Título: Produção de sondas genéticas não radioativas para o

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1996 – 1999
Mestrado em Biotecnologia
Universidade de São Paulo, USP, São Paulo,
Brasil
Título: Produção de sondas
genéticas não radioativas para o
diagnóstico do vírus rábico
atraves de RT-PCR e
imunoquimioluminescência
Orientado: Pedro Carnieli Junior
Orientador: Edison Luiz Durigon
Ano de obtenção do título: 1999
Palavras-chave: Virus rábico, Diagnostico,
Imunoquimioluminescência, Clonagem, RT-PCR
Áreas do conhecimento: Virologia,Microbiologia Aplicada
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1. INTRODUÇÃO
1.1.
HISTÓRICO
A primeira referência escrita sobre a raiva, uma encefalite fatal, é
encontrada no Código de Eshnunna, Babilônia, escrito a 2500 anos ( BAER,
1985 ). No século IV a. C., Aristóteles, na antiga Grécia, classificou a raiva como
uma doença que ocorria somente entre animais. O escritor Cornelius Celsus, da
antiga Roma, no século I d. C., recomendava a imediata excisão e cauterização
do local da mordedura de um cão raivoso. Modificações deste mesmo
tratamento, com a adição de aplicação local de diversas substâncias, como
ácidos, foram realizadas até o século XIX ( WIKTOR, 1985).
A primeira referência sobre a raiva nas Américas foi feita em 1709, no
México, por Frei José Gill Ramirez. Acredita-se que a raiva já estava presente
neste continente antes da chegada de Colombo, por citações históricas acerca
de mordidas fatais causadas por animais agressores ( KOPROWSKI, 1959 ).
Em 1804, na Alemanha, Zinke fez a primeira abordagem científica,
inoculando saliva de cães raivosos em cães não raivosos, induzindo-os a
contraírem raiva. Galtier, em 1879, inoculando extratos de tecido nervoso de
coelhos com raiva em cabras e carneiros, levou Pasteur e colaboradores a
concluirem que o Sistema Nervoso Central ( SNC ) é o local de replicação do
vírus rábico. Posteriormente, Pasteur e col. cultivaram o vírus, inoculando-o
sucessivamente em animais de laboratório, observando que o período de
incubação, antes variável, encurtava e se estabilizava. Esta nova amostra viral,
obtida experimentalmente, foi chamada de “atenuada”. Desta adaptação do vírus
rábico originou-se o vírus “fixo”, cuja virulência é constante e reprodutível para a
espécie na qual foi adaptado, ao contrário dos vírus “de rua”, isolados de
animais infectados naturalmente.
Pasteur, em 1884, utilizando medulas de coelhos, inoculadas com vírus
“fixos” e dessecadas com potassa ( NaOH ) a 22° C, inoculou durante nove dias,
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intracerebralmente, o macerado deste material em cães, e estes não adquiriram
raiva. Posteriormente, observou que animais inoculados diariamente com este
material, por via subcutânea, tornavam-se imunes. A partir dessas observações
Pasteur produziu a primeira vacina anti-rábica ( KOPROWSKI, 1985 ). Após a
obtenção desta vacina, vários pesquisadores continuam aprimorando a
produção da vacina anti-rábica e, diversos métodos de controle e manejamento
da população de animais de criação, susceptíveis à raiva, são estudados e
realizados, sendo a imunização em massa efetuada para controlar a cadeia
epidemiológica.
1.2. CLASSIFICAÇÃO E NOMENCLATURA
O vírus rábico pertence à ordem Mononegavirales, família Rhabdoviridae,
gênero
Lyssavirus.
Outras
famílias
de
vírus
pertencentes
à
ordem
Mononegavirales são Filoviridae e Paramyxoviridae, todos com genoma formado
por RNA com sentido negativo.
Vesiculovirus;
Ephemerovirus;
A família Rhabdoviridae possui cinco gêneros:
Cytorhabdovirus;
Nucleorhabdovirus
e,
Lyssavirus ( DIETZSCHOLD et al., 1996; MURPHY et al., 1995 ).
Os Lyssavirus infectam animais homeotermos, preferencialmente
mamíferos carnívoros, causando infecções no sistema nervoso central, sendo
que a espécie representante
deste gênero é o vírus rábico. As espécies
( sorotipos ou genotipos ) do gênero Lyssavirus são : Vírus rábico; Vírus Lagos
bat; Vírus Mokola; Vírus Duvenhage; European bat 1 e European bat 2.
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1.3. MORFOLOGIA E PROPRIEDADES FÍSICO-QUÍMICAS DO VÍRUS
RÁBICO
O vírus rábico é baciliforme com 100 a 300 nm de comprimento e 70 nm
de diâmetro, em média, com uma extremidade semi-circular e a outra plana.
Possui envoltório externo formado por lipídios da célula hospedeira ( envelope ),
com espículas de 5 a 10 nm de comprimento, cerca de 3 nm de espessura,
distanciadas em 5 nm, formadas por trímeros da glicoproteína G. Abaixo do
envelope encontra-se uma camada matriz formada por proteínas M, que une o
envoltório viral externo à ribonucleoproteína interna. A matriz M e a
ribonucleoproteína formam o ribonucleocapsídeo (figura 1). A ribonucleoproteína
( RNP ) é helicoidal, possuindo 30 a 35 giros, 50 nm de espessura por 170 nm
de comprimento, em média; é formada pelo RNA genômico de fita simples,
sentido negativo, não segmentado, associado às proteínas RNAs polimerases
RNA-dependentes L, fosfoproteínas P, nucleoproteínas N, além de proteínas M.
Encontramos formando o complexo ribonucleotroteíco (RNP), aproximadamente,
1800 moléculas da proteína N, 950 da fosfoproteína P e 30 a 60 da polimerase L
( MURPHY et al., 1995; GAUDIN et al., 1992; WUNNER et al., 1994 ).
O peso seco do vírion contém 65 - 75 % de proteínas e 1 - 2 % de RNA. É
constituído também por 15 - 25 % de lipídios, sendo que, deste total, 55 - 60 %
são fosfolipídios e 35 - 40 % glicolipídios. A quantidade de carboidratos do peso
seco é 3 %. O vírus rábico tem peso molecular entre 500 a 700 x 106 Da,
densidade em CsCl de 1,19 a 1,20 g / cm3, densidade em sucrose de 1,17 a
1,19 g / cm3. A infectividade é estável entre pH 5,0 e 10,0 e é rapidamente
inativado a 50°C; por irradiação ultravioleta ou raio-X; exposição a solventes
lipídicos ou agentes oxidantes ( MURPHY et al., 1995; GAUDIN et al., 1992 ).
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Envelope
Ribonucleocapsídeo
Figura 1: esquema representando a estrutura do vírus rábico
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1.4.
ORGANIZAÇÃO GENÔMICA DO VÍRUS RÁBICO
O genoma do vírus rábico contém 11932 nucleotídeos ( nt ), com uma
discordância média de 5 % entre as diferentes amostras. O RNA genômico é
linear, policistrônico, não interrompido, codificando do extremo 3’ para 5’
( sentido negativo ), com o final 5’ trifosfatado e não poliadenilado. Possui cinco
genes, designados como: N ( 1350 nt ), P ( M1 ou NS ) ( 891 nt ), M ( M2 ) ( 606
nt ), G
( 1572 nt ) e L ( 6426 nt ), transcrevendo as proteínas virais estruturais
com as mesmas designações. Assim, possuem 5 ORFs ( “open reading frame” ),
codificando nesta ordem: 3’ - N - P - M - G - L - 5’, transcritas em molaridade
decrescente de abundância ( MURPHY et al., 1995; BANERJEE, 1987). É
proposta a existência de um 6º gene, entre os genes G e L, mas ainda não foi
isolada uma proteína referente a essa região ( TORDO et al., 1986; TORDO et
al., 1996 ).
No final da região de cada um dos cinco genes, uma seqüência poli ( U ),
determinará a poliadenilação das regiões finais de seus respectivos RNAm, de
sentido positivo ( 5’  3’ ). As seqüências intergênicas no genoma do vírus
rábico variam em composição e tamanho, sendo que, em alguns casos, a região
5’ do RNAm transcrito se sobrepõe à região 3’ do gene seguinte. A região entre
os genes N e P tem os nucleotídeos GA; a região entre P e M tem GUCCG; a
região entre M e G tem GAUAA e a grande região entre G e L ( chamada
pseudogene  ) tem 423 nucleotídeos, iniciando com GGACCCAAG e
terminando com UUGACGG ( TORDO et al., 1996; MURPHY et al., 1995 ;
BANERJEE, 1987 ).
Os sinais genômicos internos do vírus rábico de início ( start ) e parada
( stop ) da transcrição flanqueiam os genes. São compostos por nove
nucleotídeos de uma seqüência de consenso entre os Rhabdoviridae. O sinal de
parada termina com uma seqüência de sete resíduos de Uridina, que são
copiados reiterativamente pela transcriptase, para produzir a cauda de
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poliadenilação de cada RNA mensageiro, antes da leitura do próximo sinal de
início ( TORDO et al., 1986 ). Os sinais de início ( start ) e parada ou
poliadenilação ( stop ) são seqüências de consenso entre os Rhabdoviridae (
TORDO et al., 1996 ). Tanto a transcrição quanto a replicação são etapas
autônomas e independentes da célula hospedeira e catalisadas pela RNA
polimerase RNA-dependente L, presente no genoma do vírus. A replicação do
genoma ocorre após a tradução dos RNAm, com a formação de vários RNAs
intermediários com sentido positivo ( antigenomas ); sendo moldes genômico
dos futuros RNA de sentido negativo.
A transcrição inicia-se pela extremidade 3’ do genoma viral, os RNAm são
5’ poli-U, 3’ poliadenilados e monocistrônicos. Um promotor para polimerização é
reconhecido pela transcriptase próximo à extremidade 3’ e, deste ponto, o
complexo transcricional desloca-se para a extremidade 5’ do genoma,
produzindo os transcritos seqüencialmente. Primeiramente, ocorre a síntese de
um grupo de RNAs-líder não traduzidos, com 58 nucleotídeos, os quais
correspondem exatamente ao trecho de nucleotídeos do extremo 3’ do genoma,
precedendo a primeira seqüência de tetranucleotídeos ( UUGU ) localizados no
início da seqüência do gene N. O pequeno RNAm líder não é poli-U ou
poliadenilado e, há evidências de exercer controle na mudança da transcrição
para a replicação ( WUNNER et al., 1988; TORDO et al., 1986; TORDO et al.,
1996 ). A produção dos cinco diferentes RNAm não é igual em número, pela
existência de seqüências genômicas internas de atenuação e pausa. Desta
forma, ocorre um gradiente na produção das proteínas nesta ordem: N > NS > M
> G > L ( BANERJEE et al., 1992 ). O que parece determinar esta molaridade
decrescente dos produtos gênicos são os sinais internos do genoma, que
controlam a progressão seqüencial do complexo transcricional L. Pensa-se que
o complexo polimerase dissocia-se do genoma após a leitura de cada sinal de
parada antes de se acoplar ao próximo sinal de início. Como as regiões
intergênicas, não transcritas, são muito curtas ( cinco a seis nucleotídeos ), o
complexo polimerase tem dificuldade em unir-se ao próximo sinal de início. Os
complexos polimerases que não se encaixam nos sinais de início subseqüentes
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voltam ao primeiro sinal, e este fato explicaria o grande número de produtos do
primeiro
gene
e
pouquíssimos do
último
( 1800
e
60 respectiva
e
aproximadamente ). Portanto, a localização de um gene influencia diretamente
sua taxa de transcrição ( SCHNELL
et al., 1994;
GAUDIN et al., 1992;
BANERJEE et al., 1992 ).
A polimerase L efetua tanto a transcrição do genoma em RNAm, quanto a
replicação do próprio RNA genômico. Durante a replicação, a polimerase não
deve reconhecer os sinais de parada e atenuação. Pesquisas recentes postulam
que os RNAs genômicos replicam-se após a transcrição dos RNAm e, também,
após a síntese de proteína N. Esta proteína liga-se ao RNA genômico recémsintetizado e determinaria o não reconhecimento dos sinais de parada e
atenuação, respeitados na transcrição ( TORDO et al., 1996; BANERJEE et al.,
1992 ; WERTZ et al., 1987 ).
O primeiro evento da replicação é a formação do anti-genoma. Tanto o
genoma quanto o anti-genoma, para serem funcionais, devem estar revestidos
com proteína N, e isto requer coordenação entre polimerização e capsidização.
Assim, um promotor para capsidização deve existir no final 5’, para iniciar a
capsidização do RNA nascente. Através de estudos sobre o VSV ( vírus da
estomatite vesicular ), o vírus mais estudado da família Rhabdoviridae, sabe-se
que os elementos catalíticos na função polimerase são as proteínas L e P. A
proteína L possui, no mínimo, a seguintes funções enzimáticas: síntese de RNA,
“capping”, poliadenilação e quinação parcial das proteínas N e P. As funções da
proteína P são regulatórias: ajuda a polimerase L a ligar-se corretamente ao
promotor de polimerização, retira proteínas N do RNA molde à frente do
complexo de polimerização e detecta a quantidade mínima de proteína N
necessária para a capsidização ( PRINGLE, 1987).
A proteína N possui a principal função estrutural na capsidização do RNA
genômico, além de ser a responsável pela mudança ( “switch” ) entre transcrição
e replicação. A replicação não pode iniciar-se sem uma quantidade suficiente de
proteína N unida ao RNA genômico. Enquanto a quantidade de proteína N sobre
o genoma for pequena, o complexo polimerase reconhece os sinais de
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poliadenilação ( “stop codon” ) da seqüência líder; solta-se do RNA e reconhece
os sinais de início dos genes N, P, M, G ou L, produzindo os RNAs mensageiros.
Havendo quantidade suficiente de proteínas N sobre o RNA, os sinais internos
de início e parada não são respeitados e o complexo polimerase segue a leitura
do
genoma
ininterruptamente.
Como
o
pequeno
RNA
líder
( 57 - 58
ribonucleotídeos ) da extremidade 3’, rico em resíduos A ( adenina ), que entre
outras funções, quebra o promotor de capsidização da extremidade 5’ durante a
transcrição, não é mais produzido durante a replicação, pela presença da
proteína N, a capsidização pode ocorrer ( TORDO et al., 1996 ).
As extremidades genômicas 3’ e 5’ desempenham importantes funções
na replicação viral por formarem os sítios da iniciação da síntese de RNA e da
iniciação de capsidização, respectivamente. As seqüências gênicas envolvidas
nessas funções contém 58 nucleotídeos na região 3’ e 69 nucleotídeos na região
5’ não transcrita. Ambas regiões são ricas em resíduos U e A entre os
nucleotídeos 7 a 40, em todos Lyssavirus. Essas regiões podem corresponder
ao sinal de reconhecimento do complexo polimerase L. Também existe uma
perfeita
complementariedade
entre
os
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primeiros
nucleotídeos
das
extremidades 3’ e 5’. Esta complementariedade terminal é encontrada em todos
os vírus RNA não segmentados de sentido negativo e, pode representar a
conservação de sinais entre o genoma e o antigenoma, sinalização fundamental
na replicação ( TORDO et al., 1996 ).
1.5. REPLICAÇÃO VIRAL
Os eventos seqüenciais no ciclo do vírus rábico na célula hospedeira são:
adsorção, penetração, transcrição, tradução, replicação, maturação e liberação
por brotamento. Todas as fases intracelulares ocorrem no citoplasma celular.
A adsorção não é dependente de temperatura, mas de pH, sendo o pH
6,5 o mais favorável. O vírus liga-se aos receptores celulares, provavelmente
colinérgicos, através das espículas de glicoproteína G encontradas sobre a
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superfície do capsídeo viral ( SCHLEGEL et al., 1985 ). A penetração do vírus é
dependente de temperatura, sendo 37° C o ponto ótimo. A endocitose
( pinocitose ) é a hipótese mais aceita atualmente para explicar como ocorre a
entrada do vírus na célula. No interior da célula ocorre a liberação da
ribonucleoproteína, e imediatamente ocorre a transcrição dos cinco RNAm, em
seguida a tradução e, finalmente, a replicação ( PRINGLE, 1987 ).
A montagem do vírus no citoplasma da célula hospedeira inicia-se com a
associação das proteínas N, P e L ao RNA genômico recém-sintetizado,
formando a ribonucleoproteína. As proteínas M, recém-formadas, seguem dois
caminhos: uma parte une-se a ribonucleoproteína, condensando-a, e outra parte
insere-se na membrana plasmática da célula hospedeira, preparando-a para a
liberação dos vírions. Esta proteína é reconhecida tanto pela glicoproteína G
como também pelas proteínas P e N ( LAWSON et al., 1995; WILSON et al.,
1981). A glicoproteína G também tem um papel crítico na liberação e biogênese
do vírion. Primeiramente, esta proteína agrega-se à membrana plasmática da
célula hospedeira, em regiões
basolaterais, juntamente com proteínas M,
direcionada, provavelmente, por enzimas presentes no citoesqueleto celular. O
domínio citoplasmático da glicoproteína G, com carga negativa, parece dirigir a
reunião da ribonucleoproteína, revestida com proteína M, à membrana
plasmática ( GAUDIN et al., 1992; GAUDIN et al., 1993).
A ribonucleoproteína, junto à membrana plasmática, e outros possíveis
fatores intracelulares, parece estimular a liberação do vírion por brotamento. A
vesícula que brota da célula é formada pela ribonucleoproteína, a matriz M, que
a acomoda na membrana plasmática, sendo que esta se apresenta
transpassada por glicoproteína G. Antes do brotamento do vírion, a transcrição e
replicação viral são inibidas pela ação da proteína M, inibindo a síntese de RNA.
A proteína M, concentrando glicoproteína G em certas áreas da membrana
plasmática, determina a atração de proteínas N, pois estas são atraí das pela
glicoproteína G. A pressão interna desse aglomerado nucleoproteico, sobre a
membrana plasmática, determina que a região formada destaque-se da célula,
ocorrendo o brotamento do vírus rábico ( MESLIN et al., 1996 ).
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Durante o ciclo do vírus rábico no interior da célula ocorre a inibição,
mesmo que pequena, da síntese de RNA, DNA e proteínas celulares. Os dois
principais fatores destas inibições, provavelmente, são os RNA-líderes de 58 nt
formados no início da transcrição, e a proteína M do vírus, que é encontrada no
núcleo das células infectadas e, portanto, devem ter alguma ação sobre a
expressão gênica celular ( REMENICK et al., 1986; REMENICK et al., 1988 ).
1.6. PROPRIEDADES ANTIGÊNICAS, ESTRUTURAIS E FUNCIONAIS
DAS PROTEÍNAS DO VÍRUS RÁBICO
Embora as características bioquímicas e imunológicas das proteínas
rábicas N, P, M, G e L sejam objeto de inúmeros estudos, estes se concentram,
principalmente, sobre as proteínas G e N, por serem mais imunogênicas e fáceis
de serem detectadas e isoladas.
A glicoproteína G é a única capaz de induzir a formação e reagir com os
anticorpos neutralizantes do vírus rábico. Esta proteína tem 524 aminoácidos,
deduzidos da clonagem do gene que a codifica, a partir de várias amostras de
vírus. Esta mesma proteína, pós-processada, contém somente 505 aminoácidos,
pois ocorre uma clivagem retirando 19 aminoácidos da posição N-terminal-sinal.
O domínio extracelular da proteína é o mais imunogênico. Este domínio externo
estimula tanto linfócitos B quanto linfócitos T ( WUNNER, 1991; KAWAI et al.,
1994 ). O domínio citoplasmático C-terminal da glicoproteína G tem 44
aminoácidos, o domínio transmembrana possui 22 e o domínio N-terminal, com
439 aminoácidos, é externo ao vírus. As células infectadas produzem, além de
glicoproteína G encontrada nos vírus, a forma solúvel de G ( Gs ) com 447
aminoácidos, referentes ao domínio extra-citoplasmático desta glicoproteína
(
RUPPRECHT et al., 1991). No mínimo, oito sítios antigênicos foram
encontrados e, destes, seis foram mapeados no domínio externo da
glicoproteína G. Epítopos estimuladores de linfócitos T-citotóxicos foram
localizados entre os aminoácidos 130 e 178 da glicoproteína G ( MACFARLAN
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et al., 1986 ). Um sítio de glicosilação, na posição 319 da glicoproteína G,
parece ser de grande importância, pois é encontrado em todos Vesiculovirus e
Lyssavirus ( BOURHY et al., 1993 ). A presença do aminoácido arginina na
posição 333, determina a invasão do vírus nos neurônios e a conseqüente
patogenicidade. A falta deste aminoácido determinaria o não reconhecimento
dos receptores virais de membrana, pelo vírus rábico ( PREHAUD et al., 1988).
A partir de várias amostras virais deduziu-se que a nucleoproteína N é
formada por 450 aminoácidos, possuindo grande homologia entre as amostras
( 98 % - 99.6 % ), sendo muito conservada durante a evolução do vírus rábico
( ERTL et al., 1989 ). Os aminoácidos mais conservados da proteína N são
aqueles que, provavelmente, interagem com o genoma RNA do vírus rábico.
Sua função é encapsidar o genoma e protegê-lo contra nucleases celulares,
além de ser o fator que regula a expressão gênica ( KAWAI et al., 1994 ). A
proteína N não induz anticorpos neutralizantes, mas protege contra o vírus
rábico após desafio periférico. Esta proteína é o antígeno alvo das células T
CD4+; entre as diversas amostras do vírus rábico e, entre os diferentes
genotipos do gênero Lyssavirus
( LAFON et al., 1992 ).
A fosfoproteína P é formada por 297 aminoácidos, sendo relativamente
bem conservada entre as diferentes amostras de vírus rábico, com uma
homologia média de 95 % ( KAWAI et al., 1994 ). Dois sítios antigênicos entre os
aminoácidos 75 a 90 estão presentes e epítopos para linfócitos T CD4+ e T
CD8+ foram encontrados. Somente um determinante antigênico de linfócito B foi
detectado através de anticorpos monoclonais nesta fosfoproteína ( LAFON et al.,
1992 ).
A proteína matriz M contém 202 aminoácidos ( TORDO et al. 1986 ), tem
homologia entre as diversas amostras virais de 93 %, em média, sendo que sua
antigenicidade não foi, até agora, muito estudada. Esta proteína tem uma
importante função, senão a principal, em regular a morfogênese do vírus rábico.
Um determinante antigênico na posição entre os resíduos 1 e 72 foi localizado
( WUNNER, 1991 ).
A RNA polimerase RNA-dependente L é a maior proteína do vírus rábico,
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possuindo 2142 aminoácidos. É responsável pela síntese de RNA ( RNA
transcriptase ), cobertura da extremidade 5’ com poli-U ( “cap” ), metilação
( metil-transferase ), poliadenilação, e funções de guanilil-transferase, proteína
quinase, nucleosídeo trifosfatase e nucleosídeo trifosfato quinase dos RNAs
virais. A polimerase L, provavelmente, é um complexo multienzimático
( DIETZSCHOLD et al., 1996 ; MURPHY et al., 1995).
1.7. PATOGÊNESE
A quase totalidade dos casos de raiva humana ocorre pela penetração do
vírus presente na saliva de animais infectados, através de mordidas. Casos de
arranhões, contato de mucosas com saliva ou materiais contaminados, inalação
de aerossóis em laboratórios ou cavernas já foram descritos, mas têm chances
mínimas de causarem infecção. A probabilidade de que uma pessoa agredida
desenvolva raiva depende da profundidade e localização da mordida. Quanto
mais profunda e próxima de regiões muito enervadas, como cabeça, mão e pé,
maior a chance de ocorrer a infecção. A rápida assepsia com água e sabão e
aplicação de um antisséptico local é a melhor forma de combater a infecção,
obviamente, seguida de soro- vacinação ( VEERARAGHAVAN, 1954 ).
O período de incubação em humanos é em média de 1 a 2 meses.
Entretanto, variações de menos de uma semana até 6 anos são registradas. A
duração do período de incubação depende da proximidade da mordida em
relação ao SNC, quantidade de vírus inoculado, idade e estado imune do
indivíduo. Nos EUA e Europa, há registros de doadores de córnea para
transplante que morreram infectados pela raiva, sem terem sido diagnosticados,
contaminando seus receptores ( MESLIN et al., 1996 ).
O desenvolvimento clínico de um paciente com raiva pode ser dividido em
3 estágios distintos: período prodrômico, fase neurológica aguda e coma.
Durante o período prodrômico, os sintomas podem se manifestar de 2 a
10 dias, e são inespecíficos como: febre, dor de cabeça, anorexia, fotofobia e
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formigamento ao redor da inoculação. Na fase neurológica aguda, que se
estabelece pela invasão do vírus no SNC, ocorre ansiedade, agitação, paralisia,
hidrofobia, aerofobia e episódios de delírio. Quando a hiperexcitabilidade é
predominante, o quadro clínico é classificado como “furioso” e quando a paralisia
é predominante, como “paralítico” ( CHOPRA et al., 1980 ). A raiva paralítica é
mais observada em herbívoros expostos a vírus inoculados por morcegos . A
raiva furiosa progride mais rapidamente ( 2 a 7 dias ) do que a paralítica ( média
de 2 meses ) no período neurológico. O final destas fases é paralisia total e
asfixia. Três casos de sobrevivência, após tratamento clínico, são documentados
e, os sobreviventes apresentam seqüelas neurológicas ( WHO, 1992 ).
Após a introdução de saliva infecciosa de animal raivoso, o vírus replicase no próprio local de entrada, e segue em direção ao SNC. Os vírus replicamse em tecido muscular e, através das conexões neuro-musculares, penetram
nos nervos periféricos. É muito provável que os vírus penetrem no sistema
nervoso através dos finais dos nervos sensoriais desmielinizados e placas
motoras.
Estudos
comprobatórios
destes
eventos
ainda
estão
sendo
desenvolvidos. Com o uso de sondas moleculares e técnicas de hibridização in
situ, espera-se demonstrar a existência de replicação viral nas células
musculares antes da entrada do vírus no SNC ( SHANKAR et al., 1991 ).
Em relação ao neurotropismo, é provável que o vírus reconheça sítios
celulares colinérgicos em células musculares. Ao que parece, componentes das
membranas celulares com fosfolípidios e glicolípidios estimulam o neurotropismo
do vírus rábico. Em neurônios e fibroblastos, componentes de membrana como
o ácido siálico e gangliosídeos, parecem estar envolvidos ( LENTZ et al., 1986 ).
Após a entrada nos nervos periféricos, o vírus rábico move-se através do fluxo
interno dos axônios dos neurônios em direção ao SNC. Através das junções
sinápticas, os virions passam de neurônio a neurônio, transportados por
movimento axonal retrógrado ( TSIANG, 1978 ).
Chegando ao cérebro, os virions encontram na região do hipocampo
superior, no chamado Corno de Amon, do sistema límbico, o local mais propício
para a replicação, multiplicando-se com maior intensidade. Também mostram ter
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preferência pelo cerebelo e região superior da medula, mas todas as regiões do
SNC são infectadas, em maior ou menor intensidade. Do cérebro, ocorre uma
propagação viral centrífuga a vários locais ( coração, rins, cavidades nasais,
córnea, etc ). O forte tropismo pelas glândulas salivares representa o final do
ciclo no hospedeiro, que culmina com a morte. Desta forma, o vírus rábico
durante seu ciclo, passa pelo sistema límbico, altera o comportamento,
geralmente aumentando a agressividade. O animal tem como reflexo a
mordedura e o vírus, estando presente na saliva, passa para o animal agredido,
perpetuando-se ( MURPHY, 1985 ).
As mudanças patológicas em animais e humanos infectados são lesões
inflamatórias, observadas histologicamente, que normalmente levam as células
à
morte.
O
citoplasma
dos
neurônios
apresentam
aglomerados
de
nucleocapsídeos do vírus, os chamados Corpúsculos de Negri ( FU et al.,
1993 ).
1.8. IMUNIDADE ANTI-RÁBICA
O vírus rábico, ao penetrar no hospedeiro via células musculares ou
células epiteliais, pode permanecer um longo período em latência e replicar-se
no local. Isto possibilita que o tratamento
anti-rábico seja realizado com
administração de vacina ( muitas vezes associada a soro hiperimune ) que, na
grande maioria das vezes, impede a penetração do vírus nos neurônios. No
entanto, se o vírus penetrar no SNC, foge da vigilância imunológica do
hospedeiro levando-o, invariavelmente, à morte ( KING et al., 1993 ). Sem
vacinação, a quantidade de vírus no local de inoculação não é suficientemente
antigênica para provocar uma resposta protetora. O aparecimento de anticorpos
anti-rábicos ocorre muito tardiamente, já na fase final da doença, sem nenhuma
influência sobre seu desfecho fatal ( KOPROWSKI et al., 1972 ).
Os antígenos rábicos são timo-dependentes, tanto assim que a vacinação
anti-rábica não protege camundongos da linhagem “nude” de uma infecção, já
16
que estes apresentam uma deficiência de linfócitos T ( SUGAMATA et al, 1992 ).
Os
macrófagos,
células
dendríticas
e
outras
células
fagocíticas
e
apresentadoras de antígeno ( APC ), têm papel fundamental, já que são
responsáveis pela ingestão e processamento dos antígenos rábicos e a
consequente apresentação de seus determinantes antigênicos, juntamente com
moléculas de classe 2 do Complexo de Histocompatibilidade Principal ( CELIS et
al., 1985 ).
Os linfócitos T auxiliares CD4+, uma vez estimulados por
determinantes antigênicos do vírus expostos na superfície das APC, passam a
produzir citocinas, que vão estimular diferentes células, como linfócitos T
citotóxicos CD8+, os linfócitos B produtores de anticorpos e as células “Natural
Killer” ( PERRY et al., 1991).
O vírus rábico pode ser neutralizado por anticorpos da classe IgG
específicos para a glicoproteína G,
já que estas estão na parte externa da
partícula viral e são as responsáveis pelo seu neurotropismo. Uma vez revestida
de anticorpos anti-G, a partícula viral não consegue se ligar aos seus receptores
específicos. Além disso, células infectadas são passíveis de serem revestidas
por anticorpos com subseqüente atuação do Sistema Complemento, provocando
a lise das células, limitando a propagação viral até o SNC ( FINKELMAN et al.,
1988). Dentre as citocinas produzidas, principalmente pelos linfócitos T
auxiliares, já foi demonstrado que o interferon  ( INF- ) tem efeito adjuvante
quando administrado concomitantemente com a vacina. Um dos principais
estimuladores dos linfócitos T citotóxicos é o INF-. No entanto, quando esta
citocina foi usada no tratamento da raiva humana, não foi obtido nenhum
sucesso ( KAWANO et al., 1990).
Linfócitos Th 1 ( sub-tipo de linfócitos T auxiliares ) respondem a
imunização com peptídios sintéticos de proteina N ou com plasmídeos,
expressando a proteína G, secretando interleucina 2 ( IL-2 ) ( BOOM et al.,
1988). Além disso, a dosagem de IL-2 produzida pela estimulação in vitro de
esplenócito murino com antígeno rábico, mostrou ter correlação direta com os
níveis de proteção ( ROBB, 1984). Os linfócitos T citotóxicos agem no local de
infecção depois de reconhecerem peptídeos do vírus expressos na superfície de
17
células infectadas, associadas a moléculas de classe 1 do Complexo de
Histocompatibilidade Principal. Assim, destroem as células infectadas e parecem
ter papel fundamental na proteção contra amostras atenuadas do vírus rábico
( PERRY et al., 1990 ).
1. 9. EPIDEMIOLOGIA
A raiva é uma doença cosmopolita, sendo que alguns países insulares
conseguiram eliminar o vírus de seus territórios, como o Japão, Grã-Bretanha,
Oceania e outros poucos. É
uma
zoonose
de
difícil
erradicação
pela
multiplicidade de hospedeiros naturais e pelo fato do vírus ser transmitido pela
saliva, através de mordidas entre animais no ecossistema, comportamento
comum nas disputas territoriais intra e extra-específicas ou mesmo pela
expulsão do indíviduo doente da população ou grupo ( SMITH, 1996 ). Os
principais hospedeiros são os mamíferos carnívoros e quirópteros. Os
herbívoros, roedores e os lagomorfos desempenham papel secundário na
epidemiologia. A excreção do vírus rábico pela saliva ocorre antes mesmo de
surgirem os primeiros sintomas neurológicos e, provavelmente, é uma
característica específica da espécie infectada e origem do virus. Assim, deve
haver pesquisas acerca da excreção viral em termos de amostra de vírus,
espécies hospedeiras e coadaptação do vírus com o hospedeiro ( WHO, 1994 ).
A doença está presente tanto no meio silvestre como no urbano. Nos países
pobres a zona urbana é claramente mais afetada, sendo os principais
transmissores o cão e o gato. Na América do Norte e Europa os principais
transmissores são os animais silvestres ( BAER et al., 1990 ).
Entre o ano de 1990 a 1993, 51.453 casos de raiva em animais foram
diagnosticados na América Latina, com uma média anual de 12.865 casos,
sendo que 15% destes animais eram de interesse econômico. No Brasil, Peru,
Paraguai e México, o cão ocupa o primeiro lugar na transmissão da raiva
18
humana
( aproximadamente
75 % ),
vindo
em
seguida
os
morcegos
( aproximadamente 18 % ). No Panamá e no Chile o morcego é o principal
transmissor. Os morcegos hematófagos, somente encontrados em Trinidad
Tobago e países da América Latina, são os responsáveis pela transmissão,
quase total, dos casos de raiva em bovinos e eqüinos ( PAHO, 1995 ).
A raiva, por representar um problema na área de Saúde Pública e
Pecuária, é considerada prioritária nos programas de saúde humana e animal.
Em 1992, mais de 800.000 pessoas receberam vacina pós-exposição em todo
mundo, sendo cerca de 70 % nas Américas. Na Ásia, ocorre o maior número de
mortes humanas, onde se estimou, em 1987, mais de 50.000 casos / ano. A
China, pelo desenvolvimento recente de vacinas de cultura celular, diminuiu
esmagadoramente esta doença. Foram registrados, na América Latina, em
1994, 4.956 casos de raiva em cães, 1.492 em bovinos, 463 em animais
silvestres e 349 em gatos ( PAHO, 1995; MESLIN et al.,1996 ).
No Brasil, o controle da doença se faz com imunoprofiláticos e interrupção
da cadeia epidemiológica urbana, através da vacinação em massa de animais
domésticos e o sacrifício de animais errantes capturados. Mais de 50 milhões de
doses de vacinas são aplicadas por ano no plantel de gado nacional, estimado
em 180 milhões de cabeças. O número de pessoas atendidas no Brasil, durante
o ano de 1995, em relação a raiva, foi de 363.163 casos. Destas, 186.204
receberam vacina e 18.366 receberam soro e vacina. O número total de vacinas
aplicadas em humanos foi 893.543 doses. O número de animais colocados em
observação, suspeitos de raiva, foi 213.908 ( MS/FNS BRASIL, 1994). Na
campanha nacional de vacinação anti-rábica canina de 1995, foram aplicadas
14.051.669 doses de vacina, sendo 11.808.237 em cães, 2.232.400 em gatos e
11.032 em outros animais. Apesar dos estados de Santa Catarina e Paraná não
realizarem campanha de vacinação canina, foram atendidas respectivamente,
6.424 e 20.703 pessoas agredidas por animais e, aplicadas 14.775 e 21.497
doses de vacinas humanas, respectivamente. O número de acidentes com
animais agressores, observados em Santa Catarina foi de 3.517 e no Paraná
14.495 ( MS/FNS BRASIL, 1995 ).
19
Foram eliminados, em 1992, na América Latina, 542.852 cães, e em
1993, 668.537, sendo 45.238 no Brasil. Em 1994, também no Brasil, 64.000
cães foram sacrificados somente na cidade de São Paulo, este número
representando 50 % do total brasileiro ( WHO, 1994 ).
No final da década passada, o Centro de Controle de Zoonoses da cidade
de São Paulo, capturou morcegos insetívoros positivos na região central desta
capital, um deles na sala de estar de um apartamento residencial. Entre os anos
de 1990 e 1995, 27 espécies de morcegos, hematófagos ou não, foram
diagnosticados com o vírus rábico e 42 casos humanos transmitidos por
morcegos foram diagnosticados no Brasil ( MS/FNS BRASIL, 1995 ; MS/FNS
BRASIL, 1994), conforme mostrado nas tabelas 01 e 02.
Tabela 01- número de casos de raiva humana, por região geográfica do Brasil,
durante o período de 1986 a 1998 ( Dados fornecidos por MS/ FNS Brasil, 1998 )
REGIÃO
TOTAL
NORTE
112
NORDESTE
347
SUDESTE
62
SUL
01
CENTRO-OESTE
51
TOTAL GERAL
573
20
Tabela 02- casos de raiva humana, segundo o tipo de animal agressor, no
período de 1986 a 1998 ( Dados fornecidos por MS/ FNS Brasil, 1998 )
ANIMAL
Nº DE CASOS
CÃO
415
MORCEGO
61
IGNORADO
38
GATO
28
RAPOSA
13
MACACO
10
OUTROS
08
TOTAL
573
No Brasil, o estudo da epidemiologia da raiva entre as populações de
animais silvestres é praticamente nulo. Para exemplificar, casos com raposas
agressoras de humanos, na região do agreste nordestino, são freqüentemente
registrados, e entretanto, análises mais detalhadas não se realizam ( MS/LACEN
BRASIL, 1995 ).
Em 1995, na região de Ribeirão Preto ( São Paulo ) um surto de raiva
canina foi observado, com um caso humano fatal. Somente no Instituto Pasteur,
em São Paulo, foram diagnosticados 47 casos positivos em cães. É de se
observar que durante vários anos não se diagnosticava casos positivos nesta
região. Em contrapartida, cidades paulistas como Andradina e Araçatuba são
regiões com freqüentes casos de raiva, ao longo de vários anos. Em 1996,
durante janeiro a junho, foram diagnosticados 38 animais raivosos na região de
Birigui ( São Paulo ), com uma infectividade média de 40% das amostras
enviadas. Nesta mesma cidade, não se diagnosticava raiva há longo tempo.
Estas explosões de surtos localizados são imprevísiveis ( INSTITUTO
21
PASTEUR-SP, 1994, 1995, 1996 ).
O controle da raiva é oneroso e difícil pelo grande número de fatores
ecológicos, comportamentais e sócio-econômicos envolvidos. Um país, como os
EUA, onde se gasta, anualmente, mais de 300 milhões de dólares em
programas de controle da raiva, observou-se entre 1957 a 1993 que o número
de mãos-pelada ( Procyon lotor ), conhecidos como “ racoons ”, diagnosticados
com raiva, subiu de 36 para 5.912 casos / ano. Em 1996, na Austrália, país
continental, que oficialmente é livre da raiva, foi diagnosticado um vírus
associado a encefalite em morcegos frugívoros e em um humano ( SMITH,
1996 ). A raiva, como algumas outras doenças virais, pode dizimar pequenas
populações animais em qualquer região. Quando isto ocorre entre espécies com
risco de extinção, pelo pequeno número de indivíduos existente, é um problema
maior ainda. A interferência ambiental humana nos nichos ecológicos, via de
regra, introduz o principal transmissor da raiva, o cão ( Canis familiaris )
( CLEAVELAND et al., 1995 ).
É impossível calcular, em todo mundo, o número de casos de raiva não
notificados, seja por falta de experiência ou condições laboratoriais. O efetivo
controle da raiva depende de uma série de medidas, tais como: campanha de
vacinação; captura de animais e destino adequado; envio de material para
exame laboratorial; cobertura de foco; atendimento dos indíviduos expostos ao
risco; tratamento profilático; observação de cão e gato; investigação dos casos;
educação em saúde e pesquisa de novos imunógenos, através das técnicas
tradicionais e moleculares, visando oferecer produtos mais potentes e com baixo
custo financeiro. A raiva, por ser uma zoonose, dificilmente será erradicada e,
portanto, o aprimoramento das campanhas vacinais deve ser constantemente
valorizado e estimulado, na tentativa de se tentar controlar a cadeia
epidemiológica do vírus rábico ( WHO, 1992; OMS/WSPA, 1990 ).
1.10. VACINAS
22
Atualmente, a profilaxia contra a raiva consiste no tratamento do indivíduo
com soros e vacinas. Os regimes vacinais, que possuem diferenças entre
diferentes países, são estabelecidos de acordo com as necessidades da
imunização ( regime pré ou pós exposição, gravidade do ferimento, etc ). A
profilaxia com imunoglobulinas anti-rábicas, homólogas ou heterólogas, é
recomendada para ferimentos graves, conjuntamente com o uso de vacinas e
assepsia local cuidadosa ( MS/FNS BRASIL, 1995 ).
A produção de vacinas depende da qualidade das amostras virais
utilizadas. Estas amostras pertencem ao sorotipo 1, de amostras “fixas”: Pasteur
Virus ( PV ), Challenger Virus Standard ( CVS ) e Pitman-Moore ( PM ), são
derivadas da amostra inicial utilizada por Pasteur no século passado. As
amostras veterinárias freqüentemente utilizadas são “Street Alabama Dufferin”
( SAD ) ou “Evelyn-Rokitnicki-Albelseth” ( ERA ) ( CELIS et al., 1990; MS/FNS
BRASIL, 1995; WHO, 1992 ).
FUENZALIDA & PALACIOS, em 1955 ( FUENZALIDA et al., 1955 ),
desenvolveram uma vacina, de modo original, inoculando camundongos recémnascidos, e portanto, desprovidos de mielina no sistema nervoso. Assim,
diminuíram significativamente, mas não totalmente, as reações adversas graves.
Esta ainda é a vacina mais utilizada em todo o mundo, inclusive no Brasil (
WHO, 1992 ). Em 1953, SANDERS, KIEM & LAGUNOFF foram os primeiros a
cultivarem o vírus rábico em cultura celular ( SANDERS et al., 1953 ). Em 1960,
FENGE ( FENGE, 1960 ) conseguiu a produção de vacina anti-rábica em cultura
celular primária de rim de hamster. Esta mesma vacina, com poucas
modificações, é utilizada na China, e na antiga URSS. Na China, a amostra viral
utilizada é a Beijring e na URSS é a amostra viral modificada Vnukovo-32
( FANGTAO et al., 1983 ). Convém salientar que as vacinas anti-rábicas
produzidas em cultura celular são totalmente desprovidas de mielina e, portanto,
não causam acidentes vacinais neuroparalíticos.
O vírus rábico foi adaptado em células diplóides humanas, em 1964, por
WIKTOR, FERNANDEZ & KOPROWSKI na linhagem WI-38 e, assim, a
produção de vacinas utilizando culturas celulares iniciou-se ( WIKTOR et al.,
23
1964 ). Em 1970, JACOB, JONES & BAILLE substituíram a linhagem WI-38 por
outra linhagem humana a MRC-5, sendo a mais usada atualmente ( JACOB et
al., 1970 ).
1.10.1. Vacinas de última geração
Vacinas sintéticas de subunidades homólogas ou heterólogas, produzidas
por meios bioquímicos e genéticos, são pesquisadas pela produção de
peptídeos representativos dos sítios imunogênicos das proteínas G e N do vírus
rábico. Uma outra forma de se obter peptídeos imunogênicos, por processos
biotecnológicos, de maneira econômica e obtendo produtos com grande pureza,
é com o uso de plasmídeos e vetores virais ( DIETZSCHOLD et al., 1987 ).
Desde a década de 70, busca-se uma forma eficaz para a vacinação antirábica por via oral. Dois tipos de imunização já foram efetuados, em larga
escala, em vários países, para vacinação oral animal. Estas imunizações
utilizaram vacinas atenuadas e vacinas produzidas pela tecnologia do DNA
recombinante ( THOMAS et al., 1990 ). O custo operacional de uma imunização
em massa, de forma oral para animais, ficaria bastante reduzido pois seria
desnecessária a inoculação individual e o espectro de espécies vacinadas seria,
teoricamente, amplo. Com o uso de iscas, é possível realizar campanhas
vacinais objetivando a imunização dos grandes reservatórios naturais da raiva,
como os animais silvestres e cães errantes ( WHO, 1992; PASTORET et al.,
1995 ).
O cDNA do gene N, que codifica a proteína N, foi clonado e expresso, a
proteína depois de purificada, foi utilizada para imunizar, intramuscularmente,
camundongos que sobreviveram a um desafio com o vírus rábico ( FU et al.,
1991 ). A utilização do vírus vaccínia ( poxvírus ) como vetor do gene da
glicoproteína G, fez com que esta proteína fosse expressa em células de
camundongos. Estes animais foram inoculados intramuscularmente com vírusvaccínia-recombinado com G ( VRG ) e demonstraram indução de linfócitos B
que produziram anticorpos neutralizantes e estimulação de linfócitos T
24
citotóxicos ( WIKTOR et al., 1984 ). Em 1991, foi construído um outro vetor a
partir de poxvírus de aves ( canaripox ) que expressou a glicoproteína G. A
construção de um vetor do gene G, usando um vírus que não infecta mamíferos,
resultou em um novo conceito de vacinas. Esta vacina não replica nas células de
mamíferos, pois ocorre replicação abortiva, mas mesmo assim, os genes
inseridos, como G ou N, são expressos e produzem suas respectivas proteínas
por um curto espaço de tempo, sendo suficiente para obter a imunização
( TAYLOR, 1991 ). Entre 1989 até hoje, a Bélgica e a França realizaram, em
uma área de 10.000 km2, uma campanha para erradicar a raiva entre raposas e,
após a campanha, foi constatado um decréscimo superior a 90 % de animais
raivosos. Foi usada a vacina com o vírus vetor vaccínia com a glicoproteína G
( VRG ), de uso oral, adicionada, inicialmente, em pescoços de galinha, usados
como isca. Atualmente é utilizado um sistema de iscas vacinais, designado com
o nome comercial Raboral ( DESMETRE et al., 1990 ).
Na América Latina, a atual situação econômica é um fator que muito limita
uma possível imunização de forma oral em grande escala. Calcula-se que um
programa de imunização em massa, com vacinas orais, possa ser pago como
custo-benefício em aproximadamente sete anos. No Brasil, os dois principais
vetores da raiva são os cães e os morcegos. As campanhas de vacinação atuais
para a população canina, se feitas com rigor, dão bons resultados, ainda que
não atinjam os níveis ideais, pois não são a única maneira de se controlar a
raiva em área urbana. O controle de morcegos, principais vetores da zona rural,
é feito de modo precário e através de algumas práticas totalmente condenáveis,
como explosões de cavernas e uso de pastas anti-coagulantes aplicadas em
alguns indivíduos da colônia ( WHO, 1993; CAMPBELL, 1994 ).
1.11. DIAGNÓSTICOS
Antes que ocorra a invasão do vírus rábico no sistema nervoso, é possível
a vacinação após a infecção, e assim, o seu diagnóstico é de extrema
25
importância para quem tenha entrado em contato com o vírus.
O diagnóstico clínico do animal agressor ou do indíviduo infectado é
importante em localidades totalmente desprovidas de assistência laboratorial.
Entretanto, é difícil, pois o vírus determina manifestações clínicas inespecíficas
no período que precede a invasão ao SNC. Há diferentes sintomas, mesmo em
indivíduos da mesma espécie. Na avaliação clínica do agredido é importante
analisar se o transmissor é espécie de risco, se a região é zona endêmica, como
também a gravidade do ferimento ( WHO, 1992; WHO, 1994 ).
As técnicas laboratoriais de diagnóstico antemortem são similares as post
mortem, mudando o material a ser analisado.
O indivíduo vivo, suspeito de infecção, poderá ter sua saliva, bulbo piloso
e córnea analisados. As duas últimas estruturas são altamente enervadas e, a
primeira, a porta de saída do vírus do hospedeiro. A análise post mortem se
efetua no SNC, preferencialmente na região do hipocampo, cerebelo e medula.
Em algumas espécies, como morcegos e outros animais silvestres, recomendase a análise das glândulas salivares, devido à falta de conhecimento sobre o
tropismo do vírus nestas espécies ( KAPLAN, 1996; CHOMEL, 1993 ).
As técnicas laboratoriais devem identificar e isolar o vírus rábico. A
metodologia de diagnóstico para a raiva é normatizada pela Organização
Mundial da Saúde. O diagnóstico clínico deve ser realizado através de
Imunofluorescência Direta, utilizando conjugado antinucleoproteína, seguida de
inoculação intracerebral em camundongos. As duas técnicas, quando utilizadas
conjuntamente,
necessárias
oferecem
pela
alta
máxima
letalidade
sensibilidade
da
infecção
e
alta
(
específicidade,
WHO,
1992 ).
A
Imunofluorescência Direta é rápida e executada facilmente em duas a três
horas.
Anticorpos
fluoresceína,
anti-nucleoproteínas
coram
amostras
marcados
positivas,
com
detectando
isotiocianato
inclusões
de
intra-
citoplasmáticas, chamadas Corpúsculos de Negri, que são aglomerados de
nucleocapsídeos do vírus ( DEAN et al., 1996 ). A inoculação de suspensões do
SNC, ou saliva, da pessoa ou animal suspeito de raiva, em camundongos, por
via intracerebral, é amplamente utilizada para o isolamento do vírus rábico. Após
26
a inoculação, observa-se os camundongos 21 dias e, todos que morrerem após
o quinto dia de inoculação, devem ter seus cérebros retirados e analisados por
Imunofluorescência Direta ou deles se preparar uma suspensão, para
posteriormente inoculá-la em outros camundongos ( KOPROWSKI, 1996 ). Uma
linhagem celular de neuroblastoma murino ( C-1300; clone NA ), por ser muito
susceptível à infecção do vírus rábico, é utilizada em laboratórios de grandes
centros para isolamento do vírus. Após 48 a 72 horas de efetuada a inoculação
do material suspeito, cora-se a cultura celular, como na Imunofluorescência
Direta e observa-se a presença de Corpúsculos de Negri nas amostras positivas
( WEBSTER et al., 1996 ). Esta técnica poderá, em um futuro próximo, substituir
as inoculações em animais, por seu caráter ético. O isolamento do vírus rábico
também pode ser feito pela inoculação de suspensões em células BHK 21
( RUDD et al., 1987 ), ovos embrionados e outros animais ( KOPROWSKI,
1996).
Diagnósticos para identificação do vírus também são realizados através
de
métodos
imunohistoquímicos,
utilizando
Avidina-Biotina,
em
alguns
laboratórios. Esta técnica é muito importante em estudos de epizootiologia, que
necessita de grande número de amostras de campo e conseqüente conservação
em formalina para posterior diagnóstico. Neste tipo de pesquisa é inevitável que
muitas amostras comecem a se decompor, mas pela grande sensibilidade da
técnica, este inconveniente é superado ( WEBSTER et al., 1996 ). A reação
imunoenzimática, tipo ELISA, é realizada em alguns laboratórios e existe grande
tendência em ser usada amplamente. Atualmente, é muito utilizada em estudos
epidemiológicos feitos em campo, pois seu resultado é rápido e constatado
facilmente ( BOURHY et al., 1996 ).
Técnicas
histoquímicas
são
pouco
utilizadas
por
sua
pequena
sensibilidade, como a reação de Sellers, usada durante muitos anos, que cora
os Corpúsculos de Negri em vermelho ( TIERKEL et al., 1996 ). Reações de
contra-imunoeletroforese ( MANZANERO, 1983 ), hemaglutinação e reação de
fixação de complemento ( PEREIRA et al., 1970 ), por serem pouco difundidas
nos laboratórios de diagnóstico da raiva, não tiveram sua sensibilidade e
27
especificidade suficientemente pesquisadas para serem usadas em rotina
laboratorial.
A análise de anticorpos para o vírus rábico, no soro ou líquido céfaloraquidiano, também pode ser usada para o diagnóstico antemortem da raiva,
desde que o indíviduo nunca tenha sido vacinado contra esta doença. Um fator
limitante desta técnica de diagnóstico é a demora na resposta imune-humoral
contra o vírus rábico. A titulação de anticorpos neutralizantes, em cultura celular
ou camundongos, é importante para se diagnosticar a resposta imune-humoral
do indivíduo em tratamento, em sistemas de pré ou pós-exposição ( SMITH,
1996 ), pois diferenças na potência das vacinas de um certo lote produzido,
condições de armazenamento, local e número de doses aplicadas, além do
próprio genótipo do indivíduo, influem na resposta imune contra o vírus rábico,
estimulada pela vacinação, sendo, portanto, necessário que a imunização seja
acompanhada laboratorialmente ( SIZARET, 1996 ). Atualmente, também se tem
utilizado reações imunoenzimáticas ( ELISA ) para avaliação de títulos de
anticorpos neutralizantes (ELMGREN et al., 1996; ESTERHUYSEN et al., 1995).
O vírus rábico, até recentemente, somente podia ser identificado com o
uso de anticorpos policlonais ou monoclonais, após o isolamento do vírus em
cultura de células ou tecidos infectados. A clonagem e seqüênciamento do
genoma deste vírus, permitiu o início do uso de técnicas moleculares para seu
diagnóstico; o estudo da expressão gênica ( relacionando os elementos
genômicos na replicação e transcrição ). Também permitiu a tipificação do vírus,
iniciando assim, o estudo da epidemiologia molecular e das relações
taxonômicas, dentro do seu gênero e, entre diferentes gêneros. Duas estratégias
foram aplicadas para o seqüênciamento do vírus; clonando o RNAm ou o RNA
genomico, sendo que, a segunda estratégia permite o conhecimento das regiões
intergênicas, relacionando espacialmente os genes com as seqüências não
expressas. A clonagem inicia-se com a amplificação do genoma, podendo ser
realizada através de RT-PCR. Através de clonagens é possível formar um banco
de cDNA que, armazenado, permite a conservação das seqüências genômicas
para futuras investigações ( TORDO et al., 1996; SAMBROOK et al., 1989 ).
28
O diagnóstico molecular do vírus rábico é realizado pela demonstração
direta da presença do gene N, hibridizando sondas complementares a região
alvo através de Dot blot, Northern blot
ou Southern blot ou, indiretamente,
efetuando a hibridação depois de amplificação através de RT-PCR. Sondas
radioativas hibridizadas podem ser detectadas diretamente por autoradiografia, e
sondas
não
radioativas,
conjugadas
com
peroxidase,
são
detectadas
indiretamente por imunoquimioluminescência. A detecção direta do RNA viral
por dot blot ou Northern blot não tem suficiente sensibilidade, provavelmente
pela degredação do RNA do vírus durante a manipulação da amostra, ou pela
quantidade insuficiente de vírus. A observação direta do ácido núcleico em gel
de agarose, corado com brometo de etídio, após RT-PCR, não tem suficiente
especificidade, pois pode ocorrer migração de bandas inespecíficas junto a
banda de interesse, fato comum em amostras altamente degradadas.
Entretanto,
produtos
amplificados
e
hibridizados,
após
Southern
blot,
discriminam bandas específicas e inespecíficas ( SACRAMENTO et al., 1991;
TORDO et al., 1996 ).
O uso de RT-PCR, devido a sua grande sensibilidade, permite o
diagnóstico de amostras em avançado estado de decomposição, e a execução
da técnica RT-PCR em diagnósticos antemortem possibilita o diagnóstico
precoce da infecção; permitindo o tratamento do indíviduo infectado e profilaxia
pós-exposição para os que entraram em contacto com o infectado ou a fonte do
vírus ( SMITH, 1996; KAMOLVARIN et al., 1993; ORCIARI et al., 1993 ). O uso
conjunto de RT-PCR e sondas genéticas evita os riscos de diagnósticos falsopositivos, pelo aumento da sensibilidade e especificidade ( JACKSON et al.,
1991; JACKSON et al., 1989; MAUDRU et al., 1998; WHITBY et al., 1997 ).
Os resultados comparativos obtidos para o diagnóstico do vírus rábico
pelo uso de RT-PCR ( confirmado através de sondas radioativas ou marcadas
com digoxigenina, utilizadas após Dot blot ou Southern blot ), e técnicas de
rotina
( Imunofluorescecência Direta, ELISA, ou diagnóstico em culturas de
células NA ), são semelhantes. Comparando o tempo de execução das técnicas
citadas acima, determinou-se para a Imunofluorescência Direta 2-3 hs.; ELISA 4-
29
5 hs.; PCR seguido de hibridização 18- 20hs. e, diagnóstico em cultura de
células 24- 36 hs.. O diagnóstico através de Dot blot de amplificados de RT-PCR
é a técnica molecular efetuada com maior rapidez e facilidade e a utilização de
sondas não radioativas é mais simples e rápida do que as radioativas, além de
possuirem maior estabilidade ( SACRAMENTO et al., 1991 ).
A amplificação e detecção in vitro de ácidos nucleicos virais, através de
RT-PCR possui sensilbilidade comparável a propagação do vírus em culturas
celulares, tendo a vantagem de ser mais rápida e não necessitar da viabilidade
do vírus e, assim, a médio prazo, o custo do RT-PCR é vantajoso. As variações
das seqüências genômicas são detectáveis através da sua hibridização com
sondas, pela especificidade do pareamento das bases nitrogenadas. A
associação da amplificação do genoma por RT-PCR e hibridização com sondas
genéticas, pode detectar infecções latentes, mesmo na ausência de antígenos
específicos e com pequena quantidade do ácido nucleico do vírus. A
versatilidade da técnica RT-PCR permite um grande número de aplicações,
utilizando-se variações da reação. A técnica de Nested PCR permite o aumento
da especificidade e sensibilidade da reação; PCR multiplex amplifica vários
segmentos genômicos em uma mesma reação; PCR utilizando primers
degenerados
possibilita
seqüenciar
genomas;
PCR
utilizando
primers
conjugados a determinados grupos químicos podem sintetizar sondas genéticas
e PCR quantitativo permite correlacionar o número de moléculas amplificadas
com o número de moléculas utilizadas no início da reação ( SAMBROOK et al.,
1989 ).
Também utiliza-se RT-PCR para a produção de sondas DNA reveladas
por quimioluminescência. Amplificando a região genômica a ser detectada ( alvo
), esta será utilizada como molde na reação de “nick-translation” que dá origem a
sonda. Nesta reação corre a incorporação de hexanucleotídeos randômicos,
conjugados com digoxigenina, portanto, as sondas são regiões complementares
ao alvo, possuindo diversos tamanhos e com digoxigenina incorporada em sua
estrutura. Esta reação é polimerizada pelo fragmento de Klenow, que não realiza
a síntese de novo, permitindo, assim, a conservação dos hexanucleotídeos
30
conjugados. A sonda é hibridizada ao ácido nucleico alvo após Southern-blot, e
a detecção inicia-se com a adição de anticorpo anti-digoxigenina conjugado com
fosfatase alcalina. A hibridação é revelada com Lumi-Phos; uma formulação
para a detecção imunoquimioluminescente de ácidos nucleicos, contendo
LumigenTM
( substrato para fosfatase alcalina ) que, entre outras substâncias,
possui fluoresceína. O substrato LumigenTM ao ser defosforilado pela fosfatase
alcalina, forma um intermediário instável que emite luz, captada em chapa
fotográfica.
A tipificação e epidemiologia molecular do vírus rábico são realizadas
através de hibridização, enzimas de restrição, RT-PCR e seqüênciamento
genômico. A utilização paralela de um painel de anticorpos monoclonais,
representativo da área estudada, é de fundamental importância, pois a detecção
imunológica é prova diagnóstica confiável. O princípio do diagnóstico
epidemiológico do vírus rábico parte da análise comparativa dos dois genotipos
mais divergentes do gênero Lyssavirus,
o genotipo 1 ( vírus rábico ) e o
genotipo 3 ( Mokola ). A área de maior polimorfismo destes vírus é a do
pseudogene , região pouco conservada e não codificadora de proteína. Outra
região de interesse neste estudo é a do gene G, relativamente pouco
conservada. A comparação das regiões conservadas, como a do gene N, entre
os diferentes genotipos, são importantes na tipificação por relacionar a distância
taxônomica entre os Lyssavirus. A tipificação e epidemiologia molecular em
regiões geográficas onde circulam diversas amostras de vírus divergentes é
fundamental; o conhecimento adquirido assegura se a amostra vacinal oferece
proteção contra as amostras circulantes ( BOURHY et al., 1993; SACRAMENTO
et al., 1991 ).
A epidemiologia molecular do vírus rábico tem início com a tipificação
molecular do vírus, identificando as variantes gênicas de uma região, e
associando-as com os possíveis vetores encontrados na área. As divergências
encontradas entre as variantes gênicas ocorrem por mutações genéticas,
permitindo ao vírus adaptações ambientais, que em última análise, relacionam-
31
se ao hospedeiro. O conhecimento da História Natural dos vetores, associada a
tipificação molecular do vírus, é essencial para a obtenção de dados para a
prevenção da infecção. Também é possível construir a gênese das variantes
genômicas do vírus, associando a seqüência de nucleotídeos com as espécies
animais de diversas regiões geográficas; e assim, determinar um quadro de
evolução molecular e diversificação do vírus no ecossistema. A árvore
filogenética construída para os Lyssavirus possui 6 principais “clusters”
genéticos, sugerindo que as regiões genômicas evoluem paralelamente, de
acordo com as pressões seletivas locais. A análise compara a variação no
tamanho das regiões genômicas e regiões não codificadoras ( BOURHY et al.,
1993; TORDO et al., 1996 ).
32
2. OBJETIVOS
O objetivo deste trabalho é o diagnóstico do vírus rábico, realizado pela
técnica de RT-PCR e hibridação, revelada por imunoquimioluminescência. Em
resumo, o trabalho abrange:
2.1. Produção de sonda DNA não radioativa para detecção do gene
N ( região conservada ).
2.2. Produção de sonda DNA não radioativa para detecção do gene
G ( região variável ).
2.3. Construção de um plasmídeo com inserto do gene da
glicoproteína G, para controle e comparação do diagnóstico.
33
3. MATERIAIS e MÉTODOS
3.1. Amostras
As amostras clínicas são designadas, conforme normas do Instituto
Pasteur, como: 878 M ( bovino ), 963 M ( equíno ), 51 M ( cão ) do ano de 1999;
3959 M ( cão ), 4004 M ( bovino ), de 1997; e 008 M ( cão ) de 1998. As
amostras 008 M ( 1998 ) e 51 M ( 1999 ) são negativas e todas as outras são
positivas.
Todas as amostras
acima foram
cedidas pelo Instituto, e
diagnosticadas por Imunofluorescência Direta e inoculação intracerebral em
camundongos.
Também foi realizada RT-PCR para a detecção dos genes G e N do vírus
rábico, utilizando os primers citados neste trabalho, as seguintes amostras da
Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia - USP, gentilmente cedidas pelo
Prof. Dr. Fumio Honma Ito: M-276/98, T-11/95, IC/94, T-09/95 ( morcegos
hematófagos positivos ); M-07/96, M-13/88 ( amostras de bovinos positivos ) e
as amostras PV e CVS. Como controles negativos, M-328/98 ( ovino ) e M-49/76
( bovino ).
3.2. Extração do RNA
As amostras clínicas foram preparadas utlizando-se 0,5 g de sistema
nervoso maceradas em 1,5 mL de H2O-DEPC e centrifugadas a 2.000g. Em
seguida, coletou-se 0,5 mL do sobrenadante para a extração do RNA viral.
Procedeu-se a extração do RNA viral utilizando-se 0,5 mL de amostra e
adicionando-se TRIzol ( solução monofásica de fenol-isothiocianato de
guanidina-GIBCO ). Nas amostras virais fixas, CVS ou PV, congeladas a -70C
em alíquotas de 0,5 mL, foram adicionados 0,5 ml. de Trizol, após serem
descongeladas em banho de gelo. Após 5 min., seguindo com o protocolo para
todas as amostras, foram adicionados 0,2mL de clorofórmio e, após
homogeneização em vortex, a mistura resultante foi incubada em gelo, por 5
min. e centrifugada a 12,000g a 4ºC, durante 15 min. Após centrifugação, o
sobrenadante obtido da fase superior foi coletado, transferido para outro tubo
34
estéril e precipitado, volume a volume, com isopropanol e, a seguir, incubado em
gelo durante 15 min.. A mistura foi novamente centrifugada ( 12,000g por 15
min. ) e o sedimento lavado com 1 mL de etanol ( 75% ), centrifugado a 7,500g a
4ºC, por 8 min.. Finalmente, o sedimento foi seco durante 10 min. e ressuspenso
em 25uL de H2O-DEPEC
( dietilpirocarbamato ). A seguir, foi colocado em
banho-maria a 60C, durante 10 min., para completa dissolução e armazenado a
-70ºC, até o momento de uso.
3.3. Descrição dos oligonucleotídeos iniciadores ( "primers" )
Os primers para os genes G e N do vírus rábico, foram desenhados a
partir das seqüências nucleotídicas da amostra PV, obtidas durante acesso ao
GeneBank e, produzidos por GIBCO BRL Custom Primers.
Chamou-se de N1 e N2 os primers para o gene N, com sentido de
polimerização 5´  3´ e, 3´  5´, respectivamente. Da mesma forma, chamouse G1 e G2 os primers para o gene G, com sentido de polimerização 5´  3´ e,
3´  5´, respectivamente. Abaixo o desenho dos primers N e G.
N1: 5´ CAC CTG CAC GGA TCC ATG GAT GCC GAC AAG ATT 3´
N2: 5´ CAC CTG CAC GGA TCC TTA TGA GTC ACT CGA ATA 3´
G1: 5´ CAC CTG CAC GGA TCC ATG GTT CCT CAG GCT CTC 3´
G2: 5´ CAC CTG CAC GGA TCC TCA GAG TCC GGT CTC AC 3´
Legenda do desenho dos primers N1, N2, G1 e G2 : azul, seqüências
inespecíficas; negrito, seqüências para cortes com Bam H I e; vermelho,
seqüências dos genes G ou N.
35
3.4. Polimerização por Transcrição Reversa ( RT )
Nas reações de transcrição reversa ( RT ), para a obtenção de cDNA,
assim como nas de polimerização em cadeia ( PCR ), foram utilizadas ponteiras
com filtros e fluxos laminares.
Para a transcrição reversa ( RT ) foi utilizado o sistema Super Script
RT-PCR ( Gibco-BRL ). Para cada 5L de amostra usou-se; 8L de tampão
RT; 12L de H2O-DEPC; 1L RNAsin; 6L dNTPs; 5L de primer 5´  3´ e, 5L
de primer 3´  5´; 1L de enzima RT e; 4L DDT. A reação foi realizada em
termociclador ( MJ Research ) com 1 ciclo de 42°C, em 60 minutos.
3.5. Reação em Cadeia pela Polimerase ( PCR )
Foram utilizados, para esta reação, 0,5 L de Taq DNApolimerase
( Gibco-BRL ); água-DEPC 50,5 L; MgCl2 5L; tampão PCR 10 L; dNTPs 1,25
mM 16l; 5L de primer 5´  3´ e, 5L de primer 3´  5´;e, 10L de amostra em
cDNA. Os tubos de reação Eppendorff ( 500L ) foram cobertos com 50L de
óleo mineral Nujol.
A reação de polimerização em cadeia ( PCR ) teve o seguinte protocolo
no termociclador:
1 ciclo
94°C Denaturação
5 min.
35 ciclos
94ºC Denaturação
45 seg.
35 ciclos
55ºC Anelamento
45 seg.
35 ciclos
72°C Extensão
1 min. 30 seg.
1 ciclo
72°C Extensão
5 min.
Foram submetidos à corrida de eletroforese 10 L das amostras dos
produtos amplificados, em gel de agarose (Gibco BRL), a 1% ( w/v ), contendo
0,5 g / ml de brometo de etídio ( Etd Br-Sigma ) em tampão TBE ( 89 mM - Tris
36
HCl; 89 mM H3BO3; 2 mM Na2 EDTA; pH 8,3 ) durante 45 minutos à 100 volts,
visualizados sobre transluminador de U.V., sendo os resultados comparados aos
controles positivos e negativos, e aos marcadores de peso molecular, com 100
pb. ( Gibco BRL ) ou 1 Kb ( Bethesda Research Laboratories ). Os resultados em
géis de agarose foram fotografados digitalmente em equipamento Eagle Eye
( Stratagene ).
3.6. Construção do plasmídio pSHG
3.6.1. Plasmídeo pSH
O vetor pSH, com 5900 bp e AmpR ( VENTURA et al., 1993 ) foi
escolhido para a clonagem do gene G, sendo gentilmente cedido pelo Prof. Dr.
Armando Ventura ( Depto de Microbiologia, ICB III ), que também orientou os
procedimentos de clonagem e transfecção do mesmo ( figura 2 ).
37
3.6.2. RT-PCR com polimerase DeepVent
O gene G do vírus rábico foi amplificado para a clonagem por RT-PCR a
partir da amostra PV, e utilizou-se a polimerase DeepVent ( New England
Biolabs), com o mesmo protocolo do RT-PCR para Taq polimerase.
3.6.3. Purificação por Eletroeluição
Após confirmação da amplificação em gel de agarose, retirou-se o
amplificado do gel, recortando-o com bisturi, isolando-o de bandas espúrias. Em
seguida, o fragmento foi colocado em saco de diálise com TBE ( 0,5% ) e
realizou-se eletroeluição em cuba eletroforética a 100 volts, durante 1 h. Em
seguida, foi invertida a corrente elétrica durante 2 min., dissociando o DNA
eletroeluído da membrana de diálise. Em um Becker, com 500 mL. de TE ( 1 mL
EDTA 0,5M; 5mL Tris 1M pH 8; 500 mL de H2O Milli-Q ), sobre agitador
magnético, realizou-se a troca dos tampões TBE por TE, por agitação. Após
duas trocas de tampão, sendo 20 min. cada uma, retirou-se cuidadosamente o
fragmento do gel de agarose do interior do saco de diálise, medindo-se o
conteúdo líquido no interior da membrana, no qual a seqüência do gene G
encontrava-se. Em seguida, a amostra G foi purificada pelo método do fenolclorofórmio e ressuspessa em 20 L de TE ( SAMBROOK al., 1989 ).
3.6.4. Preenchimento das extremidades dos amplificados
Foi realizado o preenchimento ( "feel-in" ) das extremidades do
amplificado do gene G, com T4 polimerase, conforme o seguinte protocolo do
produtor ( New England, Biolab ): gene G, 15 L; dNTP, 8 L; enzima T4
polimerase, 1 L; tampão T4, 1 L; 0,1% BSA, 3 L. A reação ocorreu em 1h. e
a 37°C.
38
3.6.5. Linearização e defosforilação do vetor
A linearização do vetor pSH foi realizada em seu sítio de restrição Bam H
I, conforme protocolo do fabricante. Foi utilizado; pSH, 3L; H2O, 23L; Bam H I
( GIBCO ), 1L; tampão Bam H I 1L. A reação foi realizada durante 2h. a 37°C.
Em seguida, realizou-se a defosforilação do vetor pSH linearizado com CIP
( fosfatase alcalina intestinal, New England, Biolab ), conforme protocolo do
fabricante: adicionou-se 1L de CIP no tubo onde ocorreu a linearização, em 1h.
e a 37°C. Após as etapas anteriores, purificou-se o vetor pSH, através do
método fenol-clorofórmio e, em seguida, foi ressuspenso em10L de H2O MilliQ.
3.6.6. Formação de extremos coesivos no inserto G
O amplificado do gene G, tendo em suas extremidades sítios de restrição
para Bam H I, teve que ser digerido para a formação de extremos coesivos, para
a ligação clone-vetor, utilizando a referida enzima, da mesma forma que foi
utilizada com o vetor pSH. Em seguida, purificou-se o inserto G através do
método fenol-clorofórmio, que foi ressuspenso em 10L de H2O Milli-Q.
3.6.7. Ligação clone-vetor
Utilizou-se a enzima T4 DNA ligase ( New England, Biolab ) para a
ligação inserto-vetor, conforme protocolo do produtor a seguir: pSH linearizado e
defosforilado ( com extremos coesivos ), 1L; inserto G com extremos coesivos,
2L; T4 DNA ligase, 0.5L; tampão ATP ligase 10X, 1L; H2O Milli-Q, 5.5L., e a
reação ocorreu em 12h. a 16°C.
39
3.6.8. Preparo das bactérias competentes
Utilizou-se células DH5-, linhagem bacteriana de Escherichia coli,
supE44 alc U 169 ( 80 lac Z M 15 ) nsd R 17 rec A1 end A1 gyra 96 thi-rel A1 (
New England, Biolabs ), com marca para Tetraciclina. Colônias bacterianas
mantidas refrigeradas em meio LB sólido ( Triptona, 1%; extrato de levedura,
0.5%; NaCl, 0.5%; agár, 1.5%; Tris pH 7.4, 10mM; MgSO 4, 1mM ), foram
propagadas em meio LB líquido, em estufa rotatória a 37°C, por 2h., e, atigindo
a fase log de crescimento, efetuou-se o método do Cálcio-Rubidio ( SAMBROOK
et al.,1989 ), para a obtenção de células competentes.
3.6.9. Transformação bacteriana
A cultura celular DH5- competente foi transformada pela adição de 5 L
do plasmídeo pSH-G ( pSH ligado ao inserto G ), através de eletroporação,
utilizando cuvetas "Gene Pulser/E.coli" ( BIO-RAD ), conforme instruções do
fabricante. Após a eletroporação, as células foram reparadas em meio SOC (
SAMBROOK et al.,1989 ), e em seguida semeadas em placas de cultura para
bactérias, em meio LB-sólido Ampicilina/Tetraciclina ( 50 g/mL ), para a seleção
das células transformadas, durante 24 horas em estufa de CO 2, a 37°C. Da
eletroporação obteve-se 37 colônias, expandidas com meio LB líquido
Ampicicilina/Tetraciclina, em estufa rotatória durante 12h., a 37°C.
3.6.10. Extração do DNA plasmideal e Análise de Restrição
Utilizando um "kit" ( Nucleon Mip, Amersham Life Science ), foi extraído o
DNA plasmideano
( "miniprep" ), das 37 colônias expandidas em meio LB
líquido, conforme protocolo de extração e purificação do fabricante. Após a
obtenção do DNA plasmideano, foi realizada análise de restrição, com a enzima
Bam H I, nas culturas celulares, para a comprovação da presença do gene G, e
em seguida, análise de restrição com as enzimas de restrição Bam H I e Hind III,
para a detecção da orientação do inserto G no vetor pSH. Confirmada a
40
orientação correta, inoculou-se as
colônias, com o inserto G na orientação
correta, em meio LB líquido Ampicilina/Tetraciclina, que foram propagadas em
estufa rotatória por 12 horas, para a obtenção de DNA plasmideano em média
escala ( med-prep ), conforme protocolo descrito a seguir. As células, das
colônias selecionadas pela análise de restrição, foram inoculadas na proporção
de 1/100 em 250 mL de meio LB com 100 g/mL de Ampicilina/Tetraciclina e,
novamente incubadas, por uma noite, sob agitação a 37°C. Em seguida, as
células foram centrifugadas a 6000g, por 15 min., a 4°C e, o sedimento
ressuspendido em 15 mL de solução I, contendo 5 mg/mL de lisozima. A
suspensão foi mantida a temperatura ambiente por
10 min. e em seguida,
adicionou-se 15 mL de solução II. Após incubação no gelo por 10 min.,
adicionou-se 15 mL de solução III, misturando-se com cuidado. O material foi
mantido no gelo por 20 min. e centrifugado a 6000g por 15 min. a 4°C. O
sobrenadante foi transferido para outro tubo (antes, porém, o líquido foi filtrado
utilizando-se uma gaze estéril), adicionou-se 0,6 volumes de isopropanol e
deixou -se a temperatura ambiente por 1 h. para precipitar o DNA. O material foi,
então, centrifugado a 8000g por 15 min., o sedimento ressuspendido em 2,5 mL
de tampão TE e transferido para um tubo Corex de 15 mL. As proteínas foram
precipitadas pela adição de 2,5mL de NaH4Oac ao material que foi
homogeneizado e incubado no gelo por 20 min.. Após este período, procedeu-se
à centrifugação por 15 min. a 8000g a 4°C. O sobrenadante foi transferido para
outro tubo Corex, adicionou-se 2 volumes de etanol 95% e incubou-se a –20%
por 30 min.. O material foi centrifugado a 8000g por 15 min., o sedimento
dissolvido em 0,7 ml. de tampão TE e transferido para um tubo Eppendorf.
Adicionou-se 0,5 L de uma solução de Rnase a 20 mg/mL e incubou-se a 37°C
por 15 min.. A seguir, adicionou-se 300L de uma solução de NaCL 5M e 250 L
de
PEG30%NaCl 1,5M sendo o material incubado por 30 min. no gelo.
Procedeu-se a centrifugação por 15 min. a 14000g a 4°C. O sedimento foi
ressuspendido em 0,2 mL de tampão PK 2X ( 20mM Tris-HCl, pH 8,0; 10mM
EDTA; 1% SDS ) e 10L de proteinase K ( 20 mg/mL ),sendo em seguida
incubado a 37°C por 30 min.. O material foi tratado com fenol e centrifugado a
41
14000g por 15 min. para separar as fases. À fase resultante, adicionou-se
acetato de potássio 3M para atingir uma concentração de 0,3M, seguindo-se à
adição de 2 volumes de etanol absoluto e incubação a –20°C por 30 min.. O
sedimento foi coletado por centrifugação, lavado com 1mL de etanol 70% e
ressuspendido em tampão TE. A concentração do DNA plasmideal foi
determinada por espectrofotometria, medindo-se a absorbância em 260nm (
Sambrook et,1989 ). O DNA obtido foi congelado a -70°C para ser utilizado no
momento adequado.
3.7. Reação de Seqüenciamento Automático
Para a reação de seqüenciamento automático do gene G, inserto em
pSH-G, utilizou-se BigDyeTM terminator – cycle sequencing ready reaction –
Applied Biosystems – Perkin Elmer, conforme descrito a seguir.
Foi utilizado o DNA do gene G presente em pSH-G, obtido após
reação de PCR. Após eletroforese do produto de PCR, recortou-se do gel de
agarose a banda de interesse, onde encontrava-se o amplificado do gene G, e
efetuou-se a extração do DNA do gel utilizando-se o “kit” ConcertTM Rapid Gel
extraction System ( GibcoBRL ), conforme protocolo do fabricante. A reação de
seqüenciamento foi executada seguindo as normas do fabricante.
Para cada reação:
Reagentes
Terminator ready reaction Mix
Produto de PCR
Primer G1 e G2
Água deionizada
Quantidade
4 L
30-90 ng
3.2 pmol ( para cada primer )
q.s.p. 10 L
Após homogeneização, a mistura foi levada ao termociclador com o
seguinte programa:
25 ciclos
 96 C por 10 segudos
 50 C por 5 segundo
 60 C por 4 minutos
42
Após a amplificação, o DNA foi purificado por filtração em coluna,
utilizando-se Spin column – Centri-StepTM FROM Princeton Separations ( P/N
CS-901 ), conforme descrito a seguir:
Após hidratação da coluna, por no mínimo 2 hs., a amostra foi aplicada
cuidadosamente na superfície do gel ( após todo o líquido de hidratação ter sido
retirado ). A coluna, acoplada a um tubo tipo Eppendorf , foi centrifugada a 730g
por 2 min., sendo a seguir descartada. A amostra coletada no tubo foi seca em
speed vacumm por 15 min.. Após a secagem, a amostra foi ressuspendida em
10 L de tampão formamida EDTA, aquecida a 95C por 2 min. e imediatamente
resfriada em gelo. Foram adicionados 1,5 L de cada amostra em cada orifício
do gel de poliacrilamida 5,5% e a eletroforese foi realizada no equipamento ABI
Prism 377 DNA sequencer. Após a corrida, as seqüências geradas foram
analisadas pelos programas do equipamento. Analisadas as seqüências, foi
comprovado que a seqüência do gene G é presente em pSH-G.
3.8. Construção das sondas G e N marcadas com digoxigenina
Foram utilizados o sistema "DIG DNA Labeling Kit" (BOEHRINGER
MANNHEIM ), para a produção das sondas G e N, através do protocolo abaixo.
O gene N foi obtido amplificando-se por RT-PCR a amostra PV, e o gene G,
amplificando-se o gene G inserto no vetor pSH-G. Foram adicionados 2 L da
amostra do gene G, para a construção da sonda G, e 2L do gene N, para a
construção da sonda N, em 15L de àgua Milli-Q, seguida de fervura a 100°C
durante 10 min., denaturando o DNA. Em seguida, resfriou-se rapidamente em
gelo-seco-álcool, impedido a reorganização do DNA. Descongelou-se o produto
acima e foram adicionados 2L de hexanucleotídeos ( dUTP ), 2L de dNTPDIG e 1L de enzima Klenow. A reação foi realizada a 37°C por 12 horas. Após
este período, o produto da reação foi diluído em 150L de TE, adicionando-se o
diluido em colunas spin, com carga positiva, centrifugando a 2000g.
Ressuspendeu-se o produto ( DNA marcado com digoxigenina ) em 30L de
água Milli-Q.
43
3.9. Hibridação pelo Southern blot e detecção pela
quimioluminescência
A hibridação do DNA marcado sobre fragmentos alvo amplificados,
ocorreu sempre em etapas sob agitação constante e à temperatura ambiente,
iniciando-se com a denaturação dos produtos da reação RT-PCR, na qual o gel
foi mantido em tampão denaturante ( 0,5N NaOH; 1,5 M NaCI ) durante uma
hora, neutralizados em solução ( 0,5 M Tris-H Cl; 1,5 M NaCI; pH 7,5 ) por 30
min. e transferidos durante 60 min. para membrana de nylon com carga positiva
( BOEHRINGER MANNHEIM, Mannheim, W.Germany ), utilizando-se tampão 20
X SSC ( 3 M NaCI; 0,3 M Citrato de Sódio; pH 7,0 ) sobre a cuba a vácuo
Vaccum Blotter ( BIORAD Labs. ), montada segundo instruções do fabricante.
Após dois ciclos de imobilização do produto, com radiação UV em
aparelho Ultraviolet Cross Linker ( AMERSHAM International plc, Littie Chelfont,
Bucks, England, UK ), a membrana foi pré-hibridizada em tampão  5 x SSC;
0,02% (w/v) SDS; 1% ( w/v ) de reagente de bloqueio ( BOEHRINGER
Mannheim ) ] por 2 hs., a 60°C, e hibridizada, utilizando o tampão anterior
acrescido de uma sonda marcada pela digoxigenina, para uma concentração
final de 10 pmol / ml., em Sistema Hybridization Oven/Shaker ( AMERSHAM,
International ), em tubos tipo "roller" durante 9 hs., a 60°C como fator de
estringência. No fim deste período, a membrana foi mantida em solução de
bloqueio [ ( 100 mMTris-HCI; 150 m M NaCI; 2% ( w/v ) de reagente de bloqueio;
pH 7,0 ) ] por 2 hs. e substituída por tampão de lavagem ( 100 m M Tris-HCI;
150 m M NaCI ) durante 2 min.. A seguir, por solução de bloqueio acrescentada
de conjugado anticorpo antidigoxigenina-fosfatase alcalina ( antidigoxigenin-AP
Fab fragments- BOEHRINGER Mannhelm ), para concentração de 250 mU/mL,
por 30 min.; tampão de lavagem, por duas vezes de 15 min.; e em tampão de
equilíbrio
( 100mM Tris-HCI; 100 mM NaCI; 50 mM Mg Cl2; pH 9,5 ) por 5
min.. A detecção prosseguiu adicionando-se 1 mL de LUMI-PHOS 530 (
BOEHRINGER Mannhelm ) sobre a membrana, intercalando-a entre folhas de
acetato, mantendo a 37°C, por 30 min. e exposta a um filme X - OMat AR (
44
EASTMAN KODAK CO., Rochester, N.Y. ) por período variável ( 01 a 04 min. ),
e revelando em câmara escura.
45
4. RESULTADOS
Após a extração do RNA viral, realizou-se RT-PCR com os primers G1 e
G2 e a polimerase Taq; para a amplificação do gene G, da glicoproteína G do
vírus rábico. Usou-se as amostras PV e CVS, e os resultados, como mostra a
figura 3, foram positivos. Continuando com as amplificações genômicas, agora
utilizando as polimerases Taq e DeepVent, amplificou-se por RT-PCR o mesmo
gene G, da amostra PV ( a figura 4 mostra as amplificações positivas ). Após a
obtenção do amplificado do gene G com a polimerase Deep Vent, foi realizada a
eletroeluição do mesmo, retirando a banda espúria, observada nas figuras 3 e 4.
O resultado da eletroeluição pode ser visto na figura 5, onde nota-se a ausência
de banda espúria.
1
2
3
4
5
6
7
1600 bp
Bandas espúrias
400 bp
Figura 3: Gel de agarose com amplificação do gene G, com Taq polimerase.
Canaletas 1 e 2, amostra PV; 3, amostra CVS; 4 e 5, controles da reação ( H 2O ); 6,
linha vazia e; 7, peso molecular 100 bp.
46
1
2
3
4
5
Bandas espurias
400 bp
Figura 4: Gel de agarose 1%, para confirmação de PCR do gene G, da amostra PV,
utilizando as enzimas DeepVent e Taq polimerase. Em 1 e 2, DeepVent positivo e controle
negativo, respectivamente. Em 3 e 4, Taq pol positivo e controle negativo, respectivamente. Peso
molecular: 100 bp.
1
2
1600 bp
Figura 5: Gel de agarose mostrando o gene G, obtido por RT-PCR, utilizando a enzima
DeepVent, após eletroeluição, para retirada de banda espúria ( 400 bp ). Em 1, peso molecular
1 Kb; e em 2, o gene G.
47
Tendo obtido o amplificado do gene G, para o inserto do mesmo no
plasmídeo pSH, foi realizado "feel-in" no inserto G; e "feel-in", linearização e
defosforilação do plasmídeo pSH. Na figura 6, podemos observar a linearização
de pSH. Notar pSH linearizado situando-se abaixo do controle não linearizado.
1
2
3
4
1600 bp
Figura 6: Gel de agarose confirmando linearização de pSH. Em 1, G após
“feel-in”; 2, pSH linearizado com Bam H I; 3, peso molecular 1Kb; 4, pSH não
linearizado como controle.
Após o preparo do vetor pSH e do inserto G, foi realizada a transformação
das células DH5  competentes, por eletroporação, após “mini-prep”. Nas
colônias transformadas foi realizada análise de restrição, com as enzimas Bam
H I e Hind III. A figura 7 mostra o resultado após digestão com Bam H I de
colônias transformadas com pSH-G e, portanto, com o inserto G retirado do
plasmídeo. A figura 8, mostra a análise de restrição com Bam H I e Hind III,
efetuada em uma das colônias obtidas com o inserto G na orientação correta.
48
1
2
3 P
4
5
6
7
Inserto G
Figura 7: Gel de agarose mostrando 7 colonias ( 1 a 7 ) com inserto G, após digestão com
Bam H I. O peso molecular ( P ) 1Kb.
A
B
C
1
2
3
4
Figura 8: Gel de agarose mostrando análise de restrição com Bam H I e Hind III.
Em A2, pSH sem o inserto G; em A3, inserto G retirado de A2.
Em B1, pSH sem o fragmento de 122 bp, retirado por Hind III; em B4, fragmento de
122 bp
( perdido durante a eletroforese ).
Em C peso molecular 1 Kb.
49
Sendo confirmada, por análise de restrição, a obtenção das células
transformadas, o plasmídeo passou a ser chamado pSH-G. Após propagação
das células transformadas, foi realizado "med-prep", obtendo-se quantidade
adequada de pSH-G, posteriormente usado no controle de RT-PCR, como
citado nos objetivos. Em seguida, foi realizado o seqüênciamento do gene G
inserto em pSH-G. O resultado do alinhamento ( anexo 1 ), indica a
concordância entre as seqüências do gene G, da amostra PV, com a seqüência
nucleotídica do gene G clonado, a partir da amostra PV, e inserto em pSH-G.
Somente a primeira metade do gene foi seqüenciada. Na amostra PV, o gene G
tem ínicio na posição 3321 nt, terminando na posição 4893 nt. Foi seqüenciado
714 nt, de um total de 1572nt. O resultado do seqüenciamento tem início na
posição 15 nt e termina na posição 729 do gene G. Comparando as seqüências,
nota-se algumas mutações pontuais ( em 7 posições ), e alguns nucleotídeos
não detectados na reação.
Após o seqüenciamento iniciou-se a produção das sondas N e G, descrita
em Material e Métodos, e após as reações confirmou-se a produção das
mesmas, como pode ser visto nas figuras 9 e 10.
1
2
Figura 9: Imagem obtida por imunoquimioluminescência, comprovando a produção da sonda G.
Observar faixa mais escura na região da seta. Em 1 e 2, mesmas amostras em duplicata.
Figura 10: Imagem obtida por imunoquimioluminescência, comprovando a produção da sonda N.
Observar faixa mais escura.
50
Após a construção das sondas N e G, passou-se à detecção de
amplificados dos genes G e N, por RT-PCR, seguido de hibridização. A figura 11
mostra a sonda G detectando o inserto G, de pSH-G. A figura 12, mostra a
detecção, através da hibridização da sonda G, do gene G, presente na amostra
clínica 3959 M.
Figura 11: Detecção do gene G ( observar a seta ), presente no inserto G em
pSH-G, hibridizada com a sonda DNA G, através de imunoquimioluminescência
Figura 12: Detecção do gene G, na amostra clínica 3959 M, através da
sonda DNA G, por imunoquimioluminecência
Em seguida, passou-se à detecção do gene N, através de RT-PCR e
hibridização com a sonda N. As amostras clínicas 4004 M e 3959 M, foram
detectadas através de RT-PCR e imunoquimioluminescência, como podemos
observar nas figuras 13, 14 e 15.
51
1
2
3
4
Figura 13: Detecção por imunoquimioluminescência, através da hibridização da sonda N, dos genes
N, na amostra PV ( 1 ), e nas amostras clínicas 963 M ( 2 ); 4004 M ( 3 ); e 3959 M ( 4 ).
1
2
3
4
5
6
7
1600 bp
Figura 14: gel de agarose com produtos de RT-PCR. Em 1, peso molecular 100 bp; em 2,
amostra PV ( controle positivo para G ); em 3, amostra 51 M ( controle negativo para G ). Em 4 e
6, amostra 4004 M, teve amplificado os genes N e G ( pouco visível ), respectivamente; e em 5 e
7, amostra 3959 M, amplificou os genes N e G, respectivamente.
1
2
3
4
1600 bp
Figura 15: gel de agarose com produtos RT-PCR. Em 1, amplificação do gene G, por PCR, da
amostra 4004 pouco visível na figura 14. Em 2 peso molecular 100 bp.. Em 3 e 4, amplificação do
gene N, das amostras 878 M e 008 M, respectivamente
52
5. DISCUSSÃO
A produção das sondas genéticas não radioativas apresentadas neste
trabalho partiu do interesse em oferecer um método alternativo para o
diagnóstico do vírus rábico. A premissa assumida foi a produção de um material
de baixo custo, fácil manipulação, alta sensibilidade e específicidade. A
hibridação quando realizada em produtos amplificados por RT-PCR, que possui
grande sensibilidade, aumenta ainda mais a sensibilidade desta técnica e
confere alta específicidade ao diagnóstico ( TORDO, 1996; SACRAMENTO
1991 ).
O vírus rábico, devido a sua letalidade, deve ser detectado com rapidez e
segurança e, para isto diversas técnicas são utilizadas ( BOURHY et al., 1989 ).
A Imunofluorescência Direta é a técnica preconizada pela OMS, devido a sua
rapidez, simplicidade e sensibilidade ( BOURHY et al., 1990 ). Entretanto, esta
técnica apresenta alguns inconvenientes como o custo e necessita de prova
complementar do seu resultado, como a inoculação em camundongos ( WHO
Expert Committee on Rabies, Eighth Report, 1992 ).
As técnicas moleculares para detecção do genoma viral, baseados na
hibridação com sondas genéticas e na reação em cadeia pela polimerase ( RTPCR ), vem contribuindo de maneira irrefutável para o aumento de
específicidade e sensibilidade de detecção do vírus rábico. A técnica de RT-PCR
oferece sensibilidade, tempo reduzido para obtenção de resultados e custo
compatível com outras metodologias ( TORDO et al., 1996 ). A RT-PCR
possibilita também determinar diferenças geográficas entre as amostras virais,
possibilitando estudos de epidemiologia molecular ( BOURHY et al., 1993 ).
Utilizou-se a amostra PV ( Pasteur Virus ) para a produção das sondas
G e N, por ser esta uma amostra vacinal utilizada em todo mundo ( WHO Expert
Committee on Rabies, Eighth Report, 1992 ) e, teoricamente, possui
características genotípicas semelhantes a um grande número de amostras de
vírus circulantes. O gene N do vírus rábico, por ser conservado, é o alvo de
escolha para o diagnóstico de amostras virais circulantes. O gene G, sendo
53
pouco conservado entre as diferentes amostras do vírus rábico, como também o
é entre os Lyssavirus, não possui valor diagnóstico mas, facilita o estudo
epidemiológico do vírus, pois sua variabilidade permite detectar diferenças entre
as amostras circulantes ( BOURHY, 1993; SACRAMENTO, 1991 ). A detecção
de diferenças genotípicas pode promover o controle genético de cepas vacinais
representativas, pois a glicoproteína G do vírus rábico é a única que induz a
formação de anticorpos neutralizantes ( SACRAMENTO et al., 1992 ).
O interesse em se construir o plasmídeo pSH-G partiu da necessidade de
um controle positivo para o RT-PCR do gene G, para análise epidemiológica. A
utilização da polimerase DeepVent, para a clonagem do gene G, deve-se ao fato
desta enzima diminuir a taxa de mutações pontuais que possam vir a ocorrer
durante as amplificações. Esta enzima possui uma região com função de
correção exonucleásica 3´ 5´, não existente na enzima Taq polimerase e,
assim, a possível troca de nucleotídeos durante a incorporação destes durante o
ciclo de extenção na polimerização em cadeia, tem maior probabilidade de
ocorrência.
Apesar da enzima DeepVent oferecer a vantagem da correção
exonucleásica, o seqüenciamento mostrou sete mutações pontuais quando a
seqüência da amostra PV clonada foi comparada com a seqüência do vírus PV
realizada por Tordo et al. ( TORDO et al., 1986 ). Essas mutações
provavelmente são de nossa amostra PV, devido as várias passagens em
células BHK 21. Apesar de não ter sido realizado o seqüenciamento total do
gene G inserto em pSH-G, obtivemos um fragmento com tamanho esperado
após a análise de restrição efetuada.
A capacidade de detecção do vírus rábico em amostras clínicas pode ser
aumentada com o uso de uma segunda amplificação, utilizando a técnica de
“nested PCR” ( KAMOLVARIN et al., 1993 ). Contudo, essa técnica apresenta a
desvantagem de um grande consumo de tempo para ser realizada, além de
aumentar consideravelmente os riscos de obtenção de resultados falsopositivos,
devido
a
contaminação
do
DNA.
O
uso
da
técnica
de
imunoquimioluminescência pelo método de “Southern-blot”, utilizando as sondas
marcadas com digoxigenina, resulta em sensibilidade e específicidade
54
comparaveis ao “nested PCR”, mostrando-se no mínimo 100 vezes mais
sensível do que uma única amplificação por RT-PCR ( DURIGON et al., 1994;
HOLTKE et al.,1992 ). A maior vantagem, contudo, é em relação ao controle de
contaminação no laboratório, pois com a hibridação com a sonda marcada, não
existe a necessidade de se fazer uma segunda amplificação para se obter a
sensibilidade e específicidade desejada.
Uma opção para o uso das
sondas marcadas com digoxigenina, será uma reação de hibridação “in situ”,
diretamente no material clínico ( JACKSON et al., 1989; JACKSON et al., 1991 ),
utilizando as sondas G e N como uma alternativa ao método de RT-PCR. Este
método poderia ser uma alternativa bastante útil ao RT-PCR nos processos de
diagnóstico aonde as provas de PCR possam ser muito onerosas ou os riscos
de contaminação bastante acentuados.
Acreditamos que a produção de sondas genéticas não radioativas para a
detecção dos genes G e N, vem referendar a importância do desenvolvimento
de novos métodos moleculares para o diagnóstico rápido das infecções por vírus
rábico.
55
6. CONCLUSÃO
6.1. As sondas G e N produzidas e marcadas com digoxigenina, ao
serem utilizadas para a detecção de produtos amplificados pela
reação de RT-PCR, mostraram ter sensibilidade e específicidade.
6.2. A utilização das sondas G e N pode ser uma alternativa para o
diagnóstico da raiva.
6.3. A construção do plasmídeo pSH-G foi de grande utilidade,
servindo como controle para as reações de RT-PCR.
56
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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