INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA

INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZÔNIA- INPA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO
Genética, Conservação e Biologia Evolutiva- PPG-GCBEv
Isolamento, caracterização de locos microssatélites e variabilidade genética
em Anopheles albitarsis sensu lato (Diptera: Culicidae), de duas populações
do Amazonas e uma de São Paulo
GISELLE MOURA GUIMARÃES MARQUES
Manaus, Amazonas
julho, 2012
GISELLE MOURA GUIMARÃES MARQUES
Isolamento, caracterização de locos microssatélites e variabilidade genética
em Anopheles albitarsis sensu lato (Diptera: Culicidae), de duas populações
do Amazonas e uma de São Paulo
Orientadora: Dra. MÍRIAM SILVA RAFAEL
Coorientadora: Dra. Jacqueline da Silva Batista
Dissertação apresentada ao Programa
de Pós-Graduação do INPA como
parte dos requisitos para obtenção do
titulo de Mestre em Genética,
Conservação e Biologia Evolutiva.
Manaus, Amazonas
julho, 2012
1
M357
Marques, Giselle Moura Guimarães
Isolamento, caracterização de locos microssatélites e variabilidade
genética em Anopheles albitarsis sensu lato (Diptera: Culicidae), de duas
populações do Amazonas e uma de São Paulo / Giselle Moura Guimarães
Marques .--- Manaus : [s.n.], 2012.
xii, 72 f.. : il. color.
Dissertação (mestrado) --- INPA, Manaus, 2012
Orientador: Míriam Silva Rafael
Coorientador: Jacqueline da Silva Batista
Área de concentração: Genética, Conservação e Biologia Evolutiva.
1. Anopheles albitarsis sensu lato. 2. Marcadores microssatélites.
3. Variabilidade genética. 4. Amplificação heteróloga. 5. Complexo Anopheles
albitarsis. I. Título.
CDD 19. ed. 595.770415
Sinopse
O complexo Anopheles albitasis inclui seis espécies: Anopheles albitarsis s.s.,
Anopheles marajoara, Anopheles deaneorum, Anopheles janconnae, Anopheles
oryzalimnetes e Anopheles albitarsis F. A variabilidade genética deste complexo de
espécies foi estimada por meio de marcadores moleculares microssatélites em duas
localidades do Estado do Amazonas e uma no Estado de São Paulo, confirmando
três populações geneticamente distintas.
Palavras-chave:
1.
Complexo
Anopheles
microssatélites. 3. Estudo populacional.
albitarsis
2.
Marcadores
2
A minha mãe Carla d’ Rose,
ao meu esposo Carlos Eduardo e a minha filha Giulia Marques.
Por serem tudo na minha vida.
Dedico
3
EPÍGRAFE
“A vida é um rio de DNA que corre ao longo do tempo, conectando todos os organismos,
passado, presente e futuro”
(R. Darkins)
“Não existe castigos nem recompensas, tudo o que existe são consequências.”
(Autor desconhecido)
4
AGRADECIMENTOS
Muito eu tenho a agradecer, pois a realização desse sonho só foi possível graças:
A Deus, por ter me dado força, coragem, fé para ir em frente nessa caminhada árdua e
vitoriosa. O meu muito obrigado!!
Ao programa de Pós – Graduação em Genética, Conservação e Biologia Evolutiva – PPGGCBEv / INPA.
À Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado do Amazonas – FAPEAM pelo financiamento
da bolsa de mestrado e ao PROCAD/CAPES pelo financiamento deste trabalho. Obrigada!!
Ao Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA) e ao Laboratório Temático de
Biologia Molecular (LTBM / INPA) por propiciar as condições necessárias de infraestrutura e
logística para a execução desse trabalho. Muito obrigada!!
A minha orientadora Dra. Míriam Silva Rafael pelos ensinamentos, apoio e pela
oportunidade de continuar depois de graduada, com os trabalhos no laboratório. Por
acreditar em mim e no meu potencial. Obrigada por todo carinho e incentivo!!!
A minha coorientadora Dra. Jacqueline da Silva Batista, que me acompanha desde o PIBIC
e que me deu oportunidade de entrar para um grupo de pesquisas que muito contribuiu para
o meu amadurecimento profissional. Obrigada por toda dedicação dada a mim e a este
trabalho. Obrigada por toda consideração e respeito!
A minha especial colaboradora, a Msc. Kyara Formiga pela amizade, carinho, conselhos,
puxões de orelha e incentivo. Valeu Kyara!!!
Às secretárias Elci e Alessandra do PPG_GCBEv / INPA. Obrigada por tudo.
Aos membros da banca de qualificação do plano de mestrado (Dra. Doriane Rodrigues, Dra.
Joselita Santos e Dra. Gislene Carvalho-Zilse), e da banca de defesa da dissertação (Dra.
Adna Sousa, Dra. Joselita Santos e Dra Daniele Matoso), obrigada pelas contribuições.
A minha turma de mestrado: Daniel Barros Fagundes, Eliane Cardoso Carvalho, Fábio de
Lima Muniz, Francis Paola Castro Paz, Gisele Torres Clímaco, Helber Abellini Astolpho,
Olavo Pinhatti Colatreli, Pedro Rauel Cândido Domingos, Renato de Souza Pinto
Lemgruber, Suélen Dias da Silva, Thatianna de Lira. Valeu galera!!!
Aos amigos do Laboratório de Malária e Dengue/INPA: Gilson (meu irmão Gilbelândio),
Mellina, Ketlen (Ketelene boyzinha), Letícia, Graciela, Paulinha (minhas irmãs do coração, o
que seria de mim sem vocês?), Pedro (Boyzinho, meu 4˚ irmão (pois o Gilson é o 3˚).
Famoso pelo seu café cheiroso e saboroso e dono do fã clube que eu faço parte “minha vida
5
mudou com a chegada do Pedim”), Hugo, Sabrina, Wancleia, Juraci, Adelina, Carlos Praia.
Obrigada por todo carinho, por todas as risadas, por todas as festinhas, almoços, lanches,
cafezinhos (Cafécomciência) e por terem me emprestado os ouvidos e os ombros nos
momentos de desabafo.
Aos meus amigos PIRADOS e simpatizantes: Iamili (negróide), Rosa Jaqueline (Rosinha),
Adriel, Karem, Keroleny, Henrique, Larissa (Maria Rita), Jane (Botinha), Luciana (noiva),
Paulinha (Paulete), Paola (Paola Bracho), Saulo (Considerado!!!), Izaura (ser humano que
aprendi a admirar, quando crescer gostaria de ser como você!), Vanessa (Bin Laden) e
Carolina Maia (Carolzinha), Fabíola Rodrigues (FCR). Obrigada por todo carinho, pelas
trocas de informações, por todas as alegrias, tristezas, preocupações compartilhadas, enfim,
por todas as horas de convívio com todos vocês. Obrigada Deus, por ter tido a oportunidade
de conhecer essas pessoas lindas!!! Aprendi e cresci muito com vocês.
Aos meus amigos: Maria de Fátima Pinto, Leandra Terencio (Leandra Cullen), Carlos
Henrique Schneider e Cláudia Gross, que desde o PIBIC já me incentivavam ao mestrado. A
todos aqueles que passaram pelo LTBM que eu tive a oportunidade de conviver um
pouquinho. Muuuuito obrigada!!!!
A minha família: Mãe (Carla d’ Rose, você é minha maior inspiração), Pai (José Carlos), meu
Irmão (Alessandro), minha sobrinha (Lorena), minha prima (Danielle Fernandes), minha
sogrinha e sogrinho (Euza e Vinícius), a minha irmã e meu filhote do coração (Fabiana e
Henrique Saunier), a minha querida sobrinha Adriane Marques, a minha amada
prima/irmã/filha Ingrid, aos meus tios Aldenor e Suely. A minha amiga e “cumadi” Ana
Patrícia. A minha amiga Kelly Menezes. Desculpem minha ausência. Vocês também são
responsáveis por essa conquista! Muito obrigada por cada palavra de incentivo, carinho...
Enfim, por vocês existirem. Eu não teria conseguido sem o apoio de vocês.
Ao meu esposo maravilhoso Carlos Eduardo, por todo respeito, incentivo, companheirismo,
cumplicidade, fazendo-se sempre presente, carinhoso e paciente. Motivo de muito orgulho,
sempre. Te amo!!!
A minha filha Giulia. Foi por ela, para Ela, e pensando nela, que eu segui em frente! Filha,
espero que a minha ausência em algum momento, não tenha gerado nenhum trauma a
você. Eu procurei dar o melhor de mim! Obrigada por todo carinho, por todo abraço
apertado, por todo sorriso e por todas as vezes que sem eu esperar e pedir você falou:
“Mamãe, eu te amo, sua linda!!! Eu também amo você filha!!! Infinitamente!!!
6
As minhas babás: Néia e Lucimar por cuidarem tão bem da minha filha nos momentos em
que eu precisei me ausentar. A minha amiga e pediatra da Giulia: Dra. Dorothéa Aragão.
Sou eternamente grata a vocês.
A todas as pessoas que cruzaram em meu caminho nessa vida, em algum
momento da minha caminhada acadêmica, mesmo que por alguns segundos, pois de
alguma forma me auxiliaram a seguir em frente. A todos os meus amigos e a minha família...
Os meus sinceros agradecimentos!! \o/\o/
7
RESUMO
O complexo Anopheles albitasis inclui seis espécies: Anopheles albitarsis sensu
stricto, Anopheles marajoara, Anopheles deaneorum, Anopheles janconnae, Anopheles
oryzalimnetes e Anopheles albitarsis F. As espécies do complexo A. albitarsis transmissoras
da malária no Brasil são: A. marajoara nos Estados de São Paulo, Pará e Amapá; A.
janconnae no Estado de Roraima e A. deaneorum no Estado de Rondônia. Marcadores
microssatélites têm sido úteis em estudos populacionais de diversos mosquitos de
importância epidemiológica. Isolar, caracterizar locos microssatélites para analisar a
estrutura genética de A. albitarsis s.l. de duas populações do Estado do Amazonas e uma
do Estado de São Paulo foram os objetivos deste estudo. Foram desenhados 34 pares de
primers, os quais foram caracterizados em 24 a 36 indivíduos coletados no bairro
Puraquequara, Manaus (AM). O número de alelos variou de 2 a 10 com média de 1,98 e
com o total de 126 alelos. A heterozigosidade observada (HO) variou de 0,181 a 0,896 e a
Heterozigosidade esperada (HE) de 0,255 a 0,854. Onze locos mostraram desvio
significativo, para o Equilíbrio de Hardy-Weinberg, e não foi encontrado desequilíbrio de
ligação entre os locos. Dentre os 25 locos microssatélites testados, 11 amplificaram com
sucesso em outras cinco espécies do subgênero Nyssorhynchus: Anopheles triannulatus,
Anopheles braziliensis, Anopheles nuneztovari, Anopheles darlingi e Anopheles oswaldoi.
Para estimar a variabilidade e diferenciação genética entre as três populações de A.
albitarsis s.l. de Puraquequara, Coari (AM), e Ilha Comprida (SP), selecionaram-se 12 locos
polimórficos, e foram obtidos 156 alelos com média de 4,33 alelos, por loco. O número de
alelos por loco variou entre dois a nove, com tamanho de 119 a 337 pb. A média da
heterozigosidade observada (HO) e a heterozigosidade esperada (HE) foi de 0,532 a 0,586,
respectivamente, mostrando variabilidade nessas populações. As estatísticas F de Wright
revelaram uma estruturação genética moderada entre as três populações (FST = 0,143) com
diferenciação genética intermediária entre Puraquequara e Coari, e uma alta diferenciação
genética entre estas duas últimas localidades e Ilha Comprida (FST = 0,191 e 0,189). A
distância genética entre as três populações variou de 0,102 a 0,191, indicando que as do
Amazonas (Puraquequara e Coari) são mais próximas entre si do que estas com a de São
Paulo (Ilha Comprida). A análise Bayesiana por meio do programa STRUCTURE, mostrou
três clusters (K = 3), indicando três populações distintas. Estes dados auxiliarão no estudo
da estruturação genética, evolução, e juntamente com outros marcadores genéticos, para a
compreensão do status taxonômico do complexo A. albitarsis s.l., envolvido na transmissão
primária de espécies do gênero Plasmodium da malária no Brasil.
8
ABSTRACT
The Anopheles albitasis complex includes six species: Anopheles albitarsis sensu
stricto, Anopheles marajoara, Anopheles deaneorum, Anopheles janconnae, Anopheles
albitarsis and Anopheles oryzalimnetes F. The Anopheles albitarsis complex vectors of
malaria in Brazil are named A. marajoara, in São Paulo, Pará and Amapá States, A.
janconnae in the State of Roraima and A. deaneorum in Rondonia State. Microsatellite DNA
markers have been useful in population studies of various mosquitoes of epidemiological
importance. Isolate, characterize microsatellite loci to analyze the genetic structure of A.
albitarsis s.l. of two populations from Amazonas State and one from São Paulo State were
goals of this study. We designed 34 primer pairs, which were characterized in 24 to 36
individuals in the neighborhood Puraquequara, Manaus (AM). The number of alleles ranged
between 2-10 with an average of 1.98 and a total of 126 alleles. The observed
heterozygosity (HO) ranged from 0.181 to 0.896, and the expected heterozygosity (HE) varied
among 0.255 to 0.854. Eleven loci showed significant deviation for the Hardy-Weinberg
equilibrium, and was not found linkage disequilibrium between loci. Among the 25
microsatellite loci tested, 11 amplified successfully in five other species of the subgenus
Nyssorhynchus: Anopheles triannulatus, Anopheles braziliensis, Anopheles nuneztovari,
Anopheles darlingi and Anopheles oswaldoi. To estimate the variability and genetic
differentiation among three populations of A. albitarsis s.l. from Puraquequara, Coari (AM)
and Ilha Comprida (SP), we selected 12 loci and 156 alleles were obtained with an average
of 4.33 alleles per locus. The number of alleles per locus ranged from two to nine, with size
from 119 to 337 bp. The average observed heterozygosity (Ho) and expected heterozygosity
(HE) was from 0.532 to 0.586 respectively, showing variability in these populations. The
Wright's F statistics showed a moderate genetic structuring among the three populations (FST
= 0.143) with intermediate genetic differentiation between Puraquequara and Coari localities,
and a high genetic differentiation between these last two localities and Ilha Comprida (FST =
0.191 and 0.189). The genetic distance among the three populations ranged from 0.102 to
0.191, indicating that those in the Amazon (Puraquequara and Coari localities) are closer
together than those of São Paulo (Ilha Comprida locality). The Bayesian analysis, using the
program STRUCTURE, showed three clusters (K = 3), indicating three distinct populations.
These data will be useful in the genetic structure and evolution studies, and together with
other genetic markers, for understanding the taxonomic status of the A. albitarsis complex,
involved in the primary transmission of Plasmodium genus species of malaria in Brazil.
9
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ................................................................................................................ 12
1.1. Considerações gerais sobre o Complexo Anopheles albitarsis sensu lato................. 12
1.2. Situação da malária no Brasil e no Mundo ................................................................ 14
1.3. Marcadores moleculares microssatélites ................................................................... 17
1.4. Isolamento, caracterização e amplificação heteróloga de locos microssatélites ........ 19
2. OBJETIVOS .................................................................................................................... 22
2.1. Geral ......................................................................................................................... 22
2.2. Objetivos Específicos ................................................................................................ 22
CAPÍTULO I: Isolamento e caracterização de 25 locos polimórficos de DNA
microssatélites para o vetor da malária Anopheles (Nyssorhynchus) albitarsis sensu
lato e amplificação inter-específica em 5 espécies congenéricas ................................. 23
CAPÍTULO II: Estimativa da variabilidade genética em três populações de Anopheles
albitarsis sensu lato (Diptera: Culicidae), utilizando marcadores microssatélites. ...... 32
1. INTRODUÇÃO ................................................................................................................ 33
1.1. Variabilidade genética ............................................................................................... 33
2.MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................................. 36
2.1. Amostragem de Anopheles albitarsis s.l. ................................................................... 36
2.2. Extração e quantificação de DNA .............................................................................. 37
2.3. Amplificação e genotipagem de Anopheles albitarsis s.l. ........................................... 37
2.4. Estimativa do tamanho dos alelos e montagem do banco de dados de genotipagem
.................. ....................................................................................................................... 39
2.5. Análises estatísticas e estrutura populacional ........................................................... 40
3. RESULTADOS ................................................................................................................ 42
3.1. Análise da variabilidade genética .............................................................................. 42
3.2. Estimativas da estrutura genética populacional ......................................................... 46
4. DISCUSSÃO ................................................................................................................... 49
5. CONCLUSÃO GERAL .................................................................................................... 55
REFERÊNCIA BIBLIOGRÁFICA ........................................................................................ 57
APÊNDICE A .........................................................................................................................69
10
LISTA DE TABELAS
Capítulo I
Tabela 01. Locos microssatélites desenvolvidos para espécies do gênero Anopheles ...... 19
Tabela 02. Caracterização de 25 locos microssatélites polimórficos para Anopheles
albitarsis s.l no bairro de Puraquequara, Manaus (Amazonas, Brasil). ................................ 29
Tabela 03. Amplificação heteróloga de 25 locos microssatélite em cinco espécies do gênero
Anopheles (N = 4, por espécie) ............................................................................................ 31
Capítulo II
Tabela 01. Locos microssatélites utilizados para estimar a diversidade genética de
Anopheles albitarsis s.l., obtidas de três localidades, sendo duas no Amazonas (bairro de
Puraquequara, Manaus e Coari (AM) e uma de Ilha Comprida (São Paulo). ...................... 38
Tabela 02. Sistema multiplex de genotipagem de 12 locos microssatélites para os indivíduos
de Anopheles albitarsis de Coari-AM e Ilha Comprida - SP. ................................................ 39
Tabela 03. Variabilidade genética em três populações de Anopheles albitarsis s.l.,
mostrando o Conteúdo de Polimorfismo (PIC) e o índice de endogamia (FIS), para cada um
dos 12 locos microssatélites. ................................................................................................ 43
Tabela 04. Índice genético de três populações de Anopheles albitarsis s.l., utilizando 12
locos microssatélites. ............................................................................................................ 44
Tabela 05. Frequência de Alelos exclusivos encontrados nos 12 locos microssatélites das
três populações de Anopheles albitarsis s.l. Entre parênteses as frequências dos alelos.... 45
Tabela 06. Fluxo gênico com Nm= Número de migrantes (valores acima da linha diagonal) e
FST par-a-par (valores abaixo da linha diagonal), estimado entre as três populações de
Anopheles albitarsis s.l. com 12 locos microssatélites. ........................................................ 46
Tabela 07. Matriz de distância (valores abaixo da diagonal) e de identidade (valores acima
da diagonal) genética de Nei, calculadas para as três populações de Anopheles albitarsis
s.l., utilizando 12 locos microssatélites. ............................................................................... 46
11
LISTA DE FIGURAS
Capítulo I
Figura 01. Distribuição geográfica do complexo Anopheles albitarsis destacados com círculo
escuro. ................................................................................................................................. 14
Figura 02. Classificação das áreas de risco para malária na região amazônica, segundo a
incidência parasitária anual (IPA). Brasil, 2008. Fonte: Ministério da Saúde, 2009. ............ 16
Capítulo II
Figura 01. Mapa do Brasil indicando os locais de coletas de Anopheles albitarsis s.l. 1 Bairro de Puraquequara, Município de Manaus, Amazonas; 2 - Município de Coari, Estado
do Amazonas. 3 – Município de Ilha Comprida, Estado de São Paulo. .............................. 36
Figura 02. Dendrograma agrupando as três populações de Anopheles albitarsis s.l. com
base na similaridade genética, obtida com os 12 locos microssatélites. Método não
ponderado de agrupamento de pares de populações, segundo o método de média aritmética
– UPGMA (Nei, 1978). .......................................................................................................... 47
Figura 03. Gráfico de autocorrelação de distância geográfica (km) e distância genética para
as três populações de Anopheles albitarsis s.l. gerado a partir dos 12 locos
microssatélites....................................................................................................................... 47
Figura 04. Valor de Delta K = 3 clusters, obtido a partir de análise Bayesiana implementada
no programa STRUCTURE, utilizando 12 locos microssatélites de indivíduos de Anopheles
albitarsis s.l. amostrados em três localidades (k = número de agrupamentos possíveis)..... 48
Figura 05. Braplot gerado pelo programa STRUCTURE 2.3.2, indicando três populações de
Anopheles albitarsis s.l. de acordo com a análise de 12 locos microssatélites. Cada cor
corresponde a um agrupamento (Verde (fundo): Coari - AM; Vermelho (fundo):
Puraquequara - AM e Azul (fundo): Ilha Comprida - SP), e cada indivíduo é representado por
uma barra vertical. Os números no eixo dos X correspondem a uma localidade específica: 1Coari, 2-Puraquequara, 3- Ilha Comprida. O eixo Y representa a probabilidade de atribuição
de um indivíduo para cada grupo........................................................................................... 48
12
1. INTRODUÇÃO
1.1. Considerações gerais sobre o Complexo Anopheles albitarsis sensu
lato
Em 1878, Lynch-Arribálzaga descreveu Anopheles albitarsis, a partir de machos e
fêmeas coletadas em Baradero, província de Buenos Aires, Argentina, por meio de
características nos tarsos posteriores (de cor branca desde o terço apical do 2˚ artículo) e
comportamento zoófilo. Por essas características confundiam-na com Anopheles argyritarsis
e com Anopheles braziliensis. Anopheles braziliensis mais tarde, foi identificado
erroneamente como sendo A. albitarsis. Em algumas localidades do Brasil A. albitarsis é
incriminada como vetora da malária e em outras, como vetora sem importância
epidemiológica (Rosa-Freitas, 1988). Em 1942, Galvão e Damasceno descreveram
Anopheles marajoara a partir de amostras coletadas na Ilha de Marajó, Estado do Pará e a
relacionaram ao A. albitarsis.
Anopheles albitarsis não tem apenas hábito doméstico. Em São Paulo, Anopheles
albitarsis albitarsis, por exemplo, habita áreas silvestres próximas à cidade, e apresenta
características morfológicas e biológicas diferentes em relação às amostras da Argentina
(Arribálzaga, 1891; Alvarado, 1942). Essas diferenças podem indicar que exemplares da Ilha
de Marajó, Estado do Pará, podem ser a sub-espécie Anopheles albitarsis domesticus, que
apresenta comportamento endófilo, com 36 a 50% de cor negra no 2º tarso posterior
(Galvão e Damasceno, 1944).
Estudo morfológico, isoenzimático e comportamental em 10 localidades sendo nove
no Brasil e uma na Argentina, caracterizaram duas subespécies pertencentes ao complexo
albitarsis: espécie A, com diferenças morfológicas exclusivas e comportamento endófilo;
espécie B, com distribuição litorânea não sendo considerada antropofílica e endofílica; por
causa dessas características foi considerada um complexo de espécies (Rosa-Freitas,
1988).
Análises
isoenzimática
e
comportamental
demonstraram
que
Anopheles
(Nyssorhynchus) deaneorum é uma nova espécie do complexo albitarsis a partir de
exemplares coletados em Guajará-Mirim (Rondônia) e Rio Branco (Acre) (Rosa-Freitas,
1989). Em estudo com Polimorfismo de DNA amplificado ao acaso - Reação em Cadeia da
Polimerase (RAPD-PCR), quatro espécies foram relatadas hipoteticamente, no grupo
Anopheles albitarsis: espécie A = A. (Nys.) albitarsis; espécie B = não descrita; espécie C =
A. (Nys.) marajoara Galvão – Damasceno; espécie D = A. (Nys.) deaneorum Rosa-Freitas
13
(Wilkerson et al., 1995a). Em estudo filogenético dentro do complexo A. albitarsis, Merritt et
al. (2005) compararam o gene White com as análises de RAPD, e confirmaram que se
tratava de quatro espécies distintas no complexo A. albitarsis.
Estudos com RAPD e do gene citocromo oxidase I (COI), mostraram quatro
membros do complexo A. albitarsis (A. albitarsis, A. albitarsis B, A. deaneorum e A.
marajoara) coletadas no Brasil, Argentina e Venezuela. O padrão filogenético e a distância
genética dentro dessas espécies sugerem a existência de uma espécie previamente não
identificada – Anopheles albitarsis E (Lehr et al., 2005). Posteriormente, esse achado
corroborou os registros de Wilkerson et al. (2005), que utilizaram dois genes mitocondriais
(COI e ND4) e dois fragmentos do DNA ribossomal (ITS2 e D2 expansão da subunidade
28S) nas quatro espécies desse complexo. Estes resultados apontam a existência de uma
quinta espécie, cujo achado não foi confirmado por Li e Wilkerson (2007). Porém, a análise
dos genes ITS2 e white com todas as espécies do complexo albitarsis mostrou uma nova
espécie denominada Anopheles albitarsis F, a qual não apresenta o quarto íntron (Brochero
et al., 2007).
A espécie B foi nomeada como: Anopheles oryzalimnetes Wilkerson & Motoki e a
espécie E: Anopheles janconnae Wilkerson & Sallum (Motoki et al., 2009). O estudo conclui
que o grupo albitarsis, é constituído por seis espécies crípticas: A. albitarsis LynchArribálzaga, A. deaneorum Rosa-Freitas, A. marajoara Galvão e Damasceno e A. albitarsis F
Brochero (ainda não descrita). O status taxonômico do complexo albitarsis parece não estar
resolvido. Um recente estudo mostrou que A. deaneorum pode ser um complexo de
espécies (Bourke et al., 2010).
A distribuição geográfica de A. albitarsis nas Américas (Figura 01) compreende a
região nordeste da Argentina, Uruguai, Paraguai, Brasil, a Venezuela e as Guianas
ocorrendo também na Colômbia, Panamá, Costa Rica, Honduras, Guatemala e Trinidad
(Consoli e Lorenço de Oliveira, 1994). É comumente encontrado picando durante todo o
ano, mas é bem mais abundante na estação chuvosa, quando são ampliados os seus
criadouros. Em algumas áreas do Brasil, A. albitarsis pode entrar nas casas e se alimentar
de sangue humano. Contudo, na maior parte de seu território, incluindo o Nordeste seco e o
sertão das regiões Sudeste e Centro-Oeste, é zoofílico e exofílico. Prefere muito mais atacar
animais, como equídeos, do que o homem e aves (Deane et al., 1948).
14
Figura 01. Distribuição geográfica do complexo Anopheles albitarsis destacados com círculo escuro.
1.2. Situação da malária no Brasil e no Mundo
A Malária é uma doença infecciosa febril aguda, parasitária sistêmica, não
contagiosa, cujos agentes etiológicos são protozoários transmitidos por mosquitos vetores
em diversos países dos trópicos. No Brasil, especialmente na Amazônia, é de grande
importância epidemiológica, pela sua elevada incidência e potencial gravidade clínica. Pode
causar consideráveis perdas sociais e econômicas na população sob-risco, principalmente,
aquela que vive em condições precárias de habitação e saneamento (Ministério da Saúde,
2005; 2010). Popularmente, os vetores da malária são conhecidos por “carapanã”,
“muriçoca”, “sovela”, “mosquito-prego” e “bicuda” (Ministério da Saúde, 2005).
Seus transmissores são mosquitos do gênero Anopheles, sendo o Anopheles
(Nyssorhynchus) darlingi Root,1926 a principal espécie vetora no Brasil (Tadei et al. 1998).
Na região amazônica, ocorre cerca de 99% dos casos da doença (Deane et al., 1948; Tadei
15
et al., 1998). Esta espécie destaca-se na transmissão da malária, pela sua ampla
distribuição geográfica, antropofilia e capacidade de ser infectada por diferentes espécies de
plasmódios (Ministério da Saúde, 2005). As espécies transmissoras da malária são
encontradas em áreas de baixas altitudes, sempre associadas aos grandes rios e florestas,
podendo ocorrer também no litoral (Consoli e Lourenço de Oliveira, 1994)
Os mosquitos da malária pertencem à ordem Diptera, família Culicidae, gênero
Anopheles. Este gênero compreende mais de 400 espécies. No Brasil são encontradas 60
espécies, e as envolvidas na transmissão de malária pertencem aos subgêneros
Nyssorhynchus e Kerteszia (Deane, 1986; Consoli e Lourenço de Oliveira, 1994). Cinco
espécies são consideradas como vetores principais: A. (N.) darlingi, Anopheles (N.)
aquasalis, A. (N.) albitarsis, Anopheles (Kerteszia) cruzii e Anopheles (K.) bellator, além de
outras de menor importância (Ministério da Saúde, 2006). A. (K) cruzi e A. (K) bellator são as
principais vetoras da malária, uma vez endêmica no sudeste/ sul do Brasil. Anopheles cruzii
está envolvida na manutenção da malária oligossintomática, ocorrendo nos vales do litoral
da Mata Atlântica, nos Estados do Rio de Janeiro e São Paulo (Rosa-Freitas et al., 1998).
São incriminadas como vetoras da malária no Brasil: A. marajoara, nos Estados de
São Paulo, Pará e Amapá (Conn et al., 2002; Li, 2005; Mckeon et al., 2010), A. deaneorum
em Rondônia (Klein et al., 1991) e Anopheles janconnae, vetora local no Estado de Roraima
(Póvoa, 2006). Diferenças bioquímicas e/ou moleculares, hábitos alimentares, antropofilia e
zoofilia refletem a heterogeneidade na capacidade vetorial do grupo A. albitarsis (Consoli e
Lorenço de Oliveira, 1994).
Os parasitos da malária são da família plasmodidae, gênero Plasmodium. Os
plasmódios se caracterizam por apresentarem dois tipos de multiplicação: uma assexuada
denominada esquizogonia, que ocorre no hospedeiro vertebrado (aves, répteis e
mamíferos), e a outra sexuada chamada de esporogonia, que se passa no hospedeiro
invertebrado (mosquitos do gênero Anopheles). São quatro as espécies conhecidas de
plasmódios que infectam o ser humano (Forrattini, 2002; Ministério da Saúde, 2006):
Plasmodium malariae (Descoberto por Laveran 1881, Grassi e Faletti 1890), agente
da febre quartã, muito encontrada no continente africano;
Plasmodium vivax (Descoberto por Grassi e Faletti 1890), responsável pela terçã
benigna;
Plasmodium falciparum (Descoberto por Welch 1897), responsável pela terçã
maligna;
Plasmodium ovale (Descoberto por Stephens 1922), causadora de uma forma de
terçã benigna, que não ocorre nas Américas. Tem sido assinalada principalmente na parte
16
leste da África e, de maneira ocasional, em áreas da região oriental (Forrattini, 2002;
Ministério da Saúde, 2006).
Estima-se que 3,3 bilhões de pessoas correram risco de contrair malária em 2010. As
populações que vivem na África Subsaariana têm o maior risco de adquirir malária. Em 2010
81% dos casos e 91% das mortes foram estimadas pela OMS como tendo ocorrido na
região africana, sendo as mais afetadas crianças menores de cinco anos de idade e
mulheres grávidas (HWO, 2011). Na região das Américas, o Brasil é o país que mais registra
casos de malária, cerca de 50% das ocorrências (Ministério da Saúde, 2005).
O quadro epidemiológico da malária no Brasil é preocupante. A malária humana na
região amazônica brasileira abrange mais de 97% de todos os casos registrados no país
(Tadei et al., 1998). Segundo relatório SIVEP-Malária (2012) até o mês de dezembro do ano
de 2011, foram registrados 575.912 casos de malária na Amazônia Legal (Figura 02).
Destes, 60.119 (20%) casos no Estado do Amazonas, e o maior índice registrado foi no
Estado do Pará, 130.984 casos (45%) (SIVEP-Malária, 2012).
A transmissão da malária na Amazônia Legal está relacionada a fatores biológicos
(presença de alta densidade de mosquitos vetores, agente etiológico e população
suscetível); geográficos (altos índices de pluviosidade, amplitude da malha hídrica e a
cobertura vegetal); ecológicos (desmatamentos, construção de hidroelétricas, estradas e de
sistemas de irrigação, açudes); e sociais (presença de numerosos grupos populacionais,
morando em habitações com ausência completa ou parcial de paredes laterais e
trabalhando próximo ou dentro das matas) (Ministério da Saúde, 2010).
Figura 02. Classificação das áreas de risco para malária na região amazônica, segundo a
incidência parasitária anual (IPA). Brasil, 2008. Fonte: Ministério da Saúde, 2009.
17
Outros anofelinos do subgênero Nyssorhynchus são considerados capazes de
transmitir malária humana na natureza, mas geralmente são chamados de vetores
secundários, especialmente quando coexistem com o A. darlingi. São anofelinos
principalmente exófilos, zoofílicos e crepusculares, mas que na ausência dos seus
hospedeiros preferenciais ou nas épocas de elevada densidade, podem se alimentar no
homem com dada frequência. Neste caso, tais anofelinos podem, eventualmente, se infectar
ao sugar portadores de gametócitos de plasmódios em áreas, cuja endemicidade tenha sido
desencadeada e mantida por A. darlingi (Consoli e Lorenço de Oliveira, 1994).
Dados morfológicos, isoenzimáticos, e de DNA (Motoki, 2009), confirmaram que A.
albitarsis é um complexo de espécie, das quais três transmitem a malária. Assim,
determinações precisas são necessárias para avaliar melhor o status taxonômico de cada
vetor, pois a distinção problemática entre as espécies desse complexo faz o estudo da
transmissão da malária e da ecologia de A. albitarsis s.l. um trabalho intenso (Motoki, 2009).
Além desses, outros estudos sobre citogenética e evolução (Rafael et al., 2005 e
2006), genética de populações (Brochero et al., 2010) e outros marcadores têm auxiliado na
compreensão de diversos aspectos envolvendo a biologia, a evolução e o estudo
populacional do complexo A. albitarsis.
Os dados da literatura possibilitam verificar que, ainda é necessário conhecer com
maior profundidade a biologia e o comportamento hematofágico de vários anofelinos
transmissores da malária no Brasil, cujos parâmetros são relevantes no controle da malária
(Tadei, 1998).
1.3. Marcadores moleculares microssatélites
Sequências Simples Repetidas (SSR) ou Marcadores Moleculares Microssatélites,
também chamadas Variable Number of Tandem Repeats (VNTR), Sequence Tagged
Microsatellites (STMS) ou Single Sequence Length Polymorphisms (SSLP) são pequenas
sequências com um a seis nucleotídeos repetidas em tandem, distribuídas no genoma
nuclear dos organismos eucariotos. São caracterizados como um eficiente marcador
molecular para estudar os padrões de fluxo gênico e estimar a diferenciação genética intra e
interespecífica. Os microssatélites são os marcadores moleculares mais polimórficos
conhecidos atualmente. Estes apresentam expressão codominante, taxa de mutação
elevada e são seletivamente neutros (Estoup et al., 1995; Lanzaro et al., 1995).
Os microssatéites são classificados de duas formas de acordo com a natureza das
repetições
em:
perfeitos,
não
apresentando
nenhuma
interrupção
na
sequência
18
(TATATATATATATA); imperfeitos, quando um ou mais nucleotídeos diferentes está
presente no meio da sequência (TATATACTATATA); interrompidos, quando uma pequena
sequência aparece no meio da sequência repetitiva (TATATACGTGTATATA), e compostos
quando apresentam duas sequências diferentes (TATATAGTGTGT) (Weber, 1990; Goldsten
e Schlotterer, 1999).
O motivo de repetição pode ser classificado em: mononucleotídeos, um tipo de
nucleotídeo na sequência (AAAAAAAAA); dinucleotídeos, dois tipos de nucleotídeos
(ATATATATATAT); trinucleotídeos, com três nucleotídeos (ATCATCATCATC) e, os
tetranucleotídeos, com quatro tipos de nucleotídeos diferentes na sequência dos
microssatélites (ATCGATCGATCG) (Hamada et al., 1984).
Os microssatélites são multi-alélicos, codominantes e evoluem de processos
mutacionais decorrentes dos escorregões da DNA polimerase ou do crossing over desigual.
Embora, possuam altas taxas evolutivas, eles são conservativos em regiões flanqueadoras
e podem passar por longo período sem modificações (Zardoya et al., 1996). As sequências
flanqueadoras de DNA com microssatélites são conservadas entre os indivíduos de uma
mesma espécie. Essa característica facilita a seleção de primers específicos que amplificam,
via PCR, fragmentos contendo o DNA repetitivo. Os produtos amplificados podem ser
visualizados em gel de agarose e genotipados em poliacrilamida, ou em um sequenciador
automático com auxílio de primers fluorescentes visualizados em analisador de DNA (Borém
e Caixeta, 2006). Os microssatélites são marcadores eficientes em análises moleculares
que podem ser verificadas a partir da técnica de PCR (Mullins, 1990).
Os marcadores microssatélites têm sido utilizados para avaliar a estrutura genética
de populações de vetores da malária, como: Anopheles gambiae (Rongnoparut et al., 1996),
Anopheles arabiensis (Lehmann et al., 1997), Anopheles maculatus (Kamau et al., 1999) de
regiões africanas, A. darlingi (Conn et al., 2001; Scarpassa e Conn, 2007, Lima, 2010a), A.
marajoara (Verardi et al., 2002) e Anopheles stephensi (Li et al., 2005) do Brasil. Estudos
populacionais são necessários para o esclarecimento do status taxonômico de espécies de
mosquitos (Lanzaro et al., 1995; Rongnoparut et al., 1996; Lehmann et al., 1997; Kamau et
al., 1999) além de possibilitarem a identificação de membros de complexos de espécies, que
ocorrem com frequência nesses culicídeos (Munstermann e Conn, 1997).
19
1.4. Isolamento, caracterização e amplificação heteróloga de locos
microssatélites
Desenvolver marcadores microssatélites é uma etapa indispensável para a
caracterização do loco. Estes marcadores são eficientes para avaliar a variabilidade genética
entre as populações, estimar fluxo gênico e verificar estrutura genética entre populações de
diversos organismos. E como característica desse marcador, sua transferibilidade ou
amplificação heteróloga, permite a aplicação de microssatélites desenvolvidos de uma espécie
em outra espécie próxima e geneticamente relacionada (Ferreira e Grattapaglia, 1998; Falcão
et al., 2004; Gouveia et al., 2008).
Marcadores microssatélites foram desenvolvidos para diferentes organismos incluindo
insetos, tais como: Melipona mondury (Lopes et al., 2008), Melipona seminigra merrillae
(Francini et al., 2009) e Drosophila montana (Orsini e Schlotterer, 2004). Dentre os
anofelinos, também já foram isolados locos microssatélites para 16 espécies (Tabela 1).
Tabela 01. Locos microssatélites desenvolvidos para espécies do gênero Anopheles.
o
o
N de
Locos
N de
Alelos
HO
Anopheles gambiae
11
3 - 13
0,73
Anopheles maculatus
4
8 - 12
0,25 - 0,54
A. gambiae
24
7 -14
-
Anopheles funestus
9
5 - 11
0,62 - 0,84
Sharakhov et al. (2001)
Anopheles darlingi
8
7 - 44
0,36 - 0,76
Conn et al. (2001)
A. funestus
18
5 - 15
0,13 - 0,85
Cohuet et al. (2002)
Anopheles stephensis
16
3 - 13
0,50 - 0,95
Verardi et al. (2002)
Espécies
Referência
Lanzaro et al. (1995)
Rongnoparut et al. (1996)
Wang et al. (1999)
Anopheles flavirostris
11
2 - 16
0,14 - 0,77
Torres et al. (2002)
Anopheles maculipennis
15
2-8
0,37 - 0,77
Weill et al. (2003)
Anopheles moucheti
17
4 - 16
0,43 - 0,87
Annan, 2003
Anopheles nili
11
9 - 28
0,58 - 0,96
Berthomeu et al. (2003)
Anopheles sacharovi
15
5 - 17
0,30 - 0,92
Guillemin et al. (2003)
A. funestus
9
5 - 11
0,77 - 0,78
Scherhorn et al. (2003)
Anopheles culicifacies
31
2 - 12
0,04 - 0,60
Sunil et al. (2004)
Anopheles albimanus
4
4 - 19
0,33 - 0,90
Molina-Cruz et al. (2004)
Anopheles marajoara
11
11 - 52
0,64 - 0,95
Li et al. (2005)
Anopheles sinensis
11
4 - 13
0,30 - 0,89
Jung et al. (2006)
A. sinensis
14
2 - 11
0,11 - 0,93
Yajun and Yong (2008)
A. darlingi
24
4 - 11
0,04 - 0,83
Lima et al. (2010)
Anopheles nuneztovari
18
2 - 13
0,07 - 0,92
Cardoza et al. (2011)
Anopheles triannulatus
15
3 - 10
0,15 - 0,86
Cruz et al. (2012)*
*Dados ainda não publicados.
20
Entre os marcadores microssatélites já desenvolvidos para diferentes espécies do
gênero Anopheles, destacam-se 39 microssatélites-dinucleotídeos (Schemerhorn et al.,
2003) específicos de A. funestus, um dos principais vetores da malária africana, procedente
da população de Burkina Faso e Quênia, na África. Dos 20 locos analisados, nove foram
polimórficos. A diversidade genética foi similar entre as localidades (0,77 e 0,78,
respectivamente) e apresentaram alto nível de polimorfismo. Esses resultados indicaram
ausência significativa de deficiência de heterozigotos.
O isolamento e caracterização de 20 microssatélites em Anopheles sinensis (Yajun Ma
and Yong Fan, 2008), principal vetor da malária na Ásia, a partir de 252 sequências
microssatélites resultaram em 20 locos caracterizados, dos quais, 14 foram polimórficos.
Dentre esses, 24 indivíduos mostraram 12 locos com o número de alelos variando de dois a 11,
e heterozigosidade esperada variando de 0,116 a 0,903.
Em um estudo com 323 indivíduos de A. marajoara da região Nordeste da Amazônia
brasileira (Li et al., 2005), foram isolados e caracterizados 40 locos microssatélites, dos
quais, 11 locos foram polimórficos. O número de alelos variou de 11 a 52. A
heterozigosidade esperada variou de 0,64 a 0,95. Os autores inferiram que, estes
marcadores são úteis para estudos de estrutura populacional e variação intra-específica em
A. marajoara.
Considerando a amplificação heteróloga de locos microssatélites, esta abordagem é
bastante utilizada no auxílio a novos marcadores moleculares, embora seja um método
oneroso e trabalhoso. Entretanto, diversos estudos têm mostrado sucesso quanto a
transferibilidade de marcadores microssatélites como aquelas realizadas para Natrix natrix
(Hille et al., 2002), Melipona compressipes e Melipona seminigra (Costa Pinto, 2007), e
Aedes taeniorhynchus (Bataille et al., 2009).
Vinte e quatro locos microssatélites polimórficos foram isolados e caracterizados para
A. darlingi, procedentes do Município de Coari, Estado do Amazonas, Brasil (Lima et al.,
2010). O número de alelos por loco variou de 4 a 11. A heterozigosidade observada (HO)
variou de 0,037 a 0,833, enquanto que a heterozigosidade esperada (HE) variou de 0,177 a
0,871. Treze locos apresentaram desvio significativo do HWE. Não foi encontrado
desequilíbrio de ligação entre os locos. Estes 24 locos de A. darlingi foram testados para
amplificação heteróloga em três espécies de Anopheles (subgênero Nyssorhynchus):
Anopheles rangeli, Anopheles benarrochi e A. triannulatus. O número de marcadores
amplificados variou de 10 locos em A. rangeli a 15 locos em A. benarrochi. Oito locos foram
amplificados em todas as três espécies e 17 locos amplificaram em pelo menos uma
espécie. Foram polimórficos 14 locos em pelo menos uma espécie.
21
A literatura mostra a importância epidemiológica do complexo A. albitarsis, como
transmissor da malária na Amazônia. Dentre essas espécies Deane et al. (1948) e Arruda et
al. (1986) registraram infecções por espécie de Plasmodium falciparum e P. vivax da malária
humana em A. albitarsis sensu stricto, A. marajoara e A. deaneorum. Porém, estudos
genéticos e moleculares no grupo, ainda são escassos. Portanto, fazem-se necessários
isolamento e caracterização de locos microssatélites para conhecer a estrutura e
variabilidade genética de populações desses mosquitos. Assim, no presente trabalho foi
realizado o estudo de isolamento, caracterização de locos microssatélites e estimativa da
variabilidade genética de três populações de A. albitarsis sensu lato, para compreensão do
fluxo gênico, taxa de dispersão, migração e evolução. Ainda, auxiliar em um melhor
esclarecimento acerca do seu status taxonômico uma vez que, dentre as espécies do
complexo (A. albitarsis s.s., A. deaneorum, A. marajoara, A. oryzalimnetes Wilkerson e
Motoki, n. sp., A. janconnae Wilkerson e Sallum, n. sp. e A. albitarsis F) somente A.
deaneorum é identificada por caracteres morfológicos clássicos (Motoki et al., 2009).
22
2. OBJETIVOS
2.1. Geral
Isolar e caracterizar marcadores moleculares microssatélites para Anopheles
albitarsis s.l., e estimar a variabilidade genética em duas populações do Estado do
Amazonas e uma de São Paulo.
2.2. Objetivos Específicos
Capítulo I:
•
Construir uma biblioteca genômica enriquecida com regiões de microssatélites para
A. albitarsis s.l.
•
Sequenciar clones recombinantes da biblioteca genômica.
•
Caracterizar a biblioteca genômica.
•
Desenhar primers flanqueadores para as regiões de microssatélites.
•
Caracterizar os locos microssatélites para A. albitarsis s.l. quanto ao polimorfismo.
•
Testar a amplificação heteróloga dos locos microssatélites desenvolvidos para A.
albitarsis s.l. em cinco diferentes espécies do subgênero Nyssorhynchus (A.
triannulatus, A. braziliensis, A. nuneztovari, A. darlingi e A. oswaldoi).
Capítulo II:
•
Analisar a variabilidade e estrutura genética em três populações do complexo A.
albitarsis s.l.
23
CAPÍTULO I:
Isolamento e caracterização de 25 locos polimórficos de
DNA microssatélites para o vetor da malária Anopheles
(Nyssorhynchus) albitarsis sensu lato e amplificação interespecífica em 5 espécies congenéricas
Os resultados do Capítulo I desta dissertação foram aceitos na forma de manuscrito, para
publicação na revista Genetics and Molecular Research – GMR (APÊNDICE A).
G.M. Guimarães-Marques; J.S. Batista; H.M. Guimarães; M.V. Naice-Daou; M.P. Lima; K.M.
Formiga; J.M.M. Santos; C.A.P. Lima e M.S. Rafael. 2012. Isolation and characterization of
25 microsatellite DNA loci for Anopheles albitarsis sensu lato and inter-specific amplification
in 5 congeneric species. Genet. Mol. Res. DOI http://dx.doi.org/10.4238/2012.December.6.3
O presente capítulo seguiu as regras de formatação e estilo da referida revista.
24
Resumo
O complexo Anopheles albitarsis inclui seis espécies: Anopheles albitarsis s.s., Anopheles
marajoara Galvão e Damasceno, Anopheles deaneorum Rosa-Freitas, Anopheles janconnae
Wilkerson e Sallum n. sp., Anopheles oryzalimnetes Wilkerson e Motoki, n. sp. e A. albitarsis
F Brochero. São incriminadas como vetoras da malária no Brasil: A. marajoara, vetora nos
Estados de São Paulo, Pará e Amapá; Anopheles janconnae, vetora local no Estado de
Roraima e A. deaneorum em Rondônia. Marcadores microssatélites têm sido úteis em
estudos populacionais, para esclarecer o status taxonômico de diversos mosquitos de
importância epidemiológica. Vinte e cinco locos microssatélites polimórficos foram isolados e
caracterizados em 24-36 indivíduos coletados no bairro de Puraquequara, Manaus (AM,
Brasil). O número de alelos variou entre 2 a 10 com um total de 126. A heterozigosidade
observada (HO) variou de 0,181 a 0,896 e a Heterozigosidade esperada (HE) variou entre
0,255 a 0,854. Onze locos mostraram desvios significativos para o Equilíbrio de HardyWeinberg. Não foi encontrado desequilíbrio de ligação entre os locos. Dez locos
microssatélites amplificaram com sucesso em outras cinco espécies de Anopheles. Estes
locos podem ser utilizados em estudos de estrutura populacional bem como para o controle
biológico deste vetor.
Palavras-Chave: Anopheles albitarsis, Complexo de espécies, Vetores da Malária,
Microsatéllites e Amplificação heteróloga.
25
INTRODUÇÃO
O complexo Anopheles (Nyssorhynchus) albitarsis tem sido investigado com
diferentes marcadores moleculares, como RAPD, COI (Lehr, 2005; Wilkerson et al., 2005),
ITS2 (Li, 2005), Gene White (Mckeon et al., 2010) e marcadores morfológicos (Motoki et al.,
2009) a fim de elucidar seu status taxonômico, o que culminou em um recente
reconhecimento de seis espécies crípticas: Anopheles albitarsis s.s. Lynch-Arribálzaga,
Anopheles marajoara Galvão e Damasceno, Anopheles deaneorum Rosa-Freitas,
Anopheles janconnae Wilkerson e Sallum n. sp., Anopheles oryzalimnetes Wilkerson e
Motoki, n. sp. e
A. albitarsis F. Brochero (Motoki et al., 2009). As espécies são
indistinguíveis quando utilizados apenas caracteres morfológicos, exceto Anopheles
deaneorum, única espécie do complexo identificada taxonomicamente por caracteres
morfológicos (Rosa-Freitas et al., 1998). São incriminadas como vetoras da malária no
Brasil: A. deaneorum em Rondônia (Klein et al., 1991), A. marajoara, vetora nos Estados de
São Paulo, Pará e Amapá (Li, 2005; Conn et al., 2002; Mckeon et al., 2010) e Anopheles
janconnae, vetora local no Estado de Roraima (Póvoa, 2006). Diferenças bioquímicas e/ou
moleculares, hábitos alimentares, antropofilia e zoofilia refletem a heterogeneidade na sua
capacidade vetorial (Consoli e Lourenço de Oliveira, 1994). Marcadores microssatélites têm
sido úteis em estudos populacionais, para esclarecer o status taxonômico de diversos
mosquitos de importância epidemiológica (Lanzaro et al., 1995; Rongnoparut et al., 1996;
Lehmann et al., 1997; Kamau et al., 1999). No complexo albitarsis, onze locos
microssatélites foram caracterizados para A. marajora (Li et al., 2005). No presente estudo
foram isolados e caracterizados 25 novos locos microssatélites para A. albitarsis s.l. e
realizada amplificação heteróloga em cinco espécies do mesmo gênero: Anopheles darlingi,
Anopheles
oswaldoi, Anopheles
triannulatus,
Anopheles
nuneztovari e Anopheles
braziliensis. Visando o estudo populacional das espécies do Complexo Albitarsis e de outros
anofelinos.
MATERIAL E MÉTODOS
Construção e sequenciamento da biblioteca de DNA enriquecida com
microssatélites
Uma biblioteca genômica enriquecida com regiões microssatélites de A. albitarsis s.l.
foi construída seguindo o método descrito por Billotte et al. (1999). Para a extração do DNA
genômico foi utilizado o protocolo de Wilkerson et al. (1995a), a partir de um pool de 12
larvas de 4° estádio larval, sem o trato digestivo para evitar contaminação, coletadas no
Município de Coari, Estado do Amazonas, Brasil. O DNA extraído foi digerido com a enzima
de restrição RsaI (Invitrogen), e os fragmentos digeridos foram ligados aos adaptadores
26
RSA21 e RSA25. Fragmentos de DNA contendo regiões com microssatélites foram
selecionados por hibridização com sondas (CT)8 e (GT)8 biotiniladas e recuperadas por
esferas magnéticas contendo estreptavidina (Streptavidin MagneSphere Paramagnetic
Particles, Promega). Os fragmentos selecionados foram ligados ao vetor de clonagem
pGEM-T (Promega) e transformados em células competentes XL1-blue de Escherichia coli.
Posteriormente foram inoculadas em placas contendo X-Gal/IPTG e meio sólido Luria–
Bertani (LB) com ampicilina (100 mg/ml) e incubados entre 18 a 22 horas a 37°C. Colônias
brancas individuais foram transferidas e incubadas a 37°C em placas (96 poços) contendo
meio de cultura 2YT-HMFM com ampicilina (100 mg/ml). O DNA plasmidial foi extraído
(Sambrook et al., 1989) de 96 clones e sequenciado utilizando os primers T7 e SP6,
juntamente com o Kit Big Dye terminator v3.1. Os clones foram sequenciados em ABI
PRISM 3130 automated Genetic Analyzer (Perkin Elmer, Applied Biosystems).
Desenho de primers, PCR e genotipagem
Entre as 96 colônias obtidas, foram sequênciados 88 clones com um índice de
enriquecimento de DNA microssatélites (SSR) de 95,8% e as sequências nucleotídicas de
70 clones (72,9%) da biblioteca foram editadas, usando o programa CHROMAS 2.23
CHROMAS PRO e BIOEDIT 7.0.9.0 (Hall, 1999).
Os primers foram desenhados com o auxílio dos programas WEBSAT (Martins et al.,
2009) e PRIMER3 (Rozen e Skaletsky, 2000), e apresentaram porcentagem média de GC
igual a 52%. Uma cauda M13 foi adicionada na extremidade 5’ de cada primer forward para
permitir a marcação por fluorescência de acordo com o protocolo sugerido por Schuelke
(2000).
O DNA genômico utilizado para a caracterização dos fragmentos de microssatélites
foi obtido a partir de amostras coletadas no bairro de Puraquequara, Manaus, Amazonas,
Brasil. As fêmeas de A. albitarsis foram coletadas no peridomicílio, entre 18:00 e 22:00
horas com auxílio de capturadores entomológicos manuais em animais em repouso. Os
exemplares foram transferidos para copos de papelão parafinados, tampados com tecido de
malha fina (filó) e presos nas bordas por elásticos, no centro do tecido foi aberto um orifício
para colocação dos espécimes, em seguida estes foram acondicionados em caixas de
poliestireno contendo papel umedecido e posteriormente transferidas para o Laboratório de
Vetores da Malária e Dengue do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia/INPA, para
as posturas individuais.
Após a oviposição, os ovos foram transferidos para outro copo com água e mantidos
até o 2˚ estágio larval. Em seguida transferidos e mantidos em cubas esmaltadas e
alimentados com uma mistura de farelo de peixe e pó de fígado mantidas até o quarto
27
estádio larval, conforme a metodologia de Santos et al. (1981). Um indivíduo de cada
desova (que corresponde a uma progênie) foi acondicionados em microtubo e mantido em
freezer a 80°C negativos até o momento da extração de DNA segundo o protocolo de
Wilkerson et al. (1995a).
Os fragmentos com microssatélites foram amplificados via PCR (Batista et al., 2009).
Para um volume final de 10µl contendo: 10 ng de DNA genômico, 0,4 µM de cada primer
forward e do primer M13 marcado com a fluorescência (FAM, HEX e NED), 0,8 µM do
primer reverso, dNTP (200µM), 1,5 mM de MgCl2, 1X de tampão (10 mM Tris–HCl, 50 mM
KCl, pH 8,4) e 0,5 U de goTaq DNA Polymerase (Promega). O produto amplificado foi
analisado por eletroforese em gel de agarose 1,5%, corado com GelRed (Biotium) e
visualizado em fotodocumentador.
A PCR foi realizada em três etapas: a primeira consistiu de desnaturação (68˚C, 2
min; 92 C, 30 s) seguida por 30 ciclos de 30 s a 92˚C, 35 s na temperatura de anelamento
do primer específico, 35 s, a 68˚C; o segundo passo consistiu de 20 ciclos com o seguinte
tempo e perfil de temperatura: 20 s, a 92˚C, 30 s, a 53˚C, 30 s, a 72˚C, e uma extensão final
a 72˚C 15 min, 68˚C 15 min. O produto amplificado foi visualizado em gel de agarose a 1,5%
corado com GelRed. A genotipagem foi visualizada em ABI PRISM 3130 Automated Genetic
Analyzer (Perkin Elmer, Applied Biosystems). O tamanho dos alelos foi estimado usando o
padrão de genotipagem ET-550 ROX (GE Healthcare), analisadas no programa GeneMarker
software v 1.97 (SoftGenetics).
Análises estatísticas
O teste para o equilíbrio de Hardy-Weinberg (HWE) foi estimado com o auxílio do
programa GENEPOP v4 (Raymond e Rousset, 1995). O programa MSTOOLS foi utilizado
para calcular heterozigosidade esperada (HE) e observada (HO). As estatísticas descritivas
(FIS) e desequilíbrio de ligação foram inferidos pelo programa FSTAT v2. 9.3.2 (Goudet,
2001). Os alelos nulos, dropout e stutters, foram checados com auxílio do programa
MICROCHECKER (Oosterhout et al., 2004).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Foram utilizados 35 contigs não redundantes com 54 SSR’s com tamanho médio de
506 pb no desenho de 34 pares de primers desenhados com a seguinte classificação: 4
mononucleotídeo, 42 dinucleotídeo, um trinucleotídeo, cinco tetranucleotídeo e dois
pentanucleitídeo. Sendo 47 perfeitos (87,04%), um perfeito composto (1,85%); quatro
imperfeitos (7,41%), e dois imperfeitos compostos (3,70%).
28
Dos 34 pares de primers desenhados, 25 locos microssatélites apresentaram-se
polimórficos e foram avaliados em 24 a 36 indivíduos de A. albitarsis s.l. coletados no bairro
de Puraquequara - Manaus (Amazonas, Brasil), cuja temperatura de anelamento variou
entre 56°C a 65°C (Tabela 02). Nove pares de primers restantes apresentaram problemas
na etapa de amplificação, e por isso, foram descartados.
O número de alelos variou de 2 a 10 com um total de 126 com media de 5,0 alelos
por loco com o tamanho variando entre 95 pb (Aa34) a 323 pb (Aa26). A heterozigosidade
observa da (HO) variou entre 0.181 e 0.896 (Aa01 – Aa27, respectivamente) com uma média
de 0,493, enquanto a heterozigosidade esperada (HE) variou entre 0,255 a 0,854 (Aa18 e
Aa07, respectivamente) com media de 0,624. O PIC variou entre 0,232 (Aa18) a 0,821
(Aa07), com a média de 0,560 (Tabela 2). Onze locos (Aa01, Aa07, Aa11, Aa19, Aa21,
Aa23, Aa26, Aa27, Aa28, Aa30, Aa31) mostraram desvio significativo para HWE após da
correção de Bonferroni (P: (5%) ≤ 0,002) (Rice, 1989). Esse desvio pode ser devido a um ou
vários fatores como: a influência da ação de inseticidas utilizados na região onde as
amostras foram coletadas; tamanho amostral insuficiente; efeito gargalo de garrafa. Todos
esses fatores interferem na detecção de todos os alelos na população ou mesmo, a
presença de alelos nulos como sugere o programa MICROCHECKER v2.2.3 (Oosterhout et
al., 2004) detectada nos locos Aa01, Aa07, Aa08, Aa11, Aa14, Aa19, Aa23, Aa25, Aa26,
Aa28, Aa31 e Aa34.
Foram utilizados 25 marcadores na amplificação heteróloga em cinco espécies de
Anopheles (Tabela 03). Um loco (Aa09) amplificou em todas as cinco espécies e 10 locos
amplificaram em pelo menos uma espécie. O número de marcadores amplificados variou
entre 2 (A. triannulatus) e 9 (A. nuneztovari). O número de alelos variou entre 1 a 6 por loco.
Os 25 marcadores microssatélites polimórficos desenvolvidos, podem ser usados como uma
ferramenta eficiente para estudos populacionais em A. albitarsis s.l. e em outras espécies
de Anopheles.
29
Tabela 02. Caracterização de 25 locos microssatélites polimórficos para Anopheles albitarsis s.l no bairro Puraquequara, Manaus (Amazonas, Brasil).
Locos
SSR
Acesso
GenBank
Motivo de
Repetição
Aa01
JQ697071
(CT)16
Aa05
JQ697072
(GT)7
Aa06
JQ697073
(CA)5
Aa07
JQ697074
(CA)9
Aa08
JQ697075
(AC)8
Aa09
JQ697076
(TG)8
Aa10
JQ697077
(TG)9
Aa11
JQ697078
(GT)12
Aa14
JQ697079
(GT)5at(GT)3
Aa16
JQ697080
(GA)9
Aa18
JQ697081 (TCAG)4ca(TTCAG)3
Aa19
JQ697081
(AC)9
Aa20
JQ697082
(GT)7
Sequência do Primer (5' - 3')
Ta (˚C)
Tamanho (bp)
N
A
57
132 – 152
33
4
56
184 – 194
33
62
216 – 244
65
HO
HE
P-HWE
FIS (f)
0,182 0,410
0,000*
0,560
5
0,727 0,658
0,453
-0,107
31
6
0,667 0,785
0,003
0,139
297 – 301
31
9
a
0,290 0,854
0,000*
0,664
56
124 – 134
36
5
a
0,472 0,674
0,017
0,302
60
238 – 256
36
7
0,722 0,644
0,557
-0,124
60
126 – 136
35
5
0,514 0,532
0,641
0,033
60
269 – 283
33
7
a
0,394 0,777
0,000*
0,497
60
315 – 321
34
4
a
0,471 0,673
0,028
0,304
60
107 – 113
36
4
0,806 0,640
0,132
-0,262
60
165 – 177
35
4
0,229 0,260
0,141
0,121
60
109 – 115
31
3
0,194 0,574
0,000*
0,666
60
271 – 273
35
2
0,629 0,497
0,171
-0,270
NED
F : CTGATGTCTGCATTTGACGG
R: TGAGTGAGTGAGTGATGACGG
FAM
F : TGTTGTTGCTCCTCCTTCTGT
R: CAGAGAGAACGCATTACGGAG
HEX
F : GCTACGCCCTGTTTTAACTCC
R: GGTGTGTTCGTGTATGTGTGTG
HEX
F : GAAGGGATAGTCAGCAATCACG
R: TCCAGTGAGAGGGAGAGAGGT
HEX
F : TCTATCGAGCAACGTCATGC
R: CCTCGCAGCTCACACATTA
HEX
F : AGATGATGAATGGGAGTGGG
R: AAATACGACGCCAGGAAGGT
a
FAM
(Continua)
Tabela 02. Continuação.
F : CGAGAATAGCCACCGTATGA
R: TAAGCACCACATCACAATCC
HEX
F : GTTCTCGTCTCGTCTCGTTTG
R: GGTCTGTCTGCTATCTGCTGG
HEX
F : GCAATTCCATGATTTACCCC
R: AGGAGAAGGAGGAGAAGCAGA
HEX
F : AGAGTAGAGTATCGGGTCGGC
R: CAGTCGAAGCGCGTACTAAGA
HEX
F : TGCAACCCCTTACGTCCTAC
R: GCTAAAAGCACAATCCACCG
FAM
F : CCTCACTTTCAATTCGGT
R: TCGACTTTACATTAACAAGC
NED
F : CACATGAACACCGACACGTAG
R: CTGGGGATTGTGACTGGATAG
a
30
Locos
SSR
Acesso
GenBank
Motivo de
Repetição
Sequência do Primer (5' - 3')
Ta (˚C)
Tamanho (bp)
N
A
60
151 – 157
34
4
65
184 – 192
35
3
60
242 – 272
36
10
65
142 – 152
31
4
60
313 – 323
33
7
65
101 – 127
29
5
60
198 – 218
36
8
62
219 – 241
31
4
65
216 – 231
35
4
59
203 – 209
28
62
245 – 257
60
95 – 105
HO
HE
P-HWE
FIS (f)
0,765 0,717
0,000*
-0,068
0.514 0.612
0.186
0.162
0.278 0.802
0.000*
0.657
a
0.387 0.685
0.003
0.439
a
0,394 0,753
0,000*
0,481
0,897 0,630
0,000*
-0,434
0,222 0,533
0,000*
0,587
0,871 0,617
0,000*
-0,421
0,400 0,632
0,000*
0,371
4
0,500 0,659
0,479
0,245
24
4
0,417 0,402
1,000
-0,038
30
4
0,333 0,586
0,006
0,435
NED
Aa21
JQ697083
Aa22
JQ697083
Aa23
JQ697084
Aa25
JQ697085
Aa26
JQ697086
Aa27
JQ697087
Aa28
JQ697088
Aa30
JQ697089
Aa31
JQ697090
Aa32
JQ697090
Aa33
JQ697091
Aa34
JQ697091
F : GAGAGAAACAGTGAGTGAGCGG
R: ACGCCACGCCATCATCAG
FAM
F : CTACCACGCTTCGTTCGACT
(AACA)5
R: GCCGACTGAAAATAGCTTCC
FAM
F : CTTCCTCTTGTCTGTCATCGC
(TG)5a(TG)13
(GA)15
R: TGCTCGTGTCTGTATTTGCC
NED
F : AGGGATGATACTGGGGTATGG
(AC)5
R: GAAGGGTGCGTAGAGGATTG
FAM
F : ACATTTCCTGTGGTCCTGTGG
(CA)8ct(CA)5
R: GAGAGCTTCAGCGTAATCGTC
HEX
F : CGGCATTCAAACGCATCT
(TG)5ttta(TG)8
R: GGAATACTGTTGACGCTGACC
HEX
F : CTGAACGAGATGCTGGAGCTA
(CAT)7
R: TCACAGATGGAGTGGTTGGA
NED
F : TGCACCAGAATTGGCACG
(GT)5
R: GAACCCTCTTCCCTCTGATTG
HEX
F : GGCTAGGAGCGTAGAGAGAGG
(ATC)4 A (GAG)3
R: CTACCAGCATCCACCGTTCTA
FAM
F : AGAGTCCTTTCTGCCGCTAAC
(CA)7
R: CATTAACCCCTTCCTTCGGT
FAM
F : CACATAGTTACGAGGACGAG
(AGCC)7
R: GACTCTTAGGACTTCCAGGG
NED
F : GAGAGAAACAGTGAGTGAGCGG
(CT)7
R: ACGCCACGCCATCATCAG
(TG)6
a
a
a
a
Ta temperatura anelamento (˚C); N número de indivíduos genotipados; A número de alelos; a presença de alelo nulo; HO heterozigosidade observada;
HE heterozigosidade esperada; P-HWE* locos que não se mostraram em equilíbrio Hardy-Weinberg após correção de Bonferroni.
31
Tabela 03. Amplificação heteróloga de 25 locos microsatéllite em cinco espécies do gênero Anopheles (N=4, por espécie).
Locos
Anopheles
Anopheles
Anopheles
Anopheles
Anopheles
darlingi
braziliensis
triannulatus
oswaldoi
nuneztovari
Tamanho (bp)
Aa01
Aa05
Aa06
Aa07
Aa08
Aa09
Aa10
Aa11
Aa14
Aa16
Aa18
Aa19
Aa20
Aa21
Aa22
Aa23
Aa25
Aa26
Aa27
Aa28
Aa30
Aa31
Aa32
Aa33
Aa34
X
X
X
X
X
244 – 268
X
X
X
X
X
X
323
X
X
X
X
230 – 282
136 – 148
X
X
X
X
X
110
A
3
1
3
2
1
Tamanho (bp)
A
Tamanho (bp)
138 – 152
X
X
X
X
238 – 252
X
X
X
125-129
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
251
X
X
X
X
4
x
x
x
x
x
238 - 268
x
x
x
109 - 125
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
2
2
1
*Temperatura de Anelamento mostrada na tabela 1, A número de alelos, X não amplificou.
A
3
4
Tamanho (bp)
138 - 168
x
x
x
x
252 - 268
x
x
337 - 343
103-125
x
x
253 - 281
x
x
x
x
330
x
x
251
x
x
x
105 - 113
A
Tamanho (bp)
4
x
x
x
x
x
240 - 286
x
x
347
115- 137
x
x
257-277
x
x
x
x
x
132 - 142
214
251
x
206 - 224
x
119 - 125
6
2
5
3
1
1
2
A
5
1
4
2
2
1
4
2
32
CAPÍTULO II:
Estimativa da variabilidade genética em três populações de
Anopheles
albitarsis
sensu
lato
(Diptera:
utilizando marcadores microssatélites.
Culicidae),
33
1. INTRODUÇÃO
1.1. Variabilidade genética
A diversidade de uma espécie era medida pelas diferenças morfológicas. Mas,
atualmente, dados moleculares vêm sendo utilizados e considerados vantajosos devido ao
maior número de caracteres estudados (Ferreira e Grattapaglia, 1998). As populações
naturais possuem altos níveis de variabilidade genética intrapopulacional, que é introduzida
por mutação, migração ou fluxo gênico (Morand-Prieur et al., 2002), e as espécies
endogâmicas, contribuem para a depressão genética (perda da variabilidade genética) em
suas populações (Medeiros, 2006). Assim, a diversidade genética é necessária para as
populações se adaptarem às mudanças ambientais (Frankham, et al., 2008), geralmente
observadas em nível de espécie, dentro de uma mesma população ou entre diferentes
populações. Em espécies ameaçadas de extinção, a diversidade genética é importante para
a manutenção das populações ao longo do tempo. Espécies com baixa variação genética
têm geralmente uma redução na habilidade de sobreviver às mudanças ambientais durante
o processo evolutivo (Frankham, 1995). A variabilidade genética é fundamental para a
espécie manter a vitalidade reprodutiva, a resistência a doenças e adaptar-se a mudanças
ambientais (Primack, 2001).
A diversidade genética tem sido estudada por métodos moleculares (DNA –
Dominante: RAPD, AFLP e Codominante: RFLP, SSR), que se baseiam em três diferentes
classes de marcadores: proteínas (alozimas), polimorfismo de sequências de DNA e
variação do DNA repetitivo. Entre os principais marcadores, destacam-se os de sequência
de DNA e os microssatélites (Ferreira e Grattapaglia, 1998; Schlotterer, 2004). Em estudos
de genética de populações, os microssatélites têm sido usados com sucesso para análises
de fluxo gênico, sistemas de cruzamentos e estrutura populacional. Os locos microssatélites
medem a variação genética de locos neutros (não sujeitos a seleção e deriva genética) uma
vez que as repetições em tandem estão geralmente localizadas em segmentos nãocodificantes do DNA (Frankham et al. 2008).
A literatura mostra oito locos isoenzimáticos em um estudo de genética de
populações de espécies de Anopheles do subgênero Nyssorhynchus, da Amazônia
brasileira (A. darlingi, Anopheles triannulatus, Anopheles mattogrossensis, A. albitarsis e
Anopheles intermedius). Essas cinco espécies revelaram diferenças quanto ao grau de
heterozigosidade genética (0,060 – 0,284), sendo que a proporção de locos polimórficos
observados em A. darlingi, A. triannulatus e A. mattogrossensis foi de 50%, divergente para
34
A. albitarsis (62,5%) e A. intermedius (25%). O índice de fixação demonstrou elevada
diferenciação genética entre essas espécies (FST = 0,644). Esses resultados mostraram
divergência genética interespecífica, que diferem da hipótese filogenética baseada em
caracteres morfológicos (Santos et al., 2003).
O gene mitocondrial ND5 foi estudado em A. albirarsis s.l. dos Municípios de Coari,
Manaus e Cacau Pirera no Estado do Amazonas (Naice et al., 2006). Os autores verificaram
que A. albitarsis de Coari não apresentou haplótipos compartilhados com as amostras de
Manaus e Cacau Pirera. Os dados estatísticos mostraram estruturação genética, com
diferenças significativas, entre Coari e as duas outras localidades. O mesmo marcador foi
utilizado por Naice (2007) para estudar A. albitarsis s.l. procedente de PuraquequaraManaus, Estado do Amazonas, e mostraram níveis elevados de variabilidade genética entre
os 21 indivíduos estudados.
Os Genes ITS2, ND4 e RAPD foram utilizados para identificar A. albitarsis s.l. e A.
triannulatus s.l. da região de Porto Primavera (Mato Grosso do Sul - MS), por Neves (2009).
O marcador molecular RFLP, mostrou que 62,85% dos anofelinos pertencem à espécie A.
deaneorum, do complexo A. albitarsis e que o Gene ND4 não foi uma ferramenta útil para a
diferenciação de A. albitarsis e A. albitarsis B. Porém, a identificação molecular por meio do
marcador ITS2 mostrou polimorfismos intragenômicos em anofelinos do complexo A.
triannulatus.
Os marcadores microssatélites têm sido muito utilizados em estudo populacional de
mosquitos. Duas populações de A. gambiae s.s., foram utilizadas para verificar os efeitos da
sazonalidade em duas populações na Costa do Quênia (Midega et al., 2010). Em Anopheles
arabiensis, para analisar a estrutura genética de populações do Projeto Mwea de Irrigação
de arroz e em áreas ao arredor do Quênia Central, para comparar diferentes sistemas
agrícolas e analisar a estrutura populacional (Muturiet et al., 2010). Anopheles moucheti foi
analisado quanto aos níveis de diferenciação genética populacional de sua área de
distribuição na África Central (Antonio-Nkondjio et al., 2008). Em cinco populações de
Anopheles marajoara da Colômbia representando diversas condições ecológicas (Brochero
et al., 2010). Em Anopheles albimanus, foi estimado a diversidade genética intrapopulacional, a diferenciação genética e a história demográfica (Gutiérrez, 2009).
Segundo a literatura, os gêneros Anopheles, Aedes e Culex são os mosquitos mais
estudados, devido a sua importância médica como vetores de doenças e pela sua complexa
posição taxonômica (Santos,1992). Porém, o uso de marcadores microssatélites em
espécies do complexo A. albitarsis ainda é escasso. Portanto, este estudo propôs o
isolamento, caracterização de locos microssatélites e variabilidade genética do complexo A.
albitarsis sensu lato, por meio de marcadores microssatélites, visando compreender
35
aspectos evolutivos do grupo e auxiliar estudos voltados para programas de controle desses
mosquitos.
36
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1. Amostragem de Anopheles albitarsis s.l.
As amostras de A. albitarsis (N= 37) foram coletadas no bairro de Puraquequara
(3°3'27"S 59°50'39"W) em Manaus e em Coari (04°5′6″S, 63°8′27″W) (N= 32) Estado do
Amazonas e Ilha Comprida (N= 15), Estado de São Paulo (24°42.75’S, 47°31.6’W) (Figura
03). As fêmeas de A. albitarsis s.l. foram coletadas no peridomicílio, entre 18:00 e 22:00
horas, com auxílio de capturadores entomológicos manuais nos bovinos em repouso em
currais.
Os exemplares foram transferidos para copos de papelão parafinados, tampados
com tecido de malha fina (filó) e presos nas bordas por elásticos. No centro do tecido foi
aberto um orifício para colocação dos espécimes, em seguida estes foram acondicionados
em caixas de poliestireno contendo papel umedecido e posteriormente transferidos para o
Laboratório de Vetores da Malária e Dengue do Instituto Nacional de Pesquisas da
Amazônia/INPA, para as posturas individuais. Após as oviposicões, as fêmeas foram
identificadas, segundo a chave entomológica de Consoli e Lourenço-de-Oliveira (1994).
Cada indivíduo corresponde a uma progênie. As progênies foram mantidas até o quarto
estádio larval, conforme a metodologia de Santos et al. (1981), as quais foram congeladas
imediatamente em freezer -70°C até o momento das extrações de DNA.
Figura 01. Mapa do Brasil indicando os locais de coletas de Anopheles
albitarsis s.l. 1 - Bairro de Puraquequara, Município de Manaus, Amazonas; 2 Município de Coari, Estado do Amazonas. 3 – Município de Ilha Comprida,
Estado de São Paulo.
37
2.2. Extração e quantificação de DNA
A extração de DNA foi realizada segundo protocolo de Wilkerson et al. (1995a),
utilizando-se larva de quarto estádio sendo uma de cada progênie, no total de 83 indivíduos
(Puraquequara, N= 36; Coari, N= 32 e Ilha Comprida, N= 15). O protocolo de extração
consta das seguintes etapas: as larvas foram maceradas individualmente em tampão de lise
TL (SDS 1%, Tris – HCL 50mM, pH 8,0, EDTA 25mM, pH 8,0 e NaCl 52mM) com auxílio de
pistilos. Em seguida foram incubadas em banho-maria por 30 minutos a 65°C. Foi
acrescentada RNAse (100µg/ml) em cada tubo. Em seguida, este foi centrifugado e
adicionado acetato de potássio (3M pH 7,2), misturado em vortex e deixado em 20º C
negativos até o dia seguinte. O DNA foi centrifugado por dez minutos. O sobrenadante foi
transferido para um novo tubo e, em seguida adicionado etanol absoluto e centrifugado por
30 minutos. Foi descartado o sobrenadante, adicionado etanol 70% e, centrifugado por dez
minutos. Foi retirado o sobrenadante, e após a evaporação do etanol foi adicionado o TE
(Tris-EDTA) para ressuspender o DNA, em seguida estocado em temperatura a -20ºC.
A concentração e a qualidade do DNA genômico dos indivíduos de A. albitarsis s.l.
foram determinadas em gel de agarose 0,8%, por eletroforese horizontal, corado com
GelRed (Biotium) e visualizado em transluminador, para comparação com a concentração
conhecida do DNA do bacteriófago lambda, para posteriores análises moleculares.
2.3. Amplificação e genotipagem de Anopheles albitarsis s.l.
Os 25 locos microssatélites caracterizados em A. albitarsis s.l. (Capitulo I, Tabela 03;
Guimarães-Marques et al., 2012 in press) foram selecionados e avaliados, segundo
padrões eletroforéticos, genotipagem e ausência de alelos nulos. Após avaliação, foram
selecionados 12 locos polimórficos (Tabela 01) para estimar a variabilidade e diferenciação
genética entre as três populações de A. albitarsis s.l., sendo duas no Estado do Amazonas
(bairro de Puraquequara, Município de Manaus e Coari) e uma no Estado de São Paulo
(Município de Ilha Comprida).
As amplificações foram realizadas segundo o protocolo de Schuelke (2000), com
marcações por fluorescência (FAM, HEX e NED) por meio da adição de uma cauda M13 na
extremidade 5´ de cada primer forward. Foram selecionados 12 locos (Tabela 01), com base
no padrão da amplificação e polimorfismo (Tabela 01), para que, assim, pudesse ser
estimada a variabilidade e diferenciação genética entre as três populações.
38
Tabela 1. Locos microssatélites utilizados para estimar a diversidade genética de Anopheles albitarsis
s.l., obtidas de três localidades, sendo duas no Amazonas (bairro de Puraquequara, Manaus e Coari
(Amazonas) e uma de Ilha Comprida (São Paulo).
SSR
Loco
Motivo de Repetição
Aa05
(GT)7
Aa07
(CA)9
Sequência do Primer (5' - 3')
FAM
F : TGTTGTTGCTCCTCCTTCTGT
R: CAGAGAGAACGCATTACGGAG
F
Ta Tamanho
(˚C)
(bp)
56
184-194
65
297-301
60
238-256
60
126-136
60
107-113
60
167-179
60
271-273
60
151-157
65
167-179
65
101-227
62
219-241
62
245-257
HEX
: GAAGGGATAGTCAGCAATCACG
R: TCCAGTGAGAGGGAGAGAGGT
HEX
Aa09
(TG)8
F : AGATGATGAATGGGAGTGGG
R: AAATACGACGCCAGGAAGGT
Aa10
(TG)9
F : CGAGAATAGCCACCGTATGA
R: TAAGCACCACATCACAATCC
Aa16
(GA)9
F : AGAGTAGAGTATCGGGTCGGC
R: CAGTCGAAGCGCGTACTAAGA
Aa18
FAM
HEX
HEX
(TCAG)4ca(TTCAG) F : TGCAACCCCTTACGTCCTAC
3
R: GCTAAAAGCACAATCCACCG
NED
Aa20
(GT)7
F : CACATGAACACCGACACGTAG
R: CTGGGGATTGTGACTGGATAG
Aa21
(TG)6
F : GTCGTGCCTCTCTTTTCTAGG
R: CCGCTCACTCACTGTTTCTCT
Aa22
(AACA)5
Aa27
FAM
NED
F : GAGAGAAACAGTGAGTGAGCGG
R: ACGCCACGCCATCATCAG
FAM
(TG)5ttta(TG)8
F : ACATTTCCTGTGGTCCTGTGG
R: GAGAGCTTCAGCGTAATCGTC
HEX
Aa30
(GT)5
F : CTGAACGAGATGCTGGAGCTA
R: TCACAGATGGAGTGGTTGGA
Aa33
(AGCC)7
F : AGAGTCCTTTCTGCCGCTAAC
R: CATTAACCCCTTCCTTCGGT
FAM
Referência
Capítulo I,
Tabela 02
Guimarães
-Marques
et al., 2012
Ta: Temperatura de anelamento; pb: tamanho dos alelos; FAM, NED e HEX: fluorescências
utilizadas em cada loco.
Cada reação da PCR foi feita com um volume final de 10 µL contendo: 10 ng de DNA
genômico, 0,4 µM de cada primer forward e do primer M13 marcado com as fluorescências:
FAM, NED ou HEX, dependendo do loco. 0,8 µM do primer reverso, 200 µM de cada dNTP,
1,5 MgCl2, 1 X de tampão (10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, pH 8.4) e 0,5 U de goTaq DNA
polimerase (Promega). A PCR foi conduzida, utilizando-se dois programas: o primeiro
consistiu na desnaturação do DNA (68˚ C, 1 min; 94˚ C, 30s), seguida de 30 ciclos de 30s a
92˚ C, 35s na temperatura de anelamento específica de cada par de primer (Tabela 01), e
40s a 68˚ C; o segundo programa consistiu em 20 ciclos com as seguintes condições de
temperatura e tempo: 25 s a 92° C, 35 s a 53° C, 30 s a 72° C e uma extensão final a 68° C
por 15 min e a 72° C 15 min. Os produtos amplificados foram verificados em eletroforese,
em gel de agarose 1,5%, corado com GelRed (Biotium) e visualizado em fotodocumentador
UV. O tamanho do fragmento amplificado foi estimado por comparação ao marcador Ladder
1kb plus (Invitrogen).
39
As amostras foram avaliadas em ABI PRISM 3130 xl Automated Genetic Analyzer
(Perkin Elmer, Applied Biosystems), o tamanho dos alelos foi estimado usando o padrão de
genotipagem ET-550 ROX (GE HealthCare), analisados no programa GeneMarker software
v 1.97 (SoftGenetics). Para a genotipagem foi utilizado 1,0 µL do produto da PCR diluído
(1:20), posteriormente adicionado a 7,0 µL de solução contendo Tween 20 a 0,1% + ET 550
ROX (padrão de genotipagem - GE Healthcare). Um sistema multiplex (Tabela 02) foi
montado para a genotipagem dos indivíduos de Coari – AM e Ilha Comprida - SP, por meio
da combinação das fluorescências (FAM, HEX e NED) de cada loco. Esse procedimento
auxiliou na otimização de tempo e reagentes, uma vez que em um único poço da placa de
genotipagem (96 poços), pudessem ser analisados pelo menos dois locos de um mesmo
indivíduo simultaneamente.
Tabela 02. Sistema multiplex de genotipagem de 12 locos microssatélites
para os indivíduos de Anopheles albitarsis de Coari-AM e Ilha Comprida SP.
Multiplex
Locos
Tamanho do
Fragmento (pb)
Fluorescência
1
Aa05
Aa07
Aa20
Aa10
Aa09
Aa22
Aa21
Aa16
Aa27
Aa18
Aa33
Aa30
184-194
297-301
271-273
126-136
238-256
167-179
151-157
107-113
101-227
167-179
245-257
219-241
FAM
HEX
NED
FAM
HEX
NED
FAM
HEX
FAM
HEX
FAM
HEX
2
3
4
5
pb = Tamanho dos alelos em pares de bases.
2.4. Estimativa do tamanho dos alelos e montagem do banco de dados
de genotipagem
Os dados genotípicos foram analisados com o auxílio do programa GeneMarker
software v 1.97, com os quais foi estimado o tamanho dos alelos (em pb), usando o padrão
de genotipagem ET-550 ROX (GE Healthcare). Foi gerada uma matriz de dados em formato
de tabela, contendo o genótipo de todos os indivíduos amostrados nas três localidades.
Para geração e conversão dos arquivos de entrada, utilizados nos diferentes programas de
análise e estimativa de parâmetros genéticos foram utilizados os programas MSTOOLS
(Park, 2001) e GENALEX 6.2 (Peakall e Smouse, 2006). Essa matriz foi usada para as
análises e estimativas de parâmetros genéticos. Indivíduos idênticos e diferenças de
tamanho entre os alelos de cada genótipo foram checados com o auxílio dos programas
40
MSTOOLS
(Park,
2001)
e
MICROCHECKER
2.2.3
(Oosterhout
et
al.,
2004)
respectivamente. Foram excluídos 18 pb do tamanho de cada alelo (correspondente ao
tamanho do primer / cauda de M13 fluorescente usado na PCR), conforme sugerido por
Schuelke (2000). O programa MICROCHECKER 2.2.3 (Oosterhout et al., 2004) também foi
utilizado para verificar a presença de alelos nulos, stutters (“picos/bandas de gaguejos”) e
large dropout, em cada loco e em cada população.
2.5. Análises estatísticas e estrutura populacional
O coeficiente de endogamia (FIS) para cada loco e em cada localidade, o
desequilíbrio de ligação (DL), a riqueza alélica (AR) e o número total de alelos foram
estimados com auxílio do programa FSTAT 2.9.3.2 (Goudet, 2001). O Conteúdo de
Polimorfismo - PIC (Botstein et al., 1980), a heterozigosidade observada (HO) e a esperada
(HE) foram estimados com o programa MSTOOLS (Park, 2001). O desvio do Equilíbrio de
Hardy-Weinberg (EHW) foi verificado pelo programa GENEPOP v4 (Raymond e Rousset,
1995), o número de alelos exclusivos em cada localidade foi estimado com o programa
GENALEX 6.2 (Peakall e Smouse, 2006). Os níveis de significância estatísticos foram
ajustados por meio da correção sequencial de Bonferroni, para os testes de EHW e DL
(Rice, 1989).
A análise de variância dos dados moleculares foi verificada através das estatísticas F
de Wright (Wright, 1951), estimada com o auxílio do programa FSTAT 2.9.3.2 (Goudet,
2001), ARLEQUIN (Excoffier et al., 2005) e TFPGA (Miller, 1997). A distância de Nei (1978)
e identidade genética foram calculadas no programa TFPGA (Miller, 1997). O fluxo gênico
foi estimado a partir do número de migrantes por geração (Nm), onde Nm = 0,25(1FST)/(FST) foi baseado nos valores de FST, com ajuda do programa POPGENE 1.31 (Yeh et
al., 1997).
O programa TFPGA (Miller, 1997) foi utilizado para averiguar ligação genética entre
as populações amostradas por intermédio de análises que correlaciona distância genética
com distância geográfica (Km) por meio do teste de Mantel (1967). A primeira utiliza a
distância genética de Nei (1978), enquanto a segunda, verifica significância, por meio de
permutações, da correlação entre uma matriz de distância genética dos agrupamentos de
indivíduos, utilizando os valores de comparação de FST par-a-par (Slatkin, 1995). A matriz de
distância geográfica foi estimada por ferramentas disponíveis no programa Google Earth
(2012).
Para verificar se as populações analisadas apresentam diferenciação genética foi
realizada uma análise Bayesiana implementada no programa STRUCTURE 2.3.2 (Pritchard
et al., 2000), que atribui indivíduos a número k de populações, assumindo equilíbrio de
41
Hardy-Weinberg e ausência de desequilíbrio de ligação entre os locos analisados dentro de
cada população. Para essas análises foi usado o modelo de mistura (admixture model), no
qual cada indivíduo pode ter ancestrais de mais de uma população, e frequências alélicas
correlacionadas, permitindo uma sensível identificação de populações sub-estruturadas
(Falush et al., 2003).
Foram realizadas 10 réplicas para cada valor de k, variando de um a quatro, com
valores de corte (burnin) de 50.000 permutações e Markov Chain Monte Carlo (MCMC) com
1.000.000 permutações. O número de clusters (k) foi inferido pelo método proposto por
Pritchard et al. (2000), realizado com o auxílio do programa STRUCTURE HARVESTER
0.56.3 (Earl, 2009), disponível no site http://taylor0.biology.ucla.edu/struct_harvest/.
42
3. RESULTADOS
3.1. Análise da variabilidade genética
Em A. albitarsis s.l. não foi observado desequilíbrio de ligação significativo entre os
locos em nenhuma localidade; também não foram observados alelos nulo em loco comum
nas três populações. Os 83 indivíduos das localidades de Puraquequara (N= 36); Coari (N=
32) e Ilha Comprida (N= 15) foram analisados nos 12 locos. Identificaram-se um total de 156
alelos nessas três populações, com média de 4,33 alelos por loco. O número de alelos por
loco variou entre dois a nove e o tamanho de 119 a 337 pares de bases.
A heterozigosidade observada (HO) de: 0,229 a 0,897; 0,125 a 0,966; 0,143 a 0,933,
com uma média de: 0,615; 0,546; 0,436 foi registrada nas populações de A. albitarsis de
Puraquequara, Coari e Ilha Comprida, respectivamente. A heterozigosidade esperada (HE)
foi de: 0,260 a 0,854; 0,222 a 0,812; 0,138 a 0,809 com média de: 0,586; 0,614; 0,555 por
loco, nas populações de Puraquequara, Coari e Ilha Comprida, respectivamente; e, a média
total da heterozigosidade observada (HO) foi de 0,532 e da heterozigosidade esperada (HE)
de 0,586 (Tabela 03).
O PIC variou de 0,242 a 0,821; 0,195 a 0,775; 0,124 a 0,745, com médias de: 0,520;
0,548; 0,480 nas populações de Puraquequara, Coari e Ilha Comprida, respectivamente. A
média total do PIC foi de 0,516 nessas três populações.
O FIS (índice de endogamia) variou de -0,107 a 0,664; -0,017 a 0,636; 0,085 a 1,000,
com médias de -0,046; 0,112; 0,224 nas populações de Puraquequara, Coari e Ilha
Comprida, respectivamente. A média total do FIS foi de 0.097 (Tabela 03).
Foi observado desvio do equilíbrio de Hardy-Weinberg em oito locos nas três
populações de A. albitarsis analisadas. Dentre esses, quatro locos em Puraquequara (Aa
07, Aa21, Aa27 e Aa 30), cinco em Coari (Aa07, Aa10, Aa21 Aa27 e Aa33), e quatro locos
na população de Ilha Comprida, (Aa10, Aa16, Aa18 e Aa27) após a correção de Bonferroni
(P: (5%) ≤ 0,004) (Rice, 1989) (Tabela 03).
43
Tabela 03. Variabilidade genética em três populações de Anopheles albitarsis s.l., mostrando o Conteúdo de Polimorfismo (PIC) e o índice de endogamia
(FIS) para cada um dos 12 locos microssatélites.
AMAZONAS
SÃO PAULO
ILHA COMPRIDA
COARI
PURAQUEQUARA
População/
Estado
Aa05
Aa07
Aa09
Aa10
Aa16
Aa18
Aa20
Aa21
Aa22
Aa27
Aa30
Aa33
A
5
9
7
5
4
4
2
4
3
5
4
4
HO
0,727
0,290
0,722
0,514
0,806
0,229
0,629
0,765
0,514
0,897
0,871
0,417
HE
0,658
0,854
0,644
0,532
0,640
0,260
0,497
0,717
0,612
0,630
0,617
0,402
PIC
0,585
0,821
0,585
0,485
0,565
0,242
0,370
0,651
0,519
0,550
0,526
0,343
FIS
-0,107
0,664
-0,124
0,033
-0,262
0,121
-0,270
-0,068
0,162
-0,434
-0,421
-0,038
HWE
0,471
0,000*
0,580
0,637
0,015
0,132
0,169
0,000*
0,184
0,000*
0,000*
1,000
A
3
5
5
8
6
2
2
4
3
4
5
6
HO
0,345
0,286
0,438
0,966
0,667
0,125
0,387
0,900
0,531
0,923
0,656
0,333
HE
0,402
0,774
0,657
0,812
0,671
0,222
0,495
0,618
0,522
0,751
0,726
0,719
PIC
0,360
0,716
0,597
0,775
0,611
0,195
0,368
0,537
0,397
0,689
0,673
0,657
FIS
0,144
0,636
0,338
-0,193
0,007
0,441
0,221
-0,469
-0,017
-0,235
0,097
0,540
HWE
0,012
0,000*
0,007
0,000*
0,011
0,050
0,267
0,000*
1,000
0,000*
0,005
0,000*
A
3
3
3
8
6
3
3
4
2
3
6
3
HO
0,143
0,308
0,692
0,933
0,692
0,000
0,500
0,385
0,000
0,846
0,500
0,231
HE
0,473
0,397
0,640
0,731
0,809
0,370
0,594
0,588
0,138
0,588
0,817
0,514
PIC
0,386
0,350
0,535
0,664
0,745
0,325
0,505
0,496
0,124
0,471
0,730
0,426
FIS
0,714
0,232
-0,085
-0,289
0,150
1,000
0,165
0,355
1,000
-0.467
0,404
0,561
0,000*
0,004*
0,000*
0,001*
0,021
0,249
0,856
0,007
0,074
0,039
0,018
0,019
HWE
A= Número de alelos; HO= heterozigosidade observada; HE= Heterozigosidade esperada; FIS= Coeficiente de endogamia; HWE= Equilíbrio de HardyWeinberg; *P: (5%) ≤ 0,004 fora do equilíbrio de Hardy-Weinberg após a correção de Bonferroni.
44
Após a análise em 12 locos de A. albitarsis s.l. para as três localidades, o número de
alelos totais (AT) foi maior na população de Puraquequara (AT= 56) e menor na população
de Ilha Comprida (AT= 47). Coari apresentou a maior riqueza alélica (AR= 3,596), e a média
da diversidade gênica variou entre 0,809 (Coari) e 0,863 (Puraquequara). A média do
coeficiente de endogamia (FIS) foi de -0,046 em Puraquequara, 0,112 em Coari e 0,224 em
Ilha Comprida. O valor de FIS (negativo) encontrado para a população de Puraquequara
revelou que o acasalamento ao acaso pode estar gerando excesso de heterozigotos,
enquanto nas demais populações pode estar ocorrendo endocruzamento (Tabela 04).
Tabela 04. Índice genético de três populações de Anopheles albitarsis s.l. utilizando 12 locos
microssatélites.
População
N
AT
AR
Média da
Diversidade
Genética
Média HO – HE
FIS
Puraquequara - AM
36
56
3,445
0,863 ± 0,260
0,615 - 0,589
-0,046
Coari - AM
32
53
3,596
0,809 ± 0,224
0,546 - 0,614
0,112
Ilha Comprida - SP
15
47
3,457
0,839 ± 0,143
0,436 - 0,555
0,224
N= número de indivíduos por loco; AT= alelos totais; AR= riqueza alélica; FIS= coeficiente de
endocruzamento.
Dentre os 156 alelos de A. albitarsis s.l. distribuídos nas três localidades amostradas,
em 83 indivíduos de A. albitarsis s.l., foram observados 35 alelos exclusivos, sendo 14
alelos, nas populações de Puraquequara – AM e Ilha Comprida - SP, e 7 alelos em Coari –
AM (Tabela 05). A maior frequência registrada (0,333) foi do alelo denominado 159,
encontrado no loco Aa21 em Coari - AM. As baixas frequências alélicas (0,013 e 0,014)
foram dos alelos 260 e 183 presentes nos loco Aa09 e Aa18, na população de
Puraquequara. O loco que apresentou maior quantidade de alelos exclusivos foi Aa10 (A=
06) sendo dois em Coari e quatro em Ilha Comprida, seguido dos locos Aa07 e Aa21 (A=
05). Os locos com menor quantidade de alelos exclusivos foram Aa20 e Aa33 (A= 01).
45
Tabela 05. Frequência de Alelos exclusivos encontrados nos 12 locos microssatélites das três populações de Anopheles albitarsis s.l. Entre parênteses as
frequências dos alelos.
População
Total
PURAQUEQUARA - AM 14
Aa05
Aa07
Aa09
Aa10
Aa16
Aa18
202 (0,030) 321 (0,032) 256 (0,027)
183 (0,014)
206 (0,090) 333 (0,177) 260 (0,013)
187 (0,085)
Aa20
Aa21
Aa22
175 (0,088)
Aa27
Aa30
Aa33
129 (0,034) 259 (0,016)
208 (0,060) 335 (0,129)
337 (0,032)
COARI - AM
323 (0,142)
7
140 (0,137) 135 (0,016)
257 (0,125) 259 (0,016)
142 (0,103)
216 (0,071)
ILHA COMPRIDA SÃO
PAULO
159 (0,333)
134 (0,033) 123 (0,076) 199 (0,142) 287 (0,166) 161 (0,576)
14
136 (0,033)
163 (0,307)
146 (0,100)
201 (0,076)
133 (0,076) 243 (0,125)
249 (0,062)
158 (0,033)
Total
35
4
* Em parênteses as frequências dos alelos.
5
2
6
2
3
1
5
0
2
4
1
46
3.2. Estimativas da estrutura genética populacional
O coeficiente de F de Wright (Wright, 1951), para os 12 locos microssatélites revelou
estruturação genética moderada entre as populações estudadas (FST= 0,143). Os valores de
FST par-a-par mostraram diferenciação genética intermediária entre as populações de
Puraquequara e Coari (FST= 0,102), e uma alta diferenciação genética entre Ilha Comprida
comparada às localidades de Puraquequara e Coari (FST= 0,191 e 0,189) (Tabela 06), com
variação baixa (dentro) das populações (FIS= 0,058). O baixo fluxo gênico baseado nos
valores de Nm (número de migrantes por geração), menores que um, corrobora a forte
estrutura genética encontrada entre as três populações amostradas, juntamente com a taxa
de migração (Nm= 1,609) calculada pelo programa POPOPGENE 1.31, segundo Yeh et al.,
(1997), entre as três populações de A. albitarsis s.l. com base nos 12 locos microssatélites.
Tabela 06. Fluxo gênico com Nm= Número de migrantes (valores acima da linha diagonal) e
FST par-a-par (valores abaixo da linha diagonal), estimado entre as três populações de
Anopheles albitarsis s.l. com 12 locos microssatélites.
População Comparada
Puraquequara - AM
Coari - AM
Ilha Comprida - SP
Puraquequara - AM
-----
0,0899
0,1667
Coari - AM
0,1022
-----
Ilha Comprida - SP
0,1918
0,1897
0,1714
------
A distância genética e identidade de Nei (1978) foram calculadas com o auxílio do
programa TFPGA (Miller, 1997), que mostraram as populações de Puraquequara e Coari –
AM serem mais próximas entre si do que a população de Ilha Comprida – SP (Tabela 07).
Tabela 07. Matriz de distância (valores abaixo da diagonal) e identidade (valores acima da
diagonal) genética de Nei, calculadas para as três populações de Anopheles albitarsis s.l., utilizando
12 locos microssatélites.
População
Puraquequara AM
Coari - AM
Ilha Comprida - SP
Puraquequara - AM
-----
0,8139
0,6584
Coari - AM
0,2059
-----
0,6428
Ilha Comprida - SP
0,4180
0,4418
------
47
A partir dos resultados obtidos, foi possível construir um dendrograma de
similaridade genética, separando as três populações em dois grupos (Figura 02). O primeiro
foi formado por Puraquequara e Coari (AM), e o segundo, por Ilha Comprida - SP. O
bootstrap mostrou nesses três clusters valores consistentes em cada nó obtido. Os nós que
incluem as três populações apresentaram os suportes de 58,33% e 100% nas localidades
de Puraquequara/Coari e Ilha Comprida, respectivamente e de 100% nas três localidades.
Puraquequara - AM
58,33%
58,33%
100%
Coari - AM
100%
Ilha Comprida - SP
Figura 02- Dendrograma agrupando as três populações de Anopheles albitarsis s.l. com base na
similaridade genética, obtida com os 12 locos microssatélites. Método não ponderado de
agrupamento de pares de populações, segundo o método de média aritmética – UPGMA (Nei,
1978).
O teste de Mantel, implementado no programa TFPGA (Miller, 1997), mostrou que o
coeficiente de correlação entre a distância genética de Nei (1978) e a distância geográfica,
não foi significativo (r= 0,9984; P= 0,1530), quando todas as localidades foram
consideradas, indicando que não há correlação entre distância genética e distância
geográfica entre as três populações de A. albitarsis s.l. (Figura 03).
Coari - AM
Bairro de Puraquequara, Manaus - AM
Ilha Comprida - SP
Figura 03. Gráfico de autocorrelação com a distância geográfica (km) e distância genética
para as três populações de Anopheles albitarsis s.l. gerado a partir dos 12 locos
microssatélites.
48
A estruturação das populações foi analisada por meio da análise Bayesiana
implementada no programa STRUCTURE 2.3.2 (Pritchard et al., 2000). O número de
populações (k) mais provável foi estimado pelo programa considerando todos os indivíduos
amostrados nas três populações, indicando três clusters (k= 3) (Figura 04).
Figura 04. Valor de Delta K = 3 clusters, obtido a partir de análise Bayesiana implementada
no programa STRUCTURE, utilizando 12 locos microssatélites de indivíduos de Anopheles albitarsis
s.l. amostrados em três localidades (k = número de agrupamentos possíveis).
O Barplot gerado com o auxílio do programa STRUCTURE 2.3.2 evidencia uma
estrutura genética entre as três populações (Figura 05).
1 - Coari
1
2
2 - Puraquequara
3
3 - Ilha Comprida
Figura 05. Barplot gerado pelo programa STRUCTURE 2.3.2, indicando três populações de
Anopheles albitarsis s.l. de acordo com a análise de 12 locos microssatélites. Cada cor corresponde a
um agrupamento (Verde (fundo): Coari - AM; Vermelho (fundo): Puraquequara - AM e Azul (fundo):
Ilha Comprida - SP), e cada indivíduo é representado por uma barra vertical. Os números no eixo dos
X corresponde a uma localidade específica: 1-Coari, 2-Puraquequara, 3- Ilha Comprida. O eixo Y
representa a probabilidade de atribuição de um indivíduo para cada grupo.
49
4. DISCUSSÃO
A malária é um problema de saúde pública em diversos continentes dos trópicos.
Apesar dos esforços dos órgãos de saúde pública, os casos de malária continuam
crescendo em populações urbanas e principalmente em zonas rurais (Ministério da saúde,
2006). Um amplo conhecimento das características demográficas e variabilidade genética
das espécies de mosquitos são fundamentais para o seu controle. Dentre as características
mais importantes destacam-se: o conhecimento do fluxo gênico, do sistema reprodutivo e da
diversidade entre as populações (Frankham, 2008).
O complexo Anopheles albitarsis (Nyssorhynchus) é composto por seis espécies
crípticas, mas ainda apresenta problemas de status taxonômico. Além disso, as relações
entre essas espécies representam um enigma taxonômico com um número até hoje incerto
de taxo constituinte. Estas relações entre eles são pouco compreendidas, porque as árvores
filogenéticas inferidas com diferentes marcadores moleculares são confusas e com
topologias conflitantes (Krzywinski, 2011). Vários métodos têm sido utilizados para resolver
as identidades das espécies do Complexo Albitarsis, incluindo cromossomos (Kreutzer et
al.,1976; Rafael et al., 2006), isoenzimas (Santos et al., 2003), RAPD-PCR (Wilkerson et al.,
1995b), morfologia e comportamento (Rosa-Freitas et al., 1990). Porém, estudos
populacionais para essa espécie na região amazônica são escassos.
Os marcadores microssatélites são considerados ideais para estimar parâmetros
genéticos de populações e para a compreensão de padrão de fluxo gênico e parentesco
(Zucchi, 2002). A diversidade genética é o material bruto sobre a qual a seleção natural atua
para permitir a adaptação às mudanças ambientais, podendo haver perda da diversidade
genética e redução do potencial evolutivo (Frankham et al. 2008). E, o entendimento do
processo evolutivo, que mantém a variabilidade genética de populações naturais de
mosquitos, especialmente, com relação à definição da competência vetorial, poderia ajudar
na prevenção de doenças (Chapman et al., 1999).
Considerando a variabilidade genética em A. albitarsis s.l., os 12 locos
microssatélites analisados apresentaram-se polimórficos nas três populações analisadas.
Dentre os 83 indivíduos, um total de 156 alelos foi observado, com o número de alelos por
loco variando de dois a nove, e riqueza alélica com valores próximos entre as três
populações.
Os efeitos da sazonalidade na estrutura populacional em Anopheles gambiae de
duas localidades da Costa do Quênia foram analisados com 11 marcadores microssatélites
(Midega et al., 2010). Esses autores encontraram variação de 7 a 21 alelos por loco, a partir
de 535 alelos analisados em 407 indivíduos. Um estudo envolvendo 12 marcadores
50
microssatélites em duas populações de A. dalingi (Coari e São Gabriel da Cachoeira – AM),
que totalizaram 60 indivíduos, foi encontrado um total de 112 alelos, variando entre 6 a 15
alelos por loco, e riqueza alélica de 6,554 (Lima, 2010ª). Neste trabalho, o número de alelos
obtidos foi menor do que os observados em A. darlingi. Em outro estudo com A. marajoara,
membro do Complexo Albitarsis, oriundos de cinco populações da Colômbia foram utilizados
9 marcadores microssatélites em 323 indivíduos (Brochero et al., 2010). Os autores
encontraram 72 alelos variando de 6 a 10 por loco. Em A. (Nyssorhynchus) triannulatus,
outro grupo de anofelinos formado por um complexo de espécie, foram utilizados 8 locos
microssatélites analisados em 51 indivíduos, nos quais foram observados 66 alelos, que
variaram de 5 a 12 alelos por loco (Cruz, 2011).
No presente estudo, oito locos de A. albitarsis s.l. encontram-se fora do Equilíbrio de
Hardy-Weinberg com média de (HO = 0,615 e HE = 0,546) em pelo menos uma localidade.
Quatro locos em Puraquequara (Aa07, Aa21, Aa27 e Aa30), cinco locos em Coari (Aa07,
Aa10, Aa21, Aa27, Aa33) e quatro locos em Ilha Comprida (Aa10, Aa16, Aa18, Aa27). Na
população de Puraquequara o desvio do equilíbrio é provavelmente devido ao excesso de
heterozigotos confirmado pelo valor de FIS (-0,046), pois somente o loco Aa07 apresentou
alelo nulo. Nas outras populações o desvio pode ter ocorrido provavelmente, pelo excesso
de homozigotos nas populações. Em Ilha Comprida, esse desvio pode ser devido ao número
amostral inferior a N = 20. Não foi detectado desequilíbrio de ligação entre os locos em
nenhuma população indicando independência genética entre locos.
Nove locos microssatélites e outros marcadores genéticos (ITS2, gene white) foram
analisados em cinco populações de A. marajoara da Colômbia, dentre os quais, somente um
loco microssatélite mostrou equilíbrio de Hardy-Weinberg (Brochero et al., 2010). Uma
população estava com excesso de heterozigotos. Todas as populações de origem
colombianas analisadas apresentaram níveis muito semelhantes de heterozigosidade
esperada (HE = 0,547 - 0,587), sendo apenas a localidade de Caquetá ligeiramente inferior
(H = 0,481). Os autores sugerem que essa perda de diversidade genética seria mais
provável por causa do efeito fundador na origem das populações colombianas por
posteriores, ou recentes, pontos de estrangulamento.
Em duas populações do Complexo A. triannulatus foram analisados 8 marcadores
microssatélites, e observados que metade dos locos encontrava-se em equilíbrio de HardyWeinberg, sendo dois locos (ATR18 e ATR44) do Lago Janauari e dois (ATR29 e ATR48) de
Puraquequara, Município de Manaus, Estado do Amazonas (Cruz, 2011). Para o A. gambiae
da costa do Quênia, foram encontrados 50% de locos microssatélites fora do equilíbrio de
Hardy-Weinberg, dentre os 11 analisados, o que sugere uma deficiência de heterozigotos.
51
Foi encontrado, também, desequilíbrio de ligação entre pares de locos, sugerindo a
existência de subestruturação (Midega et al., 2010).
Para A. albimanus colombiano (Gutiérrez et al., 2009), em estudo com quatro locos
microssatélites, todos se encontravam fora do equilíbrio de Hardy-Weinberg associados com
déficits de heterozigotos causados pela presença de alelos nulo e efeito Wahlund. O desvio
significativo do Equilíbrio de Hardy-Weinberg também foi apresentado em estudo com
Aedes aegypti utilizando 8 marcadores microssatélites em quatro populações da Amazônia
brasileira. O desvio que ocorreu em alguns locos nas quatro populações analisadas pode
ser decorrência do excesso de homozigotos. Dentre as quatro populações, Boa Vista – RR
registrou somente um loco em desequilíbrio genético, enquanto que as populações de Porto
Velho, Santarém e São Luís, apresentaram dois a três locos em desequilíbrio genético
(Lima, 2010b).
No presente estudo, 156 alelos foram observados nas três populações, 35 alelos
foram exclusivos (22%), sendo 14 alelos encontrados na população de Puraquequara – AM
e Ilha Comprida – SP e 7 alelos em Coari - AM. A maior frequência (0,333) foi dos alelos
159, encontrado no loco Aa21, em Coari - AM. A menor frequência alélica (0,013 e 0,014) foi
dos alelos 260 e 183 presentes no loco Aa09 e Aa18, respectivamente na população de
Puraquequara. A maior quantidade de alelos exclusivos foi nos locos Aa10 (A = 06), seguido
de Aa07 e Aa21 (A = 05). Os locos com menor quantidade de alelos exclusivos foram Aa20
e Aa33 (A = 01).
A taxa de migração dos 83 indivíduos de A. albitarsis s.l. nas três populações
analisadas revelou um baixo fluxo gênico (Nm = 1,609). O número de alelos exclusivos é
uma estimativa indireta de fluxo gênico, baseado nos valores de Nm (Slatkin, 1985). Para
esse autor, quanto mais baixo o fluxo gênico de uma população, mais alelos exclusivos
surgem por mutação. O número de alelos exclusivos encontrados no presente estudo pode
indicar a ocorrência de mais de uma espécie nas amostragens analisadas do complexo
Albitarsis em função do compartilhamento de alelos registrados. O que pode ser um
indicativo de restrição ao fluxo gênico, confirmando a diferenciação entre as populações.
Dados com o gene mitocondrial ND5 mostraram que os haplótipos procedentes do
Bairro de Puraquequara, Município de Manaus e da localidade de Cacau Pirera, Estado do
Amazonas, sugerem a ocorrência de até três espécies ou linhagens do Complexo albitarsis
(Naice, 2007; Rafael et al., 2012).
Neste estudo, o valor de FST (0,143) maior do que o de FIS (0,058) e o de Nm
(migrantes por geração) par a par abaixo de 1 (Tabela 06) e o estimado entre as três
populações abaixo de 4 (1,609), indicando que possa estar existindo alguma barreira ao
52
fluxo gênico. Em um estudo realizado por Kimura e Maruyama (1971) foi mostrado que
populações estão diferenciadas geneticamente quando o Nm<1, e consideradas como uma
única população panmítica quando o Nm>4. Segundo Frankham et al. (2008), um único
migrante por geração é considerado suficiente para prevenir a diferenciação completa
(fixação de alelos) das populações ideais independente do seu tamanho. Embora, nas
populações pequenas essa proporção seja maior, pois, migrações mais altas em
populações pequenas neutralizam sua maior perda de variabilidade, devido à deriva
genética.
Portanto, esses valores confirmam que as amostras de A. albitarsis s.l. das três
localidades estudadas são populações moderadamente estruturadas e diferenciadas
geneticamente e com baixa endogamia. Isso indica que possa estar ocorrendo um processo
de especiação recente entre elas. Essa justificativa é reforçada pelo fato de A. albitarsis ser
um complexo de espécies e de ter a possibilidade de haver diferentes espécies ou linhagens
desse grupo na amostragem analisada.
O número de migrantes por geração de A. albitarsis s.l., encontrado neste estudo foi
bem inferior quando comparado aos números das amostras de A. marajoara, de Antioquia e
Magdalena, da Colômbia (Brochero et al., 2010), que tiveram um valor de Nm = infinito,
confirmando se tratar de uma única população. Porém, as populações de A. marajoara de
Meta e Santander foram altamente homogêneas por fluxo gênico (Nm = 22,86 - 28,79), bem
como Caquetá e Meta (Nm=13,31 - 25,66) e Caquetá e Santander (Nm = 10,15 - 10,44).
Isso mostrou a ocorrência de migração de indivíduos elevando os níveis de fluxo gênico
nessas populações. Em A. arabiensis do Quênia foi observado, também, um alto nível de
fluxo gênico (Nm = variando de 29 – 101), segundo Muturiet et al. (2010). Valores de fluxo
gênico aproximados àqueles obtidos para A. albitarsis s.l. deste trabalho foram observados
em A. gambiae do Quênia com Nm variando de 0,08 – 1,35, sugerindo que existe restrição
ao fluxo gênico nessa população (Midega et al., 2010).
Neste estudo, à distância/identidade de Nei, foi calculada entre as populações de
Puraquequara x Coari, Puraquequara x Ilha Comprida e Coari x Ilha Comprida. As
populações de Puraquequara e Coari são as mais próximas e semelhantes entre si quando
comparadas àquela de Ilha Comprida (0,899; 0,1667 e 0,1714). Essa estruturação genética
foi observada, por meio do algoritmo UPGMA, que gerou o dendrograma, agrupando
Puraquequara e Coari em um mesmo clado, e os indivíduos de Ilha Comprida formaram um
único grupo. Esses dados confirmam a análise Bayesiana obtida pelo programa
STRUCTURE (Pritchard et al., 2000), considerando todos os indivíduos analisados nas três
localidades, a existência de três populações, indicado por análise do programa
STRUCTURE. Segundo o Barplot desse programa, se forem consideradas as seis espécies
do Complexo Albitarsis, o programa indica que a espécie tipo que ocorre em São Paulo
53
compartilha alelos com amostras das localidades de Coari e Puraquequara. Porém, estas
duas últimas localidades compartilham alelos em níveis restritos com a população de São
Paulo. O teste de Mantel mostrou que o coeficiente de correlação obtido (r = 0,9984; P =
0,1530) entre a distância genética de Nei (1978) e a distância geográfica não foi
significativo, indicando que não há correlação entre distância genética e distância geográfica
entre as três populações de A. albitarsis s.l. Um estudo cromossômico evolutivo do cariótipo
e de mapeamento físico pelo método de Hibridação in situ Fluorescente (FISH) da unidade
maior 45S do DNA ribossomal entre populações de A. albitarsis s.l. das localidades de Ilha
Comprida (SP), Iranduba e Coari (AM). Os resultados mostraram que o cariótipo do grupo
apresenta 2n = 6 cromossomos e a localização e quantidade dos cístrons de RNA
ribossomais mostraram-se conservados nas populações analisadas. Estes dados foram
comparados pela análise de variância (ANOVA) e não houve diferenças significativas entre
as três populações estudadas (Rafael et al., 2005).
Anopheles albitarsis s.l., de Manaus, Cacau Pirera e Coari (AM) e Ilha Comprida (SP)
foram estudadas por meio do gene mitocondrial ND5 (Rafael et al., 2012). Os autores
observaram baixa variabilidade genética nas amostras de Manaus e Cacau Pirera e alta
variabilidade genética em Coari e Ilha Comprida. A AMOVA mostrou forte estruturação (FST
= 0,89) para os indivíduos dessas mesmas localidades, sendo que 89% de variação
genética observada foi entre as localidades. Não houve diferenciação genética significativa
entre Manaus e Cacau Pirera. Os indivíduos de Coari e Ilha Comprida apresentaram
estrutura genética significativa em relação a Manaus e Cacau Pirera.
Uma diferenciação genética intrapopulacional foi encontrada em populações de A.
marajoara da Colômbia, conforme análise com os mesmos marcadores, com os quais foram
obtidos o FIS = 0,082 > FST = 0,069, em que a variabilidade genética foi de origem
intrapopulacional, confirmado pelos altos valores de fluxo gênico (Brochero, 2010). Segundo
esse autor, a análise da estrutura genética de A. marajoara evidenciou a presença de duas
populações distintas (K = 2). No entanto, outras possíveis barreiras geográficas (rios,
montanhas e outros) não desempenharam qualquer papel na heterogeneidade genética
moderada encontrada entre essas populações. Em A. gambiae com o mesmo marcador, o
valor de FST = 0,171 indica a existência de diferenciação populacional e restrição ao fluxo
gênico (Midega et al., 2010).
Em amostras de A. triannulatus, oriundas de Puraquequara e Lago do Janauari (AM),
o FST (0,281) encontrado entre as duas populações foi maior que o FIS (-0,0529), indicando
estruturação genética elevada decorrente, possivelmente, de um processo de especiação
recente, resultante de barreiras ao fluxo gênico (Nm = 0,634) entre elas (Cruz, 2010). Dados
corroborados pela análise da estrutura genética evidenciaram a presença de duas
populações distintas (K = 2). Em estudo com A. nuneztovari, Scarpassa et al. (1999),
54
utilizando 16 locos enzimáticos em quatro localidades da Amazônia brasileira e duas da
Colômbia, com 11 isoenzimas mostraram uma forte diferenciação para dois locos: αglicerofosfato desidrogenase (α-gpd) e malato desidrogenase (Mdh) indicando pouca
estrutura genética e baixa diferenciação geográfica entre as populações de A.nuneztovari da
Amazônia brasileira, a partir dos valores de FIS (0,029), FST (0,070) e de distância genética
(0,001-0,032).
Em A. arabiensis, do Quênia, o FST observado foi baixíssimo (0,006), não havendo
nenhuma estruturação significante entre as populações, o que indicou haver alto fluxo
gênico, confirmado pelos altos valores de Nm (Muturi et al. 2010). Anopheles darlingi, dos
Municípios de Coari e São Gabriel da Cachoeira (AM) teve o valor de FIS (0,108) maior do
que o de FST (0,028), indicando baixa diferenciação genética (2,8%) entre as populações
(Lima, 2010a).
O presente estudo mostrou um alto grau de variabilidade genética e diferenças
significativas entre as populações de A. albitarsis s.l. estudadas. A Amazônia, de baixa
altitude, possui nichos ecologicamente complexos, com áreas abertas contendo água
corrente ou estagnadas (doce e pH menos ácido), sombreadas com vegetação aquática,
pequenos córregos ensolarados, além de tipos de criadouros temporários, formados pelo
ciclo anual de cheia e vazante e por ações antrópicas (desmatamento), que são importantes
fatores para o ciclo reprodutivo de espécies de Anopheles (Tadei et al., 1998). Em Ilha
Comprida (SP), por outro lado, existe um ambiente tipicamente lagunar, no qual a Ilha
desempenha o papel de barreira, separando-o do mar aberto (Forrattini et al., 2002) e,
segundo Galvão e Damasceno (1942), os anofelinos aumentam de porte com a altitude.
Portanto, dentre essas e outras características, A. albitarsis de Ilha Comprida-SP pode ser
mais variável geneticamente do que os da Amazônia, por razões que incluem localização e
características geográficas distintas daquelas encontradas na região amazônica.
Esses resultados são úteis para um melhor entendimento da estruturação genética
populacional e evolução de A. albitarsis s.l., envolvido na transmissão da malária na
Amazônia, cujo controle depende de estratégias de ação diferenciadas, considerando as
áreas de ocorrência dessas espécies.
55
5. CONCLUSÃO GERAL
Capítulo I
A biblioteca enriquecida de DNA microssatélites de A. albitarsis s. l. teve alto rendimento
(95,8%%), com motivo de repetição de dinucleotídeo mais frequente (84%), que permitiu o
desenho de 34 pares de primers. Os 25 Locos microssatélites polimórficos foram
caracterizados e mostraram-se eficientes na detecção da variabilidade genética desses
mosquitos.
Dentre esses 25 locos microssatélites, onze apresentaram amplificação heteróloga em
outras espécies do subgênero Nyssorhynchus: A. darlingi, A. braziliensis, A. triannulatus, A.
oswaldoi e A. nuneztovari. Somente um loco foi amplificado em todas essas espécies. O
número de locos amplificados variou de 2 (A. triannulatus) a 9 (A. nuneztovari). Dez locos
foram polimórficos em pelo menos uma dessas cinco espécies. Esses resultados poderão
ser úteis em estudos de genética de populações das espécies do Complexo Albitarsis e de
outros anofelinos.
Capítulo II
Os 12 marcadores microssatélites mostraram-se eficientes, para as análises da
variabilidade e estrutura genética das três populações de A. albitarsis s.l.
Níveis elevados de variabilidade genética foram observados nas três populações
analisadas,
podendo
sugerir a
existência
de
mais
de
uma
espécie
dentro
do
Complexo Albitarsis analisado.
Dos 12 locos, oito desviaram-se do equilíbrio de Hardy-Weinberg, provavelmente devido
ao excesso de homozigotos, indicando que esteja ocorrendo cruzamento entre indivíduos
aparentados de acordo com os valores de FIS dos locos: Aa07 (Puraquequara), Aa 07 e
Aa33 (Coari), Aa16 e Aa18 (Ilha Comprida) e de heterozigotos, por estar ocorrendo
acasalamento aleatório de acordo com os locos: Aa21, Aa27 e Aa30 (Puraquequara), Aa10,
Aa21, Aa27 (Coari), Aa10 e Aa27 (Ilha Comprida). Estes dados indicam que mais de uma
espécie dentro do complexo Albitarsis foram analisadas, podendo ser elucidados em
estudos posteriores com DNA Barcode e com o Gene mitocondrial ND5.
As estatísticas F de Wright nas três populações mostraram diferenciação genética
moderada, não existindo correlação entre distância genética e distância geográfica entre
elas.
Estas
quando
foram
agrupadas
em
três
clusters distintos
(k
=
3)
pelo
56
Programa Structure, confirmaram essa diferenciação genética. Os valores de FST par-a-par
mostraram diferenciação genética intermediária entre as populações de Puraquequara e
Coari, e uma alta diferenciação genética de Ilha Comprida comparada às localidades de
Puraquequara e Coari, mostrando fluxo gênico reduzido, conforme os valores de Nm =
0,1022. Esses dados demonstram que está havendo um processo de especiação recente no
Complexo Albitarsis. Essas informações podem auxiliar iniciativas de controle desse
importante vetor da malária local na Amazônia e São Paulo.
57
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