecer resultados morfo-químicos sem a manipulação das amostras, foi a título de padronização que os espécimes de tecido mamário foram adequados ao experimento, como descrito a seguir: 4.2.3.1 Descongelamento das Amostras No intuito de preservar os espécimes biológicos, para que não se degradassem quando expostos ao ambiente, o descongelamento dos mesmos em soro fisiológico a 9 % foi realizado somente no momento serem utilizados para o experimento. Assim sendo, procedia-se o corte da matriz original congelada que rapidamente era recolocada no nitrogênio líquido. 4.2.3.2 Punch Os espectros FT-Raman de tecido mamário de 35 pacientes mulheres foram obtidos a partir de amostras congeladas padronizando, com um punch de 2 mm de diâmetro, a remoção de três a sete pequenas amostras, de 2 mm3 , simulando um exame Core Biopsy . O restante do ma terial foi novamente armazenado em Nitrogênio líquido para futuras análises, sem que estas amostras tivessem sido descongeladas. 4.2.3.3 Procedimento Pós-Espectroscopia Ao término da coleta dos espectros FT-Raman de cada nova amostra, as mesmas foram armazenadas separadamente em solução de formol 10 % para fixação e posterior análise histopatológica. 4.3 Análise Histopatológica As amostras armazenadas foram enviadas ao Departamento de Patologia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, na Universidade de São Paulo para realização da análise histopatológica. Avaliou-se a metodologia de manipulação e aquisição de espectros Raman através da avaliação da presença de deterioração das amostras. 4.4 Análise dos Dados Espectrais Os espectros FT-Raman obtidos e armazenados pelo OPUS (Bruker, Inc., Karlsruhe, Alemanha), foram convertidos para o formato ASCII, para posterior processamento e análise no Matlab da Mathworks Inc. 4.4.1 Análise Qualitativa Todos espectros obtidos neste estudo foram divididos em 9 grupos distintos a partir dos dados da análise histopatológica das amostras estudadas. Para cada um dos espectros foram ajustadas as linhas de base, com o auxílio do próprio software do sistema de FT-Raman, Bruker (OPUS ). Os espectros de cada grupo foram normalizados em relação ao pico de maior intensidade e posteriormente foram realizadas as médias de cada grupo a fim de se obter um padrão espectroscópico, no qual se basearam as análises qualitativas. As análises focaram as variações de intensidade, deslocamento e aparecimento de novos picos e bandas entre os espectros dos diferentes grupos; e a associação dos espectros dos tecidos mamários aos espectros de macromoléculas biológicas conhecidamente presentes nos tecidos mamários normais e alterados. 4.4.2 Análise Quantitativa Baseados na literatura científica sobre Espectroscopia Raman para fins de automatização de diagnóstico de câncer de mama, no presente estudo admitiu-se, para avaliação, a região de deslocamento Raman de 400 a 2500 cm-1 como característica dos espectros de tecido mamário para o processamento das análises estatísticas (MAHADEVAN-JANSEN, 1996). Primeiramente os espectros foram normalizados com seu máximo pico e para cada grupo calculados os coeficientes de correlação e realizado o teste t de Student. 4.4.2.1 Coeficientes de correlação Com vista a se obter uma melhor relação sinal-ruído do espectro (FT-Raman) de cada amostra, um espectro médio dos diferentes pontos de coleta na amostra foi obtido. Para tal, considerou-se somente os espectros que apresentaram um coeficiente de correlação maior ou igual a 0,7. Os espectros de cada amostra foram considerados independentes porque pela metodologia utilizada estes espécimes foram colhidos de maneira aleatória. 4.4.2.2 Teste t de Student O teste t de Student é muito utilizado em pesquisa para verificar se a diferença observada entre duas médias obtidas em diferentes amostras é significativa, e explicar se estas diferenças são reais ou se ocorrem devido ao erro amostral. Para uma primeira visualização dos dados, através deste teste, pretendeu-se observar uma separação entre os dados obtidos a partir de amostras de mama normais e entre as amostras que foram consideradas pelo exame histopatológico como condição fibrocística e carcinoma ductal infiltrante. Estes três grupos forma escolhidos por exemplificarem uma situação clínica muito importante, que é a diferenciação entre tecidos benignos e malignos, além de serem estes três grupos que se mostraram mais presentes neste estudo. Estatisticamente, quando se trabalha com uma amostragem pequena, existe uma tendência para que as médias das amostras sejam realmente diferentes, mesmo que se originem da mesma população. Neste caso, o Teste t-Student objetiva justamente verificar se o grau de diferença entre os três conjuntos ocorre devido a fatores outros que não o erro de amostragem. 5 RESULTADOS Todos os espectros de tecido mamário deste estudo foram obtidos através do espectrômetro FT-Raman RFS 100, Bruker, com fonte de excitação laser Nd: YAG a 1064 nm, coletados por um detector de germânio resfriado por nitrogênio líquido. A energia de excitação a 1064 nm, com potência de 110 mW nas amostras, se mostrou adequada, pois a maioria da emissão da fluorescência das moléculas orgânicas foram eliminadas e a presença de água não influenciou no espectro Raman. O aquecimento das amostras promovido pelo laser e o tempo de exposição ao meio ambiente que as mesmas permaneceram para a aquisição dos espectros não comprometeram a estrutura destas amostras, como comprovado pela histopatologia. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 -1 Deslocamento Raman (cm ) Figura 15 - Médias dos espectros FT-Raman normalizados pelo pico máximo dos tecidos de Mama normal (1), Condição fibrocística (2), Carcinoma ductal in situ (3), Carcinoma ductal in situ tipo comedo (4), Carcinoma ductal infiltrante (5), Carcinoma ductal infiltrante inflamatório (6), Carcinoma ductal infiltrante medular (7), Carcinoma ductal infiltrante mucinoso (8) e Carcinoma lobular infiltrante (9). Neste presente estudo, todos os dados espectrais foram inicialmente agrupados de acordo com os resultados da análise histopatológica. Na Figura 15, pode-se observar as médias dos espectros FT-Raman normalizados em seu pico máximo, 1446 cm-1 , referentes aos nove tipos histopatológicos encontrados neste presente estudo. São eles: Mama normal, Condição fibrocística, Carcinoma ductal in situ, Carcinoma ductal in situ comedo, Carcinoma ductal infiltrante, Carcinoma ductal infiltrante inflamatório, Carcinoma ductal infiltrante medular, Carcinoma ductal infiltrante mucinoso, Carcinoma lobular infiltrante. Para cada grupo de espectro foram calculados os Coeficientes de correlação relacionando os espectros de mesmo diagnóstico, determinando a proporcionalidade entre os dados do mesmo grupo (Tabela 3). Tabela 3 - Coeficiente de correlação dos Espectros FT-Raman dos Grupos Histopatológicos. Diagnóstico Histopatológico Espectros FT-Raman Coeficientes de Correlação (CC) Mama Normal 31 0,55 < CC < 0,99 Condição Fibrocística 28 0,60 < CC < 0,98 Carcinoma Ductal in Situ 2 0,98 < CC < 0,99 Carcinoma Ductal in Situ Comedo 2 0,95 < CC < 0,99 102 0,70 < CC < 0,98 Carcinoma Ductal Infiltrante Inflamatório 13 0,85 < CC <0,98 Carcinoma Ductal Infiltrante Medular 14 0,71< CC < 0,96 Carcinoma Ductal Infiltrante Mucinoso 6 0,72 < CC < 0,86 Carcinoma Lobular Infiltrante 10 0,92 < CC < 0,98 208 - Carcinoma Ductal Infiltrante TOTAL DE ESPECTROS FT-RAMAN Visando obter-se uma melhor relação sinal/ruído dos espectros de tecido mamário, um espectro médio de cada grupo diagnóstico foram adquiridos, a partir dos diferentes pontos de coleta nas amostras, considerando somente os espectros que apresentaram um coeficiente de correlação maior ou igual a 0,7. De maneira geral, as diferenças nos espectros Raman entre os tecidos normais e alterados são relativamente fáceis de serem comparadas visualmente. Utilizando-se de algoritmos matemáticos mais simples, baseados nas características de bandas Raman, através da Deconvolução dos espectros, foram identificadas diferentes intensidades e energias destes picos nos espectros médios dos tipos histológicos de mama envolvidos neste estudo. A Deconvolução é um processo de decomposição de um sinal complexo em seus componentes individuais, através da otimização pelo critério de mínimos quadrados, tendo como parâmetros de entrada o número e posição dos picos, forma e largura do sinal e uma linha de base. Para melhor entendimento das bases moleculares dos espectros Raman observados do tecido mamário humano normal e patológico, apresentam-se, nas Tabelas 4 e 5, as bases moleculares e modos vibracionais relativos ao tecido mamário humano normal e patológico de acordo com os dados da literatura (DOLLISH, 1974; KELLER, 1994; MIZUNO, 1994; SHIM, 1996; MANOHARAN, 1997; MAHADEVANJANSEN, 1998; STONE, 2000; HATA, 2000). Tabela 4 - Relação dos Picos Raman analisados pelo Software Origin 5.0 através da Análise Gaussiana de Múltiplos Picos e tentativa de identificação da maioria dos modos vibracionais observados nos tecidos mamários normais e patológicos. Picos MN CF CDIS CDI CDII CDIM CDIMU CLI 1 - 538,9 538,95 538,92 538,68 538,72 538,76 538,64 2 858,75 861,7 858,4 854,08 853,34 854,57 869,38 853,51 3 - 935,6 - 964,83 970,27 962,09 976,14 971,26 4 1005 1005,3 - 1005,4 1004,7 1004,8 1007,1 1005,7 5 1080,6 1091,4 1080,7 1082,4 1084,4 1095,6 1091,6 1083,5 6 1266,6 1261,2 1264,1 1262,5 1261,1 1274,5 1277,2 1266,9 7 1304,0 1305,4 1304,8 1305,2 1303,8 1303,3 1305,4 1303,6 8 1446,4 1449,4 1447,5 1448,6 1448,0 1450,2 1449,6 1447,8 9 1657,1 1657,7 1657,8 1659,5 1659,1 1659,7 1657,1 1657,8 10 1747,4 1747,6 1746,4 1748,1 1746,4 1743,5 1748,0 1747,8 11 - - 2028,9 2028,9 2029,0 2029,3 2028,5 2029,0 12 - - 2084,2 2084,2 2083,7 2083,6 2079,1 2084,3 MN = mama normal; CF = condição fibrocística; CDIS = carcinoma ductal in situ; CDISC = carcinoma ductal in situ comedo; CDI = carcinoma ductal infiltrante; CDII = carcinoma ductal infiltrante inflamatório; CDIM = carcinoma ductal infiltrante medular; CDIMU = carcinoma ductal infiltrante mucinoso; CLI = carcinoma lobular infiltrante. Tabela 5 - Modos Vibracionais e Biomoléculas referentes picos Raman de tecido mamário humano normal e patológico. Picos Modos Vibracionais Biomoléculas 1 (SS), (CO) e (NO), (OPO) Cisteína, Hemoprotéinas, Ácidos Nucléicos ν (CC), δ(CCH), Anel Aromático, 2 Prolina, Tirosina, Polissacarídeos, Ácidos Nucléicos (OPO) 3 ν (CC), α-helix, (OPO) Prolina, Valina, Colágeno, Desoxirribose 4 ν s(CC), Anel Aromático, (CCH3 ) Fenilalanina, Carotenóides 5 ν (CC) ou ν (CO), (CH OH) Fosfolipídios, Carboidratos 6 ν (CN), δ(NH), Amida III, α-helix, (=CH) Colágeno, Triptofano, Lipídios 7 δ(CH2), (δCH3) Colágeno, Fosfolipídios, Triglicérides 8 δ(CH2), δ(CH3), (OPO) Colágeno, Fosfolipídios, Desoxirribose, Carboidratos 9 ν (C=O), Amida I, α-helix, (C=C) Colágeno, Elastina, Lipídios 10 ν (C=O) Fosfolipídios 11 (CO) Proteínas, Ácidos Nucléicos 12 C=O/ CN/ CO Proteínas, Ácidos Nucléicos -1 Intensidade (u.a.) 1446cm 1304cm Tecido Mamário Normal Doença Fibrocística Carcinoma Ductal in Situ Carcinoma Ductal in Situ Comedo Carcinoma Ductal Infiltrante Carcinoma Ductal Infiltrante Inflamatório Carcinoma Ductal Infiltrante Medular Carcinoma Ductal Infiltrante Mucinoso Carcinoma Lobular Infiltrante -1 -1 1657cm 1270cm -1 -1 1747cm 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 -1 Deslocamento Raman (cm ) Figura 16 - Média dos Espectros FT-Raman não-normalizados dos diferentes tecidos mamários representados entre 1200 a 1800cm-1 . Através da Deconvolução dos espectros FT-Raman dos nove tipos histopatológicos encontrados nestes estudo, propôs-se uma análise qualitativa dos padrões espectrais dos mesmos, combinando as diferenças espectrais aos achados histopatológicos. Na Figura 16, observam-se que as diferenças entre os espectros Raman dos tecidos de mama normal e patológicos são relativamente fáceis de serem comparadas visualmente. A grande quantidade de lipídios presentes no tecido mamário normal pode ser claramente identificada por fortes bandas Raman em: (i) 1270 cm-1 relacionadas ao modo vibracional de estiramento ν(CN) e de dobramento δ (NH); (ii) 1304 cm-1 relacionada ao modo vibracional de dobramento da ligação δCH2 , (iii) 1446 cm-1 também relacionada ao modo vibracional de dobramento entre os átomos de carbono e hidrogênio δCH2 , (iv) 1657 cm-1 relacionada ao modo vibracional de estiramento da ligação C=C e (v) 1747 cm-1 relacionada ao modo vibracional de estiramento da ligação C=O. Intensidade (u.a.) Mama Normal CA Ductal in Situ CA Ductal Infiltrante Alanina (C3H 7NO2) Glicina (C 2H5NO2) Prolina e Hidroxiprolina Alanina (C3H 7NO2) Glicina (C2H 5NO2) Prolina e Hidroxiprolina 3 FENILANALINA 1 2 800 900 1000 1100 1200 1300 1400 -1 Deslocamento Raman (cm ) Figura 17 - Média dos Espectros FT-Raman normalizados pelo pico máximo (1446 cm-1 ) de tecido mamário humano normal, Carcinoma ductal in situ e Carcinoma ductal infiltrante representados no deslocamento Raman entre 800 a 1400cm-1 . Em evidência estão as regiões espectrais identificadas como referentes os aminoácidos formadores do colágeno. Na Figura 17, existem três regiões, que nesta figura estão destacadas pelo quadrado, que caracterizam os principais aminoácidos constituintes do colágeno. As regiões demarcadas mostram o aumento da intensidade do sinal do tecido tumoral em relação ao tecido normal, e especialmente o aumento da intensidade quando o carcinoma se torna infiltrante. Nos espectros de Mama normal, Carcinoma ductal in situ, e Carcinoma ductal infiltrante, em relação às áreas representativas do colágeno, observou-se que na área 1, o pico mais intenso encontrado no tecido normal está em 858 cm-1 de largura de linha de 57,15 cm-1 ; no tecido mamário com Carcinoma ductal in situ, este pico mais intenso se não se desloca, mas tem sua largura de linha aumentada para 73,42 cm-1 ; no Carcinoma ductal infiltrante, o pico mais intenso está situado em 872 cm-1 e largura de linha de 47,15 cm-1 . Na área 2, os picos encontrados referentes aos aminoácidos no tecido mamário normal foram: 919 e 972 cm-1 , com largura de linha de 66,23 e 14,03 cm-1 respectivamente; no tecido Carcinoma ductal in situ estes picos deslocaram para a posição 932 e 967 cm-1 , com larguras de linha de 30,53 e 27,57 cm-1 , respectivamente. Nos espectros com Carcinoma ductal infiltrante, ocorreram deslocamentos de picos máximos para região de 923 e 964 cm-1 , com larguras de linha variando para 19,11 e 22,68 cm-1 , além do surgimento de um novo pico em 941 cm-1 de largura de linha de 15,17 cm-1 . Na Área 3, não foram observados picos nesta região no tecido normal, porém com o desenvolvimento do Carcinoma ductal in situ se observou uma banda centrada em 1317 cm-1 com largura de linha de 140,84 cm-1 , que se deslocou para 1311 cm-1 com largura de linha de 112,54 cm-1 no espectro de Carcinoma ductal infiltrante. Mama Normal CA Ductal in Situ CA Ductal Infiltrante Intensidade (u.a.) Amida I (C=O) Amida III (C-N, N-H) 1657cm -1 -1 1270cm 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800 -1 Deslocamento Raman (cm ) Figura 18 - Média dos Espectros FT-Raman de tecido mamário normal, Carcinoma ductal in situ e Carcinoma ductal infiltrante e representação dos Picos e Bandas entre 1200 a 1700cm-1 . Em evidência estão as regiões espectrais identificadas como referentes à representação espectral da estrutura secundária das proteínas, através das ligações peptídicas. Na Figura 18, observa-se a região de deslocamento Raman do modo vibracional Amida III, que no espectro Mama normal o pico máximo localiza-se em 1304 cm-1 com largura de linha de 20,12 cm-1 . Esta banda, no Carcinoma ductal in situ não se deslocou, porém se tornou mais larga, com 25,02 cm-1 de largura de linha. No Carcinoma ductal infiltrante, esta banda se deslocou para a posição de 1305 cm-1 com largura de linha de 20,54 cm-1 . Na região de deslocamento Raman referente ao modo vibracional Amida I, o espectro Mama normal apresentou deslocamento Raman em 1657 cm-1 com largura de linha de 16,77 cm-1 . No espectro do Carcinoma ductal in situ, não houve deslocamento porém esta banda se tornou mais larga, com 27,41 cm-1 . No Carcinoma ductal infiltrante, esta mesma banda se deslocou para a posição de 1659 cm-1 com largura de linha de 24,84 cm-1 . Carcinoma Ductal in Situ Carcinoma Ductal in Situ Comedo Intensidade (u.a.) 1450cm 1447cm -1 CH 2 C=C -1 -1 1310cm -1 1661cm CH2 1657cm -1 1304cm 800 1000 1200 1400 -1 1600 1800 -1 Deslocamento Raman (cm ) Figura 19. Média dos Espectros FT-Raman de Carcinoma ductal in situ e Carcinoma ductal in situ Comedo. Na Figura 19 observamos claramente, dentro da demarcação quadrada pontilhada, que a diferença entre os sinais Raman de Carcinoma ductal in situ e Carcinoma ductal in situ comedo, o aumento da intensidade e aspecto ruidoso do espectro do segundo me relação ao primeiro. Os picos referentes aos deslocamentos das freqüências Raman que qualificam os espectros dos mesmos, destacam-se: o pico em 1304 cm-1 no tecido Carcinoma ductal in situ se deslocou para 1310 cm-1 no Carcinoma in situ comedo, além de ter a largura de linha variado de 25,02 cm-1 para 31,25 cm-1 . O pico em 1447 cm-1 no tecido Carcinoma ductal in situ se deslocou para 1450 cm-1 no Carcinoma in situ comedo, além de ter a largura de linha variado de 31,28 cm-1 para 37,82 cm-1 ; o pico em 1657 cm-1 no tecido Carcinoma ductal in situ se deslocou para 1661 cm-1 no CA in situ comedo, além de ter a largura de linha variado de 27,41 cm-1 para 31,81 cm-1 . Tecido Mamário Normal Doença Fibrocística CA Ductal in Situ CA Ductal in Situ Comedo CA Ductal Infiltrante CA Ductal Infiltrante Inflamatório CA Ductal Infiltrante Medular Carcinoma Ductal Infiltrante Mucinoso Carcinoma Lobular Infiltrante Intensidade (u.a.) C-H 2950cm -1 OH (NH) 3250cm 2700 2800 2900 3000 -1 3100 3200 3300 3400 -1 Deslocamento Raman (cm ) Figura 20. Média dos Espectros FT-Raman referentes aos Nove tipos Histológicos estudados na região de deslocamento Raman de 2700 a 3400cm-1 referente ao gasto energético tecidual. Na Figura 20, observa-se no tecido normal, que a região de deslocamento Raman em 2950 cm-1 apresentou maior intensidade, e praticamente não apresentou manifestação na região de deslocamento 3250 cm-1 . De maneira contrária, se expressam todos os outros tecidos mamários patológicos, onde observamos um grande aumento na intensidade na banda de 3250 cm-1 em relação à banda em 2950 cm-1 . CA Ductal Infiltrante Mucinoso CA Ductal Infiltrante Doença Fibrocística C-O Intensidade (u.a) -CH OH 800 900 1000 1100 1200 -1 Deslocamento Raman (cm ) Figura 21. Média dos Espectros FT-Raman de Carcinoma ductal infiltrante, Carcinoma ductal infiltrante mucinoso e Condição fibrocística. Na Figura 21 observam-se picos referentes às vibrações moleculares que identificam os carboidratos que constituem a substância amorfa presente em conteúdo cístico representada no espectro de tecido mamário, existiram alguns deslocamentos de pico importantes: o pico em 1062 cm-1 referente à ligação -CH OH no espectro de Carcinoma ductal infiltrante se deslocou para 1071,7 cm-1 no Carcinoma ductal infiltrante mucinoso e para 1061 cm-1 na Condição Fibrocística, além de ter a largura de linha variado de 7,18 cm-1 para 31,74 e 60,87 cm-1 , respectivamente. O pico em 1082 cm-1 referente à ligação C-O no espectro de Carcinoma ductal infiltrante se deslocou para 1091 cm-1 no Carcinoma infiltrante mucinoso e para 1091 cm-1 na Condição fibrocística; além de ter a largura de linha variado de 38,05 cm-1 para 10,87 cm-1 e 39,721 cm-1 , respectivamente. Intensidade (u.a.) Mama Normal Carcinoma Ductal in Situ Carcinoma Ductal Infiltrante Carcinoma Lobular Infiltrante 500 520 540 560 580 -1 Deslocamento Raman (cm ) Figura 22. Médias dos Espectros FT-Raman referentes aos tecidos Mama normal, Carcinoma ductal in situ, Carcinoma ductal infiltrante e Carcinoma lobular infiltrante. Como podemos observar na Figura 22, na região de deslocamento Raman de 500 a 580 cm-1 existem diferenças que facilmente diferencial nos espectros dos tecidos normais, in situ e infiltrantes, mostrando que esta região espectral pode ser uma área de bastante interesse para o diagnóstico clínico. O pico mais evidente nesta figura, 538cm1 , pode representar as alterações de material genético que ocorrem durante o processo tumoral. Nesta figura estão representados os espectros dos tecidos mamários com alterações do epitélio ductal ou lobular. O tecido epitelial da mama, composto de ductos e lóbulos, é o elemento principal das transformações neoplásicas expostas; as diferenças encontradas nestes espectros condizem somente às alterações envolvendo somente as células epiteliais e suas transformações neoplásicas in situ e infiltrante. Notamos que no tecido mamário normal existe o pico em 538 cm-1 , de baixa intensidade quando comparados aos outros espectros. No Carcinoma ductal in situ, o centro do pico 538 cm1 , não deslocou, mas aumentou a intensidade e tem largura de linha de 7,94 cm-1 . Neste espectro nota-se o aparecimento de um novo pico, centrado em 521 cm-1 , com largura de linha de 11,69 cm-1 . Nos espectros de Carcinoma infiltrante, tanto ductal quanto lobular, apresentaram este pico mais intenso e similar, mostrando possivelmente as alterações encontradas nesta faixa de deslocamento podem estar relacionadas às alterações que identifiquem a invasividade dos tumores. O pico em 538 cm-1 se manteve na mesma posição, somente variando a largura de linha para 6,41 cm-1 no Carcinoma ductal infiltrante e para 5,8 cm-1 no Carcinoma lobular infiltrante. Intensidade (u.a.) Mama Normal Carcinoma Ductal in Situ Carcinoma Ductal Infiltrante Carcinoma Lobular Infiltrante 2000 2020 2040 2060 2080 2100 -1 Deslocamento Raman (cm ) Figura 23. Médias dos Espectros FT-Raman referentes aos espectros Mama normal, Carcinoma ductal in situ, Carcinoma ductal infiltrante e Carcinoma lobular infiltrante. Na Figura 23, observa-se que os espectros apresentam diferenças importantes que podem diferenciá-los entre Normal, tumores in situ e infiltrantes. No espectro Carcinoma ductal in situ, o centro dos picos estão em 2028 e 2083 cm-1 e evidencia-se um aumento na intensidade dos mesmos quando observados os espectros dos carcinomas infiltrantes, tanto ductal como lobular. Nos espectros dos carcinomas infiltrantes, estas bandas apresentaram o centro em 2029 e 2084 cm-1 , porém com larguras de linha diferentes: 9,27 e 8,01 cm-1 para o tipo ductal, e 7,04 e 6,24 cm-1 , para o tipo lobular relacionados aos primeiro e segundo picos, respectivamente. Todas as informações contidas nos 208 espectros FT-Raman de tecido mamário humano obtidos neste presente estudo, mostraram-se extremamente complexa para serem analisadas ind ividualmente. Por esta razão, esta enorme quantidade de estruturas dificultou a identificação precisa dos picos e as vibrações relacionadas para uma abordagem particularizada dos compostos. Entretanto, todos estes espectros FT-Raman de tecido mamário se mostraram extremamente valiosos e definitivos como padrões matemáticos para o desenvolvimento de algoritmos de reconhecimento de padrões para diagnóstico automático. Para esta finalidade, existem várias técnicas de processamento de sinais que visam classificação de padrões. Para este estudo, utilizou-se o Teste t de Student para validar estatisticamente as principais diferenças espectrais, promovendo posteriormente a dispersão destes dados em função das áreas destes principais picos. As Figuras 24, 25 e 26 mostram o conjunto de espectros FT-Raman obtidos a partir dos tecidos de Mama normal, Condição Fibrocística e Carcinoma ductal infiltrante. As figuras dos espectros foram obtidas através do software Matlab 6.2, estão com as linhas de base corrigidas e normalizados em seu pico máximo Figura 24 – Espectros FT-Raman de tecido mamário normal, com correção de linha de base e normalizado em seu pico máximo pelo software Matlab . Figura 25 - Espectros FT-Raman de Condição fibrocística, com correção de linha de base e normalizado em seu pico máximo pelo software Matlab . Figura 26 - Espectros FT-Raman de Carcinoma ductal infiltrante, com correção de linha de base e normalizado em seu pico máximo pelo software Matlab . As Figuras 27, 28 e 29 mostram a comparação estatística, com o Teste t de Student, entre cada componente espectral (Deslocamento Raman - cm-1 ) da Mama Normal e Condição Fibrocística, Mama Normal e Carcinoma Ductal Infiltrante, e Condição Fibrocística e Carcinoma Ductal Infiltrante, respectivamente. Figura 27. Nível de Significância (p) para o Teste t de Student (linha horizontal, p= a = 0,05) entre Média dos Espectros de Mama Normal e Condição Fibrocística. Figura 28. Nível de Significância (p) para o Teste t de Student (linha horizontal, p= a = 0,05) entre média dos espectros de Mama normal e Carcinoma ductal infiltrante. Figura 29. Nível de Significância (p) para o Teste t de Student (linha horizontal, p= a = 0,05) entre média dos espectros de Condição fibrocística e Carcinoma ductal infiltrante. O deslocamento Raman entre a Mama Normal e Condição Fibrocística (Figura 27) mostrou-se estatisticamente diferente (p < α) nas bandas cujos picos correspondem a 540, 940, 1004, 1270, 1340, 1457, 1657 e 2084 cm-1 . Estes picos estão relacionados às biomoléculas conforme descritas na Tabela 6. Resultado similar foi obtido ao se comparar à Mama Normal e Carcinoma Ductal Infiltrante (Figura 28). Deve-se indicar que, em ambos os casos, o deslocamento Raman 2028 cm-1 , relacionada a proteínas/ácidos nucléicos (Tabela 6), embora estatisticamente não se tenha mostrado com diferença significativa (p > α), visualmente a sua média (Figura 30) mostra diferença. Este resultado pode ser devido à pequena relação sinal-ruído desta componente no espectro Raman. A comparação entre Condição Fibrocística e Carcinoma Ductal Infiltrante (Figura 29), basicamente, mostrou diferenças nas bandas anteriormente apontadas, porém com diferentes valores de significância p. Tabela 6. Teste t de Student correspondente aos espectros FT-Raman de mama normal, condição fibrocística e carcinoma ductal infiltrante em relação aos picos estatisticamente relevantes para diferenciação das médias. Picos (cm-1 ) 1 540 2 940 3 1004 4 1270 5 1340 6 1457 7 1657 8 2028 9 2084 Biomoléculas Correspondentes Cisteína (aa) Proteínas Fenilalanina (aa)/ Proteínas/ RNA Ribossomal Lipídios/ Proteínas (amida III)/ Carboidratos (?C—C—H/ dC—C) Triptofano (aa)/ RNA Ribossomal Lipídios/ Proteínas/ Ácidos Nucléicos/ Carboidratos = (C—H) Lipídios/ Proteínas Proteínas/ Ácidos Nucléicos Proteínas/ Ácidos Nucléicos 6 Mama Normal CA Ductal Infiltrante Condição Fibrocística Intensidade (u.a.) 7 5 4 1 2 3 8 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 9 2000 2200 -1 Deslocamento Raman (cm ) Figura 30. Média dos espectros FT-Raman de Mama normal, Condição fibrocística e Carcinoma ductal infiltrante, obtidas pelo espectrômetro FT-Raman RFS 100, Bruker, onde estão demarcados pelos quadrados os picos analisados pelo teste t de Student. Na Figura 30 estão representados as médias dos espectros de Mama normal, Condição fibrocística e Carcinoma ductal infiltrante, para melhor visualização das áreas espectrais cujas as diferenças entre os espectros são estaticamente significativas. Na Tabela 6, constam as biomoléculas correspondentes a estas regiões espectrais. Foram elaborados os gráficos de Dispersão binomial em função das áreas dos picos Raman identificados pelo teste t de Student com a finalidade de observar se estas áreas, quando agrupadas de duas a duas, promoveriam a separação dos grupos de acordo o tipo histopatológico. Todos os espectros destes grupos foram dispersos e os gráficos que seguem mostram os resultados desta análise. 75 Figura 31 - 2028 cm-1 versus 2084 cm-1 Figura 32 - 1657 cm-1 versus 2084 cm-1 76 Figura 33 - 1657 cm-1 versus 2028 cm-1 Figura 34 - 1457 cm-1 versus 2084 cm-1 77 Figura 35 - 1457 cm-1 versus 2028 cm-1 Figura 36 - 1457 cm-1 versus 1657 cm-1 78 Figura 37 - 1340 cm-1 versus 2084 cm-1 Figura 38 - 1340 cm-1 versus 2028 cm-1 79 Figura 39 - 1340 cm-1 versus 1657 cm-1 Figura 40 - 1340 cm-1 versus 1457 cm-1 80 Figura 41 - 1270 cm-1 versus 2084 cm-1 Figura 42 - 1270 cm-1 versus 2028 cm-1 81 Figura 43 - 1270 cm-1 versus 1657 cm-1 Figura 44 - 1270 cm-1 versus 1457 cm-1 82 Figura 45 – 1270 cm-1 versus 1340 cm-1 Figura 46 - 1457 cm-1 versus 2084 cm-1 83 Figura 47 - 1004 cm-1 versus 2084 cm-1 Figura 48 - 1004 cm-1 versus 2028 cm-1 84 Figura 49 - 1004 cm-1 versus 1657 cm-1 Figura 50 - 1004 cm-1 versus 1457 cm-1 85 Figura 51 - 1004 cm-1 versus 1340 cm-1 Figura 52 - 1004 cm-1 versus 1270 cm-1 86 Figura 53 - 940 cm-1 versus 2840 cm-1 Figura 54 - 940 cm-1 versus 2028 cm-1 87 Figura 55 - 940 cm-1 versus 2028 cm-1 Figura 56 - 940 cm-1 versus 1457 cm-1 88 Figura 57 - 940 cm-1 versus 1657 cm-1 Figura 58 - 940 cm-1 versus 1340 cm-1 89 Figura 59 - 940 cm-1 versus 1270 cm-1 Figura 60 - 940 cm-1 versus 1004 cm-1 90 Figura 61 - 540 cm-1 versus 2084 cm-1 Figura 62 - 540 cm-1 versus 2028 cm-1 91 Figura 63 - 540 cm-1 versus 1657 cm-1 Figura 64 - 540 cm-1 versus 1457 cm-1 92 Figura 65 - 540 cm-1 versus 1270 cm-1 Figura 66 - 540 cm-1 versus 1340 cm-1 93 Figura 67 - 540 cm-1 versus 1004 cm-1 Figura 68 - 540 cm-1 versus 940 cm-1 94 Observando-se os Gráficos de dispersão, verificou-se que o teste t de Student não foi capaz de separar os espectros de Condição fibrocística e Carcinoma ductal infiltrante, porém os espectros de Mama normal foram separados com eficiência pelas seguintes combinações de áreas: 1270 versus 540 cm-1 , 1270 versus 1340 cm-1 , 1270 versus 1457 cm-1 , 1270 versus 1657 cm-1 , 1270 versus 2028 cm-1 , 1270 versus 2084 cm1 , 1340 versus 1657 cm-1 , 1340 versus 2028 cm-1 , 1340 versus 2084 cm-1 , 1457 versus 1657 cm-1 , 1657 versus 2028 cm-1 e 1657 versus 2084 cm-1 . Os picos mais importantes para classificação dos espectros, apresentados neste estudo, foram os picos 1270 cm-1 que identificam os modos vibracionais ν (CN), δ(NH), Amida III, α-helix e (=CH) e 1657 cm-1 com os modos vibracionais ν (C=O), Amida I, α-helix, (C=C), que representam, proteínas e lipídios. 95 6 DISCUSSÃO Estudos recentes têm investigado a praticabilidade do diagnóstico baseado na Espectroscopia Raman. A maioria destes estudos comparam o espectro de tecido normal e patológico ex vivo. Devido ao intervalo de tempo entre a excisão do tecido e o exame espectroscópico, estas amostras devem ser congeladas adequadamente para manter seu estado bioquímico nativo. Com o objetivo de estabelecer um procedimento ótimo para a Espectroscopia Raman de tecido ex vivo, os efeitos sobre a desidratação do tecido, fixação por formol ou congelamento em nitrogênio líquido, foram estudados por Shim e Wilson (1996) no intuito de determinar se qualquer um destes procedimentos introduziam artefatos aos espectros Raman. Experimentos em tecidos biológicos indicaram que ocorre aquecimento do tecido devido ao laser de excitação, porém não há mudança significativa dos espectros. A desidratação do tecido causada pela disrupção dos modos vibracionais das proteínas pode causar artefatos espectrais. Para evitar esta situação, neste presente estudo as amostras foram levadas à temperatura ambiente em soro fisiológico ou soro fetal bovino e permanecerem hidratadas durante todo o procedimento de coleta dos espectros, de acordo com os procedimentos preconizados por Shim e Wilson (1996). A primeira etapa do processo de otimização da técnica de Espectroscopia FTRaman para análise de tecido mamário humano requeriram que os espectros obtidos fossem comparados à técnica de reconhecimento histológico ouro, sendo a biópsia excisional combinada à histopatologia. Com este padrão de reconhecimento dos tecidos, os espectros foram separados para início das análises estatísticas. Stone e colaboradores (2004) avaliaram o potencial da espectroscopia Raman para construção de livrarias espectrais de diversos tipos de tecido humano, como: cólon, mama, próstata e predizer algoritmos para classificação de tecido e patologias. Neste estudo, seguiram um rigoroso protocolo de coleta espectral seguida de análise histopatológica auxiliados por especialistas em Patologia. Foram utilizados somente os dados espectrais, para construção da base de dados de treinamento, das amostras de tecido os quais a histopatologia revelou como sendo de uma patologia homogênea. Através da Figura 15 observa-se nos espectros Raman dos nove tipos histopatologicos encontrados neste estudo, que não existe uma banda Raman específica que prove definitivamente a existência do tumor ou que os diferenciem. Entretanto, 96 existem mudanças características de todos estes espectros, por exemplo, a diminuição da intensidade das bandas de ácidos graxos e aumento da intensidade e deslocamento das bandas de proteínas que podem representar algumas mudanças bioquímicas que ocorrem nos diferentes tipos histopatológicos que poderão favorecer sua classificação via espectroscopia Raman como descrito previamente por vários autores (PARKER, 1971; LONDON et al., 1992; FRANK et al., 1994; KELLER et al., 1994; MIZUNO et al., 1994; FELD et al., 1995; MAHADEVAN-JANSEN et al, 1995; MAHADEVANJANSEN; RICHARDS-KORTUM, 1996; MANOHARAN; WANG; FIELD, 1996; MAHADEVAN-JANSEN et al, 1998; MANOHARAN, 1998; HATA et al., 2000; PAPPAS, 2000; STONE et al., 2000; HAKA et al., 2002, KENDALL et al., 2003; LAU et al., 2003; MOLCKOVSKY et al., 2003; CROW et al., 2004; GNIADECKA et al., 2004; STONE et al., 2004). Os Coeficientes de Correlação dos espectros FT-Raman de tecido mamário indicados pela Tabela 3 variaram mais nos casos diagnosticados como Mama normal e Condição fibrocística. Nestes dois casos, em particular, parte das amostras de tecido eram compostas apenas por tecido adiposo nas Mamas normais e tecido fibroso nos tecidos com Condição fibrocística, sem manifestação de tecido epitelial, culminando em grandes diferenças entre os espectros dentro do mesmo grupo diagnóstico. Existem essencialmente dois tipos de tecido mamário, o tecido protéico, em sua maioria colágeno, e estruturas lipídicas, que geralmente se mostram combinadas. Algumas análises de clusterização dos espectros deste tecido protéico, como fator de análise, identificaram as diferenças típicas entre patologias benignas e malignas. Os espectros dos tumores são dependentes dos sítios de investigação das amostras (SCHRADER et al., 1997). Na Figura 16, observa-se que tecido mamário normal tem o espectro mais intenso, provavelmente devido a sua composição estrutural ser quase inteiramente de tecido adiposo. O sinal Raman dos ácidos graxos é conhecidamente muito intenso, e neste caso, sobrepõem-se sobre todos os outros sinais Raman dos demais componentes tissulares da mama normal, como ductos e lóbulos. Redd e colaboradores (1992) identificaram diferenças nas concentrações de lipídios e carotenóides, que se mostraram mais intensas no tecido de mama normal do que nas alterações fibrocísticas e carcinoma ductal, propondo que estas características espectrais poderiam promover diagnóstico 97 diferencial entre tecido normal, benigno e maligno. Frank e colaboradores (1994), também caracterizaram amostras de tecido mamário humano em diferentes comprimentos de onda de excitação, em relação à composição dos lipídios e carotenóides presentes e as alterações destes compostos no decorrer do processo de carcinogênese. Na Figura 17, como pôde ser observado por diversos autores, como Freire (2004) estudando carcinoma espinocelular de pele, Mahadevan-Jansen e RichardsKortum (1996), em estudo diversificado sobre espectroscopia em tecidos biológicos, identificaram o pico em 1005 cm-1 o denominando como representante do aminoácido Fenilalanina. Com a bibliografia levantada em relação aos modos vibracionais dos aminoácidos como Alanina, Valina e Glicina através da publicação de Schrader (1989), identificamos que estes aminoácidos também possuem modo vibracional em 1005 cm-1 . Sendo assim, justifica-se o aumento da intensidade deste pico nos tumores infiltrantes pela grande atividade mitótica, sendo representado no pico o aumento do material genético. Também pode ser observado nesta figura a menor intensidade do sinal de todos os espectros Raman dos tecidos mamários patológicos. Esta diminuição da intensidade ocorreu provavelmente devido aos seguintes fatores: (i) aspectos físicos relacionados à disposição desorganizada das células nos tecidos alterados, resultando em uma menor seção de espalhamento Raman, alterando, assim, a intensidade dos modos vibracionais e (ii) nos tecido patológicos da mama, a abundância de colágeno ocorre em função da reação desmoplástica decorrente do processo carcinogênico, e o sinal Raman deste componente é pouco intenso e ruidoso (FELD et al., 1995; MAHADEVAN-JANSEN et al, 1995; MAHADEVAN-JANSEN; RICHARDS-KORTUM, 1996; MANOHARAN; WANG; FIELD, 1996; MAHADEVAN-JANSEN et al, 1998; MANOHARAN, 1998; HATA et al., 2000; PAPPAS, 2000; STONE et al., 2000; HAKA et al., 2002). Na Figura 18, existem duas regiões destacadas pelo quadrado que identificam as ligações peptídicas da estrutura secundária das proteínas que são Raman ativas: Amida I e Amida III. As regiões demarcadas mostram o aumento da intensidade do sinal do tecido maligno em relação ao tecido normal, e especialmente o aumento da intensidade quando o carcinoma se torna infiltrante. A estrutura secundária das proteínas influencia significativamente o espectro Raman através das ligações peptídicas entre os 98 aminoácidos. Mahadevan-Jansen; Richards-Kortum (1996) estudando a participação das proteínas dentro do processo neoplásico por Espectroscopia Raman, verificaram vibrações corresponde às ligações dos aminoácidos residuais que formam a estrutura secundária da proteína na conformação α. Dentre os quatro modos normais de ligação entre os aminoácidos residuais existentes, dois são Raman ativos: o modo Amida I, cuja estrutura responsável pela vibração é o estiramento existente entre os átomos de carbono e oxigênio (C=O); e o modo Amida III, envolvendo dois tipos vibração: (i) a vibração de dobramento da ligação dos átomos de nitrogênio com hidrogênio, δ(N-H) e (ii) a vibração de estiramento correspondente à ligação dos átomos de carbono e nitrogênio, ν(C-N). (FELD et al., 1995; MAHADEVAN-JANSEN et al, 1995; MAHADEVANJANSEN; RICHARDS-KORTUM, 1996; MANOHARAN; WANG; FIELD, 1996; MAHADEVAN-JANSEN et al, 1998; MANOHARAN, 1998; HATA et al., 2000; PAPPAS, 2000; STONE et al., 2000; HAKA et al., 2002). Como observado na Figura 19, existem diferenças entre os espectros de Carcinoma ductal in situ e o Carcinoma ductal in situ comedo que podem ser justificadas em relação ao conteúdo necrótico presente em abundância no Carcinoma tipo Comedo, além da algumas figuras de linfócitos presentes decorrentes do processo inflamatório. Dentro da área quadrada pontilhada, destaca-se no espectro do Carcinoma ductal in situ comedo, além da semelhança espectral com o espectro de colesterol simulando necrose, obtido por Shafer-Peltier e colaboradores (2002), outras diferenças importantes, como o surgimento de um novo pico em 1005 cm-1 referente a aminoácidos e RNA. Na Figura 20 destacam-se áreas do espectro que podem ser utilizadas para promoção do diagnóstico diferencial entre patologias benignas e malignas. De maneira semelhante aos resultados encontrados por Weng e colaboradores (2000), onde verificaram as diferenças existentes entre os espectros FT-Raman de tecido esofágico normal e com carcinoma, observa-se diferenças importantes na região de deslocamento Raman de 2700 a 3400 cm-1 , que possivelmente se referem às moléculas envolvidas no metabolismo energético celular. Os modos vibracionais de estiramento OH (NH) possuem bandas Raman na região de 3250 cm–1 geralmente mais largas que as bandas Raman geradas pelo modo vibracional de estiramento da ligação C–H na região de deslocamento 2950 cm–1 . Neste trabalho, não utilizou-se esta região espectral para as 99 análises estatísticas, pois a região de 3250 cm-1 pode estar associada ao aquecimento da amostra perante a excitação do laser de Nd: YAG. Observamos, através dos espectros obtidos no LEVB, esta mesma característica espectral em diversos compostos, desde outros tipos de tecido biológico, desde bactérias e traquéia de rato, até compostos carbônicos inorgânicos. Na Figura 21, as bandas vibracionais em 1025 e 1045 cm −1 são responsáveis pelos modos vibracionais do grupo –CΗ OH e o modo de estiramento C–O acoplado ao modo de dobramento de C–O do grupo C–OH dos carboidratos, o que inclui glicose, frutose e glicogênio. Nos espectros FT-Raman representados na Figura 21, observam-se diferenças na região do espectro de 1050 à 1150 cm-1 que podem ser referentes ao conteúdo colóide presentes nos tecidos Condição fibrocística e Carcinoma ductal infiltrante mucinoso. Pode-se afirmar que nesta região de deslocamento, destacada pelo quadrado, existe aumento da intensidade do sinal dos espectros de Condição fibrocística e Carcinoma ductal infiltrante mucinoso em relação ao espectro de Carcinoma ductal infiltrante, o que não é observada no restante da figura, destacada pelo quadrado pontilhado. O uso da espectroscopia FT-Raman na análise da conformação do DNA tem mostrado a possibilidade de se extrair informações sobre as conformações a, ß ou outras conformações as quais o DNA pode ser encontrado. Na maioria das células, o DNA existe na forma ß, que não é exatamente uma estrutura, e sim uma família de interações do DNA com o ambiente. Geralmente, as bandas espectrais Raman referentes ao DNA podem ser designadas às vibrações predominantemente das quatro bases nitrogenadas adenina, timina, citosina e guanina (PETICOLAS; ENETSZ, 1992; DUNGUID et al., 1993). Mahadevan-Jansen e Richards-Kortum (1996) desenvolveram um trabalho sobre o modelamento morfológico de várias biomoléculas que participam do processo neoplásico; obtiveram diversos espectros destas substâncias isoladas em solução. Como resultado, estabeleceu-se os espectros dos ácidos nucléicos. De acordo estes autores, a região de deslocamento Raman de 500 a 800 cm-1 é repleta de picos e bandas relativamente fracas devido a vibração de anéis heterocíclicos das bases nitrogenadas. Também existem duas fortes linhas que representam as bases pirimidínicas em 770 cm-1 e outras em 670 cm-1 devido as bases purínicas, devido a vibração de seus anéis aromáticos. A região de deslocamento de 1100 a 1700 cm-1 também é rica em picos e 100 bandas pouco intensos referentes aos ácidos nucléicos. As bases pirimidínicas possuem energia característica em 1240 cm-1 enquanto as bases purínicas em 1480 e 1570 cm-1 . As pentoses também contribuem na caracterização vibracional dos ácidos nucléicos, como o modo vibracional de estiramento O-P-O localizado perto da região de deslocamento 800 cm-1 e pela vibração na região de 1460 cm-1 devido à deformação CH2 . Em relação ao grupo fosfato, existem três principais modos vibracionais: (i) o estiramento simétrico de dois fosfatos ionizados no éster difosfato próximo de 1095 cm1 , (ii) o estiramento simétrico de O-P-O entre a C3’ terminal de um nucleotídeo e C5’ terminal de um segundo nucleotídeo encontrada na região de 814 cm-1 no RNA e 809 cm-1 no DNA, e (iii) a vibração assimétrica de O-P-O localizada em 832 cm-1 no DNA (KELLER et al., 1994). Observa-se na Figura 23 que o espectro de Mama normal apresentou picos de menor intensidade nesta faixa de deslocamento Raman. Entretanto, os tecidos tumorais apresentaram bandas mais intensas que sugerem representação espectral de situações histológicas específicas do processo tumoral como perda de diferenciação, resultando em um aumento da razão núcleo/citoplasma e o aumento da atividade proliferativa, aumenta o montante de nucleoproteínas e ácidos nucléicos (BURNER et al., 1992). As células com alterações pré- malignas e malignas acumulam um montante anormal de subprodutos metabólicos com porfirinas (SVANBERG et al., 1994); também exprimem antígenos tumor-específicos únicos que podem ser detectados por serem moléculas Raman ativas. Uma das mudanças mais significativas que ocorrem na transformação neoplásica é o aumento do conteúdo celular de ácidos nucléicos; extensivos estudos de Espectroscopia indicam a possibilidade de identificação de alterações no DNA através das vibrações moleculares. Neste presente estudo, através da deconvolução dos espectros FT-Raman foram identificados os centros e as variações dos principais picos Raman de nove tipos histológicos de tecido mamário. Normalmente, a deconvolução produz resultados precisos quando a separação entre os centros dos picos de duas bandas é maior que suas meias- larguras, o que não ocorre nos espectros biológicos, principalmente nos espectros de proteínas. Em trabalho desenvolvido por Forato et al. (1998), onde propuseram um modelo teórico de deconvolução de espectros Raman e Infravermelho de proteínas, concluíram que as áreas ou intensidades originais com intensidades iguais foram 101 distorcidas em até 50% depois de realizada a deconvolução (FORATO et al., 1998). Geralmente, técnicas mais elaboradas como métodos estatísticos de análises multivariadas, podem melhorar a diferenciação dos espectros que permitirão o diagnóstico automático para detecção da doença em tempo real. Lau e colaboradores (2003) baseados em resultados sobre alterações moleculares de tecidos neoplásicos da nasofaringe identificados nos espectros Raman, exploraram maneiras automáticas de distinguir tecidos normais de patológicos. Encontrou diferenças nos espectros Raman, certificados pelo teste t de Student em três bandas 1290 a 1320 cm-1 (p = 0,005), 1420 a 1470 cm-1 (p = 0,006) e 1530 a 1580 cm-1 (p = 0,002). Analisando as biomoléculas da Tabela 6 do presente estudo, estas correspondem aos picos Raman avaliados pelo teste t de Student relacionados a diferenciação das médias FT-Raman de Mama normal, Condição fibrocística e Carcinoma ductal infiltrante. Estes picos Raman são basicamente relacionados a proteínas e lipídios que, neste presente estudo, promoveram a diferenciação entre os espectros de mama normal e espectros patológicos quando observamos as seguintes combinações dos gráficos de Dispersão: 1270 versus 540 cm-1 , 1270 versus 1340 cm-1 , 1270 versus 1457 cm-1 , 1270 versus 1657 cm-1 , 1270 versus 2028 cm-1 , 1270 versus 2084 cm-1 , 1340 versus 1657 cm1 , 1340 versus 2028 cm-1 , 1340 versus 2084 cm-1 , 1457 versus 1657 cm-1 , 1657 versus 2028 cm-1 e 1657 versus 2084 cm-1. O teste t de Student é um teste de hipótese que tem por objetivo determinar a afirmação sobre uma população, usualmente sobre um parâmetro desta, quando se deseja saber se os resultados experimentais provenientes de uma amostra contrariam ou não tal afirmação. Muitas vezes, essa afirmação sobre a população é derivada de teorias desenvolvidas no campo substantivo do conhecimento. A adequação ou não desta teoria ao universo real pode ser verificada ou refutada pela amostra. O objetivo do teste estatístico de hipóteses é, então, fornecer uma metodologia que permite verificar se os dados amostrais trazem evidências que apóiem ou não a hipótese formulada (MORETTIN, 2004). Os picos mais importantes para classificação dos espectros, apresentados neste estudo, foram os picos 1270 cm-1 que identificam os modos vibracionais ν (CN), δ(NH), Amida III, α-helix e (=CH) e 1657 cm-1 com os modos vibracionais ν (C=O), Amida I, α-helix, (C=C), que representam, proteínas e lipídios (PARKER, 1971; LONDON et al., 1992; FRANK et al., 1994; KELLER et al., 1994; MIZUNO et al., 1994; FELD et 102 al., 1995; MAHADEVAN-JANSEN RICHARDS-KORTUM, 1996; et al, 1995; MANOHARAN; MAHADEVAN-JANSEN; WANG; FIELD, 1996; MAHADEVAN-JANSEN et al, 1998; MANOHARAN, 1998; HATA et al., 2000; PAPPAS, 2000; STONE et al., 2000; HAKA et al., 2002, KENDALL et al., 2003; LAU et al., 2003; MOLCKOVSKY et al., 2003; CROW et al., 2004; GNIADECKA et al., 2004; STONE et al., 2004). A dificuldade, no entanto, se encontrou na diferenciação dos espectros Raman de tecidos com alterações benignas e malignas por meio destes algoritmos matemáticos e não na aquisição das informações espectrais pela técnica FT-Raman. Manoharan e colaboradores (1996) foram capazes de diagnosticar corretamente 14 em 15 espectros Raman de amostras de tecido mamário normal, 13 em 15 espectros de amostras de tecido com alterações benignas e 31 em 31 de tecido mamário com alterações malignas, utilizando-se da análise estatística dos principais componentes do espectro (PCA). Utilizando-se de dados da espectroscopia Raman para diagnostico diferencial, Molckovsky e colaboradores (2003) avaliaram o potencial diagnóstico das informações dos espectros Raman, obtidas através de fibra óptica, para distinguir adenomatose, pólipos hiperplásicos e tecido sem alterações de tecido do trato gastrintestinal, através de análises multivariadas (PCA) e análise discriminante linear como algoritmo de classificação dos mesmos. Este algoritmo identificou as amostras com 91 % de sensibilidade, 95 % de especificidade e 93 % de precisão. Foram analisadas amostras obtidas in vivo, a partir de dez pacientes com diagnóstico de adenomas e nove pacientes apresentando pólipos. O algoritmo desenvolvido apresentou 100 % de sensibilidade, 89 % especificidade e 95 % de precisão, avaliando esta amostragem. Jaganath e colaboradores (2004), utilizando algoritmo de ENVI, desenvolveram uma metodologia de diagnóstico automática para classificar os espectros de células uroteliais, obtidos a partir da urina coletada para exames rotineiros de avaliação de carcinoma de bexiga. A partir da clusterização destes espectros foi possível separar, com 82% e 81% de especificidade de sensibilidade, respectivamente, os espécimes celulares benignos e malignos sem que previamente tivessem obtido qualquer tipo de informação morfológica que permitisse a classificação das células. Gniadecka et al. (2004) estudaram a possibilidade de diagnóstico espectral para o melanoma, mais agressivo dentre os cânceres de pele. Justificou sua nova abordagem 103 identificando a baixa especificade e a sensibilidade do diagnóstico clínico para este tipo de patologia, que varia de 40 a 80 %. No estudo, os autores investigaram as mudanças químicas no melanoma e de outras lesões que clinicamente podem ser confundidas com este carcinoma: nevus pigmentado, carcinoma basocelular, queratose seborréica e pele normal. Os espectros foram obtidos através da Espectroscopia FT-Raman e por Redes Neurais foram classificados, pela sensibilidade da análise da freqüência espectral por determinar a importância dos componentes individualmente no espectro Raman. Este algoritmo, utilizado para fins de diagnóstico automático de melanoma, apresentou 85 % e 99 %, de especificidade e sensibilidade, respectivamente. 104 7 CONCLUSÃO Através da análise qualitativa dos espectros FT-Raman deste presente estudo, foram construídos modelos espectrais para cada um dos nove grupos histopatológicos encontrados, utilizando-se do ajuste do sinal pela deconvolução dos espectros seguido de análise dos múltiplos picos. Desta maneira, foi possível identificar as diferenças entre os espectros de Mama normal, Condição Fibrocística, Carcinoma ductal in situ, Carcinoma ductal in situ comedo, Carcinoma ductal infiltrante, Carcinoma ductal infiltrante inflamatório, Carcinoma ductal infiltrante medular, Carcinoma ductal infiltrante mucinoso, Carcinoma lobular infiltrante. Estas diferenças foram baseadas nos deslocamentos e variações de intensidades dos espectros e achados histopatológicos. Destacam-se no tecido de Mama normal maior conteúdo de lipídio; colágeno, presente em abundância em todos os tecidos patológicos; conteúdo cístico, presentes nos tecidos de Condição Fibrocística e Carcinoma ductal infiltrante mucinoso; células inflamatórias, presente no espectro de Carcinoma ductal infiltrante inflamatório; diferentes intensidades das bandas de ácidos nucléicos que diferenciaram patologias in situ de infiltrantes. Estatisticamente, as diferenças espectrais encontradas entre os espectros de Mama normal dos espectros de Condição fibrocística e carcinoma ductal infiltrante foram validada pelo teste t de Student e a dispersão bidimensional destes dados, que mostrou forte tendência de separação pelos picos 540, 940, 1004, 1270, 1340, 1457, 1657, 2028 e 2084 cm-1 . Porém, as maiores tendências de separação foram encontradas pela relação entre as áreas dos picos 1270 cm-1 e 1657 cm-1 , que separaram os espectros Normal versus Condição Fibrocística e Carcinoma ductal infiltrante, relacionando seus conteúdos de lipídios e colágeno. As informações obtidas pela Espectroscopia FT-Raman mostraram-se decisivas para o desenvolvimento de algoritmos de treinamento para fins de classificação automática, entretanto, são requeridos um número maior de amostras para validação adicional. 105 8 PROPOSTAS A Espectroscopia FT-Raman pode promover importantes informações sobre a estrutura molecular de tecidos vivos. No entanto, deve-se admitir que a Espectroscopia Raman para fins diagnósticos está ainda iniciando seu desenvolvimento. Diversas linhas de pesquisa deverão estar completas para que esta técnica possa ser aplicada rotineiramente. Entre estas técnicas, citam-se: 1- Micro Raman a. Análise mais detalhada de tecidos e/ou células isoladas a partir de dados espectrais espectros com resolução de 1µm. 2- SERS (Surface Enhancement Raman Scattering) a. Possibilidade de identificação de proteínas envolvidas no metabolismo celular no processo carcinogênico. 3- Raman in vivo através da implementação de Fibras Ópticas a. Possibilidade se avaliar in vivo o processo de desenvolvimento de um tumor, utilizando-se cobaias; b. Desenvolvimento de cateteres ópticos para uso de clínico para diagnóstico e monitoramento de patologias via espectroscopia óptica. 4- Rede Neural (Neural Networks) a. Para classificação e confecção de banco de dados espectrais com finalidade diagnóstica; b. Para visualização de imagem química do tecido e/ou células a partir de dados coletados por Espectroscopia Micro-Raman. 106 REFERÊNCIAS ALCÂNTARA, P. Espectroscopia Molecular. Curso Física Moderna II. Centro de Ciências Exatas e Naturais, Departamento de Física, Universidade Federal do Pará, p.15, 2002. ANGEL, S.M.; CARRABBA, M.; COONEY T.F. The utilization of diode lasers for Raman spectroscopy. Spectrochim. Acta A. Mol Spectrosc., n.51, p. 1779-99, 1995. BIGIO, I. J.; BOWN, S. G. Spectroscopic sensing of cancer and cancer therapy Current status of translational research. Cancer Biology & Therapy, n.3, v.3., p.259-67, 2004. CONTRAN, R. S; KUMAR, V; COLLINS, T. Patologia Estrutural e Funcional. 6. ed. Rio de Janeiro: Guababara Koogan, 2000, 1485p. CROW, P. et al. The use of Raman spectroscopy to identify and characterize transitional cell carcinoma in vitro. Bju International, n.93, v.9, p.1232-6, 2004. DIEKMANN, F. et al. 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Um fragmento deste tecido será encaminhado para um projeto de pesquisa, previamente submetido à apreciação da Comissão de Ética em Pesquisa da Universidade do Vale do Paraíba, através da utilização da Espectroscopia Raman e de Infravermelho com transformada de Fourier para estudos de materiais biológicos, a qual fornece informações bioquímicas detalhadas, diferenciando tecidos normais de patológicos, através de alterações microscópicas detectadas por espectroscopia óptica. O fragmento do tumor será identificado no laboratório por um código formado por número e letras e, portanto, sua publicação científica será feita de modo a manter o anonimato do paciente. Concordamos com o uso do material para fins acima descritos, é necessário esclarecê-lo (a) que não existem quaisquer benefícios ou direitos financeiros a receber sobre eventuais resultados decorrentes da pesquisa. Se você não concordar em doar materiais para pesquisa, sua decisão não influenciará, de modo algum, no seu tratamento. Dúvidas ou questões sobre o Termo de Consentimento poderão ser esclarecidas pelo seu médico. Você receberá uma cópia deste documento e o original será arquivado em seu prontuário. Somente assine este Termo, se consentir. DECLARAÇÃO Declaro estar ciente das informações ora prestadas, tendo lido atentamente e concordando com o teor. São José dos Campos, Responsável ou Paciente Nome: RG: 114 Consentimento Pós-Informado Termo de Consentimento Pós-Informado Para obter um maior conhecimento clínico e científico do câncer, o Corpo Clínico deste Hospital (médicos e pesquisadores) desenvolvem pesquisas clínicocientíficas, as quais possibilitam conhecer melhor os mecanismos da doença, oferecendo novas possibilidades de diagnóstico e tratamento. Estes estudos são realizados em fragmentos de tumores removidos em cirurgias. Você está sendo admitido (a) neste Hospital para estabelecimento de diagnóstico e tratamento de alguma forma de tumor. Para fins de diagnóstico, fator prognóstico e/ou como parte de seu tratamento, há necessidade da remoção do tumor para exames clínicos laboratoriais, necessários para um diagnóstico definitivo, principalmente o diagnóstico histopatológico. O restante do tumor que é retirado, não é utilizado, sendo descartado, conforme Legislação Sanitária regulamenta sobre o assunto. Um fragmento do tumor será encaminhado para um projeto de pesquisa, previamente submetido à apreciação da Comissão de Ética em Pesquisa do Hospital, através da utilização da Espectroscopia Raman e de Infravermelho com Transformada de Fourier para estudos de materiais biológicos, com ênfase em tecidos com câncer de mama, a qual fornece informações bioquímicas detalhadas, diferenciando tecidos benignos de tecidos malignos, através de alterações microscópicas detectadas por espectroscopia óptica. O fragmento do tumor será identificado no laboratório por um código formado por números e letras e, portanto, sua publicação científica será feita de modo a manter o anonimato do paciente. Concordamos com o uso do material para fins acima descritos, é necessário esclarece-lo (a) que não existem quaisquer benefícios ou direitos financeiros a receber sobre eventuais resultados decorrentes da pesquisa. Se você não concordar em doar materiais para pesquisa, sua decisão não influenciará, de modo algum, no seu tratamento. Dúvidas ou questões sobre o Termo de Consentimento poderão ser esclarecidas pelo seu médico. Você receberá uma cópia deste documento e o original será arquivado em seu prontuário. Somente assine este Termo, se consentir. DECLARAÇÃO Declaro estar ciente das informações ora prestadas, tendo lido atentamente e concordando com o teor. São Paulo, Responsável ou Paciente Nome: RG: RGH:
